Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos...

Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas,residuos de fungicidas y cinéticas de degradación

Munitz, Martín Sebastián2013 02 15

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Industrias

Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos de fungicidas y cinéticas de degradación.

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial.

Martín Sebastián Munitz Director de tesis: Silvia Liliana Resnik Consejero de Estudios: Stella Maris Alzamora Lugar de trabajo: Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias de la Alimentación, Universidad Nacional de Entre Ríos, Monseñor Tavella 1450, Concordia, Entre Ríos. Fundación de Investigaciones Científicas Teresa Benedicta de la Cruz, Dorronzoro 141, Luján, Buenos Aires. Buenos Aires, 2012

Arándanos: micoflora contaminante; micotoxinas; residuos de fungicidas y cinéticas de degradación

Los arándanos son susceptibles a enfermedades fúngicas y a contaminación por

micotoxinas, y esta es la razón de las aplicaciones de fungicidas. Estas contaminaciones

pueden tener repercusiones en los rendimientos productivos y crear dificultades a la

exportación. Los objetivos fueron identificar los hongos causantes de las enfermedades de

arándanos en la Región de Salto Grande, Entre Ríos, una de las principales áreas de

producción y exportación de arándanos en Argentina, y su capacidad para generar toxinas,

y la cinética de degradación de azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil y

pyraclostrobin, así como su ocurrencia en productos de arándanos.

Varias especies fúngicas, algunas con la capacidad de producción de micotoxinas,

se han identificado por primera vez en los arándanos.

Las metodologías desarrolladas para la cuantificación de los fungicidas fueron

precisas y exactas. La degradación siguió una cinética de primer orden, ajustando mediante

un modelo exponencial, con valores de R2 mayores a 0,96.

La distribución de los pesticidas durante la elaboración de jugo de arándano

reduciría más del 25% de fungicidas si se eliminan el agua de lavado y escaldado. Los

productos de arándano han tenido elevada ocurrencia de los pesticidas, probablemente por

el uso de la fruta de descarte para su elaboración.

Palabras claves: arándanos – contaminación fúngica – micotoxinas – fungicidas – cinética

de degradación

Blueberries: contaminant mycoflora; mycotoxins; fungicides

residues and degradation kinetics

Blueberries are susceptible to fungal diseases and mycotoxin contaminations, and

this is the reason of fungicide applications. These contaminations may impact on

productive yields and make export difficulties. The objectives were to identify fungi that

cause blueberry diseases in the Salto Grande Region, Entre Ríos, one of the main

production areas and exportation of blueberries in Argentina, and its ability to generate

toxins, and the kinetics of degradation of azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil

and pyraclostrobin, as well as their occurrence in blueberry products.

Several fungal species, some of them with mycotoxins production capacity, have

been identified for the first time in blueberries.

The developed methodologies for the quantification of the fungicides were precise

and accurate. Degradation followed a first order kinetics, fitting using an exponential

model, with R2 values higher than 0,96.

The distribution of pesticides during the elaboration of blueberry juice would reduce

more than 25% of fungicides if are eliminated the washing and blanching water. Blueberry

products have had high occurrence of pesticides, probably for the use of scrap fruit for their

elaboration.

Key words: blueberries – fungal contamination – mycotoxins – fungicides – degradation

kinetics

AGRADECIMIENTOS

Debo mucho a muchos y lo agradezco infinitamente. Los que a continuación

menciono son especiales por su ejemplo y apoyo:

Dra Silvia Resnik, gran ser humano y profesional. Incondicional. Su guía

científica hizo posible este trabajo.

Dra Marisa Montti, al brindarme la oportunidad de trabajar en su

laboratorio y su acompañamiento permanente.

A la Facultad de Ciencias de la Alimentación de la Universidad Nacional de

Entre Ríos y a su Rector Ing. Jorge Gerard, que me permitió acceder a una

beca para realizar mi Doctorado.

A la Fundación Teresa Benedicta de La Cruz y a su Directora Dra Ana

Pacín, por los análisis de micotoxinas.

Dra Stella Alzamora, por su calidez y apoyo a lo largo de mi doctorado.

Al D r Lucas González por su aporte en el trabajo relacionado a la

identificación de microorganismos.

A Paula y Carolina del laboratorio MICA de la UBA por los trabajos que

llevamos a cabo juntos.

A Marcela, Analía y Paula por su colaboración.

A las empresas arandaneras Blueberries S.A. e Integrity de la ciudad de

Concordia, Entre Ríos, en las personas: Nicolás Cutro, Darío Azcarate,

Gastón Otamendi, al contribuir con la materia prima, arándanos, sin la

cual esta tesis no hubiera sido posible.

Mucho más que sólo colegas: Fabricio, Silvia, Bibi, Gladys, Celia y Micaela

A Julieta y Martín Bof por su aguante, a Susana y Manuel, mis padres, y a

Iriel, mi hermana.

A las que están ARRIBA: mi abuela Betty y mi compañera de primeros

pasos en este trabajo: María Rosa Chaulet.

I

INDICE

I. OBJETIVOS 1

II. INTRODUCCIÓN 2 II.1. Generalidades de arándanos 2 II.2. Propiedades del arándano 3 II.3. Comercialización 5 II.3.1. Breve reseña histórica y situación mundial 5 II.3.2. El cultivo del arándano en Argentina 6 II.4. Características generales del cultivo 8 II.4.1. Fertilización y tratamiento del suelo 8 II.4.2. Heladas 11 II.4.3. Cosecha 12 II.5. Tratamiento postcosecha de arándanos 13 II.5.1. Empaque de arándanos 13 II.5.2. Refrigeración 16 II.5.3. Aplicación de atmósferas modificadas y controladas 17 II.5.4. Bromurado 17 II.6. Alimentos elaborados con arándanos 18 II.6.1. Jugo de arándano 18 II.6.2. Néctares 21 II.6.3. Pasas de arándano 22 II.6.4. Otros 22 II.7. Enfermedades de los arándanos 22 II.7.1. Podredumbre por Alternaria 24 II.7.2. Podredumbre gris 24 II.7.3. Antracnosis 25 II.7.4. Roya 26 II.7.5. Momificación de arándanos (Mummy berry) 26 II.8. Micotoxinas 27 II.8.1. Clasificación de las micotoxinas 28 II.8.2. Principales micotoxinas 29

II

II.8.2.1. Aflatoxinas 29 II.8.2.2. Fumonisinas 32 II.8.2.3. Ocratoxina A 36 II.8.2.4. Tricotecenos 37 II.8.2.5. Zearalenona 40

II.9. Calidad del arándano para exportación 41 II.10. Manejo integrado de plagas 43 II.10.1. Pesticidas agrícolas 44 II.10.2. Formulaciones 46 II.10.3. Formas de acción 47 II.10.4. Evaluación toxicológica 48 II.10.5. Propiedades fisicoquímicas de los pesticidas 49

II.10.5.1. Volatilización 49 II.10.5.2. Solubilidad 50 II.10.5.3. Coeficiente de adsorción de carbono orgánico (Koc) 50 II.10.5.4. Coeficiente de Partición Octanol/Agua (Kow) 50 II.10.5.5. Propiedades ácido – base 51

II.10.6. Períodos de carencia y limite máximo de residuos 51 II.11. Evolución de los residuos de pesticidas en el tejido vegetal 52 II.11.1. Depósito de pesticidas 53 II.11.2. Eliminación progresiva de los residuos 54

II.11.2.1. Crecimiento del sustrato vegetal. Eliminación aparente 54 II.11.2.2. Tipo de aplicación y formulación 55 II.11.2.3. Causas mecánicas y físicas 55 II.11.2.4. Degradación química 55

II.11.3. Curvas de disipación o persistencia 56 II.11.3.1. Tiempo de vida media 58

II.12. Fungicidas aplicados en la Región de Salto Grande 59 II.12.1. Boscalid 59 II.12.2. Pyraclostrobin 60 II.12.3. Fludioxonil 62 II.12.4. Cyprodinil 63 II.12.5. Azoxystrobin 65 II.13. Metodología analítica 66

III

III. MATERIALES Y MÉTODOS 162

III.1. Plan de muestreo 162 III.1.1. Muestreo de arándanos en campo 162 III.1.2. Muestreo de arándanos envasados 164 III.1.3. Muestreo de productos elaborados con arándanos 165 III.2. Micoflora 165 III.2.1. Aislamiento de la micoflora contaminante 165

III.2.1.1. Equipos y medios de cultivo para el aislamiento 165 III.2.1.2. Procedimiento para el aislamiento de la micoflora contaminante

166

III.2.2. Identificación de la micoflora contaminante 167 III.2.2.1. Equipos y medios para la identificación 167 III.2.2.2. Procedimiento para la identificación de la micoflora contaminante

169

III.2.2.3. Identificación de los aislados de Fusarium 171 III.2.2.3.1. Desarrollo de los aislados en medio Agar hoja de Clavel (CLA)

171

III.2.2.3.2. Desarrollo de los aislados en Agar hoja de Clavel con cloruro de potasio (CLA-KCl)

172

III.2.2.4. Identificación de los aislados de Aspergillus y Penicillium 172 III.2.2.5. Identificación de aislados de otros géneros 173

III.3. Capacidad toxicogénica 173 III.3.1. Medios de cultivo, reactivos y equipamiento para la determinación de la capacidad toxicogénica

173

III.3.1.1. Medios de cultivo para la determinación 173 III.3.1.2. Reactivos, columnas y estándares para la determinación 174 III.3.1.3. Equipamiento para la determinación 176

III.3.2. Procedimiento para la determinación de capacidad toxicogénica 177 III.3.2.1. Determinación de aflatoxina y zearalenona 178 III.3.2.2. Determinación de fumonisinas 179 III.3.2.3. Determinación de ocratoxina A 180 III.3.2.4. Determinación de tricotecenos 181

III.4. Pesticidas 181 III.4.1. Reactivos, estándares y equipamiento para el análisis 181 III.4.2. Puesta a punto de la metodología 184 III.4.3. Preparación de las muestras 185 III.4.4. Metodología de extracción 186 III.4.5. Determinación cromatográfica 186

IV

III.4.5.1. Determinación por ECD 186

III.4.5.2. Determinación por NPD 187 III.4.6. Diseño experimental para el estudio de cinéticas de degradación 187 III.4.7. Determinación del tamaño de los arándanos 188 III.4.8. Elaboración de jugo de arándano y comportamiento de los pesticidas en el proceso

188

III.5. Análisis estadístico 189 III.5.1. Expresión de los resultados y métodos estadísticos 189

III.5.1.1. Frecuencia de aislamiento y densidad relativa de géneros y especies

189

III.5.1.2. Test asintótico para igualdad de proporciones 190 III.5.1.2.1. Definición de valor p 192

III.5.1.3. Test exacto de Fisher 192 III.5.1.4. Análisis unidimensional y regresión lineal 193 III.5.1.5. Comparación de líneas de regresión 194

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 195

IV.1. Flora fúngica contaminante de los arándanos 195 IV.1.1. Géneros 195 IV.1.2. Identificación de especies fúngicas 200 IV.1.3. Frecuencia de aislación y densidad relativa de las especies aisladas 208 IV.1.4. Hongos potencialmente productores de toxinas 214 IV.2. Capacidad toxicogénica 216 IV.3. Pesticidas 224 IV.3.1. Validación de la metodología analítica 224

IV.3.1.1. Selección del polímero y pH de extracción 224 IV.3.1.1.1. Azoxistrobin, boscalid y pyraclostrobin 224 IV.3.1.1.2. Fludioxonil y cyprodinil 231

IV.3.1.2. Velocidad de agitación 235 IV.3.1.2.1. Azoxistrobin, boscalid y pyraclostrobin 235 IV.3.1.2.2. Fludioxonil y cyprodinil 236

IV.3.1.3. Modo de extracción 238 IV.3.1.4. Perfil de tiempos de extracción 238 IV.3.1.5. Tiempo y temperatura de desorción 242 IV.3.1.6. Análisis unidimensional y regresión lineal 248

IV.3.1.6.1. Curvas de calibración con estándares 250 IV.3.1.6.2. Curvas de calibración con matriz adicionada 254 IV.3.1.6.3. Comparación de rectas de regresión 258

V

IV.3.1.6.4. Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) 260 IV.3.1.6.5. Exactitud del método 261

IV.3.2 Curvas de degradación 263 IV.3.2.1. Productos técnicos 263 IV.3.2.2. Azoxistrobin 264 IV.3.2.3. Boscalid 267 IV.3.2.4. Pyraclostrobin 271 IV.3.2.5. Cyprodinil 274 IV.3.2.6. Fludioxonil 277

IV.3.3. Elaboración de jugo de arándano 280 IV.3.3.1. Balance de materia etapa por etapa 281 IV.3.3.2. Balance para los distintos fungicidas estudiados 282

IV.3.4. Ocurrencia de pesticidas en muestras comerciales 285 IV.3.4.1. Arándanos para consumo 285 IV.3.4.2. Jugos de arándano y complejos vitamínicos 288

V. CONCLUSIONES 291 VI. REFERENCIA BIBLIOGRÁFÍCA 294 VII. ANEXO 326

1

I. OBJETIVOS

Los arándanos son altamente susceptibles a enfermedades fúngicas y a

contaminación por micotoxinas, es por ello que la utilización de fungicidas es una

práctica común en los cultivos de esta fruta. Estas contaminaciones impactan por un

lado en el rendimiento productivo, y por otro dificultan las exportaciones, si no se

cumple con los requerimientos de calidad de los países importadores.

Se plantean como objetivos generales de la presente tesis doctoral, en primer

lugar, identificar los hongos causantes de las enfermedades de los arándanos y su

capacidad para generar toxinas, en la Región de Salto Grande, que es una de las

mayores áreas productivas y exportadoras de arándanos de Argentina. En segundo

lugar, la cinética de degradación de los pesticidas que se aplican localmente, y la

ocurrencia de los mismos en productos elaborados a partir de arándanos.

Los objetivos específicos son:

Identificar la micoflora presente en las variedades de arándanos cultivadas en la

Región de Salto Grande, provincia de Entre Ríos.

Determinar la capacidad de producir micotoxinas por las cepas aisladas en el

campo.

Desarrollar y validar metodologías analíticas para la cuantificación de los

pesticidas utilizados en Concordia, Entre Ríos, en el cultivo de arándanos.

Determinar la cinética de degradación de pesticidas en el campo.

Estudiar la influencia de las distintas etapas del proceso de elaboración de jugo

de arándano en el contenido final de pesticidas.

Evaluar la ocurrencia de los pesticidas en estudio en muestras comerciales de

arándanos y productos elaborados con esta materia prima.

2

II. INTRODUCCIÓN

II.1. Generalidades de arándanos

Los arándanos son pequeñas bayas esféricas de 7 a 25 mm de color azul claro a

oscuro, que contienen pequeñas semillas y presentan un sabor agridulce muy

característico. Provienen de plantas florales de la familia Ericaceae, género Vaccinium

(Corrêa Antunes y col., 2008). Los nombres recibidos por la fruta en distintos idiomas

son: blueberry en inglés, bleuet en francés, mirtillo en italiano y portugués, y

heidelberre en alemán.

Las especies encontradas comunmente son las que se detallan en la tabla II.1:

Tabla II.1: Especies comunes de arándano

Nombre científico Nombre vulgar Tipo de cultivo

Vaccinium corymbosum Arándano alto (“Highbush”) Cultivado

Vaccinium angustifolium Arándano bajo (“Lowbush”) Silvestre

Vaccinium ashei Arándano ojo de conejo Cultivado

El arándano alto es la especie de mayor difusión en nuestro país, si bien la de ojo

de conejo ha ganado popularidad en los últimos años, por su tolerancia a valores de pH

ácidos del suelo, mayor resistencia a las sequías, mayor producción de fruta e

incremento en la conservación postcosecha.

El interés por el cultivo de arándanos en la zona de influencia de la región de

Salto Grande, provincia de Entre Ríos, es una alternativa que comenzó a explotarse

comercialmente hace pocos años, debido a las condiciones agroecológicas de la zona, la

posibilidad de llevar adelante una diversificación en la oferta exportable, con la ventaja

comparativa de la contraestación para la exportación en fresco, principalmente al

hemisferio norte. En la provincia de Entre Ríos las principales variedades cultivadas,

que pertenecen al “arándano alto”, son Misty, Emerald, Jewel y O`Neal, con cualidades

nutritivas y contenido apreciable de antioxidantes.

Los arándanos son frutas climatéricas, es decir que continúan con su proceso de

maduración si una vez que alcanzada su madurez fisiológica, son arrancados de la

planta. Cuando llegan a la madurez fisiológica, comienzan a sufrir numerosos cambios

3

de color, firmeza y sabor, lo que se conoce como maduración organoléptica, y es la

responsable de que sean atractivos para el consumo.

Sin embargo, una vez alcanzado el estado de máxima calidad (color, sabor y

textura), sobreviene rápidamente el de sobre madurez o senescencia, asociado a un

excesivo ablandamiento, pérdida de sabor y de color. Para evitar este deterioro de la

fruta, surgen numerosas técnicas de postcosecha como el enfriamiento, almacenamiento

en atmósferas controladas, etc.

Estas bayas poseen una tasa de producción de etileno baja de 0,1 a 1,0 ml/kg x h

a 5°C, con una vida promedio de postcosecha que oscila entre 10 y 18 días cuando se

utilizan condiciones óptimas de conservación (Cantwell, 2001; Gamage y Shafuir

Rahman, 2003; Mitcham y col., 2007). Duarte y col. (2009) informaron de períodos de

conservación mayores a 24 días.

Generalmente, para la conservación se emplean temperaturas de -0,5 a 0°C,

humedades relativas de 90 a 95%, y atmósferas controladas con 2 a 5% O2 y 12 a 20%

CO2 (Leyte y Forney, 1999a, b; Cantwell, 2001; Gorris y Peppelenbos, 2003; Kader,

2007). Las bayas son susceptibles a la pérdida de agua, lo que lleva al arrugamiento de

la fruta y a su pérdida de brillo (Chiabrando y Giacalone, 2011). Para minimizar este

problema, la humedad relativa se debe mantener en lo valores mencionados

anteriormente, tanto en el almacenamiento como en el entorno de la fruta, siempre bajo

temperaturas óptimas de 0±0,5°C (Leyte y Forney, 1999b; Mitcham y col., 2007).

El mercado estadounidense tiene exigencias particulares referidas al tratamiento

de los arándanos. Los mismos deben ser tratados con bromuro de metileno previo a la

exportación, principalmente para controlar plagas cuarentenarias como la mosca de la

fruta.

II. 2. Propiedades del arándano

Numerosos estudios han informado que el arándano presenta propiedades

beneficiosas para la salud. Se utiliza para el tratamiento de infecciones urinarias, ya que

ciertos componentes de la fruta inhiben el crecimiento de bacterias como Escherichia

coli, principal causa de cistitis, entre otras (Ofek y col., 1991; Frontela y col., 2010).

Las antocianinas y otros compuestos fenólicos son componentes característicos

de este tipo de frutas (Del Río y col., 2010). No sólo imparten un color característico,

sino también, propiedades antioxidantes (Heinonen y col., 1998; Azevedo y col., 2010;

4

Fu y col., 2011). Los beneficios terapéuticos de estos compuestos incluyen protección

antioxidante y mantenimiento de la integridad del ADN (Bagchi y col., 2004). Las

antocianinas han sido mencionadas también como agentes antiinflamatorios,

anticancerígenos y antimutagénicos, y protectores cardiovasculares (Bagchi y col.,

2004; Olsson y col., 2004; Yi y col., 2006; Lau y col., 2007; McDougall y col., 2008;

Seeram, 2008; Huntley, 2009; Aiyer y Gupta, 2010; Basu y col., 2010a, b). Según Grace

y col. (2009), los extractos de antocianinas provenientes de los arándanos poseen

propiedades hipoglucémicas, que se podrían utilizar en el tratamiento de la diabetes.

Otros estudios han mostrado evidencias de que dietas ricas en arándanos y otras

bayas, con alto contenido en antocianinas, son efectivas para prevenir y/o revertir

enfermedades neuronales degenerativas, relacionadas con la edad, como ser el mal de

Parkinson, Alzheimer, problemas motrices, etc., y estrés oxidativo (Joseph y col., 1999;

Galli y col., 2002; Joseph y col., 2005; Lau y col., 2005; Galli y col., 2006; Lau y col.,

2007; Shukitt-Hale y col., 2008; Willis y col., 2009; Krikorian y col., 2010).

En la tabla II.2 se detalla el contenido nutricional de estas frutas:

Tabla II.2: Factores nutricionales del arándano fresco�

Composición Nutricional del Arándano cada 142 g Calorías 100,00 Kcal Zinc 0,16 mg Proteínas 0,97 g Cobre 0,09 mg

Grasas 1,00 g Manganeso 0,41 mg Carbohidratos 20,50 g Vitamina C 18,90 mg

Fibra 3,00 g Tiamina 0,07 mg Calcio 9,00 mg Riboflavina 0,07 mg Hierro 0,24 mg Niacina 0,52 mg

Magnesio 7,00 mg Ácido pantoténico 0,13 mg Fósforo 15,00 mg Vitamina B6 0,05 mg Potasio 129,00 mg Ácido fólico 9,30 mg Sodio 9,00 mg Vitamnia A 145,00 IU

Fuente: NRAES (2010)

La “Food and Drug Administration” (FDA) lo cataloga como un alimento entre

bajo y libre de grasas y sodio, libre de colesterol y rico en fibras y vitamina C.

5

II.3. Comercialización

II.3.1. Breve reseña histórica y situación mundial

Para realizar esta reseña histórica se sintetizaron conceptos vertidos por la

página Arándanos Argentinos (2010). Los arándanos silvestres “lowbush blueberry”

han constituido una parte importante de la dieta de la fauna y aborígenes nativos

norteamericanos, desde épocas inmemorables, según lo informado por los exploradores

Lewis y Clark. Los europeos lo desconocían, razón por la cual, su consumo comenzó

recién a principios del siglo XIX.

En 1830 se iniciaron pruebas experimentales transplantando plantaciones

silvestres, y en 1893, Antón Gass comenzó en Michigan una de las más grandes

plantaciones, hasta ese momento.

La primer comerciante de arándanos conocida, fue Elizabeth White, quien

comenzó a comprar plantas de alta producción de origen silvestre. Logró colectar una

importante cantidad de variedades, comenzando con ellas una investigación privada, de

la cual concluyó que estas plantas necesitaban un suelo ácido de muy buen drenaje y

que su polinización se hacia con insectos; además, innovó una técnica de multiplicación

asexual. Esta información fue la base para las siguientes investigaciones. El botánico

Frederick Coville, quien pertenecía al departamento de agricultura de Estados Unidos,

comenzó su trabajo en conjunto con la señora White, quien le permitió convertir su

granja en una estación experimental, que a su vez era de carácter comercial. Estos

experimentos dieron como resultado que en 1960 el número de variedades atribuidas a

Coville rondaban las 30, algunas de las cuales aún se continúan cultivando.

Actualmente la investigación en Norteamérica incluye prácticas de cultivo para zonas

específicas en donde se han podido reducir las enfermedades, los ataques de insectos y

disminuir el estrés de algunas plantas provocado por temperaturas extremas,

inundaciones y heladas.

Los arándanos se introdujeron en America del Sur en la década del 80 para

evaluar su potencial como cultivo en las distintas regiones. En 1993, Chile contaba con

tan sólo 580 hectáreas plantadas, y muy pocas reportadas en Argentina. Desde ese

momento, el crecimiento de las hectáreas plantadas en ambos países se incrementó

rápidamente. En la cosecha 2003/2004 el país transandino contaba con alrededor de

2500 ha, exportando aproximadamente 9700 tn de fruta; mientras que nuestro país

poseía 1200 ha y exportaba 900 tn. Este rápido incremento del área plantada y de los

6

volúmenes vendidos se debió principalmente a los buenos precios de la fruta que se

comercializaban a países del hemisferio norte en contraestación, y a una mayor

demanda mundial de estas bayas (Bañados, 2006; Corrêa Antunes y col., 2008).

Estados Unidos es el principal productor, consumidor, exportador e importador

de arándanos del mundo, y junto con Canadá abarcan el 90% del área productiva total,

seguida por Chile, Argentina, Nueva Zelanda, Australia y Sudáfrica. En Europa los

principales productores son Francia, Holanda, Alemania, Polonia y España. Los

principales compradores de estas frutas son Japón, Italia, Inglaterra, Bélgica y Holanda.

Canadá es el principal proveedor de fruta congelada, pero a diferencia de su vecino

norteamericano, la producción canadiense es en su mayoría silvestre. La ventaja de la

producción de Chile y Argentina es que pueden suministrar arándanos a los países del

hemisferio norte en contraestación, es decir, cuando ellos se encuentran en estación

invernal y no pueden abastecerse con su propia producción (Corrêa Antunes y col.,

2008; Dansa, 2008; Molina y col., 2010).

II.3.2. El cultivo del arándano en Argentina

En el país hay plantadas más de 5000 ha de arándanos (Molina y col., 2010). Las

principales provincias productoras de arándanos son Entre Ríos, Tucumán y Buenos

Aires, con iniciativas en San Luis, Río Negro, Mendoza, Salta, Catamarca y San Juan.

En la provincia de Entre Ríos, las plantaciones se centran principalmente en la ciudad

de Concordia y alrededores (Región de Salto Grande), abarcando aproximadamente el

50% de la producción nacional (Bruzone, 2010), seguido por Federación y

Gualeguaychú,. En los últimos tiempos se manifestó un crecimiento del cultivo a lo

largo del corredor Zárate – Baradero – San Pedro en la provincia de Buenos Aires, con

aproximadamente 1300 ha plantadas, ubicándose en segundo lugar después de Entre

Ríos con plantaciones de más de 1500 ha (Ros, 2005; Bruzone, 2007; Molina y col.,

2010). Otras ciudades bonaerenses que cuentan con este cultivo son Mercedes, Sierra de

los Padres, Tandil, entre otras. La zona de pedemonte en Tucumán, genera cerca del 9%

de la producción nacional (Bruzone, 2007).

En 2009 - 2010 las exportaciones de arándanos fueron similares a las

correspondientes al período anterior, equivalente a 10400 tn. Los principales destinos

fueron Estados Unidos (66%), Reino Unido (20%), registrándose una merma del 30%

en las ventas a la Unión Europea (Santillán, 2009; Bruzone, 2010).

7

Debido a problemas climáticos sucedidos durante el 2009, la temporada 2009 -

2010, finalizó con una producción similar a la campaña anterior, con alrededor de

12000 tn cosechadas. Mucha fruta quedó sin cosechar, y ese remanente se destinó al

mercado interno para industria y gastronomía (Bruzone, 2010). En el caso de

Concordia, la reducción en el volumen cosechado fue del 30% como consecuencia de

las lluvias y los fuertes vientos registrados. Además, hubo un efecto negativo sobre la

calidad de la producción (Bruzone, 2010).

Argentina actualmente ocupa el segundo lugar como exportador del hemisferio

sur, detrás de Chile, y aporta el 2% de la producción mundial.

El consumo interno de estas bayas no está muy evolucionado en nuestro país, si

bien existe una tendencia creciente, debido principalmente a la mayor concientización

de la población sobre el consumo de productos naturales con propiedades beneficiosas

para la salud, como es el caso de los arándanos. Éstos pueden encontrarse en

supermercados como productos frescos en bandejas plásticas denominadas “clamshells”

de 125 g cada una. Por otro lado, el sector gastronómico y el industrial cada vez

demandan más esta fruta para incorporarla en sus productos.

En la figura II.1 se observa un esquema aproximado del calendario anual de la

producción primaria.

Figura II.1: Calendario anual de la producción primaria

En el esquema puede apreciarse que la época de cosecha suele extenderse desde

septiembre a enero. Debido a las grandes heladas que afectaron a toda la región de Salto

Grande y que produjeron daños, muchas veces irreversibles en las plantaciones, los

productores esperan que la cosecha 2012 termine a mediados de diciembre.

8

II.4. Características generales del cultivo

II.4.1. Fertilización y tratamiento del suelo

Las plantas de arándanos son arbustos originarios del norte de Norteamérica,

regiones con clima frío y suelos muy ácidos, livianos y turbosos. Se puede adaptar a

diferentes condiciones climáticas (Lavado, 2006).

El rango de pH del suelo debe oscilar entre 4 y 5,5, siendo el valor óptimo entre

4,5 y 4,8. Estos valores provocan la inhibición de las bacterias nitrificadoras presentes

en el suelo, por lo que los mismos son pobres en nitratos. Debido a esto, las plantas no

presentan capacidad de absorción de nitratos. Lavado (2006) no recomienda su adición

a este cultivo, pues no se podrían absorber provocando además un incremento en el pH.

Por otro lado, las plantas se ven obligadas a adecuar su sistema radicular y

asociarse con ciertos hongos llamados “micorrizas” para mejorar su capacidad de

absorción de nutrientes.

Los lotes utilizados para la obtención de la fruta empleada en el desarrollo de la

presente tesis, se encuentran ubicados sobre terrazas antiguas de erosión del río

Uruguay, con suelos arenosos, relieve suavemente ondulado y pendientes largas.

Una descripción detallada de las principales características de los suelos de la

región de interés se resumen de la siguiente manera (Lavado, 2006; Rivadeneira, 2012):

Serie Yuquerí Chico: Son suelos arenosos a areno francos, rojizos, sobre

materiales arcillo-arenosos rojizos, encontrados a una profundidad de 65 a 85 cm,

generalmente con cantos rodados. Son suelos bien drenados a algo excesivamente

drenados, escurrimiento superficial moderado. Su permeabilidad es moderada, muy

rápida en los horizontes superficiales y moderadamente lentos en los materiales sub-

superficiales. Constan de una napa freática profunda. Son suelos con un leve peligro de

erosión.

Serie Yuquerí Grande: Son suelos muy arenosos, poseen más del 80% de esta

fracción mineral, de característico color rojizo o rojo amarillento que yacen sobre

materiales más arcillosos que se encuentran a más de 120 cm de profundidad, siendo

común encontrarlos también hasta 200 cm de profundidad. En algunos casos

constituyen verdaderos médanos. Son suelos bien a excesivamente drenados, y

escurrimiento superficial moderado. Su permeabilidad es moderada, con una napa

freática profunda. Presentan peligro de erosión.

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Serie Puerto Yeruá: Son suelos imperfectamente drenados, franco-arenosos a

areno-franco sobre materiales muy densos y poco permeables, franco-arcillo-arenosos a

arcillo-arenosos. Están desarrollados sobre materiales arcillosos lacustres, removidos y

mezclados con una capa de material fluvial franco-arenoso más reciente. Presentan

suaves ondulaciones, generalmente con pendientes de 1 - 2%. Son suelos

moderadamente bien drenados, con escurrimiento superficial moderado. Su

permeabilidad es rápida en los horizontes superficiales y muy lenta en los sub-

superficiales, con una napa freática profunda. Presentan leve peligro a la erosión.

Estas características corresponderían a suelos arenosos rojizos que comprenden

las series Yuquerí Chico y Yuquerí Grande, y suelos arenosos pardos que comprenden

la serie Puerto Yeruá.

El uso de fertilizantes promueve el rápido crecimiento en plantas jóvenes para

que lleguen a su madurez en el mejor estado, y una vez que el tamaño fue alcanzado, el

objetivo primario es maximizar el rendimiento de los frutos y su calidad (INTA, 2012).

Este proceso se debe llevar a cabo tanto en el período de implantación como en

el de producción. En el primero, se debe utilizar un fertilizante rico en fósforo, que

permita un adecuado crecimiento del sistema radical. El segundo se realiza en varias

etapas para asegurar los requerimientos del crecimiento y desarrollo del cultivo

(Lavado, 2006). La mayor parte de las aplicaciones se realizan a través del riego y

mediante pulverizaciones foliares. En la figura II.1 puede apreciarse que la aplicación

de fertilizantes se lleva a cabo a lo largo de prácticamente todo el año. Sin embargo, el

arándano presenta requerimientos bajos de nutrientes, por lo que el uso excesivo de los

mismos puede afectar negativamente a estas plantas (Lavado, 2006).

Lo que se detalla a continuación es el resumen de las prácticas comunes

realizadas en campos de la región de Salto Grande, recolectadas a través de entrevistas

personales con encargados de campos arandaneros e ingenieros agrónomos.

Debido a las exigencias de oxígeno, las plantaciones se realizan sobre

montículos de tierra denominados camellones de aproximadamente 20 cm de altura y

1,20 m de ancho (Figura II.2). Este movimiento de tierra facilita el drenaje, evitando la

saturación con agua del sitio de plantación que provocaría la asfixia radicular. Los camellones

10

están separados entre sí una distancia de alrededor de 3,5 m. Las plantas tienen una

distancia promedio de 1 m entre ellas.

Sobre el camellón se aplica una cobertura orgánica o “mulch” compuesta por aserrín,

corteza y hojas de pino. El origen de la corteza y aserrín de pino provienen del residuo de la

industria maderera, mientras que las hojas o pinochas se recogen directamente de las

plantaciones de pino. Estos materiales no emanan olores molestos. Las funciones del “mulch”

son:

• Ayudar a mantener un correcto balance hídrico en la planta.

• Realizar control de la maleza.

• Modificar la temperatura del suelo y reducir las fluctuaciones térmicas en el mismo.

• Ayuda a mantener una estructura porosa.

• Mantener un pH constante.

• Promover una distribución uniforme de las raíces.

Figura II.2: Camellones en plantaciones de arándanos

Entre los camellones se mantiene la cobertura vegetal natural para evitar la formación

de polvo que pueda adherirse a los frutos. En los lomos se instala un sistema de riego

artificial por goteo (Figura II.3), con tuberias de 16 mm y con goteos cada 30 cm, con

caudales adecuados para satisfacer las necesidades hídricas y de nutrientes mediante la

fertirrigación (fertilización a través del sistema de riego).

11

Figura II.3: Sistema de riego por goteo

II.4.2. Heladas

Las heladas son la causa de importantes pérdidas en la agricultura, dependiendo

de su intensidad, duración y fase fenológica del cultivo. El riesgo se incrementa ante la

posibilidad de que el fenómeno se produzca fuera de la época invernal. Las “heladas

tardías” afectan a los brotes tiernos o floraciones, siendo su control, de suma

importancia para el productor arandanero (Entrevistas, 2010).

El agua del interior de las células y de los espacios intercelulares es la que sufre

constantes cambios de estado de líquido a sólido cuando la temperatura externa es

suficientemente baja. El cambio de estado genera la formación de cristales grandes que

dan lugar a la ruptura de los tejidos. Se pueden producir además necrosis o quemado de

los mismos, cuando la temperatura alcanza los -2°C (Molina y col., 2010).

Una forma práctica, común en la mayoría de los campos arandaneros, para evitar

el efecto nocivo de las heladas es la aspersión de agua, de manera que sea ésta la que se

congele sobre la superficie de las plantas y no el agua intra e intercelular (Figura II.4).

Otra técnica empleada para combatirla es la generación de humo desde la madrugada

anterior (Entrevistas, 2010; Molina y col., 2010).

12

Figura II.4: Sistema antihelada en plantaciones de arándanos

II.4.3. Cosecha

Si bien son frutas climatéricas, deben cosecharse parcial o totalmente maduras

ya que de lo contrario no logran desarrollar el sabor deseado (Mitcham y col., 2007).

Cuando su destino es el mercado en fresco casi siempre se cosechan a mano,

mientras que aquellas frutas destinadas al procesamiento se pueden cosechar

mecánicamente. La capacidad para resistir el daño durante las operaciones de cosecha

varía considerablemente entre las variedades. Las frutas de algunas variedades deben ser

recolectadas tan pronto como cambian al azul oscuro, pero hay otras variedades que no

están maduras aun cuando hallan cambiado al azul oscuro. Estas frutas deben ser

recolectadas después que desarrollen un buen sabor, pero mientras se mantengan

suficientemente firmes para una adecuada comercialización (Mitcham y Mitchell,

2007).

La cosecha manual tiene numerosas ventajas frente a la mecanizada para el caso

puntual del arándano. Debido a que estas frutas presentan un amplio rango de grados de

madurez y requieren ser cosechadas varias veces, la gente puede determinar con

exactitud la calidad del producto y seleccionar la madurez adecuada. Los trabajadores

bien entrenados pueden cosechar las bayas con rapidez, sin dañarlas (Gamage y Shafuir

Rahman, 2003; Thompson, 2007).

Las bandejas empleadas para la recolección de arándanos se observan en la

figura II.5.

13

Figura II.5: Bandejas para recolección de arándanos en el campo

II.5. Tratamiento postcosecha de arándanos

II.5.1. Empaque de arándanos

El empaque de arándanos para exportación en la Región de Salto Grande, tiene

como objetivo principal asegurar y resguardar la calidad de la fruta, manteniendo sus

características y propiedades naturales. Para lograr esto, se llevan a cabo procesos de

clasificación por tamaños, selección y envasado, en concordancia con los

requerimientos y parámetros establecidos por el mercado internacional.

La fruta fresca llegada del campo se pesa en la sala de recepción, y se envía a

cámara de pre-refrigeración, en espera de su empaque. El día en que se lleva a cabo el

proceso, según la orden de producción, se pesa la fruta por remito y variedad para el

control de peso pre-proceso.

La sala de empaque se encuentra separada por una cortina sanitaria de cloruro

de polivinilo (PVC) que no permite la contaminación cruzada entre salas.

La secuencia de empaque se detalla a continuación, y puede también ser

apreciada en la figura II.6:

La fruta se vuelca manualmente en una cinta transportadora de inicio. Esta

abastece las diferentes líneas de clasificación a través de separadores de

cangilones, que permiten que se eleve la fruta. En cada línea existen clasificadoras

por tamaño fijas, que descartan aquellas bayas de tamaño no comercializable para

el mercado internacional.

Las que continúan en la línea pasan por mesas de clasificación, donde el personal

puede eliminar la fruta de calidad de industria.

14

La fruta descartada por las clasificadoras por tamaño o por el personal, se conduce

por cintas transportadoras hacia el área de descarte, en donde se pesa y se paletiza,

destinándola luego a la industria.

La fruta elegida para exportación circula por la línea hacia una clasificadora por

tamaño variable, la cual separa en distintas líneas según el tamaño, en chico,

mediano y grande, desembocando en las maquinas envasadoras. La definición del

tamaño depende del cliente y de la variedad de arándano, siendo, para la variedad

Emerald por ejemplo: chico (<15 mm), mediano (15 a 20 mm) y grande (>20

mm).

Las máquinas envasadoras fraccionan la fruta y la disponen en cestillas de PET

(polietilentereftalato) reciclables denominadas "clamshells" de 125 g, que se

agrupan de a 12 en bandejas de cartón corrugado (1,5 kg). Finalmente estas

bandejas se agrupan de a 40 en masters (cajas) de poliestireno expandido con capa

de aluminio.

A continuación se transportan a través de cintas transportadoras hacia donde se

imprime el código de trazabilidad.

Los estibadores realizan el paletizado, mientras que otro operario coloca los

esquineros, los flejes, y una vez completo el pallet, se realiza el ajuste de flejes y

se pega la tarjeta de identificación.

Los pallets se transportan a cámaras con temperaturas de 10ºC hasta el momento

de su despacho.

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Figura II.6: Diagrama de flujo de la cadena productiva del arándano

Cosecha Transporte

Balanza Recepción

Empaque

Volcado

Selección y Clasificación

Cámara de pre-enfriamiento

Descarte a Industria

Envasado y paletizado

Despacho

Puerto

Clientes

Balanza para pesada pre-proceso

Aeropuerto

Bromurado, Refrigeración, Atmósferas modificadas o controladas

Clientes

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A lo largo de la línea de empaque se realiza un muestreo aleatorio,

representativo, para que sea analizado en el laboratorio de control de calidad. El

muestreo es estratificado, es decir, que consiste en subdividir imaginariamente el lote en

forma horizontal, de manera de obtener varias partes, o sublotes. Luego de cada una de

las partes formadas, se extrae una muestra al azar, cuyo tamaño dependerá del tamaño

del sublote, pero que en general, debe ser superior al 3% del tamaño del lote. Con todas

las pequeñas muestras obtenidas, se obtiene la muestra final, que será representativa de

ese lote. Este procedimiento se lleva a cabo con una frecuencia de una hora.

II.5.2. Refrigeración

La refrigeración es una de las técnicas de conservación de alimentos más antigua

y utilizada en el mundo para reducir el deterioro postcosecha de frutas y hortalizas

frescas (Gamage y Shafuir Rahman, 2003). Al disminuir la temperatura se genera una

reducción de la tasa respiratoria con lo cual se retrasa el comienzo de la senescencia del

vegetal, además de minimizar el deterioro microbiológico.

Estas bayas deben refrigerarse hasta alcanzar temperaturas próximas a las de

conservación dentro de las 4 horas desde el momento de la cosecha, reduciendo al

mínimo la pérdida de calidad (Entrevista, 2010).

Dentro de las técnicas de enfriamiento normalmente utilizadas en los empaques

de fruta fresca, para el caso del arándano, no se aconseja la utilización de agua debido a

que al humedecer las bayas se facilitaría el ataque microbiano. Por otro lado, el

enfriamiento en cámaras frigoríficas tampoco sería útil debido a la ineficiencia del

sistema para reducir la temperatura de la pulpa de la fruta en poco tiempo. Por estos

motivos, se recomienda la refrigeración con un sistema de aire forzado, donde una

corriente de aire frío se hace pasar a través de los envases, impulsado por ventiladores o

forzadores de aire ubicados en uno de los extremos de la carga (Leyte y Forney, 1999b).

Mientras que por aire forzado se logra bajar la temperatura de la pulpa desde 20 - 25°C

hasta 1,5°C en 2 hs, se requieren 48 hs utilizando una cámara convencional (Yommi y

Godoy, 2002).

Las pérdidas de postcosecha se pueden disminuir notoriamente si se reduce la

temperatura a los valores óptimos que oscilan entre -0,5 y 0°C (Cantwell, 2001;

Mitcham y col., 2007). La temperatura baja debe mantenerse inclusive durante la etapa

de transporte de los frutos. En estas condiciones la tasa respiratoria disminuye,

permitiendo retrasar el comienzo de la senescencia.

17

II.5.3. Aplicación de atmósferas modificadas y controladas

En las atmósferas modificadas (AM) o controladas (AC) se eliminan o añaden

gases para crear una composición atmosférica alrededor del producto que difiera de

aquella del aire, que es de aproximadamente 78% de N2, 21% de O2, y 0,03% de CO2

(Madrid y col., 1994). Usualmente esto involucra la reducción de oxígeno y/o la

elevación de las concentraciones de dióxido de carbono (Leyte y Forney, 1999a). Las

AM y AC solamente difieren en el grado de control, la AC es más exacta (Brody, 1996).

El uso de la atmósfera modificada en el empaque y durante el transporte, con un

15 a 20% de dióxido de carbono, y un 5 a 10% de oxígeno, reduce el crecimiento de

Botrytis cinerea y otros microorganismos, y reduce la tasa de respiración y el

ablandamiento, extendiendo así su vida postcosecha (Prange y col., 1995; Kader, 2007;

Mitcham y col., 2007).

Si bien las temperaturas bajas son esenciales, la combinación con atmósferas

ricas en CO2 y pobres en O2, ayuda a prolongar el período de conservación. El uso de

estas técnicas de conservación debe considerarse como un complemento de la

temperatura y humedad relativa apropiadas (Kader, 2007).

Por otra parte, concentraciones de O2 menores al 1,5% producen fermentaciones

de la fruta con aparición de olores desagradables. El CO2 protege además a las bayas del

ataque microbiano, principalmente de hongos causales de podredumbres postcosecha.

Sin embargo, cuando la concentración de este gas supera el 25% se generan olores

desagradables como consecuencia de la respiración anaeróbica, el metabolismo

fermentativo (Prange y col., 1995; Kader, 2007), y el pardeamiento del epicarpio

(Mitcham y col., 2007).

II.5.4. Bromurado

El bromuro de metilo se utiliza como tratamiento postcosecha de arándanos,

principalmente de aquellos que se exportan a Estados Unidos. Se trata de un biocida que

permite controlar eficientemente hongos, bacterias, virus, insectos, etc. Es un producto

químico muy efectivo que se airea en forma rápida. Sus desventajas son la elevada

toxicidad para el hombre y la destrucción de la capa de ozono, motivos por los cuales,

se están realizando investigaciones para poder reemplazarlo (Valeiro, 2008).

Principalmente se emplea para el control de plagas cuarentenarias como por

ejemplo Ceratitis capitata y Anastrepha fraterculus, mosca de la fruta, (Molina y col.,

18

2010). El bromurado consiste en una fumigación con el principio activo a una

temperatura de la pulpa de 21°C durante tres horas y media, con posterior aireación y

enfriamiento hasta 0,5 – 1°C. Para mantener las temperaturas durante el transporte, se

colocan geles y/o mantas térmicas, y se cierra el palet (Zapata y col., 2010).

II.6. Alimentos elaborados con arándanos

Actualmente se genera, de la producción de arándanos en nuestro país, un

descarte de aproximadamente el 10% de fruta (por tamaño, falta o exceso de

maduración, etc.) y se estima que este porcentaje irá en aumento por la lógica saturación

de los mercados que aumentaran sus exigencias, alcanzando como mínimo 4500 – 6000

tn/año de fruta a la que hay que buscarle mercados alternativos. Algunos de ellos son la

transformación de la fruta por proceso de deshidratación en pasas de arándanos, la

elaboración de jugos, mermeladas y bebidas alcohólicas, entre otros (Almenar y col.,

2007; Oliveira de Moraes, 2007; Barba y col., 2011; Chiabrando y Giacalone, 2011).

II.6.1. Jugo de arándano

De todos los procesos tecnológicos que involucran al arándano, la elaboración

de jugo, es actualmente el principal a nivel industrial en Argentina. Es una herramienta

importante para buscar una alternativa comercial a la fruta de descarte y enriquecer la

dieta de los consumidores (Heinonen y col., 1998; Joseph y col., 1999; Galli y col.,

2002; Bagchi y col., 2004; Olsson y col., 2004; Joseph y col., 2005; Lau y col., 2005;

Galli y col., 2006; Yi y col., 2006; Lau y col., 2007; McDougall y col., 2008; Seeram,

2008; Shukitt-Hale y col., 2008; Huntley, 2009; Willis y col., 2009; Aiyer y Gupta,

2010; Azevedo y col., 2010; Basu y col., 2010a, b; Krikorian y col., 2010; Fu y col.,

2011).

Existen muchas diferencias con respecto al procesamiento de arándano para la

elaboración de jugo, principalmente en los equipos y condiciones de operación

empleados en el proceso. Sin embargo, se puede reconocer un lineamiento general

(Arthey y Ashurst, 1996; Stewart, 2005).

La fruta proveniente del campo, una vez alcanzada su madurez comercial,

generalmente se somete a un congelamiento mediante un sistema de IQF

(congelamiento rápido individual) y posteriormente se almacena entre -50°C y -23°C

para evitar su deterioro microbiano, sensorial y nutricional. Llegado el momento de

19

comenzar el proceso de elaboración, la fruta se descongela hasta alcanzar 5°C

aproximadamente (Skrede y col., 2000; Lee y col., 2002; Rossi y col., 2003; Brambilla

y col., 2008). Este descongelamiento parcial lleva aproximadamente 12 hs (Rossi y col.,

2003). Una vez alcanzada la temperatura deseada y previa a la trituración de la fruta,

algunos investigadores proponen realizar un proceso de escaldado o sulfitado para

favorecer la inactivación de enzimas, principalmente de la polifenoloxidasa, causantes

de la destrucción de antocianinas y otros compuestos fenólicos de importancia para la

calidad y valor nutricional del producto terminado. El tratamiento térmico también

incrementaría la permeabilidad de las células del pericarpio de la fruta con lo que

ayudaría a la extracción de antocianinas y flavonoles. El escaldado se realiza a 85°C

durante 3 min en túneles donde se inyecta vapor y luego se enfría con agua (Rossi y

col., 2003; Brambilla y col., 2008). Otra posibilidad, según Lee y col. (2002), es realizar

el escaldado a 95°C durante 2 min y luego enfriar rápidamente hasta 38°C. Este mismo

autor experimentó también un proceso de sulfitado (100 ppm SO2) en lugar del

tratamiento térmico, para lo cual adicionó metabisulfito de potasio en dos etapas, la

primera antes de la trituración y la segunda luego de la misma.

A continuación se lleva a cabo la trituración de la fruta pudiéndose emplear para

ello distinta clase de equipamiento, aunque aquellos comunmente usados en la industria

son los molinos de rodillos o cuchillas. Sólo se requiere una suave trituración en

comparación con otras frutas. Una vez que se realizó la reducción del tamaño de la fruta

se procede a la despectinización, para lo cual la materia prima se coloca en recipientes

de acero inoxidable y se le adicionan enzimas comerciales. La concentración de

enzimas a agregar, la temperatura óptima de trabajo, así como el tiempo de proceso,

dependerá del pool comercial empleado. Por ejemplo, Brambilla y col. (2008) trabajan

con 0,7 g/kg de enzima a temperatura ambiente durante 1 hora. En cambio, Skrede y

col. (2000) utilizan 8 ml de una solución (1:10, v/v en agua) a 43°C durante 2 hs.

Para verificar que el proceso de despectinizado fue completo, sin importar cuáles

fueron las condiciones de operación, se realiza la prueba de precipitación con alcohol.

Si presentan precipitados se debe a que aún quedan pectinas sin hidrolizar, las cuales

son insolubles en alcohol.

Una vez completada la despectinización se procede a la extracción del jugo en

una etapa de prensado. En la misma se pueden utilizar por ejemplo filtros prensa de

bolsa con o sin el agregado de coadyuvantes, como cáscara de arroz. En la figura II.7 Se

puede observar un diagrama de flujo del proceso descripto. En general, cuando se

20

utilizan coadyuvantes, las presiones de prensado pueden ser menores y rondarían las 5

atmósferas (Skrede y col., 2000; Lee y col., 2002). En caso contrario alcanzarían valores

de aproximadamente 8,7 atmósferas (Rossi y col., 2003; Brambilla y col., 2008).

Figura II.7: Diagrama de flujo del proceso de elaboración de jugo de arándano

21

Los rendimientos de extracción dependen mucho de las condiciones de

operación y fundamentalmente de la variedad de arándano, debido a que poseen distinto

contenido de agua, sólidos solubles, etc. Mientras que en algunas variedades el jugo se

puede extraer más fácilmente, inclusive por sólo presionar la fruta con los dedos, en

otras es más dificultoso. Los rendimientos de extracción por lo general oscilan entre 75

y 83%.

La etapa siguiente en el proceso de elaboración es la pasteurización mediante un

sistema de HTST (alta temperatura – corto tiempo), por ejemplo 90°C durante 1 minuto.

Una vez finalizada la misma, el jugo puede ser filtrado y embotellado para ser

comercializado como jugo de arándano directamente en las góndolas de los

supermercados. Sin embargo, muchas industrias comercializan jugo concentrado, que se

obtiene mediante una concentración del mismo, desde los 15°Brix iniciales hasta

aproximadamente 74°Brix.

II.6.2. Néctares

Los néctares siempre han sido populares en Europa y otros países del mundo,

pero han ganado gran aceptación en la última década también en Estados Unidos

(Stewart, 2005).

La diferencia entre un néctar y un jugo clarificado es que este último debe estar

libre de partículas en suspensión y turbidez. Los néctares son dispersiones estables con

una proporción significativa de pulpa no disuelta en la solución viscosa. Este producto

contiene una cierta cantidad de partículas en suspensión, de las cuales la pectina es la

más importante. Usualmente en la fabricación de néctares se suelen agregar

endulzantes, ácidos proveniente de la fruta y estabilizantes.

En la producción de néctares la fruta se hace pasar a través de un “finisher” para

lograr la dispersión de todas las partículas de la fruta y eliminar las semillas y otras

partes de la fruta, dejando un producto homogéneo y estable. Las etapas claves para

fabricar un buen néctar son el triturado y la homogeinización, asegurando con ellas un

“cloud” o dispersión estable. La eliminación de gases del néctar mediante el desaereado

ayuda a estabilizar el jugo y prevenir el “off-flavor” y la degradación del color (Arthey

y Ashurst, 1996).

Los jugos pulposos pueden prepararse empleando enzimas que destruyen la

estructura intercelular de las protopectinas, lo que deja a la pectina en estado coloidal,

que es lo importante en este tipo de sistema de polidispersión. En el caso de utilizar

22

preparados enzimáticos, se debe posteriormente realizar un tratamiento térmico para

inactivar las enzimas. Si la viscosidad y estabilidad de la dispersión no son los

adecuados, se agregan coloides hidrofílicos o estabilizantes al néctar (Arthey y Ashurst,

1996; Stewart, 2005).

II.6.3. Pasas de arándano

La producción de pasas de arándanos es una alternativa viable para el

aprovechamiento del descarte de los empaques. Se podría utilizar un secadero sencillo

instalado en la propia finca de los productores, ya que la deshidratación se puede

realizar a temperaturas de aproximadamente 105°C con corrientes de aire forzado para

reducir los tiempos de proceso. El producto final debe contener una humedad menor al

25% según el Código Alimentario Argentino. En los casos en que las pasas se envasen

herméticamente, se permite un contenido de humedad de hasta 35%.

II.6.4. Otros

Los arándanos suelen utilizarse también en la fabricación de vinos, licores,

dulces, mermeladas, te saborizado, pulpas, complementos dietarios, y para enriquecer

productos tales como barras de cereales, yogures, etc. (Cinbas y Yazici, 2008).

II.7. Enfermedades de los arándanos

Los nutrientes presentes en los arándanos, combinados con una actividad acuosa

óptima y valores ácidos de pH, hacen que esta fruta sea particularmente susceptible al

deterioro fúngico (Almenar y col., 2007). Las enfermedades fúngicas que afectan tanto

a la planta como a los frutos, junto con el ataque de insectos, representan las principales

causas de pérdida en la producción de arándanos pre y postcosecha (Cline, 1997; Ellis y

col., 2004; Ellis y Nita, 2008), lo que se traduce en una reducción en términos

económicos.

Si bien las principales enfermedades fúngicas se generan postcosecha y durante

el almacenamiento, el grado de deterioro estará directamente relacionado con las

condiciones de precosecha, los potenciales inóculos y el almacenamiento de las frutas

(Cappellini y col., 1972).

Las podredumbres más significativas encontradas a nivel mundial, y los

patógenos de mayor incidencia descriptos son: podredumbre por Alternaria, generada

23

principalmente por Alternaria tenuissima (Cappellini y col., 1972; Smith y col., 1996;

Cline, 1997; Wright y col., 2004; Luan y col., 2007; Wright y col., 2008a, c; Rivera y

col., 2009), podredumbre gris por Botrytis cinerea (Cappellini y col., 1972; Cappellini y

Ceponis, 1977; Cappellini y col., 1983; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Smith,

1998; Tournas y Katsoudas, 2005; Vásquez y col., 2007; Wright y col., 2008a, c; Rivera

y col., 2009), antracnosis por Colletotrichum gloeosporioides (telemórfica: Glomerella

cingulata) y Colletotrichum acutatum (Cappellini y col., 1972; Hartung y col., 1981;

Daykin y Milholland, 1984; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Cline, 1997; Guerber y

Correll, 1997; Wright y col., 1998, 2008a; Barrau y col., 2001; Polashock y col., 2005;

Verma y col., 2006, 2007; Yoshida y col., 2007; Wharton y Schilder, 2008; Rivera y

col., 2009), podredumbre blanda por Phomopsis vaccinii (Smith y col., 1996; Cline,

1997; Gabler y col., 2004), momificación de bayas por Monilinia vaccinii-corymbosi o

Sclerotinia vaccinii-corymbosi (Cline, 1997; Lehman y Oudemans, 1997, 2000;

Lehman y col., 2007; Scherm y Copes, 1999; Copes y col., 2001; Cox y Scherm, 2001a,

b, c; Scherm y col., 2001, 2004; Ngugi y col., 2002a, b; Ngugi y Scherm, 2004; Penman

y Annis, 2005; Wharton y Schilder, 2005; Tamowski y col., 2008) y especies de los

géneros Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma y Mucor (Cappellini y col.,

1972; Cappellini y Ceponis, 1977; Smith y col., 1996; Cline, 1997; Wright y col.,

2008a, c; Wright, 2009).

En Argentina, los principales agentes responsables del deterioro del arándano en

el cultivo han sido identificados como Alternaria tenuissima (Wright y col., 2004,

2008a, c; Rivera y col., 2009); Botrytis cinerea (Vásquez y col., 2007; Wright y col.,

2008a, c; Rivera y col., 2009); Dothichiza caroliniana (Baino y col., 2007);

Pucciniastrum vaccinii (Dal Bello y Perelló, 1998; Wright y col., 2008c; Rivera y col.,

2009); Pestalotiopsis guepini (Wright y col., 1998, 2008c; Rivera y col., 2009);

Colletotrichum gloeosporioides (Wright y col., 1998, 2008a; Rivera y col., 2009);

Nigrospora sphaerica (Wright y col., 2008b); Bipolaris cynodontis (Rivera y col., 2009;

Sisterna y col., 2009); y Fusarium solani (Pérez y col., 2007). Rivera y col. (2009)

describieron otras enfermedades producidas por Rhizoctonia solani, Botryosphaeria

spp., Fusicoccum spp., Dothiorella spp., Phomopsis spp., Nigrospora sacchari,

Cylindrocladium spp., Curvularia spp., Phoma spp., Phytophthora spp., Rhizopus

stolonifer, Aspergillus spp., Penicillium spp., y Trichoderma spp.

En los ítems siguientes se describen las enfermedades fúngicas más prevalentes.

24

II.7.1. Podredumbre por Alternaria

El hongo responsable es principalmente Alternaria tenuissima (Cline, 1997). Es

una de las enfermedades más comunes en el arándano y sus daños son de importancia.

Los hongos del género Alternaria producen manchas foliares de forma y tamaño

variables, dispersas en la lámina o comenzando por el ápice o por los bordes. Pueden

aparecer sobre ambas caras de las hojas y abarcar gran parte de las mismas. También

producen atizonamiento y cancros en tallos y pudrición de frutos en pre y post cosecha

(Rivera y col., 2009). Se genera el hundimiento de la fruta cerca del cáliz tal como lo

muestra la figura II.8.

Figura II.8: Arándano contaminado con Alternaria

La superficie afectada suele cubrirse con una masa de esporas negro grisáceas.

Las frutas tienden a rajarse, aparecen manchas oscuras, reblandecimiento y pudrición.

La diseminación se produce por el viento, lluvia, etc. (Cline, 1997).

Es necesario refrigerar lo más rápido posible, realizando un adecuado control de

temperatura y humedad durante el almacenamiento.

II.7.2. Podredumbre gris �

Botrytis cinérea produce manchas y muerte del tallo, manchas foliares pardas,

irregulares que no respetan las nervaduras, podredumbres de flores y frutas en pre y

postcosecha. En las flores genera manchas castañas en los pétalos, pudiendo

desprenderse los pedúnculos florales quedando el racimo prácticamente sin frutas. Los

órganos afectados se cubren de un moho grisáceo. En las frutas se observan manchas

oscuras, reblandecimiento y pudrición (Rivera y col., 2009).

Este hongo aún sigue creciendo a 0°C, sin embargo el crecimiento a esta

temperatura es muy lento (Mitcham y col., 2007). Por estos motivos se recomienda, al

igual que en el caso anterior, refrigerar los frutos lo más rápido posible después de la

cosecha.

25

En la figura II.9 puede apreciarse un arándano contaminado con Botrytis

cinerea.

Figura II.9: Arándano contaminado con Botrytis cinerea

II.7.3. Antracnosis

Glomerella cingulata es el nombre que recibe el hongo cuando se encuentra en

su estado de reproducción sexual (teleomorfo), mientras que en el estado asexual

(anamorfo) se conoce como Colletotrichum gloeosporioides (Smith y col., 1996).

El hongo mencionado anteriormente, y Colletotrichum acutatum producen

antracnosis, generando pudriciones blandas, con una tonalidad levemente bronceada,

donde las bayas se ven cubiertas por exudados de color salmón. Estos microorganismos

suelen afectar no sólo a los frutos, sino también a flores y hojas. Dan lugar a

atizonamiento de flores, las que adquieren una coloración que va de marrón a negra. En

las hojas producen manchas café pequeñas, circulares e irregulares (Cline, 1997;

Gutiérrez, 2010). También causan tizón y cancro en tallos (Rivera y col., 2009).

La diseminación de la enfermedad se produce por el traslado de las esporas del

hongo de una planta enferma a otra sana, mediante la lluvia y el riego durante la

floración y desarrollo de frutos.

Como medidas preventivas se recomienda evitar el riego excesivo, refrigerar las

bayas de forma inmediata una vez recolectadas (Gutiérrez, 2010).

En la figura II.10 se observan frutos afectados por la enfermedad:

Figura II.10: Arándano con antracnosis

26

II.7.4. Roya

Esta enfermedad es producida por Pucciniastrum vaccinii. Este hongo es

altamente específico y ataca tanto hojas como frutos de arándano (Hong, 2005). La

infección se produce al trasladar el viento las esporas provenientes de plantas enfermas

hacia aquellas sanas. Cuando las condiciones ambientales son las propicias, se produce

la germinación de estas esporas y la penetración a través de estomas y lenticelas.

Se presenta como manchas foliares cloróticas que posteriormente se tornan

necróticas, junto con la aparición de pústulas amarillo anaranjadas, en la cara inferior de

la hoja. Esto se corresponde con manchas castaño rojizas en la cara superior de las

mismas. Si el ataque es severo, se produce una desfoliación prematura, lo que afecta el

rendimiento de la cosecha siguiente (Rivera y col., 2009).

En las frutas se observan manchas púrpura rojizas principalmente alrededor del

cáliz. Los frutos muestran pústulas amarillas como puede apreciarse en la figura II.11.

Figura II.11: Arándano con roya

II.7.5. Momificación de arándanos (Mummy berry)

Molininia vaccinii-corymbosi (Sclerotinia vaccinii-corymbosi) es el causante de

esta enfermedad. Ataca tanto frutos como hojas, causando importantes pérdidas. Como

primer paso, el hongo genera atizonamiento de brotes y hojas, con manchas color café

en la nervadura central. Se aprecian esporas de color grisáceas. Los frutos maduros se

observan momificados, grises, arrugados, duros y suelen caer prematuramente (Figura

II.12).

La infección primaria se produce por la germinación de esclerocios (masa

compacta de micelio) que dan lugar a la aparición de apotecios con ascosporas que

producen la infección en tallos y hojas. Posteriormente se diseminan los conidios por el

viento e insectos infectando las flores (Gutiérrez, 2010).

27

Figura II.12: Arándano contaminado con Molininia vaccinii-corymbosi

II.8. Micotoxinas

El término "micotoxina" combina la palabra griega "micos", que significa hongo,

y la palabra latina "toxicum", que significa veneno. Las micotoxinas son metabolitos

secundarios producidos por algunos hongos, que pueden ser encontrados principalmente

en vegetales, alimentos y forrajes. Los géneros más importantes que presentan especies

productoras de toxinas incluyen Alternaria, Aspergillius, Fusarium y Penicillium. Una

especie puede producir más de una toxina y cepas provenientes de distintos géneros

pueden producir las mismas toxinas. (FAO, 2003).

Como las micotoxinas son contaminantes naturales producidos por hongos y

éstos son ubicuos, el hombre siempre ha estado expuesto a estos compuestos en su

alimentación. Casi todas las micotoxinas son químicamente estables, por lo cual tienden

a sobrevivir el almacenamiento de materias primas y la elaboración de alimentos,

incluyendo procesos como la cocción a temperaturas muy elevadas (JECFA, 2001,

2012). Por esto es importante evitar en lo posible, las condiciones que conducen a la

formación de micotoxinas. No se puede eliminarlas por completo del suministro de

alimentos pues la mayoría provienen de los cultivos.

Es de suma importancia la identificación de contaminantes fúngicos en fruta

fresca, debido a que algunos de estos hongos pueden crecer y producir micotoxinas en

dichos productos (Tournas y Katsoudas, 2005). Una micotoxina se considera

"importante" si se ha demostrado su capacidad para tener efectos considerables sobre la

salud de las personas y la productividad de los animales en diversos países (FAO,

2003).

La presencia de un hongo que se sabe que produce toxinas no supone de manera

automática la presencia de la toxina asociada, ya que en la producción de micotoxinas

28

participan numerosas variables. De la misma manera, la falta de moho visible no

garantiza que el alimento no tenga toxinas, ya que el moho podría haberse eliminado y

dejado intacta la micotoxina.

Según la FAO (2003) y actualizado con JECFA (2008, 2012), las principales

micotoxinas a tener en cuenta, a nivel mundial son las aflatoxinas, la ocratoxina A, los

tricotecenos, zearalenona y las fumonisinas. Sin embargo, no hay que descartar otras

micotoxinas emergentes como las toxinas de Alternaria, beauvericina, citrinina,

patulina, toxinas tremorgénicas, entre otras.

Greco y col. (2012) determinaron la presencia de micotoxinas en arándanos

argentinos, producidas por especies de Alternaria. Por ello en esta tesis no se ha

incluido el estudio de dichas toxinas. Sin embargo, con excepción de este estudio sobre

metabolitos de Alternaria, poco se conoce sobre la capacidad de los hongos

contaminantes del arándano de producir micotoxinas.

II.8.1. Clasificación de las micotoxinas

La imposibilidad de clasificar a estos compuestos en forma simple, ha llevado a

considerar formas de clasificación que consideran aspectos más refinados tales como,

mecanismos moleculares, activación biológica, o estructura química.

De acuerdo con esto, el autor japonés Yoshio Ueno, ha clasificado a las toxinas

más importantes de acuerdo con su afinidad con las organelas celulares, definiendo

entonces, características toxicológicas y transformaciones metabólicas (FAO, 1994).

Según este criterio las micotoxinas se clasifican en:

a. Inhibidores de la producción de energía: actúan inhibiendo la actividad de la

adenosintrifosfatasa (ATPasa), inhibiendo en consecuencia, la fosforilación

oxidativa celular. Ej.: citreoviridinas; luteoskirina, ergocromos, etc.

b. Inhibidores de síntesis de proteínas: actúan inhibiendo el inicio de la síntesis,

tricotecenos tales como verrucarina A, fusarenona-X, nivalenol, etc., o

inhibiendo la elongación y terminación de la proteína, tricotecenos tales como

deoxinivalenol, crotocina, verruvarol, etc. Otras micotoxinas inhiben en forma

competitiva la actividad de la fenilalanil-t RNA sintetasa (Ocratoxina A).

c. Modificadores del citoesqueleto: actúan modificando las funciones de los

microfilamentos y microtúbulos celulares (griseofulvina, citocalasinas,

cloropéptido).

29

d. Micotoxinas estrogénicas: provocan respuestas de crecimiento de masa del útero

y de alteración de los niveles circulantes de hormonas (zearalenona).

e. Generadores de temblor (tremorgénicas): actúan sobre el sistema nervioso

central induciendo temblores generalizados en animales (penitrem A).

f. Micotoxinas cancerígenas: provocan desarrollo de tumores en hígado y en

corteza renal (aflatoxinas, esterigmatocistina).

La clasificación por estructuras químicas similares es la más utilizada

actualmente por los analistas, ya que facilita el desarrollo de metodologías analíticas.

Sin embargo, han quedado varias micotoxinas fuera de esta clasificación, y se agrupan

como toxinas del hongo productor, por ejemplo, toxinas de Fusarium, no mencionadas

en otro grupo con similitud estructural (Cole y Cox, 1981).

II.8.2. Principales micotoxinas

II.8.2.1. Aflatoxinas

Los mohos productores de aflatoxinas están muy extendidos por todo el mundo,

en climas templados, subtropicales y tropicales, y pueden producir aflatoxinas, tanto

antes como después de la cosecha, en numerosos alimentos y piensos, especialmente

semillas oleaginosas, nueces comestibles y cereales.

Las aflatoxinas químicamente corresponden a derivados isocumarínicos y son

producidas por especies pertenecientes al género Aspergillus, donde se destacan

Aspergillus flavus, A. parasiticus y A. nomius (Vaamonde y col., 2003).

La actividad de agua óptima para la proliferación de A. flavus es alta (alrededor

de 0,99). Se ha notificado que A. flavus puede proliferar a temperaturas de 10 a 43°C.

La tasa de crecimiento óptima, hasta 25 mm al día, se produce a una temperatura

ligeramente superior a 30°C. A. flavus produce aflatoxinas en el intervalo de

temperaturas de al menos 15 a 37°C. No es posible especificar una temperatura óptima

para la producción de toxinas, aunque se ha notificado que entre 20 y 30°C la

producción es considerablemente mayor que a temperaturas más altas y más bajas

(Montani y col., 1988; FAO, 2003).

Los efectos de la actividad de agua y la temperatura sobre el comportamiento de

A. parasiticus son similares a los antes descriptos para A. flavus. Según FAO (2003), se

requiere un valor mínimo de actividad acuosa de aproximadamente 0,83 para el

30

crecimiento, y de 0,87 para la producción de aflatoxinas. Se han notificado valores

óptimos para el crecimiento y la producción de toxinas de 30 y 28°C, respectivamente.

Las aflatoxinas más importantes y estudiadas se pueden clasificar en B1, B2, G1,

G2 (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2), según su fluorescencia de color azul o verde en

presencia de luz ultravioleta a 365 nm. Los derivados B2a y G2a se producen cuando se

derivatizan las aflatoxinas B2 y G2 para su cuantificación. En la figura II.13 se pueden

observar las estructuras químicas de las distintas aflatoxinas mencionadas.

Figura II.13: Estructuras químicas de las aflatoxinas

Las principales características y propiedades físicas de estas toxinas se detallan a

continuación:

Aflatoxina B1: 2, 3, 6a �, 9a �-tetrahidro-4-metoxiciclopenta [c] furo [3', 2': 4,5] furo

[2,3-h] [1] benzo-pirano-1,11-diona.

- Forma: cristales

- Punto de fusión: 268–269°C

- Fluorescencia : azul

- UV máx. (etanol): 362 nm

- Peso molecular: 312,0633

- Fórmula molecular: C17 H12 O6

31

Aflatoxina B2: 2, 3, 6a, 8, 9, 9a �-hexadidro-4-metoxiciclopenta [c] furo [3',2': 4,5] furo


- Forma: cristales


- Fluorescencia : azul



- Fórmula molecular: C17H14O6

Aflatoxina G1: 3, 4, 7a, 10a-tetrahidro-5-metoxi-1h, 12h-furo-[3',2': 4,5] furo [2,3-h]-

pirano [3,4c] [1]-benzopirano-1,12-diona.

- Forma: cristales


- Fluorescencia: verde




Aflatoxina G2: 3, 4, 7a, 9, 10, 10a �-hexahidro-5-metoxi-1h, 12h-furo [3',2': 4,5] furo

[2,3-h]-pirano-[3,4c] [1]-benzopirano-1,12-diona.

- Forma: cristales

- Punto de Fusión: 237–240°C

- Fluorescencia : verde




Aflatoxina B2a: 2-hidroxi derivado de B2



Aflatoxina G2a: 2-hidroxi derivado de G2.

- Peso Molecular: 346,0688


32

En general, las aflatoxinas presentan las siguientes características: baja

solubilidad en agua (10–30 �g/ml); solubles en cloroformo, metanol, acetonitrilo (AcN),

acetona; son relativamente inestables al estado de sustancia pura, a la luz y al aire; son

susceptibles a la hidrólisis alcalina y son afectadas al tratarse con amoniaco o con

soluciones de hipoclorito de sodio (pH>10,5); son termorresistentes y estables en un

rango de pH entre 3 y 10.

Las aflatoxinas en general son inmunosopresoras. Actúan sobre las membranas

celulares, inhibiendo el ADN y la síntesis de ARN; y sobre la incorporación de amino

ácidos y fosfolípidos, por lo que alteran el metabolismo de lípidos (Pacin, 2008).

AFB1 es uno de los metabolitos encontrados en la naturaleza que ha probado

mayor potencialidad como agente cancerígeno (Williams y col., 2011). Es además,

mutagénica y tóxica hepática (Pacin, 2008).

II.8.2.2. Fumonisinas

Se considera a diversas especies del género Fusarium como productores por

excelencia de estas toxinas en maíz, entre ellos se destacan, Fusarium verticillioides

(anteriormente conocido como F. moniliforme), F. proliferatum, F. subglutinans, F.

thapsinum, F. anthophilum y F. globosum (Sanchis y col., 1995; Hinojo y col., 2006;

Voss y col., 2007; JECFA, 2012).

El Aspergillus niger, ha sido mencionado como productor de fumonisinas FB2

en los cultivos de hongos, café y en vino; y la FB4 en uvas, vinos y pasas (Frisvad y

col., 2007; Logrieco y col., 2009, 2011; Mogensen y col., 2010; Knudsen y col., 2011).

Fumonisina FB6, junto con FB2 se han determinado en cultivos estacionarios del hongo

A. niger NRRL 326 (Mansson y col., 2010; Varga y col., 2010).

Las principales características de estas micotoxinas se resumen a partir del

último Addendum del JECFA (2012).

La estructura química de las fumonisinas (Figura II.14) indica la existencia de un

gran número de estereoisómeros.

33

Figura II.14: Estructura química de fumonisinas

La fumonisina B1 es el diéster del ácido propano-1,2,3-tricarboxílico y 2S-

amino-12S,16R-dimetil-3S,5R,10R,14S,15R-pentahidroxieicosano en el que los grupos

hidroxi del C14 y C15 son esterificados con el grupo carboxilo terminal del ácido

propano-1,2,3-tricarboxílico; la fumonisina B2 es el análogo desoxi de C10 de

fumonisina B1 en el que los centros estereogénicos correspondientes en la columna

vertebral de eicosano tienen la misma configuración. La FB1 es la forma molecular

predominante producida por F. verticillioides; fumonisina B2 (FB2) y fumonisinas B3

(FB3) son tan activas como FB1 pero aparecen en menor concentración.

Las fumonisinas constituyen un grupo numeroso ya que se han descripto y

caracterizado 28 hasta el año 2002, los que fueron separados en cuatro familias

principales, serie B, C, A y P (Bartók y col., 2010a). Las fumonisinas de la serie B

agrupan las más importantes desde el punto de vista toxicológico FB1, FB2 y FB3. Como

se mencionó FB1 es predominante y usualmente se encuentra en altos niveles. El

cultivo de Fusarium verticicllioides en maíz o en medio líquido permitió identificar que

FB1 constituye el 70-80% del total de los fumonisinas producidas, mientras FB2 entre

15-25 % y FB3 3-8 %.

La serie A de fumonisinas, aisladas de las cultivos de Fusarium verticillioides y

maíz entero, tiene un grupo N-acetil amida en la posición C2. El N-acetil derivado de la

FB1 se lo abrevia como FA1 y el derivado de FB2 como FA2, éstas no presentan

toxicidad.

34

La serie C, ha sido aislada de maíz mohoso, es químicamente similar a la serie

B, excepto que el grupo metilo terminal de C1 falta en las fumonisinas de esta serie.

Se ha demostrado la capacidad de F. verticillioides y F. proliferatum para

producir simultáneamente los análogos de las series de fumonisinas B y fumonisinas C.

Los aislamientos producen 10 veces más análogos de la serie de fumonisinas B que

análogos de la serie C. Además, se ha confirmado que algunas cepas de F. oxysporum

producen análogos de la serie de fumonisinas C.

La serie P de fumonisinas fue aislada de cultivos de F. proliferatum en maíz y

contiene el grupo 3-hidroxipiridinio en la posición C2 de la columna vertebral de las

fumonisinas, en lugar de la amina que se encuentra en la serie de fumonisinas B.

En el año 2006 se detectaron 37 nuevas fumonisinas y fueron agrupadas en su

mayoría en las series anteriores, pero se descubrió una nueva serie denominada FBX

(Bartók y col., 2006, 2008). La serie FBX es esterificada por otros ácidos carboxílicos

diferentes al ácido tricarbálico (oxalsuccinico, cis-aconítico, oxalilfumárico).

Además de la serie B algunos otros análogos pueden ocurrir en el maíz

contaminado naturalmente a bajas concentraciones (<5 % del total de las fumonisinas

presentes); pero se debe tener en cuenta que éstas formas, solo pueden ser detectadas

por cromatografía líquida - espectrometría de masa con ionización por electrospray.

En el 2010 se describieron nuevos compuestos pertenecientes a las fumonisinas,

apolares, por lo tanto se supone que la absorción y toxicidad en los diferentes tejidos de

seres vivos puede ser distinta a los anteriores. Los nuevos compuestos se denominan por

ejemplo para la toxina FB1 esterificada EFB1, y se les ha sugerido los nombres PA EFB1

cuando esta esterificada con ácido palmítico (PA), iso-iso-EFB1 PA, EFB1 LA (ácido

linoleico), la iso-EFB1, EFB1 OA (ácido oleico) e iso-EFB1 OA (Bartók y col., 2010b).

La cantidad total de estos nuevos compuestos se estima componen el 0,1% de la

concentración de FB1.

La toxina FB1 cuenta con 10 centros quirales, por lo tanto teóricamente, pueden

ser producidos 1024 estereoisómeros. Se han aislado ya 28 estereoisómeros de FB1 y los

métodos tradicionales por HPLC y FLD podrían detectar estos estereoisómeros. El

análisis de varios batch de estándares de FB3 obtenidos de distintos lotes de F.

verticillioides ha presentado 10 a 40% del estereoisómero de FB3 (3-epi-FB3).

Mogensen y col. (2009) mostraron que la producción de fumonisinas es

diferente para A. niger en comparación con cepas de Fusarium productoras. Las cepas

de Fusarium prefieren altas actividades acuosas (aw > 0,99) y bajas temperaturas (20-

35

25°C). A. niger prefiere menores aw y mayores temperaturas (25-30°C). La producción

de fumonisinas por A. niger genera la necesidad de estudiar la capacidad de producción

de cepas de esta especie ya que es comúnmente encontrada como contaminante en

numerosos alimentos.

Las fumonisinas debido a que son compuestos fuertemente polares, son solubles

en agua, en mezclas de AcN : agua (1:1, v/v) y muy solubles en metanol, pero nada

solubles en disolventes no polares. La FB1 es la más polar de todas las fumonisinas

(entre FB1, FB2 y FB3); en solventes polares se presenta como zwitterion debido a los

grupos carboxílicos, los cuales tienen cargas positivas y negativas, y también debido a

la presencia de un grupo amino en C1.

Las fumonisinas más estudiadas son la FB1 y la FB2, por lo cual a continuación

se detalla información adicional de las mismas.

Fumonisina B1: 2, 3, 6a �, 9a �-tetrahidro-4-metoxiciclopenta [c] furo [3', 2': 4,5] furo


- Forma: cristales marrón claro


- Fórmula molecular: C34H59NO15

Fumonisina B2: 2, 3, 6a �, 9a �-tetrahidro-4-metoxiciclopenta [c] furo [3', 2': 4,5] furo


- Forma: cristales marrón claro


- Fórmula molecular: C34H59NO14

La exposición a fumonisinas del maíz produce leucoencefalomalacia (ELEM) en

ganado equino y edema pulmonar en ganado porcino. Se han registrado casos de ELEM

en numerosos países, entre ellos los Estados Unidos, Argentina, Brasil, Egipto,

Sudáfrica y China (Giannitti y col., 2011). Estas toxinas producen inmunosupresión y

alteración de la relación esfingocina : esfingonina. Además, existen asociaciones

epidemiológicas que la ingesta de maíz contaminado con fumonisinas sería el precursor

de cáncer esofágico en seres humanos (FAO, 2003; Pacin, 2008).

36

II.8.2.3. Ocratoxina A

La ocratoxina A (OTA) es la más importante y frecuente de un grupo de

compuestos estructuralmente relacionados entre sí. Consiste en un grupo de

dihidroisocumarina derivada de polipéptidos enlazados a través del grupo 12 carboxilo

con la fenilalanina. Existen diversos compuestos análogos de la OTA, como la

ocratoxina B (que difiere de la OTA en estructura por falta del átomo de cloro), la

ocratoxina C y la ocratoxina β. Sin embargo, la OTA es el principal compuesto señalado

como contaminante natural de material vegetal. La contaminación por OTA suele

asociarse a los cereales, las uvas frescas, higos, la fruta seca de la viña, el vino, la

cerveza, el café y el cacao, provocando una exposición crónica por parte de los seres

humanos (Astoreca y col., 2007; Magnoli y col., 2007; Pacin y col., 2008; Ponsone y

col., 2011; Heperkan y col., 2012; Passone y col., 2012). Para el caso de los cereales, la

Unión Europea estableció un nivel máximo de OTA permitido de 5 µg/kg (EC, 2006).

La detección en Europa de la presencia de OTA en productos de cerdo vendidos en

establecimientos minoristas y en sangre de cerdo, ha demostrado que esta toxina puede

pasar de los piensos a los productos de origen animal.

La estructura química de la OTA puede observarse en la figura II.15.

Figura II.15: Estructura química de ocratoxina A

Esta micotoxina es producida por especies pertenecientes a los géneros

Aspergillus y Penicillium. Según el Comité FAO/WHO de Expertos de Aditivos en

Alimentos (JECFA), la OTA es producida por Penicillium verrucosum, Aspergillus

ochraceus y otras cepas de Aspergillus relacionadas, entre las que se destacan A.

carbonarius y A. niger (JECFA, 2008; Ponsone y col., 2011).

A. ochraceus crece más despacio que A. flavus y A. parasiticus, pero puede

crecer con una actividad de agua de sólo 0,79. Se ha comunicado también el crecimiento

37

a temperaturas de 8 a 37°C, y diversas fuentes han señalado valores óptimos de 25 a

31°C. Se produce ocratoxina A, a temperaturas de 15 a 37°C, con una producción

óptima entre 25 y 28°C. P. verrucosum crece a temperaturas de 0 a 31°C y con una

actividad de agua mínima de 0,80. Se produce ocratoxina A en todo el intervalo de

temperaturas. Pueden producirse cantidades considerables de toxinas a temperaturas de

sólo 4°C y con una actividad de agua de sólo 0,86.

La ocratoxina A es una nefrotoxina conocida, carcinógena, teratógena y

posiblemente también genotóxica. Se sabe desde hace mucho tiempo que la OTA es una

fuerte nefrotoxina y carcinógeno renal, y los porcinos son muy sensibles a esta

sustancia. Afecta principalmente los riñones, en los cuales puede producir lesiones

agudas y crónicas, y se ha asociado a la etiología de la nefropatía endémica de los

Balcanes (FAO, 1994, 2003, 2012). La ocurrencia de la nefropatía y tumores uroteliales

en los Balcanes, se ha asociado a la ingesta de alimentos y bebidas contaminados por

OTA (Pacin, 2008). Por el contrario, la ocratoxina B (derivado de la OTA sin cloro) no

es tóxica (FAO, 2012).

II.8.2.4. Tricotecenos

La historia de los tricotecenos se inicia, prácticamente, con la descripción de la

enfermedad denominada ATA (alimentary toxic aleukia), o leucemia tóxica alimentaria,

que causó numerosas muertes en la Unión Republicana Socialista Soviética (URSS) en

la década de los 40’, llegando hasta el 10% de la población en algunas comarcas, en

particular fue devastadora en el distrito de Orenburgo. Por ese entonces, la población

forzada por el hambre durante la segunda Guerra Mundial, utilizó para elaborar el pan,

cereales abandonados en los campos sin cosechar; éstos estaban contaminados por

hongos del género Fusarium. A causa de la ingestión de este pan contaminado, muchas

personas murieron y al principio se pensó que se debía a un agente infeccioso.

Posteriormente, se comprobó que los extractos alcohólicos de los cultivos de Fusarium

aislados de granos mohosos podían reproducir muchos de los síntomas de ATA en

animales de experimentación, incluyendo aquellos de la piel, la garganta y el tracto

gastrointestinal (IPCS, 1990; Jacobsen y col., 1993; Task Force Report, 2003).

En la tabla II.3 se detallan algunas cepas del género Fusarium que pueden

provocar la contaminación de productos alimenticios, para humanos y animales, con

tricotecenos (Tanaka y col., 1988; González y col., 2008, Döll y Dänicke, 2011). Los

principales son deoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV), toxina HT-2, toxina T-2,

38

fusarenona X (FUS X), 3-acetil-deoxinivalenol (3-A-DON), y 15-acetil-deoxinivalenol

(15-A-DON), entre otras.

Tabla II.3: Especies de Fusarium productoras de tricotecenos

Especie de moho Micotoxinas producidas

F. graminearum DON, 3-A-DON, 15-A-DON, NIV, entre otras

F. culmorum DON, 3-A-DON, NIV, toxina T-2, toxina HT-2, entre otras

F. crockwellense (sinónimo: F. cerealis) NIV, FUS X

F. avenaceum FUS X, entre otras

F. poae NIV, FUS X, toxina T-2, toxina HT-2

F. tritinctum Toxina T-2, entre otras

F. proliferatum FUS X, entre otras

F. equiseti Toxina T-2, toxina HT-2, FUS X, entre otras

En el caso de F. graminearum, se ha estimado que la temperatura óptima es de

25°C. La actividad de agua mínima para el crecimiento es 0,88; el límite máximo

notificado es superior a 0,99 (JECFA, 2001; FAO, 2003). Bottalico y Perrone (2002)

han vinculado a F. culmorum, F. avenaceum y F. poae a la producción de tricotecenos

en trigo.

Los tricotecenos pertenecen a un amplio grupo de sesquiterpenos, relacionados

desde el punto de vista estructural. En la figura II.16 se observa la estructura química

básica de los tricotecenos, y en la tabla II.4 las distintas sustituciones que dan lugar a los

diferentes tricotecenos estudiados en esta tesis.

Figura II.16: Estructuras químicas de tricótesenos

39

Tabla II.4: Grupos funcionales que dan origen a los distintos tricotecenos

Toxina R1 R2 R3 R4 R5

T-2 OH OAc OAc H OCOCH2CH(CH3)2

HT-2 OH OH OAc H OCOCH2CH(CH3)2

DON OH H OH OH O

3-A-DON OAc H OH OH O

15-A-DON OH H OAc OH O

NIV OH OH OH OH O

FUS-X OH OAc OH OH O

Las toxinas T-2 y HT-2 son tricotecenos del grupo A, mientras que los restantes

de la tabla II.4 son del tipo B. La diferencia radica en la presencia de un grupo carbonilo

en el C8 en las del grupo B, y en las del tipo A este carbono no está oxidado, está

hidroxilado o esterificado. En contraste, los dos otros grupos existentes, el C y D tienen

menor importancia práctica.

A continuación se describen algunas propiedades fisicoquímicas de interés para

los tricotecenos (JECFA, 2001; Döll y Dänicke, 2011)

DON (12,13-epoxi-3α,7α,15-trihidroxitricotec-9-en-8-ona), C15H20O6, presenta

un peso molecular de 296,32. Cristaliza como agujas incoloras. Es estable a altas

temperaturas (estable a 120°C, y moderadamente estable a 180°C). Es soluble en agua

y en algunos solventes polares como metanol, AcN y acetato de etilo (EAc).

La toxina T-2 (4β,15-diacetoxi-3α,dihidroxi-8α-[3metilbutiril-oxi]-12,13-

epoxitricotecec-9-ona), C24H34O9, presenta un peso molecular de 466,53. Se presenta

como cristales blancos. Tiene un punto de fusión de 152°C. Es soluble en etanol, EAc,

cloroformo y otros solventes orgánicos. Es ligeramente soluble en agua.

La toxina HT-2 (15-acetoxi-3α,4β−dihidroxi-8α-[3metilbutiril-oxi]-12,13-

epoxitricotecec-9-ona), C22H32O8, presenta un peso molecular de 424,5. Es soluble en

etanol, EAc, cloroformo y otros solventes orgánicos. Es ligeramente soluble en agua.

NIV (3,4,7,15-tetrahidroxi-12,13-epoxitricotec-9-en-8-ona), C15H20O7, presenta

un peso molecular de 312,32. Su punto de fusión es de 222°C. Es soluble en solventes

orgánicos.

FUS X (12,13-epoxi-3α,4β,7β,15-tetrahidroxi-tricotec-9-en-8-ona4-acetato),

C17H22O8, presenta un peso molecular de 354,13. Se presenta como cristales

40

transparentes. El punto de fusión es de 92°C. Es soluble en agua, etanol, metanol, EAc y

cloroformo.

3-A-DON (3-(acetiloxi)-12,13-epoxi-3,7-dihidroxi-(3-α,7-α)-tricotec-9-en-8-

ona), C17H22O7, presenta un peso molecular de 338,35.

15-A-DON (15-(acetiloxi)-12,13-epoxi-3,7-dihidroxi-(3-α,7-α)-tricotec-9-en-8-

ona), C17H22O7, presenta un peso molecular de 338,35.

Todos los tricotecenos son inmunosupresores. Los efectos comunes más

prominentes, además del mencionado, para las toxinas T-2 y HT-2 a nivel bioquímico y

celular son: una fuerte inhibición de la síntesis de proteínas por que se unen a los

ribosomas; el efecto inhibitorio de la síntesis de ARN y ADN; el efecto tóxico sobre la

membrana de las células; y la inducción de apoptosis particularmente en tejidos

linfáticos y hematopoyéticos (JECFA, 2001; Resnik y Pacin, 2007).

El DON, tricoteceno del tipo B más estudiado, tiene una acción biológica similar

a las mencionadas para las toxinas del grupo A, pero 100 veces menor que la toxina T-2

(Pacin, 2008).

II.8.2.5. Zearalenona

La zearalenona (ZEA) es una micotoxina estrogénica de distribución amplia,

presente principalmente en el maíz (FAO, 2003).

ZEA es producida por numerosas especies de Fusarium. Si bien, la especie

reportada con mayor frecuencia es F. graminearum (Tanaka y col., 1988, Döll y

Dänicke, 2011), otras especies de dicho género también son capaces de producir este

metabolito tóxico. Según Döll y Dänicke (2011) algunas especies de Fusarium capaces

de generar ZEA son: F. culmorum, F. crockwellense (sinónimo: F. cerealis), F.

avenaceum, F. tritinctum, F. equiseti y F. oxysporum (sinónimo: F. redolens).

La metabolización de la ZEA produce cinco metabolitos, que son zearalanona,

α-zearalanol, β-zearalonol, α-zearalenol y β-zearalenol; donde α-zearalenol es

reconocido como el metabolito más abundante (Ouanes y col., 2005). En la figura II.17

se observa la estructura química de la zearalenona.

41

Figura II.17: Estructuras químicas de zearalenona

Esta toxina está muy relacionada con la generación de problemas reproductivos

(Ouanes y col., 2005). Interatúa compitiendo con el receptor específico de la unión de

estradiol en las células blanco. Estimula la sínesis de ADN, ARN, y proteínas en el

útero y glándulas mamarias. Algunas manifestaciones clínicas observadas en cerdas y

aves son la vulvovaginitis, prolapso de vulva y cloaca (Pacin, 2008).

ZEA (6-(10-hidroxi-6-oxo-trans-1-undecenil)-β-resorciclic lactona ácida),

C18H22O5, presenta un peso molecular de 318,36. Esta toxina es cristalina de color

blanco. Posee un punto de fusión de 165°C. Es insoluble en agua, pero soluble en álcalis

acuosos y en varios solventes orgánicos. Es termoestable.

II.9. Calidad del arándano para exportación

Según Mitcham y col. (2007) y Duarte y col. (2009), los principales indicadores

de calidad de arándanos son: apariencia (color, tamaño, forma y ausencia de defectos),

firmeza, sabor (contenido de sólidos solubles, acidez, compuestos aromáticos) y valor

nutritivo (vitaminas A y C, antocianinas y otros compuestos fenólicos). Otros

parámetros a tener en cuenta están relacionados con la seguridad alimentaria, e incluyen

micotoxinas y residuos de pesticidas.

Entre los procesos que ocurren durante la maduración, el más evidente es el

cambio de color externo, desde el verde al rosa y finalmente al azul. A medida que el

color cambia, se produce un aumento en el contenido de sólidos solubles, y una

disminución de la acidez. También se observa un progresivo ablandamiento de la pulpa,

lo cual constituye una de las principales causas de descarte, pero es dependiente de la

variedad utilizada (Yommi y Godoy, 2002).

Sin embargo, los parámetros generalmente evaluados en los laboratorios de

control de calidad, pertenecientes a empaques que destinan la mayor cantidad de fruta a

la exportación, son: apariencia, peso neto, porcentaje de bloom (cera natural que recubre

42

la fruta), presencia de cabos, grado de madurez, firmeza y tamaño. Además, se registra

el porcentaje de arándanos húmedos, con cicatrices, deteriorados (aplastados, resecos,

machucados, partidos, dañados por pájaros, etc.), contaminados por hongos, entre otros.

De acuerdo a estos análisis, que se realizan siguiendo las recomendaciones del

Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, USDA (Tabla II.5), se le otorgan

puntos a cada lote para luego clasificarlos de acuerdo a su calidad.

Tabla II.5: Estándares de inspección de calidad de arándanos utilizados en empaques

Aspectos Descripción Características Puntos

Apariencia

1. Muy bueno 2. Bueno 3. Aceptable 4. Pobre 5. Malo

Fruta excelente, sin defectos de calidad Fruta buena, pocos defectos de calidad Fruta regular, algunos defectos Fruta pobre, más del 30% de defectos Fruta mala, debe considerarse como descarte

30 25 20 10 0

Bloom 67-100% 33-66% < 33%

Porcentaje de bloom en el clamshell 20 10 0

Cabos

1. Pocos 2. Algunos 3. Presente en la mayoría de la fruta

3 frutas por clamshell 4-8 frutas por clamshell 9 o más frutas por clamshell

_2 -5 -7

Madurez 1. Buena 2. Inmadura 3. Pasada

Presencia de color rojo o verde 10 5 5

Tamaño 1. Grande 2. Medio 3. Pequeño

90-129 frutas por taza (70-100 frutas en 4.4 oz) 130-189 frutas por taza (71-148 frutas en 4.4 oz) 190-250 frutas por taza (149-195 frutas en 4.4 oz)

15 10 5

Firmeza 1. Fruta firme 2. Fruta 3. Fruta blanda

Más del 80% de fruta firme Fruta que no cumple los requisitos de las frutas firmes y blandas Más del 50% de fruta blanda

25 15 2

Húmedos 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave

Hasta 3 frutas por clamshell 4-8 frutas por clamshell 9 o más frutas por clamshell

_5 -10 -15

Deteriorados 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave

Hasta una fruta por clamshell 2 frutas por clamshell 3 o más frutas por clamshell

_8 -13 -18

Hongos 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave

Hasta una fruta cada 2 clamshells 1 fruta por clamshell 2 o más frutas por clamshell

_13 -17 -20

Aplastados 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave

Hasta una fruta cada 2 clamshells 1 fruta por clamshell 2 o más frutas por clamshell

_4 -8

-12

Resecos 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave


_4 -8

-12

Dañados por pájaros

1. Ligero 2. Moderado 3. Grave


_2 -5

-10

Cicatrices 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave


_2 -5

-10

Machucados 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave


_4 -8

-12

Partidos 1. Ligero 2. Moderado 3. Grave


_2 -5

-10

43

De acuerdo a esto, las categorías van desde mala (0 - 29 puntos) hasta muy

buena (más de 95 puntos).

Existen además, límites de contenido máximo de micotxinas en diversos

productos, principalmente toxinas de Fusarium y alfatoxinas B1, G1, B2 y G2 en cereales

y oleaginosas, patulina en productos derivados de manzana y jugos de otras frutas, OTA

en cereales, productos derivados de la industria porcina, vinos y pasas de uvas entre

otros. Sin embargo, algunas legislaciones son generales y se refieren a todo tipo de

productos alimenticios, como es el caso de la legislación española (Real Decreto

47/1988) que comprendería un nivel máximo de aflatoxinas, en arándano y productos

derivados del mismo, de 5 ppb (AFB1) y 10 ppb (para la suma de las cuatro aflatoxinas

antes mencionadas).

Las frutas frescas y los productos elaborados a partir de ellas, como es el caso de

los arándanos y sus subproductos, suelen tener diferentes exigencias legislativas con

respecto a los contaminantes, dependiendo del mercado importador. Esto es así tanto

para el caso de las micotoxinas, como para otros contaminantes como los metales

pesados, tema no incluido en la presente tesis doctoral, y los pesticidas, los cuales serán

tratados en detalle en los puntos siguientes. Debido a esto, conocer la posible presencia

de dichos contaminantes en los arándanos de la Región de Salto Grande, así como las

medidas a tomar para prevenir la contaminación, es una forma de impulsar la

exportación.

II.10. Manejo integrado de plagas

Desde los albores de la civilización el hombre ha luchado continuamente para

mejorar su condición de vida. En su afán por producir las provisiones necesarias de

alimentos, ha combatido los estragos ocasionados por plagas de insectos y por las

enfermedades de las cosechas.

El cultivo de arándanos surge en la Argentina como una nueva alternativa de

producción orientada a la exportación. Las progresivas exigencias de los mercados,

respecto a productos libres o con bajos niveles de plaguicidas, requieren de un adecuado

manejo de la producción. Las enfermedades fúngicas son las principales causales de

pérdidas en los cultivos, y la aplicación de fungicidas son necesarios para su control.

La creciente concientización sobre los peligros de la contaminación ambiental,

que surge de la extensa aplicación de pesticidas químicos, se ve reflejada en el mayor

44

énfasis puesto en la obtención de productos químicos más seguros y selectivos. En

muchos países, estas sustancias deben satisfacer criterios legislativos muy estrictos

antes de ser comercializados en el mercado.

Sin embargo, Schreinemachers y Tipraksa (2012), realizaron un estudio de

comparación sobre el uso de pesticidas entre diversos países del mundo. Sus resultados

muestran que en los últimos años hubo un incremento en la producción de productos

agrícolas, lo que fue acompañado por una mayor utilización de pesticidas. Los países

desarrollados tienden a reducir el uso de insecticidas, aunque se ve un incremento en la

utilización de herbicidas y fungicidas sintéticos. Países en vías de desarrollo, como

Argentina, Brasil, Sudáfrica y Uruguay, muestran un rápido incremento en el uso de

estos compuestos, mientras que la utilización de insecticidas de amplio espectro sigue

siendo elevada.

II.10.1. Pesticidas agrícolas

Un Pesticida Agrícola puede definirse como todo producto químico destinado a

luchar contra los parásitos de animales o vegetales que atacan a los cultivos (Barberá,

1989). Este vocablo se aplica a todas las sustancias empleadas para controlar “pestes”

durante la producción, almacenaje, transporte, comercialización o procesado de

alimentos para el hombre o animales, y también cualquier sustancia que pueda

administrarse a los animales para controlar insectos o arácnidos en sus cuerpos. Sin

embargo, el término pesticida no se aplica a productos empleados en animales con otros

fines tales como antibióticos, estimulantes del crecimiento; así como tampoco a los

fertilizantes (Barberá, 1989).

Se incluyen en esta definición:

- Insecticidas: que luchan contra insectos entre los que se pueden mencionar

pulgones, minadores, taladradores, chupadores, cochinillas, etc.

- Acaricidas: que combaten araña roja, ácaros varios, etc.

- Nematicidas: utilizados contra nemátodos.

- Moluscocidas: destinados a exterminar caracoles y babosas.

- Rodenticidas: empleados contra ratas, ratones y topillos.

- Fungicidas o Anticriptogámicos: actúan sobre hongos causantes de

enfermedades en los cultivos, tales como mildiu, moteado, oidium,

podredumbres, marchitez, royas, etc.

45

- Antibióticos de uso agrícola: utilizados contra las bacteriosis propias de todos

los cultivos.

- Desinfectantes de suelos: cuya acción general se extiende a nemátodos, insectos,

hongos patógenos, malas hierbas, que se encuentran en los suelos destinados a

los cultivos.

- Herbicidas: que se utilizan en la lucha contra malezas, sea de un modo general o

selectivo, es decir, dejando indemne el cultivo y destruyendo todas o buena parte

de las hierbas adventicias.

- Repelentes: alejan los insectos dañinos.

- Atrayentes: que atraen a los insectos dañinos hacia un cebo intoxicado.

- Esterilizantes: que por un sistema similar al anterior provocan la infertilidad de

huevos y puestas en los insectos, o inhiben completamente su mecanismo

sexual.

- Todos los medios artificiales que el hombre es capaz de poner en práctica para

luchar contra plagas y enfermedades.

Los pesticidas agrícolas, considerados en su sentido más extenso, se emplean

sobre los cultivos a través de dos sistemas principales:

a) Empleando el producto químico tal cual, sin formulación alguna.

b) Utilizando el producto químico debidamente acondicionado en un vehículo

adecuado.

Las hojas generalmente presentan una capa lipídica sobre la superficie cutánea,

la cual en la mayoría de los casos juega un papel fundamental en la resistencia o no a la

penetración por parte del pesticida. La penetración de la cutícula se ve afectada en

algunos casos por el valor del pH, por lo que la adición de un surfactante adecuado en la

formulación es necesaria (Elworthy y col., 1968).

Dejando de lado aquellas situaciones en que se emplea el pesticida como

producto químico puro o técnico, sin formulación alguna, lo más corriente es

emplearlos debidamente formulados, es decir, acondicionados para que rindan la mayor

efectividad en su uso. En toda formulación, sea cual sea el uso a que se destine, cabe

distinguir tres clases de componentes (Barberá, 1989):

a- La materia o principio activo que es eficaz contra la plaga o enfermedad que se

trata de combatir.

46

b- Disolventes y diluyentes que actúan como vehículos de la materia activa y que

permiten usar el formulado tal cual o diluirlo posteriormente en otro vehículo de

aplicación, como agua.

c- Coadyuvantes constituidos por inertes que ayudan eficazmente al principio

activo en su efecto, perfeccionando e incluso mejorando su propia acción.

II.10.2. Formulaciones

Las posibles formulaciones de los pesticidas se pueden clasificar de la siguiente

manera:

Polvos espolvoreables

Polvos solubles

Formulaciones sólidas Polvos mojables

Microencapsulados

Gránulos

Solubles en agua

Formulaciones líquidas Emulsionables

Suspensiones fluidas (flowables)

Dentro de estas formulaciones, las de mayor relevancia para el caso de las

plantaciones de arándanos son las de gránulos dispersables y polvos mojables, ya que

corresponden con las presentaciones de los productos técnicos en estudio empleados en

los campos arandaneros de la Región de Salto Grande.

Polvos mojables

Esta clase de formulaciones se presenta en forma de un polvo capaz de ser

mojado y mantenerse en suspensión en agua durante un tiempo más o menos largo. El

principio activo, generalmente insoluble o muy poco soluble en agua, está disperso en

una materia inerte, y a la formulación se agregan coadyuvantes tales como humectantes

para conseguir que el producto moje y se logre esparcir en las superficies tratadas;

agentes de suspensión, para ayudar a mantenerlos suspendidos en el agua; adherentes,

para impartir resistencia a las lluvias; cuando es necesario, estabilizantes para impedir

descomposiciones durante el almacenamiento, y tamponadores de pH para evitar su

47

hidrólisis. Todos estos coadyuvantes están destinados a conseguir la mejor eficacia del

producto una vez aplicado (Barberá, 1989).

Una característica muy importante de estos productos es la suspensibilidad o

capacidad de mantenerse las partículas de polvo en suspensión durante el mayor

tiempo, sin depositarse en el fondo o haciéndolo en la menor cantidad posible. Por

ejemplo, al realizar una aplicación en el campo con una máquina de mochila, si el

producto es de buena suspensibilidad, apenas se forma un depósito en el fondo durante

el tiempo de trabajo y si el equipo tiene un agitador, el depósito prácticamente no existe;

las plantas rociadas reciben siempre igual cantidad de materia activa, tanto al principio

como al final del tratamiento. Sin embargo, si el producto es de mala suspensibilidad, se

deposita y al poco tiempo de iniciar el tratamiento existe ya un depósito que va

aumentando paulatinamente; la pulverización es homogénea al principio, pero luego al

enriquecerse de materia activa el fondo de la máquina, que es por donde se realiza la

succión, la concentración del producto aplicado es más alta. Al final de la pulverización

la concentración del principio activo es muy baja, succionándose prácticamente sólo

agua. Es por este motivo que finalizada la aplicación habrá plantas bien rociadas, otras

con exceso de principio activo y las últimas que no recibieron prácticamente nada.

Gránulos dispersables

Este tipo de formulaciones sólidas se aplica directamente a las plantas o al suelo.

Los gránulos tienen aspecto de arenilla más o menos fina, con tamaños de partícula que

oscilan de 0,2 a 1,5 mm, predominando generalmente los tamaños intermedios (Barberá,

1989).

La materia inerte que sirve de soporte a tales gránulos, es un producto ya

preformado, capaz de absorber o de recubrirse con el pesticida.

II.10.3. Formas de acción

Se pueden dividir en dos grandes grupos: de contacto y sistémicos (Cremlyn,

1995).

Dentro de los pesticidas de contacto, de superficie o no sistémicos se encuentran

aquellos que no penetran notablemente en los tejidos del sistema vascular de la planta.

Los primeros pesticidas fueron de este tipo, y contaban con las desventajas de la escasa

resistencia a las inclemencias climáticas (viento, lluvia, sol); y que además, al crecer la

planta, las partes nuevas estaban desprotegidas y, por lo tanto, expuestas al ataque de

48

insectos y hongos. En realidad, los primeros fungicidas sólo cumplían con el rol de

protectores (fungistáticos) ya que estaban diseñados para prevenir el desarrollo de las

esporas fúngicas, pero, una vez establecido el hongo y comenzada la infección a través

de los tejidos de la planta, la acción destructora de estos fungicidas no sistémicos era

muy pequeña y en general no podían detener la infección (Cremlyn, 1995).

En segundo lugar se encuentran los pesticidas sistémicos, los cuales presentan la

propiedad de penetrar efectivamente en la cutícula vegetal, así como trasladarse a través

del sistema vascular de la planta.

A los fungicidas sistémicos también se los conoce como quimioterapéuticos

vegetales, ya que no sólo protegen a la planta contra un ataque fúngico, sino que

además, curan o inhiben una infección establecida. Son poco afectados por el clima y

confieren inmunidad a los brotes nuevos que crecen en la planta (Cremlyn, 1995).

Entre ambos tipos extremos, existen una serie de gradaciones, pudiéndose hablar

de fungicidas dotados de acción penetrante más o menos localizada, o de acción

sistémica limitada.

II.10.4. Evaluación toxicológica

En todos los desarrollos de los pesticidas comerciales se realizan evaluaciones

exhaustivas no sólo de la toxicidad aguda, sino también de los posibles efectos a largo

plazo en el medio ambiente.

La toxicidad aguda se determina probando el producto químico en estudio en

varios mamíferos, generalmente ratas y ratones. Usualmente se expresa como el valor

DL50, que es la dosis requerida para matar el 50% de la población de animales de prueba

y se expresa en términos de mg/kg del peso del cuerpo del animal. Es requisito, entre

otros, que el experimento cuente con al menos 10 animales (Cremlyn, 1995).

La administración del producto químico puede ser por vía oral (en el alimento

del animal), por inyección intravenosa, o por vía cutánea (dérmica). Generalmente las

toxicidades dérmicas son ligeramente menores que las orales, mientras que las

intravenosas son mayores. Mientras menor sea el valor DL50 mayor será la toxicidad del

producto químico (Cremlyn, 1995), por lo que se puede hacer la siguiente graduación

(Tabla II.6):

49

Tabla II.6: Toxicidad de compuestos químicos

DL50 (mg/kg) Extremadamente tóxico 1 Altamente tóxico 1 – 50 Moderadamente tóxico 50 – 500 Ligeramente tóxico 500 – 5000 Prácticamente no tóxico 5000 – 15000 Relativamente inofensivo > 15000

II.10.5. Propiedades fisicoquímicas de los pesticidas

Las propiedades fisicoquímicas de los pesticidas son importantes para poder

entender su comportamiento no sólo en el sustrato vegetal, sino también, en el medio

ambiente. La complejidad de las variables intervinientes, sumado a que en general los

análisis del destino de los pesticidas se realizan en condiciones controladas de

laboratorio, hace muy difícil poder predecir con exactitud el destino de las moléculas de

pesticida que entran en contacto con el medio ambiente. Sin embargo, el estudio de la

solubilidad, presión de vapor, constante de la Ley de Henry, el coeficiente de carbono

orgánico (Koc) y el coeficiente de partición Octanol-Agua (Kow), para cada caso,

permiten tener una idea de su comportamiento.

II.10.5.1. Volatilización

Una propiedad física importante de los pesticidas es la volatilidad, íntimamente

relacionada con su presión de vapor. Algunos compuestos poseen una volatilidad tan

elevada que deben ser mezclados inmediatamente con el suelo para no sufrir una

evaporación a la atmósfera circundante antes de haber tenido la oportunidad de

controlar la plaga (Cremlyn, 1995).

La volatilidad representa la tendencia del plaguicida a pasar a la fase gaseosa.

Todas las sustancias orgánicas son volátiles en algún grado dependiendo de su presión

de vapor, del estado físico en que se encuentren y de la temperatura ambiente. La

volatilidad se mide a partir de la constante de Henry que depende de la presión de vapor

en estado líquido y de la solubilidad en agua. Cuando la sustancia tiene una alta

solubilidad en agua en relación a su presión de vapor, tenderá a disolverse en el agua

principalmente.

La presión de vapor aumenta al incrementarse la temperatura y viceversa. Un

pesticida con presión de vapor mayor a 10,6 mmHg puede fácilmente volatilizarse, es

50

decir, que el tiempo en que esta sustancia queda en contacto con la superficie del

vegetal puede llegar a ser muy corto.

Cuando el pesticida presenta un valor elevado de la constante de Henry, este

tiene un mayor potencial para volatilizarse del suelo húmedo; en cambio, un valor bajo

predice un mayor potencial de lixiviación, es decir, de alcanzar las capas más profundas

del suelo e inclusive llegar hasta el acuífero, que en consecuencia resulta contaminado.

En la tabla II.7 se pueden apreciar la relación entre la constante de Henry y la

volatilidad de los compuestos químicos.

Tabla II.7: Constantes de la Ley de Henry

Volatilidad H (atm m3/mol) No volátil 3x10-7

Volatilidad baja 3x10-7 – 1x10-5 Volatilidad moderada 1x10-5 – 1x10-3 Volatilidad elevada > 1x10-3

II.10.5.2. Solubilidad

La solubilidad en agua, es una medida que determina la máxima concentración

de un plaguicida a disolverse en un litro de agua y por lo general tiene un rango de 1 a

100000 mg/l, y es importante en los procesos de distribución en el suelo. Una alta

solubilidad da por resultado el pasaje más fácil al suelo y a la penetración por debajo de

las capas superficiales, aunque también el material será frecuentemente lixiviado del

suelo por las lluvias torrenciales (Cremlyn, 1995; Pardo del Campo, 2010).

II.10.5.3. Coeficiente de adsorción de carbono orgánico (Koc)

Este valor es una medida de la tendencia de un compuesto orgánico a ser

adsorbido por los suelos o sedimentos. Cuando este parámetro es elevado indica una

mayor afinidad del pesticida por la materia orgánica presente en el suelo.

II.10.5.4. Coeficiente de Partición Octanol/Agua (Kow)

Indica la forma en que una sustancia química puede distribuirse entre dos

solventes inmiscibles como son agua (polar) y octanol (relativamente no polar).

Proporciona un valor de la polaridad de un pesticida, y una idea de su mayor o menor

afinidad por solventes polares o apolares.

51

II.10.5.5. Propiedades acido – base

La fuerza básica o alcalinidad de un compuesto mide su capacidad para cargarse

positivamente por la adsorción de iones de hidrógeno del suelo. Éstos son atraídos por

centros de carga negativa de los pesticidas, convirtiendo las moléculas originalmente

neutras en cationes. Son ejemplos de estos compuestos los herbicidas del grupo de las

triazinas y las ureas. Entre mayor sea la alcalinidad del pesticida, mayor será la función

que desempeña en las reacciones de intercambio catiónico en el suelo.

Hay casos extremos manifestados por sustancias como el paraquat que son

cationes por si mismos y así fácilmente se intercambian con cationes de los coloides del

suelo. Estas reacciones de intercambio dan como resultado una fuerte fijación del

pesticida al suelo, de modo que ya no está disponible para ser absorbido por las raíces

de la planta (Cremlyn, 1995).

Otro caso extremo son los plaguicidas ácidos como es el caso del ácido 2,4

diclorofenoxiacético (2,4-D), que liberan iones de hidrógeno convirtiéndose en aniones.

Esto provoca que sean rechazados por los coloides del suelo de carga negativa, y

consecuentemente no sean absorbidos en sus superficies (Cremlyn, 1995).

II.10.6. Período de carencia y límite máximo de residuos

Es el tiempo mínimo establecido por las distintas comercializadoras de

arándanos, expresado en días, que debe transcurrir entre la última aplicación de un

fitosanitario y el consumo del producto vegetal tratado. Por ejemplo, el período de

carencia recomendado es de 6 días para Bellis (boscalid + pyraclostrobin), 1 día para

Switch (cyprodinil + fludioxonil), y de 90 días para Amistar (azoxystrobin).

El período de carencia establecido, ya sea por las comercializadoras de

arándanos o por los vendedores de pesticidas, carece de rigurosidad científica ya que no

toma en cuenta una serie de variables que serán descriptas en el punto II.11, y su

utilización sin comprobación puede llevar a superar los límites máximos de residuos

que establecen los mercados compradores. Por lo ante dicho, se considera importante la

realización y estudio de curvas de degradación de fungicidas en arándanos en la región

de interés.

El límite máximo de residuos químicos presentes en los alimentos (LMR) es el

nivel máximo de residuos de plaguicida expresado en mg/kg, legalmente permitido en

alimentos y piensos. Los países que importan alimentos establecen sus LMR y son

impuestos como regulaciones en las fronteras (Drogué y DeMaria, 2012).

52

II.11. Evolución de los residuos de pesticidas en el tejido vegetal

Las moléculas de pesticidas no permanecen intactas indefinidamente en el medio

ambiente, ya que con el tiempo sufren una degradación influenciada por

microorganismos, actividad química, pH, clima, contenido de materia orgánica del

suelo, entre otros. En la figura II.18 se observan los posibles mecanismos de transporte

y degradación de los pesticidas en el medio ambiente. Las características físicas y las

condiciones climáticas del sitio de estudio contribuyen al transporte de los

contaminantes. Por consiguiente, es necesaria información acerca de la topografía, tipos

de suelo y ubicación, precipitación anual, condiciones de temperatura, entre otros, para

poder estimar hacia donde pudiera desplazarse el pesticida aplicado.

Figura II.18: Posibles mecanismos de transporte y transformación de pesticidas en el

ambiente (Instituto Nacional de Ecología, 2009)

53

II.11.1. Depósito de pesticidas

Se refiere a la cantidad de plaguicida que queda sobre el vegetal inmediatamente

después de un tratamiento o aplicación. Se expresa en miligramos de plaguicida por

kilogramo del vegetal ó partes por millón (Coscolla, 1993).

Existe una gran variabilidad en el depósito del agente químico sobre el sustrato

vegetal, ya que dependiendo de la naturaleza del pesticida y de su formulación,

características de aplicación, condiciones meteorológicas, etc., éste irá a parar sobre la

superficie a tratar, suelo, se evaporará antes de llegar a su objetivo, o será víctima de

deriva. Por estos motivos, la variabilidad de los depósitos en una aplicación es muy

amplia, con coeficientes de variación mayores al 35% (Coscolla, 1993; Instituto

Nacional de Ecología, 2009).

No todas las gotas de pesticida que llegan a la planta serán retenidas en la

superficie. Esto dependerá de su morfología y propiedades químicas, así como de la

cantidad de ceras que la recubren, principalmente en el caso de los frutos.

Entre los factores que determinan el depósito del pesticida se pueden mencionar:

a) Dosis: es la cantidad de pesticida por unidad de superficie cultivada.

Lógicamente, a mayor dosis, mayor es el depósito.

b) Naturaleza química: hay compuestos que por su estructura molecular,

polaridad, etc., son más retenidos que otros.

c) Naturaleza de la formulación: se refiere a la presencia o no de

coadyuvantes para mejorar la retención por parte de la planta.

d) Características de la aplicación: se refiere principalmente al tamaño de la

gota, ya que cuanto menor sea éste, mayor será el riesgo de deriva y

evaporación, y más acusados serán los efectos de las condiciones

climáticas. Conviene que la aplicación se realice de la manera más regular

y uniforme posible y que los instrumentos utilizados estén bien calibrados,

ya que de lo contrario, podría ocurrir que ciertas zonas presenten una

sobredosis y superen los LMR; y otras, una subdosis con lo cual quedarían

desprotegidas.

e) Relación superficie/volumen: este es un factor, que imposibilita la

extrapolación de un cultivo a otro a no ser que estos sean muy similares.

Por ejemplo, considerando la misma aplicación, el depósito será mayor en

frutas con relación superficie/volumen más alta, como es el caso de los

arándanos en comparación con frutas cítricas.

54

f) Naturaleza de la superficie del cultivo: la retención será mayor en frutas

con superficie cubierta de pelos como el kiwi, que en frutas de superficie

lisa o cubierta de cera como el arándano.

g) Condiciones meteorológicas en el momento de la aplicación: la velocidad

del viento, la temperatura, humedad relativa, presencia de rocío, etc.,

pueden afectar la cantidad depositada (Coscolla, 1993). Cuanto mayor sea

la temperatura, hay más posibilidades de evaporación; y cuanto mayor sea

la velocidad del viento, más posibilidades de deriva.

En el caso de los arándanos, su velocidad de crecimiento desde el momento del

cuaje hasta la madurez es relativamente alta, aproximadamente de 18 a 20 días, según

las condiciones meteorológicas; además la maduración en la planta no es homogénea,

requiriéndose recolectar los frutos aproximadamente 8 veces por planta en cada

temporada de cosecha. Esto necesariamente hace prever que existirá una gran

variabilidad en los residuos.

II.11.2. Eliminación progresiva de los residuos

Efectuado el depósito del pesticida sobre el vegetal, éste va disminuyendo

progresivamente en el tiempo por la acción de numerosos factores, incluidos el

crecimiento natural del vegetal, meteorológicos como el efecto de la lluvia y el viento

(causas mecánicas), temperatura, humedad relativa y radiación solar, eliminación por

volatilización y solubilización del pesticida, y fundamentalmente por la degradación

química del mismo (Pei y col., 2004; Lhomme y col., 2007; Saien y Khezrianjoo, 2008).

La eliminación progresiva del pesticida está influenciada también por otros factores ya

mencionados, tales como características de la molécula, formulación, etc.

II.11.2.1. Crecimiento del sustrato vegetal. Eliminación aparente

Debido a que la forma tradicional de expresar el contenido de pesticida de una

fruta es como una proporción en peso, mg/kg, al aumentar su volumen y peso,

disminuye proporcionalmente la cantidad de residuo. Esto es particularmente visible en

frutas de crecimiento rápido, y se conoce como eliminación aparente de los residuos, ya

que no se trata de una eliminación real, sino que podría considerarse como una dilución.

Por ejemplo, los arándanos al momento del cuaje poseen un diámetro de 1mm,

alcanzando al momento de la maduración completa, según la variedad, un tamaño de 15

55

mm o más. Suponiendo que la concentración inicial de un pesticida sobre la fruta,

aplicado en el momento del cuaje es de 10 mg/kg, cuando las bayas midan 15 mm de

diámetro, por una simple proporción, el residuo teórico sería de 0,67 mg/kg en ausencia

de otras fuentes de eliminación.

II.11.2.2. Tipo de aplicación y formulación

Cuando la formulación contiene tensioactivos y el grado de esparcimiento es

elevado, se favorece la penetración, ya que cuanto más extendido esté el producto,

mayor superficie de penetración presenta. La influencia del tipo de aplicación y

formulación inciden no sólo en la determinación del depósito, sino en la evolución de

los residuos. Los mismos persisten más cuando proceden de pulverizaciones líquidas,

formuladas como emulsiones que contienen tensioactivos, espesantes y estabilizantes

(Coscolla, 1993).

II.11.2.3. Causas mecánicas y físicas

El efecto que tienen sobre la eliminación del residuo es mayor cuando actúan

inmediatamente después de la aplicación, cuando todavía el depósito no está seco y bien

adherido a la superficie vegetal. Además, la intensidad de la lluvia y la velocidad y

duración del viento, juegan un rol importante en el arrastre del pesticida.

Como ya se ha mencionado con anterioridad, son numerosos los factores

involucrados tanto en el depósito como en la eliminación de los agentes fitosanitarios.

Por ejemplo, aquellos compuestos solubles en agua serán lavados más fácilmente.

La eliminación por volatilización del pesticida es función de la tensión de vapor,

del viento y de la temperatura, etc.

La solubilización de los pesticidas en agua es generalmente débil, aunque

existen excepciones. En el caso de que ocurran precipitaciones prolongadas y de alta

intensidad, y que la cantidad de pesticida depositada sea escasa, la eliminación puede

llegar a ser importante (Instituto Nacional de Ecología, 2009).

II.11.2.4. Degradación química

Es el mecanismo principal de eliminación de los residuos, y depende

fundamentalmente de la estructura química del principio activo, del sustrato vegetal y

de la temperatura. La estructura molecular es la que determina su estabilidad química y

por lo tanto, cuanto mayor sea ésta, mayor su persistencia.

56

Los procesos degradativos pueden ocurrir tanto en la superficie como en el

interior del tejido vegetal, aunque lo que se cuantifica es la degradación total. Puede

producirse por reacciones químicas simples, tales como procesos de fotólisis, hidrólisis,

oxidorreducción, isomerización, descarboxilación, etc., o bien, por reacciones

bioquímicas más o menos complejas, donde intervienen procesos enzimáticos (Pei y

col., 2004; Zertal y col., 2005; Lhomme y col., 2007; Saien y Khezrianjoo, 2008).

La velocidad de degradación no sólo está determinada por la estabilidad química

del pesticida, sino que es función de la temperatura y ésta es uno de los factores más

decisivos en la disipación (Athanasopoulos y col., 2005; Kyriakidis y col., 2005;

Stenrød y col., 2008).

La degradación de los pesticidas que quedan en la superficie, está notablemente

vinculada con la fotodescomposición, acelerada en presencia de agua. Siendo la luz

solar, en el rango del ultravioleta de 300-400 nm de longitud de onda, la causa de la

alteración fotoquímica (Sakkas y col., 2002).

Dentro del tejido vegetal, la degradación es afectada por la temperatura, y en

menor grado por otros factores meteorológicos. Esta degradación es más compleja y la

velocidad de metabolización interna es muy variable y está determinada por acciones

enzimáticas, propias del tejido vegetal (Montti y col., 1998; Gerard y col., 2000).

II.11.3. Curvas de disipación o persistencia

Además de los factores antes mencionados, la persistencia también depende de

la presencia de ceras en la superficie de los frutos, que favorece la estabilidad de los

residuos con propiedades liposolubles. La penetración en el tejido vegetal y su

persistencia dependen de la estructura molecular del pesticida y la naturaleza o

composición del tejido o sustrato vegetal.

En conclusión, la interacción entre los distintos factores hacen que la dinámica

de degradación de pesticidas sea compleja y variable. Por ejemplo, la disipación de

tetraconazole en pepinos de invernadero fue evaluada por Khalfallah y col. (1998),

quienes concluyeron que la degradación podía atribuirse principalmente a factores

fisicoquímicos y no tanto a un efecto de dilución por crecimiento del vegetal. Por otro

lado, Gonzalez y col. (1998) compararon los efectos del tipo de cultivo, la estación y el

tipo de invernadero en la degradación de metamidofós en vegetales, encontrando que la

especie y estación del año fueron los factores determinantes de la vida media del

pesticida.

57

Cabe aclarar que muchas veces las sustancias resultantes de la descomposición

de un pesticida pueden llegar a ser aún más tóxicas y tener vidas medias significativas

(Coscolla, 1993; Lhomme y col., 2007; Saien y Khezrianjoo, 2008). En general, los

procesos degradativos son considerados en conjunto y con el tiempo, como mecanismos

destoxificadores.

Para obtener curvas de degradación (o disipación) para un pesticida determinado

se debe graficar la evolución del mismo en función del tiempo transcurrido desde la

aplicación. En general las reacciones de disipación son de primer orden y se ajustan con

un modelo aproximadamente exponencial (Athanasopolous y col., 2005; Pose-Juan y

col., 2006; Chen y col., 2007), lo cual debe verificarse experimentalmente y determinar

la constante (k) específica de la velocidad de reacción según las ecuaciones:

[ ] [ ]Rk

dt

RdreaccióndeVelocidad =

−= (Ec. II.1)

�� =−tR

R

kdtR

dRt

00][

][

Aplicando Ln: ktR

R

t

=][

][ln 0

)(0

kt

t eRR−= (Ec. II.2)

donde:

Rt = residuos al cabo de un tiempo t (mg/kg)

R0 = residuos teóricos iniciales para t = 0 (mg/kg)

k = constante de la velocidad de reacción (día-1)

t = tiempo transcurrido en días tras la aplicación

A fin de no utilizar ecuaciones exponenciales, se suele efectuar una

transformación a través de una regresión lineal semilogarítmica y así la curva de

disipación se transforma en una recta del tipo:

ktRRt −= ]ln[]ln[ 0 (Ec. II.3)

58

En esta última ecuación, ln[R0] es la ordenada al origen, y k es la pendiente, de

signo negativo pues es decreciente.

Hay casos en los cuales el proceso de degradación no se puede explicar con una

cinética de primer orden como la mencionada anteriormente, y suelen aplicarse en

forma pragmática dos o tres cinéticas de primer orden consecutivas (Coscolla, 1993).

Las pendientes de estas cinéticas son diferentes. La primera (A) generalmente es mayor

debido a que al principio la disipación suele ser mucho más rápida y se debe

principalmente a acciones mecánicas, si estas ocurren inmediatamente después de la

aplicación. Esta etapa va seguida de una menos rápida (B) debida a causas físicas y/o

químicas. La tercera y última dinámica (C) es mucho más lenta y está determinada

probablemente por un proceso de difusión del pesticida desde el interior hacia la

superficie del vegetal (Figura II.19).

Figura II.19: Curva teórica de disipación de pesticidas.

II.11.3.1. Tiempo de vida media

El tiempo de vida media se define como el tiempo, generalmente expresado en

días, que tarda el contenido de residuos en llegar a la mitad del valor inicial depositado

en la fruta. Se representa por las siglas VR50, y es una medida cuantitativa de la

persistencia de los residuos (Coscolla, 1993). Se calcula a partir de una expresión

matemática sencilla, partiendo de la ecuación II.2, aplicando logaritmo natural, y

considerando que el contenido de residuo se reduce a la mitad. Luego, el tiempo

transcurrido para que esto suceda se deduce de la ecuación II.4:

kt−=)5,0ln( (Ec. II.4)

59

donde k se obtiene de la ecuación de la exponencial y t es el tiempo de vida

media. Como se puede observar, este valor es independiente de la concentración inicial

del analito.

II.12. Fungicidas aplicados en la Región de Salto Grande

Las enfermedades fúngicas representan las principales pérdidas económicas para

los productores arandaneros, debido a que tienen un efecto directo sobre los

rendimientos. Por este motivo, los campos de la Región de Salto Grande utilizan

distintas combinaciones de fungicidas para el control de las enfermedades. Se puede

mencionar para el control de podredumbre por Alternaria el tratamiento con

azoxystrobin y fludioxonil; para la podredumbre gris combinaciones de boscalid +

pyraclostrobin y fludioxonil + cyprodinil; para antracnosis la utilización de

azoxystrobin y cyprodinil al comienzo del período de floración; y para roya se destacan

las aplicaciones de estrobilurinas como el azoxystrobin, entre otros.

Los fungicidas mencionados son los que se seleccionaron para el estudio de las

curvas de degradación en el cultivo. Las propiedades fisicoquímicas y características de

los mismos son detalladas a continuación y corresponden a un resumen realizado a

partir de la información citada por distintos organismos: Community Reference

Laboratories for Residues of Pesticide, (2009); Footprint, (2009); y el Instituto Nacional

de Ecología, (2009).

II.12.1. Boscalid

Nomenclatura química: 2-cloro-N-(4'-cloro[1,1'-bifenil]-2-il)-3-piridincarboxamida

CAS Nº: 188425-85-6

Clasificación química: Piridincarboxamida

Fórmula química: C18H12Cl2N2O (Figura II.20)

Sinónimo: Nicobifen

Figura II.20: Fórmula molecular de Boscalid

60

Propiedades fisicoquímicas:

Peso molecular: 343,21 g/mol

Solubilidad en agua a 20ºC: 4,6 mg/l

Solubilidad en acetona a 20ºC: 180000 mg/l

Solubilidad en metanol a 20ºC: 45000 mg/l

Solubilidad en tolueno a 20ºC: 22500 mg/l

Solubilidad en 1-octanol a 20ºC: 10000 mg/l

Punto de fusión: 143,3ºC

Punto de ebullición: se descompone antes de la ebullición

Estado físico: sólido

pKow a pH 7 y 20°C: 2,96

Presión de vapor a 25°C: 7,2 x 10-4 mPa

Constante de Henry a 25oC: 5,18 x 10-8 Pa m3 mol-1

Koc: 809 ml/g

Este compuesto es un fungicida cuya utilización es recomendada contra un

amplio rango de patógenos fúngicos incluyendo Botrytis spp., Alternaria spp. y

Sclerotinia spp., empleado en una gran cantidad de productos vegetales.

Información toxicológica:

DL50 oral aguda: 5000 mg/kg peso corporal (ratas)

DL50 dérmica aguda: 2000 mg/kg peso corporal (ratas)

Riesgos ambientales: Moderadamente tóxico para aves, abejas, peces, invertebrados

acuáticos y algas.

II.12.2. Pyraclostrobin

Nomenclatura química: metil[2-[[[1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-3-il]oxi]metil]fenil]

metoxicarbamato

CAS Nº: 175013-18-0

Clasificación química: Estrobilurina

Fórmula química: C19H18CIN3O4 (Figura II.21)

61



Solubilidad en agua a 20ºC y pH = 5,8 – 1,9 mg/l




Solubilidad en octanol a 20ºC: 24200 mg/l

Solubilidad en n-heptano a 20ºC: 3700 mg/l



Punto de degradación: 200ºC

Densidad: 1,3 g/ml

Estado físico: sólido cristalino color blanco o beige claro

pKow a pH 7 y 20°C: 3,99



Koc: 11000 ml/g

Es inhibidor de la respiración mitocondrial de las células fúngicas al nivel de los

citocromos (Q0I).




Figura II.21: Fórmula molecular de Pyraclostrobin

62

Riesgos ambientales: Presenta alta toxicidad para peces y crustáceos acuáticos.

Moderada toxicidad para aves y abejas.

II.12.3. Fludioxonil

Nomenclatura química: 4-(2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-4-il)-1H-pirrol-3-carbonitrilo

CAS Nº: 131341-86-1

Clasificación química: Fenilpirrol

Fórmula química: C12H6F2N2O2 (Figura II.22)







Solubilidad en octanol a 20ºC: 20000 mg/l


También es soluble en etanol y hexano




Densidad: 1,54 g/ml

Estado físico: cristales amarillos

pKow a pH 7 y 20°C: 4,12



Koc: 75000 ml/g

Figura II.22: Fórmula molecular del Fludioxonil

63

Posee una estructura química similar a un compuesto bioactivo natural

producido por un microorganismo del suelo del género Pseudomona spp.

Reemplazando algunos constituyentes de la molécula se logró aumentar su actividad

biológica y estabilidad.

Actúa por contacto y penetración parcial, es no sistémico de larga acción

residual, perturbando los intercambios a nivel de las membranas entre las células del

hongo y bloqueando así su crecimiento. Inhibe el desarrollo del micelio e induce una

reducción instantánea de la absorción de los aminoácidos y azúcares. Posee un amplio

rango de acción sobre patógenos de los grupos Ascomicetes, Basidiomicetes y

Deuteromicetes, con actividad fungiestática o fungicida según el tipo de patógeno.

Es ligeramente persistente. En el suelo es degradado por la actividad microbiana

en condiciones aerobias; sin embargo, persiste en condiciones anaerobias y en ausencia

de luz. En este medio tiene una movilidad prácticamente nula, por lo cual sus

posibilidades de lixiviación son limitadas. Es susceptible a la fotólisis en el suelo y en el

agua (vida media estimada de 10 días en ambos medios), pero es estable a la hidrólisis a

valores de pH presentes en el ambiente. La volatilización y bioconcentración no son

destinos ambientales importantes para este producto.




Riesgos ambientales: Baja toxicidad para aves y abejas, pero altamente tóxico para

peces, invertebrados acuáticos y algas.

II.12.4. Cyprodinil

Nomenclatura química: 4-ciclopropil-6-metil-N-fenil-2-pirimidinamina

CAS Nº: 121552-61-2

Clasificación química: Anilinopirimidina

Fórmula química: C14H15N3 (Figura II.23)

64



Solubilidad en agua a 20ºC: 13 mg/l

Solubilidad en agua a 25ºC: 4 mg/l


Solubilidad en cloruro de metileno a 20ºC: 500000 mg/l


Solubilidad en n-hexano a 20ºC: 26000 mg/l


Densidad: 1,21 g/ml

Estado físico: polvo color beige

pKow a pH 7 y 20°C: 4



Koc: 1706 ml/g

Este fungicida es de acción sistémica. Es absorbido a través de las hojas. Inhibe

la síntesis proteica.




Riesgos ambientales: Moderadamente tóxico para aves, peces, invertebrados acuáticos y

algas. De baja toxicidad para abejas.

Figura II.23: Fórmula molecular del Cyprodinil

65

II.12.5. Azoxystrobin

Nomenclatura química: Metil (�E)-2-[[6-(2-cianofenoxi)- 4-pirimidinil]oxi]-�-

(metoximetilen) bencenacetato

CAS Nº: 131860-33-8

Clasificación química: Estrobilurina

Fórmula química: C22H17N3O5 (Figura II.24)



Solubilidad en agua a 20ºC y pH = 5,2 – 7: 6,7 mg/l




Solubilidad en n-hexano a 20ºC: 57 mg/l

Es muy soluble en acetato de etilo, acetonitrilo y diclorometano, ligeramente soluble en

metanol, tolueno y acetona y poco soluble en hexano y n-octanol.

Punto de fusión: 116ºC

Punto de ebullición: 360ºC


Densidad: 1,34 g/ml

Estado físico: sólido cristalino color blanco

pKow a pH 7 y 20°C: 2,5

Presión de vapor a 25°C: 1,1 x 10-7

mPa

Constante de Henry a 25oC: 7,4 x 10

-9 Pa m

3 mol

-1

Koc: 482 ml/g

Figura II.24: Fórmula molecular del Azoxystrobin

66

Es inhibidor de la respiración mitocondrial de las células fúngicas al nivel de los

citocromos (Q0I).

Se trata de un fungicida poco persistente. En el aire está presente únicamente en

la fase de partículas, las cuales son eliminadas de la atmósfera por acción de la gravedad

o al precipitarse con la lluvia. En el suelo muestra una movilidad baja. En los cuerpos

de agua se espera que se adsorba a los sólidos suspendidos y sedimentos. La hidrólisis y

la volatilización desde las superficies del agua o suelo no son destinos ambientales

importantes para el compuesto. Tiene un potencial bajo de bioconcentración en

organismos acuáticos.




Riesgos ambientales: Es extremadamente tóxico para zooplancton, pero prácticamente

no es tóxico para aves y abejas. Su toxicidad varía de ligera a alta para peces.

II.13. Metodología analítica

El principio de todas las técnicas de preparación de muestras es la partición del

analito entre la matriz y la fase extractiva. Dentro de las técnicas analíticas encuadradas

entre aquellas que utilizan pequeña cantidad de solvente, o no requieren su uso, la

extracción en fase sólida (SPE), y la microextracción en fase sólida (SPME) son muy

empleadas.

En la SPE el primer paso es pasar la muestra a través de un cartucho conteniendo

un adsorbente adecuado, de acuerdo a las características del analito. En la columna de

limpieza (clean up) pueden quedar retenidos el analito junto con interferencias propias

de la matriz y se utiliza un solvente selectivo para eliminar las interferencias, y luego,

otro para remover el compuesto de interés; o quedan retenidas las interferencias dejando

pasar solamente el analito de interés. Esta técnica es sencilla, utiliza volúmenes

pequeños de solvente en comparación con las técnicas tradicionales de extracción

líquido – líquido. Presenta en algunos casos, como en los pesticidas, las desventajas que

se limita a compuestos semivolátiles, y la recuperación para estas sustancias suele ser

relativamente baja debido a la interacción con la matriz, y que se pueden saturar los

sitios activos del adsorbente y perder analito (Pawliszyn, 1997).

67

En el caso de micotoxinas, los resultados dentro del rango de capacidad de las

columnas, suelen dar recuperaciones altas. Además, se emplean columnas

inmunológicas específicas para algunas de las micotoxinas, cuyo principio es retener la

micotoxina en los anticuerpos correspondientes, dejar pasar las impurezas, y luego, con

los solventes adecuados recuperar las micotoxinas sin interferencias (Pacin y col., 2005,

2008). Cada uno de los analitos en estudio han sido determinados cromatográficamente

por numerosos autores, los cuales han utilizado diversas metodologías analíticas

aplicadas a una amplia variedad de matrices. Para los estudios de capacidad

toxicogénica, las técnicas empleadas ya habían sido desarrolladas y/o validadas previo

al inicio de esta tesis (Quiroga y col., 1995; González y col., 1996; Resnik y col., 1996a,

b; Moltó y col., 1997; Samar y Resnik, 2002; Pacin y col., 2005, 2008).

Para pesticidas se realizó una extensiva búsqueda bibliográfica, pero no se

encontraron publicaciones en las cuales azoxystrobin, boscalid, pyraclostrobin,

cyprodinil y fludioxonil hayan sido analizados en arándanos. Las tablas II.8 a II.17

resumen los métodos de extracción y clean up para los cinco fungicidas mencionados,

así como la matriz estudiada. En las mismas se puede apreciar que en su mayoría los

autores han utilizado métodos basados en extracción líquido líquido y SPE.

En la década del 90 surge la SPME como una metodología de extracción

alternativa en el caso de los pesticidas, para reducir los tiempos de proceso, debido a su

sencillez. Sólo se hace un extracto acuoso y se ajustan el pH y la fuerza iónica mediante

el agregado de sales. Este método presenta dos etapas, en primer lugar, el analito debe

particionarse entre el recubrimiento de la fibra y la matriz, y en segundo lugar, la

desorción térmica en el cromatógrafo gaseoso. La extracción puede realizarse tanto por

inmersión directa (ID) como por espacio de cabeza, “headspace” (HS). ID se utiliza

para los analitos disueltos en la solución, donde el polímero se sumerge en la solución

que contiene los mismos. HS se utiliza cuando los compuestos son volátiles y se

encuentran en fase gaseosa, en el cual el polímero queda expuesto por encima de la

superficie del líquido (Pawliszyn, 1997; Wang y col., 2005; Zimmermann y col., 2006;

Viñas y col., 2009; Antalick y col., 2010). Estos recubrimientos son selectivos, por lo

que es necesario una adecuada elección del absorbente en función del peso molecular y

polaridad del analito a extraer.

Del relevamiento bibliográfico realizado, cabe mencionar que son pocas las

técnicas que emplean SPME, por ejemplo, Menezes Filho y col. (2010a, b) para

azoxystrobin y pyraclostrobin en mango y agua superficial y subterránea; Viñas y col.

68

(2009) para azoxystrobin en alimento para bebés; Rial Otero y col. (2002) para

cyprodinil y fludioxonil en vino blanco. Debido a que esta técnica permite trabajar con

agua, lo cual se traduce en una menor utilización de solventes orgánicos, los cuales en

general son costosos y tóxicos, se planteó en la presente tesis el desarrollo de una

metodología basada en una extracción mediante SPME.

69

Tabla II.8: Métodos de preparación de muestra y extracción para cuantificar azoxystrobin

Referencia Matriz Cantidad Preparación de la muestra y Extracción

Agüera y col. (2004)

Pimienta, lechuga y berenjena

15g Adicionar 90ml EAc y 1ml NaOH (6,5M) y mezclar 30s a 21000rpm. Adicionar 13g Na2SO4 y mezclar otros 30s. Filtrar a través de 20g Na2SO4 anhidro. Lavar los sólidos con 50ml EAc.

Tomate 10g Adicionar 0,5ml de agua para obtener 10ml entre agua natural y agregada. Extraer con 20ml metanol.

Pepino 10g Adicionar 0,5ml de agua para obtener 10ml entre agua natural y agregada. Extraer con 20ml metanol.

Limón 10g Adicionar 1ml de agua para obtener 10ml entre agua natural y agregada. Extraer con 20ml metanol.

Pasas de uva 5g Adicionar 8ml de agua. Extraer con 20ml metanol.

Alder y col. (2004)

Harina de trigo

5g Adicionar 9ml de agua. Extraer con 20ml metanol.

Arrebola y col. (2003)

Pepinos 15g Mezclar con 50g diclorometano y agitar 2min a 19000rpm. Agregar 50g Na2SO4 anhidro y dejar reposar 2min. Filtrar a través de Na2SO4 anhidro.

10g Extraer con 10ml EAc y 10g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar y centrifugar a 2000rpm 5min. 25g Extraer con 25ml EAc y 25g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar y centrifugar a 2000rpm 5min.

Banerjee y col. (2007)

Uvas

10g QUECHERS: Adicionar 10ml AcN, 4g MgSO4 anhidro y 1g cloruro de sodio.

Belmonte Valles y col. (2012)

Tomate, manzana, naranja

10g Adicionar 10ml EAc y agitar 3s. Agregar 1,5g NaCl y 8g MgSO4 y agitar 15min.Centrifugar a 3700rpm por 5min.

Bolaños y col. (2007)

Frutilla 10g Adicionar 10ml AcN. Agitar 1min en vórtex. Agregar 1g NaCl y 4g MgSO4 y agitar nuevamente. Centrifugar a 2750g durante 6min.

Cajca y col. (2005)

Alimento para bebe a base

de fruta 15g

Adicionar 15ml ácido acético al 1% en acetonitrilo. Adicionar 6g MgSO4 anhidro y 2,5g acetato de sodio trihidratado. Agitar vigorosamente 1min. Centrifugar a 3450 rcf por 1 minuto.

Cajca y col. (2012)

Te verde y negro

2g Adicionar 10ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, y agitar 1min. Centrifugar a 10000rpm por 5min. Agregar a 1ml del extracto 1ml hexano y 5ml NaCl al 20% (p/p) y agitar 1min. Centrifugar a 10000rpm por 1min.

Caldas y col. (2011)

Suelo 10g Adicionar 10ml AcN y 0,1ml ácido acético y agitar 15s manualmente y 1min en agitador. Agregar 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, y agitar 15s manualmente y 1min en agitador. Centrifugar a 5000rpm por 5min.

Campillo y col. (2010)

Pera, uva, limón

5g Adicionar 2ml etanol. Sonicar 1min a temperatura ambiente. Centrifugar a 6000rpm por 5min. Diluir el sobrenadante a 14ml con solución buffer de acetato (0,04M). Adicionar 5% (p/v) de NaCl.

Cazorla-Reyes y col. (2011)

Orina 5ml Diluir con 5ml agua bidestilada.

Chen y col. (2011)

Te 5g Adicionar 10ml agua y 10ml AcN (1% ácido acético) y agitar 3min en vórtex. Dejar reposar 60min. Agregar 4g MgSO4 anhidro y 1,5g acetato de sodio anhidro, y agitar 1min. Enfriar en hielo rápidamente por 5min. Centrifugar a 5000rpm por 5min.

70

Tabla II.8 (Continuación)


Chu y col. (2005) Jugo de

manzana 10g

Mezclar con 20g tierra de diatomeas. Transferir a una columna de vidrio. Eluir los pesticidas con 160ml hexano-diclorometano (1:1) a 5ml/min. Lavar con 8ml de solvente.

Coscollà y col. (2009)

Aire - -

Cunha y col. (2009b)

Jugo de manzana

50g Centrifugar 12000rpm 5min. 5g de sobrenadante se transfirió a un tubo conteniendo 25µl TPP (100mg/l). Adicionar una

mezcla de 400µl acetona y 100µl CCl4. Agitar manualmente 1min. Centrifugar a 5000rpm 2min.

Cunha y Fernandes (2011)

Maíz 2,5g Adicionar 10ml agua deionizada y 10ml AcN. Agitar 30min. Agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar a 5000rpm por 4min.

Uva, orujo, torta,

sedimento 20g Cus y col.

(2010a)

Mosto, vino 20ml

Adicionar una mezcla de acetona, éter y diclorometano (1:2:2). Separar la fase orgánica superior, filtrar y evaporar los solventes por corriente de N2. Redisolver el extracto en una mezcla de ciclohexano y EAc (1:1, v/v).

Cus y col. (2010b)

Vinos 20ml Mezclar con acetona : éter : diclorometano (1:2:2). Filtrar

Uva 10g Dasgupta y col. (2010) Vino 10ml

Adicionar 10ml EAc y 10g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar y centrifugar a 2000rpm 5min

Uvas 5g De Melo Abreu y col. (2006) Vino 5ml

Adicionar 10ml de solución EAc - Hexano (50:50 v/v). Agitar 15min a 8rpm. Dejar separar las fases y remover la fase orgánica.

Economou y col. (2009)

Vino 10ml

Diluir la muestra a 100ml con agua deionizada. Pasar a través de cartuchos Oasis HLB de SPE con vacío a un flujo de 5ml/min. Previamente acondicionar los cartuchos con 6ml metanol y 6ml agua deionizada. Lavar el cartucho con la muestra con 5ml agua deionizada. Secar con vacío durante 10min. Eluir dos veces con 5ml metanol en un vial conteniendo 0,5ml agua. Evaporar hasta 0,5ml a 40°C. Llevar a 5ml con metanol. Diluir con agua (1:4 v/v). Filtrar a

través de 0,22µm.

Fenoll y col. (2007)

Morrón y Tomate

10g Homogeinizar con 20ml acetona por 2min. Adicionar EAc : ciclohexano (1/1, v/v). Centrifugar a 4000g 10min. Filtrar.

Fernández Morenos y col.

(2008)

Pepino y naranja

10g Adicionar 10ml AcN con 1% ácido acético. Agitar 1min en vórtex. Agregar 1g acetato de sodio y 4g MgSO4 y agitar nuevamente. Centrifugar a 4000rpm (2750g) durante 6min.

Gilberto-López y col. (2010)

Bebida de naranja

15ml No se realiza extracción, directamente se pasa por cartuchos de SPE.

Hernández y col. (2006)

Tomate, limón, pasas

y palta 20g

Mezclar con 60ml metanol : agua (80:20, v/v) con 0,1% ácido fórmico durante 2min a 8000rpm. Filtrar. Diluir el filtrado con metanol : agua (80:20, v/v) con 0,1% ácido fórmico hasta un volumen final de 100ml. Tomar una alícuota de 2,5ml y diluir a 20ml con agua (0,1% ácido fórmico).

Hetherton y col. (2004)

Manzana, lechuga y naranja

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Adicionar 4g MgSO4 y 1g NaCl y agitar 30s. Centrifugar a 4300g por 5min. Transferir

1ml del extracto a un tubo conteniendo 150mg MgSO4. Centrifugar a 5200g por 1min. Ajustar el volumen de 500µl a 1ml con agua.

71



15 g Agitar 20s con 30ml acetona. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20s. Centrifugar 4min a 3600 rpm.

Hiemstra y de Kok (2007)

Lechuga, naranja,

manzana, repollo, uva,

harina de trigo

7,5 g Agitar 20s con 30ml acetona y 7,5g Na2SO4 anhidro. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20s. Centrifugar 4min a 3600rpm.

Huang y col. (2009)

Te 1g Mezclar con 5ml AcN. Agitar 1min. Sonicar 20min. Centrifugar a 3000rpm por 3min. Extraer nuevamente el residuo con 2ml AcN y centrifugar. Combinar los sobrenadantes.

Kolberg y col. (2011)

Trigo, harina de trigo, salvado

500g Adicionar 1500g agua y homogeinizar. Tomar 10g y adicionarle 10ml AcN (1% ácido acético, v/v). Agitar 1min. Agregar 3g MgSO4. Agitar 20s. Adicionar 1,7g acetato de sodio y 1g citrato de sodio. Agitar 1min. Centrifugar a 4000rpm por 8min.

Lacina y col. (2010)

Manzana, frutilla, tomate,

espinaca

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl y agitar 1min. Centrifugar a 11000rpm 5min. Filtrar una

alícuota del sobrenadante en filtro de 0.2µm.

Leandro y col. (2007a)

Pera, lechuga y alimento

para bebé a base de fruta

10g

Adicionar 10ml AcN : ácido acético (99:1, v/v), 4g MgSO4 anhidro y 1,66g acetato de sodio y agitar inmediatamente. Centrifugar a 4300rpm 5min. Tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y evaporar hasta 0,8ml en corriente de nitrógeno. Ajustar el volumen a 1ml con tolueno. Transferir el extracto a un vial conteniendo 50mg PSA, 150mg MgSO4 anhidro y 50mg carbón. Agitar en vórtex 30seg, centrifugar a 5000rpm 1min.

Leandro y col. (2007b)

Naranja, Papa y

alimento para bebé a base de cereales

10g

Adicionar 10ml AcN : ácido acético (99:1, v/v), 4g MgSO4 anhidro y 1,66g acetato de sodio y agitar inmediatamente. Centrifugar a 4300rpm 5min. Tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y evaporar hasta 0,8ml en corriente de nitrógeno. Ajustar el volumen a 1ml con tolueno. Transferir el extracto a un vial conteniendo 50mg PSA, 150mg MgSO4 anhidro. Agitar en vórtex 30s, centrifugar a 5000rpm 1min. Diluir el sobrenadante con agua (1:10).

Lee y col. (2009) Harina de

trigo y arroz pulido

50g Adicionar 100ml AcN y mezclar 20min y ultrasonicar 10min. Filtrar. Adicionar 15g NaCl. Agitar 1min. Mantener a 4°C 1h.

Lee y Jo (2012) Ginseng coreano

50g Adicionar 100ml AcN y mezclar 10min. Filtrar. Adicionar 20g NaCl anhidro. Agitar 3min. Centrifugar a 4000rpm por 5min a 4°C.

Lesueur y col. (2008)

Limón, uva, cebolla y tomate

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g NaCl, 1g citrato de sodio dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 1min. Ajustar el pH a 5-5,5 con NaOH. Centrifugar a 5000rpm 3min. Estándar

interno: trifenilfosfato 10µg/ml.

Lozano y col. (2012)

Te 2g Adicionar 4ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y 200µl estándar interno, y agitar 7min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g NaCl, 1g citrato trisódico dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 7min. Centrifugar a 3700rpm 5min. Estándar interno: trifenilfosfato 25mg/l.

Marín y col. (2009)

Agua 100ml Centrifugar a 4500rpm por 5min. Agregar 1ml metanol al sobrenadante.

72



Menezes Filho y col. (2010a)

Mango 3g

Adicionar 10ml solución alcohol isopropílico - agua (20:80, v/v) con 5% NaCl. Ajustar a pH 3 con HCl. Agitar a 1000rpm 10min. Centrifugar a 5000rpm 15min. Transferir la capa superior a un vial de 10ml y enrazar con la mezcla alcohol - agua.

SPME: Fibra de Poliacrilato (85µm). Inmersión directa a 50ºC 30min con agitación a 250rpm en ciclos alternados (30seg de agitación seguidos de 10seg sin agitación). Colocar la fibra en el inyector. Desorsión 5min a 280ºC. Luego de la extracción limpiar la fibra a 280ºC durante 1min en atmósfera de helio.

Menezes Filho y col. (2010b)

Agua superficial y subterránea

250ml

Filtrar a través de membrana de 0,45µm.

SPME: Fibra de Poliacrilato (85µm). Inmersión directa a 50ºC 30min con agitación a 250rpm en ciclos alternados (30seg de agitación seguidos de 10seg sin agitación). Colocar la fibra en el inyector. Desorsión 5min a 280ºC. Luego de la extracción limpiar la fibra a 280ºC durante 1min en atmósfera de helio.

Ortelli y col. (2004)

Ensalada verde, tomate

y frutilla 20g Adicionar 10ml agua y ajustar el pH a 6-7. Agitar 15min con 40ml EAc. Centrifugar a 1000rpm 5min.

Pang y col. (2006)

Tejido animal 10g Adicionar 20g Na2SO4. Agregar 35ml ciclohexano : EAc (1:1, v/v). Homogeinizar a 15000rpm 1,5min. Centrifugar a 1400rpm 3min. Filtrar a través de 15g Na2SO4 y recolectar el filtrado. Repetir la extracción con 35ml de la mezcla de solventes. Centrifugar y juntar los filtrados.

Pizzutti I., y col. (2009)

Soja 2 g Adicionar 4g de agua. Reposar 1h. Agregar 20 mL acetonitrilo - 1% ácido acetico. Agitar manualmente 4,5s. Adicionar 2g MgSO4 anhidro y 2.5g NaAc, agitando vigorosamente. Decantar la capa superior de AcN en un tubo con 2g MgSO4 anhidro. Agitar 20seg. Centrifugar 3000rpm 1 min. Diluir una alícuota de 0,5ml con 0,5ml metanol.

Pizzutti y col. (2007)

Soja 5g Adicionar 10g agua. Reposar 1h. Agregar 100ml de acetona, diclorometano y benceno (1:1:1), y 15g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar 20s. Centrifugar 3600 rpm 3 min.

Rial Otero y col. (2003)

Uva 60g Fortificar con 30µl de solución metanólica 1000mg/l de carbofuran como estándar interno. Adicionar 100ml de diclorometano : acetona (75:25, v/v) y 45g Na2SO4 anhidro. Agitar vigorosamente 5min. Centrifugar a 10000rpm 15min.

Smalling y Kuivila (2008)

Sedimentos 10g Humedecer y realizar dos extracciones con diclorometano : metanol (9:1, v/v) asistidas por microondas (MAE) de 10min cada una. La primera a 100ºC y la segunda a 120ºC.

Viñas y col. (2009)

Alimento para bebé

25g

Diluir hasta 100ml con agua. Sonicar 5min. Filtrar y enfriar a 4ºC (30min). Tomar 8ml de muestra y adicionarle 1ml buffer fosfato 0,15M pH 5 y agua para ajustar el volumen a 14ml. Agitar 1min previa inmersión de la fibra.

SPME: Fibra de PDMS - DVB (65µm). Inmersión directa a 60ºC 40min con agitación a 1700rpm. Colocar la fibra en el inyector. Desorsión 4min a 240ºC.

Walorczyk (2007) Trigo

Trigo

Walorczyk (2008) Alimento animal

deshidratado

5g Adicionar 10ml agua. Agregar 50 ml solución estándar interno (TPP a 150 mg/ml) y 15ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5 g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm por 2min.

73


Referencia Matriz Cantidad Preparación de la muestra y Extracción Walorczyk y Gnusowski

(2009) abejas

2 g (16 - 31 insectos)

Adicionar 15ml AcN : agua (2:1, v/v) y 50µl estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 0,5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.

Walorczyk y col. (2011)

Vino 10g Adicionar 10ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4000rpm 2,5min.

Frutas y vegetales

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5min.

Walorczyk (2012) Malta de cebada

5g Adicionar 25ml AcN : agua (3:2, v/v) y agitar 5min. Adicionar 0,5 g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5min.

Walorczyk y Drozdzysnki

(2012)

Trigo sarraceno y

centeno 5g

Adicionar 25ml AcN : agua (2:3, v/v) y 50µl estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.

Tabla II.9: Métodos de clean up para cuantificar azoxystrobin

Referencia Clean up

Agüera y col. (2004)

Evaporar a sequedad bajo vacío (45°C). Redisolver con 15ml de metanol y sonicar. Filtrar a través de filtro de 0,2µm.

Alder y col. (2004)

Mezclar 6ml del extracto con 2ml NaCl al 20%. Transferir 5ml a una columna Chem-Elut. Dejar equilibrar 5min. Eluir con 16ml diclorometano. Evaporar a 40°C hasta sequedad. Redisolver con 0,25 ml metanol en ultrasonido y mezclar con 1ml agua conteniendo 5 mmoles/litro

formato de amonio. Filtrar con filtro 0,45�µ��


Evaporar hasta sequedad (35 – 40°C). Redisolver con 10g ciclohexano con 0,5ppm estándar interno (cafeina).

Limpiar 5ml del sobrenadante por DSPE con 25mg PSA. A 4ml adicionar 200µl de dietilenglicol (10% metanol) y mezclar vigorosamente. Evaporar hasta casi sequedad a 35°C. Redisolver con 1ml metanol y 1ml ácido acético (0,1% en agua) sonicando 1min. Agitar en vórtex 30seg. Centrifugar a

10000rpm 5min. Filtrar con filtro 0,2µm. Banerjee y col. (2007)

DSPE: 150mg MgSO4 anhidro y 25mg PSA.


Colocar 1ml de muestra extraída en un tubo conteniendo 25mg PSA y 150mg MgSO4. Agitar en vórtex. Centrifugar a 3500g por 1min.

74


Referencia Clean up


SBSE (polidimetilsiloxano): sumergirla en la solución agitada a 2000rpm. Establecer una temperatura de extracción de 45°C por 20min. Enjuagar la

barra con agua destilada. Extraer desde la barra con 100µl AcN : agua (50:50, v/v).


Acondicionar los cartuchos de C18 (500mg) con 4ml diclorometano, seguido de 4ml de agua bidestilada. Pasar la muestra y dejar secar por 2hs. Eluir con 5ml diclorometano. Evaporar a sequedad bajo vacío a 40°C. Redisolver con 2ml EAc.

Chen y col. (2011)

Acondicionar la columna de SPE con 10ml AcN : tolueno (3:1, 1% ácido acético). Pasar 1ml del extracto por la columna. Eluir con 20ml AcN : tolueno (3:1, 1% ácido acético). Concentrar a menos de 1ml evaporando con corriente de N2 a 40°C. Reconstituir con 1ml AcN (1% ácido acético) y filtrar a

través de filtro orgánico 0,2µm.

Chu y col. (2005) Evaporar hasta sequedad.

Cunha y Fernandes (2011)

Adicionarle a 4ml del extracto 100ml CCl4. Adicionar 4ml agua deionizada. Agitar 30s. Centrifugar a 5000rpm por 1min.

Cus y col. (2010a)

Cromatografía de gel permeado. Evaporar el eluato en corriente de N2. Redisolver en mezcla de ciclohexano y Eac (1:1).

Cus y col. (2010b)

Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con ciclohexano : EAc (1:1, v/v). Filtrar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,20µm. Luego GPC (cromatografía de permeación en gel)

Dasgupta y col. (2010)

Adicionar a 1ml del extracto 25mg PSA. Centrifugar a 10000rpm 2min. Filtrar a través de membrana de 0,2�m

De Melo Abreu y col. (2006)

Evaporar hasta sequedad 1ml del extracto en corriente de nitrógeno. Para análisis por HPLC redisolver con 1ml fase móvil. Para análisis por GC redisolver con 0,5ml solución EAc - Hexano (50:50, v/v)

Fenoll y col. (2007) Evaporar la fase orgánica a sequedad. Redisolver con 5ml Eac : ciclohexano (1:1, v/v)


(2008)

Colocar 1ml de muestra extraída en un tubo conteniendo 25mg PSA y 150mg MgSO4. Agitar en vórtex. Centrifugar a 6000rpm (3500g) por 1min. Evaporar a sequedad 800µl del extracto con N2. Redisolver con 400µl de solución de ciclohexano (0,5mg/l). Agitar 10s.


Acondicionar cartuchos Oasis HLB con 5ml metanol y 5ml agua mQ a 2ml/min. Pasar la muestra a 3ml/min. Eluir con 5ml metanol a 1ml/min. Evaporar a casi sequedad con corriente de N2. Adicionar 0,5ml metanol y 1ml agua mQ. Filtrar a través de membrana de 0,45�m.


Acondicionar el cartucho de SPE con 5ml metanol, 5ml metanol : MTBE (10:90, v/v) 0,1% ácido fórmico, 5ml metanol con 0,1% ácido fórmico, y 5ml agua acidificada (0,1% ácido fórmico). Pasar 5ml muestra. Secar pasando aire 1 hora. Eluir con 5ml metanol : MTBE (10:90, v/v) 0,1% ácido fórmico. Agregar 0,5ml agua y evaporar bajo corriente de N2 a 40°C hasta un volumen de 0,5ml. Ajustar el volumen hasta 1ml con metanol : agua(10:90, v/v).

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Referencia Clean up

Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 1.1ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acetico. Hiemstra y de

Kok (2007) Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 2.3ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acetico.

Huang y col. (2009)

Para la extracción en fase sólida, adicionar 1cm de Na2SO4 anhidro en un cartucho Carb-NH2. Eluir con 25ml tolueno : AcN (1:3, v/v). Evaporar el volumen eluido hasta sequedad con corriente de N2 a 45°C. Reconstituir con 0,5ml metanol y filtrar a través de membrana de 0,45µm.

Kolberg y col. (2011) Transferir 4ml de la capa superior del extracto a un tubo conteniendo 0,6h MgSO4 y 0,5g C18. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm por 8min.

Lee y col. (2009) Evaporar 20ml del extracto a sequedad a 40°C. Redisolver con 3ml metanol y agitar 1min dos veces. Filtrar.

Lee y Jo (2012) Evaporar 4ml de la capa superior del extracto hasta sequedad con corriente de N2 (35-40°C). Redisolver con acetona : hexano (2:8, v/v). Evaporar a sequedad con corriente de N2 (35-40°C) y redisolver con 2ml acetona.


Adicionar a 6ml de extracto 150mg PSA y 950mg MgSO4. Centrifugar a 5000rpm 3min. Filtrar en filtro de 0.45�m. Transferir 1.5ml a un vial conteniendo 15µl de solución de ácido fórmico al 5%. Evaporar hasta sequedad y redisolver en 150µl acetona/Eac (1:1, v/v).


Transferir 3ml del sobrenadante a un tubo conteniendo 150mg ClCa anhidro y 150mg PSA. Agitar 30s y centrifugar a 3700rpm por 5min. Adicionar 30µl ácido fórmico 5% en AcN. Evaporar con corriente de N2 y reconstituir con AcN : agua (10:90, v/v).


Acondicionar los cartuchos Oasis HLB con 5ml metanol y 5ml agua 1% ácido fórmico. Pasar 100ml de muestra. Secar bajo vacío y eluir con 5ml acetona. Evaporar a sequedad con N2 (40°C). Reconstituir con 1ml AcN : agua (10:90, v/v).

Ortelli y col. (2004) Evaporar 5ml del sobrenadante orgánico hasta sequedad. Redisolver con 1ml de metanol y filtrar en membrana de nylon de 0,45µm.

Pang y col. (2006)

Evaporar hasta 5ml en un baño a 40°C. Transferir a un vial de 10ml. Lavar el tubo de evaporación con 5ml ciclohexano – Eac (1:1, v/v) y mezclar. Filtrar y luego realizar la cromatografía de permeación en gel (GPC). Fase móvil, ciclohexano – EAc (1:1, v/v); flujo, 5ml/min; longitud de onda, 254nm; volumen de inyección, 5ml; tiempos de recolección desde 22min hasta 40min. Columna Bio-Beads S-X3 (400mm×25 mm) Evaporar la fracción recolectada hasta 0,5ml en un baño a 40°C. Cambiar el solvente por 5ml de hexano dos veces, quedando con un volumen final de 1ml.


Evaporar hasta casi sequedad 1mL del extracto en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver con 1ml metanol. Agitar en forma manual o con vórtex 30seg.

76


Referencia Clean up


Evaporar una alícuota de 20ml hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 5ml de isooctano. Acondicionar el cartucho de sílica Sep-Pak con 5ml de isooctano sin dejarlo secar. Adicionar el extracto. Secar con N2 por 20min. Eluir con 5ml diclorometano-acetona (50:50, v/v). Evaporar hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 1ml AcN. Agitar en vórtex y filtrar a través de filtro de nylon de 22µm. Evaporar el metanol hasta sequedad en corriente de N2 a 45°C. Redisolver con 25ml de metanol y centrifugar un par de minutos.

Adicionar a 1ml del extracto 50mg PSA y 150mg MgSO4. Centrifugar. Smalling y Kuivila (2008) Secar con Na2SO4. Evaporar hasta 0,5ml. Eliminar sulfuros a través de columna de GPC con diclorometano - metanol (98:2, v/v) como solvente carrier.

Evaporar hasta 0,5ml nuevamente. Pasar por columna con florisil. Eluir con 100ml EAc al 60% en hexano. Evaporar hasta 0,2ml en corriente de N2 y agregar EAc.

Walorczyk (2007) Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro, 0,5g C18, y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 2500rpm 5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µL de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

Walorczyk (2008)

Previo a la etapa de DSPE tomar una alícuota de sobrenadante y almacenarla al menos 2h en freezer (−26°C). Separar el extracto del precipitado por decantación. Adicionar 100mg MgSO4 anhidro, 75mg C18, y 20mg PSA por ml de extracto. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2min. Acidificar una alícuota con 15 µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN por ml de extracto. Evaporar a sequedad en corriente N2 y redisolver con tolueno. Adicionar el segundo estándar interno (PCB 153).

Walorczyk y Gnusowski

(2009)

Almacenar el sobrenadante en freezer a –26ºC por al menos 2hs. Separar 5mL de extracto del precipitado por decantación y filtración en algodón, en un tubo centrífuga conteniendo 500mg MgSO4 anhidro, 450mg C18, 200mg PSA y 50mg GCB. Agitar en vórtex 2min y centrifugar a 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico al 5% en AcN (v/v). Evaporar el extracto en corriente N2 y redisolver 1,5ml tolueno.


Tomar 5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro, 0,250g C18 y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4000rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 1,5ml con 50µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

Tomar 5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 1,5ml con 50µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

Walorczyk (2012) Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.


(2012)

Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro, 0,075g GCB, 0,55g C18 y 0,15g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Evaporar una alícuota de 3ml hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

77

Tabla II.10: Métodos de preparación de muestra y extracción para cuantificar boscalid


Tomate 10 g Adicionar 0,5ml de agua para obtener 10ml entre agua natural y agregada. Extraer con 20 ml metanol.

Pepino 10 g Adicionar 0,5ml de agua para obtener 10ml entre agua natural y agregada. Extraer con 20 ml metanol.

Limón 10 g Adicionar 1ml de agua para obtener 10 ml entre agua natural y agregada. Extraer con 20 ml metanol.

Pasas de uva 5 g Adicionar 8ml de agua. Extraer con 20 ml metanol.

Alder L., y col. (2004)

Harina de trigo 5 g Adicionar 9ml de agua. Extraer con 20 ml metanol.


Tomate, manzana, naranja

10g Adicionar 10ml EAc y agitar 3s. Agregar 1,5g NaCl y 8g MgSO4 y agitar 15min.Centrifugar a 3700rpm por 5min.

Chen M., y col. (2007)

Pepinos 10 g Homogeinizar con 50 ml Metanol : H2O : 2N HCl (70:25:5, v/v/v) 1min. Filtrar con vacio Advantec N° 2. Ajustar volumen a 100ml con la solución. A 10ml mezclarlo con 10ml de NaCl 10%. Particionar con 50ml hexano agitando 15min.

Uva, orujo, torta,


(2010a) Mosto, vino 20ml

Adicionar una mezcla de acetona, éter y diclorometano (1:2:2, v/v/v). Separar la fase orgánica superior, filtrar y evaporar los solventes por corriente de N2. Redisolver el extracto en una mezcla de ciclohexano y EAc (1:1, v/v).

Cus y col. (2010b)

Vinos 20ml Mezclar con acetona : éter : diclorometano (1:2:2, v/v/v). Filtrar

Gabriolotto C., y col. (2009)

Uvas 25g Adicionar 100ml Acetona-metanol (50:50, v/v). Agitar 15min, centrifugar a 3000 rpm 15min. Repetir la extracción previa remoción del sobrenadante con 50ml Acetona-Metanol, 5min agitación y 5min centrifugación. Filtrar con algodón. Llevar a 250ml con agua.

Uvas blancas 15g Uvas rojas 15g

Adicionar 15ml de EAc : Hexano (1:1, v/v). Homogeinizar vigorosamente en ultrasonido 10min. Agregar 1g NaCl y 5g Na2SO4 anhidro. Agitar en vórtex 2min. Centrifugar 3min, 4000rpm.

Vino blanco 15ml

González-Rodríguez R., y

col. (2009) Vino tinto 15ml

Evaporar el etanol bajo corriente N2 (40°C, 30min). Centrifugar y seguir el procedimiento para uvas.

15g Agitar 20s con 30ml acetona. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20s. Centrifugar 4min a 3600rpm. Hiemstra y de

Kok (2007)

Lechuga, naranja,


harina de trigo

7,5g Agitar 20 seg con 30ml acetona y 7,5g Na2SO4 anhidro. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20s. Centrifugar 4min a 3600rpm.

78






Lohmann W., y col. (2009) Estandar - -

Lozano y col. (2012) Te 2g

Adicionar 4ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y 200µl estándar interno, y agitar 7min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g NaCl, 1g citrato trisódico dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 7min. Centrifugar a 3700rpm 5min. Estándar interno: trifenilfosfato 25mg/l.

Pizzutti I., y col. (2007) Soja 5g Adicionar 10g agua. Reposar 1h. Agregar 100ml de acetona, diclorometano y benceno (1:1:1), y 15g Na2SO4 anhidro.

Homogeinizar 20s. Centrifugar 3600 rpm 3min.


Soja 2g Adicionar 4g de agua. Reposar 1h. Agregar 20ml acetonitrilo - 1% ácido acético. Agitar manualmente 4,5s. Adicionar 2g MgSO4 anhidro y 2,5g NaAc, agitando vigorosamente. Decantar la capa superior de AcN en un tubo con 2g MgSO4 anhidro. Agitar 20seg. Centrifugar 3000rpm 1min. Diluir una alícuota de 0,5ml con 0,5ml metanol.

Schummer C., y col. (2009) Aire - -

Trigo Walorczyk E.

(2008) Alimento animal

deshidratado

5g Adicionar 10ml agua. Agregar 50ml solución estándar interno (TPP a 150mg/ml) y 15ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2min.

Walorczyk E. y Gnusowski

(2009) Abejas 2g (16 - 31

insectos)

Adicionar 15ml AcN - agua (2:1, v/v) y 50ml estandar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 0,5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4 g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.

Walorczyk y col. (2011) Vino 10g Adicionar 10ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado,

4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4000rpm 2,5min.

Frutas y vegetales

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5 g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5min.




(2012)

Trigo sarraceno y

centeno 5g

Adicionar 25ml AcN - agua (2:3, v/v) y 50µl estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.

79

Tabla II.11: Métodos de clean up para cuantificar boscalid

Referencia Clean up


Mezclar 6ml extracto con 2ml NaCl al 20%. Transferir 5ml a una columna Chem-Elut. Dejar equilibrar 5min. Eluir con 16ml diclorometano. Evaporar a 40°C hasta sequedad. Redisolver con 0,25ml metanol en ultrasonido y mezclar con 1ml agua conteniendo 5 mmoles/l formato de amonio. Filtrar con filtro 0,45µm.

Chen M., y col. (2007)

Filtrar la fase orgánica en 20g Na2SO4 anhidro y evaporar hasta sequedad. Redisolver con 2ml hexano y filtrar 0,2 µm de PTFE.

Cus y col. (2010a) Cromatografía de gel permeado. Evaporar el eluato en corriente de N2. Redisolver en mezcla de ciclohexano y EAc (1:1).

Cus y col. (2010b)

Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con ciclohexano-EAc (1:1). Filtrar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,20 micrómetros. Luego GPC (cromatografía de permeación en gel)


Diluir una alícuota de 25ml con 200ml de agua. Pasar por columna Supelclean LC18, previa activación con 6ml metanol, y luego 6mlagua. Eluir con 5ml de metanol.


col. (2009)

Evaporar hasta sequedad 12ml de la fase orgánica en corriente de N2 y redisolver con 3ml AcN. Acondicionar cartucho Envi Carb-II/PSA SPE con 5ml AcN : Tolueno (3:1, v/v). Eluir con 20ml de AcN : Tolueno (3:1, v/v). Evaporar hasta sequedad en corriente de N2. Llevar a 0,5ml con Acetona conteniendo los 3 AP (analyte protectants: 3-ethoxy-1,2-propanediol 10g/l; d-sorbitol y l-gulonic acid -lactone 1g/l; respectivamente). Mezclar 0,285ml del extracto en acetona con 0,015ml de solución de trifenilfosfato usado como estándar interno (10mg/l)

Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 1,1ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acetico. Hiemstra y de

Kok (2007) Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 2,3ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acetico.



Transferir 3ml del sobrenadante a un tubo conteniendo 150mg ClCa anhidro y 150mg PSA. Agitar 30s y centrifugar a 3700rpm por 5min. Adicionar 30µl ácido fórmico 5% en AcN. Evaporar con corriente de N2 y reconstituir con AcN : agua (10:90, v/v).


Evaporar hasta casi sequedad 1mL del extracto en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver con 1mL metanol. Agitar en forma manual o con vórtex 30 seg.

Walorczyk E. (2008)

Previo a la etapa de DSPE tomar una alícuota de sobrenadante y almacenarla al menos 2h en freezer (−26°C). Separar el extracto del precipitado por decantación. Adicionar 100mg MgSO4 anhidro, 75mg C18, y 20mg PSA por mL de extracto. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2min. Acidificar una alícuota con 15µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN por ml de extracto. Evaporar a sequedad en corriente N2 y redisolver con tolueno. Adicionar el segundo estándar interno (PCB 153).


(2009)

Almacenar el sobrenadante en freezer a –26ºC por al menos 2hs. Separar 5ml de extracto del precipitado por decantación y filtración en algodón, en un tubo centrífuga conteniendo 500mg MgSO4 anhidro, 450mg C18, 200mg PSA y 50mg GCB. Agitar en vortex 2min y centrifugar a 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3m, con 50µl de ácido fórmico al 5% en AcN (v/v). Evaporar el extracto en corriente N2 y redisolver 1,5ml tolueno.

80


Referencia Clean up



Tomar 5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 1,5ml con 50µL de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

Walorczyk (2012) Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µL de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.


(2012)


Tabla II.12: Métodos de preparación de muestra y extracción para cuantificar pyraclostrobin






Alder y col. (2004)

Harina de trigo

5g Adicionar 9ml de agua. Extraer con 20ml metanol.

10g Extraer con 10ml EAc y 10g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar y centrifugar a 2000rpm 5min.

25g Extraer con 25ml EAc y 25g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar y centrifugar a 2000rpm 5min. Banerjee y col.

(2007) Uvas

10g QUECHERS: Adicionar 10ml AcN, 4g MgSO4 anhidro y 1g cloruro de sodio.


Pera, uva, limón 5g

Adicionar 2ml etanol. Sonicar 1min a temperatura ambiente. Centrifugar a 6000rpm por 5min. Diluir el sobrenadante a 14ml con solución buffer de acetato (0,04M). Adicionar 5% (p/v) de NaCl.

Uvas 5g De Melo Abreu y col. (2006) Vino 5ml

Adicionar 10ml de solución EAc : Hexano (50:50, v/v). Agitar 15min a 8rpm. Dejar separar las fases y remover la fase orgánica.

Uvas 5g Garau y col. (2009) Vino 5ml

Adicionar 10ml de solución EAc : Hexano (50:50 v/v). Agitar 15min. Dejar separar las fases y remover la fase orgánica.

81


Referencia Matriz Cantidad Preparación de la muestra y Extracción Uvas blancas 15 g

Uvas rojas 15 g Adicionar 15 ml de EAc - Hexano (1:1, v/v). Homogeinizar vigorosamente en ultrasonido 10min. Agregar 1g NaCl y 5g Na2SO4 anhidro. Agitar en vórtex 2min. Centrifugar a 4000rpm 3min.

Vino blanco 15 ml

González-Rodríguez y col.

(2009) Vino tinto 15 ml

Evaporar el etanol bajo corriente N2 (40°C, 30min). Centrifugar y seguir el procedimiento para uvas.

15g Agitar 20s con 30ml acetona. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20s. Centrifugar a 3600rpm 4min. Hiemstra y col.

(2007)

Lechuga, naranja,


harina de trigo

7,5g Agitar 20s con 30ml acetona y 7,5 g Na2SO4 anhidro. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20s. Centrifugar a 3600rpm 4min



espinaca

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl y agitar 1min. Centrifugar a 11000rpm 5min. Filtrar una alícuota del sobrenadante en filtro de 0,2µm.





Uva, limón, cebolla, tomate

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g ClNa, 1g citrato de sodio dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 1min. Ajustar el pH a 5-5,5 con NaOH. Centrifugar a 5000rpm 3min. Estándar interno: trifenilfosfato 1µg/ml.

Menezes Filho y col. (2010a) Mango 3g

Adicionar 10ml solución alcohol isopropílico - agua (20:80, v/v) con 5% NaCl. Ajustar a pH 3 con HCl. Agitar a 1000rpm 10min. Centrifugar a 5000rpm 15min. Transferir la capa superior a un vial de 10ml y enrazar con la mezcla alcohol - agua. SPME: Fibra de Poliacrilato (85µm). Inmersión directa a 50ºC 30min con agitación a 250rpm en ciclos alternados (30s de agitación seguidos de 10s sin agitación). Colocar la fibra en el inyector. Desorsión 5min a 280ºC. Luego de la extracción limpiar la fibra a 280ºC durante 1min en atmósfera de helio.


Agua superficial y subterránea

250ml

Filtrar a través de membrana de 0,45µm. SPME: Fibra de Poliacrilato (85µm). Inmersión directa a 50ºC 30min con agitación a 250rpm en ciclos alternados (30seg de agitación seguidos de 10s sin agitación). Colocar la fibra en el inyector. Desorsión 5min a 280ºC. Luego de la extracción limpiar la fibra a 280ºC durante 1min en atmósfera de helio.

Nguyen y col (2009) Hierbas 2,5g

Adicionar 10ml de agua y la mezcla de 4 estándares internos (naphthalene-d8, acenaphthene-d10, phenanthrene-d10, fluoranthene-d10). Extraer con 10ml AcN (HAc 0.5%). Agitar 1min. Guardar en heladera 30min. Cuando la temperatura llegue a 4ºC agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min.

Pizzutti y col. (2007) Soja 5g

Adicionar 10g agua. Reposar 1h. Agregar 100ml de acetona, diclorometano y benceno (1:1:1), y 15g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar 20s. Centrifugar 3600 rpm 3min.

82




Soja 2g

Adicionar 4g de agua. Reposar 1h. Agregar 20ml AcN - 1% ácido acético. Agitar manualmente 4,5s. Adicionar 2g MgSO4 anhidro y 2,5g NaAc, agitando vigorosamente. Decantar la capa superior de AcN en un tubo con 2g MgSO4 anhidro. Agitar 20seg. Centrifugar 3000rpm 1min. Diluir una alícuota de 0,5ml con 0,5ml de metanol.

Schummer y col. (2009)

Aire - -

12,5g Adicionar 10g Na2SO4 y extraer 2min con 50ml EAc a 10000rpm. Filtrar bajo vacio a través de una capa de Na2SO4. Lavar con 25ml EAc.

0,15g Utilizar cartucho C18 de microextracción. Adicionar 3 volúmenes de metanol de 100µl. Recolectar el líquido. Schurek y col.

(2008) Trigo

5g Adicionar 5g de agua y 10ml AcN. Agitar en vortex 1min. Adicionar 4g MgSO4 y 1g NaCl, y agitar 1min. Centrifugar a 11000rpm 5min.

Smalling y Kuivila (2008) Sedimentos 10g Humedecer y realizar dos extracciones con diclorometano - metanol (9:1, v/v) asistidas por microondas (MAE) de 10min

cada una. La primera a 100ºC y la segunda a 120ºC.

Viñas y col. (2009)

Alimento para bebé 25g

Diluir hasta 100ml con agua. Sonicar 5min. Filtrar y enfriar a 4ºC (30min). Tomar 8ml de muestra y adicionarle 1ml buffer fosfato 0.15M pH 5 y agua para ajustar el volumen a 14ml. Agitar 1min previa inmersión de la fibra. SPME: Fibra de PDMS - DVB (65µm). Inmersión directa a 60ºC 40min con agitación a 1700rpm. Colocar la fibra en el inyector. Desorsión 4min a 240ºC.


(2009) abejas 2g (16 - 31

insectos)

Adicionar 15ml AcN : agua (2:1, v/v) y 50mL estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 0,5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar a 4500rpm 2,5 min

Walorczyk y col. (2011) Vino 10g

Adicionar 10ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4000rpm 2,5min.

Frutas y vegetales





(2012)

Trigo sarraceno y

centeno 5g

Adicionar 25ml AcN - agua (2:3, v/v) y 50µl estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.

83

Tabla II.13: Métodos de clean up para cuantificar pyraclostrobin

Referencia Clean up

Alder y col. (2004)

Mezclar 6ml del extracto con 2ml NaCl al 20%. Transferir 5ml a una columna Chem-Elut. Dejar equilibrar 5min. Eluir con 16ml diclorometano. Evaporar a 40°C hasta sequedad. Redisolver con 0,25 ml metanol en ultrasonido y mezclar con 1ml agua conteniendo 5 mmoles/litro formato de amonio. Filtrar con filtro 0,45 µm.

Limpiar 5ml del sobrenadante por DSPE con 25mg PSA. A 4ml adicionar 200µl de dietilenglicol (10% metanol) y mezclar vigorosamente. Evaporar hasta casi sequedad a 35°C. Redisolver con 1ml metanol y 1ml ácido acético (0,1% en agua) sonicando 1min. Agitar en vórtex 30seg. Centrifugar a 10000rpm 5min. Filtrar con filtro 0,2µm.


DSPE: 150mg MgSO4 anhidro y 25mg PSA.


SBSE (polidimetilsiloxano): sumergirla en la solución agitada a 2000rpm. Establecer una temperatura de extracción de 45°C por 20min. Enjuagar la barra con agua destilada. Extraer desde la barra con 100µl AcN : agua (50:50, v/v).

De Melo Abreu y col. (2006)

Evaporar hasta sequedad 1ml del extracto en corriente de nitrógeno. Para análisis por HPLC redisolver con 1ml fase móvil. Para análisis por GC redisolver con 0,5ml solución EAc - Hexano (50:50, v/v)

Garau y col. (2009) Evaporar hasta sequedad 1ml del extracto en corriente de nitrógeno. Redisolver con 1ml fase móvil.


(2009)

Evaporar hasta sequedad 12ml de la fase orgánica en corriente de N2 y redisolver con 3ml AcN. Acondicionar cartucho Envi Carb-II/PSA SPE con 5ml AcN - Tolueno (3:1, v/v). Eluir con 20ml de AcN - Tolueno (3:1, v/v). Evaporar hasta sequedad en corriente de N2. Llevar a 0,5ml con Acetona conteniendo los 3 AP (“analyte protectants”: 3-ethoxy-1,2-propanediol 10g/l; d-sorbitol y l-gulonic acid -lactone 1g/L; respectivamente). Mezclar 0,285ml del extracto en acetona con 0,015ml de solución de trifenilfosfato usado como estándar interno (10mg/l)

Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 1,1ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acético. Hiemstra y col.

(2007) Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 2,3ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acético.



Adicionar a 6ml de extracto 150mg PSA y 950mg MgSO4. Centrifugar a 5000rpm 3min. Filtrar en filtro de 0,45µm. Transferir 1,5ml a un vial conteniendo 15µl de solución de ácido fórmico al 5%.

Nguyen y col (2009)

Colocar 2ml del extracto en un vial con 50mg PSA, 300mg MgSO4, 30mg GCB. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min a 4ºC. Evaporar hasta sequedad 1,2ml del extracto. Redisolver con 0,25ml AcN conteniendo 0,1mg/l de TPP.


Evaporar hasta casi sequedad 1mL del extracto en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver con 1ml metanol. Agitar en forma manual o con vórtex 30s.

Schurek y col. (2008) Evaporar con evaporador rotatorio a 40°C hasta un volumen de 20ml. Llevar a 25ml con EAc.

84


Referencia Clean up

Evaporar el metanol hasta sequedad en corriente de N2 a 45°C. Redisolver con 25ml de metanol y centrifugar un par de minutos.

Adicionar a 1ml del extracto 50mg PSA y 150mg MgSO4. Centrifugar. Smalling y Kuivila (2008) Secar con Na2SO4. Evaporar hasta 0,5ml. Eliminar sulfuros a través de columna de GPC con diclorometano - metanol (98:2, v/v) como solvente carrier.

Evaporar hasta 0,5ml nuevamente. Pasar por columna con florisil. Eluir con 100ml EAc al 60% en hexano. Evaporar hasta 0,2ml en corriente de N2 y agregar EAc.


(2009)

Almacenar el sobrenadante en freezer a –26ºC por al menos 2hs. Separar 5ml de extracto del precipitado por decantación y filtración en algodón, en un tubo centrífuga conteniendo 500mg MgSO4 anhidro, 450mg C18, 200mg PSA y 50mg GCB. Agitar en vórtex 2min y centrifugar a 4500rpm 2,5 min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico al 5% en AcN (v/v). Evaporar el extracto en corriente N2 y redisolver 1,5ml tolueno.






(2012)


Tabla II.14: Métodos de preparación de muestra y extracción para cuantificar cyprodinil






Alder y col. (2004)

Harina de trigo 5g Adicionar 9ml de agua. Extraer con 20ml metanol.

85


Referencia Matriz Cantidad Preparación de la muestra y Extracción Asensio-Ramos y

col. (2008) Agua mineral - -

Basa Cesnik y col.

(2008) Uvas 20g Mezclar con acetona-eter-diclorometano (1:2:2). Filtrar.

Agua 500ml Acidificar a pH 3,5 y ajustar la conductividad a 50mS con HCl/NaCl. Belmonte Vega y

col. (2005) Suelo 30g Sonicar con 40ml metanol-agua (4:1, v/v) por 20min. Filtrar a través de filtro de nylon de 0,45µm. Evaporar el solvente orgánico. Llevar a 50ml con agua. Acidificar a pH 3,5 y ajustar la conductividad a 50mS con HCl/NaCl.

Blasco y col. (2009) Leche 5ml

Adicionar 5ml AcN. Agitar 10-15seg. Centrifugar a 4000rpm 15min. Transferir 5ml sobrenadante a un tubo de centrífuga conteniendo 45ml ácido fórmico 0,1%. Invertir el tubo 3 o 4 veces para mezclar.


Frutilla 10g Adicionar 10ml AcN. Agitar 1min en vórtex. Agregar 1g NaCl y 4g MgSO4 y agitar nuevamente. Centrifugar a 2750g durante 6min.

Bolaños y col. (2008) Vino, cerveza 15ml

Cortar la fibra hueca en piezas de 2cm e introducirla en el soporte de la jeringa de 10µl. Impregnar la fibra con 1-octanol (1min) y luego introducirla en un vial con la muestra. Agitar 45min a 9rpm. Colocar sólo la fibra en un vial de 2ml conteniendo 1,5ml metanol. Agitar 5min a 30rpm. Retirar la fibra e inyectar 5µl en el equipo.

Cabras y col. (1997)

Uva, mosto, vino

5g Adicionar 2g NaCl y 10ml acetona-eter (50:50, v/v). Homogeinizar 20min. Colocar la fase orgánica en un tubo conteniendo 1g Na2SO4 anhidro.

Cajca y col. (2005)

Alimento para bebe a base

de fruta 15g Adicionar 15ml ácido acético al 1% en acetonitrilo. Adicionar 6g MgSO4 anhidro y 2,5g acetato de sodio trihidratado.

Agitar vigorosamente 1min. Centrifugar a 3450 rcf por 1 minuto.

Cajca y col. (2012)

Te verde y negro

2g Adicionar 10ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, y agitar 1min. Centrifugar a 10000rpm por 5min. Agregar a 1ml del extracto 1ml hexano y 5ml NaCl al 20% (p/p) y agitar 1min. Centrifugar a 10000rpm por 1min.

Coscollà y col. (2009) Aire - -

Uva Mosto

Cunha y col. (2009a)

Vino 10g Adicionar 10ml AcN, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl. Adicionar 50µl TPP (estándar interno). Agitar manualmente 1min.

Centrifugar a 5000g 1min.


Jugo de manzana 50g

Centrifugar 12000rpm 5min. 5g de sobrenadante se transfirió a un tubo conteniendo 25µl TPP (100mg/l). Adicionar una mezcla de 400µl acetona y 100µl CCl4. Agitar manualmente 1min. Centrifugar a 5000rpm 2min.

Uva, orujo, torta,


(2010a) Mosto, vino 20ml

Adicionar una mezcla de acetona, eter y diclorometano (1:2:2). Separar la fase orgánica superior, filtrar y evaporar los solventes por corriente de N2. Redisolver el extracto en una mezcla de ciclohexano y EAc (1:1).

Cus y col. (2010b)

Vinos 20ml Mezclar con acetona-eter-diclorometano (1:2:2). Filtrar

86


Referencia Matriz Cantidad Preparación de la muestra y Extracción Uva 10g Dasgupta y col.

(2010) Vino 10ml Adicionar 10ml EAc y 10g Na2SO4 anhidro.Homogeinizar y centrifugar a 2000rpm 5min

Economou y col. (2009) Vino 10ml

Diluir la muestra a 100ml con agua deionizada. Pasar a través de cartuchos Oasis HLB de SPE con vacío a un flujo de 5ml/min. Previamente acondicionar los cartuchos con 6ml metanol y 6ml agua deionizada. Lavar el cartucho con la muestra con 5ml agua deionizada. Secar con vacío durante 10min. Eluir dos veces con 5ml metanol en un vial conteniendo 0,5ml agua. Evaporar hasta 0,5ml a 40°C. Llevar a 5ml con metanol. Diluir con agua (1:4 v/v). Filtrar a través de 0,22µm.


Morrón y Tomate

10g Homogeinizar con 20ml acetona por 2min. Adicionar EAc/ciclohexano (1/1, v/v). Centrifugar a 4000g 10min. Filtrar.


(2008)

Pepino y naranja

10g Adicionar 10ml AcN con 1% ácido acético. Agitar 1min en vortex. Agregar 1g acetato de sodio y 4g MgSO4 y agitar nuevamente. Centrifugar a 4000rpm (2750g) durante 6min.

Garrido Frenich y col. (2004)

Vegetales 10g Homogeinizar con 50ml EAc 2min. Adicionar 20g Na2SO4 y mezclar 1min. Filtrar y lavar dos veces con 15ml EAc. Recolectar el filtrado junto con los líquidos de lavado. Evaporar a sequedad a 60°C. Redisolver con 5ml metanol. Tomar 0,5ml y llevarlo a 2ml con agua destilada.

González Rodríguez y col.

(2008a, b)

Acelga, Espinaca y Lechuga

10g Extraer con 30ml AcN. Homogeinizar en ultrasonido por 10min. Agregar 3gNa Cl y 12g MgSO4 anhidro y agitar 5min. Dejar particionar 10min.

Guerrero y col. (2007)

Vinagre 40ml

SBSE: Agregar 40ml de estándar interno (heptacloro epoxi 3,42 mg/l en acetona). Colocar dentro del erlenmeyer con la muestra la barra magnética de 20mm de longitud × 0,5mm de espesor del polímero PDMS. Agitar a 1000rpm a 25°C 150min. Luego colocar la barra pocos segundos en agua destilada y secarla. Transferirla a un tubo de vidrio donde se realiza la desorción térmica (300°C 15min)

25g

Schenck modificado: Adicionar 50ml AcN. Ultrasonicar 1-5min. Filtrar. Adicionar 2,5g NaCl. Agitar 1min. Dejar separar las fases 15min. Extraer la capa superior y adicionarle 2g MgSO4 anhidro. Agitar 1min. Evaporar hasta menos de 1ml y transferir a cartucho SPE-NH2 con una capa de 1cm de MgSO4. Acondicionar previamente la columna con acetona. Eluir con 15ml acetona. Evaporar hasta sequedad con N2. Redisolver con 5ml tolueno.

5g MSPD: Mezclar con 8g florisil. Transferir a una columna de vidrio de 25cm x 15mm rellena con lana de vidrio y una capa de 2,5g de MgSO4 anhidro. Eluir la columna con 60ml EAc. Evaporar hasta sequedad el eluato. Redisolver con 1ml tolueno.

10g

QuEChERS: Adicionar 10ml AcN y homogeinizar a 19000rpm 3min. Adicionar 1g NaCl y 4g MgSO4 y agitar manualmente 1min. Centrifugar a 3000rpm 5min. Transferir la capa superior a un tubo conteniendo 25mg PSA y 125mg MgSO4 por cada ml de extracto. Agitar manualmente 1min. Centrifugar a 3000rpm 5min. Evaporar hasta sequedad con N2. Redisolver con tolueno.

Hercegová y col. (2006)

Manzana

10g QuEChERS modificado: Adicionar 10ml AcN y homogeinizar a 19000rpm 3min. Adicionar 1g NaCl y 4g MgSO4 y agitar manualmente 1min. Centrifugar a 3000rpm 5min. Transferir 5ml de la capa superior a una columna de SPE. Eluir con 10ml acetona. Evaporar hasta sequedad con N2. Redisolver con 2ml tolueno.

87




Manzana 25g

Adicionar 50ml AcN. Ultrasonicar 1-5min. Filtrar. Adicionar 2g NaCl. Agitar 1min. Dejar separar las fases 15min. Extraer la capa superior y adicionarle 1g MgSO4 anhidro. Agitar 1min. Evaporar hasta menos de 1ml y transferir a cartucho SPE-NH2 con una capa de 1cm de MgSO4. Acondicionar previamente la columna con acetona. Eluir con 15ml acetona. Evaporar hasta sequedad con N2. Redisolver con 5ml tolueno.


Tomate, limón, pasas

y palta 20g

Mezclar con 60ml metanol:agua (80:20, v/v) con 0,1% ácido fórmico durante 2min a 8000rpm. Filtrar. Diluir el filtrado con metanol:agua (80:20, v/v) con 0,1% ácido fórmico hasta un volumen final de 100ml. Tomar una alícuota de 2,5ml y diluir a 20ml con agua (0,1% ácido fórmico).


Manzana, lechuga y naranja

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Adicionar 4g MgSO4 y 1g NaCl y agitar 30s. Centrifugar a 4300g por 5min. Transferir 1ml del extracto a un tubo conteniendo 150mg MgSO4. Centrifugar a 5200g por 1min. Ajustar el volumen de 500µl a 1ml con agua.

15 g Agitar 20s con 30ml acetona. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20 seg. Cetntrifugar 4 min a 3600 rpm.


Lechuga, naranja,


harina de trigo

7,5 g Agitar 20s con 30ml acetona y 7,5 g Na2SO4 anhidro. Adicionar 30ml diclorometano y 30ml benceno, agitar 20 seg. Centrifugar 4 min a 3600 rpm.

Huang y col. (2009) Te 1g

Mezclar con 5ml AcN. Agitar 1min. Sonicar 20min. Centrifugar a 3000rpm por 3min. Extraer nuevamente el residuo con 2ml AcN y centrifugar. Combinar los sobrenadantes.

Kirchner y col. (2008)

Manzana 10g Adicionar 10ml AcN y homogeinizar a 19000rpm 3min. Adicionar 1g NaCl y 4g MgSO4 y agitar manualmente 1min. Centrifugar a 4000rpm 5min. Transferir la capa superior a un tubo conteniendo 25mg PSA y 150mg MgSO4 por cada ml de extracto. Agitar manualmente 1min. Centrifugar a 4000rpm 5min.



espinaca

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl y agitar 1min. Centrifugar a 11000rpm 5min. Filtrar una alícuota del sobrenadante en filtro de 0,2µm.




10g

Adicionar 10ml AcN : ácido acético (99:1, v/v), 4g MgSO4 anhidro y 1,66g acetato de sodio y agitar inmediatamente. Centrifugar a 4300rpm 5min. Tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y evaporar hasta 0,8ml en corriente de nitrógeno. Ajustar el volumen a 1ml con tolueno. Transferir el extracto a un vial conteniendo 50mg PSA, 150mg MgSO4 anhidro y 50mg carbón. Agitar en vórtex 30s, centrifugar a 5000rpm 1min.


Naranja, Papa y

alimento para bebé a base de cereales

10g

Adicionar 10ml AcN : ácido acético (99:1, v/v), 4g MgSO4 anhidro y 1,66g acetato de sodio y agitar inmediatamente. Centrifugar a 4300rpm 5min. Tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y evaporar hasta 0,8ml en corriente de nitrógeno. Ajustar el volumen a 1ml con tolueno. Transferir el extracto a un vial conteniendo 50mg PSA, 150mg MgSO4 anhidro. Agitar en vórtex 30s, centrifugar a 5000rpm 1min. Diluir el sobrenadante con agua (1:10, v/v).

Lee y Jo (2012) Ginseng coreano 50g

Adicionar 100ml AcN y mezclar 10min. Filtrar. Adicionar 20g NaCl anhidro. Agitar 3min. Centrifugar a 4000rpm por 5min a 4°C.

88





10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g ClNa, 1g citrato de sodio dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 1min. Ajustar el pH a 5-5,5 con NaOH. Centrifugar a 5000rpm 3min. Estándar interno: trifenilfosfato 10µg/ml.

Lozano y col. (2012) Te 2g

Adicionar 4ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y 200µl estándar interno, y agitar 7min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1gNa Cl, 1g citrato trisódico dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 7min. Centrifugar a 3700rpm 5min. Estándar interno: trifenilfosfato 25mg/l.

Marín y col. (2009) Agua 100ml Centrifugar a 4500rpm por 5min. Agregar 1ml metanol al sobrenadante.

Marinas y col. (2010) Aceite oliva 2g

Mezclar con 2ml hexano. Adicionar 10ml AcN y 0,2g Na2SO4. Agitar 20min. Dejar separar las fases por 60min. Luego evaporar 9ml de la fase con AcN a 40°C bajo vacío. Reconstituir con 4ml de la fase móvil del GPC (ciclohexano : EAc, 50:50, v/v).

Uvas Homogeinizar a 8000rpm 3min con 30ml Acetona-Diclorometano (1:1, V/v) y 2g NaCl anhidro. Filtrar (tamaño poro N°4) y luego por Whatman 2100150 1 PS en un tubo de vidrio conteniendo 10ml de la mezcla de solventes.

Navarro y col. (2000)

Mosto y vino 5g Mezclar con 20ml Acetona-Diclorometano (1:1, V/v) y 2g NaCl anhidro. Colocar en baño de ultrasonido con agua

destilada por 10min. Pasar por Whatman 2100150 1 PS en un tubo de vidrio conteniendo 10ml de la mezcla de solventes.

Nguyen y col. (2008)

Repollo y rábano 10g

Adicionar la mezcla de 6 estándares internos (naphthalene-d8, acenaphthene-d10, phenanthrene-d10, fluoranthene-d10, Chrysene-d12,Perylen-d12). Extraer con 10mL AcN (HAc 0,5%).Agitar 1min. Guardar en heladera 30min. Cuando la temperatura llegue a 4ºC agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min.



y frutilla 20g Adicionar 10ml agua y ajustar el pH a 6-7. Agitar 15min con 40ml EAc. Centrifugar a 1000rpm 5min.

Pang y col. (2006)

Tejido animal 10g Adicionar 20g Na2SO4. Agregar 35ml ciclohexano - EAc (1:1, v/v). Homogeinizar a 15000rpm 1,5min. Centrifugar a 1400rpm 3min. Filtrar a través de 15g Na2SO4 y recolectar el filtrado. Repetir la extracción con 35ml de la mezcla de solventes. Centrifugar y juntar los filtrados.

Patil y col. (2009) Vino 20ml Adicionar 20ml agua acidificada con 1% HCl. Agitar 2min. Adicionar 10ml EAc y 20g Na2SO4 anhidro y agitar 1min. Centrifugar a 5000rpm por 7min a -5°C. Separar el sobrenadante y agregarle 2g CaCl2 anhidro. Agitar 30s y centrifugar a 5000rpm por 7min a -5°C.

Pizzutti I., y col. (2009) Soja 2 g

Adicionar 4g de agua. Reposar 1h. Agregar 20 ml acetonitrilo - 1% ácido acetico. Agitar manualmente 4,5s. Adicionar 2g MgSO4 anhidro y 2,5g NaAc, agitando vigorosamente. Decantar la capa superior de AcN en un tubo con 2g MgSO4 anhidro. Agitar 20seg. Centrifugar 3000rpm 1min. Diluir una alícuota de 0,5ml con 0,5ml metanol.


Soja 5g Adicionar 10g agua. Reposar 1h. Agregar 100ml de acetona, diclorometano y benceno (1:1:1), y 15g Na2SO4 anhidro. Homogeinizar 20s. Centrifugar 3600rpm 3min.

Rial Otero y col. (2003) Uva 60g Fortificar con 30µl de solución metanólica 1000mg/l de carbofuran como estándar interno. Adicionar 100ml de

diclorometano-acetona (75:25, v/v) y 45g Na2SO4 anhidro. Agitar vigorosamente 5min. Centrifugar a 10000rpm 15min.

89



Rial Otero y col. (2002) Vino blanco 30ml

SPME: Adicionar lindano como estándar interno (3ml de la solución 100mg/l). Insertar la fibra de DVB–CAR–PDMS 30min. La extracción se realiza agitando y a temperatura ambiente. Desorber 5min a 240°C en el puerto de inyección del GC.

Rial Otero y col. (2004) Suelo 10g

La muestra se seca al aire y se tamiza para eliminar partículas mayores a 2mm. Sonicar 10min a temperatura ambiente con 15ml de buffer pH 8 de Na2CO3 anhidro (3,6% p/v) y polifosfato de sodio (0,8% p/v) en agua destilada. Adicionar 10ml EAc. Agitar a 200rpm 45min. Extraer la fase orgánica con pipeta Pasteur. Filtrar a través de 0,15g de Na2SO4 anhidro.

Štajnbaher & Zupan�i�-Kralj

(2003)

Manzana, chaucha, naranja

10g Adicionar 20ml acetona y agitar en vórtex por 2min. Centrifugar a 3000rpm por 5min.

Vaquero Fernández y col.

(2008) Mosto y vino 20ml Adicionar 25ml diclorometano y agitar durante 15min. Separar el extracto y agregar Na2SO4 anhidro.

Walorczyk (2007) Trigo

Trigo


deshidratado

5g Adicionar 10ml agua. Agregar 50 ml solución estándar interno (TPP a 150 mg/ml) y 15ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2min.


(2009) abejas


Adicionar 15ml AcN - agua (2:1, v/v) y 50ml estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 0,5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.



Frutas y vegetales





(2012)

Trigo sarraceno y

centeno 5g

Adicionar 25ml AcN - agua (2:3, v/v) y 50µl estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.

90

Tabla II.15: Métodos de clean up para cuantificar cyprodinil

Referencia Clean up

Alder y col. (2004)

Mezclar 6ml del extracto con 2ml NaCl al 20%. Transferir 5ml a una columna Chem-Elut. Dejar equilibrar 5min. Eluir con 16ml diclorometano. Evaporar a 40°C hasta sequedad. Redisolver con 0,25 ml metanol en ultrasonido y mezclar con 1ml agua conteniendo 5 mmoles/litro formato de amonio. Filtrar con filtro 0,45 µm.

Asensio-Ramos y col. (2008)

Introducir porciones de nanotubos de carbono de 0,04g en tubos de vidrio con frits en ambos lados para sostener la fase estacionaria. Preacondicionar con 10ml de AcN y luego 10ml agua.Ajustar el pH de la muestra a 8 y pasarla por el cartucho. Secar el cartucho bajo vacío 20min. Eluir con 10ml AcN al 5% de ácido fórmico y 20ml de diclorometano al 5% de ácido fórmico. Evaporar a sequedad a 40ºC bajo vacío. Redisolver con cantidad necesario de solución de estándar interno (ametrin) y solución metanol-AcN (78:22, v/v), 1,11mM HClO4 hasta alcanzar un volumen final de 1ml.

Basa Cesnik y col.

(2008)

Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con ciclohexano-EAc (1:1, v/v). Filtrar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,20 micrómetros. Luego GPC (cromatografía de permeación en gel)

Belmonte Vega y col. (2005)

Cartuchos Oasis HLB (200mg) previamente acondicionados con 4ml diclorometano, 4ml metanol y 5ml agua. El flujo de muestra es de 8ml/min. Secar en corriente de aire 30min. Eluir con 5ml metanol, 5ml diclorometano. Evaporar a sequedad. Redisolver con fase móvil inicial.

Blasco y col. (2009)

Acondicionar el cartucho de extracción con 5ml AcN y 5ml 0,1% ácido fórmico-AcN (95:5, v/v). Luego adicionar el extracto y hacerlo pasar por el cartucho aplicando vacío hasta un remanente de líquido de 1-2cm. Lavar el cartucho con 5ml ácido fórmico 0,1%. Secar el cartucho aplicando vacío. Eluir por gravedad con 2ml AcN. Adicionar al tubo conteniendo el eluido 1ml de buffer 80mM formato de amonio pH 4,16. Agitar en vórtex. Evaporar a 40ºC bajo corriente de N2 hasta un volumen menor a 0,5ml. Ajustar el volumen a 0,5 con una mezcla de buffer-metanol (80:20, v/v).


Colocar 1ml de muestra extraída en un tubo conteniendo 25mg PSA y 150mg MgSO4. Agitar en vórtex. Centrifugar a 3500g por 1min.


Evaporar 3ml del extracto hasta sequedad bajo corriente de N2. Redisolver con 0,3ml solución de estándar interno (1ml solución 300mg/kg de trifenilfosfato en 1l acetona-hexano 50:50, v/v)


Transferir 1ml extracto a un tubo de minicentrífuga conteniendo 150mg MgSO4 anhidro, 50mg PSA y 50mg C18. Mezclar 20s. Centrifugar a 5000g 1min. Transferir 500µl a un vial conteniendo 50µl de solución interna de malatión-d6.

Cus y col. (2010a) Cromatografía de gel permeado. Evaporar el eluato en corriente de N2. Redisolver en mezcla de ciclohexano y EAc (1:1).

Cus y col. (2010b)

Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con ciclohexano-EAc (1:1). Filtrar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,20 micrómetros. Luego GPC (cromatografía de permeación en gel)

Dasgupta y col. (2010) Adicionar a 1ml del extracto 25mg PSA. Centrifugar a 10000rpm 2min. Filtrar a través de membrana de 0,2µm

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Referencia Clean up

Fenoll y col. (2007) Evaporar la fase orgánica a sequedad. Redisolver con 5ml EAc/ciclohexano (1/1, v/v)


(2008)

Colocar 1ml de muestra extraída en un tubo conteniendo 25mg PSA y 150mg MgSO4. Agitar en vórtex. Centrifugar a 6000rpm (3500g) por 1min. Evaporar a sequedad 800µl del extracto con N2. Redisolver con 400µl de solución de ciclohexano (0,5mg/l). Agitar 10s.


(2008a, b)

Evaporar 15ml de la fase orgánica hasta 1-2ml a 40°C. Acondicionar un cartucho Supelclean Envi Carb-II/PSA con 5ml de AcN : Tolueno (3:1, v/v). Agregar el extracto en AcN al cartucho. Eluir los pesticidas lentamente con 20ml de AcN : Tolueno (3:1, v/v). Evaporar el eluato hasta sequedad a 40°C. Redisolver con 0,5ml de acetona conteniendo 0,5mg/l de cada estándar interno (pentaclorobenceno y fenpropatrin) y los 3 analitos protectors (10 g/l de 3-etoxi-1,2-propanediol, 1 g/l de d-sorbitol y ácido L-gulonico g-lactona). Agitar en vórtex


Acondicionar el cartucho de SPE con 5ml metanol, 5ml metanol : MTBE (10:90, v/v) 0,1% ácido fórmico, 5ml metanol con 0,1% ácido fórmico, y 5ml agua acidificada (0,1% ácido fórmico). Pasar 5ml muestra. Secar pasando aire 1 hora. Eluir con 5ml metanol : MTBE (10:90, v/v) 0,1% ácido fórmico. Agregar 0,5ml agua y evaporar bajo corriente de N2 a 40°C hasta un volumen de 0,5ml. Ajustar el volumen hasta 1ml con metanol:agua(10:90, v/v).

Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 1.1ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acético. Hiemstra y de

Kok (2007) Evaporar hasta casi sequedad una alícuota de 2,3ml en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver en 1ml metanol, 0,02% ácido acético.

Huang y col. (2009)

Para la extracción en fase sólida, adicionar 1cm de Na2SO4 anhidro en un cartucho Carb-NH2. Eluir con 25ml tolueno : AcN (1:3, v/v). Evaporar el volumen eluido hasta sequedad con corriente de N2 a 45°C. Reconstituir con 0,5ml metanol y filtrar a través de membrana de 0,45µm.



Adicionar a 6ml de extracto 150mg PSA y 950mg MgSO4. Centrifugar a 5000rpm 3min. Filtrar en filtro de 0.45�m. Transferir 1.5ml a un vial conteniendo 15µl de solución de ácido fórmico al 5%. Evaporar hasta sequedad y redisolver en 150µl acetona : EAc (1:1, v/v).


Transferir 3ml del sobrenadante a un tubo conteniendo 150mg CaCl2 anhidro y 150mg PSA. Agitar 30s y centrifugar a 3700rpm por 5min. Adicionar 30µl ácido fórmico 5% en AcN. Evaporar con corriente de N2 y reconstituir con AcN : agua (10:90, v/v).


Acondicionar los cartuchos Oasis HLB con 5ml metanol y 5ml agua 1% ácido fórmico. Pasar 100ml de muestra. Secar bajo vacío y eluir con 5ml acetona. Evaporar a sequedad con N2 (40°C). Reconstituir con 1ml AcN : agua (10:90, v/v).

Marinas y col. (2010)

Inyectar 2ml de extracto filtrado en el GPC. Evaporar la fracción de pesticidas que eluye entre 12,5 y 22,5min hasta sequedad y reconstituir con 1ml ciclohexano : EAc (9:1, v/V).

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Referencia Clean up


Evaporar hasta sequedad bajo vacío. Redisolver con 5ml Isooctano-Tolueno (1:1, v/v).


Colocar 2ml del extracto en un vial con 50mg PSA y 300mg MgSO4. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min a 4ºC. Evaporar hasta sequedad 1.2ml del extracto. Redisolver con 0,4ml AcN conteniendo 0,1mg/l de TPP.


Pang y col. (2006)

Evaporar hasta 5ml en un baño a 40°C. Transferir a un vial de 10ml. Lavar el tubo de evaporación con 5ml ciclohexano - EAc (1:1, v/v) y mezclar. Filtrar y luego realizar la cromatografía de permeación en gel (GPC). Fase móvil, ciclohexano - EAc (1:1, v/v); flujo, 5ml/min; longitud de onda, 254nm; volumen de inyección, 5ml; tiempos de recolección desde 22min hasta 40min. Columna Bio-Beads S-X3 (400mm×25 mm) Evaporar la fracción recolectada hasta 0,5ml en un baño a 40°C. Cambiar el solvente por 5ml de hexano dos veces, quedando con un volumen final de 1ml.

Patil y col. (2009) El sobrenadante se limpió por DSPE con 200mg florisil. Evaporar 5ml del sobrenadante limpio hasta sequedad a 35°C con N2. Reconstituir con 1ml ciclohexano : EAc (9:1, v/v). Centrifugar con 25mg PSA.


Evaporar hasta casi sequedad 1mL del extracto en baño de agua (de 45°C a 62°C). Evaporar a sequedad al aire. Redisolver con 1ml metanol. Agitar en forma manual o con vórtex 30s.


Evaporar una alícuota de 20ml hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 5ml de isooctano. Acondicionar el cartucho de sílica Sep-Pak con 5ml de isooctano sin dejarlo secar. Adicionar el extracto. Secar con N2 por 20min. Eluir con 5ml diclorometano-acetona (50:50, v/v). Evaporar hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 1ml AcN. Agitar en vórtex y filtrar a través de filtro de nylon de 22µm.


Evaporar hasta sequedad 8ml del extracto a 40°C. Redisolver con 0,5ml de una solución de lindano (4mg/l) en EAc como estándar interno. Agitar en vórtex.


(2003)

SPE: columnas de vidrio empacadas con 400mg de un polímero de estireno-divinilbenceno. Lavar las columnas con 6ml EAc y acondicionar con 6ml metanol seguido de 8ml agua deionizada. No dejar secar. Después de hacer pasar la muestra, secar al vacío. Eluir con 2ml EAc 1% trietilamnina y con 3 alícuotas de 2ml EAc : acetona (90:10, v/v). Evaporar hasta menos de 1ml con N2 en un baño de agua a 35°C. Adicionar en dos veces 2ml acetona y evaporar hasta un volumen menor. Finalmente concentrar hasta 350ml.


(2008) Evaporar a sequedad. Redisolver con 5ml metanol.

Walorczyk (2007) Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro, 0,5g C18, y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 2500rpm 5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µL de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

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Referencia Clean up

Walorczyk (2008)

Previo a la etapa de DSPE tomar una alícuota de sobrenadante y almacenarla al menos 2h en freezer (−26°C). Separar el extracto del precipitado por decantación. Adicionar 100mg MgSO4 anhidro, 75mg C18, y 20mg PSA por ml de extracto. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2min. Acidificar una alícuota con 15 µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN por ml de extracto. Evaporar a sequedad en corriente N2 y redisolver con tolueno. Adicionar el segundo estándar interno (PCB 153).


(2009)

Almacenar el sobrenadante en freezer a –26ºC por al menos 2hs. Separar 5mL de extracto del precipitado por decantación y filtración en algodón, en un tubo centrífuga conteniendo 500mg MgSO4 anhidro, 450mg C18, 200mg PSA y 50mg GCB. Agitar en vórtex 2min y centrifugar a 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico al 5% en AcN (v/v). Evaporar el extracto en corriente N2 y redisolver 1,5ml tolueno.






(2012)


Tabla II.16: Métodos de preparación de muestra y extracción para cuantificar fludioxonil


Uvas 2g Amvrazi y Tsiropoulos

(2009) Manzanas 2g

Mezclar con 25ml de un buffer pH 4 preparado con acetato de sodio 0,1M y ácido acético 0,1M en acetona/agua, 10/90 (v/v). Homogeinizar a 13000rpm durante 1min y centrifugar a 4000rpm por 10 min. Colocar 7ml del sobrenadante (solución donante) en vial de 10ml con agitador magnético y tapa. SDME: microjeringa de 10ml. Suspenden una microgota (1,6ml) de solvente orgánico (tolueno) y estándar interno (etión) a 1,5cm de la superficie de la solución donante. Se agita a 250rpm durante 25min. Luego se retrae la microgota e inyecta en el GC.

Arrebola y col. (2003) Pepinos 15g

Mezclar con 50g diclorometano y agitar 2min a 19000rpm. Agregar 50g Na2SO4 anhidro y dejar reposar 2min. Filtrar a través de Na2SO4 anhidro.

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Referencia Matriz Cantidad Preparación de la muestra y Extracción Papas Basa Cesnik y

Gregorcic (2003) Lechuga Basa Cesnik y col.

(2008) Uvas

20g Mezclar con acetona-eter-diclorometano (1:2:2). Filtrar.

5g Extracción Acelerada con Solvente: Dispersar las semillas trituradas en 35g de arena de Fontainebleau. Colocar en las celdas de extracción previamente calentadas 5min. Las muestras se extraen en dos ciclos de calentamiento de 5min a 120°C y 1500psi de presión con AcN. Bourgin y col.

(2009) Trigo y maíz

5g Extracción Asistida con Ultrasonido: Agregar 14ml AcN a las semillas trituradas y colocar en ultrasonido 30min a temperatura ambiente. Luego agitar vigorosamente una hora. Dejar reposar 10min. Remover el sobrenadante. Lavar la fase sólida dos veces con AcN (2 – 5ml). Mezclar los sobrenadantes.


uva, mosto, vino 5g

Adicionar 2g NaCl y 10ml acetona-eter (50:50, v/v). Homogeinizar 20min. Colocar la fase orgánica en un tubo conteniendo 1g Na2SO4 anhidro.

Cajca y col. (2012)

Te verde y negro 2g

Adicionar 10ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, y agitar 1min. Centrifugar a 10000rpm por 5min. Agregar a 1ml del extracto 1ml hexano y 5ml NaCl al 20% (p/p) y agitar 1min. Centrifugar a 10000rpm por 1min.


manzana 10g Mezclar con 20g tierra de diatomeas. Transferir a una columna de vidrio. Eluir los pesticidas con 160ml hexano-

diclorometano (1:1) a 5ml/min. Lavar con 8ml de solvente.

Cus y col. (2010) Vinos 20ml Mezclar con acetona : eter : diclorometano (1:2:2, v/v/v). Filtrar. Fenoll y col.

(2007) Pimientos y

Tomate 10g Homogeinizar con 20ml acetona durante 2min. Adicionar 20ml EAc : ciclohexano (1:1, v/v). Centrifugar 10min a 4000rpm. Filtrar.

Fernández González y col.

(2003) Uva blanca 60g Adicionar 24µl de lindano como estándar interno (100mg/l). Adicionar 100ml diclorometano : acetona (75:25, v/v) y 45g

Na2SO4 anhidro. Agitar 5min y centrifugar a 10000rpm 15min.


(2008a, b)

Acelga, Espinaca y Lechuga

10g Extraer con 30ml AcN. Homogeinizar en ultrasonido por 10min. Agregar 3g NaCl y 12g MgSO4 anhidro y agitar 5min. Dejar particionar 10min.


Vinagre 40ml

SBSE: Agregar 40ml de estándar interno (heptacloro epoxi 3,42 mg/l en acetona). Colocar dentro del erlenmeyer con la muestra la barra magnética de 20mm de longitud × 0,5mm de espesor del polímero PDMS. Agitar a 1000rpm a 25°C 150min. Luego colocar la barra pocos segundos em agua destilada y secarla. Transferirla a un tubo de vidrio donde se realiza la desorción térmica (300°C 15min)

Juan-García y col. (2005)

Frutilla, Uva, Lechuga y

Tomate 5-25g


Lechuga y Uvas

5g

Aplicar ultrasonido 15min. Adicionar 10ml Agua : Acetona (50:50, v/v) y homogeinizar otros 15min. Filtrar la suspension. Lavar la torta de filtrado dos veces con 20ml de la solución.

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espinaca

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 y 1g CNal y agitar 1min. Centrifugar a 11000rpm 5min. Filtrar una alícuota del sobrenadante en filtro de 0,2µm.




10g

Adicionar 10ml AcN : ácido acético (99:1, v/v), 4g MgSO4 anhidro y 1,66g acetato de sodio y agitar inmediatamente. Centrifugar a 4300rpm 5min. Tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y evaporar hasta 0,8ml en corriente de nitrógeno. Ajustar el volumen a 1ml con tolueno. Transferir el extracto a un vial conteniendo 50mg PSA, 150mg MgSO4 anhidro y 50mg carbón. Agitar en vórtex 30s, centrifugar a 5000rpm 1min.


Naranja, Papa y

alimento para bebé a

base de cereales

10g

Adicionar 10ml AcN : ácido acético (99:1, v/v), 4g MgSO4 anhidro y 1,66g acetato de sodio y agitar inmediatamente. Centrifugar a 4300rpm 5min. Tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y evaporar hasta 0,8ml en corriente de nitrógeno. Ajustar el volumen a 1ml con tolueno. Transferir el extracto a un vial conteniendo 50mg PSA, 150mg MgSO4 anhidro. Agitar en vórtex 30s, centrifugar a 5000rpm 1min. Diluir el sobrenadante con agua (1:10).


50g Adicionar 100ml AcN y mezclar 10min. Filtrar. Adicionar 20g NaCl anhidro. Agitar 3min. Centrifugar a 4000rpm por 5min a 4°C.



10g Adicionar 10ml AcN y agitar 1min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g NaCl, 1g citrato de sodio dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 1min. Ajustar el pH a 5-5,5 con NaOH. Centrifugar a 5000rpm 3min. Estándar interno: trifenilfosfato 10µg/ml.


Te 2g Adicionar 4ml agua y agitar 30s. Dejar reposar 30min. Adicionar 10ml AcN y 200µl estándar interno, y agitar 7min. Agregar 4g MgSO4 anhidro, 1g NaCl, 1g citrato trisódico dihidratado y 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado. Agitar 7min. Centrifugar a 3700rpm 5min. Estándar interno: trifenilfosfato 25mg/l.


Naranja, manzana, tomate,

zanahoria, alcachofa y calabacines

0.5g MSPD: Mezclar con 0.5g de C18 hasta mezcla homogénea. Colocar en columna cromatográfica de vidrio (100mm x 9mm d.i.) con frit de 40µm conteniendo 1g silica. Eluir con 10ml EAc aplicando vacio suave.

Uvas Homogeinizar a 8000rpm 3min con 30ml Acetona-Diclorometano (1:1, V/v) y 2g NaCl anhidro. Filtrar (tamaño poro N°4) y luego por Whatman 2100150 1 PS en un tubo de vidrio conteniendo 10ml de la mezcla de solventes. Navarro y col.

(2000) Mosto y vino

5g Mezclar con 20ml Acetona : Diclorometano (1:1, v/v) y 2g NaCl anhidro. Colocar en baño de ultrasonido con agua destilada por 10min. Pasar por Whatman 2100150 1 PS en un tubo de vidrio conteniendo 10ml de la mezcla de solventes.


Hierbas 2.5 g Adicionar 10ml de agua y la mezcla de 4 standares internos (naphthalene-d8, acenaphthene-d10, phenanthrene-d10, fluoranthene-d10). Extraer con 10mL AcN (HAc 0.5%).Agitar 1min. Guardar en heladera 30min. Cuando la temperatura llegue a 4ºC agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min.

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Repollo y rábano 10g

Adicionar la mezcla de 6 estándares internos (naphthalene-d8, acenaphthene-d10, phenanthrene-d10, fluoranthene-d10, Chrysene-d12,Perylen-d12). Extraer con 10mL AcN (HAc 0.5%).Agitar 1min. Guardar en heladera 30min. Cuando la temperatura llegue a 4ºC agregar 4g MgSO4 y 1g NaCl. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min.


Ensalada verde,

tomate y frutilla

20g Adicionar 10ml agua y ajustar el pH a 6-7. Agitar 15min con 40ml EAc. Centrifugar a 1000rpm 5min.

Pang y col. (2006) Tejido animal 10g Adicionar 20g Na2SO4. Agregar 35ml ciclohexano - EAc (1:1, v/v). Homogeinizar a 15000rpm 1,5min. Centrifugar a 1400rpm 3min. Filtrar a través de 15g Na2SO4 y recolectar el filtrado. Repetir la extracción con 35ml de la mezcla de solventes. Centrifugar y juntar los filtrados.

Pose-Juan y col. (2006) Jugo de uva 40ml Adicionar 75ml diclorometano-acetona (75:25, v/v). Agitar 10min vigorosamente. Dejar reposar 5min. Secar la fase orgánica

con 7g Na2SO4 anhidro. Rial Otero y col.

(2002) Vino blanco 30ml SPME: Adicionar lindano como estándar interno (3ml de la solución 100mg/l). Insertar la fibra de DVB–CAR–PDMS 30min.

La extracción se realiza agitando y a temperatura ambiente. Desorber 5min a 240°C en el puerto de inyección del GC. Rial Otero y col.

(2003) Uva 60g Fortificar con 30µl de solución metanólica 1000mg/l de carbofuran como estándar interno. Adicionar 100ml de diclorometano-acetona (75:25, v/v) y 45g Na2SO4 anhidro. Agitar vigorosamente 5min. Centrifugar a 10000rpm 15min.


Suelo 10g La muestra se seca al aire y se tamiza para eliminar partículas mayores a 2mm. Sonicar 10min a temperatura ambiente con 15ml de buffer pH 8 de Na2CO3 anhidro (3,6% p/v) y polifosfato de sodio (0,8% p/v) en agua destilada. Adicionar 10ml EAc. Agitar a 200rpm 45min. Extraer la fase orgánica con pipeta Pasteur. Filtrar a través de 0,15g de Na2SO4 anhidro.

Pulpa de tomate, puré

de pera 20g

Ajustar el pH a 6 con NaOH 10M. Adicionar 40ml acetona y 7g ClNa. Homogeinizar 2min. Adicionar 20ml EAc - ciclohexano (50:50, v/v) y agitar 1min a 9000rpm. Centrifugar 15min a 5000rpm. Tomar 50ml de fase orgánica, filtrar a través de filtro de microfibra de vidrio conteniendo 20g de sulfato de sodio anhidro, previamente lavado con 15ml de la mezcla EAc : ciclohexano. Enjuagar el filtro con 20ml de la mezcla de solventes. Sannino y Bandini

(2005) jugo

concentrado de limón

10g Adicionar 15ml agua deionizada. Ajustar el pH a 6 con NaOH en lentejas. Continúa igual que el anterior.


(2003)

Manzana, chaucha, naranja

10g Adicionar 20ml de acetona. Agitar en vórtex 2min. Centrifugar a 3000rpm 5min. Extraer el sobrenadante.


(2008) Mosto y vino 20ml Adicionar 25ml diclorometano y agitar durante 15min. Separar el extracto y agregar Na2SO4 anhidro.

Walorczyk (2007) Trigo 5g Adicionar 10ml agua. Agregar 50 ml solución estándar interno (TPP a 150 mg/ml) y 15ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5 g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2min.

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Trigo


deshidratado

5g Adicionar 10ml agua. Agregar 50 ml solución estándar interno (TPP a 150 mg/ml) y 15ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5 g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2min.

Walorczyk y Gnusowski (2009) abejas


Adicionar 15ml AcN - agua (2:1, v/v) y 50ml estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 0,5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5 min.



Frutas y vegetales

10g Adicionar 10ml AcN y agitar 5min. Adicionar 0,5 g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4 anhidro y 1g NaCl, mezclar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5min. Walorczyk (2012)

Malta de cebada



(2012)

Trigo sarraceno y

centeno 5g

Adicionar 25ml AcN - agua (2:3, v/v) y 50µl estándar interno (TPP a 150mg/ml). Homogeinizar 5 min. Adicionar 0,5g citrato ácido disódico sesquihidratado, 1g citrato trisódico dihidratado, 4g MgSO4, y 1g NaCl. Agitar 1min. Centrifugar 4500rpm 2,5min.

Tabla II.17: Métodos de clean up para cuantificar fludioxonil

Referencia Clean up

Arrebola y col. (2003) Evaporar hasta sequedad (35 – 40°C). Redisolver con 10g ciclohexano con 0,5ppm estándar interno (cafeina).

Basa Cesnik y Gregorcic (2003)

Basa �esnik y col. (2008)

Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con ciclohexano-EAc (1:1, v/v). Filtrar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,20 micrómetros. Luego GPC (cromatografía de permeación en gel)

Bourgin y col. (2009) Evaporar a sequedad a 50°C. Redisolver con 10ml AcN. Homogeinizar en ultrasonido y vórtex. Filtrar a través de filtro de 0,45µm.

Cabras y col. (1997) Evaporar 3ml del extracto hasta sequedad bajo corriente de N2. Redisolver con 0,3ml solución de estándar interno (1ml solución 300mg/kg de trifenilfosfato en 1l acetona-hexano 50:50, v/v)

Chu y col. (2005) Evaporar hasta sequedad.

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Referencia Clean up

Cus y col. (2010) Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con ciclohexano-EAc (1:1, v/v). Filtrar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,20 micrómetros. Luego GPC (cromatografía de permeación en gel)

Fenoll y col. (2007) Evaporar hasta sequedad. Redisolver con 5ml EAc-ciclohexano (1:1, v/v). Fernández González

y col. (2003) Evaporar 20ml de la fase orgánica hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 1,5ml AcN. Agitar en vórtex. Evaporar hasta sequedad en corriente de N2 y redisolver con 0,5ml EAc. Agitar en vórtex y filtrar a través de filtro de nylon de 25µm

González Rodríguez y col. (2008a, b)

Evaporar 15ml de la fase orgánica hasta 1-2ml a 40°C. Acondicionar un cartucho Supelclean Envi Carb-II/PSA con 5ml de AcN:Tolueno (3:1, v/v). Agregar el extracto en AcN al cartucho. Eluir los pesticidas lentamente con 20ml de AcN : Tolueno (3:1, v/v). Evaporar el eluato hasta sequedad a 40°C. Redisolver con 0,5ml de acetona conteniendo 0,5mg/l de cada estándar interno (pentaclorobenceno y fenpropatrin) y los 3 analitos protectors (10 g/l de 3-etoxi-1,2-propanediol, 1 g/l de d-sorbitol y ácido L-gulonico g-lactona). Agitar en vórtex SPE: Evaporar hasta eliminar la acetona. Pasar la solución acuosa por una columna de C18 a 2ml/min. Secar bajo vacío 10min. Eluir con 10ml diclorometano. Evaporar hasta sequedad. Redisolver con 0,5ml de buffer pH 9,2 (6mM tetraborato de sodio decahidratado y 75mM de ácido cólico – sodio) Juan-García y col.

(2005) SBSE: Agitar con la barra magnética 4hs a 900rpm. Desorber en un vial con 1ml metanol. Evaporar a sequedad y redisolver con 0,5ml de buffer pH 9,2 (6mM tetraborato de sodio decahidratado y 75mM de ácido cólico – sodio)


Evaporar hasta eliminar la acetona. Pasar la solución acuosa por una columna de C18 a 2ml/min. Secar bajo vacío 10min. Eluir con 10ml diclorometano. Evaporar hasta sequedad. Redisolver con 0,5ml de buffer pH 2,3 (20mmol/l fosfato, 25mmol/l dodecilsulfato de sodio y 10% metanol)



Adicionar a 6ml de extracto 150mg PSA y 950mg MgSO4. Centrifugar a 5000rpm 3min. Filtrar en filtro de 0.45µm. Transferir 1.5ml a un vial conteniendo 15µl de solución de ácido fórmico al 5%. Evaporar hasta sequedad y redisolver en 150µl acetona : EAc (1:1, v/v).

Lozano y col. (2012) Transferir 3ml del sobrenadante a un tubo conteniendo 150mg CaCl2 anhidro y 150mg PSA. Agitar 30s y centrifugar a 3700rpm por 5min. Adicionar 30µl ácido fórmico 5% en AcN. Evaporar con corriente de N2 y reconstituir con AcN : agua (10:90, v/v).


Evaporar hasta 0.5ml en corriente de N2.


Evaporar hasta sequedad bajo vacio. Redisolver con 5ml Isooctano : Tolueno (1:1, v/v).

Nguyen y col. (2009) Colocar 2ml del extracto en un vial con 50mg PSA, 300mg MgSO4, 30mg GCB. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min a 4ºC. Evaporar hasta sequedad 1,2ml del extracto. Redisolver con 0.25ml AcN conteniendo 0,1mg/l de TPP.

Nguyen y col. (2008) Colocar 2ml del extracto en un vial con 50mg PSA y 300mg MgSO4. Agitar 1min y centrifugar a 4000rpm 5min a 4ºC. Evaporar hasta sequedad 1,2ml del extracto. Redisolver con 0.4ml MeCN conteniendo 0,1mg/l de TPP.


99


Referencia Clean up

Pang y col. (2006)

Evaporar hasta 5ml en un baño a 40°C. Transferir a un vial de 10ml. Lavar el tubo de evaporación con 5ml ciclohexano - EAc (1:1, v/v) y mezclar. Filtrar y luego realizar la cromatografía de permeación en gel (GPC). Fase móvil, ciclohexano - EAc (1:1, v/v); flujo, 5ml/min; longitud de onda, 254nm; volumen de inyección, 5ml; tiempos de recolección desde 22min hasta 40min. Columna Bio-Beads S-X3 (400mm × 25 mm) Evaporar la fracción recolectada hasta 0,5ml en un baño a 40°C. Cambiar el solvente por 5ml de hexano dos veces, quedando con un volumen final de 1ml.

Pose-Juan y col. (2006)

Evaporar una alícuota de 30ml hasta sequedad a 40ºC y 280mBar. Redisolver con 5ml isooctano. Homogeinizar en vórtex. Evaporar a sequedad a 40ºC y 90mBar. Disolver en 1ml de EAc conteniendo 20mg/l de lindano como estándar interno.


Evaporar una alícuota de 20ml hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 5ml de isooctano. Acondicionar el cartucho de sílica Sep-Pak con 5ml de isooctano sin dejarlo secar. Adicionar el extracto. Secar con N2 por 20min. Eluir con 5ml diclorometano-acetona (50:50, v/v). Evaporar hasta sequedad a 40ºC. Redisolver con 1ml AcN. Agitar en vórtex y filtrar a través de filtro de nylon de 22µm.


Evaporar hasta sequedad 8ml del extracto a 40°C. Redisolver con 0,5ml de una solución de lindano (4mg/l) en EAc como estándar interno. Agitar en vortex.

Sannino y Bandini (2005)

Evaporar bajo vacio hasta 0,5ml en un baño a 30ºC y luego las trazas de solvente con corriente de N2. Redisolver con 9ml acetona - hexano (15:85, v/v). Evaporar una alícuota de 0,5ml hasta sequedad en corriente de N2, y redisolver con 1ml AcN - metanol - agua (43:43:14, v/v/v). Filtrar con una jeringa con filtro de 0,45µm.


(2003)

Usar columnas de vidrio empacadas con polímero de estireno - DVB. Lavar la columna con 6ml de EAc. Acondicionar con 6ml metanol y luego 8ml agua deionizada. Pasar la muestra. Secar a vacio (aproximadamente 30min). Eluir con 2ml EAc al 1% de trietilamina y luego con 3 lavados de 2ml de EAc-acetona (90:10). Juntar las fracciones eluidas y evaporar hasta menos de 1ml con N2 en baño de 35°C. Redisolver con 2ml acetona, evaporar nuevamente hasta un volumen menor. Repetir el procedimiento hasta obtener un volumen de 0,35ml.

Vaquero Fernández y col. (2008)

Evaporar a sequedad. Redisolver con 5ml metanol.

Walorczyk (2007) Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro, 0,5g C18, y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 2500rpm 5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

Walorczyk (2008)

Previo a la etapa de DSPE tomar una alícuota de sobrenadante y almacenarla al menos 2h en freezer (−26°C). Separar el extracto del precipitado por decantación. Adicionar 100mg MgSO4 anhidro, 75mg C18, y 20mg PSA por ml de extracto. Agitar en vortex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2min. Acidificar una alícuota con 15µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN por ml de extracto. Evaporar a sequedad en corriente N2 y redisolver con tolueno. Adicionar el segundo estándar interno (PCB 153).

Walorczyk y Gnusowski (2009)

Almacenar el sobrenadante en freezer a –26ºC por al menos 2hs. Separar 5ml de extracto del precipitado por decantación y filtración en algodón, en un tubo centrífuga conteniendo 500mg MgSO4 anhidro, 450mg C18, 200mg PSA y 50mg GCB. Agitar en vórtex 2min y centrifugar a 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico al 5% en AcN (v/v). Evaporar el extracto en corriente N2 y redisolver 1,5ml tolueno.



100


Referencia Clean up

Tomar 5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 1,5ml con 50µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno. Walorczyk (2012) Tomar 7,5ml del sobrenadante y adicionar 0,75g MgSO4 anhidro y 0,125g PSA. Agitar en vórtex 0,5min y centrifugar 4500rpm 2,5min. Acidificar una alícuota de 3ml con 50µl de ácido fórmico 5% (v/v) en AcN. Evaporar hasta sequedad en corriente N2 y redisolver con 1,5ml de tolueno.

Walorczyk y Drozdzysnki (2012)


101

Las tablas II.18 a II.27 resumen las condiciones cromatográficas y parámetros de

validación empleados por distintos autores para la determinación y cuantificación de los

fungicidas azoxystrobin, boscalid, pyraclostrobin, cyprodinil y fludioxonil.

Para los pesticidas mencionados, las técnicas usadas son mayoritariamente con

distintos tipos de detectores de masa, como ser simple o triple cuadrupolo (MS o

MS/MS), tiempo de vuelo (TOF), trampa de iones (IT), acoplados a cromatografía

gaseosa (GC), multidimensional (MD), de baja presión (LP), o a cromatografía líquida

de alta resolución (HPLC) o de ultra alta resolución (UPLC), o electroforesis capilar

(CE y “reverse migration micellar eloctrokinetic chromatography” RM-MEKC).

Además, se han utilizado detectores de ultra violeta (UV) para cyprodinil y fludioxonil;

de arreglo de diodos (DAD) para azoxystrobin, cyprodinil, fludioxonil y pyraclostrobin;

detector de nitrógeno – fósforo (NPD) para azoxystrobin, fludioxonil y cyprodinil;

detector de micro captura de electrones (µECD) para boscalid, sistema de vaporización

a temperatura programada (PTV) para boscalid y pyraclostrobin; “Direct Analysis in

Real Time” (DART) y “Desorption Electrospray Ionization” (DESI) para

pyraclostrobin; “Large Volume Difficult Matrix Introduction” (LV-DMI) para

cyprodinil.

A disposición para este trabajo experimental, se contaba con el acceso a un

cromatógrafo gaseoso con detectores de µECD y NPD. Esta revisión bibliográfica

mostró que no existen metodologías que apliquen estos detectores para el análisis de

estos cinco fungicidas en arándanos, por ello se desarrollaron y validaron metodologías

analíticas específicas para poder ser aplicadas en el estudio de las curvas de degradación

de los mismos en el campo, y de los residuos en fruta fresca y productos elaborados a

partir de las mismas.

102

Tabla II.18: Condiciones cromatográficas para cuantificar azoxystrobin

Referencia Equipo Columna Fase Móvil Rampa Horno Otras condiciones

Agüero y col. (2004)

HPLC –MS/MS

Polaris C18-A (150mm x 2mm x 3µm).

Precolumna (30mm x 2mm)

Ácido fórmico 0,1% y 2mM formeato de amonio (A), y AcN :

metanol, 3:1 v/v (B). Gradiente: 5% B a 35% en 3min; de 35 a 42% B en 7min; de 42 a 65% B en 2min; de 65 a 70% B en 13min; de 70 a 100% B en

2min. Luego de 100 a 5% B en 0,06min.

- -


HPLC –MS/MS

C18 Aqua 5m 125ª°, 50mm × 2mm.

Guarda columna C18 Aqua 5m 125ª° , 10mm ×

2mm.

A = 80% agua – 20% metanol;B = 90% metanol – 10% agua; ambas con 5 mmoles/l formato amonio.

-

- APCI: flujo 0,4 ml/min y fase móvil 0% B hasta 100% linealmente en 25 min y se

mantiene 6min. - ESI: flujo 0,2 ml/min e incremento lineal de B de 0% a 100% en 29min y se mantiene 10min.


GC – MS/MS

J&W Scientific DB-5MS (30m x 0.25mm x 0.25µm). Guarda

columna (2m x 0,25mm)

-

70°C (3,5min); 50°C/min hasta 150°C; 5°C/min hasta 180°C; 1°C/min hasta 183°C (4min); 1°C/min hasta 191°C (4min);

1°C/min hasta 205°C; 4°C/min hasta 300°C (5min)

Gas carrier: He; flujo 1ml/min; Inyección 10µl T inyector: 70°C (0,50min); 100°C/min hasta

310°C (10min); �Split ratio y válvula artic vent: 0min (abierto, 30:1); 0,5min (cerrado, off); 3,5min (abierto,

100:1); 3,5min (abierto, 100:1); 18,5min (abierto, 20:1)

EI y CI; T fuente iones 200°C; T manifold 50°C; T transfer line 280°C

Banerjee K., y col. (2007)

HPLC-MS/MS

Purosphere RP-18 (55mm × 2mm × 3µm)

A= metanol – agua (20:80, v/v) con 5mM formato de amonio.

Gradiente 0–1 min/90% A, 1–2 min/90%–5%A, 2–11 min/5%A,

11–12 min/5–90%A, 12–18 min/90%A.

-

Flujo: 0,3ml/min Ion spray voltage 5500V; Presión gas

nebulizador 30 psi; curtain gas 25 psi; eather gas 60 psi y temperatura fuente iones 500°C.

Belmonte Valles y col.

(2012) GC-MS

Bruker VF-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm).

Guarda columna Bruker (2m x 0,25mm)

- 90°C (2min); 20°C/min hasta

200°C (1min); 30°C/min hasta 300°C (7min).

T inyector 250°C; T fuente iones 250°C; T cuadrupolo 40°C.

103




GC –MS/MS

Varian FactorFour VF-5 ms (30m x 0,25mm x

0,25µm). Guarda columna Supelco (2m x

0,25mm)

- 70°C (3,5min); 50°C hasta

180°C; 25°C/min hasta 300°C (10min)

Modo EI (70eV). Flujo de He 1ml/min. Rampa inyector: 70°C (0,5min); 100°C/min

hasta 310°C (10min) T transfer line 280°C; T manifold 40°C; T

fuente iones 250°C.

Cajca y col. (2005)

LV – DMI – GC –

MS

Varian VF-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm)

Guarda columna Varian VF-5MS EZ (5m x

0,25mm)

- 80°C (3,5min), 30°C/min hasta 180°C, 10°C/min hasta 230°C, 45°C hasta 300°C (9,61min)

Voltaje 200V; T interfase 280°C; T fuente iones 150°C; T cuadrupolo 230°C

Cajca y col. (2012)

GC –MS/MS

HP-5MS (15m x 0,25mm x 0,25mm) y DB-5MS

(0,5m x 0,15mm x 0,15µm)

- 50°C (1min); 50°C/min hasta 150°C; 6°C/min hasta 200°C;

16°C/min hasta 280°C (4,07min)

EI (70eV). T transfer line 280°C; T fuente iones 280°C; T cuadrupolos 150°C

Caldas y col. (2011)

HPLC –MS

Xterra (50mm x 3mm x 3,5µm)

Metanol (A) y agua 0,1% ácido fórmico (B) - -


HPLC-DAD

Spherisorb ODS2 (150mm x 4mm x 5µm)

AcN : agua (50:50, v/v) isocrática - T columna 60°C; flujo 1ml/min


GC-IT MS/MS

VF-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm)

Guarda columna (2m x 0,25mm)

- 70ºC (3,5min); 50ºC/min hasta 150ºC; 4ºC/min hasta 270ºC; 50ºC/min hasta 300ºC (5min)

T inyector 70°C (3,5min), 100°C/min hasta 310°C (10min).

EI (70eV); T transfer line 280°C; Tmanifold 50°C; T trampa iones 200°C

Chen y col. (2011)

UPLC MS/MS

Aquity UPLC BEH Shield RP18 (150mm x 2,1mm x

1,7µm).

0,02% ácido fórmico en AcN (A) y 0,02% ácido fórmico en agua (B) Gradiente: 10 a 98% A en 12min;

y regresar a 10%A en 0,5min.

- Voltaje capilar 3,5kV; T fuente iones 100°C; T

gas desolvatación 350°C.

104



Chu y col. (2005)

GC – MS DB-5MS (30m x 0.25mm x 0.25µm) con 5% fenil –

95% metilsilicona -

80°C (1min); 10°C/min hasta 160°C (5min); 3°C/min hasta 240°C; 25°C/min hasta 280°C

(10min)

Gas carrier: He; flujo 1ml/min; Inyección 1µl T inyector 250ºC; T detector 280°C

Ionización electrónica (70eV), T quad 150ºC, T ion source 230ºC; SIM


HPLC -MS/MS

Luna C18 (150mm × 2mm x 0,25µm)

Agua con 0,1% ácido fórmico y 5mM formeato de amonio (A) y

metanol (B). Gradiente: 30% B a 35% en 8min;

de 35 a 90% B en 4min; isocrático durante 10min. Luego

de 90 a 30% B en 1min y mantener 2min.

- Flujo 200µl/min. ESI (+). Voltage del espray 4500V, Temp capilar 350°C


MD-GC/MS

Columna primaria J&W Scientific DB-5HT (3m x

0,32mm x 0,1µm)Columna secundaria J&W

Scientific DB-5MS (15m x 0,25mm x 0,25µm)

- 90°C (0,5min); 60°C/min hasta 180°C; 80°C/min hasta 290°C

(4,62min)

T inyector 250°C EI 70eV; T interfase 280°C; T fuente iones

230°C; T cuadrupolo 150°C; modo SIM

Cunha y Fernandes

(2011) GC-MS

DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm)

-

80°C (2min); 20°C/min hasta 180°C; 5°C/min hasta 230°C;

20°C/min hasta 280°C; 40°C/min hasta 300°C (min)

T inyector 280°C EI (70eV), T fuente iones 230°C, T cuadrupolo

150°C.

Cus y col. (2010a) GC-MS

HP-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm)

-

55ºC (2min); 25ºC/min hasta 130ºC (1min); 5ºC/min hasta

180ºC (30min); 20ºC/min hasta 230ºC (16min); 20ºC/min hasta 250ºC (13min); 20ºC/min hasta

280ºC (20min)

T inyector 250°C. T fuente iones 230°C; T interfase 280°C; T

cuadrupolo 150°C.

Cus y col. (2010b) GC-MS - -



280ºC (20min)

Gas carrier: He; flujo 1,2ml/min T inyector 250ºC

EI (70eV), T interface 280ºC, T fuente iones 230ºC; SIM

105




GCxGC - TOFMS

DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) en serie con

Varian V-17 (1m x 0,1mm x 0,1µm).

-

Horno primario: 100°C (2min); 15°C/min hasta 190°C (5min);

10°C/min hasta 200°C; 15°C/min hasta 242°C (5min); 10°C/min hasta 285°C (12min)

Horno secundario: 106°C (2min); 15°C/min hasta 195°C (5min); 15°C/min hasta 250°C (5min); 10°C/min hasta 305°C

(11min)

T inyector 250°C. T interfase 305°C; EI 70eV; T fuente iones

240°C.

HPLC DAD

Macherey-Nagel cc250/4 Superspher 100-4RP-18ec. Guarda columna

Merck LiChrospher 100RP-18 (5µm).

Metanol - agua (80:20 v/v) - Flujo: 0,8ml/min De Melo Abreu

S., y col. (2006)

GC - MS J&W Scientific DB-5MS

(30m x 0,25mm x 0,25µm)

- 170ºC, 15ºC/min a 320ºC (5min) T inyector 300ºC

Electron impact (65eV ion energy), T interface 300ºC, T fuente iones 180ºC


HPLC -MSMS

Xterra MS C18 (2,1mm x 150mm x 3,5µm).

Guardacolumna Xterra MS C18 (2,1mm x 10mm

x 3,5µm)

Agua deionizada con 0,1% (v/v) ácido fórmico (A) y AcN con 0,1%

(v/v) ácido fórmico (B) Gradiente: 90% A por 3min; de

90% a 10% A en 28min (mantener 5min); de 10% a 90% A en 0,5min (mantener 8,5min).

- T columna 28°C; flujo 0,2ml/min. ESI(+); voltaje 4kV; T capilar 350°C


GC-NPD HP-5MSI (30m x 0,25mm

x 0,25µm) -

70°C (2min); 25°C/min hasta 150°C; 3°C/min hasta 200°C; 8°C/min hasta 280°C (10min)

T inyector 250°C; T detector 325°C


(2008)

GC -MS/MS



0,25mm)

- 70°C (3,5min); 50°C hasta





106




HPLC -TOFMS

Zorbax ZXB C18 (50m x 4,6mm x 1,8µm)

Agua 0,1% ácido fórmico (A) y AcN 0,1% ácido fórmico (B).

10% B (1min), de 10 a 100% B en 11min (3min)

- ESI (+), voltaje capilar 4kV, T gas 325°C


HPLC -MSMS

Atlantis C18 (2,1mm x 100mm x 5µm)

Metanol 0,1% ácido fórmico (A) y Agua 0,1% ácido fórmico (B) -

API (+). Presión celda colisión 6xa0-3 mBar. Voltaje capilar 3,5kV. T interfase 350°C. T



HPLC -MSMS

HyPURITY C18 (2,1mm x 150mm x 5µm)

Guarda columna C18 (4mm x 2mm)

Acetato de amonio 10mM (A) y metanol (B).

Gradiente: 10% B hasta 90% en 20min (10min). Luego regresar a condición inicial en 1min (9min).

- Turbo Ion spray (TIS) (+). Voltaje ionización 5kV. T calentamiento 350°C


HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3.2mm x 5µm). Guarda columna

C18 (4mm×3mm)

25% metanol - 5mM formato de amonio, creciendo linealmente hasta 95% en 15min. Mantener

10 min

- -

Huang y col. (2009)

HPLC-MS/MS

XDB-C18 (150mm x

4,6mm x 5µm)

Ácido acético 0,1% (A) y metanol (B).

Gradiente: 90% B (4min); de 90% a 40% B en 11min (5min); 40% a

5% B en 5min (7min). Luego regresar a condición inicial en

0,01min (8min).

- ESI (+). Flujo 0,5ml/min; Voltaje ionización 5KV; Temp aguja ionización 550°C

Kolberg y col. (2011)

GC MS/MS


- 80°C (1min); 25°C/min hasta 180°C; 5°C/min hasta 280°C

(5min)

T inyector 80°C (0,1min), 200°C/min hasta 300°C (13min); T detector 250°C, T fuente

iones 235°C, T manifold 40°C.


UHPLC-TOF-MS

Acquity UPLCHSST3 (100mm × 2,1mm x

1,8µm)

Metanol (A) y 0.005M formato de amonio (B). Gradiente: 10% A

hasta 1min; 50% A hasta 6,50min; 100% A hasta 9,50min y

10% A hasta el final

- Flujo: inicial de 0,30ml/min hasta 7,75min;

aumenta a 0,60ml/min hasta 9,5min y luego desciende a 0,45ml/min hasta 11,5min

107




GC- TOF-MS

Rxi-5ms (30m×0,25mm x 0,25µm)

- 50°C; 20°C/min hasta 150°C; 6°C/min hasta 280°C (7min)

PTV: 50°C; 720°C/min hasta 300°C Gas carrier: He; Vol inyección 5µl

T fuente iones 200°C; T transfer line 260°C


UPLC MS/MS

Acquity UPLC BEH C18 (50mm × 2,1mm x

1,7µm)

Agua (A) y Metanol (B) ambos con 17,5mmol/l ácido acético.

Gradiente: 10% B incrementando hasta 100% B en 4min. Mantener 1min y regresar a las condiciones

iniciales

-

T columna 40°C; flujo 0,6ml/min ESI intercambiando entre modo + y -.

Parámetros de ionización: voltaje capilar 1kV; T fuente iones 120°C; T gas de desolvatación

400°C a un flujo de 1,3x104 ml/min (N2)

Lee y col. (2009)

HPLC-MS/MS

Zorbax XDB-C18 (50mm x 4,6mm x 5µm)

Agua (A) y Metanol 5mM formeato de amonio pH 4 (B)

Gradiente: 20% B (11min), 20 a 90% B en 4min (5min)

- T columna 20°C, flujo 0,2ml/min

Lee y Jo (2012)

GC MS/MS


-

70°C (2min); 20°C/min hasta 200°C; 2°C/min hasta 220°C

(3min); 10°C/min hasta 300°C (3min)

T inyector 250°C, EI (70eV), T manifold 40°C, T transfer line 280°C, T trampa iones 200°C


GC-MS HP 5 MS (30m x 0,25mm

x 0,25µm) -

70°C (2min); 25°C/min hasta 150°C; 3°C/min hasta 200°C; 8°C/min hasta 280°C (10min);


T inyector 280°C; T interfase 250°C; T cuadrupolo 150°C; EI (70eV)


HPLC-MS/MS

Zorbax SB C8 (150mm x 4,6mm x 5µm)

AcN (A) y agua acidificada 0,1% con ácido fórmico (B)

Gradiente: 30% A (3min); de 30% a 50% A en 2min; 50% a 100% A en 16min (3min). Luego regresar

a condición inicial (7min).

- ESI; T gas 300°C; voltaje capilar 4KV


UPLC MS/MS

Acquity UPLC HSS T3 (100mm x 2,1mm x

1,8µm)

Agua 0,1mM acetato amonio (A) y Metanol 0,1mM acetato amonio

(B) Gradiente: de 5% a 90% B en 7min (8min). Luego regresar a

condición inicial en 0,1min.

- -

108





GC-MS

RestekRtx - 1MS Crossbond 100%

polidimetilsiloxano (30m × 0,25mm × 0,25 µm)

- 60ºC (1min); 25ºC/min hasta 170ºC; 6ºC/min hasta 290ºC

(1min)

EI (70eV), T transfer line 250ºC; T fuente iones 230ºC


HPLC-MS/MS

Nucleosil 100-5 C18 HD,(70mm × 2mm). Precolumna (8mm ×

2mm)

0,1% ácido fórmico en agua (A) y 0,1% ácido fórmico en metanol

(B) Gradiente: 100% A inicial

disminuyendo hasta 10% a los 12min. Mantener 2min.

- Flujo 0,3ml/min, Vol inyección 10µl.

ESI (+),T fuente iones 120ºC, T desolvatación 350ºC

Pang y col. (2006)

GC-MS DB-1701 (30m × 0,25mm

x 0,25µm) -

40°C (1min), 30°C/min hasta 130°C, 5°C/min hasta 250°C, 10°C/min hasta 300°C (5min)

Flujo 1,2ml/min; T inyección 290°C; volumen inyección 1µl; energía de ionización 70eV; T fuente de iones 230°C; T interfase 280°C;

modo SIM



HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x 5µm). Guarda columna

C18 (4mm × 3mm)

25% metanol - 5 mmol/ L formato de amonio creciendo linealmente

a 95% en 15min. Mantener 10min.

- ESI(+)


HPLC-DAD

Ultracarb ODS 30%C

(250mm x 4,6mm x 5µm). Guarda columna

Pelliguard LC-18 (50mm x 4,6mm x 40µm)

AcN (A) y Agua (B). Gradiente: comienza con 25% A y lo

mantiene hasta los 15min, luego sube a 30% A a los 20min y lo

mantiene hasta los 40min. Asciende hasta 50% A a los 60min y mantiene hasta los

78min. Luego 90% A a los 79min y mantiene hasta 89min. Vuelve a

las condiciones iniciales a los 90min y mantiene hasta los

110min

- Flujo 1,5ml/min; T columna 40ºC; volumen

inyección 50µl. Longitud de onda 204nm

109



Smalling y Kuivila (2008) GC-MS

DB-5MS (30m × 0,25mm x 0,25µm)

- 80ºC (1min); 10ºC/min hasta

300ºC (10min)

Detector: µECD T inyector 275ºC; T tranfer line 280ºC; T

trampa iones 220ºC

Viñas P., y col. (2009) GC-MS

ASBL 5MS (30m × 0,25mm x 0,25µm)

- 180ºC (2min), 10ºC/min hasta 250ºC, 50ºC/min hasta 300ºC

(3min) T fuente iones 230ºC, T transfer line 325ºC

Walorczyk (2007)

T inyector: 250ºC (1,5min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min). Split ratio 20:1, a 0,01min el split vent se cierra hasta 1,5min,

luego se abre y mantiene a 100:1 (20 min), y finalmente se reduce a 20:1. EI (70eV). T

transfer line 290ºC; T manifold 40ºC; T fuente iones 250ºC.

Walorczyk (2008)

T inyector: 250ºC (1.5min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min).


(2009)


luego se abre y mantiene a 100:1 (20 min), y finalmente se reduce a 20:1. T transfer line 290ºC; T manifold 40ºC; T fuente de iones

270ºC.


T inyector: 250ºC (1min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min).

EI (70eV). T transfer line 290ºC; T manifold 40ºC; T fuente iones 270ºC.

Walorczyk (2012)

T inyector: 250ºC (1min), 200ºC/min a 300ºC (20min). Split ratio 20:1, a 0,01min el split vent

se cierra hasta 1,5min, luego se abre y mantiene a 100:1 (20 min), y finalmente se

reduce a 20:1. EI (70eV). T transfer line 290ºC; T manifold 40ºC; fuente iones 270ºC.


(2012)

GC-MS/MS

Columna capilar DB-5 MS (30m × 0,25mm x

0,5µm). Guarda columna (2m × 0,53mm)

- 80°C (3min), 30°C/min a 150°C, 10°C/min a 300°C (10min).



110

Tabla II.19: Características de la metodología analítica para azoxystrobin

Referencia Matriz Recuperación Repetibilidad

RSD Reproducibilidad

RSD LOQ LOD r2 Rango

Pimienta 89%±4% (50ppb)

93%±5% (500ppb) 0,5ppb

Lechuga 80%±6% (50ppb) 81%±4% (500ppb)

0,5ppb Agüera y col.

(2004)

Berenjena 70%±6% (50ppb)

77%±5% (500ppb)

- - -

1ppb

>0,99 10-

1000µg/l

Tomate - - - - - - -

Pepino - - - - - - - Limón - - - - - - -

Pasas de uva - - - - - - -

Alder y col. (2004)

Harina de trigo - - - - - - - Arrebola y col.

(2003) Pepinos 83%±8% (65ppb)

87%±16% (250ppb) - 104%±17% (65ppb)

120%±11% (250ppb) 0,27 ppb 0,08ppb 0,997 0,05 –

0,75ppm


Uvas

80%±9% (2,5ppb) 79,5%±2% (5ppb)

80,6%±0,7% (10ppb) 81,1%±0,4% (25ppb) 100,4%±0,3% (50ppb)

- - 0,25 ppb 0,1ppb 0,9982 -

Tomate 0,997 Manzana 0,999


(2012) Naranja - <20% <20% 1ppb -

0,999

0,5-50ppb


Frutilla 97% (11,5ppb) 81% (50ppb)

6% (11,5ppb) 3% (50ppb)

7% (11,5ppb) 3% (50ppb)

10ppb 4ppb >0,98 10-200ppb

Cajca y col. (2005)

Alimento para bebe a base de fruta 98%±7% (0,05ppm) - - - - - -

Te verde 68%±14% (0,01ppm)

64%±3% (0,1ppm) 69%±4% (1ppm)

5ppb Cajca y col.

(2012) Te negro

55%±14% (0,01ppm) 50%±6% (0,1ppm) 65%±3% (1ppm)

- - -

5ppb

- -

111





Caldas y col. (2011) Suelo

73,6% (10ppb) 70,3% (50ppb) 80,4% (100ppb)

118,9% (500ppb)

15% (10ppb) 7,7% (50ppb)

10,4% (100ppb) 3,7% (500ppb)

- 10ppb - 0,997 0,01-1ppm

Pera 94%±3% (50ppb) 96%±3% (130ppb)

Limón 88%±6% (50ppb) 92%±7% (130ppb)


Uva 95%±2% (50ppb) 94%±7% (130ppb)

- - 17µg/l 5µg/l 0,9989 0,01-5ppm


Orina 81% (5ppb)

107% (10ppb) 88% (50ppb)

11% (5ppb) 10% (10ppb) 9% (50ppb)

15% (5ppb) 0,466ppb 0,14ppb >0,996 0,1-100ppb

Chen y col. (2011)

Te 109,45%±11,8% (10ppm) 93,28%±10,5% (50ppm)

- - 5ppm - 0,9988 -

Chu y col. (2005)

Jugo de manzana 105,2%±4,3% (0,04ppm) - - - 8ppb 0,98-1 0,05-4ppm

Coscollà y col. (2009) Aire

99%±3% (0,01ng/filtro) 106,4%±2% (0,2ng/filtro) 88,8%±8% (0,5ng/filtro)

- - 6,5pg/m3 - - -


Jugo de manzana 78% (0,17ppm) 79% (0,25ppm) 84% (0,5ppm)

5% (0,17ppm) 7% (0,25ppm) 6% (0,5ppm)

(n=6)

3% 1,3µg/l 0,38µg/l 0,9997 0,006-0,11ppm

Cunha y Fernandes

(2011) Maíz

103% (0,05ppm) 73% (0,5ppm)

4% (0,05ppm) 8% (0,5ppm) - - 11ppb 0,9995

0,025-1ppm

Cus y col. (2010a)

Uva, orujo, torta, sedimento, mosto,

vino - - - - 0,02ppm - -

Cus y col. (2010b) Vino - - - - 0,02ppm - -

112





Uva 82%±5% (25ppb) 88%±3% (50ppb) Dasgupta y

col. (2010) Vino 79%±4% (25ppb)

82%±3% (50ppb)

- - - - - -

Uvas 0,6ppm 0,2ppm De Melo Abreu S., y col. (2006) Vino

99%±8% (0,25ppm) 97%±6% (1ppm)

104%±6% (2ppm) <8,9% (0,25ppm) <9,3% (0,25-1-2ppm)

0,8ppm 0,2ppm 0,998 0,1 -

2,5ppm

Vino blanco 2,3µg/l 0,71µg/l 0,9997 Economou y col. (2009) Vino tinto

81%±10,2% (10ppb) 74%±6,1% (50ppb)

- - 2,6µg/l 0,78µg/l 0,993

0,001-0,1mg/l

Morrón verde 102,2%±3,3% (0,05ppm)

96,4%±3,6% (0,1ppm) 100,4%±2,7% (0,2ppm)

- - 3,9ppb 1,2ppb

Morrón rojo 103,3%±5,5% (0,05ppm) 100,1%±3,9% (0,1ppm)

98%±4,1% (0,2ppm) - - 4,6ppb 1,4ppb


Tomate 112,9%±5,3% (0,05ppm)

95,1%±3,5% (0,1ppm) 101,1%±4,2% (0,2ppm)

- - 2,6ppb 0,8ppb

>0,999 0,05-2mg/l

110% (11,5ppb) 95% (50ppb)

10% (11,5ppb) 8% (50ppb)

16% (11,5ppb) 15% (50ppb) 0,9984 10-

150ppb Pepino

86%(150ppb) 5%(150ppb) 7%(150ppb) 0,9999 50-400ppb

99% (11,5ppb) 99% (50ppb)

9% (11,5ppb) 11% (50ppb)

19% (11,5ppb) 17% (50ppb) 0,9954

10-150ppb


(2008) Naranja

71%(150ppb) 8%(150ppb) 13%(150ppb)

10ppb -

0,9942 50-400ppb


Bebida de naranja 83,9%±7,3% (10ppb)

110,6%±2,3% (50ppb) 2% (20ppb) - 0,08ppb - 0,9971

0,1-50ppb

113





Tomate 95%±7% (0,01ppm) 83%±5% (0,1ppm)

Limón 95%±5% (0,01ppm) 88%±4% (0,1ppm)

Pasas 94%±8% (0,01ppm) 76%±6% (0,1ppm)


Palta 94%±7% (0,01ppm) 87%±2% (0,1ppm)

<15% - <0,01ppm - 10-500ppb

Naranja 110%±6% (0,01ppm) 110%±6% (0,1ppm)

Manzana 99%±6% (0,01ppm) 105%±4% (0,1ppm)


Lechuga 108%±5% (0,01ppm) 104%±4% (0,1ppm)

- - - - - -

Lechuga 101%±5% (0,01ppm) 84%±2% (0,05ppm) 92%±5% (0,1ppm)

Naranja 86%±3% (0,01ppm) 92%±5% (0,05ppm) 93%±2% (0,1ppm)

Manzana 92%±4% (0,01ppm) 97%±4% (0,05ppm) 100%±2% (0,1ppm)

Repollo 94%±3% (0,01ppm) 93%±6% (0,02ppm) 95%±3% (0,1ppm)

Uva 89%±6% (0,01ppm) 98%±3% (0,02ppm) 96%±1% (0,1ppm)


Harina de trigo 88%±6% (0,01ppm) 88%±3% (0,02ppm) 93%±2% (0,1ppm)

< 15% - < 0.01ppm < 0.01ppm > 0,99 0,001 - 0,2ppm

114





Huang y col. (2009)

Te 75,3% (n=6) 79,4% (n=6) 98,7% (n=6)

10,6% (n=6) 12,1% (n=6) 9,4% (n=6)

- 0,05ppm - 0,9984 0,05-0,2ppm

Trigo

125,6%±0,1% (5ppb) 96,4%±3,1% (10ppb) 93,6%±2,2% (20ppb) 92%±0,8% (50ppb)

10ppb 1 1-

100µg/l

Harina trigo

106,4%±5,5% (5ppb) 99,3%±1,1% (10ppb) 100,7%±0,9% (20ppb) 98,1%±2,7% (50ppb)

5ppb 1 2-

200µg/l Kolberg y col.

(2011)

Salvado

123,6%±2,9% (5ppb) 88,7%±2,8% (10ppb) 105,1%±5,4% (20ppb) 120,9%±9,4% (50ppb)

- -

10ppb

2,5ppb

0,9997 2-

200µg/l

Manzana - 3,16% - - - 1-450ppb

Frutilla - 5,10% - - - 1-

300ppb

Tomate - 4,10% - - - 1-450ppb


Espinaca - 3,68% -

<10ppb

- - 1-300ppb

Alimento para bebé (fruta)

103%±5% (0,01ppm) 1066%±3% (0,1ppm) - - - -

Pera 105%±12% (0,01ppm) 107%±4% (0,1ppm)

- - - - Leandro y col.

(2007a)

Lechuga 105%±11% (0,01ppm) 84%±12% (0,1ppm) - - - -

>0,99 0,005-0,25ppm

Alimento para bebé (cereal)

104%±5% (0,01ppm) 110%±4% (0,1ppm) - - - -

Naranja 99%±10% (0,01ppm) 110%±3% (0,1ppm)


(2007)

Papa 105%±4% (0,01ppm) 103%±3% (0,1ppm) - - - -

>0,99 0,005-0,25ppm

115





Harina de trigo 114%±2% (0,1ppm) 131%±7% (1ppm)

1ppb Lee y col.

(2009) Arroz pulido

80%±13% (0,1ppm) 91%±9% (1ppm)

- - - 2,2ppb

>0,995 0,01-2ppm

Lee y Jo (2012)

Ginseng coreano 81,11%±2,37% (30ppb) 90,33%±1,28% (100ppb)

97,13%±0,65% (1000ppb) - - 2,23ppb 0,67ppb 0,9920 0,01-

0,5ppm

Uva 119% (0,503ppm) 1,2% - Limón 114% (0,503ppm) 7,8% -

Cebolla 97% (0,503ppm) 10,2% - Lesueur y col.

(2008) Tomate 114% (0,503ppm) 8,2% -

1,2-161ppb 0,4-48,2ppb >0,99 0,05-

10ppm

Te verde

71,5%±7% (10ppb) 72,4%±9% (25ppb) 76,3%±6% (50ppb) 81%±4% (100ppb)

2,5% (5ppb) 2,9% (20ppb)

4,6% (5ppb) 6,6% (20ppb)

Te rojo

80%±9% (10ppb) 83,1%±4% (25ppb) 84,8%±3% (50ppb) 75,9%±1% (100ppb)

3,4% (5ppb) 4,7% (20ppb)

7,5% (5ppb) 12% (20ppb)

Te negro

79,2%±9% (10ppb) 72,2%±4% (25ppb) 75,2%±7% (50ppb)

62,8%±11% (100ppb)

1,2% (5ppb) 6,3% (20ppb)

12,7% (5ppb) 8,5% (20ppb)


Te manzanilla

108,6%±3% (10ppb) 103,3%±3% (25ppb) 75,9%±10% (50ppb)

79,3%±19% (100ppb)

4,7% (5ppb) 2,3% (20ppb)

19,7% (5ppb) 16,9% (20ppb)

10ppb 1ppb >0,99 0,5-200ppb

Agua superficial 72% (0,025ppb)

86% (0,1ppb) 10% (0,025ppb)

7% (0,1ppb)

Agua subterranea 99% (0,025ppb) 114% (0,1ppb)

-% (0,025ppb) 1% (0,1ppb)

Agua potable 72% (0,025ppb)

81% (0,1ppb) 6% (0,025ppb) 8% (0,1ppb)


Agua residual tratada

55% (0,025ppb) 67% (0,1ppb)

4% (0,025ppb) 5% (0,1ppb)

- 0,025ppb 0,05-1ppb >0,99 1-100ppb

116






Mango 84,75%±7,32% (33,3ppb) 82,8%±5,06% (166,5ppb)

80,02%±4,75% (333,3ppb) 6,61% 12% 6,66ppb 1ppb 0,9929 6,66 -

1665ppb

Agua superficial Menezes Filho y col. (2010b) Agua subterránea

93,8%±4,6% (0,2ppb) 92,6%±5% (5ppb)

70,2%±4,6% (50ppb)

3,6% (5ppb) 6,7% (50ppb)

8,4% (5ppb) 6,3% (50ppb) 0,05ppb 0,02ppb 0,9952

0,05-250ppb


Ensalada verde, tomate y frutilla

122% (0,01ppm) 132% (0,1ppm) 105% (1ppm)

9% (0,01ppm) 7% (0,1ppm) 6% (1ppm)

- 0,01ppm - >0,98 0,01-1ppm

Pang y col. (2006) Tejido animal

75% (0,001ppm) 97% (0,002ppm) 89% (0,01ppm)

8% (0,001ppm) 12% (0,002ppm)

6% (0,01ppm) - 1ppb 0,5ppb �0,98

0,2-4800ppb


Soja 77%±5,6% (0,01ppm) 89%±5,1% (0,05ppm) 95%±3,1% (0,1ppm)

- - 0.01 ppm 0.1 - 0.25 ppb 0,999 0,1 - 10

ppb


Soja 46%±21,4% (0,01ppm) 60%±7,9% (0,05ppm) 68%±4,4% (0,1ppm)

- - - 0.1 - 0.25ppb 0,999 0,1 - 10

ppb


Uva 84% (n=7) 5% (n=7) 25% (n=6) 0,02ppm 0,01ppm 0,999 0,05-

7,9ppm


Sedimentos 94,1% 9,2%

- 4,4ppb - -

Viñas P. y col. (2009)

Alimento para bebé 102%±8% 2,6%

73ppt (ng/l)

0,29ppb

(µg/kg)

22ppt 0,9934 0,1 -

10ppb

Walorczyk (2007)

Trigo 130%±18% (0,01ppm) 103%±11% (0,02ppm) 101%±10% (0,05ppm)

- - 0,02ppm 0,007ppm >0,98 0,002-0,2ppm

Trigo

116%±9% (0,01ppm) 110%±5% (0,05ppm) 99%±4% (0,1ppm) 104%±2% (0,5ppm)

- - Walorczyk

(2008)

Alimento animal deshidratado

109%±10% (0,01ppm) 110%±13% (0,1ppm)

- -

< 0,01ppm < 0,01ppm 0,999 0,01 -

0,5ppm

117






(2009) abejas

92%±23% (10ppb) 88%±8% (50ppb)

99%±5% (500ppb) - - < 0,01ppm < 0,01ppm 0,9970

4-500ppb

Vino tinto 82%±10% (0,01ppm) 90%±7% (0,05ppm) 91%±3% (0,2ppm)

0,9992 0,005-0,2ppm

Vino blanco 93%±5% (0,05ppm) - -


Vino rosado 95%±5% (0,05ppm)

- - 0,01ppm -

- -

Walorczyk (2012)

Frutas, vegetales y malta de cebada

89,6%±6,4% (0,5ppm) 87,5%±7,2% (1ppm)

- - - - 0,9940 0,01-

0,5ppm

Trigo sarraceno 99%±7% (0,01ppm) 98%±5% (0,05ppm)

103%±2% (0,25ppm) Walorczyk y Drozdzysnki

(2012) Centeno

105%±6% (0,01ppm) 97%±5% (0,05ppm)

102%±4% (0,25ppm)

- - 0,01ppm - >0,99 0,005-0,5ppm

�

Tabla II.20: Condiciones cromatográficas para cuantificar boscalid



HPLC-MS/MS

C18 Aqua 5m 125A°,

50mm × 2µm. Guarda columna C18

Aqua 5m 125A° , 10mm × 2mm.

A = 80% agua - 20% metanol;B = 90% metanol - 10% agua; ambas con 5 mmoles/L formato amonio.

-

- APCI: flujo 0.4 mL/min y fase móvil 0% B hasta 100% linealmente en 25 min y se

mantiene 6 min. - ESI: flujo 0.2 mL/min e incremento lineal de B

de 0% a 100% en 29 min y se mantiene 10 min.


(2012) GC-MS

Bruker VF-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm).

Guarda columna Bruker (2m x 0,25mm)


200°C (1min); 30°C/min hasta 300°C (7min).

T inyector 250°C; T fuente iones 250°C; T cuadrupolo 40°C.

Chen M., y col. (2007) GC-µECD

DB-5 (10m × 0,1mm x 0,17µm) -

130°C (5 min) - 30°C/min hasta 250°C (10 min)

T inyector 260°C; T detector 300°C; vol injección 1µl

118



Cus y col. (2010a)

GC-MS HP-5MS (30m x 0,25mm

x 0,25µm) -



280ºC (20min)


cuadrupolo 150°C.




280ºC (20min)




HPLC-MS/MS

SupelcoSil TM LC-ABZ (25cm × 4.6mm x 5�m).

Agua acidificada a pH 3 con H3PO4 (A) y AcN (B), 50:50 (%A :

%B, V/V). - Longitud de onda 230nm

González-Rodríguez R., y col. (2009)

GC-ITMS con PTV

SPB-5 (30m × 0,25mm x

0,25µm) -

60°C (2min), 10 °C/min a 150 �C (2 min), 20°C/min a 210°C

(5min), 2°C/min a 220°C (5min), 10°C/min a 310°C (5min).

Rampa PTV: 80°C (0,1min), 720°C/min a 100°C (0,1min), 402°C/min a 275°C (1,5min),

402°C/min a 300°C (5min). Volumen inyectado 2ml, split flow 50ml/min,

splitless time 1,5min, flujo inyección 50ml/min. T transfer line 270°C, T trampa iones 250°C.

EI (70eV).


HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x

5µm). Guarda columna C18 (4mm × 3,mm)


10 min

- -

Lee y col. (2009)

HPLC-MS/MS

Zorbax XDB-C18 (50mm

x 4,6mm x 5µm)




Lohmann W., y col. (2009)

HPLC-MS C18 ZORBAX Eclipse

XDB (50mm x 2,1mm x

3,5µm)

Agua + ácido fórmico 0.1% (A); Acetonitrilo (B).

Gradiente: 10% B (1min); sube hasta 95% en 9min (1min); bajar

a 10% (4min).

- -

119




GC-MS/MS

HP-5MS UI (15m x 0,25mm x 0,25µm)

- 70°C (1min), 50°C/min a 150°C,

6°C/min a 200°C, 16°C/min a 280°C (4,07min).

T inyector: 80°C (0,1min), 600°C/min hasta 300°C (20min)

EI. T transfer line 280°C, T fuente iones 280°C, T cuadrupolo 150°C

Pizzutti I., y col. (2007) Pizzutti I., y col. (2009)

HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x

5µm). Guarda columna C18 (4mm × 3mm)



- ESI(+)

Schummer C., y col. (2009)

GC-MS/MS

Varian VF-5ms (60m x

0,25 mm x 0,25µm). -

50°C (5 min), 17°C/min a 220°C (11min), 0.4°C/min a 223°C (4.5

min), 0.4°C/min a 244°C, 2°C/min a 300°C (5 min).

T inyector 280°C, T transfer line 250°C, T manifold 200°C.

Walorczyk E. (2008)

T inyector 250ºC (1,5min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min).


(2009)

T inyector 250ºC (1.5min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min). Split ratio 20:1, a 0,01min el split vent se cierra hasta 1.5min,

luego se abre y mantiene a 100:1 (20 min), y finalmente se reduce a 20:1.

T transfer line 290ºC; T manifold 40ºC; T fuente iones 270ºC.




Walorczyk (2012)

T inyector: 250ºC (1min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min). Split ratio 20:1, a 0,01min el split vent se cierra hasta 1,5min,




(2012)

GC-MS/MS



- 80°C (3min), 30°C/min a 150°C,

10°C/min a 300°C (10min).



120

Tabla II.21: Características de la metodología analítica para boscalid




Tomate - - - - - - - Pepino - - - - - - - Limón - - - - - - -

Pasas de uva

- - -

- - - - Alder y col. (2004)

Harina de trigo - - - - - - -

Tomate 0,997 Manzana 0,999


Naranja - <20% <20% 50ppb -

0,999 0,5-50ppb

Chen y col. (2007) Pepinos 100,1%±3,3% (0,2ppm)

99,5%±2,8% (1ppm) 97,1%±1,2% (2ppm)

1,49 (n=5) 6,03 (n=5) 0,01ppm 0,005ppm 0,999 0,005 – 3ppm

Cus y col. (2010a)

Uva, orujo, torta,

sedimento, mosto,

vino

- - - - 0,01ppm - -

Cus y col. (2010b) Vinos - - - - 0,01ppm - -

Gabriolotto y col. (2009)

Uvas 87%±3% (0,2ppm) 87%±2% (0,7ppm) 89%±3% (1,2ppm)

- - - - - -

Uvas blancas

97%±4% sin AP 118%±9% con AP - - 0,001ppm < 0.001ppm 0,999 0,001 -

0,2ppm

Uvas rojas 106%±6% sin AP 112%±4% con AP

- - 0,002ppm 0,001ppm 0,998 0,002 - 0,2ppm

Vino blanco

137%±4% sin AP 124%±12% con AP

- - 0,002ppm 0,001ppm 0,996 0,002 - 0,1ppm


(2009)

Vino tinto 131%±9% sin AP 119%±5% con AP

- - 0,003ppm 0,001ppm 1 0,003 - 0,1ppm

121






Lechuga, naranja,

manzana, repollo,

uva, harina de

trigo

70 - 110% < 15% - <0,01ppm < 0.01 ppm > 0,99 0,001 - 0,2

ppm

Harina de trigo

115%±12% (0,1ppm) 123%±9% (1ppm) 1,9ppb

Lee y col. (2009) Arroz pulido

80%±5% (0,1ppm) 85%±15% (1ppm)

- - -

2,9ppb

>0,995 0,01-2ppm

Lohmann y col. (2009)

Estándar - - - - - - -

Te verde

<LOD (10ppb) <LOD (25ppb) <LOD (50ppb)

119,2%±19% (100ppb)

- (5ppb) 9,4% (20ppb)

- % (5ppb) 10,4% (20ppb)

100ppb 50ppb 20-200ppb

Te rojo

66,6%±7% (10ppb) 70%±5% (25ppb)

73,9%±5% (50ppb) 78,9%±4% (100ppb)

0,2% (5ppb) 0,4% (20ppb)

19,3% (5ppb) 18,5% (20ppb)

10ppb 2ppb 2-200ppb

Te negro

79,3%±7% (10ppb) 73,7%±8% (25ppb) 92,9%±5% (50ppb) 90%±4% (100ppb)

3,1% (5ppb) 1,6% (20ppb)

16,6% (5ppb) 13,9% (20ppb)

10ppb 3ppb 2-200ppb


Te manzanilla

72,1%±6% (10ppb) 72,6%±2% (25ppb) 77,4%±4% (50ppb)

84,5%±5% (100ppb)

0,7% (5ppb) 1,2% (20ppb)

23% (5ppb) 19,9% (20ppb)

10ppb 1ppb

>0,99

0,5-200ppb


Soja 55%±12,8% (0,01ppm) 68%±8,5% (0,05ppm) 70%±6,6% (0,1ppm)

- - 0,1ppm 0,1 –

0,25ppb 0,999

0,1 – 10ppb

122






Soja 84%±10,1% (0,01ppm) 89%±1,7% (0,05ppm) 94%±4,1% (0,1ppm)

- - 0,01 ppm 0,1 – 0,25ppb

0,999 0,1 - 10ppb


Aire - - - - 27,28pg/m3 - -

Trigo

98%±13% (0,01ppm) 108%±3% (0,05ppm) 94%±5% (0,1ppm) 99%±2% (0,5ppm)

- - <0,01ppm < 0,01 ppm 0,999 0,005 - 0,5 ppm


deshidratado

119%±1% (0,01ppm) 100%±8% (0,1ppm) - - <0,01ppm < 0,01 ppm

Walorczyk E. y Gnusowski (2009)

abejas 87%±20% (0,01ppm) 85%±7% (0,05ppm) 88%±6% (0,5ppm)

- - 0,01ppm o menos

0,01ppm o menos

0,9992 10 - 500ppb


0,9997 0,005-0,2ppm

Vino blanco 86%±4% (0,05ppm) - - Walorczyk y col.

(2011)


- - 0,01ppm -

- -

Walorczyk (2012)

Frutas, vegetales y

malta de cebada

90,3%±9,4% (0,5ppm) 92,2%±14,4% (1ppm)

- - - - 0,9991 0,01-0,5ppm


(2012)

Trigo sarraceno

99%±5% (0,01ppm) 96%±4% (0,05ppm)

100%±2% (0,25ppm) - - 0,01ppm - >0,99

0,005-0,5ppm

123

Tabla II.22: Condiciones cromatográficas para cuantificar pyraclostrobin



HPLC-MS/MS

C18 Aqua 5m 125A°, 50mm × 2µm.

Guarda columna C18 Aqua 5m 125A° , 10mm

× 2mm.

A = 80% agua - 20% metanol;B = 90% metanol - 10% agua; ambas con 5 mmoles/l formato amonio.

-



Banerjee K., y col. (2007)

HPLC-MS/MS

Purosphere RP-18

(55mm × 2mm × 3µm)

A= metanol - agua (20:80, v/v) con 5mM formato de amonio.

Gradiente 0–1 min/90% A, 1–2 min/90%–5%A, 2–11 min/5%A,

11–12 min/5–90%A, 12–18 min/90%A.

-

Flujo: 0,3ml/min Ion spray voltage 5500V; Presión gas

nebulizador 30 psi; curtain gas 25 psi; heater gas 60 psi y T fuente iones 500°C.


HPLC-DAD

Spherisorb ODS2

(150mm x 4mm x 5µm) AcN : agua (50:50, v/v) isocrática - T columna 60°C; flujo 1ml/min

HPLC DAD

Macherey-Nagel cc250/4 Superspher 100-4RP-18ec. Guarda columna

Merck LiChrospher

100RP-18 (5µm).

Metanol - agua (80:20, v/v) - Flujo: 0,8ml/min De Melo Abreu

S., y col. (2006)

GC - MS J&W Scientific DB-5MS

(30m x 0,25mm x

0,25µm) - 170ºC, 15ºC/min a 320ºC (5min)

T inyector 300ºC EI (65eV), T interface 300ºC, T fuente iones

180ºC

Garau y col. (2009)

HPLC DAD-MS

Synergi Hydro RP-C18 (150mm ×

4,6mm × 4�m) Precolumna LiChrospher

100 RP-C18 (4mm × 4mm × 5�m)

Metanol - agua (80:20, v/v) con ácido trifluoroacético 0,1%

- Flujo: 0,4ml/min. Inyección de 20µl

ESI; T fuente iones 280°C; T cdl 280°C; modo SIM

González-Rodríguez y col. (2009)

GC-ITMS con PTV

SPB-5 (30m × 0,25mm x

0,25µm) -

60°C (2min), 10 °C/min a 150°C (2 min), 20°C/min a 210°C

(5min), 2°C/min a 220°C (5min), 10°C/min a 310°C (5min).

Rampa PTV: 80°C (0,1min), 720°C/min a 100°C (0,1min), 402°C/min a 275°C (1,5min),

402°C/min a 300°C (5min). Vol inyectado 2 ml, split flow 50 ml/min,

splitless time 1,5min, injection flow: 50 ml/min. T transfer line 270°C, T trampa iones 250°C.

EI (70eV).

124



Hiemstra y col. (2007)

HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x



10min

- -


UHPLC-TOF-MS


1,8µm)

Metanol (A) y 0,005M formato de amonio (B). Gradiente: 10% A





Lee y col. (2009)

HPLC-MS/MS

Zorbax XDB-C18 (50mm

x 4,6mm x 5µm)





HPLC - MS

Zorbax SB-C18 (210mm

x 150mm x 3,5µm)

(A) Agua – metanol 90–9,95% (v/v) con 0,05% HCOOH; (B)

Agua – metanol, 9,95–90% (v/v) con 0,05% HCOOH.

Gradiente: 100% A a 0min, 100% A a 1min,0% A a 10min,0% A a

17min, 100% A a 22min.

- -



GC-MS

RestekRtx - 1MSCrossbond 100%

polidimetilsiloxano (30m

× 0,25mm × 0,25 µm)

- 60ºC (1min); 25ºC/min hasta 170ºC; 6ºC/min hasta 290ºC

(1min)

EI (70eV), T transfer line 250ºC; T fuente iones 230ºC

Nguyen y col (2009)

GC-MS J&W DB5MS, 5% fenil

polisiloxano (30m × 0,25mm x 0,25µm)

-

65°C (1min), 15°C/min hasta 135°C, 10°C/min hasta 145°C,

5°C/min hasta 150°C, 2,5°C/min hasta 220°C, 7,5°C/min hasta

227,5°C, 12,5°C/min hasta 300°C (4,5min)

T inyector 260°C



HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x


25% metanol - 5 mmol/ l formato de amonio creciendo linealmente


- ESI(+)

125




GC-MS/MS

Varian VF-5ms (60m x 0,25mm x 0,25µm).

-

50°C (5 min), 17°C/min a 220°C (11min), 0,4°C/min a 223°C (4,5

min), 0,4°C/min a 244°C, 2°C/min a 300°C (5 min).

T inyector 280°C, T transfer line 250°C, T manifold 200°C.

DART - TOF - MS

- - - -

DESI - LIT - MS

- - - - Schurek y col.

(2008)

HPLC - MS/MS

C18 (150mm × 3mm × 5�m)

Agua conteniendo 10mM acetato de amonio (A) y metanol (B).

Gradiente: 0-3 min 70% B; 3-14 min 70-100% B; 14-20min 70% B

- Volumen inyección 5 �l. Flujo 0,3ml/min


GC-MS DB-5ms (30m × 0,25mm

x 0,25µm) - 80ºC (1min); 10ºC/min hasta

300ºC (10min)

Detector: µECD T inyector 275ºC; T tranfer line 280ºC; T

trampa iones 220ºC

Viñas P., y col. (2009)

GC-MS ASBL 5MS (30m ×

0,25mm x 0,25µm) -

180ºC (2min), 10ºC/min hasta 250ºC, 50ºC/min hasta 300ºC

(3min) T fuente iones 230ºC, T transfer line 325ºC


(2009)

T inyector: 250ºC (1,5min) durante inyección, 200ºC/min a 300ºC (20min). Split ratio 20:1, a 0,01min el split vent se cierra hasta 1,5min, luego se abre y mantiene a 100:1 (20min), y

finalmente se reduce a 20:1. T transfer line 290ºC; T manifold 40ºC; T

fuente iones 270ºC.




Walorczyk (2012a)

GC-MS/MS

DB-5 MS (30m × 0,25mm

x 0,5µm). Guarda columna (2m × 0,53mm)

- 80°C (3min después de

inyección), 30°C/min a 150°C, 10°C/min a 300°C (10min).




126




(2012)

GC-MS/MS

DB-5 MS (30m × 0,25mm x 0,5µm). Guarda

columna (2m × 0,53mm) -

80°C (3min después de inyección), 30°C/min a 150°C,

10°C/min a 300°C (10min).



Tabla II.23: Características de la metodología analítica para pyraclostrobin




tomate - - - - - - - pepino - - - - - - - limón - - - - - - -

pasas de uva - - - - - - -

Alder y col. (2004)

harina de trigo

- - - - - - -

Banerjee y col. (2007) uvas

91%±6% (2,5ppb) 78,2%±5% (5ppb) 90,5%±6% (10ppb)

88,1%±0,9% (25ppb) 84,5%±1% (50ppb)

- - 2,5ppb 1ppb 0,9997 -

Pera 100%±3% (10ppb) 98%±5% (25ppb)

Limón 94%±3% (10ppb) 99%±5% (25ppb)


Uva 92%±5% (10ppb) 95%±3% (25ppb)

- - 17µg/l 5µg/l 0,9989 0,01-5ppm

127





uvas 0,6ppm 0,2 ppm De Melo Abreu S., y col. (2006) vino

97%±12% (0,25ppm) 102%±12% (1ppm) 101%±9% (2ppm)

<6,5% (0,25ppm) <11,4% (0,25-1-2ppm) 0,8ppm 0,2 ppm

0,999 0,1 - 2,5ppm

Uvas 99%±5% (0,1ppm) 96%±4% (0,5ppm) 113%±7% (1ppm)

4,4 (0,1ppm) 4,8 (0,5ppm) 6,9 (1ppm)

5,4 (0,1ppm) 11,3 (0,5ppm)

7,5 (1ppm) 0,03ppm -

Garau y col. (2009)

Vino 109%±3% (0,1ppm) 98%±8% (0,5ppm) 104%±7% (1ppm)

- - 0,06ppm -

>0,996 0,01 – 1ppm

uvas blancas

>1000% sin AP

147% con AP

10% sin AP

16% con AP 0.005ppm 0.004ppm 0,997

0,005 - 0,2ppm

uvas rojas >1000% sin AP

142% con AP

33% sin AP

6% con AP 0.007ppm 0.003ppm 0,999 0,007 -

0,2ppm

vino blanco

>1000% sin AP

129% con AP

8% sin AP

11% con AP 0.002ppm 0.001ppm 0,996 0,002 -

0,1ppm


col. (2009)

vino tinto >1000% sin AP

129% con AP

9% sin AP

8% con AP

-

0.005ppm 0.002ppm 0,995 0,005 - 0,1ppm

Hiemstra M., y col. (2007)

Lechuga, naranja,

manzana, repollo,

uva, harina de

trigo

70 - 110% < 15% - < 0.01ppm < 0.01ppm > 0,99 0,001 - 0,2ppm

Manzana 4,99% 1 - 300ppb Frutilla 5,73% 1 - 300ppb Tomate 6,84% 1 - 450ppb

Lacina O., y col. (2010)

espinaca

-

2,48%

- < 10ppb - -

1 - 200ppb

128





Harina de trigo

125%±4% (0,1ppm) 129%±10% (1ppm)

1,5ppb Lee y col. (2009)

Arroz pulido 81%±10% (0,1ppm) 89%±7% (1ppm)

- - - 0,8ppb

>0,995 0,01-2ppm

Uva 92 - 95% 3 - 6,5%

limón 79 - 85% 3,1 - 4,9%

Cebolla 62 - 86% 3,4 - 3,6% Lesueur C., y col.

(2008)

tomate 91 - 117% 3 - 4,3%

- 3,3 - 382ppb

1 - 115ppb > 0,99 (cuadrática)

0,05 - 5ppm


Mango

115,95%±10,04% (33,3ppb)

74,24%±3,47% (166,5ppm)

77,07%±2,88% (333,3ppm)

7,55% 12,72% 16,65ppb 5ppb 0,9991 16,65 - 1665ppb


Agua superficial

- (0,2ppb) 93,4%±8,3% (5ppb)

87,4%±4,6% (50ppb)

7,3% (5ppb) 9% (50ppb)

12,6% (5ppb) 13,7% (50ppb) 1ppb 0,3ppb 0,9934 1-

100ppb

Acanthopanax senticosus

83%±10% (0,05ppm) 93%±8% (0,1ppm)

104%±4% (0,4ppm) - - -

Morus alba 114%±10% (0,05ppm) 106%±7% (0,1ppm) 111%±8% (0,4ppm)

- - - Nguyen T., y col

(2009)

Hobenia dulcis

80%±10% (0,05ppm) 74%±6% (0,1ppm)

110%±7% (0,4ppm) - -

0,075ppm

-

> 0,99 0,05 - 0,4ppm

Pizzutti I., y col. (2007) Soja 55 - 70% 6.6 - 12.8% - 0.1ppm

0.1 - 0.25ppb - -

Pizzutti I., y col. (2009) Soja

69% (100ppb) 64% (50ppb) 49% (10ppb)

4,9% (100ppb) 12,8% (50ppb) 17% (10ppb)

- - 0.1 -

0.25ppb 0,999 0,1 -

10ppb

129





Schummer C., y col. (2010)

Aire - - - - 49,24pg/m3 - -

78% 11% 12ppb - 0.9912

- - - - - Schurek J., y col.

(2008) Trigo

96% 5%

-

2ppb - 0.9995

6 - 1200ppb


Sedimentos 80% 15,8%

- 8,9ppb - -

Viñas P. y col. (2009)

Alimento para bebé

106%±3% 4,5%

100ppt (ng/l)

0,4ppb

(µg/kg)

30ppt 0,9967 0,1 -

10ppb

Walorczyk y Gnusowski (2009)

abejas 87 - 95% 10 - 17%

0.01 ppm o menos

0.01 ppm o menos

0,9991 4 -

500ppb


0,9978 0,005-0,2ppm

Vino blanco 88%±6% (0,05ppm) - -



- - 0,01ppm -

- -

Walorczyk (2012)

Frutas, vegetales y

malta de cebada

96,6%±14,6% (0,5ppm)

97,2%±12,5% (1ppm) - - - - 0,9973

0,01-0,5ppm

Trigo sarraceno

106%±8% (0,01ppm) 81%±9% (0,05ppm)

100%±4% (0,25ppm) Walorczyk y Drozdzysnki

(2012) Centeno

1125%±5% (0,01ppm) 99%±10% (0,05ppm) 105%±7% (0,25ppm)

- - 0,01ppm - >0,99 0,005-0,5ppm

130

Tabla II.24: Condiciones cromatográficas para cuantificar cyprodinil



HPLC -MS/MS

C18 Aqua 5m 125A°, 50mm × 2mm.

Guarda columna C18 Aqua 5m 125A° , 10mm

× 2mm.

A = 80% agua - 20% metanol;B = 90% metanol - 10% agua; ambas con 5 mmoles/l formato amonio.

-



Asensio-Ramos y col.

(2008) CE - UV -

metanol-AcN (1:2, v/v),90mM dodecilsulfato sódico (SDS),

20,5mM HClO4 - Longitud de onda 241nm

Basa Cesnik y col.

(2008) GC - MS - -



280ºC (20min)


Ionización electrónica (70eV), T interface 280ºC, T ion source 230ºC; SIM

Belmonte Vega y col.

(2005)

HPLC - MS

Atlantis dC18 (150mm x 2mm x 5µm)

metanol–0,01% ácido acético (A) y 0,01% ácido acético (B).

Gradiente: 4min 20% A, luego de 20 a 90% A en 30min. Mantener 90% A por 10min. Regresar a las condiciones iniciales a los 51min

-

Flujo 0,2ml/min. T columna 30ºC. Vol inyección

20µl. ESI (+). T fuente iones 130ºC, T desolvatación 350ºC. Modo SIM


CE - DAD – MS/MS

Capilar sílica fundida (65cm long. total, 50cm long. efectiva, 75µm d.i.,

375µm d.e.)

Solución acuosa 80mM acetato de amonio pH 4,6

- Longitud de onda 220nm, T capilar 20ºC


GC -MS/MS



0,25mm)

- 70°C (3,5min); 50°C hasta


EI (70eV). Flujo de He 1ml/min. Rampa inyector: 70°C (0,5min); 100°C/min




UPLC - MS/MS

Acquity UPLC BEH C18 (100mm x 2,1mm x

1,7µm)

Metanol (A) y 0,01% ácido fórmico en agua (B).

Gradiente: 25% B a 90% en 5min. Mantener 3min. Volver a las

condiciones iniciales en 1,5min.

-

Flujo 0,35ml/min, T columna 35ºC ESI (+). Votaje capilar 3,5kV, Voltaje extractor 5V, T fuente 110ºC, T desolvatación 350ºC,

Flujo cono gas 80l/h, Flujo gas desolvatación 600l/h

131



Cabras y col. (1997) GC-NPD

J&W Scientific DB17 (30m x 0,25mm x

0,25µm) -

110ºC (1min), 20ºC/min hasta 280ºC (10min) T inyector 250ºC, T detector 280ºC

Cajca y col. (2005)

LV - DMI - GC - MS


Guarda columna Varian VF-5MS EZ (5m x

0,25µm)

- 80°C (3,5min), 30°C/min hasta 180°C, 10°C/min hasta 230°C, 45°C hasta 300°C (9,61min)

Voltaje 200V; T interfase 280°C; T fuente iones 150°C; T cuadrupolo 230°C

Cajca y col. (2012)

GC -MS/MS


(0,5m x 0,15mm x 0,15µm)





HPLC -MS/MS

Luna C18 (150mm × 2mm x 0,25mm)

Agua con 0,1% ácido fórmico y 5mM formeato de amonio (A) y

metanol (B). Gradiente: 30% B a 35% en 8min;

de 35 a 90% B en 4min; isocrático durante 10min. Luego

de 90 a 30% B en 1min y mantener 2min.

- Flujo 200µl/min. ESI (+). Voltage del espray 4500V, Temp capilar 350°C


LP-GC/MS

Supelco SPB-5 (15m x 0,32mm x 1µm).

Restricción de columna sin recubrimiento

Supelco (3m x 0,25mm)


(4,78min)

T inyector 250°C; Flujo 2,6ml/min. T interfase 280°C; 70eV; T fuente iones 230°C;

T cuadrupolo 150°C; modo SIM.


MD-GC/MS

Columna primaria J&W Scientific DB-5HT (3m x

0,32mm x 0,1µm)Columna secundaria J&W

Scientific DB-5MS (15m x 0,25mm x 0,25µm)


(4,62min)

T inyector 250°C EI (70eV); T interfase 280°C; T fuente iones

230°C; T cuadrupolo 150°C; modo SIM

132



Cus y col. (2010a)


x 0,25µm) -



280ºC (20min)


cuadrupolo 150°C.




280ºC (20min)


Ionización electrónica (70eV), T interface 280ºC, T fuente iones 230ºC; SIM


GCxGC - TOFMS

DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) en serie con

Varian V-17 (1m x 0,1mm x 0,1µm).

-

Horno primario: 100°C (2min); 15°C/min hasta 190°C (5min);

10°C/min hasta 200°C; 15°C/min hasta 242°C (5min); 10°C/min hasta 285°C (12min)

Horno secundario: 106°C (2min); 15°C/min hasta 195°C (5min); 15°C/min hasta 250°C (5min); 10°C/min hasta 305°C

(11min)

T inyector 250°C. T interfase 305°C; EI 70eV; T fuente iones

240°C.


HPLC -MSMS

Xterra MS C18 (2,1mm x 150mm x 3,5µm).

Guardacolumna Xterra MS C18 (2,1mm x 10mm

x 3,5µm)

Agua deionizada con 0,1% (v/v) ácido fórmico (A) y AcN con 0,1%

(v/v) ácido fórmico (B) Gradiente: 90% A por 3min; de

90% a 10% A en 28min (mantener 5min); de 10% a 90% A en 0,5min (mantener 8,5min).

- T columna 28°C; flujo 0,2ml/min. ESI(+); voltaje 4kV; T capilar 350°C


GC-NPD HP-5MSI (30m x 0,25mm

x 0,25µm) -

70°C (2min); 25°C/min hasta 150°C; 3°C/min hasta 200°C; 8°C/min hasta 280°C (10min)

T inyector 250°C; T detector 325°C

133




(2008)

GC -MS/MS



0,25mm)

- 70°C (3,5min); 50°C hasta





Garrido Frenich y col.

(2004)

HPLC -MSMS

Polaris 3µm C18-A (150mm x 2mm x 5µm). Guarda columna Polaris

3µm C18-A (30mm x 2mm)

Metanol (A) y buffer 2mM formeato de amonio pH 2,8 (B). Gradiente: 20% A (3,5min); 20%

a 35% A en 0,5min (1min); 35% a 85% en 20min (7min); 85% a

20% en 1min (7min).

- ESI(+); Voltaje capilar 5000V; T gas secado

300°C; modo SIM

González Rodríguez y

col. (2008a, b) GC-ITMS

SPB-5 (30m × 0,25mm x 0,25µm)

- 80°C; 8°C/min hasta 200°C;

1°C/min hasta 210°C; 1,2°C/min hasta 270°C

PTV: 85°C (0,3min); 600°C/min hasta 270°C (2min); 840°C/min hasta 300°C (5min)

T transfer line 270°C; T fuente iones 250°C

Guerrero y col. (2007) GC-MS

J&W Scientific HP-5 (30m x 0.25mm x

0.25µm) -

70°C (2,5min); 25°C/min hasta 150°C; 3°C/min hasta 200°C; 8°C/min hasta 300°C (10min)

PTV: 30; 60°C/min hasta 300°C (10min) bajo flujo de helio (75ml/min); luego la temperatura

se baja a -150°C con nitrogeno; luego a 10°C/s hasta 300°C (5min)

Gas carrier: He; flujo 1ml/min EI (70eV); SIM


GC-MS

CP-Sil 8 CB (15m x 0,15mm x 0,15µm). Precolumna (1m x

0,32mm)

- 130°C (1,13min); 27,25°C/min

hasta 290°C (8min).

EI (70eV); modo SIM. PTV: 150°C; 400°C/min hasta 300°C (2min); 400°C/min hasta 350°C

(5min).


GC-MS


0,32mm)

- 120°C (1min); 30°C/min hasta 290°C (5min).

EI (70eV); modo SIM. PTV: 120°C; 400°C/min hasta 300°C (1,2min); 100°C/min hasta 350°C

(3min).


HPLC -MSMS

Atlantis C18 (2,1mm x 100mm x 5µm)

Metanol 0,1% ácido fórmico (A) y Agua 0,1% ácido fórmico (B)

- API (+). Presión celda colisión 6xa0-3 mBar. Voltaje capilar 3,5kV. Temperatura interfase

350°C. Temperatura fuente iones 120°C.

134




HPLC -MSMS

HyPURITY C18 (2,1mm x 150mm x 5µm)

Guarda columna C18 (4mm x 2mm)

Acetato de amonio 10mM (A) y metanol (B).

Gradiente: 10% B hasta 90% en 20min (10min). Luego regresar a condición inicial en 1min (9min).

- TurboIonspray (TIS) (+). Voltaje ionización 5kV. Temperatura calentamiento 350°C


HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x 5µm) Guarda columna C18 (4mm × 3.0mm)


10 min

- -

Huang y col. (2009)

HPLC-MS/MS

XDB-C18 (4,6mm x

150mm x 5µm)

Ácido acético 0,1% (A) y metanol (B).

Gradiente: 90% B (4min); de 90% a 40% B en 11min (5min); 40% a

5% B en 5min (7min). Luego regresar a condición inicial en

0,01min (8min).

- ESI (+). Flujo 0,5ml/min; Voltaje ionización 5KV; Temp aguja ionización 550°C

Kirchner y col. (2008)

GC-MS


o,32mm)

- 60°C (1,75min); 60°C/min hasta 150°C; 23,8°C/min hasta 300°C

(1,9min)

EI (70eV). PTV: 40°C (0,2min); 400°C/min hasta 300°C



UHPLC-TOF-MS


1,8µm)







GC- TOF-MS

Rxi-5ms (30m × 0,25mm x 0,25µm)



T fuente iones 200°C; T transfer line 260°C


UPLC MS/MS

Acquity UPLC BEH C18 (50mm × 2,1 mm x

1,7µm)



iniciales

-


Parámetros de ionización: voltaje capilar 1kV; T fuente 120°C; T gas de desolvatación 400°C

a un flujo de 1,3x104 ml/min (N2)

135



Lee y Jo (2012)

GC MS/MS


-






x 0,25µm) -





GC-MS/MS

HP-5MS UI (15m x 0,25mm x 0,25µm)

- 70°C (1min), 50°C/min a 150°C,





UPLC MS/MS

Acquity UPLC HSS T3 (100mm x 2,1mm x

1,8µm)

Agua 0,1mM acetato amonio (A) y Metanol 0,1mM acetato amonio

(B) Gradiente: de 5% a 90% B en 7min (8min). Luego regresar a

condición inicial en 0,1min.

- -


GC-MS VF-5MS Factor Four

(25m x 0,25mm x 0,25µm)

- 70°C (0,5min), 250°C/min hasta 300°C (10min).

EI (70eV). Temp fuente iones 285°C.

GC-NPD HP-5 (30m x 0,32mm x

0,25µm) -

90°C (1min), 10°C/min hasta 180°C (1min), 1°C/min hasta

205°C, 30°C/min hasta 250°C. T inyector 250°C, T detector 300°C



x 0,25µm) -

90°C (1min), 10°C/min hasta 210°C, 5°C/min hasta 240°C, 30°C/min hasta 270°C (3min).

T inyector 250°C, T interfase 280°C, SCAN (rango de masas 50 a 450), T ionización

230°C, T cuadrupolo 150°C, Voltaje 1650V, Ionización por impacto de electrones

Nguyen y col. (2008) GC-MS J&W DB-5MS (30m ×

0,25mm x 0,25µm) -

50ºC (1min),20ºC/min hasta 180ºC, 10ºC/min hasta 190ºC, 3ºC/min hasta 240ºC, 10ºC/min

hasta 300ºC (5min)

T inyector 220ºC, ionización por impacto de electrones, Energía de ionización 70eV, SCAN (rango de masas de 50 a 550), T fuente iones

200ºC, T transfer 280ºC.

136




HPLC-MS/MS

Nucleosil 100-5 C18 HD,(70mm × 2mm). Precolumna (8mm ×

2mm)






Pang y col. (2006) GC-MS

DB-1701 (30m × 0,25mm x 0,25µm)

- 40°C (1min), 30°C/min hasta 130°C, 5°C/min hasta 250°C, 10°C/min hasta 300°C (5min)

Flujo 1,2ml/min; T inyección 290°C; volumen inyección 1µl; EI (70eV); T fuente de iones

230°C; T interfase 280°C; modo SIM

Patil y col. (2009)

GC-TOF/MS

DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25mm) y TR-50MS (1m x 0,1mm x 0,1mm)

- 100°C (2min), 15°C/min hasta 200°C (3min), 10°C/min hasta

275°C (12min)

EI (70eV). Temp inyector 250°C; temp transfer line 285°C; temp fuente iones 240°C.

Pizzutti I., y col. (2009) Pizzutti I., y col. (2007)

HPLC-MS/MS

C18 (150mm × 3,2mm x 5µm). Guarda columna

C18 (4mm × 3mm).



- ESI(+)


HPLC-DAD

Ultracarb ODS 30%C








110min




GC-MS

Supelco MDN-5S (30m x 0,25mm x 0,25µm) con

5% difenilo - 95% dimetilsiloxano

- 50°C (1min), 10°C/min hasta 275°C (10min).

T inyector 240°C, T transfer line 275°C, EI (70eV), modo SIM

137



Rial Otero y col. (2004) GC-MS

Supelco MDN-5S (30m x 0,25mm x 0,25µm)


278°C (15min).

T inyector 240°C, T transfer line 275°C, EI (70eV), modo SIM

Štajnbaher &

Zupan�i�-Kralj

(2003) GC-MS

DB-35MS (30m x 0,25mm x 0,25µm)

-

55°C (2min), 25°C/min hasta 130°C, 1°C/min hasta 200°C;

3°C/min hasta 250°C; 20°C/min hasta 299°C (16min).

EI; Temp transfer line 280°C; temp fuente iones 230°C.


HPLC-DAD

Kromasil C18(15cm × 0,46cm)

Agua (A) y AcN (B). Gradiente: 35-60% B durante 3,5min y luego

mantinene 60% B por 20min. - Flujo 1ml/min, volumen de inyección 50µl,

longitud de onda 280nm.

Walorczyk (2007)




Walorczyk (2008)



(2009)



270ºC.


GC-MS/MS


columna (2m×0.53mm)

-

80°C (3min), 30°C/min a 150°C, 10°C/min a 300°C (10min).



138



Walorczyk (2012)





(2012)

GC-MS/MS


columna (2m×0.53mm)

-




Tabla II.25: Características de la metodología analítica para cyprodinil




Tomate - - - - - - - Pepino - - - - - - - Limón - - - - - - -

Pasas de uva

- - - - - - - Alder y col. (2004)

Harina de trigo - - - - - - -

Asensio-Ramos y col. (2008)

Agua mineral

70%±2% (0,2µg/l) 93%±13% (0,4µg/l)

85%±13% (0,801µg/l)

0,9% (n=4) (0,25, 0,5 y 1ppb)

4,6% (n=36) (0,25, 0,5 y 1ppb) 87,3µg/l 26,2µg/l 0,999 0,136-

1,36mg/l

Basa �esnik y col.

(2008) Uvas

93,4-102,5% (0,013-0,2ppm) 5-10% -

0,001-0,08ppm

0,0004-0,02ppm - -

139





Agua 79% (5ppbl) 80% (50ppbl)

8,5% (5ppb) 5,5% (50ppb)

- 0,025ppb 0,01ppb 0,98 0,05-1ppb Belmonte Vega y

col. (2005) Suelo

85% (5ppbl) 80% (50ppbl)

5,8% (5ppb) 5% (50ppb)

- 1,5ppb 0,5ppb 0,98 5-100ppb


Leche 89%±14% (0,025ppm) 94%±14% (0,05ppm) 96%±13% (0,1ppm)

6% (n=10) (0,05ppm)

9% (n=15) (0,05ppm) 25ppb 9ppb 0,996 25-0,025ppm


Frutilla 110% (11,5ppb) 100% (50ppb)

7% (11,5ppb) 3% (50ppb)

9% (11,5ppb) 4% (50ppb)

10ppb 4ppb >0,98 10-200ppb

Vino blanco

93,8%±6,9% (25µg/l)

Vino tinto 84,6%±11,1% (25µg/l)

Cerveza sin alcohol

101,6%±11,8% (25µg/l)


Cerveza 109,5%±9,9% (25µg/l)

4,3% (5µg/l)

3,3% (25µg/l) (n=5)

9,1% (5µg/l)

5,2% (25µg/l) (n=5)

0,3µg/l 0,09µg/l 0,9634 5-100µg/l

Uva 95%±9% (0,05ppm) 101%±7% (0,5ppm)

94%±5% (3ppm) - - -

Mosto 99%±10% (0,05ppm) 106%±4% (0,5ppm)

97%±6% (3ppm) - - -


Vino 106%±12% (0,05ppm) 103%±5% (0,5ppm) 102%±4% (3ppm)

- - -

0,05ppm 0,9987 0,25-

15ppm

Cajca y col. (2005)

Alimento para bebe a base de

fruta

97%± 1%(0,05ppm) - - - - - -

140





Te verde 73%±3% (0,01ppm) 85%±3% (0,1ppm) 85%±5% (1ppm)

1ppb Cajca y col.

(2012) Te negro

76%±5% (0,01ppm) 74%±4% (0,1ppm) 82%±2% (1ppm)

- - -

2,5ppb

- -


Aire

98,7%±4% (0,01ng/filtro) 108,5%±1% (0,2ng/filtro)

78,9%±7% (0,5ng/filtro)

- - 6,5pg/m3 - - -

Uva 57% (0,2ppm) 63% (1ppm)

77% (2,5ppm)

7% (0,2ppm) 14% (1ppm)

16% (2,5ppm) (n=6)

- - 4ppb -

Mosto 73% (0,2ppm) 99% (1ppm)

103% (2,5ppm)

8% (0,2ppm) 5% (1ppm)

6% (2,5ppm) (n=6)

- - 4,5ppb - Cunha y col.

(2009a)

Vino 102% (0,2ppm)

89% (1ppm) 95% (2,5ppm)

10% (0,2ppm) 17% (1ppm)

12% (2,5ppm) (n=6)

- - 6,3ppb

>0,9922

-


Jugo de manzana

89% (0,17ppm) 106% (0,25ppm) 104% (0,5ppm)

4% (0,17ppm) 5% (0,25ppm) 5% (0,5ppm)

(n=6)

3% 2,8µg/l 0,86µg/l 0,9993 0,063-1ppm

Cus y col. (2010a)

Uva, orujo, torta,

sedimento, mosto,

vino

- - - - 0,01ppm - -

141





Cus y col. (2010b) Vino - - - - 0,01ppm - -

Uva 99%±4% (10ppb) 95%±4% (25ppb) 95%±3% (50ppb) Dasgupta y col.

(2010) Vino

62%±1% (10ppb) 64%±5% (25ppb) 62%±1% (50ppb)

- - - - - -

Vino blanco 1,5µg/l 0,45µg/l Economou y col.

(2009) Vino tinto

86%±8% (10ppb) 74%±7,5% (50ppb) - -

2,2µg/l 0,65µg/l 0,988

0,0005-0,1mg/l

Morrón verde

83,7%±4,9% (0,05ppm) 80,8%±3% (0,1ppm)

86,5%±4,5% (0,2ppm) - - 0,5ppb 0,2ppb

Morrón rojo

80,7%±4,5% (0,05ppm) 81,4%±3,7% (0,1ppm) 83,4%±2,8% (0,2ppm)

- - 0,6ppb 0,2ppb Fenoll y col.

(2007)

Tomate 84,5%±3,9% (0,05ppm) 77,1%±3,8% (0,1ppm) 84,2%±2,2% (0,2ppm)

- - 1ppb 0,3ppb

>0,999 0,05-2mg/l

106% (11,5ppb) 93% (50ppb)

4% (11,5ppb) 6% (50ppb)

19% (11,5ppb) 12% (50ppb) 0,9997

10-150ppb

Pepino 87%(150ppb) 8%(150ppb) 8%(150ppb) 0,9980

50-400ppb

88% (11,5ppb) 81% (50ppb)

9% (11,5ppb) 5% (50ppb)

20% (11,5ppb) 18% (50ppb) 0,9976 10-

150ppb


(2008)

Naranja

86%(150ppb) 9%(150ppb) 11%(150ppb)

10ppb -

0,9984 50-400ppb

142





Garrido Frenich y col. (2004)

Vegetales 91% (18ppb) 83% (70ppb)

18% (18ppb) 7% (70ppb)

- 0,93ppb 0,28ppb 0,993 0,014-0,21ppm

Acelga 83% (0,05ppm) 3% (0,05ppm) (n=3) - 0,002ppm 0,001ppm - 0,02-2ppm

Espinaca 80% (0,05ppm) 10% (0,05ppm)

(n=3) - - - -


(2008a, b) Lechuga 79% (0,05ppm) 9% (0,05ppm) (n=3) - - - -

Guerrero y col. (2007) Vinagre 109,11% 5,09% 9,10% 0,83ppb 0,25ppb 0,9996 0,55-

550ppb

Manzana (Schenck

modificado) 0,11ppb

Manzana (QuEChERS)

0,33ppb

Manzana (QuEChERS modificado)

0,18ppb


Manzana (MSPD)

- <10% -

0,65ppb

- - -


Manzana 96,8%±6% (5ppb) 90%±1,6% (10ppb)

94,6%±2,9% (100ppb) - - 0,11ppb - >0,9994 0,0125-

2,5ppb

Tomate 86%±9% (0,01ppm) 74%±7% (0,1ppm)

Limón 88%±4% (0,01ppm) 82%±7% (0,1ppm)

Pasas 84%±8% (0,01ppm) 73%±1% (0,1ppm)


Palta 50%±7% (0,01ppm) 55%±5% (0,1ppm)

<15% - <0,01ppm - - 10-

500ppb

143





Naranja 109%±6% (0,01ppm) 102%±2% (0,1ppm)

Manzana Sin resultado (0,01ppm) 101%±12% (0,1ppm)


Lechuga 109%±8% (0,01ppm) 107%±3% (0,1ppm)

- - - - - -

Lechuga 104%±10% (0,01ppm) 86%±5% (0,05ppm) 92%±6% (0,1ppm)


Manzana 102%±8% (0,01ppm) 79%±8% (0,05ppm) 103%±5% (0,1ppm)


Uva 84%±4% (0,01ppm) 99%±8% (0,02ppm) 100%±1% (0,1ppm)


Harina de trigo

96%±14% (0,01ppm) 81%±4% (0,02ppm) 90%±8% (0,1ppm)

< 15% - < 0.01 ppm

< 0.01 ppm > 0,99 0,001 - 0,2 ppm

Huang y col. (2009)

Te 67,7% (n=6) 73,3% (n=6) 81,4% (n=6)

17,3% (n=6) 17,9% (n=6) 13,6% (n=6)

- 0,05ppm - 0,9995 0,05-0,2ppm

Kirchner y col. (2008) Manzana - 2% (1ppb) - 0,17µg/l - 0,9992 -

144





Manzana - 3,56% - - - 1-300ppb

Frutilla - 5,70% - - - 1-450ppb

Tomate - 2,85% - - - 1-

450ppb


Espinaca - 5,98% -

<10ppb

- - 1-200ppb

Alimento para bebé

(fruta)

52%±2% (0,01ppm) 46%±6% (0,1ppm)

- - - -

Pera 51%±6% (0,01ppm) 52%±4% (0,1ppm)


(2007a)

Lechuga 61%±6% (0,01ppm) 53%±4% (0,1ppm)

- - - -

>0,99 0,005-

0,25ppm


95%±6% (0,01ppm) 102%±6% (0,1ppm)

- - - -

Naranja 104%±7% (0,01ppm) 107%±1% (0,1ppm)


(2007)

Papa 110%±6% (0,01ppm) 104%±5% (0,1ppm)

- - - -

>0,99 0,005-

0,25ppm


92,22%±2,09% (30ppb) 102,7%±4,6% (100ppb)

103,3%±3,55% (1000ppb)

- - 0,55ppb 0,16ppb 0,9919 0,01-

0,5ppm

Uva 108% (0,505ppm) 2,3% -

Limón 78% (0,505ppm) 5,8% - Cebolla 74% (0,505ppm) 9,7% -


Tomate 88% (0,505ppm) 10,0% -

1,2-161ppb

0,4-48,2ppb >0,99 0,05-10ppm

145





Te verde

70,1%±16% (10ppb) 72,7%±185% (25ppb) 80,20%±16% (50ppb) 84,7%±15% (100ppb)

7,3% (5ppb) 4,2% (20ppb)

8,5% (5ppb) 6,8% (20ppb) 10ppb 3ppb

2-200ppb

Te rojo

60,8%±4% (10ppb) 65,4%±3% (25ppb) 72,7%±8% (50ppb) 76%±4% (100ppb)

0,9% (5ppb) 0,7% (20ppb)

2,9% (5ppb) 3,5% (20ppb) 10ppb 3ppb

2-200ppb

Te negro

71,4%±14% (10ppb) 68,2%±3% (25ppb) 77,1%±3% (50ppb)

78,8%±2% (100ppb)

5,1% (5ppb) 2% (20ppb)

7,3% (5ppb) 6% (20ppb) 10ppb 1ppb

0,5-200ppb


Te manzanilla

79,2%±8% (10ppb) 75%±2% (25ppb)

83,1%±5% (50ppb) 86%±7% (100ppb)

1,5% (5ppb) 1,6% (20ppb)

3,7% (5ppb) 2,9% (20ppb) 10ppb 1ppb

>0,99

0,5-200ppb

Agua superficial

97% (0,025ppb) 98% (0,1ppb)

7% (0,025ppb) 8% (0,1ppb)

Agua subterranea

119% (0,025ppb) 93% (0,1ppb)

6% (0,025ppb) 4% (0,1ppb)

Agua potable 90% (0,025ppb)

96% (0,1ppb) 13% (0,025ppb)

5% (0,1ppb)


Agua residual tratada

89% (0,025ppb) 73% (0,1ppb)

6% (0,025ppb) 7% (0,1ppb)

- 0,025ppb 0,05-1ppb >0,99 1-

100ppb


Aceite oliva 91,8% (0,01ppm) 83,7% (0,1ppm)

- - - - >0,98 0,01-0,25ppm

146





Uva 93,5%±17,5%

(0,01ppm) 94,7%±8,7% (0,1ppm)

- 0,0093ppm -

Mosto 103,2%±6,4%

(0,01ppm) 101,7%±6,7% (0,1ppm)

- 0,0103ppm - Navarro y col.

(2000)

Vino 102%±3% (0,01ppm) 95%±6,4% (0,1ppm)

1,1% (n=7)

- 0,0102ppm -

0,999 0,01-2ppm


- - 0.02ppm - Nguyen y col.

(2008) Rábano

89%±1% (0,03ppm) 91%±5% (0,09ppm) 100%±4% (0,18ppm)

- - -

0,9872 0,03-0,36ppm


Ensalada verde,

tomate y frutilla

113% (0,01ppm) 116% (0,1ppm)

85% (1ppm)

8% (0,01ppm) 6% (0,1ppm) 8% (1ppm)

- 0,01ppm - >0,98 0,01-1ppm

Pang y col. (2006) Tejido animal 87% (0,025ppm) 79% (0,05ppm)

106% (0,25ppm)

4% (0,025ppm) 3% (0,05ppm) 10% (0,25ppm)

- 25ppb 12,5ppb �0,98 0,2-4800ppb

Vino tinto 63%±5% (5ppb)

65%±2% (10ppb) 62%±3% (25ppb)

- - 10ppb 3ppb 0,9946 -

Patil y col. (2009)

Vino blanco 61%±1% (5ppb)

62%±5% (10ppb) 62%±1% (25ppb)

- - 7ppb 2ppb 0,9998 -

Pizzutti y col. (2009) Soja

85%±5,1% (0,01ppm) 93%±2,1% (0,05ppm) 95%±1,6% (0,1ppm)

- - 0.01ppm 0.1 - 0.25

ppb 0,999 0,1 -

10ppb

147






Soja 54%±19,3% (0,01ppm) 67%±11,4% (0,05ppm)

71%±4,8% (0,1ppm) - - 0,1ppm 0.1 - 0.25

ppb 0,999 0,1 - 10

ppb


Uva 88% (n=7) 3% (n=7) 8% (n=6) 0,03ppm 0,02ppm 0,997 0,05-10,1ppm


Vino blanco 100% 5% 5,9% 0,2ppb 0,1ppb 0,999 0,5-37ppb


Suelo - - - - - - -


(2003) Manzana

96%±5% (0,01ppm) 96%±2% (0,02ppm) 95%±3% (0,2ppm) 92%±5% (0,5ppm)

- - 0,01ppm - - -

Chaucha 90%±4% (0,02ppm) 87%±4% (0,2ppm) 92%±3% (0,5ppm)


Mosto 97% 5,3% (n=6) - 53,6µg/l 42,9µg/l 0,996 53,6-

20000µg/l Vaquero Fernández y col.

(2008) Vino 99,5% 5,4% (n=6) 45,9µg/l 34,8µg/l 0,990 45,9-

20000µg/l

Walorczyk (2007) Trigo 92%±24% (0,01ppm) 104%±9% (0,02ppm)

114%±10% (0,05ppm) - - 0,02ppm 0,006ppm >0,98

0,002-0,2ppm

148





Trigo

103%±8% (0,01ppm) 99%±2% (0,05ppm) 100%±1% (0,1ppm) 100%±1% (0,5ppm)

- -


deshidratado

117%±7% (0,01ppm) 108%±1% (0,1ppm)

- -

< 0.01ppm < 0.01ppm 0,999 0,005 - 0,5 ppm

Walorczyk y col. (2009) Abejas

72%±15% (10ppb) 68%±7% (50ppb)

73%±11% (500ppb) - - < 0.01ppm < 0.01ppm 0,9973 4-500ppb


0,9999 0,005-0,2ppm


(2011)


- - 0,01ppm -

- -

Walorczyk (2012)

Frutas, vegetales y

malta de cebada

91,9%±9,9% (0,5ppm) 93,6%±8,1% (1ppm) - - - - 0,9996

0,01-0,5ppm


(2012)

Trigo sarraceno

78%±6% (0,01ppm) 93%±4% (0,05ppm) 91%±3% (0,25ppm)

- - 0,01ppm - >0,99 0,005-0,5ppm

149

Tabla II.26: Condiciones cromatográficas para cuantificar fludioxonil


Amvrazi y Tsiropoulos

(2009) GC – MS

J&W Scientific HP-5MS 5% difenil y 95%

dimetilpolisiloxano (30m x 0.25mm x 0.25µm)


210°C (16min); 3°C/min hasta 285°C (20min)

Gas carrier: He; flujo de 1ml/min; Inyección splitless de 1µl; T inyector 250ºC

EI (70eV), T interfase 300ºC, T fuente iones 200ºC; SCAN


GC – MS/MS

J&W Scientific DB-5MS (30m x 0.25mm x 0,25µm). Guarda

columna (2m x 0,25mm)

-

70°C (3,5min); 50°C/min hasta 150°C; 5°C/min hasta 180°C; 1°C/min hasta 183°C (4min); 1°C/min hasta 191°C (4min);

1°C/min hasta 205°C; 4°C/min hasta 300°C (5min)

Gas carrier: He; flujo 1ml/min; Inyección 10µl T inyector: 70°C (0,50min); 100°C/min hasta

310°C (10min); Split ratio y válvula artic vent: 0min (abierto, 30:1); 0,5min (cerrado, off); 3,5min (abierto,

100:1); 3,5min (abierto, 100:1); 18,5min (abierto, 20:1)

EI y CI; T fuente iones 200°C; T manifold 50°C; T transfer line 280°C

Basa �esnik y Gregorcic

(2003) Basa Cesnik y

col. (2008)

GC – MS - -



280ºC (20min)



Turbo 80 ODS3 (33mm x 4,6mm x 1,5�m).

Precolumna (25mm x 4,6mm) empacada con frits de acero inoxidable

Agua (A) y AcN (B). Gradiente: 90% A hasta 0,5min; 60% A

hasta 4,5min; 50% A hasta 5min; 0% A hasta 7,5min; 90% A hasta

9min.

- Longitud de onda: 211nm; Flujo: 1,3ml/min;

Vol. Inyección: 5µl

Bourgin y col. (2009) HPLC-UV

Luna C18 (250mm x 4,6mm x 2,5�m). Guarda

columna C18 (4mm x 3mm)

Agua (A) y AcN (B). Gradiente: 60% A hasta 0,5min; 50% A

hasta 12min; 45% A hasta 13min; 0% A hasta 17,5min; 60% A

hasta 29min

- Longitud de onda: 211nm; Flujo: 1,3ml/min;

Vol. Inyección: 20µl


GC-NPD J&W Scientific DB17

(30m x 0,25mm x 0,25µm)

- 110ºC (1min), 20ºC/min hasta 280ºC (10min)

T inyector 250ºC, T detector 280ºC

Cajca y col. (2012)

GC -MS/MS


(0,5m x 0,15mm x 0,15µm)




150



Chu y col. (2005)

GC – MS DB-5MS (30m x 0.25mm x 0.25µm) con 5% fenil –

95% metilsilicona -

80°C (1min); 10°C/min hasta 160°C (5min); 3°C/min hasta 240°C; 25°C/min hasta 280°C

(10min)

Gas carrier: He; flujo 1ml/min; Inyección 1µl T inyector 250ºC; T detector 280°C

EI (70eV), T cuadrupolo 150ºC, T fuente iones 230ºC; SIM

Cus y col. (2010) GC – MS - -



280ºC (20min)


EI (70eV), T interfase 280ºC, T fuente iones 230ºC; SIM

GC-NPD T inyector 250°C; T detector 325°C; Vol

inyección 1µl Fenoll y col. (2007)

GC-MS

HP-5MSI (30m x 0,25mm x 0,25µm)

- 70°C (2min); 25°C/min hasta 150°C; 3°C/min hasta 200°C; 8°C/min hasta 280°C (10min) EI (70eV), T cuadrupolo 150ºC, T fuente iones

230ºC; SIM Fernández González y col. (2003)

GC-MS J&W Scientific DB-17

(30m x 0,25mm x 0,5µm) -

100°C (5min); 10°C/min hasta 200°C (5min); 10°C/min hasta

278°C (25min)

T inyector 240ºC, T transfer line 280ºC. EI (70eV), modo SIM

González Rodríguez y

col. (2008a, b) GC-ITMS

SPB-5 (30m × 0,25mm x 0,25µm)

- 80°C; 8°C/min hasta 200°C;

1°C/min hasta 210°C; 1,2°C/min hasta 270°C

PTV: 85°C (0,3min); 600°C/min hasta 270°C (2min); 840°C/min hasta 300°C (5min)

T transfer line 270°C; T fuente iones 250°C

Guerrero y col. (2007) GC-MS

J&W Scientific HP-5 (30m x 0.25mm x

0.25µm) -

70°C (2,5min); 25°C/min hasta 150°C; 3°C/min hasta 200°C; 8°C/min hasta 300°C (10min)

PTV: 30; 60°C/min hasta 300°C (10min) bajo flujo de helio (75ml/min); luego la temperatura

se baja a -150°C con nitrogeno; luego a 10°C/s hasta 300°C (5min)

Gas carrier: He; flujo 1ml/min EI (70eV); SIM


RM-MEKC

- - - -


RM-MEKC

- - - -


UHPLC-TOF-MS


1.8µm)






151




GC- TOF-MS

Rxi-5ms (30m×0,25mm d.i., 0.25µm)



T ion source 200°C; T transfer line 260°C


UPLC MS/MS

Acquity UPLC BEH C18 (50mm 2,1mm x 1,7µm)



iniciales

-


Parámetros de ionización: voltaje capilar 1kV; T fuente 120°C; T gas de desolvatación 400°C

a un flujo de 1,3x104 ml/min (N2)

Lee y Jo (2012)

GC MS/MS


-






x 0,25µm) -





GC-MS/MS

HP-5MS UI (15m x 0,25mm x 0,25µm)

- 70°C (1min), 50°C/min a 150°C,





GC GC-MS

Sílica fundida DB-5ms (30m x 0.25mm x

0.25µm) con 5% fenilo - 95% metilsilicona

- 50º (1min), 30ºC/min hasta

180ºC (2min), 2ºC/min hasta 280ºC (1min).

Detector NPD y ECD conectados en paralelo. T inyector 280ºC, T detectores 300ºC

T interfase 250ºC, T fuente iones 150ºC, Energía electrón 30V, Energía ión 3V, T

detector 50ºC. SCAN (rango de masas de 50 a 400) y SIM

GC-NPD HP-5 (30m x 0,32mm x 0,25µm) con 5% difenilo – 95% dimetilsiloxano


205°C, 30°C/min hasta 250°C. T inyector 250°C, T detector 300°C


GC-MS

HP-5MS (30m x 0,32mm x 0,25µm) con 5%

difenilo – 95% dimetilsiloxano

- 90°C (1min), 10°C/min hasta 210°C, 5°C/min hasta 240°C, 30°C/min hasta 270°C (3min).

T inyector 250°C, T interfase 280°C, SCAN (rango de masas 50 a 450), T ionización

230°C, T cuadrupolo 150°C, Voltaje 1650V, Ionización por impacto de electrones

152





polisiloxano (30m × 0.25mm x 0,25µm)

-


5°C/min hasta 150°C, 2.5°C/min hasta 220°C, 7.5°C/min hasta

227.5°C, 12.5°C/min hasta 300°C (4.5min)

T inyector 260°C



polisiloxano (30m × 0.25mm x 0,25µm)

-

50ºC (1min),20ºC/min hasta 180ºC, 10ºC/min hasta 190ºC, 3ºC/min hasta 240ºC, 10ºC/min

hasta 300ºC (5min)

T inyector 220ºC, EI (70eV), SCAN (rango de masas de 50 a 550), T fuente iones 200ºC, T

transfer 280ºC.


HPLC-MS/MS

Nucleosil 100-5 C18 HD,(70mm × 2mm).

Precolumna (8mm×2mm)






Pang y col. (2006)

GC-MS DB-1701 (30m × 0,25mm

x 0,25µm) -

40°C (1min), 30°C/min hasta 130°C, 5°C/min hasta 250°C, 10°C/min hasta 300°C (5min)

Flujo 1,2ml/min; T inyección 290°C; volumen inyección 1µl; EI (70eV); T fuente de iones

230°C; T interfase 280°C; modo SIM


GC-MS DB-17 (30m x 0,25mm x

0,50µm) -

40ºC (1min), 15ºC/min hasta 200ºC (5min), 10ºC/min hasta

278ºC (25min)

Volumen inyección, 1ml; T inyector 240ºC; T transfer line 250ºC; modo SCAN y SIM; EI

(70eV).


GC-MS Supelco MDN-5S (30m x

0,25mm x 0,25µm) - 50°C (1min), 10°C/min hasta

275°C (10min). T inyector 240°C, T transfer line 275°C, EI

(70eV), modo SIM


HPLC-DAD

Ultracarb ODS 30%C








110min



153




GC-MS Supelco MDN-5S (30m x

0,25mm x 0,25µm) -

100°C (5min), 10°C/min hasta 200°C (5min), 10°C/min hasta

278°C (15min).

T inyector 240°C, T transfer line 275°C, EI de 70eV, modo SIM


HPLC-MS/MS

SB-18 (50mm x 2,1mm x

3,5µm)

Metanol-AcN-5mM acetato de amonio (45:45:10, v/v/v) (A) y Metanol-AcN-5mM acetato de

amonio (5:5:90, v/v/v) (B) Isocrática: 5% A y 95% B

- Flujo 0,25ml/min T fuente iones 400ºC


(2003) GC-MS

DB-35MS (30m x 0,25mm x 0,25µm)

-


3°C/min hasta 250°C, 20°C/min hasta 299°C (16min)

T inyección 240°C, T transfer line 280°C, T fuente iones 230°C, EI, modo SIM.


HPLC-DAD

Kromasil C18(15cm × 0,46cm)

Agua (A) y AcN (B). Gradiente: 35-60% B durante 3,5min y luego

mantinene 60% B por 20min. - Flujo 1ml/min, volumen de inyección 50µl,

longitud de onda 280nm.

Walorczyk (2007)




Walorczyk (2008)



(2009)



270ºC.


GC-MS/MS



-




154



Walorczyk (2012)





(2012)

GC-MS/MS



-




Tabla II.27: Características de la metodología analítica para fludioxonil




Uvas 105%±15% (0,5ppm) 109%±7% (0,125ppm)

7% (n=6) - 0,003ppm 0,0009ppm �0,97 LOQ – 50LOQ (mg/l)

Amvrazi y Tsiropoulos

(2009) Manzanas

71%±13% (0,5ppm) 70%±12% (0,125ppm) 8% (n=6) - 0,004ppm 0,001ppm �0,97

LOQ – 50LOQ (mg/l)


Pepinos 82%±15% (26ppb) 79%±14% (100ppb)

- 90%±13% (26ppb) 100%±13% (100ppb)

0,07ppb 0,02ppb 0,996 0,02 – 0,3ppm

Papas

89%±7,9% (0,02ppm) 99%±6,7% (0,05ppm) 97%±6,4% (0,2ppm) 94%±5,6% (0,5ppm)

6% (0,19ppm) 8,9% (0,19ppm) 0,02ppm 0,01ppm - 0,01 – 1ppm

Basa �esnik y Gregorcic (2003)

Lechuga

82%±11,3% (0,02ppm) 103%±8,7% (0,05ppm) 91%±5,8% (0,2ppm) 96%±13% (0,5ppm)

- - 0,02ppm 0,01ppm - 0,01 – 1ppm

155





Basa �esnik y col.

(2008) Uvas 93,4-102,5% (0,013-

0,2ppm) 5-10% - 0,001-

0,08ppm 0,0004-0,02ppm

- -

Trigo y maíz (EAS)

82-87%±5-7% - - 0,4-1,5ppm

0,1-0,3ppm >0,9980 Bourgin y col.

(2009) Trigo y maíz

(EUS) 78-84%±3-4% - -

0,3-1,5ppm 0,08-0,5ppm >0,9984

0,12 – 400ppm

uva 107%±10% (0,1ppm) 99%±4% (0,5ppm) 104%±1% (3ppm)

- - -

mosto 107%±12% (0,1ppm) 102%±5% (0,5ppm)

93%±2% (3ppm) - - -


vino 98%±11% (0,1ppm) 102%±4% (0,5ppm)

99%±5% (3ppm) - - -

0,1ppm 0,9987 0,25-15ppm

Te verde 61%±22% (0,01ppm) 68%±7% (0,1ppm) 78%±4% (1ppm)

2,5ppb Cajca y col.

(2012) Te negro

60%±22% (0,01ppm) 56%±6% (0,1ppm) 73%±2% (1ppm)

- - -

2,5ppb

- -


manzana 97%±6,9% (0,01ppm) - - - 4ppb 0,98-1

0,05-4ppm

Cus y col. (2010) Vinos - - - - 0,02ppm - -

156





Pimiento rojo

95,8%±3,4% (0,05ppm) 91,7%±3,3% (0,1ppm) 88,2%±4,3% (0,2ppm)

- - 9,8ppb 3ppb

Pimiento verde

71,5%±4,3% (0,05ppm) 88,4%±3,6% (0,1ppm) 95,4%±3% (0,2ppm)

- - 6,4ppb 1,9ppb Fenoll y col.

(2007)

Tomate 86,9%±3,1% (0,05ppm)

83,4%±3% (0,1ppm) 86,4%±2,9% (0,2ppm)

- - 3ppb 0,9ppb

>0,999 0,05-2ppm

Fernández González y col.

(2003)

Uva blanca

75-100% 2,5% (n=3) 3,5% (n=6) 0,002ppm 0,001ppm 0,999 0,002-0,5ppm

Acelga 99% (0,05ppm) 1% (0,05ppm) (n=3) - 0,002ppm 0,001ppm -

Espinaca 95% (0,05ppm) 2% (0,05ppm) (n=3) - - - - González

Rodríguez y col. (2008a, b)

Lechuga 89% (0,05ppm) 4% (0,05ppm) (n=3) - - - -

0,02-2ppm


Vinagre 91,69% 6,94% 8,49% 2ppb 0,6ppb 0,9931 0,65-130ppb

(SPE) 46-57%±10-19% 0,5ppm 0,1ppm >0,994 0,2-

50ppm Juan-García y col. (2005)

Frutilla, Uva,

Lechuga y Tomate

(SBSE)22-27%±12-15%

3,3% 4,3% 1ppm 0,1ppm >0,996 2-50ppm

Lechuga 70-87%±10-17% - - - Juan-García y col.

(2007) Uva 88-92%±16-19% - -

0,01-0,006mg/kg

0,01-0,3mg/l >0,993 -

Manzana - 7,26% - - - 1-450ppb Frutilla - 7,68% - - - 1-300ppb

Tomate - 6,99% - - - 1-450ppb Lacina y col.

(2010)

Espinaca - 6,74% -

<10ppb

- - 1-300ppb

157





Alimento para bebé

(fruta)

95%±3% (0,01ppm) 91%±2% (0,1ppm)

- - - -

Pera 72%±11% (0,01ppm) 83%±4% (0,1ppm)

- - - -


Lechuga 91%±5% (0,01ppm) 87%±2% (0,1ppm)

- - - -

>0,99 0,005-

0,25ppm


107%±5% (0,01ppm) 107%±6% (0,1ppm)

- - - -

Naranja 115%±12% (0,01ppm) 109%±5% (0,1ppm)

- - - -


Papa 102%±11% (0,01ppm) 107%±6% (0,1ppm)

- - - -

>0,99 0,005-

0,25ppm


88,89%±2,17% (30ppb) 89,67%±0,64%

(100ppb) 98,17%±0,65%

(1000ppb)

- - 1,45ppb 0,43ppb 0,9907 0,01-

0,5ppm

Uva 78% (0,51ppm) 8,8% -

Limón 105% (0,51ppm) 6,4% -

Cebolla 86% (0,51ppm) 10,6% -


Tomate 101% (0,51ppm) 9,2% -

1,2-161ppb 0,4-48,2ppb >0,99 0,05-10ppm

158





Te verde

86,6%±12% (10ppb) 90,2%±7% (25ppb)

93,8%±12% (50ppb) 82,5%±7% (100ppb)

3,7% (5ppb) 1,6% (20ppb)

8% (5ppb) 5,5% (20ppb)

10ppb 2ppb 2-200ppb

Te rojo

65,5%±7% (10ppb) 70,7%±3% (25ppb) 78,9%±3% (50ppb)

80,1%±2% (100ppb)

2,2% (5ppb) 1,5% (20ppb)

6,5% (5ppb) 5,9% (20ppb)

10ppb 1ppb 0,5-200ppb

Te negro

78,9%±8% (10ppb) 70,1%±4% (25ppb) 72,7%±4% (50ppb)

76,2%±2% (100ppb)

3,1% (5ppb) 1,7% (20ppb)

10,3% (5ppb) 9,6% (20ppb)

10ppb 2ppb 2-

200ppb


Te manzanilla

< LOD (10ppb) 72,2%±2% (25ppb) 77,5%±4% (50ppb)

83,4%±6% (100ppb)

1,2% (5ppb) 0,9% (20ppb)

15,5% (5ppb) 10,7% (20ppb) 25ppb 6ppb

>0,99

5-200ppb

Manzana 89%±11% (0,05ppm) 90%±8% (0,5ppm) 92%±9% (5ppm)

- - -

Alcachofa 86%±11% (0,05ppm) 89%±10% (0,5ppm)

92%±9% (5ppm) - - -

Zanahoria 85%±12% (0,05ppm) 83%±7% (0,5ppm) 90%±8% (5ppm)

- - -

Calabacín 89%±11% (0,05ppm) 86%±6% (0,5ppm) 93%±5% (5ppm)

- - -

Naranja 82%±12% (0,05ppm) 88%±7% (0,5ppm) 84%±5% (5ppm)

- - -


Tomate 88%±10% (0,05ppm) 85%±9% (0,5ppm) 86%±9% (5ppm)

- -

0,05ppm (NPD)

0,01 (MS)

-

0,994-0,996

0,05-10ppm

159





Uva 98,6%±17,2%

(0,05ppm) 78,8%±6,2% (0,5ppm)

- 0,049 ppm -

Mosto 100,8%±3,2%

(0,05ppm) 100,7%±4,1% (0,5ppm)

- 0,05 ppm - Navarro y col.

(2000)

Vino 100%±5,1% (0,05ppm) 102%±1,9% (0,5ppm)

8,6% (n=7)

- 0,05 ppm -

0,999 0,01-2ppm

Acanthopanax senticosus

78%±10% (0,05ppm) 87%±9% (0,1ppm) 95%±8% (0,4ppm)

- - -

Morus alba 89%±11% (0,05ppm) 84%±9% (0,1ppm)

100%±7% (0,4ppm) - - -


Hobenia dulcis

92%±8% (0,05ppm) 98%±8% (0,1ppm)

110%±9% (0,4ppm) - -

0,015ppm

-

> 0,99 0,05 -

0,4ppm


- - - Nguyen y col.

(2008) Rábano

87%±5% (0,03ppm) 90%±5% (0,09ppm) 107%±6% (0,18ppm)

- -

0.02ppm

-

0,9913 0,03-0,36ppm



y frutilla

94% (0,01ppm) 106% (0,1ppm)

88% (1ppm)

13% (0,01ppm) 9% (0,1ppm) 4% (1ppm)

- 0,01ppm - >0,98 0,01-1ppm

Pang y col. (2006) Tejido animal 75% (0,025ppm) 82% (0,05ppm) 75% (0,25ppm)

16% (0,025ppm) 12% (0,05ppm) 11% (0,25ppm)

- 25ppb 12,5ppb �0,98 0,2-

4800ppb


Jugo de uva 109% (n=5) 15.1% (n=5) - 13ppb 7ppb >0,997 0,01-1ppm

160






Vino blanco 100% 5,2% 9,9% 2ppb 0,9ppb 0,995 2,5-35ppb

Rial Otero y col. (2003) Uva 84% (n=7) 2% (n=7) 6% (n=6) 0,03ppm 0,02ppm 0,996

0,05-1,9ppm


Suelo - - - - - - -

Pulpa de tomate

77,1%±7,5% (0,002ppm)

88,4%±4,7% (0,02ppm) - - - -

Puré de pera 82,8%±7,8% (0,002ppm)

87,5%±4,2% (0,02ppm) - - - -


Jugo de limón concentrado

96,5%±10,2% (0,004ppm)

86,1%±9,3% (0,04ppm) - - - -

>0,998 0,002-

0,04ppm

Manzana

100%±7% (0,01ppm) 97%±3% (0,02ppm) 97%±5% (0,2ppm) 91%±5% (0,5ppm)

- - - -

Chaucha 98%±4% (0,02ppm) 82%±3% (0,2ppm) 91%±5% (0,5ppm)

- - - -


(2003)


- -

0,01ppm

- -

0,01-0,5ppm

Mosto 97,7% 4,8% (n=6) - 35µg/l 30,9µg/l 0,996 35-

20000µg/l Vaquero Fernández y col.

(2008) Vino 98,8% 5% (n=6) - 177,7µg/l 173,4µg/l 0,990 177,7-

20000µg/l

161





Walorczyk (2007) Trigo 121%±12% (0,02ppm) 113%±11% (0,05ppm)

- - 0,03ppm 0,009ppm >0,98 0,002-0,2ppm

Trigo

99%±17% (0,01ppm) 103%±4% (0,05ppm) 103%±2% (0,1ppm) 98%±6% (0,5ppm)

- -


deshidratado

111%±9% (0,01ppm) 102%±5% (0,1ppm) - -

< 0.01 ppm < 0.01ppm 0,999 0,005 - 0,5ppm


Abejas 92%±10% (10ppb) 87%±7% (50ppb) 95%±5% (500ppb)

10% (10ppb) 7% (50ppb)

5% (500ppb) - < 0.01 ppm < 0.01ppm 0,9996 4-500ppb


0,9997 0,005-0,2ppm


(2011)


- - 0,01ppm -

- -

Walorczyk (2012)

Frutas, vegetales y

malta de cebada

93,1%±9,5% (0,5ppm) 93,9%±8,4% (1ppm)

- - - - 0,9999 0,01-0,5ppm

Trigo sarraceno

97%±3% (0,01ppm) 89%±3% (0,05ppm) 96%±3% (0,25ppm) Walorczyk y

Drozdzysnki (2012)

Centeno 107%±7% (0,01ppm) 98%±3% (0,05ppm) 99%±1% (0,25ppm)

- - 0,01ppm - >0,99 0,005-0,5ppm

162

III. MATERIALES Y METODOS

III.1. Plan de muestreo

III.1.1. Muestreo de arándanos en campo

El plan de muestreo seleccionado fue empleado tanto para el estudio de la

micoflora contaminante de arándanos cultivados en el departamento Concordia

(31°23�32� Latitud Sur; 58°1�1� Longitud Oeste), Región de Salto Grande, provincia de

Entre Ríos, así como para los pesticidas aplicados. La localización geográfica del

departamento Concordia puede observarse en la figura III.1.

Figura III.1: Localización del departamento Concordia

Para que el proceso de recolección fuera representativo, los frutos fueron

extraídos de todas las zonas de la planta (parte superior, central e inferior) y de los

cuatro puntos cardinales (este, oeste, norte y sur). Con respecto al tamaño de la fruta a

muestrear, fue el promedio del lote, es decir, que si el lote tenía 50% de fruta pequeña y

50% de fruta mediana, la muestra se constituyó de igual forma.

Para el estudio de la micoflora contaminante de las bayas, se tomaron muestras

al azar de la variedad Misty de 42 lotes pertenecientes a diferentes campos, ubicados en

la ciudad de Concordia, durante la temporada 2009-2010.

163

En la cosecha siguiente, 2010-2011, se recolectaron bayas de las variedades

Misty, Emerald y Jewel, provenientes de 10 lotes de cada una de las plantaciones

comerciales. El muestreo fue al azar, con un tamaño de muestra no inferior a 1 kg.

Los lotes muestreados para el estudio de la cinética de degradación de los

pesticidas contaban en general de 20 a 25 líneos de plantas por 15 a 20 arbustos por

líneo. Estos se encontraban separados del resto, sin aplicaciones previas de dichos

compuestos. Para cada grupo de pesticidas se utilizó un lote separado. Debido a que se

preveía una gran variabilidad en la fruta de los distintos lotes, ya que el crecimiento y la

maduración de las mismas no son parejos, se estableció un tamaño muestreal de 420

bayas (14 arándanos por planta; 30 plantas por lote).

La recolección se realizó sin tomar muestras de las hileras exteriores del lote, ya

que estas plantas están sujetas a un mayor estrés y sus frutos presentarían diferentes

características, por ejemplo mayor grado de madurez y mayor probabilidad de

contaminación por deriva de lotes vecinos. En la figura III.2. se observa un ejemplo de

un lote constituido por 23 líneos de 15 arbustos cada uno y los lugares o puntos de

muestreo. La metodología seguida para seleccionar las plantas a muestrear

pertenecientes a cada lote se observa en la misma, y se realizó en zig – zag cada 4 líneos

y 3 arbustos.

Cortina de pinos

Plantas de arándanos

Plantas de arándanos muestreadas

�

�

��

Cortina de pinos



Cortina de pinos



�

�

��

�

�

��

Figura III.2: Esquema del muestreo de cada lote

164

Los arbustos seleccionados para los muestreos se señalizaron con una cinta color

rojo en la base de los mismos. En la figura III.3. se pueden observar las marcas de

identificación realizadas en las plantas de arándano que se eligieron para muestrear.

Figura III.3: Señalización de plantas de arándano seleccionadas para el muestreo

Una vez que la muestra fue extraída, se colocaron en recipientes estériles

correctamente rotulados, conformando una muestra única por lote y se conservaron en

heladera (marca: Whirlpool) a 4°C hasta el momento de su análisis, para el caso de flora

fúngica (tiempo máximo menor a 48 hs), y en freezer (marca: Gafa) a -18°C para los

estudios con fungicidas (los análisis se llevaron a cabo lo más rápido posible, con

demoras inferiores al mes).

III.1.2. Muestreo de arándanos envasados

Para determinar la ocurrencia de residuos de los fungicidas en estudio en frutas

envasadas listas para el consumo, se procedió al muestreo de “clamshells” de 125 g

provenientes de empaques de distintos días de producción y de supermercados de la

región. En este último caso, se consideró la Directiva de la Comunidad Económica

Europea (EC, 2002) para determinar el número de muestras y las mismas se tomaron al

azar. Como los arándanos sufren un proceso de clasificación en la línea de empaque

previo a su envasado, esta norma establece que una muestra es suficiente. El tamaño de

muestra para el caso de bayas es de 1 kg, por lo cual cada muestra estuvo constituida

por 8 “clamshells”. Se obtuvieron 30 muestras, las cuales fueron procesadas

inmediatamente después de su recolección para su posterior análisis.

165

III.1.3. Muestreo de productos elaborados con arándanos

Un estudio similar al anterior se realizó con productos elaborados a partir de

arándanos. En cinco supermercados de la región se adquirieron muestras de jugo de

arándanos; y en cinco farmacias, muestras de complejos vitamínicos con extracto de

arándano. Según la Comunidad Económica Europea (EC, 2002), en el caso de líquidos

envasados, se debe tomar una muestra de al menos 0,5 litros, o sea que cada muestra

estuvo constituida por una botella; y en el caso de productos de elevado valor unitario,

como son las vitaminas con extracto de arándano, la muestra debe ser de 100 g, por lo

cual cada muestra se constituyó por 5 cajas conteniendo 60 cápsulas.

III.2. Micoflora

III.2.1. Aislamiento de la micoflora contaminante

III.2.1.1. Equipos y medios de cultivo para el aislamiento

A continuación se detallan los medios de cultivo y equipos utilizados para el

aislamiento de la micoflora contaminante:

� Agar rosa bengala cloranfenicol: Biokar Diagnostic BK 151

Composición (g/l de agua destilada)

Digerido papaico de harina de soja 5,0

D (+) - glucosa 10,0

NaH2PO4 1,0

MgSO4 . 7H2O 0,5

Rosa de bengala 0,05

Cloranfenicol 0,1

Agar-agar 13,0

pH: 7,2 ± 0,2

� Agar papa glucosa (PDA): Biokar Diganostic BK 095


Infusión de papa (a partir de 200 g de papa) 4,0

D (+) - glucosa 20,0

Agar-agar 15,0

166

pH: 5,6 ± 0,1

� Estufas de cultivo: FAETA S.A. a 25°C ± 1ºC

� Flujo Laminar Horizontal: Helo HOLTEN Laminar-Air HH48

� Autoclave: Chamberland 75 litros

III.2.1.2. Procedimiento para el aislamiento de la micoflora contaminante

Los medios de cultivo utilizados se prepararon según las indicaciones del envase

en erlenmeyers de 250 ml para facilitar su manipulación. En el caso del PDA, se

distribuyó en tubos de ensayo previo al proceso de esterilización. La misma se realizó

en autoclave a 121ºC, durante 15 min.

Para las muestras provenientes de la cosecha 2009-2010, se tomó un arándano

por muestra, se cortó a lo largo del eje longitudinal con un bisturí previamente

esterilizado con alcohol y un mechero, y se colocaron ambas mitades en placas de Petri

con Agar Rosa Bengala Cloranfenicol esterilizadas. Este procedimiento se llevó a cabo

dentro de un flujo laminar por duplicado (Figura III.4).

Figura III.4: Flujo laminar

En el caso de los arándanos de la cosecha 2010-2011 el procedimiento fue

similar al anterior, con la diferencia de que se colocaron 8 mitades en cada placa por

quintuplicado. Las placas de Petri con los arándanos pueden apreciarse en la figura III.5.

Las placas fueron incubadas a 25ºC durante 5 días. Las colonias de los hongos

que se desarrollaron se repicaron en tubos con PDA en pico de flauta, para su posterior

identificación (aislamientos primarios). Se incubaron a 25ºC durante 5 días.

167

Figura III.5: Arándanos en agar rosa bengala cloranfenicol (cosecha 2010-2011)

III.2.2. Identificación de la micoflora contaminante

III.2.2.1. Equipos y medios para la identificación

A continuación se detallan los medios de cultivo y equipos utilizados en la

identificación de la micoflora contaminante:

� Agar Czapek-Dox (CDA): Merck art. 5460

Composición (g/l de agua destilada):

Sacarosa 30,0

NaNO3 3,0

KCl 0,5

FeSO4.7H2O 0,01

K2HPO4 1,0

Agar-agar 13,0

pH: 7,3 ± 0,1

168

� Agar hoja de clavel (CLA)


Agar-agar (Merck art.1613) 15,0

Hojas jóvenes de clavel, sanas y libres de pesticidas (Dianthus caryophyllus) en

fragmentos de 5 x 5 mm.

� Agar hoja de clavel con cloruro de potasio (CLA-KCl)


Agar-agar (Merck art.1.613) 15,0

KCl (Merck art. 4.936) 8,0

� Agar Czapek-extracto de levadura (CYA)


KH2PO4 (Merck art. 4873) 1,0

Concentrado de Czapek 1,0 ml

Extracto de levadura en polvo (Merck art. 3753) 5,0

Sacarosa (Merck art. 7651) 30,0

Agar-agar (Merck art. 1613) 20,0

� Concentrado de Czapek

Composición (g/100 ml de agua destilada):

NaNO3 (Merck art. 6537) 30,0

KCl (Merck art. 4936) 5,0

MgSO4.7H2O (Merck art. 5886) 5,0

FeSO4.7H2O (Merck art. 3965) 0,1

� Agar extracto de malta (MEA): Merck art. 5398


Extracto de malta 30,0

Peptona de harina de soja 3,0

Agar-Agar 15,0

pH: 5,6 ± 0,1

169

� Agar agua


Agar-agar (Merck art. 1613) 30,0 o 15,0

� Agar 25% glicerol-nitrato (G25N)


K2HPO4 (Merck art. 5104) 0,75

Concentrado de Czapek 7,5 ml

Extracto de levadura (Merck art. 3753) 3,7

Glicerol p.a. (Merck art. 4094) 250,0


� Medio semisólido (SM)



Tween 80 (Merck art. 822187) 0,5

� Estufas: Modelo FS900 a 25°C ± 1ºC

� Cabina de Seguridad Biológica: Clase II, con doble filtro HEPA, marca

Tecnoequipar (Argentina).

� Autoclave: Chamberland 75 litros

Todos los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121ºC por 15

min.

III.2.2.2. Procedimiento para la identificación de la micoflora contaminante

La identificación de los aislamientos primarios se realizó observando las

características macroscópicas de las colonias y microscópicas mediante la técnica de

microcultivo en cámara húmeda (Figura III.6 y III.7). El procedimiento fue el mismo

para todos los géneros. La técnica se describe a continuación:

1- En una caja de Petri se coloca un disco de papel de filtro, una varilla de vidrio en

forma de “U” o triángulo y un portaobjetos. Estos elementos se esterilizan en forma

conjunta en autoclave a 121ºC durante 15 min (Figura III.6, B).

170

2- En otra caja de Petri se plaquea agar Czapek Dox, previamente esterilizado,

formando una capa de 2 mm de espesor. Una vez solidificado se cortan con bisturí

estéril secciones de 1 cm2

de área (Figura III.6, A). Uno de estos cuadrados se

coloca en el centro del portaobjetos apoyado en la varilla de vidrio dentro de la caja

descripta en 1.

3- Con el ansa recta esterilizada con fuego, se inoculan los cuatro lados del cuadrado

de agar descripto en el punto 2, con el hongo proveniente del aislamiento primario.

Se cubre con un cubreobjetos que previamente se sumerge en alcohol y se flamea en

forma rápida para asegurar su esterilidad (Figura III.6, C). Se humedece el papel de

filtro con 2 ml de agua destilada estéril, para obtener una atmósfera húmeda

adecuada (Figura III.6, D). Todo el conjunto se incuba a 22ºC en estufa.

4- Las observaciones microscópicas se realizan a partir de las 48 hs (aumento 640 X ó

400 X).

Figura III.6. Esquema del microcultivo en cámara húmeda

Figura III.7. Microcultivo en cámara húmeda

171

El procedimiento es el mismo para todos los géneros pero con una excepción.

En el caso de las especies de Fusarium se utilizó Agar Clavel y Agar Clavel con KCl en

lugar de agar Czapek Dox, como se describe en III.2.2.3.

III.2.2.3. Identificación de los aislados de Fusarium

Para la identificación de los aislados del género Fusarium se siguió la

metodología propuesta por Nelson y col. (1983). Para ello a partir de aislamientos

primarios en PDA, incubados a 25ºC durante 7 días, se realizaron cultivos

monospóricos. Para esto se utilizaron placas de Agar agua al 1,5% con el agregado de

sulfato de estreptomicina (0,5 g/l). Sobre el medio se colocaron, con pipetas Pasteur, 6

gotas de agua destilada estéril, se disgregó el micelio en una de ellas y posteriormente se

homogeneizó la muestra. Luego de un período de incubación de 24 hs a 25ºC se

procedió a la obtención de conidios germinados mediante el uso de aguja histológica

bajo lupa (40X). Un conidio fue transferido a un tubo con PDA inclinado, para observar

características macroscópicas (coloración del micelio y del envés del cultivo) y otro

conidio fue inoculado en CLA para observar características microscópicas de los

conidios y conidióforos.

En el caso de aislados pertenecientes a la sección Liseola, un conidio se inoculó

en agar hoja de clavel con cloruro de potasio, para confirmar las características

microscópicas de los conidióforos.

III.2.2.3.1. Desarrollo de los aislados en medio Agar hoja de Clavel (CLA)

Las hojas de clavel se obtuvieron de plantas jóvenes libres de residuos de

pesticidas, las cuales se cortaron en trozos de aproximadamente 5 mm2. Luego se

procedió a la desinfección superficial de las hojas colocándolas en un recipiente estéril

con etanol al 70% durante un minuto, pasado ese tiempo se transfirieron a una solución

de hipoclorito de sodio al 5% por 1 min y finalmente se realizaron 3 lavados con agua

destilada estéril. Los trozos ya desinfectados se introdujeron en el agar agua y se

plaqueron las cajas de Petri para la posterior inoculación. Las mismas se dejaron durante

3 días a temperatura ambiente como control de esterilidad.

Como fuera descripto en III.2.2.2. se cortaron secciones del agar de 1 cm2

de área

conteniendo los trozos de hojas de clavel, se inocularon monospóricamente y se

incubaron durante 7 días a 25ºC con ciclos de luz blanca y luz UV de 12 hs cada uno.

Transcurrido el período de incubación, una vez colonizadas las hojas con el micelio, se

172

inspeccionaron las cámaras de microcultivos bajo microscopio diariamente para la

observación de las cadenas de microconidios, tipo de fiálides y presencia o ausencia de

clamidosporas (González y col., 1995).

III.2.2.3.2. Desarrollo de los aislados en Agar hoja de Clavel con cloruro de potasio

(CLA-KCl)

El procedimiento de preparación e inoculación del medio fue descripto en

III.2.2.3.1, pero utilizando como medio de cultivo agar KCl, cuya composición se

detalla en III.2.2.1.

III.2.2.4. Identificación de los aislados de Aspergillus y Penicillium

A partir de los aislamientos primarios en PDA incubados a 25ºC durante 7 días,

se realizó la identificación de las especies siguiendo los esquemas propuestos por

Ramírez (1982) y Pitt y Hocking (2009) para el género Penicillium, y por Klich (2002),

Samson y col. (2004) y Pitt y Hocking (2009) para el género Aspergillus.

De cada uno de las estrías desarrolladas se cosecharon los conidios,

suspendiéndolos en 5 ml de medio semisólido. Estas suspensiones fueron utilizadas para

inocular cajas de Petri que contenían los siguientes medios: MEA, G25N y CYA. Se

usaron un total de 7 cajas de Petri por cada 2 cepas, sobre la base del esquema

establecido en la tabla III.1:

Tabla III.1: Esquema de medios empleados para la identificación de Aspergillus y

Penicillium

MEDIOS TEMPERATURA DE INCUBACIÓN

25ºC

5ºC y 37ºC CYA

25ºC

25ºC MEA

25ºC

G25N 25ºC

Las placas se incubaron durante 7 días a las temperaturas indicadas en el

esquema. La identificación se realizó teniendo en cuenta las siguientes características:

173

• Crecimiento: se observó el tamaño de las colonias en el reverso de las placas

desarrolladas en los medios a 25ºC y 37ºC. A 5ºC se determinó la germinación

de las esporas a una magnificación de 200X.

• Caracteres de las colonias: se observó el color y textura de las colonias, por

observación directa o en lupa.

• Observación microscópica: se midió y determinó la forma de las fiálides y

conidios (González y col., 1995).

III.2.2.5. Identificación de aislados de otros géneros

A partir de los aislamientos primarios en PDA, se realizó la identificación

usando distintas metodologías de acuerdo al género en estudio.

a) Los géneros Dematiáceos como: Alternaria, Arthrinium, Cladosporium,

Curvularia y Epicoccum, fueron identificados según la metodología descripta

por Ellis (1971) y Pitt y Hocking (2009), resumida en III.2.2.2. y se confirmaron

las observaciones morfológicas de acuerdo con Simmons (2007).

b) Para el género Phoma y otros géneros, se utilizó la metodología propuesta por

Samson y col. (2004), y se confirmaron las observaciones microscópicas de

acuerdo con Von Arx (1981).

c) Para los aislamientos de los géneros de Mucorales (Rhizopus, Mucor) se realizó

la metodología propuesta por Samson y col. (2004).

III.3. Capacidad toxicogénica

III.3.1. Medios de cultivo, reactivos y equipamiento para la determinación de la

capacidad toxicogénica

III.3.1.1. Medios de cultivo para la determinación

A continuación se detallan los medios de cultivo utilizados en la determinación

de la capacidad toxicogénica:

� Agar papa glucosa (PDA): Biokar Diganostic BK 095


Infusión de papa (a partir de 200 g de papa) 4,0

174

D (+) – glucosa 20,0

Agar-agar 15,0

pH: 5,6 ± 0,1

� Agar extracto de malta (MEA): Difco 211220


Maltosa técnica 12,75

Dextrina 2,75

Glicerol 2,35

Peptona 0,78

Agar-agar 15,0

pH: 4,7 ± 0,2

� Agua peptona


Caseína – Carne de peptona 15,0

� Caldo para Ocratoxina (Magnoli y col., 2003, 2007)

Composición (g/l de agua peptona)

Extracto de levadura (Biokar Diagnostics A1202) 2,0

Sacarosa (Merck art. 7651) 15,0

� Medio de arroz

Arroz 25,0 g

Agua destilada 50 ml

Agua peptona 10 ml

Todos los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121ºC por 15

min.

III.3.1.2. Reactivos, columnas y estándares para la determinación

A continuación se detallan los reactivos, columnas de clean up y estándares

utilizados en la determinación de micotoxinas:

175

� AcN, Metanol y tolueno: Grado HPLC (Sintorgan)

� Agua bidestilada: milli-Q (Waters).

� EAc: p.a. (Merck)

� Hexano: Grado HPLC (J-T Baker)

� Buffer fosfato salino (PBS) – pH 7,4

Fosfato monoácido de sodio (Merck Química Argentina) 0,26 g

Fosfato diácido de sodio (Merck Química Argentina) 1,14 g

Cloruro de sodio (Merck Química Argentina) 7,02 g

Cloruro de potasio (Merck Química Argentina) 0,20 g

Azida de sodio (J-T Baker) 0,50 g

Agua bidestilada 1,00 l

� NaHCO3: p.a. (J-T Baker)

� NaH2PO4: p.a. (Merck)

� NaOH: p.a. (Merck)

� Tetraborato de sodio: p.a. (Merck)

� Ácido acético y ácido fosfórico: p.a. (Merck)

� Ácido heptafluorobutirico (HFBA): p.a. (Sigma-Aldrich)

� Anhidrido trifluoroacético: p.a. (Tedia Company)

� 4-(N,N-Dimetilamina) piridina (DMAP): p.a. (Sigma-Aldrich)

� 2-Mercaptoetanol: p.a. (Merck)

� Orto-ftaldialdehído: p.a. (Merck)

� Estándares de Aflatoxinas: (Sigma Chemical Company, art. 32754-32757)

� Estándares de Fumonisinas: (Biopure, art. S02003, S02004, S02007)

� Estándar de Ocratoxina A: (Sigma Chemical Company, art. 32937)

� Estándares de Tricotecenos: (Biopure, art. S02002)

� Estándar de Zearalenona: (Biopure, art. S02029)

� Columna de inmunoafinidad: OCHRAPREP® (R-Biopharm Rhone LTD)

� Columna de SPE: PuriTox TC-M 160 (Trilogy)

� Columna de SPE: PuriTox TC-M 220 (Trilogy)

� Columna SPE: Strata SAX (Phenomenex)

176

III.3.1.3. Equipamiento para la determinación

A continuación se detalla el equipamiento y accesorios más importantes

utilizado en la determinación de la capacidad toxicogénica (Tabla III.2):

Tabla III.2: Equipamiento y accesorios para la determinación de micotoxinas

Descripción Imagen

GC Agilent Technologies 7890A para la

determinación de toxina T-2, toxina HT-2, DON, 3-

A-DON, 15-A-DON, FUS X, NIV. Consta de un

Autosampler (Hewlett Packard serie 7693) con

capacidad para 100 viales, sistema de inyección

capilar split/splitless, equipado con un inyector

automático (Agilent Technologies serie 7693B),

sistema de análisis de datos Enhanced

ChemStation, un detector de microcaptura de

electrones (µECD).

Columna analítica Narrowbore HP-5 de 30 m de

longitud, 0,32 mm de diámetro interno y 0,25 µm

de espesor de fase estacionaria (Agilent

Technology).

HPLC Agilent 1100 series equipado con un

desgasificador (G1322A), un muestreador

automático (G1313A), un detector de fluorescencia

(G1321A), una bomba cuaternaria (G1311 A), y un

controlador de temperatura (G1316A), sistema de

análisis de datos ChemStation.

Columna analítica C18 Microsorb-MV100, Varian,

de fase reversa (150 mm x 4,6 mm x 15 µm) para

aflatoxinas; Thermo-hypersil BDS C18 (250 mm x

4,6 mm x 5 µm) para ZEA; C18 (150 mm x 4,6 mm

x 5 µm) para fumonisinas; y Hypersil BDS C18

(125 mm x 4 mm x 5 µm) para OTA.

177

Blender marca Osterizer

Centrífuga velócidad máxima 4000 rpm (ROLCO

modelo CM2036)

Vacuum Maninfold marca Baker, bomba de vacío

regulable, con capacidad para 24 columnas o

cartuchos. Cartuchos de 6 y 25 ml, provistos de

filtros de teflón (Fritz) de 0,45 µm.

Baño termostático seco marca Pierce, con corriente

de N2

Baño termostático marca Vicking modelo Masson

II

� Estufas: Modelo FS900 a 25°C ± 1ºC.

� Cabina de Seguridad Biológica: Clase II, con doble filtro HEPA, marca

Tecnoequipar (Argentina).

III.3.2. Procedimiento para la determinación de capacidad toxicogénica

Se procedió a inocular las cepas de los hongos previamente aislados, que podrían

tener capacidad toxicogénica en diferentes sustratos, bajo condiciones adecuadas para la

acumulación de las micotoxinas de los géneros Aspergillus y Fusarium. Dichos hongos

fueron: Asperigllus flavus, Aspergillus niger, Fusarium graminearum, Fusarium

semitectum y Fusarium verticillioides.

Las distintas cepas de Aspergillus fueron sembradas, mediante un pinchazo en el

centro de una placa de Petri, en agar extracto de malta (MEA); mientras que las cepas

correspondientes a Fusarium, fueron sembradas en agar papa glucosa (PDA). Todas las

placas de Petri se incubaron en estufa a 22°C durante 7 días.

178

Una vez concluida la semana de incubación, se cortó un cuadrado de agar de 1

cm x 1 cm del centro de la placa de Petri, conteniendo el hongo desarrollado, y se lo

colocó en un erlenmeyer de 250 ml conteniendo medio de arroz, en el cual previamente

se agregaron 10 ml de agua de peptona. Se agitó bien, permitiendo que el hongo quede

en el centro del erlenmeyer con arroz, y luego se incubó a 25°C en estufa durante 4

semanas.

Este medio de cultivo de arroz es adecuado para evaluar la generación de

fumonisinas para A. niger y F. verticillioides, de tricotecenos y zearalenona para F.

graminearum, de zearalenona para F. semitectum, y de aflatoxinas para A. flavus.

Por otro lado, A. niger tiene capacidad de producir ocratoxina A. Para la

determinación de la capacidad de generación de esta toxina se procedió a sembrar el

hongo mediante tres repiques en tubos con pico de flauta conteniendo agar MEA. Uno

de los repiques se llevó a cabo en el fondo del tubo, otro en el centro, y el último en la

parte superior del mismo. Estos tubos se incubaron a 22°C durante una semana.

Transcurrido este período, se agregó a los tubos 10 ml de agua de peptona y se agito en

vórtex durante 1 minuto para lograr la suspensión de las esporas del hongo. Luego se

vertió el contenido del tubo en un erlenmeyer conteniendo caldo para OTA,

previamente esterilizado. Se incubó en estufa a 25°C durante 4 semanas.

Transcurridos los períodos de incubación, los erlenmeyers se colocaron en una

cámara frigorífica hasta el momento de su análisis, y las toxinas acumuladas fueron

determinadas por cromatografía líquida o gaseosa según correspondía.

Las metodologías aplicadas fueron validadas previamente en la Fundación de

Investigaciones Científicas Teresa Benedicta de la Cruz, y los análisis se realizaron con

la colaboración del personal capacitado en dichas técnicas. Por este motivo, a

continuación se describen brevemente las metodologías aplicadas.

III.3.2.1. Determinación de aflatoxina y zearalenona

Para llevar a cabo la extracción de aflatoxinas y ZEA, a 25 g de muestra se le

adicionaron 105 ml de acetonitrilo, y se licuó durante 3 minutos. Se pasaron 5 ml del

sobrenadante a través de una columna de extracción PuriTox TC-M 160.

Posteriormente, se separó el filtrado en 3 fracciones, dos de 1 ml, equivalente a 0,2 g de

muestra, y una de 2 ml (0,4 g), y se evaporaron hasta sequedad en baño María a 60ºC

bajo vacío.

179

Para el análisis de aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2), se resuspendió el

extracto evaporado en 200 µl de hexano y luego se llevó a cabo una derivatización con

50 µl de anhídrido trifluoracético. Se agitó 30 s. Transcurridos 5 min, se neutralizó con

950 µl de AcN : agua (1:9, v/v), y se separó la fase acuosa.

Posteriormente la detección y cuantificación en el HPLC se realizó a una

longitud de onda de excitación de 360 nm y 440 nm de emisión. La fase móvil utilizada

fue agua : AcN : metanol (70:15:15, v/v/v), con una temperatura de trabajo de 23°C,

una velocidad de flujo 1 ml/min, y un volumen de inyección de 100 µl.

En esta metodología, los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ)

fueron 0,2 µg/kg y 0,3 µg/kg para AFB1 y AFG1; y 0,3 µg/kg y 0,5 µg/kg para AFB2 y

AFG2, respectivamente, aplicando el método oficial 990.33 (AOAC, 2012).

Para el análisis de zearalenona se procedió a resuspender el extracto obtenido

por evaporación, en 1ml de metanol : agua (7:3, v/v). Posteriormente la detección y

cuantificación en el HPLC se realizó a una longitud de onda de excitación de 236 nm y

460 nm de emisión. La fase móvil utilizada fue agua : AcN : metanol (50:27:23, v/v/v),

con una temperatura de trabajo de 23°C, una velocidad de flujo 1 ml/min, y un volumen

de inyección de 25 µl.


para ZEA, fueron de 5 y 10 µg/kg, respectivamente, aplicando el método oficial 985.18

(AOAC, 2012).

III.3.2.2. Determinación de fumonisinas

Se utilizó esta metodología analítica para la determinación de fumonisinas FB1,

FB2 y FB3. A 25 g de muestra se le adicionaron 60 ml de metanol y 20 ml de metanol :

agua (3:1, v/v), y luego se licuó durante 2 min. Se filtró a través de papel Whatman N°4,

ajustó el pH a 6 con NaOH 1 M, y se centrifugó durante 10 min a 2000 rpm.

Para la etapa de clean up se utilizaron columnas de extracción en fase sólida

conteniendo amina cuaternaria (Strata SAX), las cuales fueron activadas con 5 ml de

metanol y 5 ml de mezcla metanol : agua (3:1, v/v). Posteriormente, se pasaron 20 ml de

filtrado a través de la columna. El lavado se realizó con 5 ml de metanol : agua (3:1,

v/v) y 5 ml de metanol. Luego se eluyó con 10 ml de ácido acético : metanol (1:99, v/v)

180

a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se evaporó hasta sequedad a 60°C con corriente

de nitrógeno. El residuo se redisolvió con 2 ml de ácido acético : metanol (1:99, v/v).

Finalmente, se separaron 2 alícuotas de 800 µl en 2 tubos (A y B) y evaporaron a

sequedad a 60°C utilizando corriente de nitrógeno. Se resuspendieron en 1 ml de AcN :

agua (1:1, v/v).

La detección y cuantificación de las fumonisinas en el HPLC se realizó,

después de una derivatización pre columna con orto-ftaldialdehído y 2-mercaptoetanol,

a una longitud de onda de excitación de 335 nm y 440 nm de emisión. La fase móvil

utilizada fue metanol : NaH2PO4 0,1 M (77:23, v/v) pH = 3,3 (ácido ortofosfórico), con

una temperatura de trabajo de 30°C, una velocidad de flujo 1 ml/min, y un volumen de

inyección de 10 µl.


para FB1, fueron de 10 y 18 µg/kg, respectivamente, para FB2, fueron de 6 y 30 µg/kg,

respectivamente, y para FB3 fueron de 12 y 30 µg/kg, respectivamente, según el método

oficial 995.15 (AOAC, 2012).

III.3.2.3. Determinación de ocratoxina A

Para la determinación de OTA, todo el volumen de la muestra se mezcló durante

2 minutos y luego se centrifugó a 2000 rpm por 10 min. Se realizó la separación de la

fase sólida, y a 20 g de la misma se le adicionaron 48 ml de AcN y 32 ml del

sobrenadante. Se licuó durante 2 minutos y filtró. Posteriormente, una alícuota de 4 ml

del filtrado se recolectó y se le adicionaron 44 ml de buffer fosfato (PBS) con pH 7,4.

Se centrifugó 10 min a 2000 rpm.

Para la etapa de clean up, se hizo pasar el líquido por una columna de

inmunoafinidad (Ochraprep) a una velocidad de flujo de 2-3 ml/min. La columna se

lavó previamente con 20 ml de PBS de pH 7,4, a una velocidad de flujo de 5 ml/min.

Finalmente, la OTA se eluyó con 1,5 ml de mezcla de ácido acético : metanol (2:98,

v/v) por gravedad, colectando en un tubo de ensayo.

Se realizaron 3 lavados a contracorriente (backflushing) y luego se evaporó a

sequedad a una temperatura inferior a 50°C. Posteriormente, se resuspendió en 250 µl

de fase móvil e inyectó en el HPLC.

La detección y cuantificación en el HPLC se realizó a una longitud de onda de

excitación de 333 nm y 460 nm de emisión. La fase móvil utilizada fue AcN : agua :

181

ácido acético (50:67:1, v/v/v), con una temperatura de trabajo de 40°C, una velocidad

de flujo 1 ml/min, y un volumen de inyección de 100 µl.


para OTA, fueron de 0,01 y 0,07 µg/kg, respectivamente (Pacin y col., 2008).

III.3.2.4. Determinación de tricotecenos

Para la determinación de tricotecenos, se tomaron 25 g de muestra y se le

adicionaron 105 ml de AcN. La mezcla se licuó durante 3 min. Se pasaron 8 ml del

sobrenadante a través de una columna de extracción PuriTox TC-M 220, extrayendo 2

alícuotas de 1 ml cada una (equivalente a 0,2 g de muestra). Se realizó la evaporación

hasta sequedad en baño María a 40°C con vacío. Al residuo seco se le adicionaron 200

µl de EAc : metanol (19:1, v/v), y se agitó en vórtex durante 15 s. Se tomaron 150 µl de

dicha solución y se trasvasaron a un tubo de derivatización. Se evaporó a sequedad con

una corriente suave de N2 (a T < 40°C).

Posteriormente, se agregaron al residuo seco 100 µl del solvente de

derivatización tolueno : AcN (80:20, v/v), el cual contiene 2 mg/ml del catalizador 4–

N,N–dimetilaminopiridina (DMAP). Se agitó con vórtex durante 15 s, y luego se le

agregaron 50 µl del derivatizante heptafluorobutiril anhídrido ácido, agitando

nuevamente en vórtex por 15 s. Los tubos fueron luego colocados en un baño de arena a

60° – 65°C durante 30 min. Transcurrido este tiempo, se agregan 1,2 ml de una solución

acuosa de NaHCO3 al 5% y 400 µl de tolueno. Se agitó en vórtex durante 30 s. Luego

de dejar enfriar a temperatura ambiente, se centrifugó a 2000 rpm durante 2 min. Se

tomó una alícuota de 300 µl de la fase orgánica, y se colocó en un inserto contenido en

un vial ámbar.

La temperatura del detector del GC se fijó en 300°C.

En esta metodología, los LOD y LOQ (µg/kg) son: 4 y 10 para DON; 2,4 y 6

para FUS X; 6,4 y 15,6 para NIV; 10 y 24 para toxina T-2; 2 y 5 para toxina HT-2; y

3,2 y 8 para 3-A-DON y 15-A-DON (Croteau y col., 1994).

III.4. Pesticidas

III.4.1. Reactivos, estándares y equipamiento para el análisis

182

A continuación se detallan los reactivos, estándares, el equipamiento y los

accesorios más importantes, utilizados para los análisis de fungicidas en arándanos y

productos elaborados a partir de ellos:

� Agua: Bidestilada obtenida a partir del sistema de purificación E-pure.

� NaOH: p. a. (Biopack)

� Metanol: Grado HPLC (Sintorgan)

� Estándar de Azoxystrobin: (Sigma-Aldrich, art. 31697)

� Estándar de Boscalid: (Sigma-Aldrich, art. 33875)

� Estándar de Cyprodinil: (Sigma-Aldrich, art. 34389)

� Estándar de Fludioxonil: (Sigma-Aldrich, art. 46102)

� Estándar de Pyraclostrobin: (Sigma-Aldrich, art. 33696)

En la tabla III.3 se detalla los equipos y accesorios más importantes utilizados en

la determinación de fungicidas en arándanos.

Tabla III.3: Equipamiento y accesorios para la determinación de fungicidas

Descripción Imagen

GC Agilent Technologies 6890N (Network GC System)

para la determinación de azoxystrobin, boscalid,

pyraclostrobin, cyprodinil y fludioxonil. Consta de un

Autosampler (Hewlett Packard serie 7683) con capacidad

para 100 viales, sistema de inyección capilar

split/splitless, equipado con un inyector automático

(Agilent Technologies serie 7683B), sistema de análisis

de datos Enhanced ChemStation, un detector de

microcaptura de electrones (µECD) y uno de Nitrógeno-

Fósforo (NPD).

Columna analítica Narrowbore HP-5MS de 30 m de

longitud, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 µm de

espesor de fase estacionaria (J&W Scientific). Liner de

900 µl – 78,5 x 6,5 mm, (para inyección directa y Liner

de 0,75 mm de diámetro interno (para SPME).

183

Vórtex (Fbr Decalab)

Centrífuga de 500 a 4000 rpm (GELEC modelo G-

142D). Capacidad para 6 tubos de 50 ml.

Balanza de 0,5 a 610 g (Mettler Toledo PB602, SNR

1113021081, TDNR 26523130)

Fibras de sílica fundida recubiertas: Polidimetilxilosano

(PDMS), Poliacrilato (PA) y Carbowax/Divinilbenceno

(CW/DVB); marca Supelco de 100, 85 y 65 µm

respectivamente.

Jeringas SPME marca Supelco, para introducir las

diferentes fibras de sílica recubiertas con los polímeros

específicos

Agitador magnético Mistral Large Magnestir II - Lab

Line Mod 1170-1, con sistema aislante, para mantener la

temperatura constante.

Vacuum Maninfold marca Alltech, bomba de vacío

regulable, con capacidad para 16 columnas o cartuchos.

Cartuchos de 6 y 25 ml, provistos de filtros de teflón

(Fritz) de 0,45 µm Alltech

184

E-pure: Barnstead/Thermolyne modelo 04642

Pipetas: Socorex Swiss de 10 – 100 µl (SN17112209) y

de 100 – 1000 µl (17072736).

III.4.2. Puesta a punto de la metodología

Para la selección del método más apropiado se tuvieron en cuenta las

propiedades físicas y químicas de cada analito, su concentración estimada en las

muestras, la naturaleza de la matriz, la forma en que el analito se presenta en la misma,

y la compatibilidad de los medios de solubilización y extracción con el sistema

cromatográfico.

Las variables extractivas analizadas para la puesta a punto de la metodología

incluyeron, en primer lugar, el modo de extracción por inmersión directa (ID) o por

espacio de cabeza (HS).

Definido el modo de extracción, se estudió el pH al cual se debieron ajustar las

soluciones para lograr la mayor extracción de los analitos provenientes de la matriz por

el solvente, el cual se varió entre 5 y 9. Además, se estudiaron 3 polímeros diferentes:

Polidimetilxilosano (PDMS) de 100 µm, Poliacrilato (PA) de 85 µm y

Carbowax/Divinilbenceno (CW/DVB) de 65 µm.

La velocidad de agitación para la extracción, se varió desde 0 hasta 200 rpm, el

tiempo de extracción de la fibra en la solución conteniendo los analitos en estudio, se

modificó entre 5 y 720 min.

El agregado de sal durante el proceso extractivo, mejora muchas veces la

extracción de los analitos (Chai y Tan, 2009; Fytianos y col., 2006; Tsoukali y col.,

2005), sin embargo, produce también un mayor deterioro de las fibras (Viñas y col.,

2009), por lo que no se incluyó en este estudio por el alto costo de las fibras.

Por otro lado, se optimizaron las condiciones cromatográficas. Para ello se

evaluaron diferentes temperaturas de desorción en el puerto de inyección entre 230 y

260°C; el tiempo de desorción necesario para lograr que no quede analito remanente en

185

la fibra, y se ajustaron las rampas de temperatura del horno para una correcta separación

de los analitos de interés.

III.4.3. Preparación de las muestras

El primer paso en la preparación de las muestras de arándanos fue dejar

descongelar las mismas. Posteriormente se procedió a la trituración de las bayas

empleando una procesadora manual Liliana AH708, como la que se observa en la figura

III.8.

Figura III.8: Procesadora manual.

Los métodos definitvos utilizados se describen en este punto, y en el capítulo de

Resultados y Discusión se describen las distintas etapas que llevaron a optar por estas

metodologías.

Se pesaron exactamente 5 g de muestra en tubos de centrífuga de 50 ml de

capacidad y se adicionaron 15 ml de agua bidestilada. Debido a que el pH normal de las

muestras es ácido, se realizó el ajuste de pH, dependiendo del analito en estudio, con

una solución de hidróxido de sodio. Los valores de pH fueron de 5 para pyraclostrobin,

y de 7 para el resto de los compuestos (boscalid, azoxystrobin, fludioxonil y cyprodinil).

Se agitó en vórtex durante 1 min para facilitar la extracción de los analitos por la fase

acuosa, y luego se centrifugaron los tubos durante 10 min a 3000 rpm.

Una vez finalizada la etapa de centrifugación, se procedió a filtrar a través de un

filtro de teflón (“Fritz”) de 0,45 �m en el “vacuum maninfold”.

Luego, se repitió el procedimiento de extracción, con la adición de 10 ml de

agua deionizada en el tubo de centrífuga que contenía los restos sólidos de la muestra,

se repitió la agitación en vórtex durante 1 minuto y se volvió a centrifugar en las

mismas condiciones antes mencionadas y se filtró. Se llevó a un volumen final de 25

186

ml. De esta manera se completó el proceso de extracción de los analitos provenientes de

la fruta.

Para el caso de los productos elaborados a partir de arándanos, el procedimiento

extractivo fue el mismo, con algunas diferencias en el caso del jugo y del complejo

vitamínico. Para el jugo se pesaron 3 g del mismo, pero las extracciones sucesivas se

realizaron con 25 y 20 ml de agua deionizada, respectivamente, llevando a un volumen

final de 50 ml. Con respecto al complejo vitamínico con extracto de arándanos, se

tomaron 0,4 g de la muestra global, y el resto del procedimiento fue el mismo que para

el caso de fruta fresca.

III.4.4. Metodología de extracción

El proceso extractivo se llevó a cabo por SPME utilizando una fibra de PDMS

de 100 µm para todos los analitos. Las soluciones preparadas se colocaron en viales de

8 ml junto con un imán. Cada vial se colocó sobre un agitador magnético con sistema

aislante para mantener la temperatura de la muestra. Se realizó la agitación a 150 rpm

para azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin, y a 200 rpm para el resto de los analitos.

En el portafibra que se encuentraba sobre el vial se introdujo la fibra de PDMS, se

expuso el polímero durante 15 min y luego se retrajo, quedando lista para introducirla

en el cromatógrafo gaseoso. La sala de trabajo estuvo climatizada, a 25±1°C.

III.4.5. Determinación cromatográfica

Las determinaciones cromatográficas de azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin

se llevaron a cabo utilizando un cromatógrafo gaseoso Agilent Technologies 6890N

equipado con un detector de micro captura de electrones (µECD), y cyprodinil y

fludixonil con un detector de nitrógeno – fósforo (NPD).

III.4.5.1. Determinación por µECD

La temperatura del inyector se programó en 240°C para el pyraclostrobin, y

250°C para los otros dos compuestos. El tiempo de desorción, necesario para asegurar

que todo el analito absorbido en la fibra sea desorbido en el puerto de inyección, fue de

6,5 min.

187

La temperatura del detector se fijó en 300°C. El flujo por columna fue de

1ml/min, y la rampa del horno se programó de la siguiente manera: 80°C durante 6 min,

luego la temperatura ascendió a 80°C/min hasta 280°C y se mantuvo 10 min.

III.4.5.2. Determinación por NPD

Con este detector se determinaron cyprodinil y fludioxonil, los cuales salieron

simultaneamente en la misma corrida. La temperatura del inyector se programó en

250°C. El tiempo de desorción, necesario para asegurar que todo el analito absorbido en

la fibra sea desorbido en el puerto de inyección, fue de 5 min.

La temperatura del detector se fijó en 300°C. El flujo por columna es de 1

ml/min. La rampa del horno se programó de la siguiente manera: 80°C durante 5,3 min,

luego la temperatura ascendió a 55°C/min hasta 260°C y se mantuvo 2 min, finalizando

con un incremento de 10°C/min hasta alcanzar una temperatura final de 280°C que se

mantuvo 4 min.

III.4.6. Diseño experimental para el estudio de cinéticas de degradación

Un estrecho vínculo con el sector productivo fue necesario para llevar a cabo

este estudio. Se realizó bajo condiciones controladas, en las cuales, lotes de arándanos

de las variedades Emerald y Jewel, que no habían sufrido previamente aplicaciones de

los fungicidas en estudio, fueron identificados y rodeados con cintas de señalización

para evitar aplicaciones accidentales.

Se coordinaron las dosis, concentraciones y momentos de aplicación junto con

los profesionales responsables de los campos, quienes realizaron las aplicaciones

utilizando una pulverizadora Stihl SR420 de 3,4 CV de potencia y 1060 m3/h de caudal,

como la que se observa en la figura III.9.

Figura III.9: Pulverizadora para aplicación de fungicidas em campo

Las aplicaciones se realizaron durante la etapa de cuaje de la fruta. Se

disolvieron 100 g de cada producto comercial en 100 litros de agua. Comercialmente se

188

conoce a los pesticidas usados como Bellis (25,2% Boscalid + 12,8% Pyraclostrobin),

Switch (25% Fludioxonil + 37,5% Cyprodinil), y Amistar (50% Azoxystrobin). La

dosis aplicada fue de 800 litros por hectárea.

El muestreo de las bayas se llevó a cabo de la manera descripta con anterioridad

para arándanos de variedades Emerald y Jewel (III.1.1), con el objeto de determinar la

degradación de los distintos fungicidas a través del tiempo. Para la toma de las muestras

se consideró como día 0 (D0) el correspondiente a la aplicación. La recolección se llevó

a cabo 12 hs después de la misma, para asegurar que la fruta se seque y no producir la

eliminación de los fungicidas por lavado de la superficie. De igual forma, se tuvo

cuidado de no ingresar a muestrear a la mañana temprano, ya que la superficie podía

estar mojada debido al rocío, ni después de un día lluvioso.

Los tiempos de muestreo posteriores se establecieron teniendo en cuenta los

tiempos de carencia (II.10.6.). Los mismos fueron: D1 – D3 – D4 – D6 – D10 – D15 – D20

(boscalid y pyraclostrobin); D10 – D16 – D21 – D27 – D31 – D36 – D41 – D48 – D57 – D66 –

D69 (azoxystrobin); D1 – D2 – D4 – D5 – D7 – D9 – D11 – D14 – D17 (cyprodinil y

fludioxonil); donde los subíndices indican los días transcurridos desde el momento de la

aplicación de los fungicidas en el campo.

III.4.7. Determinación del tamaño de los arándanos

Con el objetivo de relacionar el crecimiento de los arándanos con la degradación

de los fungicidas, se realizó la medición del diámetro ecuatorial de 100 arándanos por

cada muestra tomada para el estudio de la disipación. Se utilizó un calibre con precisión

de 0,02 mm (Figura III.10).

Figura III.10: Calibre para medir tamaño arándanos

III.4.8. Elaboración de jugo de arándano y comportamiento de los pesticidas en el

proceso.

La fabricación del jugo se llevó a cabo a escala de laboratorio. Para estudiar el

efecto que tiene el procesamiento de los arándanos para obtención de jugo, sobre el

189

contenido inicial de los fungicidas en estudio (azoxystrobin, boscalid, cyprodinil,

fludioxonil y pyraclostrobin), se obtuvieron del campo 5 kg de fruta madura.

Se adicionaron a 2 l de agua 4 g de los productos comerciales Bellis y Switch, y

1 g de Amistar, lo que equivale a 504 ppm de boscalid, 256 ppm de pyraclostrobin, 500

ppm de fludioxonil, 750 ppm de cyprodinil, y 250 ppm de azoxystrobin, teóricos. Dicha

preparación se colocó en un equipo de ultrasonido durante 1 min, asegurando la

completa disolución de los analitos. La fruta se sumergió en un recipiente conteniendo

esta solución de fungicidas, durante 30 s. Se utilizó un ventilador para secar la fruta.

Se tomó una alícuota de 100 g para determinar la concentración inicial de cada

fungicida en los arándanos.

El proceso de elaboración de jugo comenzó con una etapa de lavado / escaldado.

Se emplearon 2 l de agua a 85°C. La fruta fue sumergida durante 3 min y luego se dejó

escurrir. De esta etapa se tomaron muestras de la fruta escaldada y del agua de

escaldado (antes y después de la etapa).

La etapa siguiente consistió en la trituración de la muestra, empleando una

procesadora manual Liliana AH708, como la que se observa en la figura III.8.

Una vez que la fruta fue triturada, se procedió a prensar y filtrar la pulpa, a

través de una malla filtrante. Se procedió a recuperar la torta de filtrado y el jugo para su

posterior análisis, y para la determinación del rendimiento de extracción de jugo.

Se midió la densidad del jugo obtenido por picnometría (CODEX STAN 247,

2005).

III.5. Análisis estadístico

III.5.1. Expresión de los resultados y métodos estadísticos

III.5.1.1. Frecuencia de aislamiento y densidad relativa de géneros y especies

Las frecuencias de aislamiento (Fr) y las densidades relativas (DR) de géneros y

especies fueron calculadas de acuerdo a las siguientes ecuaciones (González y col.

2008):

100)((%) ×=N

nsFr 100)((%) ×=

Ni

niDR

190

Donde

=ns número de muestras contaminadas con hongos pertenecientes a un género o especie.

=N número total de muestras.

=ni número de aislamientos pertenecientes a un género o especie.

=Ni número total de aislamientos fúngicos.

III.5.1.2. Test Asintótico para igualdad de proporciones

Para la comparación de las densidades relativas de aislamiento entre las cosechas

2009-2010 y 2010-2011 de la variedad Misty, y entre los 3 cultivares de la cosecha 2010-

2011, se empleó un test asintótico para igualdad de proporciones (Devore, 1987), el cual se

define a continuación.

Sean p1 y p2 la proporción de individuos en las poblaciones 1 y 2, respectivamente,

que poseen una característica particular. Alternativamente, si se marca con S un individuo

que posee la característica de interés, p1 y p2 representan las probabilidades de hallar una

marca S al elegir aleatoriamente un individuo de las poblaciones 1 y 2, respectivamente.

Se supone la disponibilidad de una muestra de m individuos a partir de la primera

población y n de la segunda. Las variables X e Y representarán el número de individuos en

cada muestra poseyendo la característica de interés. Dado que el tamaño de las poblaciones

es mucho mayor que el tamaño de las muestras, la distribución de X puede ser considerada

como binomial, con parámetros m y p1, y similarmente Y es considerada como variable

binomial con parámetros n y p2. Suponiendo que las muestras sean independientes una de

otra, X e Y son variables aleatorias independientes.

El estimador natural para p1 - p2, la diferencia de proporciones en la población, es

la correspondiente diferencia entre las proporciones muestrales: X/m - Y/n.

Con 1p̂ = X/m y 2p̂ = Y/n, el estimador de p1 - p2 puede ser expresado como 1p̂ -

2p̂ .

Si X ~ Bin (m,p1) e Y ~ Bin (n,p2) con X e Y variables independientes, tenemos:

2121 )ˆˆ( ppppE −=−

Entonces 1p̂ - 2p̂ . es un estimador insesgado de p1 - p2 y

191

m

qp

m

qpppV 2211

21 )ˆˆ( +=− (donde ii pq −=1 )

Si m y n son grandes, 1p̂ y 2p̂ individualmente tienen distribución

aproximadamente normal, el estimador 1p̂ - 2p̂ tiene una distribución aproximadamente

normal y entonces:

m

qp

m

qp

ppppz

2211

2121 )(ˆˆ

+

−−−= (Ec. III.1)

tiene distribución aproximadamente normal estándar. Si la hipótesis H0 : p1 -p2 = 0 es

cierta, entonces

)11

(

0ˆˆ21

nmpq

ppz

+

−−= (Ec. III.2)

Bajo H0 : p1 = p2 = p, entonces si H0 es cierta, en vez de muestras separadas de

tamaño m y n de dos poblaciones diferentes (dos distribuciones binomiales diferentes), se

puede considerar que se tiene realmente una muestra de tamaño m + n de una población

con proporción p. Dado que el número total de individuos, en esta muestra combinada con

la característica de interés, es X + Y, el estimador de p es:

21ˆˆˆ p

mn

np

nm

m

nm

YXp

++

+=

+

+= (Ec. III.3),

El término del extremo derecho de la ecuación anterior muestra que p es realmente

un promedio ponderado de los estimadores 1p̂ y 2p̂

Si se toma la ecuación (Ec. III.3), con q̂ = 1 - p̂ , y sustituímos en (Ec. III.2) el

estadístico resultante tiene aproximadamente una distribución normal estándar. Por lo tanto

el estadístico del test es:

192

)11

(ˆˆ

ˆˆ21

nmqp

ppz

+

−=

Si la hipótesis alternativa es Ha : p1 - p2 ≠ 0, la región de rechazo para un test de

nivel aproximado α es:

2αzz ≥ o

2αzz −≤

Si la hipótesis alternativa es unilateral, Ha :p1 - p2 > 0 ó Ha : p1 - p2 < 0, las regiones

de rechazo son: z > z� y z < - z�, respectivamente, siendo zα el valor tal que 1 - Φ(zα) = α

(Φ: función de distribución normal estándar).

III.5.1.2.1. Definición de valor p

El valor p es el menor nivel de significación al cual la hipótesis nula es rechazada,

cuando se usa un procedimiento de testeo específico sobre un determinado conjunto de

datos. Una vez que el valor p ha sido determinado, la conclusión a cualquier nivel

particular de α resulta de comparar el valor p con α, de la siguiente forma:

a. valor p ≤ α � rechazamos H0 a nivel α.

b. valor p > α � no rechazamos H0 a nivel α.

Es costumbre llamar a los datos "significativos" cuando H0 es rechazado y "no

significativos" en caso contrario. El valor p es entonces el menor valor al cual los datos son

significativos (Devore, 1987).

Para los casos en que se comparó la densidad relativa de aislamiento, este Test se

aplicó mediante el paquete estadístico Statistix versión 7.0 (2.000).

III.5.1.3. Test exacto de Fisher

El análisis de las posibles diferencias en el comportamiento de las frecuencias de

aislamiento se realizó empleando el Test exacto de Fisher (Conover, 1980; Bradley;

1968). El mismo se define como un test para diferencias entre proporciones de dos

muestras independientes. Es similar al test Chi-cuadrado, pero está diseñado

193

específicamente para tablas de contingencia de 2 x 2 y calcula valores p exactos cuando

las muestras son pequeñas.

Este test se aplicó mediante el paquete estadístico Statistix versión 7.0 (2000).

III.5.1.4. Análisis unidimensional y regresión lineal

El análisis unidimensional y las regresiones lineales se llevaron a cabo mediante

el paquete estadístico Statgraphics Centurion XV.

El análisis unidimensional se efectuó para todas las concentraciones de

estándares y muestras adicionadas, para ayudar a juzgar si los datos recaían en una

distribución simétrica. De particular interés fue el estudio de los coeficientes de

asimetría y curtosis estandarizados. Los valores de estos estadísticos fuera del rango de -

2 a +2 indicarían alejamiento significativo de la normalidad, que invalidaría cualquier

test estadístico con respecto a la desviación normal.

El procedimiento para estimar la regresión lineal, está diseñado para construir un

modelo estadístico que describe el impacto de un solo factor cuantitativo X sobre una

variable dependiente Y.

El objetivo es obtener estimaciones de Y para distintos valores de X a partir de

una muestra de n pares de valores (x1, y1), . . . , (xn, yn).

Una medida de la dependencia lineal es el coeficiente de correlación lineal:

yx

i

n

i

i

ssn

yyxx

r)1(

))((_

1

_

−

−−

=�

=

Donde:

1

)( 2

1

_

2

−

−

=�

=

n

xx

s

n

i

i

x y 1

)( 2

1

_

2

−

−

=�

=

n

yy

s

n

i

i

y

Se realizó el ajuste con mínimos cuadrados. Se ejecutaron pruebas para

determinar la significancia estadística del modelo. El modelo ajustado fue utilizado para

las curvas de calibración de estándares, muestras adicionadas, y para las curvas de

degradación de los pesticidas, con límites de confianza y/o límites de predicción. Se

194

realizó el análisis de normalidad de los residuos para comprobar que se cumplían las

hipótesis del modelo.

Los parámetros estadísticos permitieron establecer la idoneidad del modelo

ajustado. Se determinó la independencia de los residuos a partir del estadístico de

Durbin Watson (p-valor).

Mediante el test de Kolmogorov (p-valor) se determinó si los residuos proceden

de una distribución normal para un nivel de confianza de al menos un 95%.

III.5.1.5. Comparación de líneas de regresión

Este procedimiento está diseñado para comparar las líneas de regresión que

relacionan Y y X a dos o más niveles de un factor categórico. Se ejecutaron pruebas

para determinar si hay diferencias significativas entre las intercepciones y las pendientes

en diferentes niveles de cada factor. Se llevó a cabo mediante el paquete estadístico

Statgraphics Centurion XV, para comprobar si había un efecto matriz en el análisis de

todos los pesticidas en arándanos respecto a los estándares, y para comparar la

degradación de fungicidas en dos variedades de arándano. Además, se graficaron las

líneas de regresión, y se corroboró que no había residuales inusuales.

195

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IV.1. Flora fúngica contaminante de los arándanos

IV.1.1. Géneros

Las cepas fúngicas de los arándanos de la cosecha 2009-2010 fueron 1180,

aisladas de la variedad Misty; y en el 2010-2011, 2705 cepas se recogieron de la

variedad Emerald, 4100 de la variedad Jewel, y 2865 de la variedad Misty.

En primer lugar se identificaron los géneros fúngicos a los cuales pertenecían

esas cepas y en la figura IV.1 se puede observar la distribución de géneros fúngicos

aislados de la variedad Misty correspondiente a la cosecha 2009-2010.

21%

5%

9%

5%19%

8%

6%5%

12%

4% 6%

Alternaria

Aureobasidium

Aspergillus

Cladosporium

Coletotrichum

Epicoccum

Fusarium

Phomopsis

Rhodotorula

Trichoderma

Otros

Figura IV.1: Distribución de géneros fúngicos aislados en arándanos variedad Misty

(cosecha 2009 – 2010)

Se puede apreciar que los géneros predominantes fueron Alternaria y

Coletotrichum en esta cosecha.

Cuando se observan, en la figura IV.2, los resultados de la misma variedad en la

cosecha siguiente (2010 – 2011), también hay un predominio de Alternaria pero mucho

más marcado. Además, parece ser que la cosecha 2009 – 2010 presentó mayor variedad

de géneros contaminantes.

196

51%9%

9%

13%

10%

8%

Alternaria

Aspergillus

Epicoccum

Rhodotorula

Trichoderma

Otros

Figura IV.2: Distribución de géneros fúngicos aislados en arándanos variedad Misty

(cosecha 2010 – 2011)

Mediante el test asintótico para igualdad de proporciones, se encontraron

diferencias altamente significativas (P < 0,01) cuando se compararon los valores de

RD entre las cosechas 2009 - 2010 y 2010 - 2011 de la variedad Misty para todos los

géneros identificados, a excepción de Aspergillus y Penicillium que no presentaron

diferencias significativas (Tabla IV.1).

En la tabla IV.1 también puede apreciarse la comparación entre los valores de Fr

para los distintos géneros, determinados empleando el test exacto de Fisher. Diferencias

altamente significativas (P < 0,01) se encontraron para el caso de Colletotrichum,

Nigrospora, Phomopsis y Rhizopus. Para los géneros Botrytis, Fusarium y Trichoderma

se encontraron diferencias significativas (P < 0,05).

Los géneros aislados en la cosecha 2010 - 2011 de las tres variedades de

arándanos, pueden verse en las figuras IV.2 a IV.4. En el mismo año de cosecha, se

observó un predominio de Alternaria en la variedad Misty; en la variedad Jewel la

distribución fue más pareja, con un ligero predominio de Rhodotorula, seguido por

Alternaria y Cladosporium; mientras que en las muestras provenientes del cultivo de la

variedad Emerald, el género mayoritario fue Alternaria.

197

Tabla IV.1: P-valor para la comparación entre géneros fúngicos contaminante de

arándanos cv. Misty cosechados durante 2009-2010 y 2010-2011 en Concordia, Entre

Ríos.

P-Valor Especies RD (comparación) Fr (comparación) Aureobasidium 0,0001 0,4815

Alternaria 0,0001 1,0000

Aspergillus 0,2225 0,4186

Botrytis 0,0001 0,0339

Cladosporium 0,0001 1,0000

Colletotrichum 0,0001 0,0001

Curvularia 0,0001 0,1488

Epiccocum 0,0001 0,0970

Fusarium 0,0001 0,0116

Nigrospora 0,0001 0,0010

Penicillium 0,9371 1,0000

Phomopsis 0,0001 0,0002

Rhizopus 0,0001 0,0054

Rhodotorula 0,0020 0,1897

Trichoderma 0,0001 0,0154

Fr: Frecuencia de aislación (%); RD: Densidad relativa (%)

P < 0,05: diferencias significativas

P < 0,01: diferencias altamente significativas

24%14%

39%

4%

19%

Alternaria

Cladosporium

Epicoccum

Rhodotorula

Otros

Figura IV.3: Distribución de géneros fúngicos aislados en arándanos variedad Jewel

(cosecha 2010 – 2011)

198

4%

8%

9%

17%

62%

Alternaria

Aspergillus

Epicoccum

Rhodotorula

Otros

Figura IV.4: Distribución de géneros fúngicos aislados en arándanos variedad

Emerald (cosecha 2010 – 2011)

En los gráficos anteriores sólo se representaron los géneros más importantes

encontrados, agrupándose en el rubro “otros”, los menos frecuentes. En la figura IV.5 se

mencionan estos últimos para las tres variedades.

Figura IV.5: RD(%) de géneros fúngicos de arándanos cosecha 2010-2011 con bajo

número de aislados. Referencia: 1.Aureobasidium; 2.Arthrinium; 3.Aspergillus;

4.Botritys; 5.Cladosporium; 6.Coletotrichum; 7.Curvularia; 8.Eurotium; 9.Fusarium;

10.Geotrichum; 11.Mucor; 12.Nigrospora; 13.Penicillium; 14.Phoma; 15.Phomopsis;

16.Rhizoctonia; 17.Rhizopus; 18.Sclerotinia; 19.Trichocladium; 20.Trichoderma.

199

En la figura IV.6 se observa la frecuencia de aislación de todos los géneros

identificados durante la cosecha 2010-2011.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Jew el

Emerald

Misty

Basándose en los valores de Fr, puede observarse que los géneros Alternaria,

Epiccocum, Rhodotorula y en último lugar Aspergillus, fueron aislados con alta

frecuencia en las 3 variedades de arándanos estudiadas.

Comparando los resultados obtenidos en la presente tesis, con aquellos

observados por otros autores, en Argentina y en otras zonas productoras, puede

concluirse que los géneros fúngicos identificados en los arándanos de la región,

descriptos previamente en la bibliografía, son: Alternaria (Cappellini y Ceponis, 1977;

Cappellini y col., 1983; Lambert, 1990; Tournas y Katsoudas, 2005), Aspergillus

(Cappellini y Ceponis, 1977; Lambert, 1990; Wright y col., 2008a; Rivera y col.,

2009), Botrytis (Smart, 1937); Cladosporium (Smart, 1937; Tournas y Katsoudas,

2005), Colletotrichum (Cappellini y col., 1972; Hartung y col., 1981; Daykin y

Milholland, 1984; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Wright y col., 1998, 2008a;

Rivera y col., 2009), Curvularia (Rivera y col., 2009), Epicoccum (Cappellini y col.,

1972), Fusarium (Cappellini y col., 1972; Tournas y Katsoudas, 2005; Wright y col.,

2008c; Rivera y col., 2009), Mucor (Lambert, 1990; Smith y col., 1996), Nigrospora

(Cappellini y col., 1972; Wright y col., 2008a), Penicillium (Smart, 1937; Cappellini y

Figura IV.6: Fr(%) de géneros fúngicos de arándanos cosecha 2010-2011.

Referencia: 1.Aureobasidium; 2.Alternaria; 3.Arthrinium; 4.Aspergillus; 5.Botritys;

6.Cladosporium; 7.Coletotrichum; 8.Curvularia; 9.Epiccocum; 10.Eurotium;

11.Fusarium; 12.Geotrichum; 13.Mucor; 14.Nigrospora; 15.Penicillium;

16.Phoma; 17.Phomopsis; 18.Rhizoctonia; 19.Rhizopus; 20.Rhodotorula;

21.Sclerotinia;22.Trichocladium; 23.Trichoderma.

200

col., 1972; Lambert, 1990; Tournas y Katsoudas, 2005; Wright y col., 2008a; Rivera y

col., 2009), Phoma (Cappellini y Ceponis, 1977; Rivera y col., 2009); Phomopsis

(Nicolini y col., 2008; Wright y col., 2008c; Rivera y col., 2009), Rhizopus (Smart,

1937; Cappellini y Ceponis, 1977; Smith y col., 1996), Rhizotocnia (Wright y col.,

2008a, c) y Trichoderma (Cappellini y col., 1972; Lambert, 1990; Tournas y Katsoudas,

2005; Nicolini y col., 2008; Wright y col., 2008a; Rivera y col., 2009).

En esta región productora se describen por primera vez cepas aisladas

pertenecientes a los géneros Arthrinium, Eurotium, Geotrichum, Trichocladium, y

levaduras pertenecientes al género Rhodotorula.

IV.1.2. Identificación de especies fúngicas

En los puntos III.2.2.2 a III.2.2.5 de Materiales y Métodos se describieron los

procedimientos llevados a cabo para la identificación de la micoflora. A continuación se

detallan los resultados obtenidos.

En las figuras IV.7 a IV.15 se observan placas de cultivo junto con

observaciones microscópicas de las diferentes especies fúngicas con posible capacidad

toxicogénica (Alternaria alternata, A. tenuissima, A. vaccinii, Aspergillus flavus, A.

niger, Fusarium graminearum, F. semitectum, F. verticillioides y Penicillium citrinum).

Figura IV.7: Cultivo de Alternaria alternata (MEA) y conidios en cadenas (CYA)

201

Figura IV.8: Cultivo de Alternaria tenuissima (MEA) y conidios en cadenas (CYA)

Figura IV.9: Cultivo de Alternaria vaccinii (MEA) y conidios en cadenas (CYA)

Figura IV.10: Cultivo de Aspergillus flavus (PDA) y microconidios (CYA)

202

Figura IV.11: Cultivo de Aspergillus niger (PDA) y microconidios (CYA)

Figura IV.12: Cultivo de Fusarium graminearum (PDA) y macroconidios (CLA)

Figura IV.13: Cultivo de Fusarium semitectum (PDA) y macroconidios (CLA)

203

Figura IV.14: Cultivo de Fusarium verticillioides (PDA), microconidios, fialides y

cadenas (CLA)

Figura IV.15: Cultivo de Penicillium citrinum (PDA) y microconidios (CYA)

En la figura IV.16 se observan placas de cultivo junto con observaciones

microscópicas de Botrytis cinerea. Este hongo no sólo produce podredumbre gris en los

frutos, sino que está relacionado con la disminución de la capacidad de Aspergillus

carbonareus de generar OTA, y el aumento en la capacidad de generación de patulina

por Penicillium expansum, al crecer juntos (Valero y col., 2008).

204

Figura IV.16: Cultivo de Botrytis cinerea (MEA) y microconidios (CYA)

En las figuras IV.17 a IV.25 se observan placas de cultivo junto con

observaciones microscópicas de Arthrinium phaeospermum, Cladosporium

cladosporioides, Curvularia lunata, Epicoccum nigrum, Eurotium chevalieri,

Geotrichum candidum, Mucor racemosus, Trichocladium spp. y Trichoderma

harzianum, respectivamente.

Figura IV.17: Cultivo de Arthrinium phaeospermum (MEA) y microconidios (CYA)

Figura IV.18: Cultivo de Cladosporium cladosporioides (MEA) y microconidios (CYA)

205

Figura IV.19: Cultivo de Curvularia lunata (MEA) y conidios (CYA)

Figura IV.20: Cultivo de Epicoccum nigrum (MEA) y conidios (CYA)

Figura IV.21: Cultivo de Eurotium chevalieri (MEA), conidióforo monoseriado con

fiálides y conidios. Cleistotecios con ascos y ascosporas (CYA)

206

Figura IV.22: Cultivo de Geotrichum candidum (MEA), Taloconidios y micelio (CYA)

Figura IV.23: Cultivo de Mucor racemosus (MEA), micelio, esporangióforos y

esporangiosporas (CYA)

Figura IV.24: Cultivo de Trichocladium spp. (MEA) y conidios (CYA)

207

Figura IV.25: Cultivo de Trichoderma harzianum (MEA) y microconidios (CYA)

En la figura IV.26 se observan placas de cultivo junto con observaciones

microscópicas de Colletotrichum gloeosporioides, hongo importante para arándanos

debido que produce antracnosis.

Figura IV.26: Cultivo de Colletotrichum gloeosporioides (MEA) y microconidios

(CYA)

En las figuras IV.27 y IV.28 se observan placas de cultivo junto con

observaciones microscópicas de Aureobasidium pullulans y Nigrospora sphaerica.

Figura IV.27: Cultivo de Aureobasidium pullulans (MEA) y microconidios (CYA)

208

Figura IV.28: Cultivo de Nigrospora sphaerica (MEA) y microconidios (CYA)

En la sección siguiente se analizan los resultados cuantitativos de las especies

identificadas.

IV.1.3. Frecuencia de aislación y densidad relativa de las especies aisladas

En la tabla IV.2 se detallan las frecuencias y densidades relativas de los hongos

aislados de los arándanos de la variedad Misty, durante la cosecha 2009-2010 en la

ciudad de Concordia, Entre Ríos.

Tabla IV.2: Frecuencia de aislación (Fr) y densidad relativa específica (RD) de la flora

fúngica contaminante de arándanos cv. Misty cosechados en Concordia, Entre Ríos, en

2009-2010.

Total de microorganismos aislados 1180 Especies Fr (%) RD (%)

Alternaria alternata 31 3,4

Alternaria tenuissima 100 18,2

Aspergillus niger 78,6 8,9

Aureobasidium pullulans 47,6 4,7

Cladosporium cladosporioides 42,9 5,1

Colletotrichum gloeosporioides 100 18,6

Curvularia lunata 33,3 3,4

Epiccocum nigrum 69 8,1

Fusarium graminearum 31 3,8

Fusarium semitectum 26,2 1,7

Nigrospora sphaerica 57,1 2,1

Penicillium citrinum 21,4 0,8

Phomopsis vaccinii 64,3 4,7

Rhodotorula spp. 83,3 12,3

Trichoderma harzianum 35,7 4,2

Fr: Frecuencia de aislación ; RD: densidad relativa

209

El análisis de los valores de RD, así como los de Fr, mostró que Colletotrichum

gloeosporioides, Alternaria tenuissima, Rhodotorula spp, Aspergillus niger, Epiccocum

nigrum y Phomopsis vaccinii fueron los hongos predominantes sobre los arándanos de

la variedad Misty contaminantes de dicha cosecha.

Los resultados de la flora fúngica contaminante de la variedad Misty del 2010 –

2011 se incluyen en la figura IV.29.

En la cosecha 2010 – 2011, Alternaria tenuissima predominó, pero el patrón de

contaminación pareció no ser similar. Para la comparación de la flora fúngica de ambas

cosechas, para la misma variedad, se empleó el test asintótico para igualdad de

proporciones. Se encontraron diferencias significativas (P < 0,05) cuando se

compararon los valores de RD entre las cosechas 2009 - 2010 y 2010 - 2011 de la

variedad Misty para el caso del Aspergillus niger (Tabla IV.3). Por otro lado,

diferencias altamente significativas (P < 0,01) se hallaron para el resto de los hongos, a

excepción de Fusarium semitectum y Penicillium citrinum. Aspergillus flavus, Botrytis

cinerea, Fusarium verticillioides y Rhizopus stolonifer no fueron aislados durante la

cosecha 2009 - 2010 en dicha variedad de arándanos, mientras que Nigrospora

sphaerica y Phomopsis vaccinii no fueron aisladas en 2010 - 2011.

Figura IV.29: Micoflora de arándanos cv. Misty cosecha 2010-2011. Referencia:

1.Aureobasidium pullulans; 2.Alternaria alternata; 3.Alternaria tenuissima;

4.Aspergillus flavus; 5.Aspergillus niger; 6.Botrytis cinerea; 7.Cladosporium

cladosporioides; 8.Coletotrichum gloeosporioides; 9.Curvularia lunata;

10.Epiccocum nigrum; 11.Fusarium graminearum; 12.Fusarium semitectum;

13.Fusarium verticillioides; 14.Penicillium citrinum; 15.Rhizopus stolonifer;

16.Rhodotorula; 17.Trichoderma harzianum.

210

En la tabla IV.3 puede apreciarse la comparación entre los valores de Fr para las

distintas especies, empleando el test exacto de Fisher. Diferencias altamente

significativas (P < 0,01) se encontraron para el caso de Alternaria alternata y

Colletotrichum gloeosporioides.

Tabla IV.3: Comparación entre micoflora contaminante de arándanos cv. Misty

cosechados durante 2009 - 2010 y 2010 - 2011 en Concordia, Entre Ríos.

P-Valor Especies RD (comparación) Fr (comparación) Alternaria alternata 0,0001 0,0001

Alternaria tenuissima 0,0001 1,0000

Aspergillus flavus 0,0001 0,001

Aspergillus niger 0,0295 0,4186

Aureobasidium pullulans 0,0001 0,4815

Botrytis cinerea 0,0002 0,0339

Cladosporium cladosporioides 0,0001 1,0000

Colletotrichum gloeosporioides 0,0001 0,0001

Curvularia lunata 0,0001 0,1316

Epiccocum nigrum 0,0001 0,0970

Fusarium graminearum 0,0001 0,2536

Fusarium semitectum 0,0994 0,4199

Fusarium verticillioides 0,0166 0,1923

Nigrospora sphaerica 0,0001 0,0010

Penicillium citrinum 0,8759 1,0000

Phomopsis vaccinii 0,0001 0,0002

Rhizopus stolonifer 0,0001 0,0054

Rhodotorula spp. 0,0019 0,1897

Trichoderma harzianum 0,0001 0,0154

Fr: Frecuencia de aislación (%); RD: Densidad relativa (%)



En la figura IV.30 se observa el promedio de las precipitaciones ocurridas en la

ciudad de Concordia, Entre Ríos, durante los períodos de cosecha de arándano. En la

temporada 2009 – 2010 hubo mayor cantidad de precipitaciones en todos los meses,

comparando con la correspondiente al año siguiente. Las diferencias en los niveles de

contaminación y especies encontradas entre ambas temporadas de cosecha, podrían ser

explicadas por estas condiciones meteorológicas, pero esto debe ser estudiado con

mayor profundidad durante sucesivas cosechas.

211

Figura IV.30: Precipitaciones ocurridas en Concordia, Entre Ríos, durante las

temporadas 2009 – 2010 y 2010 – 2011.

En las figuras IV.29, IV.31 y IV.32, se pueden apreciar las distintas especies

fúngicas aisladas en la ciudad de Concordia durante la cosecha 2010 - 2011, para las

variedades Misty, Jewel y Emerald, respectivamente.

Figura IV.31: Micoflora de arándanos cv. Jewel cosecha 2010-2011. Referencia:


4.Alternaria vaccinii; 5.Arthrinium phaeospermum; 6.Aspergillus flavus;

7.Aspergillus niger; 8.Botritys cinerea; 9.Cladosporium cladosporioides;

10.Coletotrichum gloeosporioides; 11.Curvularia lunata; 12.Epiccocum nigrum;

13.Eurotium chevalieri; 14.Fusarium graminearum; 15.Geotrichum candidum;

16.Nigrospora sphaerica; 17.Penicillium citrinum; 18.Phoma spp.; 19.Phomopsis

vaccinii; 20.Rhizoctonia solani; 21.Rhizopus stolonifer; 22.Rhodotorula;

23.Sclerotinia vaccinii; 24.Trichoderma harzianum.

212

En relación a las enfermedades fúngicas directamente relacionadas con la

calidad de las frutas, pudo apreciarse que en la variedad Jewel hubo elevada frecuencia

y densidad de aislación de Alternaria tenuissima y A. alternata, causantes de

podredumbres en la fruta. En la variedad Emerald si bien se observó el predominio de

estas especies, la fruta también tuvo elevada frecuencia de aislamientos de

Colletotrichum gloeosporioides, causante de antracnosis. Por último, arándanos de la

variedad Misty mostraron elevada frecuencia de contaminación por A. alternata y A.

tenuissima. Botrytis cinerea, causante de podredumbre gris en arándanos, presentó Fr

no superiores a 20% para Jewel y Misty, no siendo aislada en la variedad Emerald.

Sclerotinia vaccinii, causante de momificación de arándanos, presentó Fr inferiores al

10% para Jewel y Emerald, no habiendo sido aislado para Misty.

Basándose en los resultados de RD y de Fr, puede concluirse que Cladosporium

cladosporioides fue la principal especie fúngica aislada en la variedad Jewel, seguida

por Alternaria tenuissima, Alternaria alternata, Epiccocum nigrum y Aspergillus niger.

Figura IV.32: Micoflora de arándanos cv. Emerald cosecha 2010-2011. Referencia:


4.Alternaria vaccinii; 5.Aspergillus flavus; 6.Aspergillus niger; 7.Cladosporium

cladosporioides; 8.Coletotrichum gloeosporioides; 9.Curvularia lunata;

10.Epiccocum nigrum; 11.Eurotium chevalieri; 12.Fusarium graminearum;

13.Fusarium semitectum; 14.Geotrichum candidum; 15.Mucor racemosus;

16.Nigrospora sphaerica; 17. Penicillium citrinum; 18.Phomopsis vaccinii;

19.Rhizopus stolonifer; 20.Rhodotorula; 21.Sclerotinia vaccinii; 22.Trichocladium

spp.; 23. Trichoderma harzianum.

213

Otras especies aisladas con menor nivel de incidencia (2>RD%>0.6%) fueron

Arthrinium phaeospermum, Trichoderma harzianum, Rhizopus stolonifer, Botrytis

cinerea, Alternaria vaccinii y Aspergillus flavus.

Alternaria tenuissima fue la especie que prevaleció en la variedad Emerald,

seguida por Alternaria alternata, Epiccocum nigrum, Aspergillus niger, Trichoderma

harzianum, Cladosporium cladosporioides y Phomopsis vaccinii. Otras especies

aisladas con menor nivel de incidencia fueron Colletotrichum gloeosporioides,

Curvularia lunata, Fusarium graminearum y Sclerotinia vaccinii.

En la variedad Misty la especie predominante fue Alternaria tenuissima, a la

cual le siguieron Alternaria alternata, Epiccocum nigrum, Trichoderma harzianum,

Aspergillus niger, Aspergillus flavus y Cladosporium cladosporioides. Otras especies

aisladas con menor nivel de incidencia fueron Colletotrichum gloeosporioides,

Fusarium semitectum, Aureobasidium pullulans, Penicillium citrinum y Rhizopus

stolonifer. En todas las variedades de arándanos estudiados, la única especie de levadura

identificada fue Rhodothorula spp.

A continuación se detallan algunos hongos que fueron aislados por primera vez a

partir de arándanos en Argentina, pero que sin embargo, no fueron detectados en las

muestras de fruta de Concordia durante las cosechas evaluadas. Baino y col. (2007)

reportaron Dothichiza caroliniana como uno de los causantes de enfermedades foliares

que afectaron cultivares de Jewel, Emerald y O’Neal. En 1998, Dal Bello y Parelló

(1998), describieron por primera vez roya en las hojas de arándanos de la variedad

Bluegold causada por Pucciniastrum vaccinii. En el mismo año, Wright y col. (1998)

reportaron Pestalotiopsis guepini, en varios cultivares, como responsable de causar

podredumbres en las bayas. Hongn y col. (2007) aislaron Corynespora casiicola en

hojas de arándano. Sisterna y col. (2009) encontraron que la muerte de algunas plantas,

junto con afecciones de las yemas y ramas de las mismas, eran causadas por Bipolaris

cynodontis. Rivera y col. (2009) describieron a Nigrospora sacchari como responsable

de una enfermedad que afectaba los tallos de las plantas.

Pérez y col. (2007) evaluaron la ocurrencia de Fusarium solani, responsable de

podredumbres de raíz, en variedades Misty y Sharp Blue, en la misma región en la que

se llevó a cabo la presente tesis (Concordia, Entre Ríos). Sin embargo, si bien en el

presente estudio se trabajó también con variedad Misty, esta especie del género

214

Fusarium no fue aislada, ya que afecta a la raíz de la planta y probablemente no haya

ocurrido una contaminación de las bayas con dicho microorganismo.

Las especies fúngicas encontradas en este trabajo, que fueron descriptas con

anterioridad, son: Alternaria tenuissima (Cappellini y col., 1972; Smith y col., 1996;

Cline, 1997; Wright y col., 2004, 2008a, c; Luan y col., 2007; Rivera y col., 2009),

Aspergillus niger (Cappellini y col., 1972), Aureobasidium pullulans (Tournas y

Katsoudas, 2005), Botrytis cinerea (Cappellini y col., 1972; Cappellini y Ceponis, 1977;

Cappellini y col., 1983; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Smith, 1998; Tournas y

Katsoudas, 2005; Vásquez y col., 2007; Wright y col., 2008a, c; Rivera y col., 2009),

Colletotrichum gloeosporioides (Cappellini y col., 1972; Hartung y col., 1981; Daykin y

Milholland, 1984; Lambert, 1990; Smith y col., 1996; Wright y col., 1998, 2008a;

Rivera y col., 2009), Monilinia vaccinii-corymbosi (Cline, 1997; Lehman y Oudemans,

1997, 2000; Scherm y Copes, 1999; Copes y col., 2001; Cox y Scherm, 2001a, b, c;

Scherm y col., 2001, 2004; Ngugi y col., 2002a, b; Ngugi y Scherm, 2004; Penman y

Annis, 2005; Wharton y Schilder, 2005; Lehman y col., 2007; Tamowski y col., 2008),

Nigrospora sphaerica (Wright y col., 2008b); Phomopsis vaccinii (Smith y col., 1996;

Cline, 1997; Gabler y col., 2004), Rhizopus stolonifer (Cappellini y col., 1972; Rivera y

col., 2009) y Rhizoctonia solani (Rivera y col., 2009).

Realizando una búsqueda bibliográfica intensiva, se pudo determinar que no hay

antecedentes ni referencias en nuestro país sobre Alternaria alternata, Alternaria

vaccinii, Arthrinium phaeospermum, Aspergillus flavus, Cladosporium cladosporioides,

Curvularia lunata, Epicoccum nigrum, Eurotium chevalieri, Fusarium graminearum,

Fusarium semitectum, Fusarium verticillioides, Geotrichum candidum, Mucor

racemosus, Penicillium citrinum, Trichoderma harzianum y Trichocladium spp., como

contaminantes de arándanos.

IV.1.4. Hongos potencialmente productores de toxinas

Existe una gran variedad de hongos que pueden crecer naturalmente sobre los

arándanos, y que son potencialmente generadores de micotoxinas. Estos hechos pueden

deberse probablemente a la presencia de nutrientes disponibles para su crecimiento,

combinados con una actividad acuosa óptima y valores ácidos de pH que inhiben el

desarrollo bacteriano (Stinson y col., 1980; Almenar y col., 2007).

En la tabla IV.4 se observan los hongos que en bibliografía se mencionan como

productores de toxinas, aislados en las tres variedades de arándanos de la cosecha 2010

215

– 2011. En la cosecha 2009 – 2010 se aislaron menor cantidad de especies

toxicogénicas, pero las halladas están incluidas en el listado de hongos mencionado en

la tabla IV.4.

Tabla IV.4: Hongos micotoxigénicos aislados de arándanos en Concordia, Entre Ríos

en la cosecha 2010-2011

Jewel Emerald Misty Especies Fr (%) RD (%) Fr (%) RD (%) Fr (%) RD (%)

Alternaria alternata 100 8,2 100 13,5 100 15,2

Alternaria tenuissima 100 15,5 100 48,4 100 35,1

Alternaria vaccinii 20 0,7 10 0,2 nd nd

Aspergillus flavus 30 0,7 10 0,2 50 4

Aspergillus niger 40 2,1 50 3,9 60 6,1

Fusarium graminearum 10 0,1 20 0,7 10 0,2

Fusarium semitectum nd nd 20 0,6 10 1

Fusarium verticillioides nd nd nd nd 10 0,2

Penicillium citrinum 50 1 10 0,6 20 0,9

Fr: Frecuencia de aislación; RD: Densidad relativa; nd: No detectado

Para corroborar si las cepas toxigénicas presentaban diferencias entre las RD

obtenidas, se realizó un test asintótico para diferencias de densidades relativas y en la

tabla IV.5 se detallan los resultados.

Tabla IV.5: Comparación entre hongos micotoxigénicos contaminantes de las distintas

variedades de arándanos cosechados durante 2010-2011 en Concordia, Entre Ríos.

Emerald vs Misty Jewel vs Emerald Jewel vs Misty Especie P-valor

Alternaria alternata 0,4153 0,0029 0,0001

Alternaria tenuissima 0,0000 0,0000 0,0000

Alternaria vaccini 0,3233 0,1540 0,0250

Aspergillus flavus 0,0000 0,1540 0,0002

Aspergillus niger 0,0876 0,0661 0,0004

Fusarium graminearum 0,0455 0,1275 0,7966

Fusarium semitectum 0,1909 0,0837 0,0161

Fusarium verticillioides 0,2839 - 0,2839

Penicillium citrinum 0,4897 0,3852 0,8963



Diferencias altamente significativas (P < 0,01) entre los valores de RD fueron

encontradas entre las variedades Jewel y Misty para Alternaria alternata, Alternaria

tenuissima, Aspergillus flavus y Aspergillus niger; entre Jewel y Emerald para

Alternaria alternata y Alternaria tenuissima; y entre Emerald y Misty para Alternaria

216

tenuissima y Aspergillus flavus. Diferencias significativas (P < 0,05) entre los valores

de RD fueron encontradas entre las variedades Emerald y Misty para Fusarium

graminearum.

Respecto a Fr, sólo aquellas especies que no fueron detectadas en una de las

variedades presentaron diferencias significativas (Alternaria vaccinii, Fusarium

semitectum y F. verticillioides).

IV.2. Capacidad toxicogénica

Para decidir si es necesario realizar un seguimiento de las toxinas relacionadas

con la presencia en arándanos de estos hongos potencialmente productores, se debió

evaluar la capacidad toxicogénica.

Debido a que existen estudios sobre toxinas de Alternaria, como fue explicado

en el punto II.8, y que estas fueron productoras de toxinas de Alternaria, no se hizo la

evaluación sobre dichas toxinas, aunque se piensa seguir trabajando sobre el tema, pues

es la primera vez que se aisla Alternaria vaccinii, y no se ha probado aún su capacidad

de producción en Argentina. Greco y col. (2012) encontraron que de un total de 134

cepas aisladas de Alternaria a partir de arándanos argentinos, el 61% de las cepas eran

toxigénicas. El 97% de las mismas eran capaces de producir alternariol, el 95%

alternariol metileter, y el 65% ácido tenuazónico. Por lo tanto, es altamente probable la

contaminación de arándanos con toxinas de Alternaria.

A excepción de este trabajo, no se pudo encontrar otra bibliografía referida a

otras micotoxinas en arándanos en el país.

El Penicillium citrinum es probablemente productor de citrinina, como ya ha

sido demostrado en muchas cepas aisladas de maíz en el país (Boca y col., 2002), y

como internacionalmente casi no se encuentra legislada ni establecido un límite máximo

por las dificultades en su cuantificación, se prefirió trabajar sobre las cepas

probablemente toxicogénicas de los géneros Aspergillus y Fusarium, cuyas toxinas son

controladas regularmente en las exportaciones de varios productos vegetales.

El número de hongos potencialmente micotoxigénicos aislados a partir de las

distintas variedades de arándanos obtenidas durante ambas cosechas, se observan en la

tabla IV.6, donde se aprecia que fueron aisladas en total 287 cepas pertenecientes a

hongos de las especies Aspergillus flavus, A. niger, Fusarium graminearum, F.

semitectum y F. verticillioides.

217

Tabla IV.6: Total de hongos potencialmente micotoxigénicos aislados de diferentes

variedades de arándano durante las cosechas 2009 – 2010 y 2010 - 2011.

Número de hongos potencialmente micotoxigénicos aislados Variedad de

arándano Aspergillus

flavus

Aspergillus

niger

Fusarium

graminearum

Fusarium

semitectum

Fusarium

verticilloides

Misty 2009-2010 na 105 45 20 na

Emerald 2010-201 1 21 4 3 na

Jewel 2010-2011 5 15 1 na na

Misty 2010-2011 23 36 1 6 1

Total de cepas aisladas

29 177 51 29 1

na: no aislado

La mayoría de las placas de Petri que contenían los hongos presentaban más de

una cepa del mismo hongo, por lo cual, para la determinación de la capacidad

toxicogénica se decidió tomar al menos una cepa proveniente de cada muestra. Se

analizaron 8 cepas de Aspergillus flavus en busca de aflatoxinas; 19 cepas de A. niger

en busca de ocratoxina A y fumonisinas; 2 cepas de F. graminearum en busca de

zearalenona y tricotecenos; 1 cepas de F. verticillioides en busca de fumonisinas; y 2

cepas de F. semitectum en busca de zearalenona.

Las micotoxinas analizadas fueron aflatoxinas (B1, B2, G1 y G2); fumonisinas

(B1, B2 y B3); OTA; tricotecenos (DON, NIV, FUS X, toxina T-2, toxina HT-2, 3-A-

DON, y 15-A-DON); y ZEA. En las figuras IV.33 a IV.39 se observan los

cromatogramas de las distintas toxinas. Las curvas de calibración, en todos los casos,

presentaron R2 > 0,99.

Figura IV.33: Cromatograma de estándares de aflatoxinas. Masa inyectada 25 ng

218

Las cuatro aflatoxinas salen en una única corrida (Figura IV.33) por

cromatografía líquida con detector de fluorescencia, como fuera descripto en el punto

III.3.2.1, así como los tricotecenos mencionados anteriormente, los cuales fueron

analizados por cromatografía gaseosa con detector de µECD, como se indicó en el

punto III.3.2.4 (Figura IV.39). En este cromatograma se pueden observar los picos

correspondientes a los estándares internos deepoxi-deoxinivalenol (E-DON) y 2–

amino–5–cloro–benzofenona (ACBP), utilizados para la cuantificación.

Figura IV.34: Cromatograma de estándar de FB1. Masa inyectada 40 ng


219


Figura IV.37: Cromatograma de estándar de OTA. Masa inyectada 40 ng

Figura IV.38: Cromatograma de estándar de ZEA. Masa inyectada 6,28 ng

220

Figura IV.39: Cromatograma de estándares de tricotecenos. Masa inyectada 0,78 ng

221

Los resultados de las muestras positivas se pueden observar en las tablas IV.7 y

IV.8.

Tabla IV.7: Concentración de micotoxinas generadas por diferentes hongos del género

Aspergillus aislados a partir de arándanos (µg/kg)

Nº CIM Especie AFB1 AFB2 AFG1 FB1 FB2 FB3

30456 A. flavus 3932 164,6 118,8 - - -

31346 A. niger - - - 42255 nd nd

31363 A. niger - - - 6375 nd nd

31355 A. niger - - - 3188 nd nd

31364 A. niger - - - 310 nd nd

31360 A. niger - - - 545 nd nd

31365 A. niger - - - 9880 nd nd

31366 A. niger - - - 259 nd nd

31367 A. niger - - - 1807 nd nd

31347 A. niger - - - 182 nd nd

31356 A. niger - - - 595 nd nd

31345 A. niger - - - 1262 nd nd

31361 A. niger - - - 969 87 23

31362 A. niger - - - 826 nd nd

31369 A. niger - - - 105 nd nd

31371 A. niger - - - 1061 41 nd

CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas

nd: no detectado

Tabla IV.8: Concentración de micotoxinas generadas por diferentes hongos del género

Fusarium aislados a partir de arándanos (µg/kg)

Nº CIM Especie ZEA DON HT-2 T-2 FB1 FB2 FB3

30424 F. graminearum 1616,9 nd 141,6 172,8 - - -

30425 F. graminearum 138,32 5868 nd nd - - -

31339 F. verticillioides - - - - 1544 nd nd

CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas

nd: no detectado

El número de cepas productoras de micotoxinas cuyo resultado fue positivo, en

relación con el número total de cepas analizadas de cada hongo, puede apreciarse en las

tablas IV.9 para el género Aspergillus, y IV.10 para los hongos del género Fusarium.

222

Tabla IV.9: Número de hongos productores de micotoxinas positivas en relación con el

total de cepas aisladas correspondientes a cada hongo para el género Aspergillus

Micotoxina Aspergillus

flavus

Aspergillus

niger

OTA -- 0/19

FB1 -- 15/19

FB2 -- 2/19

FB3 -- 1/19

AFB1 1/8 --

AFB2 1/8 --

AFG1 1/8 --

AFG2 0/8 --

Tabla IV.10: Número de hongos productores de micotoxinas positivas en relación con el

total de cepas aisladas correspondientes a cada hongo para el género Fusarium

Micotoxina Fusarium

graminearum

Fusarium

semitectum

Fusarium

verticilloides

ZEA 2/2 0/2 --

FB1 -- -- 1/1

FB2 -- -- 0/1

FB3 -- -- 0/1

DON 1/2 na --

NIV 0/2 na --

HT-2 1/2 na --

T-2 1/2 na --

FUS X 0/2 na --

3-A-DON 0/2 na --

15-A-DON 0/2 na --

na: no analizado

De la tabla IV.9 se puede observar que de las 8 cepas de A. flavus analizadas,

sólo una resultó ser capaz de producir aflatoxinas AFB1, AFB2 y AFG1. El probable

quimiotipo, de esta cepa sería según Vaamonde y col. (2003), tipo II, o sea, que se

debería probar si produce ácido ciclopiazónico, ya que las cepas de este quimiotipo han

demostrado ser productoras de AFB, AFG y ácido ciclopiazónico. Otros autores

plantean otros quimiotipos, pudiendo ser VI o VII, dependiendo de la capacidad para la

generación de ácido ciclopiazónico (Razzaghi-Abyaneh y col., 2006; Giorni y col.,

2007; Sánchez-Hervás y col., 2008).

Respecto a la frecuencia de cepas toxicogénicas, Vaamonde y col. (2003),

mostraron que en maní el 93%, y en soja y trigo el 100% eran productoras. A pesar de

la baja frecuencia encontrada en este trabajo de tesis, la cepa presentó una alta

capacidad de producir las tres aflatoxinas, muy superior a la encontrada por Vaamonde

223

y col. (2003) y Astoreca y col. (2011), pero el tiempo de incubación fue mucho mayor

en este trabajo (4 semanas en comparación con 5 días).

De las 19 cepas estudiadas de Aspergillus niger, ninguna fue capaz de producir

ocratoxina A. La baja o nula capacidad de producción de cepas de A. niger también fue

reportada por Riba y col. (2008) en comparación con otras cepas de A. alliaceus, A.

carbonarius o A. ochraceus.

En el punto II.8.2.2 se describe la producción de fumonisinas por A. niger y en

particular Varga y col. (2010) establecieron que cepas de Aspergillus niger presentan la

capacidad de generar grandes cantidades de fumonisinas, por lo cual se decidió estudiar

la capacidad de producir estas toxinas por cepas de esta especie aisladas de arándanos.

De las 19 cepas de A. niger analizadas para la producción de fumonisinas FB1,

FB2 y FB3, 15 presentaron presencia de un compuesto con el mismo tiempo de retención

que FB1. A su vez, dos de las cepas fueron positivas para la fumonisina FB2, y una cepa

también mostró un pico con el tiempo de retención de la FB3. Estos resultados deberán

ser confirmados por otras técnicas ya que hay discusión sobre la producción de FB1 y

FB3 por Aspergillus niger (Nielssen y Logrieco, 2011; Varga y col., 2012). Además,

debería confirmarse si la fumonisina cuantificada como FB1 es esta toxina, FB6, o una

mezcla de estas dos toxinas (Mansson y col., 2010).

En la tabla IV.8 se puede observar que en el caso de las 2 cepas de F.

graminearum aisladas, ambas dieron resultado positivo para ZEA. Además, una de ellas

resultó ser productora de los tricótesenos HT-2 y T-2; mientras que la otra cepa fue

productora de DON. Ninguna de las cepas de F. graminearum aisladas durante las

cosechas 2009 y 2010 en arándanos, resultaron ser positivas en la producción de los

otros tricótesenos analizados (NIV, FUS X, 3-A-DON y 15-A-DON).

Se anlizaron 2 cepas de F. semitectum, de las cuales, ninguna fue capaz de

producir ZEA.

Una sola cepa de F. verticillioides fue aislada a partir de arándanos de la

variedad Misty durante la cosecha 2010. Esta cepa fue analizada en busca de

fumonisinas, resultando ser solamente productora de bajas cantidades de fumonisina

FB1.

224

IV.3. Pesticidas

IV.3.1. Validación de la metodología analítica

Se procedió a desarrollar y validar la metodología analítica para cuantificar los

fungicidas azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil y pyraclsotrobin, los cuales se

han seleccionado debido a su amplia utilización en los campos de arándanos de la

región de Concordia.

Por las estructuras moleculares de los fungicidas en estudio, se los dividió en dos

grupos, por un lado aquellos que contienen en sus moléculas halógenos como son

azoxystrobin, pyraclostrobin y boscalid, y pueden detectarse mediante un detector

µECD; y por otro, fludioxonil y cyprodinil que presentan nitrógeno en sus estructuras y

por ende pueden determinarse utilizando un detector NPD.

IV.3.1.1. Selección del polímero y pH de extracción

Para los analitos en estudio se evaluaron por triplicado distintos polímeros de

extracción caracterizados por presentar diferentes polaridades, a diferentes valores de

pH (5 – 7 - 9), teniendo en cuenta la resistencia de los mismos. La fibra con

recubrimiento polar fue Poliacrilato (PA), de polaridad intermedia

Carbowax/Divinilbenceno (CWX/DVB), y la apolar Polidimetilxilosano (PDMS),

cuyos espesores de 85, 65 y 100 µm respectivamente, son los más difundidos y los que

se seleccionaron en este trabajo.

IV.3.1.1.1. Azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin

Se preparó una solución mezcla de estándares de los 3 analitos de una

concentración de 0,025 ppm de cada uno. En las figuras IV.40, IV.41 y IV.42 y en las

tablas IV.11, IV.12 y IV.13, se aprecian los resultados obtenidos y su desviación

estándar (Desv. Est.).

Analizando la tabla y el gráfico correspondientes al azoxystrobin, puede

apreciarse que la fibra de PDMS permitió obtener una altura promedio de 182x106 a pH

5, en comparación con valores de 38x106 y 8x10

6 con CWX-DVB y PA,

respectivamente. A pH 7, los promedios ascendieron a 463x106, 100x10

6 y 9x10

6 para

las fibras de PDMS, CWX-DVB y PA, respectivamente. Un comportamiento similar se

pudo apreciar para las soluciones preparadas a pH 9, con promedios de 158x106, 29x10

6

y 8x106, respectivamente. En todos los casos, la fibra de PDMS presentó los resultados

225

más elevados, siendo la mayor extracción, es decir el óptimo de extracción, el obtenido

a pH 7 por esta fibra.

Realizando el mismo análisis para el caso del boscalid, la fibra PDMS permitió

obtener alturas promedio de 1447x106, 2119x10

6 y 1090x10

6; la fibra CWX-DVB de

402x106, 533x10

6 y 344x10

6; y la fibra de PA de 136x10

6, 179x10

6 y 128x10

6; para los

valores de pH 5, 7 y 9, respectivamente.

El polímero PDMS mostró ser el mejor para la realización de los ensayos,

cualquiera sea el valor de pH ensayado, tanto para azoxystrobin como para boscalid. En

ambos casos, el pH óptimo fue de 7 para las soluciones de estándares de dichos analitos.

El comportamiento del pyraclostrobin fue ligeramente distinto. Se apreciaron

valores promedios de respuesta cromatográfica de 49x106, 4x10

6 y 30x10

6 con PDMS;

41x106, 8x10

6 y 6x10

6 con CWX-DVB; y 6x10

6, 0,4x10

6 y 5x10

6 con PA, para los

valores de pH 5, 7 y 9, respectivamente. De estos resultados se observa que a diferencia

de los analitos anteriores, el pyraclostrobin a pH 7 tiene mejor respuesta con el polímero

de CWX-DVB. Sin embargo, la mejor respuesta se obtuvo con la fibra de PDMS pero

ajustando el pH de la solución a un valor de 5.

Figura IV.40: Azoxystrobin, selección del polímero de recubrimiento y del pH de

extracción para soluciones de estándar de 0,025 ppm.

226

Figura IV.41: Boscalid, selección del polímero de recubrimiento y del pH de


Figura IV.42: Pyraclostrobin, selección del polímero de recubrimiento y del pH de


En las tablas se redondearon los resultados, a números enteros, de promedios,

desviaciones estándar y desviaciones estándar relativas (RSD%).

227

Tabla IV.11: Respuestas cromatográficas del estándar de azoxystrobin con 3 fibras y 3 valores de pH.

Azoxystrobin pH 5 Azoxystrobin pH 7 Azoxystrobin pH 9 Fibra Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos

134555091 182401472 Promedio 432826182 463225193 Promedio 198981532 158890359 Promedio

185026313 46589449 Desv. Est. 473387788 26803831 Desv. Est. 149984178 36463173 Desv. Est. PDMS 227623011 26 RSD% 483461608 6 RSD% 127705367 23 RSD%


38091427 941770 Desv. Est. 81609164 46055097 Desv. Est. 27843866 4469825 Desv. Est. CWX-DVB

36542534 2 RSD% 66434920 46 RSD% 25052181 15 RSD%


8006841 74755 Desv. Est. 6929342 2577357 Desv. Est. 7613012 786684 Desv. Est. PA 8109632 1 RSD% 11853032 29 RSD% 8566311 9 RSD%

Tabla IV.12: Respuestas cromatográficas del estándar de boscalid con 3 fibras y 3 valores de pH.

Boscalid pH 5 Boscalid pH 7 Boscalid pH 9 Fibra

Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos 1437294689 1447559095 Promedio 2119112627 2117404219 Promedio 1159039139 1089985939 Promedio

1422256171 31706710 Desv. Est. 2115006126 2138361 Desv. Est. 1072951416 62307553 Desv. Est. PDMS 1483126424 2 RSD% 2118093903 0,1 RSD% 1037967261 6 RSD%


390460874 38401340 Desv. Est. 598537537 103338100 Desv. Est. 329268567 20233846 Desv. Est. CWX-DVB

444514168 10 RSD% 585666180 19 RSD% 336059779 6 RSD%


136892057 876338 Desv. Est. 174943046 12100243 Desv. Est. 123705785 4060037 Desv. Est. PA

135885331 1 RSD% 192680090 7 RSD% 128995166 3 RSD%

228

Tabla IV.13: Respuestas cromatográficas del estándar de pyraclostrobin con 3 fibras y 3 valores de pH.

Pyraclostrobin pH 5 Pyraclostrobin pH 7 Pyraclostrobin pH 9 Fibra

Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos 49277708 49026102 promedio 4151943 4138761 promedio 46958762 30334357 promedio

50135837 1254604 desv stand 3649584 482721 desv stand 24111746 14548008 desv stand PDMS 47664762 3 RSD% 4614755 12 RSD% 19932562 48 RSD%

39253971 40614273 promedio 9175772 8357435 promedio 8312346 5999109 promedio

40917419 1236911 desv stand 10242980 2401659 desv stand 5218196 2038248 desv stand CWX-DVB

41671428 3 RSD% 5653553 29 RSD% 4466785 34 RSD%

6275017 5869834 promedio 427491 408200 promedio 6030400 5512198 promedio

5457063 409030 desv stand 299096 100852 desv stand 4920761 558433 desv stand PA 5877422 7 RSD% 498014 25 RSD% 5585433 10 RSD%

229

En función de los resultados se decidió utilizar para azoxystrobin y boscalid

PDMS a pH 7; mientras que para pyraclostrobin el mismo polímero a pH 5.

Una vez alcanzados los resultados y establecido el mejor polímero para realizar

las extracciones, se procedió a repetir los ensayos pero en lugar de utilizar estándares, se

emplearon muestras adicionadas con los 3 analitos, a una concentración de 0,1 ppm de

cada uno. Esta prueba se realizó a efecto de comprobar que el pH seleccionado

anteriormente, no se veía afectado por los componentes de la matriz. En la figura IV.43

y en la tabla IV.14, se aprecian los resultados obtenidos para la matriz adicionada

empleando la fibra de PDMS.

El azoxystrobin tuvo una respuesta cromatográfica promedio de 95x106 a pH 7,

que superó los valores de 79x106 y 77x10

6 obtenidos a pH 5 y 9, respectivamente. En el

caso del boscalid, a pH 7 el resultado fue de 598x106, mientras que a valores de 5 y 9

fueron de 490x106 y 464x10

6, respectivamente. Por último, para el caso del

pyraclostrobin, a pH 5 los valores promedio de altura con la fibra de PDMS fueron de

aproximadamente 6,4x106, mientras que a pH 7 y 9 fueron de 5,4x10

6 y 3,5x10

6,

respectivamente.

Para los tres analitos, las diferencias encontradas en las respuestas permiten

alcanzar conclusiones similares a las obtenidas en el caso de soluciones de estándares,

es decir, que en el caso de muestras adicionadas, nuevamente se aprecia que pH 7 es

mejor para boscalid y azoxystrobin, y que pH 5 da resultados mayores para

pyraclostrobin. Por lo cual, estas fueron las combinaciones de polímero y pH

seleccionados para la extracción.

230

Figura IV.43: Selección del pH de extracción para arándano adicionado (0,1 ppm).

Tabla IV.14: Evaluación del efecto del pH en muestras de arándanos adicionadas (0,1 ppm) con azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin.

Pyraclostrobin Boscalid Azoxystrobin pH Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos


6264382 175140 Desv. Est. 511695711 32852109 Desv. Est. 85565225 7085452 Desv. Est. 5

6598032 3 RSD% 506768459 7 RSD% 81464427 9 RSD%



5585944 8 RSD% 550820618 7 RSD% 88870187 6 RSD%



4032207 12 RSD% 466264208 6 RSD% 80131854 9 RSD%

231

IV.3.1.1.2. Fludioxonil y cyprodinil

En primer lugar se preparó una solución mezcla de estándares de los dos analitos

de una concentración de 0,5 ppm. En las figuras IV.44 y IV.45, y en las tablas IV.15 y

IV.16, se aprecian los resultados obtenidos y su desviación estándar.

Figura IV.44: Cyprodinil, selección del polímero de recubrimiento y del pH de


Figura IV.45: Fludioxonil, selección del polímero de recubrimiento y del pH de


232

Tabla IV.15: Respuestas cromatográficas del estándar de fludioxonil con 3 fibras y 3 valores de pH.

Fludioxonil pH 5 Fludioxonil pH 7 Fludioxonil pH 9 Fibra




3710 158 Desv. Est. 6105 796 Desv. Est. 1831 130 Desv. Est. CWX-DVB 3918 4 RSD% 5229 15 RSD% 1905 7 RSD%



Tabla IV.16: Respuestas cromatográficas del estándar de cyprodinil con 3 fibras y 3 valores de pH.

Cyprodinil pH 5 Cyprodinil pH 7 Cyprodinil pH 9 Fibra




13662 506 Desv. Est. 21459 3076 Desv. Est. 5610 1097 Desv. Est. CWX-DVB 12985 4 RSD% 17853 17 RSD% 7551 16 RSD%



233

En las tablas y los gráficos se puede apreciar que para los dos analitos las

mejores respuestas cromatográficas se obtuvieron con la fibra de PDMS y un pH de 7.

El fludioxonil presentó alturas promedio superiores a 10000 con el polímero de

PA a pH 5 (15x103) y pH 7 (13 x10

3), y con la fibra de PDMS a pH 5 (12x10

3) y pH 7

(17x103). Se obtuvieron respuestas sin diferencias significativas a pH 7 con PDMS y a

pH 5 con PA, sin embargo, en el primer caso la dispersión de las respuestas fue menor,

con un valor de RSD% de 3%, en comparación con 8% para el segundo polímero, y los

valores de altura ligeramente mayores, razones por las cuales se optó por esta primera

opción. Realizando el mismo análisis para el caso del cyprodinil, la fibra PDMS

permitió obtener alturas promedio de 66x103, 101x10

3 y 62x10

3; la fibra CWX-DVB

de 13x103, 18x10

3 y 7x10

3; y la fibra de PA de 36x10

3, 56x10

3 y 20x10

3; para los

valores de pH 5, 7 y 9 respectivamente. El polímero PDMS mostró ser el mejor para la

realización de los ensayos, cualquiera sea el valor de pH ensayado para este analito.

En la figura IV.45 no se observan diferencias significativas entre PA a pH 5 y

PDMS a pH 7 para la extracción de fludioxonil. Se seleccionó el polímero PDMS y pH

7 debido a que coincide con los parámetros óptimos para cyprodinil (Figura IV.44), por

lo cual se puede emplear la misma técnica extractiva para la determinación simultánea

de ambos analitos.

Al igual que para los 3 analitos analizados en el punto anterior (IV.3.1.1.1), en

este caso también se procedió a realizar la comprobación del pH empleando muestras

adicionadas a una concentración de 0,5 ppm con la fibra de PDMS. En las figuras IV.46

y IV.47, y en la tabla IV.17, se aprecian los resultados obtenidos para matriz adicionada.

Figura IV.46: Selección del pH de extracción para arándano adicionado con

cyprodinil (0,5 ppm).

234

Figura IV.47: Selección del pH de extracción para arándano adicionado con

fludioxonil (0,5 ppm).

Tabla IV.17: Evaluación del efecto del pH en muestras de arándanos adicionadas

(0,5 ppm) con fludioxonil y cyprodinil.

Fludioxonil Cyprodinil pH

Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos

5 723874 702247 Promedio 3198772 3193475 Promedio 5 700310 20726 Desv. Est. 3367880 177112 Desv. Est.

5 682558 3 RSD% 3013774 6 RSD% 7 1037272 1030790 Promedio 4958214 4966587 Promedio 7 1024887 6213 Desv. Est. 5040116 69721 Desv. Est.

7 1030212 1 RSD% 4901431 1 RSD% 9 650327 631455 Promedio 2427881 2499558 Promedio 9 629175 17841 Desv. Est. 2571630 71875 Desv. Est.

9 614864 3 RSD% 2499163 3 RSD%

El fludioxonil tuvo una respuesta cromatográfica promedio de 1x106 a pH 7, que

superó los valores de 0,7x106 y 0,6x10

6 obtenidos a pH 5 y 9, respectivamente. En el

caso del cyprodinil, a pH 7 el resultado fue de 6x106, mientras que a valores de 5 y 9

fueron de 3,1x106 y 2,5x10

6, respectivamente.

En el caso de muestras adicionadas, nuevamente se aprecia que pH 7 arrojó los

mejores resultados.

Para cyprodinil y fludioxonil, de acuerdo a las respuestas cromatográficas de

soluciones de estándares y de muestras adicionadas, se eligió el polímero PDMS y pH 7

para la extracción.

235

IV.3.1.2. Velocidad de agitación

Se evaluaron diferentes velocidades de agitación desde 0 hasta 200 rpm,

utilizando el polímero y el pH determinado con anterioridad, para lograr la mayor

absorción de los analitos por parte del polímero.

IV.3.1.2.1. Azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin

Se prepararon soluciones de estándares de cada uno de los analitos a una

concentración de 0,025 ppm. En el Anexo (Tabla VII.1) se detallan los resultados para

las diferentes velocidades de agitación. En las figuras IV.48, IV.49 y IV.50, se observan

los resultados obtenidos para azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin empleando

diferentes velocidades de agitación.

Figura IV.48: Selección de velocidad de agitación para azoxystrobin (0,025 ppm)

Figura IV.49: Selección de velocidad de agitación para boscalid (0,025 ppm)

236

Figura IV.50: Selección de velocidad de agitación para pyraclostrobin (0,025 ppm)

En todos los casos, trabajar sin agitación produjo las respuestas cromatográficos

más bajas, con alturas promedio de 69x106, 347x10

6 y 2x10

6 para el azoxystrobin,

boscalid y pyraclostrobin, respectivamente.

Se observa que al incrementar la velocidad de agitación las respuestas

cromatográficas fueron cada vez mayores. Sin embargo, no hay diferencias

significativas entre el proceso de agitación a 150 y 200 rpm, siendo en el primer caso de

89x106, 624x10

6 y 5x10

6; y en el segundo, 95x10

6, 698x10

6 y 5,4x10

6, para

azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin, respectivamente. Para azoxystrobin la RSD%

fue del 6% para ambas velocidades. Pero, agitando a 150 rpm, los valores presentaron

menor dispersión, con RSD% de 1% en comparación de 7% agitando a 200 rpm, para

boscalid; y 1% a 150 rpm en comparación con 8% agitando a 200 rpm, para

pyraclostrobin. Por ello que se adoptó 150 rpm de velocidad de agitación para la

extracción de estos analitos.

IV.3.1.2.2. Fludioxonil y cyprodinil

Se prepararon soluciones de estándares de cada uno de los analitos pero a

diferencia del caso anterior, la concentración fue de 0,01 ppm.

En el Anexo (Tabla VII.2) se detallan los resultados para las diferentes

velocidades de agitación. En las figuras IV.51 y IV.52, se observan los resultados

obtenidos para cyprodinil y fludioxonil empleando diferentes velocidades de agitación.

237

Figura IV.51: Selección de velocidad de agitación para cyprodinil (0,01 ppm)

Figura IV.52: Selección de velocidad de agitación para fludioxonil (0,01 ppm)

Al igual que en el caso de los analitos analizados en el punto anterior, trabajar

sin agitación produjo las respuestas cromatográficos más bajas, con alturas promedio de

145x103 y 45x10

3 para el cyprodinil y fludioxonil, respectivamente.

El cyprodinil con agitación de 150 rpm permitió obtener respuestas promedio de

380x103, mientras que a 200 rpm el resultado fue de 759x10

3. El sistema de agitación

no permitía elevar más la velocidad ya que el imán a velocidades mayores a 200 rpm no

se mantenía en el fondo del vial. Esto no permite una buena agitación y además, puede

llegar a dañar el polímero mediante un golpe. Por estos motivos se resolvió trabajar a

200 rpm.

Para el fludioxonil, las respuestas cromatográficas fueron similares, con alturas

promedio de 158x103 y 156x10

3 para velocidades de 150rpm y 200rpm,

238

respectivamente. Sin embargo, el RSD% a mayor velocidad fue de 1% en comparación

con 5% a 150 rpm.

Finalmente se concluye que tanto para cyprodinil como para fludioxonil, los

mejores resultados se obtuvieron con agitación a 200 rpm.

IV.3.1.3. Modo de extracción

La selección del modo de extracción se efectuó considerando la matriz de la

muestra, volatilidad de los analitos y su afinidad por la matriz. La volatilidad de los

cinco pesticidas es baja y la utilización de una matriz acuosa definió, entre las dos

metodologías de extracción posibles, inmersión directa (ID) y espacio de cabeza (HS),

que el método más adecuado era el modo de extracción por inmersión directa. De

cualquier manera se realizaron algunos ensayos por HS para corroborar esta hipótesis,

pero los resultados fueron negativos para todos los analitos, por lo cual no se

incluyeron.

IV.3.1.4. Perfil de tiempos de extracción

Otra variable a ajustar al momento de realizar una extracción por SPME es el

tiempo que debe estar el polímero en contacto con la solución. Para determinar el

tiempo adecuado se procedió a estudiar las respuestas cromatográficas en función del

tiempo de extracción y comparar las respuestas a tiempos más cortos respecto al

necesario para alcanzar el equilibrio, obtenido del perfil de tiempos de extracción. El

tiempo de equilibrio entre el polímero y la solución que contiene los analitos se alcanza

en el momento en que no se observa variación de la concentración (medido a través de

la respuesta cromatográfica).

En los puntos IV.3.1.1.1 y IV.3.1.1.2 se estableció que el polímero adecuado

para los cinco analitos es PDMS, y que el pH para azoxystrobin, boscalid, cyprodinil y

fludioxonil es 7 mientras que para pyraclostrobin es 5. Posteriormente, en el punto

IV.3.1.2.1 se estableció que la velocidad de agitación para azoxystrobin, boscalid y

pyraclsotrobin es de 150 rpm, mientras que en el IV.3.1.2.2 se fijó en 200 rpm la

velocidad de agitación para cyprodinil y fludioxonil. Además, el modo de extracción,

para los cinco analitos, es ID (punto IV.3.1.3). Estas condiciones son las que se

utilizaran de aquí en adelante para llevar a cabo los ajustes necesarios y validaciones del

método.

239

El perfil de tiempos de extracción se realizó con muestras adicionadas a 0,1 ppm

de cada uno de los analitos.

Los tiempos de extracción ensayados fueron: 5, 10, 15, 20, 30, 60, 120, 180,

240, 480, 540, 600, y 720 minutos para cada analito. Se expuso el polímero a la

solución agitada durante esos tiempos. Los análisis se llevaron a cabo por triplicado.

Los perfiles correspondientes a cada analito, junto con su desviación estándar, pueden

apreciarse en las figuras IV.53 a IV.55, para los determinados con el detector µECD, y

en las figuras IV.56 a IV.57, por NPD. Los valores individuales de las mediciones se

encuentran en el Anexo (Tablas VII.3 y VII.4).

Figura IV.53: Perfil de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm azoxystrobin

(n=3)

Figura IV.54: Perfil de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm boscalid

(n=3)

240

Figura IV.55: Perfil de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm pyraclostrobin

Figura IV.56: Perfil de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm cyprodinil

Figura IV.57: Perfil de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm fludioxonil

241

Se puede observar como a medida que se incrementa el tiempo de extracción, la

respuesta aumenta hasta un punto después del cual no se observan incrementos en la

respuesta cromatográfica. Este tiempo fue alcanzado, para todos los analitos, a los 120

minutos.

Estos tiempos son poco prácticos para su aplicación en un laboratorio.

Normalmente se acortan los tiempos y se comprueba que a los tiempos elegidos haya

linealidad con adecuados límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ).

Para ilustrar la diferencia de trabajar con 120 min o los 15 min elegidos como

tiempo de extracción, se muestra el análisis de arándanos adicionados con boscalid a

0,05; 0,1; 0,25; y 0,4 ppm. Los valores pueden observarse en la tabla VII.5 del Anexo.

La figura IV.58 muestra las dos rectas obtenidas. Si bien las respuestas cromatográficas

son diferentes, y existen diferencias significativas entre las muestras, con valores de

altura mucho mayores para tiempos de extracción mayor, las rectas son lineales, es decir

que el cálculo de la concentración a través de esas dos curvas de calibración, dará

respuestas equivalentes siempre y cuando la concentración a evaluar supere el LOQ de

cada metodología, entendiendo por metodología a aquella que utiliza distintos tiempos

de extracción. Por este motivo, se tomó como valor de tiempo de extracción 15 minutos,

pues presentó una sensibilidad adecuada para los cinco analitos que se detalla en el

punto IV.3.1.6.4.

Figura IV.58: Rectas de calibración con arándano adicionado a 0,05; 0,1; 0,25; y 0,4

ppm de boscalid (n=3) a 15 y 120 minutos de extracción

Codigo120 minutos15 minutos

0 0,1 0,2 0,3 0,4ppm

0

1

2

3

4(X 1,E9)

h

242

A los 15 minutos la curva se encuentra en la zona de crecimiento exponencial,

por lo cual, para evitar variaciones importantes en los resultados cromatográficos, se

debe trabajar con mucha precaución para que el tiempo de extracción sea exacto.

IV.3.1.5. Tiempo y temperatura de desorción

La fibra se introduce directamente en el inyector, el split del sistema

cromatográfico se mantiene cerrado durante la desorción, para lograr transferir todo el

analito en el frente de la columna del cromatógrafo gaseoso, optimizando así la

sensibilidad (Langenfeld, y col. 1996).

Para llevar a cabo la selección del tiempo de desorción se realizaron

determinaciones cromatográficas utilizando fruta adicionada con 0,1 ppm de cada uno

de los cinco pesticidas. Se empleó un tiempo de extracción de 15 minutos a una

temperatura de desorción de 250°C, por triplicado.

Para los fungicidas azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin se probaron tiempos

de desorción, luego de pruebas preliminares, de 5, 6, 6,5 y 7 minutos; y para cyprodinil

y fludioxonil de 4, 5, 6 y 7 minutos. En las figuras IV.59 a IV.63 se pueden observar los

resultados obtenidos junto con su desviación estándar. Los valores individuales de las

mediciones se encuentran en el Anexo (Tablas VII.6 y VII.7).

Figura IV.59: Tiempos de desorción de azoxystrobin en arándano adicionado con

0,1 ppm. Referencia: 1=5 min; 2=6 min; 3=6,5 min; 4=7 min.

243

Figura IV.60: Tiempos de desorción de boscalid en arándano adicionado con 0,1 ppm.

Referencia: 1=5 min; 2=6 min; 3=6,5 min; 4=7 min.

Figura IV.61: Tiempos de desorción de pyraclostrobin en arándano adicionado con

0,1 ppm. Referencia: 1=5 min; 2=6 min; 3=6,5 min; 4=7 min.

244

Figura IV.62: Tiempos de desorción de cyprodinil en arándano adicionado con

0,1 ppm. Referencia: 1=4 min; 2=5 min; 3=6 min; 4=7 min.

Figura IV.63: Tiempos de desorción de fludioxonil en arándano adicionado con

0,1 ppm. Referencia: 1=4 min; 2=5 min; 3=6 min; 4=7 min.

De los gráficos anteriores se puede apreciar que el tiempo de desorción al principio no

es suficiente para que todo el analito sea desorbido del polímero. En el caso de azoxystrobin,

boscalid y pyraclostrobin, la respuesta cromatográfica aumenta hasta los 6,5 minutos y luego

245

permanece constante. Por otro lado, cyprodinil y fludioxonil son completamente desorbidos en

el puerto de inyección con 5 minutos de exposición de la fibra.

Los tiempos de desorción se optimizaron de manera de lograr que no queden

cantidades residuales en la fibra. Por los motivos antes expuestos, se toman como tiempos de

desorción, en la metodología analítica propuesta, 6,5 minutos para azoxystrobin, boscalid y

pyraclostrobin; y 5 minutos, para cyprodinil y fludioxonil.

Los polímeros de recubrimiento de las fibras están especificados para trabajar

hasta un máximo de temperatura, que dependiendo del polímero, puede alcanzar 300°C.

Sin embargo, cuanto menor sea la temperatura de trabajo, mayor será la vida útil de la

fibra. Por ello se realizaron mediciones sólo hasta 260°C. Se prepararon muestras adicionadas

con 0,1 ppm de cada analito y se realizaron mediciones a 230, 240, 250 y 260°C, por triplicado.

Se emplearon los tiempos de desorción de la fibra en el puerto de inyección que se indicaron en

el párrafo anterior. Los valores individuales de las mediciones se encuentran en el Anexo

(Tabla VII.8). Los resultados pueden observarse en las figuras IV.64 a IV.68.

Figura IV.64: Temperatura de desorción de azoxystrobin en arándano adicionado con

0,1 ppm.

246

Figura IV.65: Temperatura de desorción de boscalid en arándano adicionado con

0,1 ppm.

Figura IV.66: Temperatura de desorción de pyraclostrobin en arándano adicionado

con 0,1 ppm.

247

Figura IV.67: Temperatura de desorción de cyprodinil en arándano adicionado con

0,1 ppm.

Figura IV.68: Temperatura de desorción de fludioxonil en arándano adicionado con

0,1 ppm.

Se observa que 250°C es la mejor temperatura de desorción para azoxystrobin,

boscalid, cyprodinil y fludioxonil, pero no es así para pyraclostrobin, cuya temperatura

248

de desorción elegida fue 240°C. Este último compuesto a mayor temperatura se

descompone (Viñas y col., 2009).

A temperaturas superiores a 250°C no sólo se descomponen los pesticidas, sino

también disminuye el tiempo de vida útil de las fibras. En función de los resultados se

decidió trabajar a 250°C para azoxystrobin, boscalid, cyprodinil y fludioxonil, y a

240°C para pyraclostrobin.

Las condiciones de tiempo y temperatura de desorción establecidas en este punto

serán las que se utilizaran de aquí en adelante para llevar a cabo las validaciones de los

métodos.

IV.3.1.6. Análisis unidimensional y regresión lineal

Con el objetivo de establecer el rango de linealidad del método analítico, se

analizaron estadísticamente las respuestas cromatográficas, expresadas en alturas de

pico, para cada analito y cada concentración. Se llevó a cabo un análisis unidimensional

para confirmar la normalidad de los resultados, para cada concentración, y determinar el

número de repeticiones necesarias.

El tiempo de las corridas cromatográficas realizadas por cromatografía gaseosa y

detector de µECD fue de 18,5 min. El tiempo de retención del pyraclostrobin, boscalid y

azoxystrobin fue de 12,5, 13,4 y 16,4 min, respectivamente. En la figura IV.69 se puede

observar un cromatograma obtenido para una muestra de arándanos sin aplicación de

pesticidas, adicionada con 0,1 ppm de pyraclostrobin. De igual manera, se puede

observar en la figura IV.70 un cromatograma obtenido de la misma manera para

boscalid y azoxystrobin en una muestra de arándanos adicionada con 0,05 ppm de

dichos fungicidas.

249

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00

1e+07

2e+07

3e+07

4e+07

5e+07

6e+07

7e+07

8e+07

9e+07

1e+08

1.1e+08

1.2e+08

1.3e+08

1.4e+08

1.5e+08

1.6e+08

1.7e+08

Time

Response_

Signal: 20036.D\ECD1A.CH

1.84 1.91 1.96 2.02 2.10 2.24 2.29 3.98 4.68 4.90

5.56

6.35 6.39 6.69 6.84

7.07

7.72 8.05 8.29 8.54 8.63 8.79 8.87

8.95 9.31 9.47 9.53

9.62 9.68 9.85

9.92

10.04 10.07

10.17 10.26 10.34 10.41

10.46

10.52 10.62

10.70 10.76 10.80 10.85 10.90 10.95 11.03 11.08 11.12 11.21

11.29

11.45 11.48 11.53

11.59

11.70

11.77 11.83 11.90

12.00

12.07 12.13 12.18 12.25 12.29 12.46 12.53

12.80

12.85 12.92 12.99 13.03 13.38 13.90

15.08

15.50

15.60 15.68 15.76

15.83

15.91

17.51 17.83

17.91

20.08

View Mode: Integration

Figura IV.69: Cromatograma de extracto de arándano adicionado com 0,1 ppm

pyraclostrobin

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

1e+08

2e+08

3e+08

4e+08

5e+08

6e+08

7e+08

8e+08

9e+08

1e+09

1.1e+09

1.2e+09

1.3e+09

Time

Response_

Signal: 20208.D\ECD1A.CH

2.02 2.21 2.63 2.74 2.79 3.02 3.37

5.93 5.97 6.28 6.40 6.62 6.78 6.84 6.89 7.09 7.14 8.22 8.27 8.41 8.51 8.56 8.77 8.87 8.96 9.01 9.05 9.09 9.15 9.26 9.42 9.64 9.81 10.11 10.18 10.28 10.41 10.74 10.80 11.04 12.27 12.68

13.44

16.85



boscalid y azoxystrobin

El tiempo de las corridas cromatográficas realizadas por cromatografía gaseosa y

detector de NPD fue de 16,8 min. El tiempo de retención del cyprodinil y fludioxonil

fue de 11,2 y 11,8 min, respectivamente. En la figura IV.71 puede observarse un

cromatograma para una muestra de arándanos sin aplicación de pesticidas, adicionada

con 0,1 ppm de cyprodinil y fludioxonil.

Pyraclsotrobin

Boscalid

Azoxystrobin

250

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

6500000

7000000

Time

Response_

Signal: 20010.D\NPD2B.CH 11.19

11.78



cyprodinil y fludioxonil

En el caso de los estándares puros, tres repeticiones permitían asegurar, para las

concentraciones menores (Anexo, Tablas VII.9 a VII.13) un error menor al 10% para

azoxystrobin, al 5% para boscalid y pyraclostrobin, al 7% para cyprodinil, y al 11%

para fludioxonil. El error aumentó al trabajar con la matriz adicionada (Anexo, Tablas

VII.14 a VII.18) obteniéndose errores menores al 15% para azoxystrobin, boscalid y

fludioxonil, al 12% para pyraclostrobin, y al 10% para cyprodinil

.

Se construyeron las curvas de calibración para soluciones de estándares y matriz

adicionada, para n = 10 y 95% de confianza (α = 0,05).

IV.3.1.6.1. Curvas de calibración con estándares

Para determinar las curvas de calibración de los pesticidas en estudio se

prepararon soluciones de estándares de distintas concentraciones. Las curvas para

azoxystrobin, boscalid, pyraclostrobin, cyprodinil y fludioxonil, y el promedio,

desviación estándar y RSD% correspondiente a cada concentración, pueden observarse

en las figuras IV.72 a IV.76, y en las tablas IV.18 a IV.22, respectivamente. Los valores

individuales de las mediciones se encuentran en el Anexo (Tablas VII.9 a VII.13).

Cyprodinil

Fludioxonil

251

Linealidad estándares azoxistrobin

h = 6,56717E6 + 3,05858E9*ppm

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1ppm

0

1

2

3

4(X 1,E8)

h

Figura IV.72: Curva de calibración para estándar de azoxystrobin. R2=0,9974.

Tabla IV.18: Promedio, desviación estándar y RSD% de estándares de azoxystrobin

Azoxystrobin (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,1

Promedio 23737700 36502236 88006718 149636993 316081703

Desviación Estandar 870308 2065587 4978060 7159955 9262694

RSD% 4 6 6 5 3

Linealidad estándares boscalid

h = 1,21188E7 + 1,38715E10*ppm

0 0,02 0,04 0,06 0,08ppm

0

2

4

6

8

10

12(X 1,E8)

h

Figura IV.73: Curva de calibración para estándar de boscalid. R2=0,9980.

252

Tabla IV.19: Promedio, desviación estándar y RSD% de estándares de boscalid

Boscalid (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,075

Promedio 65794321 183722295 351642582 678621739 1069611846


RSD% 3 3 2 1 1

Linealidad estándares pyraclostrobin

h = -4,31822E7 + 7,04203E8*ppm

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1ppm

0

2

4

6

8(X 1,E8)

h

Figura IV.74: Curva de calibración para estándar de pyraclostrobin. R2=0,9979.

Tabla IV.20: Promedio, desviación estándar y RSD% de estándares de pyraclostrobin

Pyraclasotrobin (ppm)

0,05 0,1 0,25 0,5 1

Promedio 9506312 33080355 106446975 304826890 668214459


RSD% 2 1 4 2 2

253

Linealidad estándares cyprodinil

h = -1,04709E6 + 8,99028E7*ppm

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5ppm

0

1

2

3

4

5(X 1,E7)

h

Figura IV.75: Curva de calibración para estándar de cyprodinil. R2=0,9980.

Tabla IV.21: Promedio, desviación estándar y RSD% de estándares de cyprodinil

Cyprodinil (ppm)

0,005 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5

Promedio 322343 740016 3296003 6855284 15643655 44626051

Desviación Estandar 15416 20319 151033 83387 434180 786399

RSD% 5 3 5 1 3 2

Linealidad estándares fludioxonil

h = -297745 + 2,334E7*ppm

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5ppm

0

2

4

6

8

10

12(X 1,E6)

h

Figura IV.76: Curva de calibración para estándar de fludioxonil. R2=0,9981.

254

Tabla IV.22: Promedio, desviación estándar y RSD% de estándares de fludioxonil

Fludioxonil

0,005 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5

Promedio 81259 155803 745743 1591805 4355726 11472254

Desviación Estandar 5047 2689 10944 23225 111322 170244

RSD% 6 2 1 1 3 1

Del análisis realizado se desprende que existe una relación lineal entre los

valores de concentración y la respuesta cromatográfica para las soluciones de

estándares, con valores de R2 mayores a 0,99 para todos los pesticidas analizados.

IV.3.1.6.2. Curvas de calibración con matriz adicionada

Una vez obtenidas las curvas de calibración con soluciones de estándares de los

distintos analitos, se procedió a construirlas a partir de matriz adicionada, para así

determinar el rango de linealidad y luego comparar las pendientes de las rectas y decidir

si existe efecto matriz. Las curvas de regresión lineal de azoxystrobin, boscalid,

pyraclostrobin, cyprodinil y fludioxonil, y el promedio, desviación estándar y RSD%

correspondiente a cada concentración, pueden observarse en las figuras IV.77 a IV.81, y

en las tablas IV.23 a IV.27, respectivamente. Los valores individuales de las mediciones

se encuentran en el Anexo (Tablas VII.14 a VII.18).

Linealidad Azoxistrobin

h = -1,07168E7 + 8,47641E8*ppm

0 0,2 0,4 0,6 0,8ppm

0

2

4

6

8(X 1,E8)

h

Figura IV.77: Curva de calibración para matriz adicionada con azoxystrobin.

R2=0,9965

255

Tabla IV.23: Promedio, desviación estándar y RSD% de muestra adicionada con

azoxystrobin

Azoxystrobin (ppm) 0,005 0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0,5 0,75 Promedio 7132330 9397914 24969450 31390955 51981131 176570795 403442310 641893611

Desviación Estándar

488454 874012 2107221 1057853 4143655 8801504 18624447 18186997

RSD% 7 9 8 3 8 5 5 3

Linealidad Boscalid

h = 2,52894E7 + 5,26228E9*ppm

0 0,1 0,2 0,3 0,4ppm

0

4

8

12

16

20

24(X 1,E8)

h

Figura IV.78: Curva de calibración para matriz adicionada con boscalid. R2=0,9975


boscalid

Boscalid (ppm) 0,005 0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0,4

Promedio 60860736 75930269 225597287 233194402 482995441 1405613112 2108146844

Desviación Estándar

3694485 6768450 22140468 10892660 22041790 40720057 4668941

RSD% 6 9 10 5 5 3 0,2

256

Linealidad Pyraclostrobin

h = -3,18435E6 + 5,41458E7*ppm

0 1 2 3 4 5ppm

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3(X 1,E8)

h

Figura IV.79: Curva de calibración para matriz adicionada con pyraclostrobin.

R2=0,9990


pyraclostrobin

Pyraclostrobin (ppm) 0,05 0,1 0,25 0,5 1 3 5

Promedio 1895418 4729363 13922207 25665966 49617839 155483982 270041865

Desviación Estándar 125152 193380 966894 1706398 1649996 5589329 5025515

RSD% 7 4 7 7 3 4 2

Linealidad Cyprodinil

h = -28175 + 1,00307E7*ppm

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5ppm

0

1

2

3

4

5

6(X 1,E6)

h

Figura IV.80: Curva de calibración para matriz adicionada con cyprodinil.

R2=0,9997.

257


cyprodinil

Cyprodinil

0,005 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5

Promedio 17984 45575 215225 489570 751474 1011874 2418647 5005441

Desviación Estandar 662 1953 12047 13310 11816 14527 27309 50514

RSD% 4 4 6 3 2 1 1 1

Linealidad Fludioxonil

h = -15398,9 + 2,09813E6*ppm

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5ppm

0

2

4

6

8

10

12(X 100000,)

h

Figura IV.81: Curva de calibración para matriz adicionada con fludioxonil.

R2=0,9998.


fludioxonil

Fludioxonil

0,005 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5

Promedio 1937 3965 40488 76039 150487 191487 506660 1035349

Desviación Estandar 173 344 1908 1970 2183 2510 6318 7841

RSD% 9 9 5 3 1 1 1 1

Del análisis realizado se determinó que el R2 correspondiente al azoxystrobin,

boscalid, pyraclostrobin, cyprodinil y fludioxonil es 0,9965, 0,9975, 0,9990, 0,9997 y

0,9998, respectivamente.

258

Se puede ver que el método presenta muy buena linealidad en los rangos

estudiados de cada analito, con valores de R2 superiores a 0,99 en todos los casos, y que

la precisión fue satisfactoria para la construcción de las curvas de calibración con

muestras de arándanos adicionadas, ya que la desviación estándar relativa no superó el

10% en ningún caso.

IV.3.1.6.3. Comparación de rectas de regresión

A los efectos de evaluar la existencia o no de efecto matriz, para determinar la

metodología de calibración para muestras reales, como son las muestras de arándanos

provenientes de empaques o campos, fue necesario efectuar la comparación de los

resultados de las rectas de regresión.

En las figuras IV.82 a IV.86 se grafican las curvas de regresión para soluciones

de estándares y arándanos adicionados.

Comparación de Rectas de Regresión para Azoxistrobin

CodigoEstandarFruta

0 0,2 0,4 0,6 0,8Concentracion

0

2

4

6

8(X 1,E8)

Altu

ra

Figura IV.82: Comparación rectas de regresión de soluciones estándar y matriz

adicionada para azoxystrobin

259

CodigoEstandarFruta

Comparación de Rectas de Regresión para Boscalid

0 0,1 0,2 0,3 0,4Concentracion

0

4

8

12

16

20

24(X 1,E8)

Altu

ra


adicionada para boscalid

CodigoEstandarFruta

Comparación de Rectas de Regresión para Pyraclostrobin

0 1 2 3 4 5Concentracion

0

2

4

6

8(X 1,E8)

Altu

ra


adicionada para pyraclostrobin

CódigoEstandarFruta

Comparación de Rectas de Regresión para Cyprodinil

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5Concentración

0

1

2

3

4

5(X 1,E7)

Altu

ra


adicionada para cyprodinil

260

CódigoEstandarFruta

Comparación de Rectas de Regresión para Fludioxonil

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5Concentración

0

2

4

6

8

10

12(X 1,E6)

Altu

ra


adicionada para fludioxonil

De la observación de las figuras anteriores se puede visualizar la menor

sensibilidad del método con fruta adicionada, ya que las pendientes son menores que las

correspondientes a los estándares puros.

El análisis estadístico se realizó con el software Statgraphics Centurion XV

comparando las curvas de regresión, a partir de los resultados obtenidos para soluciones

acuosas de estándares y soluciones de frutas adicionadas a las concentraciones

detalladas en las Tablas VII.9 a VII.18 del Anexo.

Debido a que los P-valor de la comparación entre las pendientes y las ordenadas

al origen de ambas rectas son menores que 0,01, existen diferencias altamente

significativas entre las pendientes y las ordenadas al origen, para las distintas curvas de

fruta adicionada y soluciones de estándares, con un nivel de confianza del 99%.

De estos resultados se decidió que para determinar las concentraciones de los

fungicidas en estudio, se realizaran periódicamente nuevas curvas de calibración con la

matriz adicionada, que en todos los casos mostraron R2 mayores a 0,99.

IV.3.1.6.4. Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ)

Los límites de detección y cuantificación fueron calculados como 3 y 10 veces la

relación señal / ruido (S/N), respectivamente. En la tabla IV.28 se detallan los resultados

261

obtenidos a partir del software del cromatógrafo, para los picos correspondientes a

0,005 ppm de boscalid y azoxystrobin, 0,05 ppm de pyraclsotrobin, y 0,01 ppm de

cyprodinil y fludioxonil, corregido por el peso de la muestra empleado y el volumen

final al que se llevó la misma, que fue de 5 g y 25 ml, respectivamente. Los valores

individuales de señal y ruido, para cada analito, se detallan en la tabla VII.19 del Anexo.

Tradicionalmente se utilizan para la selección de productos para la exportación

aquellos arándanos cuya contaminación no supere los LMR establecidos por la Unión

Europea. En la tabla IV.28 se incluyó una columna con estos límites para comparar si la

metodología desarrollada es adecuada para el control de pesticidas en arándanos con

destino final a la Unión Europea.

Tabla IV.28: LOD y LOQ para los distintos analitos (n=10) y LMR expresado en ppb

(µg/kg)

LOD LOQ LMR

Azoxystrobin 2 6 5000

Boscalid 2 4 10000

Pyraclostrobin 26 86 3000

Cyprodinil 2 4 5000

Fludioxonil 1 2 3000

Estos valores de LOD y LOQ se encuentran muy por debajo de los LMR

permitidos por la Unión Europea, lo que indica la aplicabilidad del método analítico

propuesto para este fin. Se debe resaltar que esta práctica de utilizar los LMR de la

Unión Europea puede no ser adecuada para aquellos lotes que se exporten a otros

destinos, como puede ser por ejemplo Estados Unidos, que en el caso de boscalid

plantea un LMR de 3500 ppb pero incluyendo los metabolitos que se produzcan por

degradación del mismo.

IV.3.1.6.5. Exactitud del método

Para determinar la exactitud del método se realizó un estudio de recuperación de

los fungicidas en estudio. Se fortificaron muestras de arándanos a 3 diferentes

concentraciones de cada pesticida; una cerca del límite inferior, una en el centro y una

próxima al límite superior de cada rango de concentraciones correspondientes a las

curvas de calibración, y se analizaron por triplicado. Los valores individuales para cada

analito se detallan en la tabla VII.20 del Anexo. En las tablas IV.29 y IV.30 se observan

262

los porcentajes de recuperación para los cinco analitos en estudio, junto con su

correspondiente RSD%.

Tabla IV.29: Recuperación ± RSD% para 3 niveles de concentración de azoxystrobin,

boscalid y pyraclostrobin.

Azoxystrobin Boscalid Pyraclostrobin ppm Recup. RSD% ppm Recup. RSD% ppm Recup. RSD% 0,01 106% 3% 0,01 98% 4% 0,1 106% 2%

0,1 102% 1% 0,1 104 % 4% 1 96% 2%

0,75 100% 1% 0,4 98% 0,2% 5 101% 3%

Tabla IV.30: Recuperación ± RSD% para 3 niveles de concentración de cyprodinil y

fludioxonil.

Cyprodinil Fludioxonil ppm Recup. RSD% ppm Recup. RSD% 0,01 100% 4% 0,01 100% 1%

0,1 99% 1% 0,1 99% 1%

0,5 101% 2% 0,5 98% 2%

Se puede apreciar que los métodos de análisis dan recuperaciones muy próximas

al 100% y son suficientemente exactos ya que los RSD% no superan el 4%.

Los resultados obtenidos muestran que las metodologías desarrolladas y

validadas presentan altas recuperaciones para todos los analitos, superiores a la mayoría

de las metodologías descriptas en las tablas II.19, II.21, II.23, II.25 y II.27.

En los LOD y LOQ la comparación resulta más difícil pues muchas de las

metodologías no indican como determinaron estos parámetros. Sin embargo,

azoxystrobin, boscalid, cyprodinil y fludioxonil, muestran que los límites de las

metodologías desarrolladas están en el orden o son menores que los más bajos citados

en dichas tablas. Para pyraclostrobin, cuyos LOD y LOQ son 26 y 86 ppb,

respectivamente, mucho mayores que los obtenidos para los otros pesticidas, la

comparación con otras metodologías es dificultosa pues no existen metodologías

específicas para arándanos. Sin embargo, se puede citar el trabajo de Banerjee y col.

(2007) en uvas con un LOD de 1 ppb hasta valores de 115 ppb en el mismo sustrato

determinados por Lesueur y col. (2008), implicando un amplio rango de LOD y LOQ

establecidos para los métodos citados en la tabla II.23.

263

IV.3.2. Curvas de degradación

Para poder realizar estos ensayos, se trabajó en conjunto con encargados de

campos de arándanos. Las metodologías empleadas para realizar la aplicación,

muestreo, tratamiento de la fruta, etc., fueron explicados en los puntos III.1.1 y III.4.6;

mientras que los conceptos teóricos sobre degradación de pesticidas, en el punto II.11.

Todas las muestras fueron analizadas por triplicado.

IV.3.2.1. Productos técnicos

La concentración real de cada fungicida contenido en los productos técnicos fue

comprobada utilizando la metodología analítica desarrollada.

Para azoxystrobin, boscalid, cyprodinil y fludioxonil, se disolvieron 0,01 g de

producto técnico en 1 litro de agua destilada. Luego, se tomó 1 ml de dicha solución y

se llevó a un volumen final de 100 ml con agua destilada. La concentración de la

solución final fue de 0,01 g de producto técnico en 100 litros de agua.

En el caso de pyraclostrobin, se disolvieron 0,01 g de Bellis en 100 ml de agua

destilada, y luego se tomó 1 ml de dicha solución y se lo llevó a un volumen final de

100 ml. En este caso, la concentración de la solución final era de 0,01 g de producto

técnico en 10 litros de agua.

El contenido de azoxystrobin en el producto comercial Amistar, y de boscalid y

pyraclostrobin en el producto Bellis, fueron evaluados mediante la determinación por

quintuplicado, mediante cromatografía gaseosa con detector de µECD.

Por otro lado, la concentración de cyprodinil y fludioxonil en el fungicida

comercial Switch, fue establecida mediante la determinación por quintuplicado, por

cromatografía gaseosa con detector de NPD.

Para determinar el contenido de cada fungicida en el producto comercial, se

utilizaron las ecuaciones correspondientes a las curvas de calibración de estándares, las

cuales son descriptas en la sección IV.3.1.6.1. Los valores individuales correspondientes

a cada analito se detallan en la tabla VII.21 del Anexo. Los resultados pueden apreciarse

en la tabla IV.31.

264

Tabla IV.31: Concentración de cada fungicida en el producto técnico

Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

mg/l ± RSD% (n=5) 0,0470 ±

0,0005

0,0250 ±

0,0001

0,038 ±

0,001

0,0250 ±

0,0002 0,128 ± 0,003

% en producto técnico 47 % 25 % 38 % 25 % 12,8 %

Las etiquetas de los productos declaraban Bellis (25,2% boscalid + 12,8%

pyraclostrobin), Amistar (50% azoxystrobin), y Switch (25% fludioxonil + 37,5%

cyprodinil).

IV.3.2.2. Azoxystrobin

La concentración inicial (D0) de azoxystrobin depositada sobre la fruta fue de

0,38 y 0,23 mg/kg en las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Se graficaron las concentraciones de azoxystrobin (residuos) en función de los

días transcurridos desde el momento de la aplicación en el campo, para ambas

variedades de arándano. Los valores individuales correspondientes a las curvas de

calibración de cada variedad se detallan en la tabla VII.22 del Anexo.

Los valores promedio y la desviación estándar de las muestras recolectadas en el

campo entre los días 0 y 69, pueden observarse en las figuras IV.87 y IV.88 (los valores

individuales en el Anexo Tabla VII.23).

0 10 20 30 40 50 60 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Res

iduo

s de

azo

xyst

robi

n (m

g/kg

)

Tiempo posterior a la aplicación (días)

Figura IV.87: Curva de degradación de azoxystrobin en arándanos variedad Emerald.

265

0 10 20 30 40 50 60 700,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Res

iduo

s de

azo

xyst

robi

n (m

g/kg

)


Figura IV.88: Curva de degradación de azoxystrobin en arándanos variedad Jewel.

Las concentraciones fueron disminuyendo de manera rápida al comienzo con un

remanente de 55,6% y 57,7% transcurridos 10 días, en las variedades Emerald y Jewel,

respectivamente. La persistencia de este fungicida, transcurridos 69 días desde el

momento de la aplicación, fue de 4,5 y 7,3% del contenido inicial, para las variedades

Emerald y Jewel, respectivamente.

Como puede observarse en los gráficos IV.87 y IV.88, la evolución de los

residuos de azoxystrobin sigue una cinética de degradación de primer orden, y un

modelo exponencial fue el que mejor ajustaba ambas curvas.

El coeficiente de regresión R2 se obtuvo graficando el lnRt (punto II.11.3) en el

eje Y, y el tiempo en el eje X para cada curva, demostrando el buen ajuste del modelo

seleccionado (R2 = 0,9977 para Emerald y R

2 = 0,9781 para Jewel). En la figura IV.89

se pueden observar los resultados de las curvas de degradación linealizados, para las

variedades Emerald y Jewel.


Ln R

esid

uos

de a

zoxy

stro

bin

EmeraldJewel

0 20 40 60 80-4,1

-3,1

-2,1

-1,1

-0,1

Figura IV.89: Curvas de regresión de azoxystrobin en arándanos

266


comparando las curvas de regresión, y mostró que existen diferencias altamente

significativas entre las curvas de ambas variedades (p < 0,01) para un nivel de confianza

del 99%.

Los parámetros de degradación se resumen en la tabla IV.32.

Tabla IV.32: Parámetros cinéticos de la degradación de azoxystrobin en arándanos

Variedad Ecuación de regresióna R2 Constante de velocidad (k)

Tiempo vida media (t1/2)

Emerald R = 0,01087+0,36803e-0,0597t

0,9977 0,0597 días-1

11,6 días

Jewel R = 0,2e-0,039t

0,9781 0,039 días-1

17,8 días a R = concentraión de azoxystrobin; t = tiempo (días)

El tiempo de vida media para azoxystrobin en arándanos de las variedades

Emerald y Jewel calculado fue de 11,6 y 17,8 días, respectivamente, observando

diferencias entre el tiempo de vida media del pesticida en ambas variedades de

arándano.

Se midió el diámetro ecuatorial de 100 bayas de cada muestra para corroborar la

evolución de este parámetro con el transcurso del tiempo (punto III.4.7). Las variedades

Emerald y Jewel presentan un diámetro inicial de 8,8 y 8,5 mm, respectivamente. Sin

embargo, la variedad Emerald presentó un diámetro promedio de 18,2 mm, mientras

que Jewel de 15,6 mm, transcurridos 69 días (Figura IV.90). Al aumentar el volumen y

peso de las bayas, disminuye proporcionalmente la cantidad de residuo. Esta

eliminación aparente de los residuos, considerada una dilución, explica parcialmente las

diferencias encontradas en el tiempo de vida media y en la velocidad de degradación de

azoxystrobin en ambas variedades.

267

Figura IV.90: Comparación entre las velocidades de crecimiento de arándanos de la

variedad Emerald y Jewel

De los resultados obtenidos puede concluirse que el tiempo de carencia

recomendado para azoxystrobin en arándanos de 90 días, es incorrecto ya que el tiempo

de vida media fue menor a 18 días. Estos tiempos de carencia imposibilitan la

utilización de este compuesto en el campo 90 días antes de la exportación de la fruta.

IV.3.2.3. Boscalid

La concentración inicial (D0) de boscalid depositada sobre la fruta fue de 0,55 y

0,19 mg/kg para las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Se graficaron las concentraciones de boscalid (residuos) en función de los días

transcurridos desde el momento de la aplicación en el campo, para ambas variedades de

arándano. Los valores individuales correspondientes a las curvas de calibración de cada

variedad se detallan en la tabla VII.24 del Anexo.

268




0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Res

iduo

s de

bos

calid

(m

g/kg

)


Figura IV.91: Curva de degradación de boscalid en arándanos variedad Emerald.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Res

iduo

s de

bos

calid

(m

g/kg

)


Figura IV.92: Curva de degradación de boscalid en arándanos variedad Jewel.

La concentración fue disminuyendo rápidamente con el correr de los días,

quedando sólo el 7,3 y 9,5% del contenido inicial transcurridos 20 días desde el

momento de la aplicación, para las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Lo observado para boscalid en arándanos puede compararse con la degradación

de este fungicida en pepinos (Chen y col., 2007). Estos autores trabajaron con dos dosis

de aplicación (0,5 y 0,83 kg de ingrediente activo por hectárea), con depósitos iniciales

de 0,66 y 1,48 mg/kg, y un contenido final del 5 y 17%, respectivamente, seis días

después de la aplicación.

269

Como puede observarse en los gráficos IV.91 y IV.92, la evolución de los

residuos de boscalid sigue una cinética de degradación de primer orden, y un modelo

exponencial fue el que mejor ajustaba ambas curvas. Chen y col. (2007) para pepinos

encontraron el mismo tipo de cinética.

El coeficiente de regresión R2 se obtuvo graficando el lnRt en el eje Y, y el

tiempo en el eje X para cada curva. En la figura IV.93 se pueden observar los resultados

de las curvas de degradación linealizados, para las variedades Emerald y Jewel.


Ln R

esid

uos

de b

osca

lid EmeraldJewel

0 4 8 12 16 20-4,1

-3,1

-2,1

-1,1

-0,1

Figura IV.93: Comparación de curvas de regresión de boscalid en arándanos

variedades Emerald y Jewel


Tabla IV.33: Parámetros cinéticos de la degradación de boscalid en arándanos



Emerald R = 0,5428e-0,131t

0,9979 0,131 días-1

5,3 días

Jewel R = 0,04435+0,18123e-0,0654t

0,9672 0,0654 días-1

10,6 días a R = concentraión de boscalid; t = tiempo (días)




del 99%.

El tiempo de vida media para boscalid en arándanos de las variedades Emerald y

Jewel calculado fue de 5,3 y 10,6 días, respectivamente. El mismo parámetro fue

determinado por Chen y col. (2007), encontrando que la carga inicial del fungicida se

270

reducía a la mitad en menos de dos días. Esto demuestra la necesidad de realizar curvas

de degradación para los distintos vegetales y en las distintas regiones de producción.

Observando los resultados, se pueden apreciar diferencias entre el tiempo de

vida media de ambas variedades de arándano. Por otro lado, también existen diferencias

en este parámetro entre arándanos y pepinos. La degradación de este fungicida es más

rápida en pepinos, como se mencionó en el párrafo anterior. Chen y col. (2007)

consideran que la posible explicación de la velocidad de degradación puede atribuirse a

dilución por crecimiento del vegetal o por una degradación física o química, aunque

afirman que es necesaria una investigación más profunda.

Al igual que para azoxystrobin, se midió el diámetro ecuatorial de 100 bayas de

cada muestra para corroborar la evolución de este parámetro con el transcurso del

tiempo (punto III.4.7). Ambas variedades presentan similar diámetro inicial (10,4 mm).

Sin embargo, la variedad Emerald presentó un diámetro promedio de 16,5 mm, mientras

que Jewel de 14,6 mm, transcurridos 20 días (Figura IV.94). La dilución por

crecimiento de las bayas explica parcialmente la existencia de diferencias en el tiempo

de vida media y en la velocidad de degradación de ambas variedades, como fue

explicado para azoxystrobin.

271


variedad Emerald y Jewel.

IV.3.2.4. Pyraclostrobin

La concentración inicial (D0) de pyraclostrobin depositada sobre la fruta fue de

0,62 y 0,24 mg/kg, para las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Se graficaron las concentraciones de pyraclostrobin en función de los días







272

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Res

iduo

s de

pyr

aclo

stro

bin

(mg/

kg)


Figura IV.95: Curva de degradación de pyraclostrobin en arándanos variedad

Emerald.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Res

iduo

s de

pyr

aclo

stro

bin

(mg/

kg)


Figura IV.96: Curva de degradación de pyraclostrobin en arándanos variedad Jewel.

La concentración fue disminuyendo rápidamente con el correr de los días,

quedando sólo el 7,9 y 13,1% del contenido inicial transcurridos 20 días desde el

momento de la aplicación, para las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Al igual que en la degradación de azoxystrobin y boscalid, como puede

observarse en los gráficos IV.95 y IV.96, la evolución de los residuos de pyraclostrobin

sigue una cinética de degradación de primer orden, y un modelo exponencial fue el que

mejor ajustaba ambas curvas.


tiempo en el eje X para cada curva. En la figura IV.97 se puede observar los resultados


273


Ln R

esid

uos

de p

yrac

lost

robi

n

EmeraldJewel

0 4 8 12 16 20-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

Figura IV.97: Comparación de curvas de regresión de pyraclostrobin en arándanos





del 99%.


Tabla IV.34: Parámetros cinéticos de la degradación de pyraclostrobin en arándanos

Variedad Ecuación de regresióna

R2 Constante de velocidad (k)


Emerald R = 0,5779e-0,125t

0,9962 0,125 días-1

5,5 días

Jewel R = 0,17859e-0,08658t

0,9794 0,08658 días-1

8,0 días a R = concentraión de pyraclostrobin; t = tiempo (días)

El tiempo de vida media para pyraclostrobin en arándanos de las variedades

Emerald y Jewel calculado fue de 5,5 y 8,0 días, respectivamente, observando

diferencias entre el tiempo de vida media del pesticida en ambas variedades de

arándano.

La figura IV.94 muestra la evolución del tamaño de las bayas de ambas

variedades. Este gráfico es el mismo que para boscalid debido a que la aplicación de

ambos fungicidas se realiza en los campos simultáneamente, por lo que las muestras

recolectadas fueron comunes para realizar el estudio. Nuevamente el efecto dilución no

explica totalmente las diferencias en cuanto a la degradación del pesticida en ambas

variedades.

274

IV.3.2.5. Cyprodinil

La concentración inicial (D0) de cyprodinil depositada sobre la fruta fue de 0,53

y 0,54 mg/kg en las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Se graficaron las concentraciones de cyprodinil en función de los días







0 2 4 6 8 10 12 14 16 180,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Res

iduo

s de

cyp

rodi

nil (

mg/

kg)


Figura IV.98: Curva de degradación de cyprodinil en arándanos variedad Emerald.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Res

iduo

s de

cyp

rodi

nil (

mg/

kg)


Figura IV.99: Curva de degradación de cyprodinil en arándanos variedad Jewel.

Las concentraciones fueron disminuyendo de manera muy rápida al comienzo

con un remanente de 33,7% y 43,6% transcurridos 4 días, en las variedades Emerald y

275

Jewel, respectivamente. La persistencia de este fungicida, transcurridos 17 días desde el

momento de la aplicación, fue de 1,2 y 4,4 % del contenido inicial, para las variedades

Emerald y Jewel respectivamente.

Al igual que en la degradación de los fungicidas anteriores, y como puede

observarse en los gráficos IV.98 y IV.99, la evolución de los residuos de cyprodinil




tiempo en el eje X para cada curva. En la figura IV.100 se pueden observar los

resultados de las curvas de degradación linealizados, para las variedades Emerald y

Jewel.




del 99%.


Ln R

esid

uos

de c

ypro

dini

l

EmeraldJewel

0 2 4 6 8 10 12-3,8

-2,8

-1,8

-0,8

0,2

Figura IV.100: Comparación de curvas de regresión de cyprodinil en arándanos



Tabla IV.35: Parámetros cinéticos de la degradación de cyprodinil en arándanos



Emerald R = 0,00416+0,55285e-0,3114t

0,9970 0,3114 días-1

2,2 días

Jewel R =0,01147+0,52339e-0,2057t

0,9963 0,2057 días-1

3,4 días a R = concentraión de cyprodinil; t = tiempo (días)

276

El tiempo de vida media para cyprodinil en arándanos de las variedades Emerald

y Jewel calculado fue de 2,2 y 3,4 días, respectivamente, observando diferencias entre el

tiempo de vida media del pesticida en ambas variedades de arándano.

La cinética de degradación de cyprodinil fue estudiada por Pose-Juan y col.

(2006) en jugo de uva almacenado a 40°C, encontrando que la misma también era de

primer orden, pero con coeficientes de regresión de 0,89, menor que los obtenidos en

este trabajo en estudios a campo. La constante de velocidad de degradación fue mucho

menor (0,016 días-1

) y el tiempo de vida media de 33 días.

Al igual que para los fungicidas anteriores, se midió el diámetro ecuatorial de

100 bayas de cada muestra para corroborar la evolución de este parámetro con el

transcurso del tiempo (punto III.4.7). Las variedades Emerald y Jewel presentan un

diámetro inicial de 17,2 y 17,0 mm, respectivamente. La variedad Emerald alcanzó un

diámetro promedio de 21,0 mm y la Jewel de 20,8 mm, transcurridos 11 días (Figura

IV.101).


variedad Emerald y Jewel.

277

En este caso el tiempo de carencia recomendado de un día es incorrecto ya que

el tiempo de vida media para ambas variedades supera los dos días, generando un riesgo

para el productor de arándanos y para el consumidor.

IV.3.2.6. Fludioxonil

La concentración inicial (D0) de fludioxonil depositada sobre la fruta fue de

0,043 y 0,037 mg/kg en las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Se graficaron las concentraciones de fludioxonil en función de los días





campo entre los días 0 y 17, pueden observarse en las figuras IV.102 y IV.103 (los

valores individuales en el Anexo Tabla VII.27).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180,00

0,02

0,04

Res

iduo

s de

flud

ioxo

nil (

mg/

kg)


Figura IV.102: Curva de degradación de fludioxonil en arándanos variedad Emerald.

278

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

Res

iduo

s de

flud

ioxo

nil (

mg/

kg)


Figura IV.103: Curva de degradación de fludioxonil en arándanos variedad Jewel.

Las concentraciones fueron disminuyendo de manera más lenta en comparación

con cyprodinil. Una concentración del 39,1% y 46,3% del valor inicial permanecía en la

fruta transcurridos 17 días, en las variedades Emerald y Jewel, respectivamente.

Al igual que en la degradación de todos los pesticidas analizados, como puede

observarse en los gráficos IV.102 y IV.103, la evolución de los residuos de fludioxonil




tiempo en el eje X para cada curva. En la figura IV.104 se puede observar los resultados



Ln R

esid

uos

de fl

udio

xoni

l

EmeraldJewel

0 3 6 9 12 15 18-4,1

-3,9

-3,7

-3,5

-3,3

-3,1

Figura IV.104: Comparación de curvas de regresión de fludioxonil en arándanos


279




del 99%.


Tabla IV.36: Parámetros cinéticos de la degradación de fludioxonil en arándanos



Emerald R = 0,04313e-0,0548t

0,9860 0,0548 días-1

12,7 días

Jewel R = 0,0343e-0,0425t

0,9801 0,0425 días-1

16,3 días a R = concentraión de fludioxonil; t = tiempo (días)

El tiempo de vida media para fludioxonil en arándanos de las variedades

Emerald y Jewel fue de 12,7 y 16,3 días, respectivamente, observando diferencias entre

el tiempo de vida media del pesticida en ambas variedades de arándano.

La figura IV.101 muestra la evolución del tamaño de las bayas de ambas

variedades. Este gráfico es el mismo que para cyprodinil debido a que la aplicación de

ambos fungicidas se realiza en los campos simultáneamente, por lo que las muestras

recolectadas fueron comunes para realizar el estudio.

La cinética de degradación de fludioxonil fue estudiada también por Pose-Juan y

col. (2006) en jugo de uva almacenado a 40°C, encontrando que la misma era de primer

orden, pero con coeficientes de regresión (0,83) menores que los obtenidos en este

trabajo a campo. La constante de velocidad de degradación fue aproximadamente la

mitad de la obtenida en este trabajo (0,021 días-1

) y mayor el tiempo de vida media (44

días).

Otro estudio de degradación realizado con pesticidas con mayores R2 que los

mencionados para jugo de uva es el de metamidofos en uvas (Athanasopoulos y col.,

2005). Así mismo, presenta R2 (0,916 a 0,944) menores que los obtenidos para

arándanos en este trabajo experimental.

El tiempo de carencia recomendado para fludioxonil de un día es incorrecto ya

que el tiempo de vida media para ambas variedades supera los doce días, generando un

riesgo para el productor de arándanos y para el consumidor.

280

IV.3.3. Elaboración de jugo de arándano

En la figura IV.105 puede observarse un diagrama de flujo del proceso de

elaboración de jugo de arándano llevado a cabo en el laboratorio, tal como fue

explicado en el punto III.4.8. En la misma se detallan todas las corrientes intervinientes

en las diversas etapas, así como los flujos másicos.

Se realizó la elaboración de jugo de arándanos en dos procesos independientes, y

se determinó el contenido de los pesticidas en cada etapa.

Figura IV.105: Diagrama de flujo global del proceso de elaboración de jugo de

arándanos

Donde:

m1 = masa de fruta tratada

m2 = masa de fruta lavada y escaldada

m3i = masa de agua de lavado y escaldado inicial

Jugo

Torta de Prensado

m4

TRITURADO

PRENSADO

m5

LAVADO Y ESCALDADO

Agua

m3i

Agua

m3f

Fruta tratada m1

85°C

3 minutos

m2

281

m3f = masa de agua de lavado y escaldado final

m4 = masa de torta de prensado

m5 = masa de jugo de arándano

El balance global del proceso se detalla a continuación:

m1 + m3i = m4 + m3f + m5

Se partió de 5 kg de arándano tratado con 250 ppm de azoxystrobin, 504 ppm de

boscalid, 750 ppm de cyprodinil, 500 ppm de fludioxonil v 256 ppm de pyraclostrobin,

como fue mencionado en el punto III.4.8, y 2 kg de agua utilizada en el proceso de

lavado y escaldado.

IV.3.3.1. Balance de materia etapa por etapa

En la figura IV.106 puede observarse la etapa de lavado y escaldado de la fruta

previamente tratada con la mezcla de pesticidas.

Figura IV.106: Diagrama de flujo de la etapa de lavado y escaldado de arándanos

Para el balance de la etapa se considera la densidad del agua igual a 1 g/ml. El

mismo se detalla a continuación:

m1 + m3i = m2 + m3f

Fruta tratada

m1

Agua

m3f

m2

LAVADO Y ESCALDADO

Fruta lavada y escaldada

Agua

m3i

282

En la figura IV.107 puede observarse el diagrama de flujo correspondiente a las

etapas de triturado y filtrado de la fruta.

Figura IV.107: Diagrama de flujo de las etapas de triturado y prensado en la

obtención de jugo de arándano

El balance de la etapa se detalla a continuación:

m2 = m4 + m5

A partir de este último balance, se determinó el rendimiento de extracción de

jugo de arándano elaborado en el laboratorio. El rendimiento del primer proceso fue del

72% (3,7 kg de jugo y 1,3 kg de torta de prensado). Y el segundo proceso arrojó un

rendimiento del 74%. Es decir, que por cada 100 g de arándanos se obtuvieron 72 o 74 g

de jugo de arándano. La densidad del jugo de arándano en promedio fue de 1,031 g/ml.

IV.3.3.2. Balance para los distintos fungicidas estudiados

El balance de materia para cada fungicida se calculó como:

Fruta lavada y escaldada

m2

Jugo

Torta de Prensado

m4

TRITURADO

PRENSADO

m5

283

a) Lavado y escaldado:

m1 * x1 + m3i * x3i = m2 * x2 + m3f * x3f + PL

Donde:

x1 = concentración del pesticida en la fruta tratada.

x2 = concentración del pesticida en la fruta lavada y escaldada.

x3i = concentración del pesticida en el agua de lavado y escaldado inicial.

x3f = concentración del pesticida en el agua de lavado y escaldado final.

PL = pérdida probable del pesticida en el proceso de lavado y escaldado.

El agua de lavado y escaldado no contenía inicialmente cantidades cuantificables

de ninguno de los analitos en estudio.

b) Triturado y prensado:

m2 * x2 = m4 * x4 + m5 * x5 + PT

Donde:

x4 = concentración del pesticida en la torta de prensado.

x5 = concentración del pesticida en el jugo.

PT = pérdida probable del pesticida en el proceso de triturado y prensado.

En las tablas VII.28 y VII.29 del Anexo se detallan las respuestas

cromatográficas para los distintos fungicidas en cada etapa de los dos procesos de

elaboración de jugo. Además, en la tabla VII.30 del Anexo se pueden observar los datos

correspondientes a las curvas de calibración utilizadas para la determnación de las

concentraciones en cada etapa del proceso. En la tabla IV.37 se detallan las

concentraciones de los cinco fungicidas estudiados en cada una de las corrientes que

intervienen en el primer proceso de elaboración de jugo, y en la tabla IV.38 las

correspondientes al segundo proceso.

284

Tabla IV.37: Concentración de fungicidas en las corrientes intervinientes del primer

proceso de elaboración de jugo de arándano.

Fungicida Muestra

Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin m1 Fruta aplicada 0,169 mg/kg 0,820 mg/kg 0,544 mg/kg 0,331 mg/kg 1,904 mg/kg

m2 Fruta escaldada 0,109 mg/kg 0,560 mg/kg 0,371 mg/kg 0,150 mg/kg 0,939 mg/kg

m3 Agua escaldado 0,145 mg/l 0,612 mg/l 0,435 mg/l 0,457 mg/l 2,403 mg/l

m4 Torta de prensado 0,243 mg/kg 0,930 mg/kg 0,423 mg/kg 0,252 mg/kg 1,968 mg/kg

m5 Jugo 0,057 mg/l 0,417 mg/l 0,360 mg/l 0,114 mg/l 0,554 mg/l

Tabla IV.38: Concentración de fungicidas en las corrientes intervinientes del segundo

proceso de elaboración de jugo de arándano.

Fungicida Muestra

Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin m1 Fruta aplicada 0,223 mg/kg 1,018 mg/kg 0,658 mg/kg 0,403 mg/kg 2,246 mg/kg

m2 Fruta escaldada 0,158 mg/kg 0,763 mg/kg 0,450 mg/kg 0,186 mg/kg 1,206 mg/kg

m3 Agua escaldado 0,161 mg/l 0,658 mg/l 0,538 mg/l 0,537 mg/l 2,622 mg/l

m4 Torta de prensado 0,347 mg/kg 1,619 mg/kg 0,474 mg/kg 0,325 mg/kg 2,637 mg/kg

m5 Jugo 0,095 mg/l 0,480 mg/l 0,452 mg/l 0,140 mg/l 0,706 mg/l

En la tabla IV.39 se resumen los % de distribución de los cinco fungicidas en las

distintas fracciones obtenidas en el proceso de elaboración de jugo. Los datos

corresponden a las dos elaboraciones llevadas a cabo.

Tabla IV.39: % de distribución de fungicidas en las distintas fracciones, en las dos

elaboraciones

Fungicida

Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin Muestra

Jugo 1 Jugo 2 Jugo 1 Jugo 2 Jugo 1 Jugo 2 Jugo 1 Jugo 2 Jugo 1 Jugo 2

Agua de

escaldado 34,3 28,9 29,8 25,8 32 32,7 55,2 53,3 50,5 46,7

Torta de

prensado 40,2 40,5 31,8 41,4 21,8 18,7 21,3 20,9 28,9 30,5

Jugo 23,5 30,5 35,5 33,8 46,1 49,3 24,0 24,9 20,3 22,6

Pérdida

total 2 0,1 2,9 -1 0,1 -0,7 -0,5 0,9 0,3 0,2

Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

El proceso de lavado y escaldado podría haber generado la reducción del

contenido de pesticidas por degradación térmica, sin embargo, no se produjo reducción

285

sino una distribución de los pesticidas. El cyprodinil es el que más se retuvo en el jugo,

mientras que el fludioxonil y pyraclostrobin fueron los pesticidas con mayor

eliminación por lavado. Los resultados muestran que para todos los pesticidas

estudiados, un porcentaje superior al 25% puede eliminarse en el agua utilizada para el

lavado y escaldado. Es conveniente estudiar el proceso industrial de elaboración de jugo

para ver si se confirman estos estudios preliminares a escala laboratorio.

IV.3.4. Ocurrencia de pesticidas en muestras comerciales

Se analizaron 30 muestras de arándanos provenientes de empaques y

supermercados. El muestreo de las mismas se realizó según lo explicado en el punto

III.1.2. Por otro lado, se estudiaron 5 muestras de jugo de arándano obtenidos en

comercios de la zona, y 5 muestras de cápsulas de extracto seco de arándano y vitamina

C obtenidas en farmacias. El método de muestreo para estos subproductos se detalló en

el punto III.1.3.

En todas las muestras se analizaron los fungicidas azoxystrobin, boscalid,

cyprodinil, fludioxonil y pyraclostrobin.

IV.3.4.1. Arándanos para consumo

La metodología analítica validada anteriormente (punto IV.3.1), se utilizó para

determinar el contenido de los fungicidas en estudio en las muestras de arándanos.

La extracción de todos los fungicidas se llevó a cabo utilizando el polímero de

PDMS, ajustando el pH de la solución acuosa de extracción a 7, excepto para el caso del

pyraclostrobin, en la cual el pH fue de 5. El tiempo de extracción para los 5 analitos fue

de 15 minutos. La velocidad de extracción para azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin

se fijó en 150 rpm, mientras que para cyprodinil y fludioxonil, en 200 rpm. La

temperatura de desorción para todos los analitos se estableció en 250°C, excepto para

pyraclostrobin, en 240°C. Para azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin, el tiempo de

desorción fue de 6,5 minutos; mientras que para cyprodinil y fludioxonil, de 5 minutos.

Para realizar el estudio de ocurrencia en muestras de fruta y poder cuantificar el

contenido de los fungicidas presentes, se utilizaron las ecuaciones correspondientes a las

curvas de calibración realizadas con matriz adicionada (IV.3.1.6.2), las cuales se

detallan en la tabla IV.40.

286

Tabla IV.40: Ecuaciones correspondientes a las curvas de calibración de arándano

adicionado

Fungicida Ecuación Azoxystrobin h=-10716800 + 847641000*ppm

Boscalid h=2,52894E7+5,26228E9*ppm

Cyprodinil h=-28175+1,00307E7*ppm

Fludioxonil h=-15398,9+2,09813E6*ppm

Pyraclostrobin h=-3184350+54145800*ppm

Utilizando estas ecuaciones, y multiplicando el resultado por mil, se pudo

determinar, en aquellas muestras que contenían los analitos, las concentraciones de los

mismos expresadas en µg de fungicida por kg de fruta. Los resultados del estudio se

detallan en la tabla IV.41. En las tablas VII.31 a VII.33 del Anexo se pueden observar

las respuestas cromatográficas para los distintos fungicidas.

Tabla IV.41: Ocurrencia de los fungicidas en estudio en muestras de arándano (µg/kg)

Muestra Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin 1 ND 133 104 136 ND

2 75 117 27 58 ND

3 117 19 3382 2405 ND

4 109 90 558 473 ND

5 ND 105 209 362 597

6 ND 86 2154 3671 843

7 71 21 2495 3409 1505

8 ND 26 3864 3251 ND

9 72 ND 24 53 ND

10 ND 5 80 88 1041

11 72 22 7066 ND 1320

12 69 ND 5174 ND 623

13 ND ND 47 106 ND

14 ND 30 58 128 1177

15 ND 1 43 2613 1719

16 ND 3 ND ND ND

17 ND 42 79 127 ND

18 72 ND 4482 268 ND

19 99 ND 48 2742 639

20 ND 142 116 3914 938

21 ND ND 6241 1900 ND

22 ND 74 350 238 1054

23 ND 102 60 59 531

24 ND ND ND ND 1520

25 ND ND 183 815 ND

26 ND 32 ND ND 1972

27 225 167 53 470 1443

28 261 ND ND ND ND

29 71 121 5086 4470 1222

30 ND 51 ND ND ND

287

Analizando la tabla IV.41 se puede destacar que además de una alta frecuencia

de aparición de los fungicidas (azoxystrobin 40%, boscalid 67%, cyprodinil 83%,

fludioxonil 77%, y pyraclostrobin 53%), existe co-ocurrencia de varios de ellos en la

misma muestra. Se calcularon las medias y medianas, reemplazando los valores no

detectados por cero, y en la tabla IV.42 se observan estos estadísticos para las 30

muestras, así como para las positivas. A efectos de analizar los resultados se incluyeron

los tiempos de vida media para cada fungicida en las dos variedades determinados en

este trabajo, y los tiempos de carencia de uso frecuente en el campo.

Tabla IV.42: Resultados de la ocurrencia de fungicidas en arándanos (µg/kg) y

parámetros relacionados con la degradación

� � Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

Media ��

Mediana � ��

Muestras totales

(n = 30) Max ��

N° ��

Media ��

Mediana ��

Muestras positivas

Min ��

Emerald �� Tiempo de vida media

(días) Jewel ��

Carencia (días) ��

Los promedios de las concentraciones de cyprodinil y fludioxinil detectadas en

el total de las muestras son 1399,4 y 1058,5 µg/kg, respectivamente, sin embargo, las

medianas son relativamente bajas (92 y 187 µg/kg, respectivamente). Pero se han

detectado muestras contaminadas con valores tan altos como 7066 y 4470 µg/kg para

estos compuestos, respectivamente. Estos valores pueden estar relacionados con los

tiempos de vida media determinados en este trabajo, (por ejemplo para la variedad

Jewel el tiempo de vida media es de 16,3 días) respecto a los días de carencia utilizados

en el campo, de sólo un día. Los productores no estarían dejando pasar el tiempo

necesario para que la concentración de residuos de estos fungicidas se reduzca a la

mitad, lo que se evidencia en las muestras comerciales. Por otro lado, lo mencionado

anteriormente se confirmaría ya que el azoxystrobin, que tiene un tiempo de carencia de

90 días, excesivamente alto en comparación con el tiempo de vida media para ambas

288

variedades estudiadas en esta tesis que no supera los 18 días, presentó la menor

concentración promedio de contaminación (43,8 ppb).

IV.3.4.2. Jugos de arándano y complejos vitamínicos

Previamente, se verificó la factibilidad de utilización del método desarrollado

para arándanos en estas otras matrices.

Se adicionaron muestras de jugo y vitaminas con 0,05 ppm de azoxystrobin,

boscalid, cyprodinil y fludioxonil; y 0,5 ppm de pyraclostrobin. Se realizaron 10

mediciones de cada analito a dichas concentraciones. Las respuestas cromatográficas,

medidas en altura de pico, se compararon con las correspondientes a fruta adicionada a

la misma concentración, empleando para ello el software Statgraphics Centurion XV.

En las tablas VII.34 y VII.35 del Anexo se detallan las respuestas cromatográficas para

los distintos fungicidas, para el jugo y el complejo vitamínico. Del análisis de los

resultados se pudo observar que no existían diferencias significativas (p > 0,05), con

una confianza del 95%, entre las medias, medianas, desviaciones estándar y

distribuciones, de las dos series correspondientes a jugo y vitaminas. Los 5 fungicidas

estudiados mostraron el mismo comportamiento. Por estas razones se decidió utilizar las

ecuaciones de las curvas de calibración obtenidas con arándano adicionado, que se

detallan en la tabla IV.40.

Utilizando estas ecuaciones y multiplicando el resultado por mil, se pudo

determinar, en aquellas muestras que contenían los analitos, las concentraciones de los

mismos, expresadas en µg de fungicida por kg de fruta. Los resultados del estudio se

detallan en la tabla IV.43. En la tabla VII.36 del Anexo se detallan las respuestas

cromatográficas para los distintos fungicidas.

Analizando la tabla IV.43 se puede observar que existe co-ocurrencia de

boscalid, cyprodinil, fludioxonil y pyraclostrobin en los jugos analizados, y de

cyprodinil, fludioxonil y pyraclostrobin en los complejos vitamínicos.

Se calcularon las medias y medianas para todas las muestras, reemplazando los

valores no detectados por cero, y para las positivas. Se observan estos estadísticos en las

tablas IV.44 y IV.45 para las muestras de jugo y de complejos vitamínicos.

289

Tabla IV.43: Ocurrencia de los fungicidas en estudio en muestras de jugo de arándano

y vitaminas con extracto de arándano (µg/kg)

Fungicida Jugo de arándano Vitamina con extracto de arándano ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

Azoxystrobin

ND ND

140 ND

452 ND

687 ND

105 ND

Boscalid

23 ND

1073 3003

291 2463

ND 2679

1750 2424

Cyprodinil

1411 3121

3033 6638

850 3900

ND 3286

5081 2554

Fludioxonil

4098 9276

7529 6161

ND 5639

5439 ND

6236 ND

Pyraclostrobin

ND 6862

Tabla IV.44: Resultados de la ocurrencia de fungicidas en jugos de arándanos (µg/kg)


Media � ��

Mediana � ��

Muestras totales

(n = 30) Max � ��

N° � � ��

Media � ��

Mediana � ��

Muestras positivas

Min � ��

290

Tabla IV.45: Resultados de la ocurrencia de fungicidas en complejos vitamínicos

(µg/kg)


Media � � ��

Mediana � � ��

Muestras totales

(n = 30) Max � � ��

N° � � � � ��

Media � � ��

Mediana � � ��

Muestras positivas

Min � � ��

Como se mencionó en el punto anterior, puede observarse que azoxystrobin fue

negativo en las muestras de jugo y complejo vitamínico debido probablemente al

excesivo tiempo de carencia en comparación con el tiempo de vida media determinado

en esta tesis. Nuevamente, cyprodinil y fludioxonil se encontraron en concentraciones

elevadas, con una media de 2738 y 5130, 8 µg/kg, respectivamente, estando presente

como contaminación en todas las muestras analizadas de ambos subproductos.

Las contaminaciones presentes en el complejo vitamínico para cyprodinil,

fludioxonil y pyraclostrobin, son mayores que los presentes en la fruta fresca,

probablemente porque se concentran en la elaboración de este producto.

Los niveles del fungicida pyraclostrobin, para el jugo con una media de 3840,8

µg/kg, en comparación con la contaminación en arándano son mayores. Si bien el

tiempo de carencia utilizado por los productores arandaneros para este compuesto se

aproxima a los tiempos de vida media establecidos en esta tesis para ambas variedades

de arándanos (5,5 días para Emerald y 8 días para Jewel), no hay que olvidar que esta

elevada contaminación de los subproductos puede ser atribuida a la utilización para su

elaboración de fruta de descarte.

291

V. CONCLUSIONES

Se describen por primera vez cepas aisladas pertenecientes a los géneros

Arthrinium, Eurotium, Geotrichum, Trichocladium.

Los arándanos de la Región de Salto Grande presentan mayor probabilidad de

sufrir podredumbres por Alternaria y antracnosis, ya que se encontró una gran

ocurrencia de cepas de Alternaria tenuissima y A. alternata, seguido de

Colletotrichum gloeosporioides entre la micoflora aislada en ambas cosechas.

Los siguientes hongos fueron aislados e identificados por primera vez en

arándanos en Argentina: Alternaria alternata, Alternaria vaccinii, Arthrinium

phaeospermum, Aspergillus flavus, Cladosporium cladosporioides, Curvularia

lunata, Epicoccum nigrum, Eurotium chevalieri, Fusarium graminearum,

Fusarium semitectum, Fusarium verticillioides, Geotrichum candidum, Mucor

racemosus, Penicillium citrinum, Trichoderma harzianum y Trichocladium spp.

Se encontraron diferencias en la resistencia a la contaminación fúngica por las

distintas variedades de arándanos analizadas. La variedad Jewel fue la más

susceptible.

La capacidad de producir toxinas por los hongos aislados de los arándanos

mostró que existe probabilidad de contaminación por fumonisinas, toxinas de

Alternaria, y en menor medida por aflatoxinas, tricotecenos y zearalenona.

Estudios posteriores serán necesarios para confirmar la identidad de las

fumonisinas producidas por Aspergillus niger.

La microextracción en fase sólida por inmersión directa permitió cuantificar

trazas de azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil y pyraclostrobin en

arándanos, permitiendo emplear agua como solvente de extracción, con el

consecuente ahorro económico y la disminución de la utilización de solventes

orgánicos.

292

La cuantificación de azoxystrobin, boscalid, cyprodinil, fludioxonil y

pyraclostrobin en arándanos y productos elaborados con esta materia prima,

debe realizarse a partir de curvas de calibración de la matriz adicionada con los

distintos pesticidas.

Las metodologías desarrolladas son precisas y exactas, con adecuada resolución,

y bajos LOD y LOQ comparados con los límites máximos de residuos

permitidos en los distintos países importadores.

La degradación de los fungicidas a campo, en las variedades de arándano

Emerald y Jewel, siguió una cinética de primer orden, realizándose el ajuste

mediante un modelo exponencial, presentando coeficientes de regresión R2

mayores a 0,96.

El tiempo de vida media es importante desde dos puntos de vista. En primer

lugar, permite conocer el período de tiempo durante el cual el cultivo estará

protegido de las enfermedades fúngicas para las que se utiliza el fungicida. Y en

segundo lugar, por los costos vinculados a aplicaciones sucesivas innecesarias.

Los fungicidas en la variedad Emerald mostraron tiempos de vida media

menores que en la variedad Jewel, desde 50% para boscalid hasta 79% para

fludioxonil, evidenciando la necesidad de diagramar las aplicaciones de

fungicidas dependiendo de la variedad.

Las cinéticas de degradación estudiadas permitirán al productor arandanero

modificar los tiempos de carencia, ya que por ejemplo para azoxystrobin es

excesivamente alto, imposibilitando su utilización 90 días antes de la

comercialización de la fruta; mientras que para fludioxonil, un día de período de

carencia no es suficiente para asegurar una adecuada degradación del mismo ya

que los tiempos de vida media son de al menos 12 días, con el riesgo comercial

y para el consumidor que esto supone.

Los estudios preliminares de la distribución de los pesticidas durante la

elaboración de jugo de arándano a escala laboratorio, son promisorios para

reducir la contaminación del jugo a través de la eliminación por el agua de

lavado y escaldado, con un porcentaje superior al 25% para todos los fungicidas

293

empleados. Es conveniente comprobar si este efecto se manifiesta en el proceso

industrial de elaboración de jugo.

La frecuencia de ocurrencia de los fungicidas en fruta fresca fue elevada

(azoxystrobin 40%, boscalid 67%, cyprodinil 83%, fludioxonil 77%, y

pyraclostrobin 53%), existiendo co-ocurrencia de varios de ellos en la misma

muestra.

Azoxistrobin fue el fungicida con menor ocurrencia en las distintas muestras

comerciales de arándanos, debido probablemente al excesivo tiempo de carencia

en comparación con el tiempo de vida media determinado en esta tesis. Presentó

la menor concentración promedio de contaminación en fruta fresca (43,8 g/kg),

y no fue detectado en muestras de jugo y complejo vitamínico.

Las concentraciones de cyprodinil y fludixonil en fruta fresca, jugo y complejo

vitamínico fueron elevadas probablemente por el corto tiempo transcurrido entre

la última aplicación en campo y la comercialización o utilización en la industria.

La utilización de fruta de descarte en la elaboración de productos derivados de

arándanos puede explicar la elevada concentración de algunos de los fungicidas

presentes en los jugos y complejos vitamínicos, como pyraclostrobin.

Se requieren estudios para conocer el efecto de los fungicidas, en la medida que

estos se degradan, sobre la acumulación de micotoxinas.

La transferencia al sector productivo de los conocimientos adquiridos en este

trabajo de tesis, permitiría un manejo integrado de la cadena de valor del

arándano, logrando reducción de pérdidas, favoreciendo la exportación y

reduciendo el riesgo para el consumidor.

294

VI. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

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326

VII. ANEXO

Tabla VII.1: Velocidad de agitación para estándares de 0,025 ppm de pyraclostrobin, boscalid y azoxystrobin

rpm Pyraclostrobin Boscalid Azoxystrobin

Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos

0


1867221 193498 Desv. Est. 347336009 1448743 Desv. Est. 68664115 1223294 Desv. Est.

2084957 10 RSD% 345966128 0,4 RSD% 70329016 2 RSD%

50



3931697 3 RSD% 453136992 8 RSD% 74019007 4 RSD%

100



4429144 3 RSD% 489315851 5 RSD% 77473795 3 RSD%

150



5109278 1 RSD% 625288418 0,5 RSD% 94090890 6 RSD%

200



5766573 8 RSD% 622354964 7 RSD% 98007299 5,84 RSD%

327

Tabla VII.2: Velocidad de agitación para estándares de 0,01 ppm de cyprodinil y fludioxonil

rpm

Cyprodinil Fludioxonil

Altura Parámetros estadísticos Altura Parámetros estadísticos

0

133522 144865 Promedio 51552 44750 Promedio

144822 11365 Desv. Est. 43819 6388 Desv. Est.

156252 8 RSD% 38878 14 RSD%

50


188124 2147 Desv. Est. 116829 9779 Desv. Est.

188868 1 RSD% 118695 9 RSD%

100


247821 17463,929 Desv. Est. 125843 5315,63 Desv. Est.

282102 7 RSD% 134901 4 RSD%

150


376551 6929 Desv. Est. 150012 8304,81 Desv. Est.

375220 1,82 RSD% 166621 5 RSD%

200


759102 6750 Desv. Est. 156722 990 Desv. Est.

766000 1 RSD% 154743 1 RSD%

328

Tabla VII.3: Perfil de tiempos de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm de azoxystrobin, boscalid y pyraclostrobin

Tiempo Azoxystrobin Boscalid Pyraclostrobin

5 28449292 26056490 27500174 175994615 151031063 163772098 3456276 3549272 3420441

10 46767474 42840018 45091882 306689507 298110032 292031646 3972897 4309227 4289012

15 67045413 68969130 67619520 384686076 380529510 385881933 5363339 5205259 5092776

20 80658955 81787227 83649825 461069030 478659955 482110139 5799437 6619326 7069214

30 113646420 113972933 113091771 518370884 557734098 549001662 7658321 7801994 7913268

60 167837792 166269782 169021630 864830655 855180306 867599001 16198418 16481498 16362479

120 246768155 248100627 250416821 1107219331 1096417146 1010214317 21767577 20801783 20636611

180 260159298 259160266 261340521 1096247081 1172813007 1082513557 20925687 21277394 21047992

240 274879483 273686596 272830911 1132804252 1086900262 1101866188 21187938 21155212 21089261

480 269200418 276110363 278919427 1102243738 1159022741 1102573111 21692000 21495621 22007194

540 271910822 271907662 267551029 1130918332 1142938861 1162774098 21921083 20945913 21623008

600 271092744 272868441 278109444 1149107599 1090183883 1148212593 22025651 21931884 22283163

720 273710604 275109633 269103818 1168500781 1199636712 1080328910 22071574 21930662 23216992

329

Tabla VII.4: Perfil de tiempos de extracción de arándano adicionado con 0,1 ppm de cyprodinil y fludioxonil

Tiempo Cyprodinil Fludioxonil

5 335812 358101 339597 81772 83400 82712

10 753082 762944 751993 140266 142741 140917

15 1046771 1035116 1045914 194323 193812 194991

20 1625881 1723854 1610643 258018 261992 260522

30 2188515 2082518 2242752 417318 420381 418271

60 4713598 4690142 4728821 842772 852743 845990

120 7827663 7369007 7531773 1527921 1558219 1538090

180 7902663 7821660 7861072 1528113 1530464 1538322

240 8003631 8037441 8010932 1542272 1538092 1542115

480 8057244 8061742 8034881 1548266 1547026 1548827

540 8102616 8142173 8108442 1552089 1551831 1557749

600 8177183 8175329 8175998 1558312 1556014 1559021

720 8180218 8179388 8178821 1604623 1602774 1602487

Tabla VII.5: Curvas comparativas de boscalid en fruta adicionada extraída durante 15

y 120 minutos. Tiempo (min) Concentración (ppm) Altura

15

0,05 220607491 250255609 223348082

0,1 384686076 380529510 385881933

0,25 1405188875 1382881009 1402001473

0,4 2113702469 2105166397 2102570976

120

0,05 817700974 843259158 829903562

0,1 1107219331 1096417146 1010214317

0,25 2590071357 2510354926 2553265187

0,4 3808600135 3815499191 3862188464

Tabla VII.6: Tiempos de desorción para arándano adicionado a 0,1 ppm con pyraclostrobin, boscalid y azoxystrobin; 15 min extracción, 150 rpm y 250°C

temperatura de desorción

Tiempo desorción (minutos)

Pyraclostrobin Boscalid Azoxystrobin

5 4083621 524367444 84997499

5 4108375 527735348 85200394

5 4274699 514198475 85107099

6 5838644 598749002 92557365

6 5737920 602117465 92831773

6 5773601 592077546 92754203

6,5 6305783 622068795 98940042

6,5 6220050 622354964 98007299

6,5 6522989 615820618 98870187

7 6185793 615433793 97993732

7 6376483 622537789 98503799

7 6218673 618864533 99003874

330

Tabla VII.7: Tiempos de desorción para arándano adicionado a 0,1ppm con cyprodinil y fludioxonil; 15min extracción, 200rpm y 250°C temperatura de desorción

Tiempo desorción (minutos)


4 958522 168409

4 962007 169903

4 961937 172064

5 1024148 193584

5 1013881 190287

5 1007214 189955

6 997493 191763

6 1002637 190267

6 1017364 191830

7 969636 189640

7 1009903 187548

7 991384 190836

Tabla VII.8: Temperatura de desorción para arándano adicionado con 0,1 ppm de pyraclostrobin, boscalid, azoxystrobin, cyprodinil y fludioxonil

Temperatura (°C) Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

230 26546086 251864054 622098 98021 1933653

230 34398557 282810844 682485 93844 3250706

230 30995110 269066422 659001 90813 2543367

240 66226943 460137645 835189 138722 6305783

240 71353292 517108409 840137 150229 6220050

240 69033444 486671918 872771 146820 6522989

250 98940042 622068795 1024148 193584 4928224

250 98007299 622354964 1013881 190287 5766573

250 98870187 615820618 1007214 189955 5585944

260 62764993 458386002 769936 117390 4688692

260 61907353 447022376 782006 125003 4406753

260 60443620 437218663 752179 122253 4788653

Tabla VII.9: Análisis unidimensional y regresión lineal de estándares de azoxystrobin

Concentración de estándar de azoxystrobin (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,1

24363117 39270253 83835466 143170347 302700995

22036486 35788434 81316010 153339828 322653254

22813268 38397953 87120536 154542446 328196557

24205784 38306150 89534124 143290344 316574711

23774684 32104078 86274431 144469319 328996537

25029037 35513790 82207625 141721688 321475195

24065941 36168268 94408646 148204101 308453101

23334838 35324475 87686626 160052078 311685665

24366941 37747595 91399374 161108888 315357493

23386900 36401360 96284338 146470889 304723524

331

Tabla VII.10: Análisis unidimensional y regresión lineal de estándares de boscalid

Concentración de estándar de boscalid (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,075

68530778 186908751 353501428 687408340 1079267719

65598223 183849953 359814165 676819595 1051527003

68805944 189685375 356596713 672126953 1065117440

64320961 183824586 341035841 685317781 1076976746

62973203 185384719 359979016 672978331 1062831040

66251118 189180780 351668270 674365453 1077688847

66186686 172043788 348304522 680635380 1066378687

62393599 185088688 343149818 665034702 1078702690

65291161 176713545 350771056 685901887 1067649406

67591539 184542768 351604992 685628965 1069978886

Tabla VII.11: Análisis unidimensional y regresión lineal de estándares de pyraclostrobin

Concentración de estándar de pyraclostrobin (ppm)

0,05 0,1 0,25 0,5 1

9651472 32966715 109634249 300465561 653385830

9784832 33436142 109885458 318358832 667845183

9329906 32806650 108089525 308805308 678577441

9867015 33482677 106985288 291639124 677582120

9121199 33442962 109030017 305921011 661755809

9286958 33113207 109349995 303899737 677052558

9599185 33496456 108939589 307149555 657864943

9447951 32840320 99907377 302938632 652160642

9494421 32175841 103626582 303441995 677267820

9480182 33042581 99021674 305649146 678652248

Tabla VII.12: Análisis unidimensional y regresión lineal de estándares de cyprodinil

Concentración de estándar de cyprodinil (ppm)

0,005 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5

342901 752500 3515000 6742480 16514878 44876000

326891 766000 3297500 6902260 15381550 45030501

309111 759102 3376109 6892550 15932001 43310500

302612 742119 3452977 6721524 15941032 45721098

330189 745735 3179002 6792661 16023882 45217821

300276 720887 3220993 6872990 15298409 45561900

320712 703189 3465887 6900523 15503233 44001435

314772 720741 3109882 6821103 15243119 43821552

333890 731888 3250012 6982310 15209441 44409183

342076 758001 3092663 6924439 15389002 44310522

332

Tabla VII.13: Análisis unidimensional y regresión lineal de estándares de fludioxonil

Concentración de estándar de fludioxonil (ppm)

0,005 0,01 0,05 0,1 0,2 0,5

73430 155811 756900 1629177 4429623 11377700

75466 154743 744300 1577497 4583109 11328800

83099 156722 769511 1565210 4221044 11796400

88612 158921 736409 1553889 4209443 11300284

78902 153000 740132 1603774 4371023 11462882

82330 159621 736912 1609325 4357288 11739002

84510 154209 735009 1599366 4420001 11539043

79820 150992 742167 1587309 4390221 11376778

88209 155921 742977 1579800 4283599 11429643

78210 158090 753108 1612701 4291911 11372009

Tabla VII.14: Análisis unidimensional y regresión lineal de arándano adicionado con azoxystrobin

Concentración de arándano adicionado con azoxystrobin (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0,5 0,75

7573447 11165434 23775191 30411862 49740133 162062606 379359201 651842160

7577991 8842583 23320594 32272717 44684619 173454662 370422005 657951348

6788896 9005081 23607855 30865926 52089968 169887529 397271617 663720669

6594140 8523527 22898048 31726326 53471113 177498212 407925014 647481497

7385299 8770458 25913775 31054248 49830347 177984113 418262013 657897199

7148121 10502663 27234661 32113646 46767474 170647711 392362474 650788848

7700416 9286387 29585753 30359533 54226077 172202831 402748805 633993002

7539005 8997894 24134266 29817773 56285024 182992068 420078420 623012554

6593300 10047975 23779169 32080820 55942530 189091443 425110991 620008721

6422687 8837134 25445188 33206698 56774022 189886775 420882557 612240114

Tabla VII.15: Análisis unidimensional y regresión lineal de arándano adicionado con boscalid

Concentración de arándano adicionado con boscalid (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0,4

61785632 86341921 209974187 220607491 485623340 1405188875 2113702469

67129300 85841570 234734947 250255609 497718427 1382881009 2105166397

55369826 69126775 242015750 223348082 430723852 1402001473 2102570976

64413950 72811484 219522072 244406826 467983435 1344185052 2110457027

55623077 76025801 247744355 227513308 467752062 1458689460 2107473929

58920422 69870054 230162525 235285675 486940821 1456845380 2104831053

59821077 81785632 238957779 223690674 499936055 1456651104 2106767440

62600666 67129300 251323703 247732005 496665220 1370975543 2103973082

60081649 75369826 190856672 225626356 498870069 1368805466 2117558072

62861759 75000326 190680884 233477990 497741124 1409907753 2108967995

333

Tabla VII.16: Análisis unidimensional y regresión lineal de arándano adicionado con pyraclostrobin

Concentración de arándano adicionado con pyraclostrobin (ppm)

0,05 0,1 0,25 0,5 1 3 5

1731308 4426726 14997365 23564908 48419564 161217655 265491257

1722139 4792519 14711333 27002431 49444451 149672224 269689110

1788321 4477543 12840212 27853382 46546058 150443009 276066132

1866501 4668900 14730212 23307432 49960003 155035920 264217384

1958467 4675466 12854939 26869169 49829662 151333908 272821184

1990115 4990112 13444887 27770727 48838994 152776228 274957071

2100599 4632099 12983441 25843992 48682901 159442000 262464068

1944665 4999023 15009865 25757212 50766332 159220188 268254684

1847409 4870224 12999810 23990556 52443776 149990224 269805552

2004652 4761020 14650009 24699854 51246644 165708467 276652210

Tabla VII.17: Análisis unidimensional y regresión lineal de arándano adicionado con cyprodinil

Concentración de arándano adicionado con cyprodinil (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5

19298 46388 235234 472008 740811 1024148 2461932 4991637

18209 48474 193529 502944 762008 1013881 2391002 5010338

17821 42743 214874 480228 772091 1007214 2392201 5018900

18431 47732 217332 512833 756198 1037721 2421442 5047992

17009 46239 203844 492011 746612 1002332 2394339 5021533

18202 45987 226109 500388 739992 998215 2450133 5081242

17385 46110 217202 471912 738710 1003844 2418989 4983009

18399 45621 204221 490155 742906 989443 2394994 4958214

17644 43811 217430 482999 750118 1016277 2409112 5040116

17439 42644 222477 490223 765291 1025664 2452325 4901431

Tabla VII.18: Análisis unidimensional y regresión lineal de arándano adicionado con fludioxonil

Concentración de arándano adicionado con fludioxonil (ppm)

0,005 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5

1783 4682 43553 78029 152150 193584 514092 1047821

1821 3467 38797 75200 150321 190287 500217 1027311

1733 4203 40821 77162 153088 189955 504801 1037272

1802 3688 41833 73091 150271 188720 509166 1024887

2231 4009 38999 79225 152888 195510 512993 1030212

1921 4167 39200 74510 149211 192721 514392 1042565

2090 3871 41773 77519 147098 189962 511002 1038921

2156 3688 38115 74575 147935 190217 499824 1028867

2002 4081 39012 74318 149021 188892 499891 1031711

1832 3790 42781 76762 152882 195021 500217 1043923

334

Tabla VII.19: Respuesta cromatográfica en altura (Señal y Ruido) para el cálculo de límites de detección y cuantificación

Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

Señal Ruido Señal Ruido Señal Ruido Señal Ruido Señal Ruido

19622400 573216 87793952 1139488 378529 4829 188140 1080 24963488 951456

21996512 562400 92477152 1729984 378707 1739 194987 366 28301056 1877120

20499321 439301 98261632 1226976 368290 2081 209518 527 28782816 1880608

21499032 558143 89940256 1491680 386210 3962 218330 499 27231456 572288

22177338 190214 107596992 1790976 350912 2892 201172 320 28324064 389056

23417553 609177 124536928 2525408 333510 1920 170921 598 28277088 785856

22236128 179392 108744384 2123232 371032 2762 226442 771 28757888 1074848

23070976 666464 119869184 1585568 390115 2831 210311 390 27856608 1030784

23206432 651232 117957472 2338304 382809 1902 228410 412 27053632 509088

24925088 792544 112825280 2801600 358813 3922 208142 331 27703840 489568

Tabla VII.20: Respuesta cromatográfica para la determinación de la recuperación del método analítico

Azoxystrobin Boscalid Pyraclostrobin Cyprodinil Fludioxonil

Concentración Altura Concentración Altura Concentración Altura Concentración Altura Concentración Altura

0,01ppm

9817586

0,01 ppm

71934636

0,1 ppm

4928224

0,01 ppm

47324

0,01 ppm

4001

10361525 77712097 5066573 46214 3983

9779187 73211518 5085944 43772 3926

0,1ppm

53202250

0,1 ppm

524841083

1 ppm

47564642

0,1 ppm

998416

0,1 ppm

189426

52736406 501910978 46966103 1012528 192309

53886098 480820618 49003185 1007528 189440

0,75ppm

635308499

0,4 ppm

2073902033

5 ppm

275759562

0,5 ppm

4944972

0,5 ppm

1002737

642336765 2066850163 262953332 5090118 1035882

640812531 2069773009 278008123 5190021 1019426

335

Tabla IV.21: Respuesta cromatográfica de cada fungicida en el producto técnico Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

151862881 356738992 2481021 205254 47399822

148927565 354039892 2439822 203792 46992001

150991672 357734688 2440993 203888 47290388

153092662 355739020 2490281 205612 45209842

150726336 356287749 2399585 206773 47294005

Tabla VII.22: Curva de calibración para estudio de degradación de azoxystrobin, cyprodinil y fludioxonil en arándanos variedad Emerald y Jewel

Azoxystrobin Cyprodinil Fludioxonil

Adición (ppm) Emerald Jewel Emerald Jewel Emerald Jewel

0,01 3384549 1030771 50376 72883 6367 4376

0,01 3286906 1780607 49317 71298 6598 4317

0,01 3581309 1379162 48982 71988 6338 4982

0,1 49839809 72051405 1027812 1438220 240877 207812

0,1 48112513 70808042 1102837 1418843 241023 204837

0,1 51495885 71641662 1011621 1398322 240998 211621

0,5 284350300 465697794 5372558 5690324 1539004 1372558

0,5 297607579 463881778 5092774 5710346 1546733 1392774

0,5 280170968 464731741 5153624 5698021 1538900 1353624

336

Tabla VII.23: Datos de degradación de azoxystrobin en arándanos variedad Emerald y Jewel

Emerald Jewel

R Altura Altura

0

216896084 204754990

214780119 200986332

217210441 203800221

10

119975279 110533798

118797892 110033843

115210388 111333843

16

82044132 90338827

80134668 91745332

81200914 90998221

21

59062049 70889443

59396356 69332775

59788101 69062884

27

45235276 56998668

45001353 54900332

44977194 54733098

31

38561906 45822093

33342712 44832009

37882775 45289122

36

24924480 24875009

22592534 23911032

23576081 24377854

41

20521895 18663091

19794142 18002834

19835037 17982011

48

9422537 8021664

11510816 8210773

10122849 8259001

57

7468309 4887997

7382755 4521021

7560219 4673444

66

5621447 902177

5367130 907552

5451069 878008

69

4712955 592116

4756210 525663

4781441 530076

337

Tabla VII.24: Curva de calibración para estudio de degradación de boscalid en arándanos variedad Emerald y Jewel

Boscalid

Adición (ppm) Emerald Jewel

0,01 24859661 10285739

0,01 36898902 10366607

0,01 38644260 9528373

0,1 309114160 570803446

0,1 322424375 578080756

0,1 328991910 574130598

0,4 1756087844 2089651131

0,4 1792557160 2092158174

0,4 1697486117 2091137492

Tabla VII.25: Datos de degradación de boscalid y pyraclostrobin en arándanos variedad Emerald y Jewel

Boscalid Pyraclostrobin

Emerald Jewel Emerald Jewel

R Altura Altura Altura Altura

0

2396938649 988317732 10488734 11087443

2419441730 1003993498 10042885 11820387

2408601773 998922415 9989331 11372932

1

2078199590 643096286 8903884 8236081

2047107144 645196899 9132866 8432921

2087904374 646887002 9043844 8242990

3

1545589673 508468940 7294032 6103672

1585551973 499481842 7200974 6082012

1574592620 509622711 7253911 5992743

4

1417035703 455021874 6602853 5107312

1410842889 460127335 6593885 5078103

1419833209 462092772 6579321 5021663

6

971681813 402777028 5490322 3610361

980098121 398352726 5548933 3681433

980137880 399410301 5559300 3590229

10

678129733 369353429 4537744 2268389

636570066 373081025 4609221 2230836

614490444 375882512 4597822 2189209

15

209743243 120574086 3409518 1284533

289063017 121013744 3398409 1258254

292858228 120745813 3462092 1270316

20

116584821 96632821 3000941 199843

113449120 85200719 2921033 198321

125009422 93401559 2952863 186326

338

Tabla VII.26: Curva de calibración para estudio de degradación de pyraclostrobin en arándanos variedad Emerald y Jewel

Pyraclostrobin

Adición (ppm) Emerald Jewel

0,05 1950484 1741665

0,05 2005723 1782263

0,05 1970322 1871773

0,1 4732885 4281953

0,1 4755009 4698113

0,1 4684492 4716388

1 14839022 118387306

1 15092990 118521552

1 14812844 118330965

3 40896224 406233121

3 40098066 406266390

3 40525662 406001773

339

Tabla VII.27: Datos de degradación de cyprodinil y fludioxonil en arándanos variedad Emerald y Jewel


Emerald Jewel Emerald Jewel

R Altura Altura Altura Altura

0

5592605 6132249 88432 57390

5515802 6139088 89443 58294

5526601 6121774 90443 59002

1

4089202 5395732 80092 45929

4062081 5297400 79442 45389

4062180 5350211 79621 45852

2

3218036 4393021 72633 41447

3204034 4344309 71983 41290

3209902 4320301 71274 41885

4

1879290 2787332 59887 33909

1802018 2720994 59293 33024

1889210 2700318 58843 33904

5

1154084 2000382 54159 29159

1172504 2098321 54114 29114

1167201 2088621 54218 29218

7

450687 1473288 48382 24382

420007 1469742 48492 24492

432802 1460063 48894 24894

9

356808 1219940 40665 17490

347205 1212133 40087 18032

356604 1213290 39788 17883

11

210405 809437 30233 12546

207701 899843 29833 12338

215106 803243 29200 12779

14

87333 608232 10837 8334

87110 604472 11864 7993

89832 603391 10449 8021

17

24557 372130 5832 1912

39842 377163 5630 1903

37764 372108 5773 1883

340

Tabla VII.28: Respuesta cromatográficas (altura) de las corrientes intervinientes del proceso de elaboración de jugo de arándano (jugo 1)

Muestra Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

Fruta aplicada

34266750 852244082 7349459 1227330 19642923

35693202 878442131 7637249 1227772 19858811

36209487 880923661 7475283 1276253 19473782

Fruta escaldada

23278911 610669995 5084305 409496 9095402

22839160 607205494 5028473 381884 9015810

23093294 603573209 5053722 391732 9147483

Agua escaldado

150773689 3182336160 30335844 10284408 130732884

151482649 3043553298 29847300 10084722 129418476

149038727 3187387227 31036842 10808437 131325432

Torta de prensado

50453275 981862112 5812634 899018 18792300

50968749 980947307 5850099 846830 20948436

50842266 981729941 5674832 873009 21355279

Jugo

59779094 2150485580 25030359 2324382 30525132

59632112 2152848435 25062009 2376008 27339213

59287933 2151883602 25162881 2351884 29537721

Tabla VII.29: Respuesta cromatográficas (altura) de las corrientes intervinientes del proceso de elaboración de jugo de arándano (jugo 2)

Muestra Azoxystrobin Boscalid Cyprodinil Fludioxonil Pyraclostrobin

Fruta aplicada

47724009 1087228540 9004773 1567783 23847992

45838976 1058221089 9072932 1598026 23286229

46738482 1067999002 9166300 1577836 23096221

Fruta escaldada

32763522 819209773 6189300 568339 11635282

33005632 807827215 6109113 559032 12288648

33884390 810332776 6177309 566322 12097398

Agua escaldado

170474223 3376583992 38746291 12203722 142553772

163342428 3358667091 37009421 12363286 141863552

169980302 3379981103 37021445 12190732 142973588

Torta de prensado

72622049 1687441882 6482007 1143863 27648003

72721130 1683855420 6509234 1276493 27463779

71893022 1668225921 6512896 1227846 27974663

Jugo

98993246 2473891772 31885793 2966588 37553466

98984359 2470993446 31222748 2974588 37886637

98932244 2471209873 31590732 3000896 36998632

341

Tabla VII.30: Respuestas cromatográficas para calibración en elaboración de jugo de arándano

Concentración (ppm) 0,001 0,005 0,01 0,025 0,05

Azoxystrobin

1514689 6263771 10522908 25802110 52982004

1515598 5802993 11093221 24982115 53931326

1357779 6021633 10843772 25022665 51289077


Boscalid

215621337 269832663 441214982 1390731662 2010377750

207921002 260266731 500511218 1402773071 2065762018

218037119 264672990 476696164 1399309182 2004002946


Cyprodinil

753009 3463076 6735411 16856200 34389442

759812 3361132 6595000 17255650 35822430

761230 3470270 6752218 17231375 35090226


Fludioxonil

72458 150832 756210 1549002 11652956

74612 152411 754980 1557621 11589021

76823 151730 755721 1560865 11247484

Concentración (ppm) 0,1 0,5 1 3 5

Pyraclostrobin

4275008 27445701 49273119 169468474 270417882

4581290 29713617 47812035 173055578 269809100

4291331 27760766 48200188 162911203 270992554

342

Tabla VII.31: Ocurrencia de azoxystrobin y boscalid en muestras comerciales de arándano

Muestra Azoxystrobin Boscalid

Altura Altura

1 ND ND ND 150923858 178256390 165667312

2 1595430 1987800 2555847 130267130 165495032 149543332

3 8912140 9023008 9144183 43409397 47553109 44216634

4 8735175 6829316 7784963 110664632 128771384 120933771

5 ND ND ND 115839635 155573375 136231309

6 ND ND ND 121152434 108015352 116737201

7 1322402 1355075 1387027 48350019 45873937 46921002

8 ND ND ND 51452017 54659460 52883176

9 1446228 1678225 1302083 ND ND ND

10 ND ND ND 30226276 31410992 30918772

11 1423618 1429011 1426885 47319060 49801013 47812505

12 944854 1066024 998023 ND ND ND

13 ND ND ND ND ND ND

14 ND ND ND 56854079 56131654 57794510

15 ND ND ND 27172377 26941435 26090388

16 ND ND ND 29128817 29683537 24989550

17 ND ND ND 71372389 69125345 69068781

18 1522071 1560114 1544401 ND ND ND

19 6013615 5960118 6277142 ND ND ND

20 ND ND ND 175863553 173990721 175012885


22 ND ND ND 102886241 103552288 103421774

23 ND ND ND 132887209 131337424 132109228



26 ND ND ND 58210337 59712889 59012887

27 23407280 29529726 29154523 201882178 200054890 202119733

28 33284120 31806480 35412851 ND ND ND

29 1336658 1017706 1368938 152098226 151882476 152883712

30 ND ND ND 78098213 80221637 79661773

343

Tabla VII.32: Ocurrencia de cyprodinil y fludioxonil en muestras comerciales de arándano

Muestra Cyprodinil Fludioxonil

Altura Altura

1 182562 178320 180512 41859 40281 42389

2 26605 25388 26091 9153 9087 9134

3 6540500 6927000 6802500 909000 970500 1102000

4 1110000 1074500 1089000 173500 182500 193500

5 449000 362500 362500 142000 120500 147500

6 4120500 4233000 4525500 1400000 1487500 1687000

7 5047000 5007500 4875500 1516500 1478000 1251000

8 7805500 7864500 7500500 1147500 1443000 1455500

9 24264 16662 20334 6644 7032 7373

10 132291 130662 131762 21634 20821 22638

11 14221943 14039100 14183019 ND ND ND

12 10462770 10293661 10298441 ND ND ND

13 65445 66779 65384 29486 29537 28903

14 85586 91408 86742 38592 38739 37853

15 57272 59021 58263 1074788 1089478 1078992


17 129037 131007 130661 37649 38098 38243

18 9003217 8893221 8990837 98038 99112 93872

19 66288 68021 68743 1129470 1135733 1139937

20 204181 202873 203653 1622447 1630983 1627382

21 12885633 12023776 12568289 783114 780993 781132

22 672000 675992 672746 83210 85580 84627

23 90202 93555 91088 9218 9336 9329


25 339110 338909 340027 327465 320932 330974


27 77264 77728 76221 183223 180387 182273


29 10746999 9825667 9950221 1866072 1852003 1862338


344

Tabla VII.33: Ocurrencia de pyraclostrobin en muestras comerciales de arándano

Muestra Pyraclostrobin

Altura

1 ND ND ND

2 ND ND ND

3 ND ND ND

4 ND ND ND

5 3250950 3309889 3287512

6 5908212 6017733 5899264

7 12990372 13245886 13109811

8 ND ND ND

9 ND ND ND

10 8103771 8022937 8133218

11 11102889 11073284 11163909

12 3800117 3289001 3580182

13 ND ND ND

14 9120442 9167823 10382908

15 15921664 15289221 15072942

16 ND ND ND

17 ND ND ND

18 ND ND ND

19 3888210 3582448 3721999

20 6902111 7017731 7001823

21 ND ND ND

22 8217333 8263210 8207362

23 2572444 2609264 2499264

24 13001663 13347690 13478594

25 ND ND ND

26 18002741 18529066 17992611

27 12829100 12383277 12128029

28 ND ND ND

29 10027211 9998212 10121882

30 ND ND ND

Tabla VII.34: Jugo y vitaminas adicionadas con 0,05 ppm de azoxystrobin y boscalid, y 0,5 ppm de pyraclostrobin

Azoxystrobin Boscalid Pyraclostrobin

Jugo Vitamina Jugo Vitamina Jugo Vitamina

28635118 30183443 237882098 228974681 24898721 26837882

32086352 27981938 228037361 218628290 27009137 22873629

30881553 32846221 225431789 208365511 26982011 27082674

29200512 29021874 237006001 230975251 24091383 24887620

31662725 31887312 244276881 241266410 28763999 24007822

32390812 31997400 230882191 239051874 26101772 23867299

30190021 29848110 231867200 229980143 24990089 26972699

29572188 30012874 240981900 240117559 25092177 24862991

30616333 30581120 238089116 232117882 26636781 25023174

31028442 31736992 242007917 237275143 26333674 23726532

345

Tabla VII.35: Jugo y vitaminas adicionadas con 0,05 ppm de cyprodinil y fludioxonil


Jugo Vitamina Jugo Vitamina

501773 480734 75210 73008

489098 500290 73947 77865

500277 472887 77821 78932

487214 488892 78990 76219

492774 478291 75218 74883

498010 492024 79021 74117

488288 498184 77462 75884

487025 460184 74928 77277

496552 482140 76778 78439

490288 489290 78645 75935

Tabla VII.36: Ocurrencia de los fungicidas en muestras de jugo y vitaminas con extracto de arándano

Fungicida Jugo de arándano Vitamina con extracto de arándano

Altura Altura

Azoxystrobin

ND ND ND ND ND ND

ND ND ND ND ND ND

ND ND ND ND ND ND

ND ND ND ND ND ND

ND ND ND ND ND ND

Boscalid

67712538 70893277 69423556 ND ND ND

1,63E+08 168735009 172105322 ND ND ND

2,41E+08 237211092 240067273 ND ND ND

58626009 57996110 58210983 ND ND ND

32875611 32108922 32564188 ND ND ND

Cyprodinil

616909 617921 617266 445730 460092 455722

145621 147772 146909 363895 367210 370117

ND ND ND 399157 401632 404721

1023771 1025674 1025742 345461 367991 369016

821081 820909 821882 468801 472001 477526

Fludioxonil

365882 367119 366261 205672 208632 207998

89012 92853 93009 114517 115528 116542

ND ND ND 93283 96710 94772

622856 625431 624444 69208 71862 69962

500636 499614 501213 286352 301652 300017

Pyraclostrobin

21494443 21337819 20998212 2220044 2047662 2190773

ND ND ND 1652009 1762911 1688421

13775082 15342001 14338991 ND ND ND

16990652 17218003 17019772 ND ND ND

ND ND ND 2808628 2773661 2698221

Arándanos: micoflora contaminante, micotoxinas, residuos...

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