Artículo Original

Optimización de las condiciones de cultivo para eldesarrollo de una biopelícula bacteriana y suaplicación como biofertilizante en Solanum

lycopersicum L. var. Río grandeOptimization of the culture conditions for the

development of a bacterial biofilm and its application asa biofertilizer in Solanum lycopersicum L. var. Río

grandeGabriela C. Sarti 1 , Ana E.J. Cristóbal Miguez 1 *, Alfredo J. Curá 2

1Cátedra de Química Inorgánica y Analítica, Departamento de Recursos Naturales y Ambiente,Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires. Av. San Martín 4453, Argentina.2Cátedra de Bioquímica, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires. Av. San Martín,Argentina.

El objetivo del presente trabajo fue optimizar las condiciones de cultivo de Bacillussubtilis subsp. spizizenii para el desarrollo de una biopelícula y su uso como biofertilizante en semillasde tomate (Solanum lycopersicum L. var. Río Grande). Se evaluaron diferentes medios de cultivo parael desarrollo de biopelículas, las cuales se secaron y se les determinó su masa, así como el tiempo dedisgregación de las mismas. La siembra de la bacteria se realizó bajo dos tratamientos: suelo fértil ytindalizado. Se midió la masa seca aérea y radicular; las diferencias en la biomasa de parte aérea yradicular del tomate se evaluaron mediante un ANOVA simple. Las medias se compararon utilizandola prueba de Tukey a un nivel de significación de 0,05. El análisis estadístico se realizó con el softwareInfostat 2016. Las biopelículas obtenidas se evaluaron en términos de porcentajes aritméticos ydesviaciones estándares de tres repeticiones. En el medio papa glucosada se obtuvo la mayor cantidadde biopelícula que resultó ser la más resistente a la disgregación. El tratamiento con semillasinoculadas en suelo fértil no demostró mayor desarrollo en las plántulas respecto a los controles sininocular; sin embargo, cuando se utilizó suelo tindalizado, la biomasa aérea y radicular de las plántulasinoculadas fueron significativamente mayores que los controles sin inocular. La biopelículadesarrollada por Bacillus en el medio papa glucosada podría ser utilizada como biofertilizante entomate.

Bacillus subtilis, biofertilizantes, biopelículas, Solanum lycopersicum L., tomate.

The aim of this work was to optimize the growth conditions of Bacillus subtilis subsp.spizizenii for the development of a biofilm and its use as a biofertilizer in tomato seeds (Solanumlycopersicum L.var. Río Grande). Different culture media were tested for the development of biofilms,which were dried and weighed to determine their mass. The time for biofilm disintegration was alsodetermined. The bacteria were introduced under two treatments: fertile or tindalized soil. The aerialand root dry mass was weighed. The differences in the biomass of the aerial part and root of thetomato plants were analyzed by a simple ANOVA. The means were compared by the Tukey test at asignificance level of 0.05. The statistical analysis was carried out with the software Infostat 2016. Thebiofilms obtained were evaluated in terms of arithmetic percentages and standard deviations of threerepetitions. The greatest amount of biofilm was obtained in the glucose potato medium, and it was themost resistant to disintegration. No higher seedling growth was shown by the treatment withinoculated seeds in fertile soil compared with the uninoculated controls. However, when the tindalizedsoil was used, the aerial and root biomass of the inoculated seedlings was significantly higher than inthe uninoculated controls. The biofilm developed by Bacillus in the potato glucose medium could beused as a biofertilizer in tomato.

Bacillus subtilis, biofertilizers, biofilm, Solanum lycopersicum L, tomato.

http://opn.to/a/KEFJA

RESUMEN:

Palabras clave:

ABSTRACT:

Key words:

Revista de Protección Vegetal, Vol. 34, No. 2, mayo-agosto 2019, E-ISSN: 2224-4697

_______________________________*Autor para correspondencia: Ana E. J. Cristóbal Miguez. E-mail: karibu@agro.uba.ar; amiguez@agro.uba.arRecibido: 07/01/2019Aceptado: 10/04/2019

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INTRODUCCIÓNA nivel mundial, el consumo de hortalizas

frescas cobra cada día mayor importancia, debidoa su alto valor en vitaminas, sales, minerales yfibras. El tomate (Solanum lycopersicum L.) esuna de las hortalizas más difundidas a nivelglobal, posee alto valor económico y su uso estágeneralizado al ocupar un lugar privilegiado en lacontribución de nutrientes por su preferencia ynivel de consumo (1).

El tomate pertenece a la familia Solanaceae yes originario de Sudamérica, en especial de laregión comprendida por Perú, Bolivia y Ecuador.Se trata de un cultivo perenne de porte arbustivoque se cultiva anualmente, requiere de climastemplados a cálidos, con temperaturas óptimaspara el crecimiento que oscilan entre los 21 y24°C. Sin grandes exigencias en cuanto a suelos,se siembra directamente a campo o se hacenalmácigos para la producción de plantines, queluego se trasplantan al aire libre o a invernaderos(2).

La creciente demanda de este fruto ha llevadoal uso de agroquímicos para incrementar suproducción y para el control de plagas, pero eluso indiscriminado de grandes cantidades defertilizantes de síntesis química da comoresultado efectos negativos en la calidad de losfrutos, en las características físicas, químicas ybiológicas del suelo, en la biodiversidad y en lacalidad de vida de los productores, lo que lleva ala pérdida de cultivos y empobrecimiento de losagricultores (3).

Como alternativa a esta problemática seencuentra el uso de ciertas bacterias quecolonizan la rizósfera y rizoplano de muchasespecies vegetales y que se denominan“rizobacterias promotoras del crecimientovegetal” (RPCV) (4). Algunas bacterias conactividad (RPCV) pertenecen a los génerosAcinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes,Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus,Burkholderia, Enterobacter, Erwinia,Flavobacterim, Pseudomonas, Rhizobium,Serratia, entre otros (5). Su aplicación contribuyea proteger el ambiente para conservar la fertilidady biodiversidad del ecosistema del suelo (6,7). Eneste sentido, miembros del género Bacilluspueden actuar como biofertilizantes y

biopesticidas o cumplir ambas funciones (8).Bacillus subtilis es reconocido por su accióncomo agente de control biológico, el cualproduce más de dos docenas de antibióticosdonde la clase predominante es de naturalezaproteica (9,10,11)

Según las condiciones de crecimiento, estabacteria puede crecer en forma de vida “libre”(células planctónicas) o bien desarrollandobiopelículas sobre el sustrato que coloniza.

Las biopelículas bacterianas están constituidas,estructuralmente, por masa microbiana, unamatriz mayoritariamente de exopolisacáridos quefacilita la construcción de una sofisticadaestructura tridimensional (12) y, en menorcuantía, por proteínas, ADN y productos de lisisbacteriana (13). Estas biopelículas intervienen enla inducción y acumulación de lipopéptidos;algunos de estos poseen actividad antibacterianay antifúngica (14). Estas estructuras representanuna antigua estrategia de supervivenciaprocariótica, debido a que las mismasproporcionan protección a las células frente afluctuaciones medioambientales de humedad,temperatura y pH, concentrando nutrientes yfacilitando la eliminación de desechos. Lascélulas que lo constituyen presentan un ampliorango de estadios fisiológicos, es decir, coexistencélulas con diversos genotipos y fenotipos queexpresan distintas vías metabólicas, respuestas acondiciones hostiles y poseen actividadesbiológicas específicas.

Estas biopelículas presentan una compleja yheterogénea arquitectura que depende del tipo debacteria y de las condiciones de cultivo (15,16).Las etapas para su construcción estaríanconservadas en un amplio número demicroorganismos y se las enumeran Etapa 1)Corresponde a procesos de adhesión de células auna superficie biótica o abiótica o biencolonización de interfases aire-líquido; 2)Crecimiento y agregación de células que formanmicrocolonias, las cuales producen y liberanexopolisacáridos, esto da origen a una matrizextracelular sobre la que se desarrolla labiopelícula; 3) Maduración y mantenimiento dela estructura de la biopelícula; 4)Desprendimiento de células de la estructura paracolonizar otros ambientes (17).

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En el caso de biopelículas asociadas a especiesvegetales, se pueden encontrar aquellas queestablecen relaciones de patogénesis, como sonAgrobacterium tumefaciens (18,19) oPseudomona aeruginosa (20).

Otras bacterias que producen biopelículasgeneran beneficios, como las especiesPseudomonas fluorescens y Bacilluslicheniformis, importantes productoras desideróforos y de ácido indol acético (21,22);mientras que, Burkholderia tropica (P4) es activacomo solubilizadora de fosfatos (23).

El objetivo del presente trabajo fue optimizarlas condiciones de cultivo de Bacillus subtilissubsp. spizizenii para el desarrollo de unabiopelícula y su uso como biofertilizante ensemillas de tomate (S. lycopersicum var. RíoGrande).

MATERIALES Y MÉTODOSEfecto de medios de cultivo complejossobre la formación de biopelícula enBacillus subtilis subsp. spizizenii

Se realizaron ensayos tendientes a la búsquedade un medio de cultivo adecuado para que B.subtilis subsp. spizizenii desarrolle unabiopelícula resistente que pudiera ser utilizadacomo biofertilizante.

La cepa B. subtilis subsp. spizizenii proveníade la colección de cultivos de la Facultad deAgronomía, Universidad de Buenos Aires,Argentina.Preparación del inóculo bacteriano

Activación de la cepa: Se sembró con asa deplatino en caja Petri estéril con agar nutritivo(Merck) y se incubó a 30°C durante 24 h.Condiciones de cultivo en medio mínimosalino

El inóculo de B. subtilis subsp. spizizenii seactivó y luego se resuspendió en 10 ml desolución salina estéril (0,9 % m/v); se obtuvo1x108 UFC/ml y, posteriormente, se inocularon1,5 ml de este medio en 150 ml de medio mínimosalino (MMS) en erlenmeyers de 500 ml, con elagregado de fuentes carbonadas y nitrogenadassegún los tratamientos. La composición del MMSfue: (g/l): K2HPO4, 1; KH2PO4, 0,30; NH4Cl, 0.5;NH4NO3, 0.1; Na2SO4, 0.1; MgSO4.7H2O, 0.01;

MnSO4.4H2O, 1.10-3; FeSO4.7H2O, 1.10-3; CaCl2,5.10-4; EDTA, 0.01; pH 7.Condiciones de cultivo y extracción debiopelícula

B. subtilis subsp. spizizenii se cultivó encondiciones estáticas para permitir la formaciónde las biopelículas. En todos los casos laincubación fue a 30ºC durante 96 h. Lasbiopelículas formadas se separaron con unavarilla de vidrio, cuando la resistencia de lamisma lo permitía, o por filtración al vacío en elcaso de biopelículas frágiles. En todos los casos,las biopelículas se secaron a 40ºC hasta masaconstante y luego se pesaron en balanza analítica(OHAUS).

Se ensayaron los siguientes medios de cultivo:

a. Medios de cultivo con peptona: caldonutritivo (Britania) con 0,5 % peptona, TSC(caldo tripteína soja) (Britania) con 2 %peptona, medio cerebro-corazón (Britania) con1 % peptona y MMS enriquecido con elagregado de peptona 1 % (Britania).

b. Medios de cultivo líquidos con extracto delevadura: caldo Luria Bertani con 0,5 %extracto de levadura, medio Landy (Britania)con 0,1 % extracto de levadura y MMSenriquecido con extracto de levadura 1 %(Britania). Dado que el extracto de levadura esel resultado de la plasmólisis de las levaduras,esta aporta vitaminas, especialmente delcomplejo B, así como una mezcla deaminoácidos y péptidos.

c. Medios de cultivo con distintas fuentescarbonadas: MMS enriquecido con 1 % defuentes carbonadas simples: galactosa,fructosa y biodiesel. Se utilizó el aminoácidoácido L-glutámico 35 mM como fuentenitrogenada.

d. Medio de cultivo Papa glucosado : infusión depapa (50 µg/ml); esta se filtró y al líquidoremanente se le agregó glucosa 10 g/l.

La estabilidad de la biopelícula se evaluómediante la observación directa, a partir deltiempo que tarda en desprenderse de la interfaseaire-líquido y se deposita en el fondo delErlenmeyer (desagregación de la biopelícula).

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Aplicación de biopelícula sobre semillas detomate

Se trabajó con semillas de tomate,desinfectadas en alcohol 70 % y lavadas 3 tresveces con agua destilada estéril. Sobre estassemillas se depositó, asépticamente y por mediode una espátula, una fina porción de labiopelícula de 2 mm2.

El sustrato utilizado para la siembra fue unamezcla de tierra fértil (relación C/N: 21, pH: 6,8)y compost (relación C/N: 19, pH: 6,4) enproporción 3:1. Se realizaron tratamientosutilizando esta mezcla tindalizada (sustratoempobrecido en microorganismos) y sintindalizar (sustrato fértil). La tindalización es unmétodo de esterilización en el cual el suelo sesomete a calentamiento a 100°C, durante unahora por tres días consecutivos.

El ensayo se realizó en invernáculo enbandejas de germinación (speedling), a unatemperatura media de 20°C, durante 30 días. Lostratamientos de inoculación realizados sobresemillas de tomate fueron: a) Semillas inoculadascon la biopelícula sobre sustrato fértil; b)Semillas inoculadas con la biopelícula sobresustrato tindalizado; c) Semillas sembradas sobresustrato fértil sin inocular (tratamiento control);d) Semillas sembradas sobre sustrato tindalizadosin inocular (tratamiento control).

Al finalizar el ensayo se evaluó la biomasaaérea y radicular de las plantas de tomate.Análisis estadístico

La distribución normal de los datos se analizócon la prueba de Levene y la homogeneidad devarianzas mediante prueba de Shapiro-Wilkins.Las diferencias en la biomasa aérea y radiculardel tomate se evaluaron mediante un ANOVAsimple. Las medias se compararon mediante laprueba de Tukey a un nivel de significación de0,05. El análisis estadístico se realizó con elsoftware Infostat 2016. Las biopelículasobtenidas se evaluaron en términos deporcentajes aritméticos y desviaciones estándarde tres repeticiones.

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEfecto de medios de cultivo complejossobre la formación de biopelícula enBacillus subtilis subsp. spizizeniiMedios complejos con peptona

B. subtilis subsp. spizizenii creció y desarrollóuna biopelícula en la interfase aire-líquido enmedios de cultivos complejos, cuyascomposiciones no están completamente

definidas, formulados con extracto de carne ydigeridos de proteínas.

Para que la biopelícula pueda desarrollarse senecesitaron 96 horas de cultivo. De acuerdo conesto, Holscher et al. (24) sugirieron que lasbacterias requieren de un tiempo de incubaciónprevio a la formación de biopelícula, donde seproduce un gradiente de oxígeno que se generacuando la bacteria alcanza una alta densidad decrecimiento en el cultivo líquido y en condicionesestáticas. Cuando Bacillus alcanza la interfaseaire-líquido sufre un cambio desde su estilo devida libre como bacteria móvil a un nuevoestadio, en el cual libera exopolisacáridos queconstituyen la base de la matriz queposteriormente dará origen a la biopelícula (25).

La cantidad de biopelícula formada, utilizandocaldo nutritivo, no mostró diferencia respecto dela obtenida utilizando un medio de cultivo desales minerales con el agregado de peptona 1 %.Cuando se usó caldo Cerebro-Corazón, elincremento en la formación de la biopelícula fuemás del triple (Fig.1). Este medio de cultivo,además del hidrolizado proteico de peptona,contiene otros nutrientes como fosfatos, glucosay la presencia de otros componentesquímicamente no definidos que actuarían sobreBacillus como factores de crecimiento, parafavorecer la formación de la biopelícula.

B. subtilis subsp. spizizenii utilizando peptona,como única fuente de carbono y nitrógeno, crecióy formó biopelícula; sin embargo, otras bacterias,bajo estas condiciones, solo fueron capaces decrecer y desarrollar el primer estadio de laformación de la biopelícula, que corresponde auna adhesión reversible con la interfase, tal es elcaso de Pseudomonas spongiae (26).Medios de cultivos complejos con extracto delevadura

El medio de cultivo mínimo salino, con elagregado de extracto de levadura 1 %, produjo0,8 mg biopelícula/ml de cultivo; en el medio decultivo Landy el desarrollo de la biopelícula seincrementó más de un 80 % y en medio decultivo Luria Bertani el incremento fue mayor al100 %. (Fig.2)

El medio de cultivo Landy, además delextracto de levadura, contiene otros nutrientescomo son fosfatos, glucosa, glutamato, sales de

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hierro y magnesio, que actuarían sobre la bacteriapara favorecer su actividad metabólica ysintetizando productos que formarían parte de lamatriz. Según Morikawa y Banin et al. (27,28) enBacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa,respectivamente, el glutamato y las sales dehierro favorecieron la formación de lasbiopelículas. En el presente ensayo, la mayorcantidad de biopelícula se registró en medio decultivo Luria Bertani, que posee una combinaciónde extracto de levadura y peptona en relación 1:2.Medios de cultivo con distintas fuentescarbonadas

La mayor cantidad de biopelícula se obtuvocon el medio de cultivo papa glucosada (PG). En

este sentido Kovacs et al. (29) observaron que laprincipal bacteria aislada de productosalimenticios, como sopas a base de papas,corresponde a Bacillus subtilis. Esta bacteriapuede sobrevivir a procesos de cocción ydesarrollar grandes poblaciones que colonizan lasinterfaces aire-líquido. En estos mismosalimentos, Bacillus thuringiensis fue incapaz, porsí misma, de producir una biopelícula: sinembargo, esta especie se desarrolló si en elmismo producto coexistía con Bacillus subtilis.

Cuando se utilizó como fuentes carbonadasgalactosa y fructosa se obtuvieron cantidadessimilares (Fig. 3). Cuando se agregó biodiesel almedio de cultivo la bacteria fue capaz de crecer,

Figura 1. Formación de biopelículas por B. subtilis subsp. spizizenii en medios de cultivocomplejos con peptona a 30°C en condiciones estáticas. / Biofilm formation by B. subtilis subsp.

spizizenii in complex culture media with peptona at 30°C in static conditions.

Figura 2. Formación de biopelículas por B. subtilis subsp. spizizenii en medios de cultivocomplejos con extracto de levadura a 30°C en condiciones estáticas/ Biolfilm formation by B. subtilis

subsp. spizizenii in complex culture media with yeast extract at 30°C in static conditions

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pero no desarrolló biopelícula. Kankeu et al.(30), en su trabajo con Pseudomonas aeruginosaATCC 10145 y Bacillus subtilis sp., expusieronestas bacterias a distintas concentraciones debiodiesel, desde 1 % hasta 70 %, y en todos loscasos las bacterias crecieron (a través de laliberación de surfactinas), utilizando biodieselcomo fuente carbonada; sin embargo, bajo esascondiciones no desarrollaron biopelícula.Vazquez et al. (31) postularon un mecanismo porel cual los sustratos hidrofóbicos produciríanmodificaciones directas en la membranabacteriana favoreciendo el contacto con elsustrato y, de esta forma, poder ser utilizados porla bacteria; sin embargo, este trabajo se realizócon la bacteria crecida en medio de cultivolíquido.

B. subtilis subsp. spizizenii fue capaz desintetizar biopelícula en medios de cultivocomplejos y simples. (Fig. 1, 2, 3, 4)

En estudios con Rhizobium leguminosarum(32) se demostró que los medios de cultivomínimos, que poseían como única fuentecarbonada manitol o succinato, favorecían laformación de biopelícula. Yang et al. y Reisner etal. (33,34) demostraron que en los casos dePseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, laadherencia bacteriana y la formación de labiopelícula eran estimuladas en condiciones deescasez de nutrientes y, por el contrario, losmedios de cultivo ricos resultaron desfavorables.Para el caso de Citrobacter sp. y Staphylococcusaureus, el fosfato y la glucosa fueron elementosque aumentaron el desarrollo de sus biopelículas(35,36).

Figura 3. Biopelículas formadas por B. subtilis subsp. spizizenii en medio mínimo salino, ácido L-glutámico y diferentes fuentes carbonadas en concentración 1 % a 30°C en condiciones estáticas./Biofilms formed by B. subtilis subsp. spizizenii in minimal saline medium, L-glutamic acid and

different carbon sources at 1 % concentration at 30°C in static conditions

Figura 4. Biopelícula formada por B. subtilis subsp. spizizenii (vista superficial) en a) medioCerebro corazón, b) en medio Landy, c) en medio Papa glucosada / Biofilm formed by B. subtilis

subsp. Spizizenii (superficial view) in a) brain heart medium. b Landy medium, c) potato and glucosemedium

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Tiempo de desagregación de las biopelículasSe evaluó la durabilidad de la biopelícula en el

tiempo, utilizando los medios de cultivo en loscuales se obtuvo la mayor cantidad debiopelícula.

La biopelícula obtenida utilizando el medio decultivo Papa glucosada fue la más resistente a losprocesos degradativos, debido a que atemperatura ambiente (25°C) no mostró ningúnsigno de degradación hasta luego de siete días.(Fig. 5).

Las biopelículas desarrolladas a partir de LuriaBertani y Landy, al cuarto día evidenciaronsignos de disgregación y la biopelícula sedesprendió de la interface aire-líquido,depositándose en el fondo del erlenmeyer. A losseis días se había desintegrado el 40 % de labiopelícula desarrollada en medio de cultivoLuria Bertani y 46 % de la misma desarrollada enmedio de cultivo Landy. La biopelícula menosresistente a la degradación fue la que sedesarrolló en medio de cultivo Cerebro corazón.En varios trabajos realizados por Branda et al.(37,38,39) se sugiere que las biopelículasdesarrolladas por Bacillus subtilis son muyrobustas y contienen agregados celulares que nopueden ser disgregados por procedimientossencillos de laboratorio, con lo cual se requierevarios ciclos de sonicación para lograr su

desintegración. Las superficies de estasbiopelículas se comparan con los cuerpos defructificación de ciertas estructuras fúngicas.

En otros trabajos, donde se compara lautilización de medios de cultivo industrializadoscon subproductos de la industria alimentaria, seencontró que estos últimos pueden servir comosustratos más económicos para la producción agran escala de las biopelículas bacterianas (40).Tomando esto como referencia y los resultadosque se obtuvieron en el presente trabajo, para losensayos posteriores sobre inoculación de semillasde tomate y para el crecimiento de la bacteria ydesarrollo de la biopelícula, se utilizó el medio decultivo Papa glucosada por ser, dentro de losmedios de cultivo evaluados, el de menor costo yporque su biopelícula fue la más estable a losprocesos degradativos.Efecto de tindalización del sustrato en eldesarrollo de las plántulas de tomate

El sustrato que recibió el tratamiento detindalización quedó empobrecido en su floramicrobiana, a su vez que disminuyó sugranulometría y formó un suelo con mayorcompactación. Bajo esta condición, el desarrollode la biomasa aérea disminuyó más de 70 % y eldesarrollo de las raíces 38 %, con respecto a lasplántulas sembradas sobre sustrato fértil. (Fig. 6,7)

Figura 5. Tiempo de disgregación de las biopelículas desarrolladas en medios de cultivo complejosa 25°C en condiciones estáticas. / Time of disintegration of the biofilm developed in complex culture

media at 25°C in static conditions

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Inoculación de semillas de tomate conBacillus. subtilis subsp. Spizizenii

Cuando se utilizó el sustrato fértil no seobservaron diferencias significativas en elcrecimiento de la biomasa aérea ni de las raícesde las plántulas de tomate que fueron inoculadascon la biopelícula de B. subtilis subsp. spizizeniirespecto del control (Fig. 8 y 9).

Se observó que en los tratamientos donde seaplicó la biopelícula el tiempo de germinación seretrasó dos días respecto a las semillas sin

biopelícula, sin modificar el poder germinativo(dato no mostrado). En un trabajo en el cual seestudió la colonización de la raíz de cebada porPseudomonas sp. DMSZ 13134 (agentefitosanitario PRORADIX), sugieren que el efectode las RPCV puede variar de acuerdo a lamicrobiota presente en los sustratos, debido a lasinteracciones que pueden presentarse entre lascepas aplicadas con los microorganismos nativosy/o con condiciones abióticas (41). En otrotrabajo donde se inocularon plantas de Banano

Figura 6. Crecimiento de parte aérea de plántulas de tomate crecidas sobre sustrato sin tindalizar ytindalizado. Letras distintas entre tratamientos indican diferencias significativas (p<0,05) / Growth ofthe aerial part of tomato seedlings grown on non-tindalized or tindalized substratum. Different letters

between treatments indicate significant differences (p<0.05)

Figura 7. Crecimiento de raíces de plántulas de tomate crecidas sobre sustrato sin tindalizar ytindalizado. Letras distintas entre tratamientos indican diferencias significativas (p<0,05) / Rootgrowth of tomato seedlings grown on non-tindalized or tindalized substratum. Different letters

between treatments indicate significant differences (p<0.05)

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con Bacillus subtilis EA-CB0575, encontraron enel suelo un efecto de enmascaramiento oantagonismo de las poblaciones nativas deBanano, posiblemente debido a la dominancia dela bacteria promotora del crecimiento Bacillussobre las raíces de la planta (42).

Cuando el sustrato fue tindalizado seencontraron diferencias significativas entre lassemillas inoculadas con la biopelícula y los

controles (semillas sin inocular). Con respecto alos valores de biomasa aérea, las semillasinoculadas con la bacteria mostraron un aumentode 50 % con relación a los controles sin inoculary en el desarrollo radicular se observó unaumento de 40 % con respecto a los controles sininocular. (Fig. 10, 11)

La mayor biomasa podría deberse a laproducción de fitohormonas liberadas como

Figura 8. Crecimiento de parte aérea de plántulas de tomate crecidas sobre sustrato sin tindalizar ysin inocular (Bacillus -) e inoculadas con B. subtilis (Bacillus +). Letras distintas entre tratamientosindican diferencias significativas (p<0,05) / Growth of the aerial part of tomato seedlings grown onnon-tindalized substratum without inoculation (Bacillus -) or inoculated with B. subtilis (Bacillus +).

Different letters between treatments indicate significant differences (p<0.05)

Figura 9. Crecimiento de raíces de plántulas de tomate crecidas sobre sustrato sin tindalizar y sininocular (Bacillus -) e inoculadas con B. subtilis (Bacillus +). Letras distintas entre tratamientos

indican diferencias significativas (p<0,05) / Root growth of tomato seedlings grown on non-tindalizedsubstratum without inoculation (Bacillus -) or inoculated with B. subtilis (Bacillus +). Different letters

between treatments indicate significant differences (p<0.05)

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producto del metabolismo bacteriano de Bacillus,las cuales regulan parámetros como elcrecimiento, la división celular o extensión de laraíz. Entre ellas se encuentran las citoquininas,auxinas y giberilinas; estas últimas reportadas enalgunas especies del género Bacillus (42).Además, Dweipayan et al. (43) y Sanchez López(44) señalaron la capacidad nitrogenasa y desolubilización de fósforo, por parte de bacterias

del género Bacillus, ambos nutrientes esencialespara el desarrollo vegetal.

Niñirola et al. (45), en un estudio con plantasde berro a nivel de invernadero crecidas ensustrato estéril y tratadas con inóculo líquido deB. subtilis, encontraron mayores resultados sobreel sustrato tindalizado.

Estas observaciones sobre el efecto de Bacilluscomo RPCV de manera acentuada en el

Figura 10. Crecimiento de parte aérea de plántulas de tomate crecidas sobre sustrato tindalizado ysin inocular (Bacillus -) e inoculadas con B. subtilis (Bacillus +). Letras distintas entre tratamientosindican diferencias significativas (p<0,05) / Growth of the aerial part of tomato seedlings grown on

tindalized substratum without inoculation (Bacillus -) or inoculated with B. subtilis (Bacillus +).Different letters between treatments indicate significant differences (p<0.05)

Figura 11. Crecimiento de raíces de plántulas de tomate crecidas sobre sustrato tindalizado y sininocular (Bacillus -) e inoculadas con B. subtilis (Bacillus +). Letras distintas entre tratamientos

indican diferencias significativas (p<0,05) / Root growth of tomato seedlings grown on tindalizedsubstratum without inoculation (Bacillus -) or inoculated with B. subtilis (Bacillus +). Different letters

between treatments indicate significant differences (p<0.05)

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tratamiento con sustrato empobrecido, podríadeberse a la ausencia de una microbiota quedisminuya el desarrollo de Bacillus en el suelo, aladquirir esta bacteria dominancia como promotordel crecimiento.

La aplicación de biopelículas de origenmicrobiano, como inoculante de semillas, seríauna herramienta tecnológica efectiva y novedosaa los inoculantes líquidos convencionales, debidoa que la matriz que forma la misma le permitiríaa la bacteria adaptarse a las nuevas condicionesambientales y favorecer, de este modo, lasupervivencia de la bacteria. Esta innovación enlos métodos de inoculación de RPCV se alineacon el desarrollo de una agricultura sustentable,que aumente los rendimientos de los cultivos, sinprovocar los problemas ambientales vinculadoscon los fertilizantes químicos.

CONCLUSIONESEn este trabajo se propone utilizar como

biofertilizante la biopelícula desarrollada porBacillus subtilis subsp. spizizenii. Lascondiciones nutricionales óptimas para sudesarrollo fue el medio de cultivo líquido papaglucosado debido a que en este medio se obtuvouna cantidad adecuada de biopelícula y a su vezla misma mostró ser resistente a la degradación através del tiempo.

En el estadio de plantín del tomate, laaplicación de Bacillus como RPCV fue exitosocuando se utilizó un sustrato tindalizado; sinembargo, el hecho de no encontrar el mismoefecto cuando se utilizó un sustrato fértil podríaexplicarse teniendo en cuenta que en el sustratofértil los procesos de competencia entre la propiamicrobiota y los microorganismos queconstituyen la biopelícula requieren de mayorestiempos adaptativos para que Bacillus desarrollesu acción como promotora del crecimientovegetal. La microbiota presente en un suelo fértilpodría, en un principio, generar relaciones decompetencia con las bacterias RPCV, en este casoBacillus subtilis subsp. spizizenii, por lo que seríaadecuado, en estudios futuros, evaluar losparámetros de biomasa aérea y radicular luego deun periodo más prolongado del ciclo de vida delvegetal.

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Los autores de este trabajo declaran no presentar conflicto de intereses.Este artículo se encuentra bajo licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional(CC BY-NC 4.0)

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