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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA PEROXIDASA Y

POLIFENOLOXIDASA EN DOS VARIEDADES DE FRESA (Fragaria x ananassa

var. Chandler y Sweet Charlie) DURANTE ESTRÉS POR BAJAS TEMPERATURAS

ARLET SORAYA HERNÁNDEZ ROMERO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

Bióloga

LAURA E. CERÓN R.

Química Msc Microbiología

Universidad Nacional de Colombia

Directora

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGÍA

Bogotá, D. C

(27 de junio de 2006)

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario

al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales

contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la

justicia”

CARTA DE AUTORIZACIÓN DE LOS AUTORES PARA CONSULTA Y PUBLICACIÓN ELECTRÓNICA

Bogotá, 6 de Septiembre de 2006

Señores

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Ciudad

Estimados Señores:

Yo Arlet Soraya Hernández Romero identificada con C.C. No. 52.952.942 de

Bogotá, autora del trabajo de grado titulado “Evaluación de la actividad enzimática

peroxidasa y polifenoloxidasa en dos variedades de fresa (Fragaria x ananassa var.

Chandler y Sweet Charlie) durante estrés por bajas temperaturas”, presentado como

requisito para optar al título de Bióloga en el año de 2006; autorizo a la Pontificia

Universidad Javeriana a:

a) Reproducir e trabajo en medio digital o electrónico con el fin de Ofrecerlo

para la consulta en la Biblioteca General. SÍ

b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web

de la Facultad, de la Biblioteca General y en redes de información con las

cuales tenga convenio la Universidad Javeriana. SÍ

c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea

seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado. SÏ

d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades

educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de

información, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de

documentación de las respectivas entidades. SÏ

e) Todos los usos, que tengan finalidad académica. SÏ

Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo

establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión

Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables

e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante

cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su autor. Este documento se

firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor pacte con la Unidad Académica

referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan

surgir de la actividad académica.


C.C. No. 52.952.942 de Bogotá


POLIFENOLOXIDASA EN DOS VARIEDADES DE FRESA (Fragaria x

ananassa var. Chandler y Sweet Charlie) DURANTE ESTRÉS POR BAJAS

TEMPERATURAS


APROBADO

________________________________ ________________________________

Laura Cerón Rincón, Química Jorge Robles Camargo. Biólogo MSc. Microbiología Ph. D. Productos Naturales y Farmacia Directora Co-Director

____________________________ ______________________________ José Salvador Montaña Wilson Terán

Jurado Jurado


POLIFENOLOXIDASA EN DOS VARIEDADES DE FRESA (Fragaria x

ananassa var. Chandler y Sweet Charlie) DURANTE ESTRÉS POR BAJAS

TEMPERATURAS


APROBADO

___________________________ ____________________________ Angela Umaña Muñoz, Bióloga Ph.D Andrea Patricia Forero, Bióloga

Decana Académica Directora de Carrera

FORMATO DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO

AUTOR

Apellidos Nombres

HERNÁNDEZ ROMERO

ARLET SORAYA

DIRECTORA

Apellidos Nombres

CERÓN RINCÓN

LAURA EMILIA

CO-DIRECTOR

Apellidos Nombres

ROBLES CAMARGO

JORGE ELIÉCER

TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE: BIÓLOGA.

TÍTULÓ COMPLETO DEL TRABAJO: “EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA PEROXIDASA Y POLIFENOLOXIDASA EN DOS VARIEDADES DE

FRESA (Fragaria x ananassa var. Chandler y Sweet Charlie) DURANTE ESTRÉS

POR BAJAS TEMPERATURAS.

FACULTAD: CIENCIAS BÁSICAS.

PROGRAMA: CARRERA.

NOMBRE DEL PROGRAMA: BIOLOGÍA.

CIUDAD: BOGOTÁ. AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: 2006.

NÚMERO DE PÁGINAS: 121.

TIPO DE ILUSTRACIONES:

- Tablas, gráficos y diagramas.

- Fotografías.

DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES: Aclimatación, estrés por bajas

temperaturas, Fragaria x ananassa, peroxidasa, polifenoloxidasa.

RESUMEN DEL CONTENIDO: Se estudió el efecto de las bajas temperaturas sobre

las actividades enzimáticas peroxidasa (POX) y polifenoloxidasa (PFO) en plantas

de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (Susceptible al estrés por frío) y Sweet

Charlie (Tolerante al estrés por frío). El trabajo involucró dos experimentos: el

primero consistió en exponer las plantas de seis semanas de edad previamente

aclimatadas por 15 días y sin aclimatación, a 4ºC y -2ºC por períodos cortos de

tiempo (60 minutos) y el segundo, consistió en exponer las plantas a 4ºC y -2ºC por

períodos prolongados de tiempo (ocho días).

DEDICATORIA Dedico este trabajo a mis padres, a mis hermanos y a Felipe Morales,

quienes siempre me han acompañado en mi formación personal y académica y han

sido mi motivación para culminar con éxito este logro profesional.

AGRADECIMIENTOS

La autora quiere expresar sus agradecimientos a:

Dr. LUZ MARINA MELGAREJO Ph. D., Docente de la Universidad Nacional de

Colombia, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Biología, por darme la

oportunidad de realizar este proyecto en el Laboratorio de Fisiología Vegetal, por su

confianza y orientación durante la realización del proyecto, préstamo de

instalaciones, equipos de laboratorio y en general por la financiación del proyecto.

LAURA CERÓN RINCÓN, Química de la Universidad Nacional de Colombia. MSc.

Microbiología. Directora del presente Trabajo de Grado, por sus valiosos aportes,

colaboración y dedicación durante la realización del proyecto.

JORGE ROBLES CAMARGO Ph. D., Docente de la Pontificia Universidad

Javeriana, Co-director del presente Trabajo de Grado, por el apoyo y la colaboración

durante la realización del proyecto.

GERARDO PÉREZ Ph. D., Docente de la Universidad Nacional de Colombia,

Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Química, por su atención y

colaboración en el proceso de liofilización de muestras vegetales.

HAROLD ARDILA, Químico de la Universidad Nacional de Colombia, por su

atención, orientación e información sobre la técnica de Electroforesis de Proteínas

en condiciones denaturantes.

SILVIA LIZETTE BUSTAMENTE, Bióloga de la Universidad Nacional de Colombia,

por el apoyo y la confianza que me brindó desde el inicio hasta la culminación del

presente trabajo.

VÍCTOR MANUEL CRUZ, Ayudante del Laboratorio de Fisiología Vegetal del

Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia, por su ayuda en

el manejo de los equipos de laboratorio y oportuno alcance de los reactivos.

CAROLINA SÁNCHEZ, Estadística de la Universidad Nacional de Colombia, por su

colaboración en el análisis estadístico de los resultados.

JOSE ALEJANDRO BARRETO, JIMENA BAHAMON, ANDRÉS FELIPE BARON Y

JUAN FRANSISCO MANDUCA, Compañeros del Laboratorio de Fisiología Vegetal

de la Universidad Nacional de Colombia, por su ayuda y orientación en el trabajo de

laboratorio y valiosos aportes a través de los seminarios semanales organizados por

el Laboratorio.

Y a todas las personas que aportaron de una u otra forma a la realización de este

proyecto.

TABLA DE CONTENIDOS

1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................19

2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA.............................................21

2.1 ESTRÉS BIOLÓGICO, ADAPTACIÓN Y ACLIMATACIÓN.............................21

2.2 ESTRÉS POR BAJAS TEMPERATURAS .......................................................22

2.3 DAÑOS POR ENFRIAMIENTO........................................................................23

2.3.1 Daños Primarios por Enfriamiento. ...........................................................24

2.3.2 Daños Secundarios por Enfriamiento........................................................27

2.4 PEROXIDASA (POX; E.C. 1.11.1.7) ................................................................30

2.5 POLIFENOLOXIDASA (PFO; E.C. 1.14.18.1) ................................................31

2.6 CONTENIDO DE PROTEÍNAS FRENTE AL ESTRÉS POR FRÍO.................33

2.7 LA FRESA.........................................................................................................34

2.7.1 Clasificación Taxonómica ..........................................................................34

2.7.2 Morfología. .................................................................................................34

2.7.3 Clima y Suelos. ..........................................................................................35

2.7.4 Épocas de Siembra....................................................................................36

2.7.5 Propagación. ..............................................................................................36

2.7.6 Variedades. ................................................................................................37

2.7.6.1 Variedad Chandler. .............................................................................37

2.7.6.2 Variedad Sweet Charlie. .....................................................................38

2.7.7 Situación actual del cultivo en Colombia...................................................39

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ......................................40

3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA..................................................................40

3.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ..................................................................41

3.3 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN......................................................41

4. OBJETIVOS............................................................................................................43

4.1 OBJETIVO GENERAL......................................................................................43

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................43

5. MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................................44

5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ...................................................................44

5.1.1 Muestra. .....................................................................................................48

5.1.2 Variables de estudio. .................................................................................49

5.1.3 Planteamiento de Hipótesis. ......................................................................51

5.1.3.1 Hipótesis nula (Ho). ............................................................................51

5.1.3.2 Hipótesis alternativa (Ha). ..................................................................51

5.2 MÉTODOS ........................................................................................................51

5.2.1 Selección de Condiciones para la Extracción y Posterior Determinación

de Actividades Enzimáticas Peroxidasa y Polifenoloxidasa ..............................51

5.2.3 Determinación de la Actividad Polifenoloxidasa (E.C. 1.14.18.1) ............54

5.2.4 Determinación del Contenido de Proteínas ..............................................54

5.2.5 Electroforesis de Proteínas sobre Geles de Acrilamida ...........................54

5.3 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN ...................................................................55

5.3.1 Análisis Estadístico para la Actividad Enzimática POX, PFO y Contenido

Total de Proteínas...............................................................................................55

5.3.2 Análisis de los Perfiles Electroforéticos.....................................................57

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...............................................................................58

6.1 SELECCIÓN DE CONDICIONES PARA EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN

DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS: POX y PFO ...........................................58

6.2 EVALUACIÓN DE RESPUESTAS BIOQUÍMICAS DE PLANTAS DE FRESA

Fragaria x ananassa var. Chandler y Sweet Charlie A ESTRÉS POR BAJAS

TEMPERATURAS...................................................................................................61

6.2.1 Evaluación de la Actividad Peroxidasa (POX; E.C. 1.11.1.17).................61

6.2.2 Evaluación de la actividad Polifenoloxidasa (PFO; E.C. 1.14.18.1) .........69

6.2.3 Evaluación del Contenido de Proteína Soluble.........................................77

6.3 PERFILES ELECTRÓFORETICOS DE PROTEÍNAS PRESENTES EN LOS

EXTRACTOS DE Fragaria x ananassa var. Chandler y Sweet Charlie DURANTE

ESTRÉS POR BAJAS TEMPERATURAS .............................................................81

7. CONCLUSIONES ...................................................................................................90

8. RECOMENDACIONES...........................................................................................92

9. REFERENCIAS ......................................................................................................93

10. ANEXOS .............................................................................................................102

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Efectos Nocivos de las EORs a Biomoléculas……………………………….26

Tabla 2. Principales enzimas antioxidantes en plantas…………………………….....27

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Modelo del daño por enfriamiento a la membrana celular…………………24

Figura 2. Representación metabólica de las EORs y enzimas antioxidantes……….28

Figura 3. Reacciones oxidativas involucradas en la polimerización de la lignina…..30

Figura 4. Reacciones que catalizan algunas polifenoloxidasas………………………31

Figura 5. Cultivo de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler ubicado en

Guaymaral………………………………………………………………………37

Figura 6. Cultivo de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie ubicado en

Tocancipá………………………………………………………………………..38

Figura. 7. Diseño experimental…………………………………………………………...46

Figura 8. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler……………………….47

Figura 9. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie………………...47

Figura 10. Diseño factorial 23 x 3 de los tratamientos T1 a T16, señalando factores

de diseño y sus correspondientes niveles……….…………………………50

Figura 11. Diseño Factorial 2 x 3 x 4 de los tratamientos T17 a T22 señalando

factores de diseño y sus correspondientes niveles…………………….….50

Figura 12. Metodología para la extracción de enzimas peroxidasa y polifenoloxidasa

utilizando tratamiento con acetona a -20ºC………………………………..52

Figura 13. Metodología para la cuantificación de la actividad peroxidasa………….53

Figura 14. Metodología para la cuantificación de la actividad polifenoloxidasa……54

Figura 15. Actividad peroxidasa. Extracción con tratamiento de acetona a -20ºC y

evaluación de dos sustratos de la enzima: Guayacol y O-dianisidina, en

las dos variedades de fresa: Chandler (S) y Sweet Charlie (T)………...59

Figura 16. Actividad polifenoloxidasa. Extracción con tratamiento de acetona a -20ºC

y evaluación de dos concentraciones del sustrato Catecol (50 y 100mM),

en las dos variedades de fresa.………………..........................................60

Figura 17. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet

Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30min y las mismas variedades

aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min…………………..62

Figura 18. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet



Figura 19. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (S) aclimatadas y no

aclimatadas expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después

del tiempo de exposición……………………………………………………65

Figura 20. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (S)

expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días…………………………………….66

Figura 21. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie

(T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días………………………………….67

Figura 22. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler

(S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días…………67

Figura 23. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet

Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30min las mismas variedades

aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min…………………69

Figura 24. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet



Figura 25. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (S) aclimatadas y no

aclimatadas expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después

del tiempo de exposición…………………………………………………….74

Figura 26. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler

(S) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días…………………………………75

Figura 27. Actividad PFO. Plantas Fragaria x ananassa variedad Sweet Charlie (T)

expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días……………………………………..75

Figura 28. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler

(S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días………….76

Figura 29. Contenido de Proteínas. Plantas de fresa var. Chandler (S) y variedad

Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 60min y las mismas

variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min……78

Figura 30. Contenido de Proteínas. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y

variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días…….79

Figura 31. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (T=12%) en

condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var.

Chandler (S) expuestas a -2ºC por 60 minutos……………………………82


condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var.

Sweet Charlie (T) expuestas a -2ºC por 60 minutos……………………...82


condiciones denaturantes. Plantas de fresa variedad Chandler (S), y

variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 2ºC por 60 minutos…………...83

Figura 34. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida en condiciones

denaturantes. Plantas de fresa variedad Chandler (S), y variedad

Sweet Charlie (T) derecha, expuestas a -2ºC por ocho días……………85

Figura 35. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida en condiciones

denaturantes. Plantas de fresa var. Chandler (S), y var. Sweet

Charlie (T) aclimatadas y expuestas a -2ºC por 60 minutos……………..87

.

RESUMEN

Plantas de fresa, Fragaria x ananassa D. var. Chandler y Sweet Charlie, fueron

expuestas a diferentes tratamientos con bajas temperaturas: 1) 30 y 60 minutos a

4ºC y -2ºC y 2) ocho días a 4ºC y -2ºC. Además, plantas de fresa de las dos

variedades fueron aclimatadas por 15 días a 4ºC y posteriormente expuestas 30 y

60 minutos a -2ºC. Se analizaron las actividades enzimáticas peroxidasa (POX) y

polifenoloxidasa (PFO) y el contenido total de proteínas solubles. Así mismo, se

realizaron algunos perfiles electroforéticos de proteínas para comparar los patrones

de bandeo entre las plantas control y las expuestas a bajas temperaturas. El

impacto del estrés térmico sobre las plantas de fresa de las dos variedades que no

fueron aclimatadas ocasionó: 1) disminución de las actividades enzimáticas

peroxidasa y polifenoloxidasa y 2) aumento en el contenido total de proteínas

solubles. Estos resultados pueden indicar que el estrés por bajas temperaturas

causó la acumulación de compuestos fenólicos, tanto por la activación de su

biosíntesis como por la inhibición de su oxidación y, que las plantas de fresa

acumularon o sintetizaron nuevas proteínas para proteger las células de las lesiones

causadas por este tipo de estrés. En general, la disminución de las actividades

enzimáticas POX y PFO en las dos variedades de fresa, puede indicar que estas

actividades no están relacionadas con el grado de tolerancia que ha sido reportado

para cada una de ellas y que no hacen parte del mecanismo constitutivo de

protección para minimizar los daños oxidativos celulares ocasionados por las bajas

temperaturas. Finalmente, en los perfiles electroforéticos de proteínas se evidenció

la aparición de nuevas proteínas tanto en el tejido vegetal expuesto a bajas

temperaturas como en las plantas previamente aclimatadas.

ABSTRACT

Strawberry plants, Fragaria x ananassa D. var. Chandler and Sweet Charlie, they

were exposed to different processing with low temperatures: 1) 30 and 60 minutes to

4ºC and -2ºC and 2) eight days to 4ºC and -2ºC. Besides, plants of strawberry of the

two varieties were acclimated by 15 days to 4ºC and subsequently exposed 30 and

60 minutes to -2ºC. The enzymatic activities were analyzed peroxidase (POX) and

polyphenoloxidase (PFO) and the total content of soluble proteins. Thus same, some

electroforetics profiles of proteins were carried out to compare the bosses between

the plants control and them exposed to low temperatures. The impact of the thermal

stress on the plants of strawberry of the two varieties that were not acclimated

caused: 1) decrease of the enzymatic activities peroxidase and polyphenoloxidase

and 2) increase in the total content of soluble proteins. These results can indicate

that the stress by low temperatures caused the accumulation of phenolics

composed, so much by the activation of their biosynthesis as by the inhibition of their

oxidation and, that the plants of strawberry accumulated or they synthesized new

proteins to protect the cells of the wounds caused by this type of stress. In general,

the decrease of the enzymatic activities POX and PFO in the two varieties of

strawberry, indicates that these activities are not related to the degree of tolerance

that has been reported for each one of them and that do not they do part of the

protection constituent mechanism to minimize the cell oxidatives damages caused

by the low temperatures. Finally, in the electroforetics profiles of proteins the

apparition was shown so much of new proteins in the vegetable weaving exposed to

low temperatures as in the plants previously acclimated.

1. INTRODUCCIÓN

Durante los procesos normales de crecimiento y distribución, las plantas están

comúnmente expuestas a diferentes tipos de estrés como sequedad, salinidad, altas

o bajas temperaturas, luz ultravioleta, polución del aire, entre otras. La mayoría de

las plantas experimentan cambios fisiológicos, bioquímicos y moleculares por la

exposición a temperaturas más altas o más bajas que las óptimas para su

crecimiento. En los ecosistemas altoandinos colombianos, como es el caso de la

Sabana de Bogotá, las plantas experimentan estrés por bajas temperaturas y de

congelamiento, debido al fenómeno climático llamado helada. Las heladas se

presentan invariablemente a comienzos de cada año y se caracterizan por un

calentamiento fuerte en las horas del día y un gran enfriamiento en las horas de la

madrugada, limitando la distribución, la supervivencia y la producción de las plantas

y en especial de las especies cultivables.

Los daños ocasionados por el estrés térmico, que son reflejados en la mayoría de

los procesos metabólicos, pueden ocasionar una reducción en la capacidad de

crecimiento de las cosechas así como una disminución en la producción comercial.

En este sentido, los daños causados por las bajas temperaturas (menos de 2ºC) en

los cultivos de fresa, traen como consecuencia la no fructificación o la deformación

de los frutos así como la destrucción de los órganos florales, afectando

considerablemente su comercialización. Sin embargo, en Colombia son pocas las

investigaciones realizadas sobre este cultivo y especialmente sobre la respuesta

fisiológica de las plantas cuando experimentan estrés por temperatura.

No obstante, algunos de estos estudios han indicado que las respuestas fisiológicas

causadas por las bajas temperaturas pueden estar asociadas con: a) niveles

elevados de especies de oxígeno activo (peróxido de hidrógeno H2O2, anión

superóxido O2-, radical hidroxilo OH-), las cuales dañan los componentes celulares;

b) el incremento en los sistemas que controlan los niveles de estas especies,

involucrando antioxidantes lipo e hidrosolubles y enzimas como la superóxido

dismutasa, peroxidasa, catalasa y glutatión reductasa c) incremento en la actividad

de enzimas como peroxidasa (POX) y polifenoloxidasa (PFO), implicadas en

mecanismos de respuesta a daños causados por medios físicos o procesos

infecciosos y d) incremento en el contenido de proteínas.

Dentro de este contexto, el presente trabajo investigó la respuesta en términos de la

actividad enzimática peroxidasa (POX) y polifenoloxidasa (PFO), a la exposición a

bajas temperaturas en dos variedades de fresa: Chandler (susceptible al estrés por

frío) y Sweet Charlie (tolerante al estrés por frío). Se escogieron estas actividades

enzimáticas ya que ambas están implicadas en mecanismos de respuesta a daños

ocasionados por diferentes tipos de estrés (biótico y abiótico) y más

específicamente, ambas han sido relacionadas con la respuesta de las plantas al

estrés térmico. Además, se analizó la relación de esta respuesta con el grado de

tolerancia reportado para las dos variedades de fresa en estudio.

El conocimiento de los mecanismos de tolerancia al estrés permite comprender los

procesos evolutivos implicados en la adaptación de las plantas a ambientes

adversos, como las temperaturas extremas. Además, pueden ser aplicados para

mejorar las características de las plantas tanto en su fase de cultivo como en la

selección de variedades que se ajusten a unos requerimientos ambientales

determinados o, simplemente, en mejorar la productividad de una especie.

La información generada a partir de los resultados de este estudio, podrá servir

como base para futuras investigaciones a nivel fisiológico que involucren el análisis

y la identificación de otros mecanismos de respuesta que estén relacionados con el

grado de tolerancia de las plantas de fresa a diferentes factores de estrés.

Este trabajo hace parte del grupo de Fisiología del Estrés del Laboratorio de

Fisiología Vegetal del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de

Colombia, dirigido por la profesora Luz Marina Melgarejo, el cual posee proyectos

relacionados con estrés oxidativo, estrés hídrico y estrés por temperatura en

diferentes modelos vegetales

2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 ESTRÉS BIOLÓGICO, ADAPTACIÓN Y ACLIMATACIÓN

El estrés biológico hace referencia a los cambios o alteraciones en las condiciones

climáticas que puedan afectar las funciones normales de crecimiento y desarrollo de

una planta, generando una tensión biológica. Esa tensión puede ser considerada

elástica, cuando el estrés biológico ha terminado y los cambios en las funciones de

un organismo retornan a su nivel óptimo, y plástica cuando esas funciones no

retornan a la normalidad (Salisbury, 1992).

Los factores de estrés a los que las plantas pueden estar sujetas se dividen en

bióticos y abióticos. Los factores de estrés bióticos incluyen patógenos (hongos,

bacterias, virus), nemátodos, insectos y herbívoros. Los factores abióticos incluyen

condiciones climáticas como las temperaturas extremas, el exceso o deficiencia de

agua, luz o nutrientes, suelo compacto, sequía, estancamiento de agua, prácticas de

cultivo adversas, entre otras. Sin embargo, las plantas han llegado a adaptarse a

diferentes condiciones ambientales a través de la evolución y pueden llegar a

aclimatarse a una condición estresante (Costello et al. 2005).

En este sentido, la adaptación biológica se define como aquellas variaciones que

un organismo ha desarrollado mediante selección natural a lo largo de muchas

generaciones y que le permite estar en mejores condiciones para vivir y

reproducirse en su ambiente. En otras palabras, la adaptación hace referencia a

una variación heredada o a una combinación de características heredadas, que

aumentan las probabilidades del organismo para sobrevivir y reproducirse en un

ambiente determinado. La aclimatación, por otra parte, hace referencia a

modificaciones fisiológicas no heredadas que pueden ocurrir en la vida de un

individuo. Las plantas pueden llegar a aclimatarse a condiciones adversas, como

las bajas temperaturas, mediante exposiciones preliminares no letales y de corta

duración (Nayyar et al. 2004).

Para sobrevivir a las temperaturas extremas, las plantas han desarrollado dos

estrategias fundamentales: evitar y tolerar el estrés. Cuando la planta evita el factor

de estrés, esta responde reduciendo de alguna manera el impacto de ese factor.

Cuando la planta tolera el factor de estrés, simplemente resiste o soporta el

ambiente adverso. Por tal motivo, cuando las plantas son primero expuestas a bajas

temperaturas (de no congelamiento) por un período de tiempo, ellas desarrollan la

habilidad de tolerar temperaturas mucho más bajas (aquellas que habrían sido

letales antes de la aclimatación) (Pennycooke et al. 2005).

En el laboratorio, la aclimatación al frío es inducida por la exposición de las plantas

a bajas temperaturas (2-6ºC), con luz moderada y por cortos períodos de tiempo.

Biológicamente, la aclimatación al frío es compleja e involucra numerosos cambios

en la expresión génica, metabolismo y morfología de las plantas. Estos cambios

incluyen: incremento en la expresión de muchos genes, reducción del crecimiento,

acumulación de solutos compatibles (prolina, betaína, glicinbetaína, entre otros),

incremento en las concentraciones de ácido abscísico (ABA), detoxificadores de

especies reactivas de oxígeno (Iba, 2002), azúcares, aminoácidos, enzimas, y

proteínas de estrés (o shock) térmico (Browse et al. 2001).

2.2 ESTRÉS POR BAJAS TEMPERATURAS

Las bajas temperaturas constituyen un factor ambiental que limita la distribución, la

supervivencia y la producción de las plantas silvestres y cultivadas (Gray et al.

1997). El estrés por bajas temperaturas es uno de los más comunes y puede ser

clasificado en dos tipos: el que ocurre a temperaturas de congelamiento bajo el

punto de congelación (Freezing stress) y el que se da a bajas temperaturas por

encima del punto de congelación (Chilling stress) (Levitt, 1970 citado por Rojas,

1998).

El estrés causado por temperaturas de congelamiento causa alteraciones en la

estructura celular de las plantas debido a la formación de cristales de hielo. Estos

cristales se forman primero en los compartimentos extracelulares, reduciendo el

potencial de agua y causando la salida de agua de las células por ósmosis. De esta

manera, la deshidratación celular es una de las principales alteraciones ocasionadas

por este tipo de estrés. Por otra parte, el estrés causado por temperaturas bajas (de

no congelamiento) causa alteraciones principalmente a nivel de la membrana celular

y es muy común en plantas de clima cálido (Browse et al. 2001).

En los ecosistemas alto andinos colombianos, como es el caso de la Sabana de

Bogotá, las plantas experimentan estrés por bajas temperaturas y de

congelamiento, debido al fenómeno climático llamado helada. Una helada en

fruticultura es aquel evento climático en el cual la temperatura ambiente esta por

debajo de los rangos que permiten la actividad normal de la planta, afectando el

rendimiento y la producción de los cultivos. Este fenómeno está asociado al

concepto de temperatura ambiental inferior a 0ºC. A esta temperatura, el

metabolismo de un vegetal comienza a hacerse más lento y cualquier órgano o

tejido vegetal puede comenzar a congelarse (Toledo, 1999).

Una vez ocurrida la helada, y de acuerdo a la intensidad y duración, aparecen

ciertos síntomas característicos en los tejidos vegetales. De esta manera, una

helada puede causar la deshidratación de las hojas, las cuales, se pueden secar

totalmente o bien tornarse amarillas o con pigmentaciones especiales. Así mismo,

una helada puede afectar las cortezas de las ramas, a los frutos o estar involucrada

con la detención de la floración (Toledo, 1999).

En la Sabana de Bogotá, las heladas se presentan invariablemente a comienzos de

cada año y se caracterizan por un calentamiento fuerte en las horas del día y un

gran enfriamiento en las horas de la madrugada, afectando los cultivos y las

cosechas. Según el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR), los cultivos

más afectados por las heladas son las hortalizas, la papa, el maíz, algunas frutas

como la fresa, entre otras.

2.3 DAÑOS POR ENFRIAMIENTO

Los daños por frío son aquellos cambios físicos y fisiológicos que son inducidos por

la exposición a temperaturas de enfriamiento, entre 15ºC y 0ºC. Los cambios

fisiológicos pueden ser primarios o secundarios. Los cambios primarios son una

respuesta inicial al factor de estrés que causa una alteración en la planta y puede

ser reversible, si la temperatura es elevada a condiciones de no enfriamiento. Los

cambios secundarios, son alteraciones que ocurren como consecuencia de los

daños primarios y pueden ser irreversibles. Las lesiones visuales que son

indicadoras del daño ocasionado por las bajas temperaturas, son consecuencia de

los daños secundarios y pueden incluir: inhibición de la maduración, inhibición del

crecimiento y marchitez (Toledo, 1999). Sin embargo, los daños físicos y químicos

que puede experimentar una planta, dependen de la temperatura a la cual fue

expuesta, estado de desarrollo, nutrición mineral y sensibilidad de la especie y/o la

variedad (Toledo, 1999).

En las plantas sensibles al enfriamiento los cambios primarios ocurren a

temperaturas mayores de 0ºC. Por el contrario, en las plantas tolerantes al

enfriamiento, los cambios primarios pueden ocurrir, pero las plantas poseen una

habilidad inherente para resistir o tolerar los daños secundarios responsables de los

síntomas visuales (Lyons, 1973). Estas especies poseen temperaturas de transición

de fase por debajo de 0ºC, lo que les permite minimizar el daño causado por las

bajas temperaturas (Toledo, 1999).

Es importante señalar, que cuando una planta se encuentra en estado juvenil, con

los procesos de síntesis al máximo, es más estable a períodos de enfriamiento en

comparación, con estados de desarrollo más avanzados (Pell et al. 1991 citado por

Rojas, 1998).

2.3.1 Daños Primarios por Enfriamiento.

Las respuestas primarias involucran alteraciones en el metabolismo y en la

integridad de la membrana celular. La existencia de un desequilibrio metabólico

implica que vías enzimáticas o metabólicas, han sido inhibidas por las bajas

temperaturas, permitiendo la acumulación de metabolitos tóxicos. Estos compuestos

pueden afectar la integridad de la membrana y pueden contribuir a la expresión de

otros síntomas celulares y visuales.

En las plantas sensibles al enfriamiento, las bajas temperaturas pueden ocasionar

cambios en las propiedades físicas de la membrana celular. Los lípidos de

membrana se cristalizan a una temperatura crítica que está determinada por la

proporción entre los ácidos grasos saturados e insaturados. Para lograr una mayor

tolerancia a las bajas temperaturas, las plantas sensibles al frío incrementan su

proporción de ácidos grasos insaturados (Salisbury, 1992).

Lyons (1973) propuso un modelo para explicar la alteración que ocurre en la

membrana celular por temperaturas de enfriamiento. En su modelo, Lyons plantea

cómo la membrana celular al estar expuesta a temperaturas críticas pasa de su

condición líquida-cristalina normal a un estado de gel-sólido. Este cambio causa

una contracción originando canales o fracturas que aumentan la permeabilidad de la

membrana. Por consiguiente, las bajas temperaturas pueden desencadenar una

cascada de eventos secundarios, los cuales incluyen: pérdida de turgencia, salida

de solutos citoplasmáticos, pérdida de energía metabólica, ruptura de los

fotosistemas, autólisis celular y muerte (Fig. 1).

Figura 1. Modelo del Daño por Enfriamiento a la Membrana Celular (Lyons, 1973)

LYONS (1973)

Sin embargo, si la exposición al enfriamiento es corta y la temperatura se eleva

rápidamente, las membranas regresan a la condición líquida-cristalina normal (fase

de transición reversible) y la célula se recupera. Por el contrario, si la planta es

sometida a factores estresantes por largos períodos de tiempo, la célula puede morir

debido a una acumulación de metabolitos y a un escape de solutos en grandes

cantidades (Salisbury, 1992).

El estrés causado por las bajas temperaturas induce otras alteraciones primarias

que incluyen: cambios hormonales (Pell et al. 1991 citado por Rojas, 1998), cambios

en la actividad enzimática, cambios en la concentración osmótica, en el contenido y

composición de carbohidratos, en el contenido de proteínas (Chang et al. 2001),

alteraciones en la actividad génica, formación de nuevas proteínas de estrés térmico

(Iba, 2002), redistribución de iones de calcio intracelulares, reducción en la actividad

fotosintética, en la velocidad de absorción del agua y en la intensidad respiratoria

(Toledo, 1999).

Recientemente se ha demostrado que el estrés térmico en las plantas incrementa la

producción de compuestos fenólicos como flavonoides y fenilpropanoides (Rivero et

al. 2001). En relación a esto, algunos estudios han reportado un incremento en la

actividad de enzimas encargadas de regular el metabolismo de estos compuestos

tales como polifenoloxidasa (PFO), peroxidasa (POX) y fenilalanina amonio-liasa

(PAL), en respuesta a diferentes tipos de estrés, bióticos y abióticos (Pandolfini et al.

1992; Ruiz et al. 1999).

Sin embargo, Rivero et al. 2001 reportaron una acumulación de compuestos

fenólicos, incremento en la actividad de PAL y baja actividad de POX y PFO en

plantas de tomate y sandía -utilizando las hojas como material vegetal- al generar

estrés por altas y bajas temperaturas. Estos resultados indicaron que el estrés

térmico induce la acumulación de compuestos fenólicos en las plantas por la

activación de su biosíntesis así como por la inhibición de su oxidación.

2.3.2 Daños Secundarios por Enfriamiento.

Los daños secundarios causados por el enfriamiento, en las membranas y en los

fotosistemas, es causado en parte por las especies reactivas de oxígeno (EORs).

Estas especies incluyen radicales libres como el anión superóxido (O2-), radicales

hidroxilo (OH-), oxígeno singlet (1O2) y moléculas tales como el peróxido de

hidrógeno (H2O2) (Kuk, 2003).

Aunque las EROs están presentes en las plantas a varios niveles como resultado

del metabolismo aeróbico normal, incluyendo los sistemas transportadores de

electrones en los cloroplastos, mitocondria y membrana plasmática (Kuk, 2003), la

imposición de condiciones de estrés bióticas y abióticas (bajas y altas temperaturas,

radiación UV, salinidad, patógenos, entre otros) incrementan la concentración de

estas especies, resultando en daño oxidativo a nivel celular, por su alta reacción con

moléculas orgánicas (Roberfroid et al. 1995) (Ver tabla 1).

Tabla 1. Efectos Nocivos de las EORs a Biomoléculas (Roberfroid et al. 1995)

Molécula Diana Efecto

Proteínas

Agregación covalente

Cambios conformacionales

Inactivación

Proteólisis

Ácidos nucleicos

Ruptura de cadenas de DNA

Mutagénesis

Lípidos

Peroxidación lipídica

Pérdida de funcionalidad

Carbohidratos Degradación

Biomoléculas orgánicas pequeñas

Cambios en la estructura y propiedades

químicas.

Cuando las EORs reaccionan con los lípidos se produce peroxidación en las

membranas biológicas, que se manifiesta como disminución en la resistencia

eléctrica, inactivación de enzimas integrales y pérdida de la permeabilidad selectiva.

El daño en las membranas intracelulares puede afectar la actividad respiratoria en la

mitocondria, causar ruptura en los pigmentos y pérdida de la capacidad para fijar

carbono en los cloroplastos (Rojas, 1998). Sobre el ADN se pueden producir

deleciones de bases individuales o ruptura de una o dos cadenas de la doble hélice

ocasionando mutaciones y cambios en la información trasmitida. Finalmente, la

reacción del H2O2 y del –OH con las proteínas puede alterar las estructuras

primarias, secundarias o terciarias de las mismas con pérdida o modificación de su

funcionalidad (Ordoñez, 1993).

Sin embargo, las plantas han desarrollado gracias a la presión selectiva y a la

evolución, diversos mecanismos para controlar el nivel de EORs y proteger las

células bajo condiciones de estrés (Blokhina et al. 2003). Uno de estos mecanismos

es el aumento en la actividad de enzimas antioxidantes encargadas de remover,

neutralizar o atrapar radicales libres y EORs, con el objeto de proteger a las células

de la oxidación de sus constituyentes (Iba, 2002). Estas enzimas incluyen la

superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), peroxidasa (POX), ascorbato

peroxidasa (APX), glutatión peroxidasa (GPx), entre otras (Kuk, 2002). Ver Tabla 2

y Figura 2. Tabla 2. Principales enzimas antioxidantes en plantas (Blokhina et al. 2003)

Enzima Número EC

Reacción Catalizada

Superóxido dismutasa 1.15.1.1 222

.2

.2 22 OOHHOO +→++ +−−

Catalasa 1.11.1.6 OHOOH 2222 22 +→ Glutatión peroxidasa 1.11.1.12 OHPUFAGSSHOOHPUFAGSH 222 ++→−+

Glutatión S-transferasa 2.5.1.18 GSHSRHXGSHRX −−+→+ Ascorbato peroxidasa 1.11.1.11 OHDHAOHAA 222 2+→+

Peroxidasa 1.11.1.7 OHoxidadoDonadorOHDonador 222 2+→+ Monodehidroascorbato

peroxidasa 1.6.5.4 AANADMDHANADH 22 +→+ +

Figura 2. Representación metabólica de las EORs y enzimas antioxidantes (Castell et al. 2000)

La superóxido dismutasa, cataliza la dismutación del radical superóxido O2- a H2O2 y

oxígeno molecular. La glutatión peroxidasa, cataliza la reducción de H2O2,

hidroperóxidos orgánicos y lipoperóxidos usando glutatión reducido como donador

de electrones (Gechev et al. 2003). La ascorbato peroxidasa, juega un papel

importante en la eliminación de H2O2 y se encuentra distribuida en al menos cuatro

compartimentos celulares: el estroma (sAPX), membrana tilacoide (tAPX),

microcuerpo (mAPX) y citosol (cAPX) (Yoshimura et al. 2000). Así mismo, el nivel

intracelular de H2O2 también es regulado por un amplio rango de enzimas, siendo

las más importantes las catalasas y las peroxidasas localizadas en casi todos los

compartimentos de las células de las plantas (Blokhina et al. 2003). Las

peroxidasas, pueden catalizar la formación de anión superóxido y H2O2 por una

reacción compleja en la cual el NADH es oxidado usando cantidades pequeñas de

H2O2 producido primero por el rompimiento no enzimático de NADH. Luego, el

radical NAD. formado reduce el O2 a O2-, algunos de los cuales dismutan a H2O2 y

O2 (Blokhina et al., 2003). Así, las peroxidasas juegan un papel importante en la

regulación de la concentración de EORs en la célula a través de la activación y

desactivación de H2O2 (Blokhina et al. 2003). Las plantas también poseen

antioxidantes de bajo peso molecular tales como el ascorbato, el glutatión,

compuestos fenólicos y tocoferoles (Blokhina et al. 2003).

2.4 PEROXIDASA (POX; E.C. 1.11.1.7)

La peroxidasa es una hemoproteína monomérica que cataliza la oxidación de un

amplio número de sustratos (fenoles, aminas aromáticas, e hidroquinonas)

utilizando peróxido de hidrógeno como cofactor. Se encuentra en los peroxisomas,

en los cloroplastos, en las vacuolas y en la pared celular (Narváez, 2002). Además

de estar relacionada en la protección de la célula contra daños oxidativos causados

por el H2O2, también interviene en el pardeamiento enzimático y en los procesos

infecciosos, así como en la elongación de la raíz, en los procesos de lignificación de

la pared celular y en la degradación oxidativa del ácido indol-3-acético (Jansen et al.

2004). Así mismo, participa en varios procesos celulares como: desarrollo y

organogénesis de la planta, senescencia, defensa de patógenos y heridas (Gechev

et al. 2003). La reacción catalizada por la POX puede representarse mediante la

siguiente ecuación, según Blokhina et al. (2002)

OHoxidadoDonadorOHDonador Peroxidasa222 2+⎯⎯⎯ →⎯+

Un incremento en la actividad y/o en la expresión de isoenzimas de peroxidasas es

característico de la defensa de las plantas. En este sentido, se han involucrado en

respuestas a enfermedades, porque al igual que las polifenoloxidasas, catalizan la

oxidación de compuestos fenólicos para la polimerización de la lignina (Figura 3).

Figura 3. Reacciones oxidativas involucradas en la polimerización de la lignina. Tomado de Cerón

(2005).

Se ha reportado un incremento de actividad peroxidasa en diversas plantas

sometidas a estrés abiótico como en hojas de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv.

Tennessee 86) en respuesta a la aplicación de diferentes concentraciones de un

fungicida (Carbendazim Plus) (Ruiz et al. 1999) y en respuesta al estrés generado

por bajas temperaturas en la variedad Petit Havana SR 1 (Gechev et al. 2003). Así

mismo, se ha reportado un incremento de esta enzima en plantas de fresa (Fragaria

x ananassa cv. Camarosa) en respuesta al estrés generado por altas temperaturas

(30, 35, 40 y 45ºC) (Gulen et al. 2004). Por otra parte, algunos autores han

reportado una disminución en la actividad POX en hojas de tomate (Lycopersicon

esculentum L. cv Tmknvf2) en respuesta al estrés generado por altas temperaturas

y en hojas de sandía (Citrullus lanatus [Thomb.] Mansf. cv. Dulce Maravilla) en

respuesta al estrés por bajas temperaturas (Rivero et al. 2001).

2.5 POLIFENOLOXIDASA (PFO; E.C. 1.14.18.1)

La polifenoloxidasa es una metaloenzima que contiene cobre. La actividad de esta

enzima se encuentra asociada a varios procesos metabólicos y crecimiento de

diversos tejidos vegetales. A nivel celular, se encuentra en las membranas de los

tilacoides en los cloroplastos, en las mitocondrias y en fracciones solubles. Está

relacionada con el pardeamiento enzimático en frutas y tubérculos, por la oxidación

de fenoles a sus respectivas quinonas. Dentro de este grupo de enzimas

encontramos las catecolasas y las laccasas. Las catecolasas están presentes

principalmente en plantas y son capaces de catalizar dos reacciones de oxidación

distintas, que son consecutivas, y que van acompañadas de la reducción de oxígeno

molecular a agua: la hidroxilación de monofenoles a o-difenoles (actividad

monofenolasa) y también la oxidación de o-difenoles a quinonas (actividad

catecoloxidasa) (Yemenicioglu et al. 1999). Las laccasas, presentes principalmente

en hongos, solo catalizan la oxidación de orto y para-difenoles a sus respectivas

orto y para-diquinonas (Vaughn et al. 1984). Ver Figura 4.

Figura 4. Reacciones que catalizan algunas Polifenoloxidasas. Tomado de Cerón, 2005.

En el contexto de la defensa vegetal participan en procesos de oxidación en

respuesta a factores bióticos y abióticos (Martínez et al., 1981; Chunhua et al.

2001), ya que desde el momento de la disrupción celular, se da un importante

incremento de quinonas. Las quinonas son altamente reactivas y están

involucradas en la protección de los tejidos vegetales heridos o dañados frente a

otros organismos, por ejemplo, frente a la invasión bacteriana (Vaughn et al. 1984).

Al igual que la actividad POX, la actividad PFO está relacionada con la síntesis de

lignina, compuesto importante en el refuerzo de la pared vegetal. Un incremento en

los niveles de actividad PFO ha sido reportada en respuesta a diferentes tipos de

estrés (bióticos y abióticos) como en hojas de papa (Solanum tuberosum) en

respuesta a la inducción mecánica de heridas (Thipyapong et al. 1995) y en plantas

de Arabidopsis thaliana, en respuesta al estrés por bajas temperaturas (Leyva et al.

1995).

Sin embargo, algunos autores también han reportado una disminución en la

actividad PFO en hojas de tomate (Lycopersicon esculentum L. cv Tmknvf2) y en

hojas de sandía (Citrullus lanatus [Thomb.] Mansf. cv. Dulce Maravilla) como

respuesta al estrés por altas y bajas temperaturas respectivamente (Rivero et al.

2001).

2.6 CONTENIDO DE PROTEÍNAS FRENTE AL ESTRÉS POR FRÍO

Las plantas responden a condiciones de estrés como las bajas temperaturas a

través de numerosos cambios fisiológicos y moleculares. Se ha demostrado que

muchos genes responden al estrés por frío en varias especies vegetales, ya que

codifican para varios productos encargados de proteger las células de los daños

ocasionados por los cambios de temperatura: enzimas requeridas para la biosíntesis

de solutos compatibles (azúcares, prolina, betaínas), proteínas anticongelantes,

chaperonas, desaturasas lipídicas, proteasas y enzimas detoxificantes (catalasa,

ascorbato peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión S-transferasa), entre otros

(Shinozaki et al. 1996).

Guy et al. 1985 reporta que la exposición al frío altera la abundancia relativa de

mRNA en las plantas, como resultado de la expresión de genes involucrados en el

ajuste a las bajas temperaturas y que estos nuevos mRNA pueden codificar para

proteínas involucradas directamente en la protección al frío.

En este sentido, muchas especies vegetales responden al estrés abiótico

incrementando el contenido proteico, ya sea por la síntesis de nuevas proteínas o

por la acumulación de ciertos polipéptidos que responden a diferentes factores de

estrés. Plantas de arroz, maíz y sorgo, han mostrado la acumulación de un

polipéptido de 55 kDa en respuesta a diferentes condiciones de estrés: altas y bajas

temperaturas, salinidad y sequedad (Pareeck et al. 1998).

También se han detectado alteraciones en los patrones de mRNA y en las proteínas

como respuesta al estrés hídrico, luz ultravioleta y metales pesados (Salisbury et al.

1992). Además, alteraciones en el contenido proteico han sido señaladas para

plantas previamente fortalecidas contra el frío; por ejemplo, Gilmour et al. 1988

encontraron nuevos polipéptidos en Arabidopsis thaliana después de haber

aclimatado las plantas al frío. Estas nuevas proteínas de aclimatación al frío CAPs

juegan un papel importante en la protección de las membranas celulares contra el

daño ocasionado por las bajas temperaturas (Salisbury et al. 1992).

2.7 LA FRESA 2.7.1 Clasificación Taxonómica

División: Espermatofita

Subdivisión: Angiosperma

Clase: Dicotiledónea

Orden: Rosales

Familia: Rosaceae

Género: Fragaria

Especie: Fragaria x ananassa

2.7.2 Morfología.

Se pueden distinguir las siguientes partes:

♦ Raíces. La fresa presenta raíces fibrosas divididas en primarias y secundarias.

Las primarias se alargan rápidamente y antes de bifurcarse alcanzan algunos

centímetros. Las secundarias salen de las primarias y forman la masa radicular

para la absorción de nutrientes y almacenamiento de sustancias de reserva.

♦ Tallo. La fresa presenta un tallo aéreo acortado que contiene los tejidos

vasculares y que puede alcanzar una altura de 60 cm. De él salen largos

pecíolos que llevan las hojas.

♦ Hojas. Son pinadas o palmeadas, subdivididas en tres foliolos. Poseen estípulas

en su base y su grosor varía según el cultivar. Son de color verde más o menos

intenso, presentándose coloraciones rojizas en las especies invernales. En la

axila de las hojas se forman yemas que dan origen a coronas secundarias o

estolones.

♦ Estolones. Es un brote largo, delgado y rastrero que se forma a partir de las

yemas axilares de las hojas situadas en la base de la corona. En el extremo del

estolón se forma una roseta de hojas que en contacto con el terreno emite raíces

y que forma una nueva planta con idénticos caracteres que la planta madre.

♦ Flor. Consiste en una inflorescencia en la que los pedúnculos florales nacen en

distintos puntos del eje de la misma y terminan más o menos a la misma altura.

Los pedúnculos constan de un cáliz de cinco sépalos, de una corola de cinco

pétalos blancos y de numerosos estambres amarillos.

♦ Fruto. Receptáculo que se ha hecho carnoso formado por numerosos aquenios.

Su forma y tamaño varía según las variedades.

2.7.3 Clima y Suelos.

Por la amplia existencia de variedades, la fresa se adapta a los ambientes más

diversos. Como climas más favorables para el cultivo de estas especies se

encuentran aquellos que ofrecen una temperatura media anual entre los 15 y 22ºC,

siendo ideales temperaturas entre los 16 y 18ºC. De todas maneras, para el cultivo

de fresa, los determinantes climáticos a considerar como perjudiciales son las

heladas y los vientos fríos. Cuando la temperatura de las plantas alcanza los -8ºC,

-9ºC, se pueden producir daños sensibles a los tejidos y con -10ºC y -12ºC la

muerte. La actividad vegetativa decrece significativamente a los -6ºC (Branzanti,

1989). Las temperaturas extremas (menos de 2ºC y mayores de 34ºC) causan la

desvitalización del polen, el aborto floral y la malformación de los frutos (Carreño et

al. 2003).

Los factores propicios que favorecen una alta producción del cultivo son días

soleados con períodos de fotoperiodismo de 8 horas, una temperatura media de

15ºC y noches frescas (Carreño et al. 2003). En cuanto a la altura, las zonas más

favorables son las que se encuentran entre los 1.800 y 2.600 msnm con una

precipitación mínima de 600 mm (Branzanti, 1989).

En cuanto a las exigencias de suelo, la planta requiere terrenos poco profundos,

debido a que su sistema radical en un 80% se ubica en los primeros 15 cm del

suelo. Son favorables suelos livianos, preferiblemente franco-arenosos con buen

contenido de materia orgánica. El pH óptimo debe oscilar entre 5,7 y 6.0 y debe

tener buena fertilidad (Carreño et al. 2003).

2.7.4 Épocas de Siembra.

En Colombia, la fresa se puede sembrar en cualquier mes del año; sin embargo, lo

más conveniente para todas las zonas de producción es sembrar en los primeros

meses de las épocas lluviosas: marzo-abril y septiembre- octubre. De esta forma, la

planta alcanza un buen desarrollo y empieza a producir en los primeros meses de

las épocas secas: diciembre-enero y junio-julio, con lo que se logran dos objetivos

importantes: tener una planta bien desarrollada para el inicio de la producción y

obtener la mayoría de la cosecha en época seca y con la mejor calidad, cuando el

mercado internacional presenta los mejores precios para fruta fresca (Centro

Nacional de Información de la Agricultura Sostenible, 2001).

2.7.5 Propagación.

La técnica más común para la propagación de la fresa es por medio de estolones,

que normalmente se producen en toda la planta. Los estolones comúnmente se

obtienen de plantas madres importadas de Estados Unidos, que han estado

sometidas a períodos de frigoconservación, con el objeto de estimular un gran

crecimiento vegetativo cuando son llevadas a campo. Debe utilizarse material de

propagación de alta calidad, ya que es uno de los principales factores que

determinan el éxito del cultivo.

Otra técnica de propagación consiste en deshijar la planta para poner a enraizar

cada una de sus raicillas. La reproducción por semillas sólo se realiza con el fin de

obtener mejoras genéticas (Carreño et al. 2003).

2.7.6 Variedades.

Todas las fresas cultivadas provienen de cuatro especies principales: la fresa

silvestre Fragaria vesca nativa de las montañas de América y las Antillas. La fresa

de Virginia Fragaria virginiana nativa del este de América del Norte; la de Chile,

Fragaria chiloensis y la especie común en Europa, Fragaria moschata. Del

cruzamiento de F. chiloensis L. con F. virginiana Duch. se obtuvieron plantas de

mejor rendimiento a partir de la cuales, se han desarrollado las variedades

actualmente cultivadas y que han sido clasificadas como Fragaria x ananassa Duch.

(PROEXANT, 1995).

Aunque existe gran cantidad de variedades, en Colombia, se han obtenido los

mejores resultados con variedades desarrolladas por las Universidades de California

y de Florida como Tioga, Douglas, Camarosa, Selva, Chandler y Sweet Charlie.

Estas variedades son conocidas como plantas típicas de día corto, esto es, que su

producción de fruta se estimula cuando los días son de menos de 12 horas luz

(Centro Nacional de Información de la Agricultura Sostenible, 2001).

2.7.6.1 Variedad Chandler.

Fue obtenida por la Universidad de California. Es una selección de la variedad

Douglas y se caracteriza por tener un fruto grande, firme, uniforme y con menor

grado de deformaciones (Centro Nacional de Información de la Agricultura

Sostenible, 2001). Es una variedad típica de día corto, adaptada a una gran

variedad de condiciones edafoclimáticas y con un alto potencial de producción

(PROEXANT, 1995). La planta es semierecta y con buena capacidad para producir

coronas. Prolifera por medio de estolones y es considerada una de las variedades

más productoras de fruta fresca (Ver Figura 5). El fruto tiene buen tamaño, es firme,

cuneiforme, de buen sabor y color rojo por dentro. La Universidad de California

señala esta variedad como la más productora de todas las que ha producido y en

Colombia ha ocupado durante muchos años el mayor porcentaje de área cultivada

(PROEXANT, 1995). La variedad Chandler se caracteriza por ser una planta

vigorosa que se desarrolla mejor con temperaturas promedio de 16ºC. Es

susceptible a Botrytis y al daño causado por las bajas temperaturas así como al

exceso de humedad. Debido a su falta de resistencia invernal ésta variedad no se

ajusta bien en lugares de latitudes altas donde se presentan inviernos drásticos

(Krewer et al. 2004).

Figura 5. Cultivo de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler ubicado en Guaymaral

2.7.6.2 Variedad Sweet Charlie.

Variedad de día corto, obtenida por la Universidad de Florida. Fue seleccionada en

1986 de un cruce entre FL 80-456 y la variedad Pájaro. Se caracteriza por tener un

fruto mediano, uniforme y de excelente sabor. Tiene la ventaja sobre otras

variedades de resistir a la antracnosis (causada por Colletotrichum acutatum) así

como a mayores niveles de humedad. También tiene un mayor grado de tolerancia

al frío, ajustándose muy bien en lugares con inviernos fuertes y prolongados (Dufault

et al. 2000). El tamaño de las plantas varía de acuerdo a la época de plantación,

pero tienden a ser más pequeñas y más compactas que las plantas de la variedad

Camarosa. Así mismo, tiende a producir menos estolones y a tener una

fructificación más temprana que las variedades Chandler y Oso Grande (Chandler et

al. 2001). Figura 6.

Figura 6. Cultivo de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie ubicado en Tocancipá

2.7.7 Situación actual del cultivo en Colombia.

En Colombia la fresa constituye un cultivo hortícola de alta rentabilidad, con un

comercio e industrial de exportación. El departamento de Cundinamarca es el

principal productor, seguido por Cauca, Norte de Santander, Boyacá, Antioquia y

Valle (Ministerio de Agricultura, 2003). Debido a las heladas y problemas

fitosanitarios, en los últimos años, se ha reportado un descenso en la demanda

industrial de fresa pasando de 1315 t para 1997 a tan solo 700 t para el año 2002.

El mercado de exportación empezó a disminuir a partir de 1994, tanto que en 1999

presentó un comportamiento negativo, decreciendo a una tasa de –25,66% anual y

en el departamento de Cundinamarca se ha reducido el área de cosecha de 505 ha

para el año 2001 a 451 ha para el año 2003 (Ministerio de Agricultura, 2003).

De todas las variedades cultivadas en el país, el cultivo de la variedad Chandler se

ha extendido debido a que el 70 - 80% de la fruta cumple con las normas de

exportación, tiene una fruta más uniforme, con menor grado de deformación y de

mayor calidad.

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

En las plantas, las condiciones climáticas tales como las temperaturas extremas, se

consideran factores de estrés ya que ocasionan alteraciones y daños a nivel celular.

Sin embargo, las especies vegetales son capaces de adaptarse a un ambiente

siempre cambiante, a través de mecanismos metabólicos y moleculares que son

conservados en la naturaleza. Entre estos mecanismos se encuentra la acumulación

de especies reactivas de oxigeno (EORs) como parte de un sistema de señalización

para la activación de otras rutas implicadas en las adaptaciones a un determinado

factor de estrés. A su vez, la acumulación de EORs implica la activación de un

sistema antioxidante enzimático y no enzimático de protección celular, encargado de

la remoción de estas especies, ya que son altamente reactivas y dañan los

componentes celulares (lípidos, proteínas y ácidos nucleicos). Dentro del sistema de

protección antioxidante enzimático, la peroxidasa (POX) desempeña un rol

importante ya que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos (fenoles,

aminas aromáticas, hidroquinonas) utilizando peróxido de hidrógeno como cofactor;

además, está involucrada en la regulación de la concentración de EORs bajo

condiciones normales y de estrés (abiótico o biótico). Por otra parte, la enzima

polifenoloxidasa (PFO) está involucrada con la defensa vegetal ya que participa en

procesos oxidativos en respuesta a factores bióticos y abióticos, catalizando (al igual

que la POX) la oxidación de fenoles a sus respectivas quinonas y además, ha sido

relacionada con la respuesta de las plantas al estrés térmico.

Existen diferencias adaptativas entre organismos de una misma especie que los

hacen resistentes o tolerantes a factores de estrés bióticos y abióticos; en

consecuencia, los organismos tolerantes poseen la habilidad de superar y/o

sobrevivir a las condiciones adversas. Para el caso de las dos variedades de fresa

escogidas como modelo para evaluar las respuestas enzimáticas en estudio, que se

asocian con la tolerancia a estrés por bajas temperaturas, no existe una

caracterización especifica acerca del comportamiento de este sistema antioxidante.

Lo anterior, da lugar a interrogarse sobre la participación de las actividades

enzimáticas peroxidasa y polifenoloxidasa en la tolerancia constitutiva y en la

adaptación de la variedad susceptible al estrés por bajas temperaturas.

3.2 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

En términos de actividad enzimática peroxidasa y polifenoloxidasa ¿Cómo

responden las plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (Susceptible) y

Sweet Charlie (Tolerante) al estrés provocado por bajas temperaturas y cuál es la

relación con su grado de tolerancia y adaptación?

3.3 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

En Colombia, la fresa (Fragaria spp.) representa un producto de alta rentabilidad,

utilización comercial, industrial y de exportación. El departamento de Cundinamarca

es el principal productor seguido de Cauca, Norte de Santander, Boyacá, Antioquía

y Valle (Ministerio de Agricultura, 2003). Sin embargo, en los últimos años, su

producción ha presentado un descenso debido principalmente a la susceptibilidad

de los cultivos a las heladas y problemas fitosanitarios (Gómez, 2004).

En las especies agrícolas, son varios los factores de estrés que llevan a un cultivo a

disminuir la producción, siendo los más comunes, la escasez o abundancia de agua

y/o sales minerales, temperaturas extremas, presencia de minerales tóxicos y de

organismos patógenos, entre otros (Rojas, 1998). En este sentido, las variedades de

fresa cultivadas en la Sabana de Bogotá, están comúnmente expuestas a daños

ocasionados por las diversas condiciones climáticas que ocurren a lo largo del año

(lluvias, granizo, vientos, heladas, entre otras), reportándose anualmente pérdidas

significativas (entre 30 y 50%)* de producción por parte de los cultivadores (Gómez,

2004).

* Información primaria recopilada de cultivadores de fresa localizados en los municipios de El Rosal, Tocancipá, Cota y el sector de Guaymaral (C/marca).

En nuestro país, a pesar de los daños ocasionados por las bajas temperaturas a los

cultivos, son muy pocos los estudios realizados sobre la alteración en el

funcionamiento de las plantas, especialmente en el metabolismo, el balance

hormonal, cambios osmóticos, cambios enzimáticos, entre otros (Rojas, 1998);

conocimiento necesario para diseñar y desarrollar herramientas biotecnológicas

tendientes al manejo del cultivo.

Por tal motivo, el interés del presente trabajo es generar información sobre la

respuesta enzimática al estrés por frío, en términos de actividad peroxidasa y

polifenoloxidasa, en dos variedades de fresa (Chandler y Sweet Charlie), cultivadas

en la Sabana de Bogotá, que presentan diferentes grados de tolerancia a las bajas

temperaturas.

La información generada a partir de los resultados de este estudio, podrá servir

como base para futuras investigaciones a nivel fisiológico que involucren el análisis

y la identificación de otros mecanismos de respuesta que estén relacionados con el

grado de tolerancia de las plantas de fresa a diferentes factores de estrés.

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Fisiología Vegetal del Departamento de

Biología, de la Universidad Nacional de Colombia, dirigido por la profesora Luz

Marina Melgarejo.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar las actividades enzimáticas peroxidasa y polifenoloxidasa en dos

variedades de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (Susceptible) y Sweet

Charlie (Tolerante) durante estrés por bajas temperaturas y determinar si estas

actividades están relacionadas con su grado de tolerancia y adaptación al frío.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la actividad enzimática peroxidasa y polifenoloxidasa en dos variedades

de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (S) y Sweet Charlie (T) bajo condiciones

de temperatura ambiente.

Determinar la actividad enzimática peroxidasa y polifenoloxidasa en dos variedades

de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (S) y Sweet Charlie (T) sometidas a

bajas temperaturas (4ºC y -2ºC).

Comparar perfiles electroforéticos de proteínas de las plantas de fresa Fragaria x

ananassa var. Chandler (S) y Sweet Charlie (T) bajo condiciones de temperatura

ambiente y de bajas temperaturas (4ºC y -2ºC).

5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

El trabajo involucró dos experimentos: el primero consistió en investigar la respuesta

en términos de las actividades enzimáticas peroxidasa y polifenoloxidasa, a la

exposición a bajas temperaturas (4ºC y -2ºC) durante períodos cortos (30 y 60

minutos), en dos variedades de fresa de seis semanas de edad (Chandler,

susceptible al estrés por frío y Sweet Charlie, tolerante al estrés por frío); se

utilizaron plantas de las dos variedades previamente aclimatadas por 15 días y sin

aclimatación. El segundo experimento consistió en investigar las mismas respuestas

enzimáticas a la exposición a las mismas temperaturas en las dos variedades de

fresa, durante períodos prolongados (ocho días).

Para el primer experimento, el material experimental plantas de las dos variedades

de fresa bajo estudio, se dispuso en un diseño factorial 23 x 3 completamente al azar

con 16 tratamientos (T1 a T16) y tres réplicas para cada uno, realizando un total de

144 pruebas experimentales.

Para el segundo experimento, el material experimental plantas de cada variedad de

fresa bajo estudio, se dispuso en un diseño factorial 2 x 3 x 4 completamente al azar

con seis tratamientos (T17 a T22) y tres réplicas para cada uno, realizando un total

de 72 pruebas experimentales.

Se seleccionó el diseño factorial con arreglo completamente al azar, ya que éste

permite examinar las interacciones entre los diferentes factores a los diferentes

niveles. Los tratamientos aplicados para las dos variedades de fresa bajo estudio

fueron los siguientes (Figura 7):

Para el primer experimento:

Controles: Plantas var. Chandler (T1) y Sweet Charlie (T9) expuestas a TºAMB por 30min.

T2 y T10: Plantas var. Chandler (T2) y Sweet Charlie (T10) expuestas a 4ºC por 30 minutos. T3 y T11: Plantas var. Chandler (T3) y Sweet Charlie (T11) expuestas a -2ºC por 30 min.

Controles: Plantas var.Chandler (T4) y Sweet Charlie (T12) expuestas a TºAMB por 60 min.

T5 y T13: Plantas var. Chandler (T5) y Sweet Charlie (T13) expuestas a 4ºC por 60 minutos.

T6 y T14: Plantas var. Chandler (T6) y Sweet Charlie (T14) expuestas a -2ºC por 60 minutos.

ACLIMATACIÓN:

Plantas var. Chandler (T7) y Sweet Charlie (T15) expuestas 1, 3, 8 y 15 días a 4ºC,

con un día intermedio a temperatura ambiente entre cada periodo de exposición.

Posteriormente expuestas a -2ºC por 30 minutos.

Plantas aclimatadas var. Chandler (T8) y Sweet Charlie (T16) expuestas a -2ºC por

60 minutos.

Para el segundo experimento:

Controles: Plantas var.Chandler (T17) y Sweet Charlie (T20) expuestas a TºAMB por 8 días.

T18 y 21: Plantas var. Chandler (T18) y Sweet Charlie (T21) expuestas a 4ºC por ocho días.

T19 y 22: Plantas var. Chandler (T19) y Sweet Charlie (T22) expuestas a -2ºC por ocho días.

En los tratamientos T1 a T16 se tomaron muestras de material vegetal (hojas) a los

10, 30 y 60 minutos después de cada tiempo de exposición (30 y 60 minutos). En

cada muestra se realizó la extracción y posterior determinación de las actividades

enzimáticas peroxidasa (POX) y polifenoloxidasa (PFO) y contenido de proteínas

solubles.

El análisis estadístico de los resultados se realizó por análisis de varianza factorial

ANAVA (P< 0.05) (Anexo 6) y prueba LSD (Less Significant Difference) de Fischer

(P< 0.05) (Anexo 7) para la comparación entre medias de tratamiento, usando el

programa SAS (Series in Statiscal Application). El diseño también se ajustó a un

análisis de medidas repetidas (P< 0.05) (Anexo 8), para analizar el efecto del tiempo

postratamiento (10, 30, 60 minutos) sobre las actividades enzimáticas POX y PFO

en las dos variedades de fresa estudiadas.

En los tratamientos T17 a T22 se tomaron muestras de material vegetal (hojas) cada

dos días durante el tiempo de exposición (ocho días). En cada muestra se realizó la

extracción y posterior determinación de las actividades enzimáticas peroxidasa

(POX) y polifenoloxidasa (PFO) y contenido de proteínas solubles.


ANAVA (P<0.05) (Anexo 6) y prueba de LSD (Less significant diffeerence) de

Fischer (P< 0.05) (Anexo 7) para la comparación entre medias de tratamiento,

usando el programa SAS. Para analizar el efecto del tiempo postratamiento (día 2,

4, 6 y 8) a bajas temperaturas sobre las actividades enzimáticas en las dos

variedades de fresa, el diseño se ajustó a un análisis de medidas repetidas con un

nivel de confianza del 95% (Anexo 8)

Se tomaron muestras (hojas)

a los 10, 30 y 60min después de cada tiempo de exposición.

Se determinó actividad POX y

PFO

Se realizaron perfiles

electroforéticos

T2 y T10

T18 y T21

Plantas var. Chandler (T18) y Sweet Charlie (T21) a 4ºC

por ocho días.

Se tomaron muestras (hojas)

cada 2 días

T7 Y T15 ACLIMATACIÓN

Plantas var. Chandler (T1) y Sweet Charlie (T9) a TºAMB por 30 min.

Plantas var. Chandler (T2) y Sweet Charlie (T10) expuestas a 4ºC por 30 minutos.

Posterior exposición de las plantas var. Chandler (T7) y Sweet Charlie (T15) a -2ºC por 30 minutos.

T1 y T9 CONTROL

T3 y T11 Plantas var. Chandler (T3) y Sweet Charlie (T11) expuestas a -2ºC por 30 minutos.

T4 y T12 CONTROL

Plantas var. Chandler (T4) y Sweet Charlie (T12) a TºAMB por 60 min.

T5 y T13 Plantas var. Chandler (T5) y Sweet Charlie (T13) expuestas a 4ºC por 60 minutos.

T6 y T14 Plantas var. Chandler (T6) y Sweet Charlie (T14) expuestas a -2ºC por 60 minutos.

T8 Y T16 ACLIMATACIÓN

Posterior exposición de las plantas var. Chandler (T8) y Sweet Charlie (T16) a -2ºC por 60 minutos.

T19 y T22

Plantas var. Chandler (T19) y Sweet Charlie (T22) a

-2ºC por ocho días

Figura 7. Diseño Experimental

T17 y T20 CONTROL

Plantas var. Chandler (T17) y Sweet Charlie (T20) a TºAMB por ocho días.

5.1.1 Muestra.

La especie utilizada para el desarrollo de este trabajo fue Fragaria x ananassa

variedad Chandler (Figura 8) y Sweet Charlie (Figura 9). La primera variedad,

reportada como susceptible a las bajas temperaturas, provino de un cultivo de fresa

ubicado en la Sabana de Bogotá, más específicamente en el sector de Guaymaral,

en las afueras de la ciudad por la autopista que conduce a los municipios de Chía y

Cajicá, mientras que la segunda variedad, reportada como resistente a la

antracnosis y tolerante a las bajas temperaturas, provino de un cultivo localizado en

el área rural del Municipio de Tocancipá.

Figura 8. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler.

Figura 9. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie.

Los propietarios de cada cultivo donaron 35 estolones iniciales obtenidos de una

planta madre importada de California y Florida (E.U.), respectivamente. Estos

estolones fueron sembrados individualmente en materas medianas con una mezcla

ya preparada de suelo y compost (humus, material vegetal, estiércol animal) y

regados periódicamente con agua.

Una vez sembrados los estolones en las materas, se trasladaron a un invernadero

localizado en el Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia,

con el fin de mantenerlos en las condiciones necesarias de temperatura para su

óptimo crecimiento (entre 18º y 20ºC) durante un periodo de un mes y medio. Esta

condición fue regulada por medio de compuertas y verificada mediante la medición

diaria (mañana/tarde) de temperatura y humedad relativa, a través de un

Higrotermómetro Manual Berlin DDP.

Al cabo de este tiempo (mes y medio), se empezó a realizar el diseño experimental

mencionado en el numeral 5.1, transfiriendo las plantas al Laboratorio de

Investigación de Fisiología Vegetal del Departamento de Biología de la Universidad

Nacional de Colombia. Para aplicar los tratamientos en donde se manejó

temperatura ambiente, las plantas se mantuvieron en las condiciones regulares que

ofreció el laboratorio; los tratamientos en donde se manejó temperatura de 4ºC, las

plantas se trasladaron a un Refrigerador Whirpool de 24 pies; finalmente, para los

tratamientos en donde se manejó temperatura de -2ºC, las plantas se colocaron en

un Congelador Nibec de Laboratorio de 50 pies. Estas temperaturas se verificaron

mediante un termómetro Brand, (rango 5ºC / -30ºC), colocado una hora antes en el

refrigerador o congelador, con el objeto de asegurar una temperatura constante

durante los tiempos de exposición.

5.1.2 Variables de estudio.

El diseño experimental 23 x 3 (Figura 10) de los tratamientos T1 a T16, presenta

cuatro factores de diseño o variables independientes: a) Variedad, b) Tiempo de

Exposición, c) Aclimatación y d) Temperatura. A su vez, cada uno de estos factores,

excepto el último, posee dos niveles que son: Factor Variedad, las dos variedades

de plantas de fresa, es decir, Chandler y Sweet Charlie; Factor Tiempo de

Exposición, 30 y 60 minutos; y Factor Aclimatación, plantas aclimatadas y plantas

no aclimatadas. El Factor Temperatura, a comparación de los tres anteriores, posee

tres niveles: temperatura ambiente, 4ºC y -2ºC.

Figura 10. Diseño Factorial 23 x 3 de los tratamientos T1 a T16, señalando Factores de Diseño y sus

correspondientes niveles. Fuente: La autora.

Por otra parte, el diseño factorial 2 x 3 x 4 (Figura 11) de los tratamientos T17 a T22,

presenta tres factores de diseño que son: a) Variedad, b) Temperatura y c) Tiempo.

El factor Variedad posee dos niveles que son las dos variedades de plantas de

fresa, es decir, Chandler y Sweet Charlie; el factor Temperatura posee tres niveles

que son: temperatura ambiente, 4ºC y -2ºC y el factor Tiempo posee cuatro niveles

que son los días en los cuales se determinó la actividad enzimática POX/PFO:

segundo día, cuarto día, sexto día y octavo día.

Figura 11. Diseño Factorial 2 x 3 x 4 de los tratamientos T17 a T22 señalando Factores de Diseño y sus

correspondientes niveles. Fuente: La autora.

Cabe mencionar, que las variables consideradas de respuesta para los dos diseños

experimentales son: actividad enzimática peroxidasa (POX), actividad enzimática

polifenoloxidasa (PFO) y contenido de proteínas solubles. La unidad de muestreo es

la planta y la unidad de respuesta la hoja.

5.1.3 Planteamiento de Hipótesis.

5.1.3.1 Hipótesis nula (Ho): Propone que los valores promedios de los resultados

para cada una de las variables de respuesta, con un nivel de significancia del 5%,

no son influenciados por los diferentes tratamientos.

5.1.3.2 Hipótesis alternativa (Ha): Propone que los valores promedios de los

resultados para cada una de las variables de respuesta, con un nivel de significancia

del 5%, son influenciados por al menos uno de los tratamientos.

5.2 MÉTODOS

Hojas de fresa, Fragaria x ananassa var. Chandler y Sweet Charlie, fueron utilizadas

para todos los estudios.

5.2.1 Selección de Condiciones para la Extracción y Posterior Determinación de

Actividades Enzimáticas Peroxidasa y Polifenoloxidasa

Para la extracción y posterior determinación de actividades peroxidasa y

polifenoloxidasa en plantas de fresa, fue necesario evaluar algunas condiciones de

extracción directa con el uso de antioxidantes reportados para prevenir el

pardeamiento de los extractos con la consecuente pérdida de las actividades. Para

llevar a cabo este procedimiento, el material vegetal (hojas) se homogenizó en

mortero con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino, el cual posteriormente se

resuspendió en el buffer de extracción (fosfato de sodio 100mM pH 6.0) en una

proporción de 4 ml por gramo de material vegetal fresco. En el buffer de extracción

se ensayaron los antioxidantes: β-mercaptoetanol 0.1% (Sela-Buurlage et al. 1993)

y ácido ascórbico 5mM (Lawrence et al. 1996). Así mismo, también se evaluó la

extracción de las enzimas vegetales con tratamiento de acetona a -20ºC teniendo

en cuenta lo descrito por Ardila et al. 2005 y Cerón (2005), como se ilustra en la

Figura 12.

Figura 12. Metodología para la extracción de enzimas peroxidasa y polifenoloxidasa, utilizando tratamiento con acetona a -20ºC (Ardila et al. 2005 y Cerón, 2005).

Posteriormente a la extracción de las enzimas, se determinaron las actividades

peroxidasa y polifenoloxidasa por los métodos que se describen más adelante.

Para la actividad peroxidasa se ensayaron dos sustratos: Guayacol y Orto-

0,3g de material vegetal

Maceración vigorosa con Nitrógeno Líquido

Adición lenta 1ml de acetona -20ºC

Agitación por 5 min baño hielo-sal -5ºC Centrifugación 4ºC 7000 rpm por 5min

Pellet Sobrenadante

Lavados (dos veces) con acetona -20ºC 1ml

Agitación por 5 min baño hielo-sal -5ºC Centrifugación 4ºC 7000 rpm por 5min

Descartar acetona - dejar tubos abiertos

Resuspender con pvpp 3% y buffer fosfato 0.1M pH 6.5 en proporción 1:3

Agitación por 1 hora

Centrifugar 4ºC 12000 rpm por 20 min

Recuperar Sobrenadante

dianisidina, mientras que para la actividad polifenoloxidasa se ensayó el sustrato

Catecol a dos concentraciones: 50 y 100mM.

5.2.2 Determinación de la Actividad Peroxidasa (E.C. 1.11.1.7)

La actividad de esta enzima se realizó según el protocolo descrito por Dalisay y Kúc

(1995), que se basa en la determinación del cambio de absorbancia (436nm) por

minuto, producida por la oxidación de un sustrato de la enzima como la o-

Dianisidina (donador de hidrógeno) en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2).

La actividad enzimática se expresó como el cambio de absorbancia por minuto por

mg de proteína (∆ Abs min-1 mg de prot-1). El ensayo de desarrolló como se describe

en la Figura 13.

Figura 13. Metodología para la cuantificación de la Actividad Peroxidasa.

La mezcla de reacción utilizando el sustrato Guayacol consistió en: 100µL de

guayacol 20mM en buffer de ensayo, 200µL de peroxido de hidrogeno 1% p/v en

buffer de ensayo y 250µL de buffer fosfato de sodio 100mM pH 6.5.

20µL de extracto enzimático

Mezcla de reacción: 10µL de o-dianisidina (0.5% p/v en metanol), 10µL de peroxido de hidrogeno (0.5% v/v en buffer de ensayo) y 500µL de buffer fosfato

de sodio 100mM pH 6.5

Se inició reacción adicionando los 20µL de extracto enzimático a la mezcla de reacción y se agitó la celda vigorosamente

Se realizó seguimiento espectrofotométrico utilizando un espectrofotómetro BIO-RAD (SmartSpec 3000) a 436nm y temperatura ambiente durante 1 minuto

5.2.3 Determinación de la Actividad Polifenoloxidasa (E.C. 1.14.18.1)

La actividad de esta enzima se realizó según el protocolo descrito por Chunhua et

al. 2001, que se basa en la determinación del cambio de absorbancia (420nm) por

minuto, producida por la oxidación de un sustrato de la enzima como el Catecol. La

actividad enzimática se expresó como el cambio de absorbancia por minuto por mg

de proteína (∆ Abs min-1 mg de prot-1). El ensayo de desarrolló como se describe en

la Figura 14.

Figura 14. Metodología para la cuantificación de la Actividad polifenoloxidasa.

5.2.4 Determinación del Contenido de Proteínas

Para determinar el contenido de proteína soluble en los extractos se utilizó la

modificación del método de Bradford (1976), de Zor y Selinger (1996), y que se

encuentra descrito en el Anexo 1. Este método linealiza la respuesta con respecto a

la concentración de proteína, utilizando la relación de absorbancias entre 590 y

450nm. El contenido de proteína se expresó como mg por gramo de Tejido Fresco

(mg/g de TF).

5.2.5 Electroforesis de Proteínas sobre Geles de Acrilamida

Los extractos obtenidos de las plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler y

Sweet Charlie se sometieron a separación electroforética en geles de poliacrilamida

al 12% en condiciones denaturantes (Laemmli, 1970) como se describe en el Anexo

100µL de extracto enzimático

Mezcla de reacción: 500µL catecol 100mM y piruvato de sodio 1.64 mg/mL en buffer fosfato de sodio 100mM pH 6.5

Se inició la reacción adicionando los 100µL de extracto enzimático a la mezcla de reacción y se agitó la celda vigorosamente.

Se realizó seguimiento espectrofotométrico utilizando un espectrofotómetro BIO-RAD (SmartSpec 3000) a 420nm y temperatura ambiente durante 1 minuto.

2, en una cámara para minigeles de Bio-Rad (Mini-Protean II). Cabe mencionar, que

también se ensayaron geles de acrilamida al 10 y al 15% de concentración. Para

concentrar la muestra, los extractos fueron dializados por 24 horas, con cinco

cambios de agua desionizada, luego se liofilizaron y se mantuvieron a 4ºC;

posteriormente, los extractos liofilizados se resuspendieron en amortiguador de

muestras no reductor (20µl) y se agitaron en vórtex durante un minuto (Anexo 2).

Los geles fueron teñidos con colorante Coomassie Blue R-250 y con Tinción de

Plata (Blum et al. 1987) como se describe en el Anexo 3. Para la determinación de

los pesos moleculares aparentes se utilizó el siguiente estándar (Protein Standard

Mixture IV): Ovotransferrina (78 kDa), Albúmina (66.25 kDa), Ovoalbúmina (42.7

kDa), Carboanhidrasa (30 kDa), Mioglobina (16.94 kDa) y Citocromo C (12.38 kDa).

5.3 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN

5.3.1 Análisis Estadístico para la Actividad Enzimática POX, PFO y Contenido Total

de Proteínas.

Los datos obtenidos para las variables de respuesta en estudio: actividad enzimática

POX, PFO y contenido total de proteínas en los primeros 16 tratamientos, se

analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza factorial ANAVA (P<

0.05), el cual evaluó los efectos por separado de cada variable independiente y los

efectos conjuntos de dos o más variables, y prueba LSD de Fischer (P< 0.05) para

la comparación entre medias de tratamiento, utilizando el programa SAS.

Para llevar a cabo el análisis de varianza fue necesario partir de dos supuestos: 1)

La variable estudiada tiene una distribución normal y 2) Hay homogeneidad de

varianza.

Para comprobar estos supuestos se llevó a cabo la prueba de normalidad de

Anderson-Darling, con la cual, se buscó probar estadísticamente la hipótesis nula

de la prueba de normalidad: los valores de las variables independientes se

distribuyen normalmente. Para comprobar la homogeneidad de varianzas se utilizó

la prueba de Bartlett, la cual muestra la dispersión o variabilidad de los datos para

los tratamientos.

Según los resultados obtenidos con la prueba de normalidad se encontró que para

la variable de respuesta: Contenido Total de Proteínas, los valores presentaron una

distribución normal y la variabilidad de los datos para los primeros 16 tratamientos

fue homogénea. Sin embargo, para las variables de respuesta: Actividad

Enzimática Peroxidasa y Actividad Enzimática Polifenoloxidasa, los valores de las

variables independientes no presentaron una distribución normal y la variabilidad de

los datos no fue homogénea. Por tal motivo, para cumplir con los supuestos, los

datos fueron transformados (X= X2) y posteriormente se llevó a cabo el análisis de

varianza factorial (ANAVA).

Para comprobar cada una de las hipótesis se utilizó un nivel de confianza del 95%

(α = 0.05) y se comparó con la probabilidad (Pr). De este modo, se determinó la

significancia de los factores y sus combinaciones, sobre las variables de respuesta:

- Pr < 0.05 tiene efecto significativo (*)

- Pr < 0.01 tiene efecto altamente significativo (**)

- Pr > 0.05 no tiene efecto significativo (ns).

Además, el diseño se ajustó a un análisis de medidas repetidas (P< 0.05) usando el

programa SAS, para analizar el efecto del tiempo sobre cada una de las variables

de respuesta, ya que estas variables fueron medidas a los 10, 30 y 60 minutos

después de cada tiempo de exposición (30 y 60 minutos).

De la misma manera, los resultados obtenidos para los tratamientos T17 a T22, se

analizaron mediante un análisis factorial ANAVA (P< 0.05) y prueba LSD de Fischer

(P< 0.05). Posteriormente, el diseño se ajustó a un análisis de medidas repetidas,

con un nivel de confianza del 95% para analizar el efecto del tiempo sobre cada

una de las variables de respuesta, ya que estas variables fueron medidas cada dos

días durante un período de exposición de ocho días a 4ºC y a -2ºC.

Para llevar a cabo el análisis de varianza en los tratamientos T17 a T22, se

comprobaron los supuestos de normalidad y de homogeneidad de varianzas

mediante las pruebas de Anderson-Darling y Bartlett respectivamente. Los

resultados obtenidos indicaron que para las tres variables de respuesta: Actividad

Enzimática Peroxidasa, Actividad Enzimática Polifenoloxidasa y Contenido Total de

Proteínas, los valores presentaron una distribución normal y la variabilidad de los

datos fue homogénea.

5.3.2 Análisis de los Perfiles Electroforéticos

Este análisis consistió en la visualización de las proteínas presentes en los extractos

de las dos variedades de fresa expuestas a bajas temperaturas (4ºC y -2ºC). Las

proteínas de las muestras vegetales fueron separadas por electroforesis en geles de

acrilamida (T12) y visualizadas con Colorante Blue R-250 y con tinción de plata,

como se describe en el anexo 3. En estos geles se determinaron los pesos

moleculares de las proteínas calculando la movilidad electroforética relativa ( )fR de

los estándares de peso molecular conocido y de las proteínas de las muestras

(Hames et al. 1990) de la siguiente manera:

Posteriormente, se graficó el Log del Peso Molecular (PM) de los estándares

conocidos contra la movilidad electroforética relativa ( )fR , como se ilustra en el

Anexo 4. El peso molecular de las proteínas de las muestras se estimó por

interpolación en la curva del Log de PM contra fR .

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 SELECCIÓN DE CONDICIONES PARA EXTRACCIÓN Y

DETERMINACIÓN DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS: PEROXIDASA Y

POLIFENOLOXIDASA.

Con el fin de estandarizar algunas condiciones para la extracción y determinación

de las actividades enzimáticas a evaluar, se probaron algunas metodologías

reportadas para tales fines en distintas fuentes vegetales: extracción directa con

buffer fosfato 0.1M pH 6.0 con antioxidantes tales como: β-mercaptoetanol 0.1%

(Sela-Buurlage et al. 1993) y ácido ascórbico 5mM (Lawrence et al. 1996). Así

mismo, también se evaluó la extracción de las enzimas vegetales con previo

tratamiento de lavado con acetona a -20ºC teniendo en cuenta lo descrito por Ardila

et al. 2005 y Cerón, 2005. Los experimentos se realizaron por triplicado para las dos

variedades de fresa bajo estudio: Chandler (Susceptible) y Sweet Charlie

(Tolerante). Los resultados se analizaron mediante una prueba T de diferencia de

medias con un nivel de confianza del 95% (Anexo 5).

Para la actividad peroxidasa (POX), posteriormente a la extracción directa con buffer

fosfato pH 6.0 con antioxidantes y con tratamiento de lavado con acetona a -20ºC,

se evaluaron además dos sustratos de la enzima: Guayacol y ο-dianisidina. Como

en los extractos realizados de manera directa y con antioxidantes no se detectó

actividad enzimática, solo se evaluaron los dos sustratos de la enzima en los

extractos tratados con previo lavado con acetona a -20ºC. Los resultados se

ilustran en la figura 15.

Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler(S) y Sweet Charlie (T). Extracción con tratammiento de Acetona -20ºC

0

50

100

150

200

250

Abs

/min

/mg

de p

rote

ína

var. Chandler (S) Guayacol var. Chandler (S) O-dianisidina

var. Sweet Charlie (T) Guayacol var. Sweet Charlie (T) O-dianisidina

Figura 15. Actividad Peroxidasa (POX). Extracción con tratamiento de acetona a -20ºC y evaluación de dos sustratos de la enzima: Guayacol y O-dianisidina, en las dos variedades de fresa: Chandler (S) y Sweet

Charlie (T). Datos Anexo 9.

Como se puede observar en la figura 15, la actividad de la enzima POX extraída de

las plantas de fresa (variedad Chandler y Sweet Charlie), posee más afinidad por el

sustrato O-dianisidina que por el Guayacol. Por tal motivo, para determinar la

actividad POX en los ensayos posteriores se escogió el sustrato O-dianisidina.

La descompartimentalizacion de los tejidos vegetales tiene como consecuencia la

oxidación de compuestos fenólicos, que producen el pardeamiento de los extractos

e interfieren con la absorción a la longitud de onda (436nm) del ensayo de la

actividad POX. El tratamiento con acetona permite eliminar estos compuestos y

mejora significativamente la actividad (Cerón, 2005).

De la misma forma, la actividad polifenoloxidasa (PFO) se determinó ensayando la

extracción directa con el uso de antioxidantes y extracción con previo lavado de

acetona a -20ºC. Además, se evaluó el sustrato de la enzima catecol a dos

concentraciones: 50mM y 100mM. La actividad PFO -al igual que la actividad POX-

solo se detectó en los extractos realizados con previo lavado de acetona a -20ºC.

Los resultados se ilustran en la figura 16.

Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (S) y Sweet Charlie (T). Extracción con tratamiento de acetona -20ºC.

0

50

100

150

200

250

Abs

/min

/mg

de p

rote

ína

var. Chandler (S) catecol 50 mM var. Chandler (S) catecol 100 mMvar. Sweet Charlie (T) catecol 50 mM var. Sweet Charlie (T) catecol 100 mM

Figura 16. Actividad Polifenoloxidasa (PFO). Extracción con tratamiento de acetona a -20ºC y evaluación de

dos concentraciones del sustrato Catecol (50 y 100mM), en las dos variedades de fresa: Chandler (S) y Sweet Charlie (T).Datos Anexo 9.

Como se puede observar en la figura 16, para las dos variedades de plantas de

fresa, la concentración del sustrato (catecol) influyó proporcionalmente en la

determinación de la actividad PFO, por lo que para las posteriores determinaciones

se escogieron las siguientes condiciones: extracción con lavados de acetona a

-20ºC y determinación usando el sustrato catecol a una concentración de 100mM.

Como el tratamiento con acetona a -20ºC también resultó el más adecuado para la

determinación de la actividad peroxidasa, se obtuvieron las dos enzimas en el

mismo extracto, metodología que se siguió para las posteriores determinaciones

enzimáticas.

Además, también se pudo observar que los niveles constitutivos de las dos

actividades enzimáticas evaluadas, fueron más altos en la variedad Sweet Charlie

(T), reportada como tolerante al estrés por frío, que en la variedad Chandler (S),

reportada como susceptible al estrés por frío.

6.2 EVALUACIÓN DE RESPUESTAS BIOQUÍMICAS DE PLANTAS DE

FRESA Fragaria x ananassa var. Chandler y Sweet Charlie A ESTRÉS POR

BAJAS TEMPERATURAS.

Una vez establecidas las condiciones para la extracción y posterior determinación

de las actividades enzimáticas, se llevó a cabo el diseño experimental propuesto,

con el cual, se determinó la actividad enzimática POX y PFO, así como el contenido

de proteínas solubles en dos variedades de fresa: Chandler (Susceptible) y Sweet

Charlie (Tolerante) expuestas a condiciones de estrés por bajas temperaturas.


ANAVA (P<0.05) (Anexo 6) y las diferencias se establecieron por prueba LSD de

Fischer (P<0.05) (Anexo 7). El diseño se ajustó a un análisis de medidas repetidas,

con un nivel de confianza del 95% mediante el programa SAS (Anexo 8).

Los resultados obtenidos se ilustraran a continuación mediante gráficas, donde los

datos se presentan como el promedio de tres réplicas y su correspondiente

desviación estándar. Los datos correspondientes a estas gráficas se encuentran en

el anexo 9.

6.2.1 Evaluación de la Actividad Peroxidasa (POX; E.C. 1.11.1.17)

En la figuras 17 y 18 se ilustra la actividad POX registrada para las dos variedades

de fresa estudiadas: Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30

y 60 minutos –para cada temperatura- y sus respectivos controles (plantas en

condiciones de temperatura ambiente). Además, se incluye la actividad enzimática

POX registrada en plantas de las mismas variedades que fueron previamente

aclimatadas como ya se describió y expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos. La

actividad enzimática se determinó a los 10, 30 y 60 minutos después de cada

tiempo de exposición (tiempo postratamiento) para todos los tratamientos aplicados.

A ctividad P OX - var . C handler ( S ) , Sweet C harlie ( T ) expuestas a 4 ºC y - 2 ºC p30 min y las mismas variedades aclimatadas ( 30 M in a - 2 ºC )

70

90

110

130

150

170

190

10 30 60

T iempo po stratamiento (minuto s)

∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC) var S (Aclimatadas)

Var T (Contro l) var T (4ºC) Var T (-2ºC) var T (Aclimatadas)

Figura 17. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) y variedad Sweet Charlie (Tolerante)

expuestas a 4ºC y -2ºC por 30min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min.

A ct ividad P OX - P lantas var . C handler ( S ) y Sweet C harlie ( T ) expuestas a 4 ºC y - 2po r 60 min y las mismas variedades aclimatadas ( 60 M in a - 2 ºC )

50

70

90

110

130

150

170

190

210

10 30 60


∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC) var S (Aclimatadas)

var T (Contro l) var T (4ºC) varT ( -2ºC) var T (Aclimatadas)

Figura 18. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) y variedad Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por 60min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min.

Como se puede observar en las figuras 17 y 18, los niveles constitutivos de

actividad POX fueron significativamente más altos en la variedad Sweet Charlie (T)

que en la variedad Chandler (S). Los niveles constitutivos de actividad peroxidasa

son por lo general más altos en variedades resistentes a enfermedades de origen

fúngico que en variedades susceptibles, lo que ha sido ampliamente reportado

dentro del contexto de estrés biótico en diversas interacciones hospedero –

patógeno: tomate – Phytophthora infestans (Ceron, 2000), garbanzo – Fusarium

oxysporum f. sp. ciceris (García et al. 2002), pimienta - Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria (Do et al. 2003), papa - Pectobacterium chrysanthemi (Jang et al. 2004),

y ñame - Fusarium molyniforme (Dalasay et al. 1995), entre otros. Lo anterior es

consistente, ya que la variedad Sweet Charlie (T), ha sido reportada como una

variedad resistente a la enfermedad de la antracnosis causada por el hongo

Colletotrichum acutatum (Dufault et al. 2000). Además, estos resultados también

pueden estar relacionados con la tolerancia constitutiva al estrés por frío que

presenta esta variedad de fresa.

Al inducir choques térmicos (por bajas temperaturas) en las dos variedades de fresa

en estudio, se observó que la actividad POX fue significativamente menor en todos

los tratamientos aplicados a la variedad susceptible, con respecto a todos los

tratamientos aplicados a la variedad tolerante. La actividad determinada en las

plantas de la variedad S expuestas a 4ºC y -2ºC por 30 minutos, fue

significativamente menor respecto a su control (S), disminución que también se

presentó a los 60 minutos de exposición a las mismas temperaturas respecto a su

control. Entre los dos tiempos de exposición (30 y 60 minutos) y entre las dos

temperaturas empleadas (4ºC y -2ºC) no hubo diferencias significativas de actividad.

En cuanto a los niveles de actividad peroxidasa registrados en plantas de la

variedad T expuestas a los mismos tratamientos, se observó la misma disminución

significativa frente a sus respectivos controles.

Dentro de cada uno de los tratamientos, para las dos variedades de fresa, no hubo

diferencias significativas de actividad a través del tiempo (10, 30 y 60 minutos).

Algunos estudios han reportado que la actividad de la enzima peroxidasa

incrementa en respuesta a diferentes tipos de estrés: bióticos y abióticos (Pandolfini

et al. 1992 y Ruiz et al. 1999) y más específicamente, un incremento en la actividad

POX ha sido demostrada como respuesta al estrés térmico en varios modelos

vegetales: tabaco: Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 (Gechev et al. 2003),

plantas de Mahonia repens (Grace et al. 1998) y arroz Oryza sativa (Kuk et al.

2003), entre otros. Sin embargo, los resultados del presente trabajo mostraron que

tanto la variedad susceptible como la tolerante, disminuyeron los niveles de

actividad como respuesta a períodos cortos de exposición a bajas temperaturas.

La disminución en los niveles de actividad en plantas expuestas a estrés térmico

según la literatura consultada, ha sido reportada por muy pocos autores y ha sido

relacionada con la acumulación de compuestos fenólicos en las plantas, ocasionada

tanto por la activación de enzimas encargadas de su biosíntesis (como la

fenilalanina amonioliasa (PAL) como por la inhibición de enzimas encargadas de su

oxidación (como la POX y la PFO).

Las plantas que fueron aclimatadas de acuerdo a como se describió anteriormente

(sección 5.1) con posterior exposición a -2ºC por 30 y 60 minutos, tanto para la

variedad susceptible como para la variedad tolerante, no presentaron diferencias

significativas de actividad frente a su respectivo tratamiento control. En plantas

aclimatadas de la variedad S se observó el efecto de la aclimatación, ya que los

demás tratamientos (exposición a 4ºC y -2ºC por 30 y 60 minutos) aplicados a las

mismas plantas pero que no se aclimataron, presentaron una actividad POX

significativamente más baja (Figura 19).

Figura 19. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) aclimatadas y no aclimatadas

expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después del tiempo de exposición.

Se ha reportado que la aplicación de un choque térmico en las plantas induce

alteraciones celulares más rápidamente que cuando se aplica un descenso gradual

de temperatura (una semana a quince días) y se aplica el mismo choque térmico, ya

que las plantas se hacen más resistentes a las temperaturas que inicialmente

causaron el estrés (aclimatación). Las respuestas de las plantas aclimatadas al

descenso de temperatura son diferentes a las ocasionadas por los choques térmicos

en plantas no aclimatadas (Pennycooke et al. 2005). Biológicamente, la aclimatación

al frío es compleja e involucra numerosos cambios en la expresión génica,

metabolismo y morfología de las plantas. Estos cambios incluyen: incremento en la

expresión de muchos genes, acumulación de solutos compatibles (prolina, betaína,

glicinbetaína, entre otros), incremento en las concentraciones de ácido abscísico

(ABA), incremento de enzimas detoxificadoras de especies reactivas de oxígeno

(Iba, 2002), azúcares, aminoácidos, entre otros (Browse et al. 2001).

Anderson et al. 1995 reportaron que en plantas no aclimatadas, los daños

ocasionados por las bajas temperaturas se deben en parte a la acumulación de

EORs, mientras que la tolerancia al frío en plantas previamente aclimatadas es

debida en parte a un incremento en los sistemas antioxidantes enzimáticos (dentro

del cual se incluye a la POX) y no enzimáticos, que protegen las células de los

efectos nocivos causados por la acumulación de EORs, como la peroxidación

lipídica y la degradación de proteínas y ácidos nucléicos. De la misma manera,

Pérez-Torres et al. 2001, reportaron que plantas de Deschampsia antarctica previamente aclimatadas al frío (4ºC por 21 días, dejando un día intermedio a

temperatura ambiente) y posteriormente expuestas a 0ºC por 24 horas, aumentaron

los niveles de actividad POX, ascorbato peroxidasa y contenido de carotenoides,

respecto a plantas no aclimatadas y expuestas al mismo tratamiento de frío. Los

autores señalan que un incremento de estas actividades enzimáticas hace parte de

los cambios experimentados durante el proceso de aclimatación, lo que les confiere

mayor tolerancia al estrés por frío. En este sentido, las plantas aclimatadas tanto de

la variedad susceptible como de la variedad tolerante, incrementaron su tolerancia al

estrés por bajas temperaturas, lo que indica que no experimentaron el efecto que se

observó al aplicar el choque térmico a plantas no aclimatadas, particularmente de la

variedad S; es decir, cuando plantas aclimatadas de la variedad S se expusieron a -

2ºC por 30 y 60 minutos, presentaron una actividad POX más alta comparada con la

de plantas no aclimatadas y expuestas a los mismos tratamientos.

A continuación, se ilustra la actividad POX registrada para la variedad susceptible y

para la variedad tolerante, luego de ser expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días (T17 a

T22). La actividad se determinó cada dos días (tiempo postratamiento) durante el

tiempo de exposición para todos los tratamientos aplicados. Figuras 20, 21 y 22.

Figura 20. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (S) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

A ctividad P OX. P lantas variedad C handler (S) expuestas a 4ºC y -2ºC po r o cho dí as.

10

40

70

100

130

160

190

2 4 6 8

T iempo post rat amient o ( d í as)

∆ A

bs m

in -1

mg

de p

rot-1

var S (Control) var S (4ºC) var S (-2ºC)

Figura 21. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por

ocho días.

Figura 22. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

Como se puede observar en las figuras 20, 21 y 22, los niveles de actividad POX en

la variedad susceptible, tanto de plantas control, como expuestas a bajas

A ctividad P OX. P lantas variedad Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r o cho dí as.

90

140

190

240

2 4 6 8

T iempo po stratamiento (dí as)

∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var T (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC)

Actividad POX- P lantas var. Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

10

60

110

160

210

2 4 6 8T iempo po stratamiento (dí as)

∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC)var T (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC)

temperaturas (4ºC y -2ºC) por ocho días, fueron significativamente menores

respecto a los mismos encontrados en la variedad tolerante.

En general, la actividad POX de la variedad susceptible expuesta a 4ºC y a -2ºC

durante los ocho días que duró el experimento, fue significativamente menor

(alrededor de 5 veces) respecto a su control S. Los niveles de actividad en la

variedad tolerante también disminuyeron significativamente (alrededor de 2 veces)

respecto a su control (T) cuando las plantas se expusieron a los mismos

tratamientos con bajas temperaturas. Hubo diferencias significativas entre las dos

temperaturas empleadas y el tratamiento control (T), registrando valores más bajos

de actividad a -2ºC.

Cabe mencionar, que la disminución de actividad para las dos temperaturas (4ºC y

-2ºC) y para las dos variedades estudiadas, se observó de manera progresiva desde

el segundo día hasta el octavo día de exposición.

Los resultados indican que la actividad POX de la variedad S es muy sensible al

estrés por frío, comparada con la misma de la variedad T, siendo un factor débil en

la protección celular contra el daño oxidativo causado por las bajas temperaturas y

no ha sido anteriormente relacionada con el grado de tolerancia reportado para las

dos variedades de fresa estudiadas. Tanto períodos cortos (30 y 60min) como

períodos prolongados (ocho días) de exposición a 4ºC y -2ºC, disminuyeron la

actividad en las dos variedades de fresa, lo que indica que éstas plantas pueden

emplear mecanismos diferentes al incremento de esta enzima para contrarrestar los

daños celulares ocasionados por este tipo de estrés. Sin embargo, una disminución

mayor de actividad POX en la variedad S registrada en todos los tratamientos

aplicados con bajas temperaturas durante períodos cortos y prolongados de

exposición, puede indicar que esta variedad experimenta más daño celular

comparada con la variedad T, debido a una acumulación mayor de especies de

oxígeno reactivo por falta de actividad POX. Finalmente, se puede decir que la

actividad POX está relacionada con el proceso de aclimatación en plantas S, siendo

un factor importante en la remoción de EORs y en el incremento de la tolerancia de

esta variedad frente a los choques térmicos inducidos por bajas temperaturas.

6.2.2 Evaluación de la actividad Polifenoloxidasa (PFO; E.C. 1.14.18.1)

En la figuras 23 y 24 se ilustra la actividad PFO registrada para las dos variedades

de fresa estudiadas: Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30

y 60 minutos –para cada temperatura- y sus respectivos controles (plantas

mantenidas a temperatura ambiente). Además, se incluye la actividad enzimática

PFO registrada en plantas de las mismas variedades, que fueron previamente

aclimatadas como ya se describió y expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos. La

actividad enzimática se determinó a los 10, 30 y 60 minutos (tiempo postratamiento)

después de cada tiempo de exposición para todos los tratamientos aplicados.

Figura 23. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) y variedad Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min.

A ctividad P F O - P lantas var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r 30min y las mismas variedades aclimatadas (30 M in a -2ºC )

70

90

110

130

150

170

190

210

230

10 30 60


∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC) var S (Aclimatadas)var T (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC) var T (Aclimatadas)

Figura 24. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) y variedad Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por 60min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min.

Como se puede observar en las figuras 23 y 24, los niveles constitutivos de

actividad PFO, fueron significativamente más altos en la variedad Sweet Charlie (T)

que en la variedad Chandler (S). Los niveles constitutivos de actividad PFO (al igual

que de POX) son por lo general más altos en cultivares resistentes a enfermedades

fúngicas que en cultivares susceptibles, lo que ha sido reportado dentro del contexto

biótico en diversas interacciones hospedero - patógeno: Clavel (Dianthus

caryophillus) - Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2; tomate (Lycopersicum

esculentum) – Pseudomonas syringae y tabaco (Nicotiana tabacum) – virus del

mosaico, ñame (Dioscorea alata TDA) – Colletotrichum gloeosporioides, entre otros

(Bell, 1981; Steffens, 2000; Ardila, 2005; Cerón, 2005). Como se mencionó

anteriormente, la variedad Sweet Charlie (T) es resistente a la antracnosis y además

presenta una tolerancia constitutiva al estrés por frío, lo que puede indicar que esta

última característica está relacionada con niveles mas altos de PFO en plantas

control.

A ctividad P F O - P lantas var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r 60min y las mismas variedades aclimatadas (60 M in a -2ºC )

50

70

90

110

130

150

170

190

210

10 30 60


∆ A

bs m

in-1

mg

de p

rot-1

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC) var S (Aclimatadas)var T (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC) var T (Aclimatadas)

Al inducir choques térmicos (por bajas temperaturas) en las dos variedades de fresa

en estudio, se observó que la actividad PFO fue significativamente menor en todos

los tratamientos aplicados a la variedad susceptible, con respecto a todos los

tratamientos aplicados a la variedad tolerante. La actividad determinada en las

plantas de la variedad S expuestas a 4ºC y -2ºC por 30 minutos, fue

significativamente menor respecto a su control (S), disminución que también se

presentó a los 60 minutos de exposición a las mismas temperaturas frente a su

control. A diferencia de lo encontrado para la actividad enzimática POX, el factor

tiempo de exposición (30 y 60 minutos) tuvo un efecto significativo sobre la actividad

PFO: se encontraron valores más bajos de actividad cuando las plantas fueron

expuestas a 4ºC y a -2ºC por 60 minutos, que cuando las plantas fueron expuestas

a las mismas temperaturas por 30 minutos. Así mismo, hubo diferencias

significativas entre las dos temperaturas empleadas, registrando los valores más

bajos de actividad a -2ºC. Lo anterior puede indicar que la enzima PFO es más

sensible a la exposición a bajas temperaturas durante períodos cortos, que la

enzima POX.

En cuanto a los niveles de actividad polifenoloxidasa registrados en plantas de la

variedad T expuestas a los mismos tratamientos, se observó la misma disminución

significativa frente a sus respectivos controles.


diferencias significativas de actividad a través del tiempo (10, 30 y 60 minutos).

Gechev et al. 2003, reportaron que algunas enzimas relacionadas con la respuesta

de las plantas al estrés por frío, pueden operar de manera diferente y verse mas

afectadas que otras, siendo factores débiles en la protección celular contra este tipo

de estrés. En este sentido, el autor señaló que plantas de tabaco (Nicotiana

tabacum, cv. Petit Havana SR1) expuestas a bajas temperaturas, incrementaron los

niveles de actividad peroxidasa, ascorbato peroxidasa y superoxido dismutasa y,

disminuyeron los niveles de actividad catalasa, polifenoloxidasa y dehidroascorbato

reductasa. Los niveles de actividad catalasa y PFO mostraron una disminución más

rápida en respuesta a la exposición a bajas temperaturas, siendo éstas las más

afectadas por este tipo de estrés.

Por otra parte, es conocido que la actividad polifenoloxidasa está implicada en

múltiples funciones del desarrollo normal de las plantas así como en las respuestas

vegetales a diferentes tipos de estrés biótico y abiótico (Constabel et al. 1998). Un

incremento en los niveles de esta enzima ha sido reportado en plantas de

Arabidopsis thaliana, en respuesta al estrés por bajas temperaturas (Leyva et al.

1995) y en hojas de papa (Solanum tuberosum) en respuesta a la inducción

mecánica de heridas (Thipyapong et al. 1995). En contraste a lo reportado por

estos autores, los experimentos del presente trabajo mostraron que plantas de fresa

variedad Chandler (S) y Sweet Charlie (T) disminuyeron los niveles de actividad

PFO en respuesta al estrés por frío. Según la literatura consultada, lo anterior ha

sido reportado por muy pocos autores y ha sido relacionado - como se mencionó

para la actividad POX - con la acumulación de compuestos fenólicos (Rivero et al.

2001; Gechev et al. 2003).

Rivero et al. 2001, reportaron en plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L. cv

Tmknvf2) sometidas a estrés por altas temperaturas y en plantas de sandía (Citrullus

lanatus [Thomb.] Mansf. cv. Dulce Maravilla) sometidas a bajas temperaturas, una

disminución de la actividad POX y PFO, y un incremento de la actividad fenilalanina

amonioliasa (PAL) y del contenido de compuestos fenólicos.

Varios autores han reportado que condiciones de estrés tales como exceso de luz,

bajas temperaturas, radiación UV y ataque de patógenos, estimula la producción de

compuestos fenólicos, los cuales, hacen parte del sistema antioxidante de las

plantas para prevenir la acumulación de especies reactivas de oxígeno (EORs)

(Pennycooke et al. 2005). Como se mencionó en el marco teórico, aunque las EROs

están presentes en las plantas a varios niveles como resultado del metabolismo

aeróbico normal, incluyendo los sistemas transportadores de electrones en los

cloroplastos, mitocondria y membrana plasmática (Kuk, 2003), la imposición de

condiciones de estrés bióticas y abióticas incrementan la concentración de estas

especies, resultando en daño oxidativo a nivel celular, por su alta reacción con

moléculas orgánicas.

En las plantas, el metabolismo de los compuestos fenólicos es regulado por la

actividad de varias enzimas. La fenilalanina amonioliasa (PAL) es considerada la

principal enzima de la vía fenilpropanoide, catalizando la transformación por

deaminación, de L-fenilalanina en ácido trans cináminco, el cual, es el principal

intermediario en la biosíntesis de compuestos fenólicos (Rivero et al. 2001).

Mediante esta vía metabólica se sintetizan compuestos como la lignina, suberina,

fitoalexinas, flavonoides, antocianinas y compuestos fenólicos en general, que

desempeñan funciones fisiológicas y ecológicas importantes en las plantas tales

como: rizogénesis, vitrificación, resistencia a diferentes tipos de estrés, participación

en reacciones de oxido-reducción, inhibición del crecimiento de plantas vecinas,

atracción de insectos polinizadores, entre otras (Ruiz, et al. 1999). Así mismo, se ha

reportado las propiedades antioxidantes de algunos compuestos fenólicos; por

ejemplo, el ácido clorogénico, un antioxidante de la vía fenilpropanoide, inhibe la

formación de radicales libres como aniones superóxido y su acumulación ha sido

detectada en plantas de Mahonia repens en respuesta a una combinación de

factores estresantes: exposición a bajas temperaturas y alta radiación solar (Grace

et al.1998). Los flavonoides tienen una estructura química adecuada para actuar

como antioxidantes: pueden donar hidrógenos, o electrones a los radicales libres o

bien atraparlos y desplazados en su estructura aromática y, su acumulación también

ha sido reportada en varias especies vegetales en respuesta a diferentes tipos de

estrés: pino (Pinus banksiana) en respuesta a la infección por patógenos (Nozolillo

et al. 1990), maíz (Zea mays) en respuesta a las bajas temperaturas (Christie et al.

1994) y mutantes de Arabidopisis en respuesta a la radiación UV (Bharti et al. 1997).

Enzimas como la POX y la PFO también desempeñan un papel importante en el

metabolismo de compuestos fenólicos, ya que, catalizan la oxidación de fenoles a

quinonas. Bajo estrés, enzimas como la PAL, pueden ser activadas y enzimas como

la POX y la PFO –que oxidan compuestos fenólicos- inhibidas. Por consiguiente, la

acumulación de compuestos fenólicos y el incremento de la actividad PAL, puede

verse como un mecanismo de las plantas contra el estrés térmico (Rivero et al.

2001), y pudo ser el empleado por las dos variedades de fresa estudiadas contra la

exposición a bajas temperaturas.

Plantas de la variedad S que fueron previamente aclimatadas como ya se describió

(sección 5.1) con posterior exposición a -2ºC por 30 y 60 minutos, presentaron

diferencias significativas de actividad frente a su respectivo tratamiento control. Así

mismo, en plantas de la variedad S no se observó el efecto de la aclimatación, ya

que no hubo diferencias significativas de actividad PFO entre las plantas

aclimatadas y las plantas no aclimatadas de la misma variedad expuestas a -2ºC

por 30 y 60 minutos. Lo anterior indica que la PFO responde de manera diferente a

la actividad POX al proceso de aclimatación en plantas de la variedad S, y puede no

ser un factor importante en el incremento de la tolerancia al estrés por frío

(aclimatación) en esta variedad de fresa (Figura 25).

Figura 25. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (Susceptible) aclimatadas y no aclimatadas

expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después del tiempo de exposición.

Por otra parte, las plantas aclimatadas de la variedad T no presentaron diferencias

significativas cuando fueron expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos frente a su

respectivo tratamiento control, siendo esta la misma respuesta que se registró para

la actividad POX.

A continuación, se ilustra la actividad PFO registrada para la variedad susceptible y

para la variedad tolerante, luego de ser expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días (T17 a

T22) para cada temperatura. La actividad se determinó cada dos días (tiempo

postratamiento) durante el tiempo de exposición para todos los tratamientos

aplicados. Figuras 26, 27 y 28.

Figura 26. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (S) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

Figura 27. Actividad PFO. Plantas Fragaria x ananassa variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

A ct ividad PFO. Plant as var iedad C handler ( S) expuest as a 4 ºC y - 2 ºC por ocho d í as.

40

60

80

100

120

140

160

180

200

2 4 6 8

T iempo post rat amient o ( d í as)

∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var S (Control) var S (4ºC) var S (-2ºC)

A ct ividad PFO. Plant as var iedad Sweet C harl ie ( T ) expuest as a 4 ºC y - 2 ºC por ocho d í as.

80

100

120

140

160

180

200

220

2 4 6 8T iempo post rt amient o ( d í as)

∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var T (Control) var T (4ºC) varT (-2ºC)

A ctividad P F O - P lantas var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r o cho dí as.

40

80

120

160

200

2 4 6 8


∆ A

bs m

in-1 m

g de

pro

t-1

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC)

var T (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC)

Figura 28. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (S) y Sweet Charlie (T)

expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

Como se puede observar en las figuras 26, 27 y 28, los niveles de actividad PFO en

la variedad susceptible, tanto de plantas control, como expuestas a bajas

temperaturas (4ºC y -2ºC) por ocho días, fueron significativamente menores con

respecto a los mismos encontrados en la variedad tolerante.

En general, la actividad PFO de la variedad susceptible expuesta a 4ºC y a -2ºC

durante los ocho días que duró el experimento, fue significativamente menor

(alrededor de 3 veces) frente a su tratamiento control S. Los niveles de actividad en

la variedad tolerante también disminuyeron significativamente (alrededor de 1.6

veces) respecto a su control (T) cuando las plantas se expusieron a los mismos

tratamientos con bajas temperaturas. Hubo diferencias significativas entre las dos

temperaturas empleadas y el tratamiento control (T), registrando valores más bajos

de actividad a -2ºC.

Cabe mencionar, que la disminución de actividad para las dos temperaturas (4ºC y

-2ºC) y para las dos variedades estudiadas, se observó de manera progresiva desde

el segundo día hasta el octavo día de exposición.

En general, los resultados obtenidos en términos de las dos actividades enzimáticas

evaluadas (POX – PFO), indican que las plantas de fresa tanto de la variedad

susceptible como de la variedad tolerante, emplearon mecanismos diferentes al

incremento de estas enzimas, para proteger los componentes celulares del daño

oxidativo causado por la explosión de EORs y, que la actividad PFO es más

sensible al estrés por bajas temperaturas durante períodos cortos de exposición que

la actividad POX. Sin embargo, para asegurar que una de las estrategias que

emplean las dos variedades de fresa en respuesta al estrés por bajas temperaturas,

es la acumulación de compuestos fenólicos, sería necesario realizar estudios

complementarios donde se determine la actividad PAL y el contenido y

caracterización de compuestos fenólicos, en las dos variedades de fresa estudiadas

en el presente trabajo, bajo condiciones similares de estrés por bajas temperaturas.

Además, una disminución mayor de las dos actividades enzimáticas (POX y PFO)

registrada en todos los tratamientos aplicados con bajas temperaturas, durante

períodos cortos y prolongados de exposición en la variedad S, indica que esta

variedad experimenta más daños a nivel celular que la variedad T, ya que no posee

mecanismos constitutivos que la protejan de los daños ocasionados por este tipo de

estrés

6.2.3 Evaluación del Contenido de Proteína Soluble

En la figura 29 se ilustra el contenido de proteína soluble registrado para las dos

variedades de fresa estudiadas: Chandler (S) y Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y

-2ºC por 60 minutos –para cada temperatura- y sus respectivos controles (plantas

mantenidas a TºAMB). Además, se incluye el contenido proteico registrado en

plantas de las mismas variedades, que fueron previamente aclimatadas como ya se

describió (sección 5.1) y expuestas a -2ºC por 60 minutos. El contenido de proteínas

se determinó a los 10, 30 y 60 minutos (tiempo postratamiento) después de cada

tiempo de exposición para todos los tratamientos aplicados.

Figura 29. Contenido de Proteínas. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 60min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min.

Al inducir choques térmicos (bajas temperaturas) en las dos variedades de fresa en

estudio, se observó que el contenido de proteínas solubles fue significativamente

mayor en todos los tratamientos aplicados a la variedad susceptible, con respecto a

todos los tratamientos aplicados a la variedad tolerante. El contenido de proteínas

determinado en las plantas de la variedad S expuestas a 4ºC y -2ºC por 60 minutos,

fue significativamente mayor respecto a su control (S), aumento que también se

presentó a los 30 minutos de exposición a las mismas temperaturas respecto a su

control, y cuyos datos se encuentran en el anexo 9. Entre los dos tiempos de

exposición (30 y 60 minutos) y entre las dos temperaturas empleadas (4ºC y -2ºC)

no hubo diferencias significativas de contenido proteico.

En cuanto al contenido de proteínas determinado en plantas de la variedad T

expuestas a los mismos tratamientos, se observó el mismo aumento significativo

frente a sus respectivos controles.

C o ntenido de P ro teí nas. P lantas var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r 60min y las mismas variedades aclimatadas (60 M in a -2ºC ).

0,23

0,30

0,37

0,44

0,51

0,58

10 30 60T iempo po stratamiento (minuto s)

Prot

eína

(mg/

g de

Tej

ido

Fres

co)

var S (Contro l) var S (4ºC) var S ( -2ºC) var S (Aclimatadas)var T (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC) var T (Aclimatadas)

De la misma manera, plantas de las dos variedades de fresa previamente

aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30 y 60 minutos, presentaron un

contenido de proteínas significativamente más alto frente a su respectivo tratamiento

control, y sin diferencias significativas respecto a plantas no aclimatadas y

expuestas a -2ºC por 30 y 60 minutos.


diferencias significativas de contenido proteico a través del tiempo (10, 30 y 60

minutos).

A continuación, se ilustra el contenido total de proteínas solubles registrado para la

variedad susceptible y para la variedad tolerante, luego de ser expuestas a 4ºC y

-2ºC por ocho días (T17 a T22) para cada temperatura. El contenido proteico se

determinó cada dos días (tiempo postratamiento) durante el tiempo de exposición

para todos los tratamientos aplicados. Figura 30.

C o ntenido de P ro teí nas en P lantas de fresa var. C handler (S) y Sweet C harlie (T ) expuestas a 4ºC y -2ºC po r o cho dí as.

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

2 4 6 8


Prot

eína

(mg/

g Te

jido

Fres

co)

var S (Contro l) var S (4ºC) var S (-2ºC)varT (Contro l) var T (4ºC) var T (-2ºC)

Figura 30. Contenido de Proteínas. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

Como se puede observar en las figura 30, el contenido de proteínas en la variedad

susceptible, tanto de plantas control, como expuestas a bajas temperaturas (4ºC y

-2ºC) por ocho días, fue significativamente mayor respecto al mismo encontrado en

la variedad tolerante. Cabe resaltar, que el contenido total de proteínas para las dos

variedades de fresa estudiadas, aumentó con tendencia progresiva desde el

segundo día hasta el octavo día de exposición a bajas temperaturas (4ºC y a -2ºC).

En general, el contenido proteico de la variedad susceptible expuesta a 4ºC y a -2ºC

durante los ocho días que duró el experimento, fue significativamente mayor

respecto a su control S. Los niveles de contenido proteico en la variedad tolerante

también aumentaron significativamente respecto a su control (T) cuando las plantas

se expusieron a los mismos tratamientos con bajas temperaturas, pero este no fue

tan alto como se presentó en plantas de la variedad S.

Algunos autores han señalado que la exposición al frío altera la abundancia relativa

de mRNA en las plantas, como resultado de la expresión de genes involucrados en

el ajuste a las bajas temperaturas, y que estos nuevos mRNA pueden codificar para

proteínas involucradas directamente en la protección al frío (Guy et al. 1985). Se ha

reportado que los genes inducidos bajo condiciones de estrés -bajas temperaturas o

sequedad- protegen las células vegetales del déficit de agua o del cambio de

temperatura, ya que codifican para diferentes productos: enzimas requeridas para la

biosíntesis de varios solutos compatibles (azúcares, prolina y betaína), chaperonas,

proteínas detoxificadoras de especies reactivas de oxígeno (catalasa, ascorbato

peroxidasa, superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa) y proteínas

anticongelantes, entre otras (Shinozaki et al. 1996).

Guy et al. 1985 reportaron que plantas de espinaca (Spinacia oleracea L. cv.

Bloomsdale) aumentaron el contenido de proteínas así como de mRNAs cuando

fueron expuestas a bajas temperaturas (5ºC) debido a una alteración en la

transcripción génica. Los nuevos polipéptidos fueron reportados por los autores

como diferentes a las proteínas de choque térmico (HSPs).

Las plantas aclimatadas perciben las bajas temperaturas y disparan procesos

bioquímicos específicos que resultan en la tolerancia, aún, de temperaturas de

congelamiento (Thomashow, 1999). La síntesis de proteínas asociada a la inducción

de tolerancia al frío ha sido investigada en algunas especies vegetales; por ejemplo,

Gilmour et al. 1988 reportaron la aparición de nuevos polipéptidos (desde 47 kDa

hasta 160 kDa) en plantas de Arabidopsis thaliana cuando estas fueron fortalecidas

contra el frío, que podrían tener roles en la estabilización de las membranas

celulares. Recientemente, se ha informado que en el espacio extracelular de hojas

de centeno aclimatadas al frío, se acumula una proteína que modifica los patrones

de formación de cristales de hielo y hace descender la temperatura de

congelamiento de soluciones acuosas (Ramírez, 2003).

Estos resultados indican que las plantas de fresa tanto de la variedad susceptible

como de la variedad tolerante, aumentaron el contenido de proteínas en respuesta a

la exposición a bajas temperaturas por períodos cortos (30 y 60 minutos) y por

períodos prolongados (ocho días). La síntesis de nuevas proteínas o la acumulación

de algunos polipéptidos, es una respuesta de las plantas para proteger las células

vegetales contra diferentes tipos de estrés y en este caso, contra el estrés por frío.

Plantas aclimatadas de la variedad S incrementaron el contenido de proteínas, lo

que indica que éste es un mecanismo involucrado con la tolerancia a bajas

temperaturas.

6.3 PERFILES ELECTRÓFORETICOS DE PROTEÍNAS PRESENTES EN

LOS EXTRACTOS DE Fragaria x ananassa var. Chandler y Sweet Charlie

DURANTE ESTRÉS POR BAJAS TEMPERATURAS

Una vez determinadas las actividades enzimáticas POX y PFO en plantas de fresa

de la variedad Chandler (S) y de la variedad Sweet Charlie (T), se realizó un

análisis por electroforesis de las proteínas presentes en los extractos de las dos

variedades de fresa bajo estudio, y que se sometieron a los tratamientos antes

descritos; tales proteínas se separaron en geles de poliacrilamida al 12% en

condiciones denaturantes y como se describe en el anexo 2. Posteriormente los

geles se revelaron con Coomassie Blue R-250 (Anexo 2) y con tinción de plata

(método que permite detectar concentraciones muy pequeñas de proteínas del

orden de los nanogramos (ng) (Anexo 3). La determinación de pesos moleculares se

realizó mediante una curva de referencia (Anexo 4) para la cual se utilizaron los

siguientes patrones de peso molecular: Ovotransferrina (78 kDa), Albúmina (66.25

kDa), Ovoalbúmina (42.7 kDa), Carboanhidrasa (30 kDa), Mioglobina (16.94 kDa) y

Citocromo C (12.38 kDa).

Las figuras 31, 32 y 33, ilustran los perfiles electroforéticos de proteínas presentes

en los extractos de las dos variedades de fresa: Chandler (S) y Sweet Charlie (T)

expuestas a -2ºC por 60 minutos.

Variedad Susceptible

1. Tinción con Coomassie Blue R-250 1A. Tinción con Plata

Figura 31. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (T=12%) en condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (S). Gel 1 (Tinción Coomassie Blue R-250): Línea 1: Patrón de Peso Molecular. Línea 2: tejido vegetal (Control). Líneas 3 y 4: tejido vegetal expuesto a -2ºC por 60 minutos. Gel 1A (Tinción con Plata). En todos los pozos se sembraron 20 µg de proteína.

Variedad Tolerante 1. Tinción con Coomassie Blue R-250 1A. Tinción con Plata

Figura 32. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (T=12%) en condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie (T). Gel 1 (Tinción Coomassie Blue R-250): Línea 1: Patrón de Peso Molecular. Línea 2: tejido vegetal (Control). Líneas 4 y 5: tejido vegetal expuesto a -2ºC por 60 minutos. Gel 1A (Tinción con Plata). En todos los pozos se sembraron 20 µg de proteína.

Variedad Susceptible Variedad Tolerante

Figura 33. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (T=12%) en condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (susceptible) izquierda, y variedad Sweet Charlie (Tolerante) derecha. Tinción con Plata. Línea 1: Patrón de Peso Molecular. Línea 2: tejido vegetal (Control). Líneas restantes: tejido vegetal expuesto a -2ºC por 60 minutos. En todos los pozos se sembraron 20 µg de proteína.

La variedad S que se expuso a -2ºC por 60 minutos presentó un aumento en el

número de bandas con respecto al control; mientras que la muestra control (línea 2)

presentó tres bandas con pesos moleculares de 52.6, 40.7 y 37.4 kDa, el tejido

vegetal expuesto a -2ºC por 60min (líneas 3 y 4) presentó cinco bandas con pesos

moleculares estimados de 74.1, 65.2, 45.7, 39 y 35.8 kDa.

Cabe mencionar, que la banda de 52.6 kDa (rf= 0.41) apareció tanto en la muestra

control como en el tejido vegetal expuesto a -2ºC, lo que indica que esta proteína es

constitutiva de la variedad Chandler (S).

En contraste a lo encontrado en la variedad S, la variedad T no presentó diferencias

en cuanto al número de bandas de la muestra control (línea 2) y del tejido expuesto

a -2ºC por 60 minutos (líneas 4 y 5). Ambas muestras presentaron tres bandas con

peso molecular estimado de 64, 37.1 y 33.6 kDa.

Plantas de fresa de la variedad S aumentaron el número de proteínas en respuesta

al estrés por frío. Se ha reportado, que muchos de los genes inducidos por

temperaturas bajas y deshidratación codifican proteínas que comparten

características estructurales con proteínas inicialmente identificadas en semillas, y

posteriormente identificadas en tejidos vegetativos de plantas sometidas a estrés

por frío y estrés hídrico. Estas proteínas, denominadas deshidrinas, son específicas

de vegetales y han sido encontradas tanto en gimnospermas como en

angiospermas (Nylander et al. 2001). De las proteínas solubles inducidas por estrés,

las deshidrinas son las más conocidas, siendo reportadas en numerosos estudios

relacionados con estrés abiótico (frío o sequía) en varios modelos vegetales. Por

ejemplo, se ha reportado la acumulación de tres deshidrinas en plantas de

Deschampsia antarctic tratadas con frío, deshidratación y ácido abscísico (ABA);

una proteína de 42 kDa fue inducida por frío y ABA, mientras una de 58 kDa y otra

de 72 kDa fueron inducidas por deshidratación (Olave-Concha et al. 2001).

De la misma manera, la síntesis o la acumulación de proteínas involucradas en la

protección al frío, ha sido reportada por varios autores como un mecanismo de las

plantas frente a diferentes tipos de estrés abiótico. Estas proteínas incluyen: a)

enzimas requeridas para la biosíntesis de solutos compatibles (azúcares, prolina y

betaína); la acumulación de estos solutos en las células vegetales evita la formación

de hielo intraceluar porque disminuye la temperatura de congelamiento del agua

(Shinozaki et al. 1996); b) deshidrinas, las cuales juegan un rol crítico en la

estabilización de las proteínas y de las membranas celulares durante el

congelamiento, o cualquier otro estímulo ambiental que cause deshidratación celular

(frío o sequía), ya que poseen efectos crioprotectores (Nylander et al. 2001) y c)

enzimas detoxificadoras de especies reactivas de oxígeno (catalasa, ascorbato

peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión S-transferasa) (Shinozaki et al. 1996),

entre otras.

Otros autores han señalado que existen proteínas especiales que aparecen como

respuesta a tensiones que son diferentes a las temperaturas elevadas. Se han

detectado alteraciones en los patrones de mRNA y en las proteínas, como

respuesta al estrés hídrico y a temperaturas de congelamiento, que no

necesariamente concuerdan con los patrones de HSPs. Así mismo, se ha reportado

la acumulación de un polipéptido de 55 kDa en respuesta a diferentes condiciones

de estrés -altas y bajas temperaturas, salinidad y sequedad- en varios modelos

vegetales: Orysa sativa (arroz), Triticum aestivum (trigo), Sorghum bicolor (sorgo),

Pisum sativum (arveja) y Zea mays (Pareek et al. 1998).

En contraste a lo encontrado en la variedad S, la variedad T no presentó diferencias

en cuanto al número de bandas de la muestra control y del tejido expuesto a -2ºC

por 60 minutos. Sin embargo, en la sección 6.2.3 se había reportado un incremento

del contenido total de proteínas solubles en plantas de la variedad T expuestas a

bajas temperaturas. Estos resultados pueden indicar que aunque no hubo evidencia

de la síntesis de nuevas proteínas, el tejido vegetal expuesto a -2ºC incrementó

estas proteínas en respuesta al estrés por frío.

A continuación, se ilustran los perfiles electroforéticos de proteínas totales obtenidos

para plantas de fresa de la variedad Chandler (S) y de la variedad Sweet Charlie (T)

expuestas a -2ºC por ocho días. Figura 34.


Figura 34. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (T=12%) en condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (susceptible) izquierda, y variedad Sweet Charlie (tolerante) derecha, expuestas a -2ºC por ocho días. Tinción con Plata. Línea 1: Patrón de Peso Molecular. Línea 2: tejido vegetal (Control). Línea 3: segundo día a -2ºC. Línea 4: cuarto día a -2ºC. Línea 5: sexto día a -2ºC. Línea 6: octavo día a -2ºC. En todos los pozos se sembraron 20 µg de proteína

De manera contraria a lo observado cuando las plantas se expusieron a bajas

temperaturas por periodos cortos, en los perfiles electroforéticos del tejido vegetal

expuesto a -2ºC por ocho días, se observó que la variedad susceptible presentó

igual numero de bandas con respecto a la muestra control; sólo hacia el octavo día

de exposición se evidenció la presencia de nuevas proteínas. La muestra control

(línea 2) presentó dos bandas con pesos moleculares de 82 y 52.5 kDa. Estas

mismas bandas se encontraron en el tejido vegetal al segundo, cuarto, sexto y

octavo día de exposición a -2ºC (líneas 3, 4, 5 y 6). Sin embargo, al octavo día de

exposición (línea 6) a -2ºC aparecieron tres nuevas proteínas con pesos

moleculares de 90.7, 89.6 y 88.5 kDa.

Por otra parte, el tejido vegetal de la variedad T expuesto a -2ºC por ocho días

presentó un incremento en el número de bandas, lo que no se había encontrado a

los 60 minutos de exposición a la misma temperatura. La muestra control (línea 2)

presentó una banda de 42.6 kDa (rf= 0.45); esta misma banda apareció en el tejido

vegetal al segundo, cuarto, sexto y octavo día de exposición a -2ºC, lo que puede

indicar que esta proteína es constitutiva de la variedad Sweet charlie (T). Sin

embargo, al segundo día de exposición (línea 3) apareció una nueva banda de 89.1

kDa y al cuarto, sexto y octavo día de exposición (líneas 4, 5 y 6) aparecieron seis

bandas nuevas con pesos moleculares de: 84.7, 80.3, 40.7, 35.3, 31.9 y 28.8 kDa.

Estos resultados indican que la variedad S sintetiza nuevas proteínas en respuesta

a un choque térmico por períodos cortos, pero no lo hace en respuesta a choques

térmicos por períodos prolongados. Lo anterior puede llevar a pensar que en su

condición de variedad susceptible, las plantas presentan alteraciones en sus

sistemas de protección antioxidante, lo que conlleva a un mayor daño celular.

Cuando la planta es sometida a un factor de estrés por períodos prolongados de

tiempo, estos sistemas de protección se hacen ineficientes y los daños celulares

empiezan a ser irreversibles hasta que se produce la muerte celular. Cuando

plantas de la variedad S perciben un estrés por períodos cortos, se activan

mecanismos enzimáticos antioxidantes que estabilizan los componentes celulares y

revierten los daños ocasionados, lo que pudo suceder en plantas de fresa

susceptibles al estrés por frío.

Todo lo contrario sucede en plantas de la variedad T; mientras períodos cortos de

exposición a bajas temperaturas no induce la síntesis de nuevas proteínas, períodos

prolongados de choque térmico incrementan el número de proteínas respecto al

tratamiento control. En su condición de variedad tolerante, 60 minutos de exposición

a un descenso de temperatura, no es suficiente para que se disparen en gran

medida los sistemas de protección celular.

Finalmente, se ilustran los perfiles electroforéticos de proteínas totales obtenidos

para las dos variedades de fresa: Chandler (S) y Sweet Charlie (T) previamente

aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60 minutos. Figura 35.


Figura 35. Electroforesis de proteínas en geles de acrilamida (T=12%) en condiciones denaturantes. Plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (susceptible) izquierda (Tinción con plata) y variedad Sweet Charlie (tolerante) derecha (Tinción Coomassie Blue R-250), previamente aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60 minutos. Línea 1: Patrón de PM. Línea 2: tejido vegetal (Control). Líneas restantes: tejido aclimatado con posterior exposición a -2ºC. En todos los pozos se sembraron 20 µg de proteína. Como se puede observar en la figura 33, la muestra control (línea 2) de la variedad

S presentó una banda de 53 kDa (rf= 0.27), la cual, también estuvo presente en las

muestras previamente aclimatadas con posterior exposición a -2ºC (líneas 3, 4 y 5).

Sin embargo, sólo en la línea 3 aparecieron dos nuevas proteínas con pesos

moleculares estimados de 79.4 y 76 kDa.

Por otra parte, se puede observar que las muestras previamente aclimatadas de la

variedad T presentaron un aumento en el número de proteínas. Mientras la muestra

control (línea 2) presentó una banda con peso molecular estimado de 57 kDa (rf=

0.33), el tejido vegetal previamente aclimatado con posterior exposición a -2ºC por

60 minutos (líneas 3, 4 y 5), presentó cuatro nuevas proteínas con pesos

moleculares estimados de: 95.4, 88, 64.5 y 51.7 kDa.

Estos resultados pueden indicar que plantas aclimatadas de las dos variedades de

fresa sintetizaron nuevas proteínas para incrementar su tolerancia a las bajas

temperaturas. Aunque todavía existen muchos interrogantes sobre las bases

moleculares de la aclimatación al frío, varios autores han propuesto que los

mecanismos que contribuyen a la tolerancia incluyen: síntesis proteica, prevención

de la desnaturalización de proteínas inducida por bajas temperaturas, prevención

de la precipitación de moléculas y atenuación de daños ocasionados por la

formación de hielo intercelular (Thomashow, 1999)

Gilmour et al. 1988 reportaron la aparición de cinco polipéptidos (uno de 160 kDa y

cuatro con pesos moleculares cercanos a los 47 kDa) en plantas de Arabidopsis

thaliana fortalecidas contra el frío, como resultado de un incremento en los niveles

de mRNAs que codifican para estos polipéptidos. Recientemente, se ha informado

que en el espacio extracelular de hojas de centeno aclimatadas al frío, se acumula

una proteína que modifica los patrones de formación de cristales de hielo y hace

descender la temperatura de congelamiento de soluciones acuosas (Ramírez,

2003).

Por otra parte, numerosos genes inducidos y sus promotores han sido aislados y

caracterizados en plantas aclimatadas de alfalfa, Arabidopsis thaliana, cebada y

trigo. Algunos de estos genes codifican para proteínas de función conocida que

contribuyen a incrementar la tolerancia a las bajas temperaturas. Por ejemplo, el

gen FAD8 de Arabidopsis thaliana codifica una desaturasa de ácidos grasos que

altera la composición lipídica de las membranas. Así mismo, genes que codifican

chaperonas en plantas de espinaca (Spinacia oleracea) y de nabo (Brassica napus)

así como genes que intervienen en la transducción de señales, han sido

identificados y se han relacionado con la tolerancia al frío (Sangwan et al. 2001).

Estos resultados posiblemente pueden indicar que plantas de la variedad T poseen

constitutivamente los atributos para soportar el estrés que se aplicó por periodos

cortos, y que utilizan la ruta fenilpropanoide y un sistema antioxidante como parte de

los mecanismos activados durante periodos mas largos (ocho días), mecanismos

que se pueden llegar a activar en la variedad S por aclimatación. Seguir

demostrando que se pueden activar estos mecanismos y así mismo encontrar las

maneras de activarlos, es una herramienta fundamental para el desarrollo de

nuevas aproximaciones biotecnológicas para el manejo del cultivo.

7. CONCLUSIONES La actividad peroxidasa y polifenoloxidasa tanto de la variedad susceptible como de

la variedad tolerante, son afectadas por períodos cortos y prolongados de

exposición a 4ºC y -2ºC; pueden constituir factores débiles del sistema antioxidante

a bajas temperaturas.

Tanto para la variedad S como para la variedad T, la enzima polifenoloxidasa es

más sensible a la exposición a bajas temperaturas durante períodos cortos, que la

enzima peroxidasa

La actividad POX está relacionada con el proceso de aclimatación en plantas de la

variedad S, siendo un factor importante en la remoción de EORs y en el incremento

de la tolerancia de esta variedad frente a los choques térmicos inducidos por bajas

temperaturas.

La disminución de las dos actividades enzimáticas evaluadas (PFO y POX) indican

que las plantas de fresa Fragaria x ananassa variedad Chandler (S) y variedad

Sweet Charlie (T) emplearon mecanismos diferentes al incremento de estas

enzimas, para proteger los componentes celulares del daño oxidativo causado por la

explosión de EORs.

La disminución mayor de las actividades enzimáticas POX y PFO en plantas de la

variedad S, puede indicar que esta variedad experimenta más alteraciones en el

sistema antioxidante, lo que conlleva a un daño celular mayor, en comparación con

la variedad T.

La enzima PFO responde de manera diferente comparada con la enzima POX, al

proceso de aclimatación en plantas de la variedad S, y puede no ser un factor

importante en el incremento de la tolerancia al estrés por frío (aclimatación) en esta

variedad de fresa.

Las plantas de fresa tanto de la variedad susceptible como de la variedad tolerante,

aumentaron su contenido de proteínas en respuesta a la exposición a bajas

temperaturas por períodos cortos (30 y 60 minutos) y por períodos prolongados

(ocho días).

Plantas aclimatadas de la variedad S incrementaron el contenido de proteínas, lo

que indica que éste es un mecanismo involucrado con la tolerancia a bajas

temperaturas.

Plantas de la variedad T poseen constitutivamente los atributos para soportar el

estrés que se aplicó por periodos cortos presentando una mayor actividad POX

como parte de un sistema antioxidante activado durante periodos mas largos (ocho

días), un mecanismo que se puede llegar a activar en la variedad S por

aclimatación.

8. RECOMENDACIONES

Realizar estudios complementarios donde se determine la actividad PAL y el

contenido y caracterización de compuestos fenólicos, en las dos variedades de fresa

estudiadas en el presente trabajo, bajo condiciones similares de estrés por bajas

temperaturas. Lo anterior, con el objeto de ampliar la información acerca de los

mecanismos empleados por las plantas de fresa tanto de la variedad S como de la

variedad T frente al estrés por bajas temperaturas.

A partir de las condiciones estandarizadas en este trabajo para la resolución de

proteínas en geles de acrilamida, realizar perfiles electroforéticos con tinción

específica para la detección de POX y PFO y de otras proteínas de interés.

Realizar investigaciones enfocadas a ampliar la función de la enzima

polifenoloxidasa (PFO) en respuesta a la aclimatación, ya que este no ha sido muy

bien documentado y no ha sido reportado para plantas de fresa.

Seguir esta línea de investigación a partir de trabajos complementarios que permitan

tener una visión mas completa de las respuestas fisiológicas de las plantas de fresa

frente a factores de estrés, para desarrollar futuras herramientas biotecnológicas del

manejo del cultivo.

9. REFERENCIAS

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10. ANEXOS

Anexo 1 Determinación de Proteínas según Zor y Selinger (1996)

Reactivos:

Comassie brilliant blue G-250 (Sigma)

Etanol 95% (Merck)

Acido Fosfórico 85% (Merck)

Agua desionizada

Albúmina Sérica Bovina 95% (Merck)

El stock de albúmina que se utilizó para la curva de calibración fue una solución de BSA al

1% en cloruro de sodio al 1%.

Preparación del reactivo de Bradford:

Determinación de Proteína:

Agregar 1mL del reactivo de Bradford a 0.2mL de la muestra proteica. Posteriormente, leer

absorbancia a 590nm y a 450nm contra blanco de agua desionizada.

Curva de Calibración:

Tomando el Stock de BSA al 1% en un rango de 2 a 20µl, agregar la cantidad respectiva de

buffer fosfato 100mM pH 6.5 para completar siempre un volumen final de 200µl. Finalmente,

agregar 1mL del reactivo del Bradford y leer absorbancia a 590 y a 450nm. Las muestras

problema se interpolan en dicha curva.

Disolver 50mg de Comassie brilliant blue G-250 en 25 mL de etanol al 95%

Agregar 50mL de ácido fosfórico al 85% y se llevó a 500mL con agua desionizada

Filtrar la solución dos veces

Almacenar el reactivo en frasco oscuro y protegido de la luz a 4ºC

CURVA DE CALIBRACIÓN

µg proteína

2 4 6 8 10 12 14 14 18 20

Abs 590

0.422 0.442

0.44

0.508 0.539 0.523

0.518 0.519 0.524

0.536 0.548 0.568

0.657 0.614 0.655

0.695 0.656 0.645

0.665 0.642 0.678

0.729 0.738 0.741

0.741 0.753 0.768

0.802 0.819

0.77

Abs 450 0.535 0.558 0.565

0.545 0.547 0.556

0.527 0.533 0.517

0.511 0.517 0.513

0.508 0.511 0.503

0.486 0.477 0.463

0.447 0.437 0.455

0.452 0.447 0.442

0.428 0.434 0.445

0.4280 0.429 0.413

Abs 590/450

0.7888 0.7921 0.7788

0.9321 0.8700 0.9406

0.9829 0.9737 1.0135

1.0489 1.0600 1.1072

1.2933 1.2900 1.3022

1.4300 1.3753 1.3931

1.4877 1.4691 1.4901

1.6128 1.6510 1.6765

1.7313 1.7350 1.7258

1.8738 1.9091 1.8644

Valores de la Curva de Calibración. Determinación de Proteína Zor y Selinger (1996).

Determinación de proteína Zor y Selinger (1996Curva de Calibración

y = 0,0612x + 0,6468R2 = 0,9902

0

1

2

3

0 5 10 15 20 25

µg Proteína

Abs

(590

/450

)

Curva de Calibración. Determinación de Proteína Zor y Selinger (1996).

Anexo 2

Electroforesis sobre Geles de Acrilamida (Laemmli, 1970)

Soluciones Stock:

Acrilamida – bisacrilamida (30:0.8): disolver 30g de acrilamida y 0.8g de bisacrilamida en un

volumen total de 100mL de agua desionizada. Filtrar la solución y almacenar en botella

oscura a 4ºC.

Persulfato de amonio (1.5%, p/v): disolver 0.15g de persulfato de amonio en 10mL de agua.

La solución solo se utiliza recién preparada.

Buffers para electroforesis:

Amortiguador del gel de concentración: Tris –HCL pH 6.8; disolver 6g de Tris en 40mL de

agua y titular con HCL 1M hasta pH 6.8. Ajustar a un volumen final de 100mL.

Amortiguador del gel de resolución: Tris-HCL pH 8.8; Mezclar 36.3g de Tris y 48.0mL de

HCL 1M.

Amortiguador de la Cámara: Tris-Glicina pH 8.3; disolver 3.0g de Tris y 14.4g de glicina en

agua y completar a un volumen de 1000mL con agua desionizada.

Amortiguador de muestras no reductor (solución concentrada 2x): mezclar 10mL de

amortiguador del gel de concentración pH 6.8, 16mL solución SDS, 50mg azul de

bromofenol, 12mL glicerol y 4mL de agua desionizada. Mantener solución a temperatura

ambiente (<2meses).

Preparación de la muestra:

Los extractos dializados y posteriormente liofilizados se resuspendieron en amortiguador de

muestras no reductor (20µl) y se agitaron en vórtex durante un minuto.

Para preparar el Gel de Resolución (inferior) realizar la siguiente mezcla:

Componente Concentración Final 15% 12% 10%

Agua desionizada 1167µl 1683µl 2000µl Amortiguador resolución 1250µl 1250µl 1250µl

SDS 50µl 50µl 50µl Acrilamida/bisacrilamida 2500µl 2000µl 1667µl

Persulfato de Amonio 15µl 15µl 15µl TEMED 3µl 3µl 3µl

Para preparar el Gel de Concentración (Superior) realizar la siguiente mezcla:

Componente Concentración Final Agua desionizada 1,5mL

Amortiguador Concentración 630µl

SDS 33µl

Acrilamida/bisacrilamida 330µl

Persulfato de Amonio 10µl

TEMED 2µl

Condiciones de corrida para Electroforesis: En los respectivos pozos del gel se sembraron

20µl de muestra y 3µl del Patrón de Peso Molecular. La electroforesis se corrió a un voltaje

constante de 120V hasta que el frente de corrida llegó hasta el final del gel.

Solución Fijadora: Mezclar 500mL de metanol, 70mL de ácido acético glacial y 430mL de

agua desionizada.

Tinción Coomassie Blue R- 250: Disolver 0.25g de Coomassie Blue R-250 en 225mL de

metanol. Luego, se agregar 46mL de ácido acético y 230mL de agua desionizada. La

solución se deja mezclar por 15min, se filtra y se guarda a temperatura ambiente. Teñir los

geles durante un día.

Solución Decolorante: 200mL de metanol, 100mL de etanol, 50mL de ácido acético y 650mL

de agua desionizada.

Anexo 3

Protocolo para Tinción de Plata (Blum et al., 1987)

Fijación: 50% de metanol, 12% de ácido acético, formaldehído al 37% durante una hora.

Mezclar 350µl de formaldehído, 35mL de metanol, 8.4mL de ácido acético y completar a un

volumen final de 70mL con agua desionizada.

Lavado: etanol al 50% de tres a cuatro veces por 20 minutos cada lavado.

Pretratamiento: preparar una solución de tiosulfato de Sodio (Na2S2O3) 0.2g/l. Para preparar

100mL se utilizan 0.02g. Tiempo: un minuto.

Enjuague: con agua desionizada, tres veces por 20 minutos cada enjuague.

Impregnado: AgNO3 (2g/l) + formaldehído al 37% (0.75mL/l). Mezclar 0.14g de AgNO3,

52.5µl de formaldehído y completar a un volumen final de 70mL con agua desionizada.

Tiempo: 20 minutos.

Enjuague: con agua desionizada, dos veces por 20 segundos cada enjuague.

Revelado: Carbonato de sodio anhidro (60g/l), formaldehído al 37% (0.5mL/l), tiosulfato de

sodio (4mg/l). Mezclar 4.2g de carbonato de sodio anhidro, 35µl de formaldehído, 1.4mL de

Tiosulfato de Sodio y completar a un volumen final de 70mL con agua desionizada. El

tiempo de revelado concluye cuando aparecen bandas color café en el gel.

Lavado: con agua, dos veces por 20 segundos.

Lavado: con metanol al 50% y ácido acético al 12% por 10 minutos.

Lavado: metanol al 50% por 20 segundos o más. El gel se puede conservar con agua

desionizada.

Anexo 4

Curva de referencia para la estimación del peso molecular de proteínas mediante geles SDS-

PAGE (Hames et al. 1990)

A partir de los pesos moleculares de los estándares conocidos y de su movilidad

electroforética relativa ( fR ) se construye una gráfica (x= fR , y= Log PM) que permite

estimar el peso molecular de proteínas por interpolación en la curva del Log de PM contra

fR .

Marcador PM Rf

Ovotransferrina 78 000 0.1960

Albúmina 66 250 0.2549

Ovoalbúmina 42 700 0.3921

Carboanhidrasa 30 000 0.5882

Mioglobina 16 949 0.8823

Citocromo C 12 384 0.9607

Curva de Referencia para la estimación del peso molecular de proteína mediante SDS-PAGE

y = -0,9882x + 5,0631R2 = 0,9911

44,14,24,34,44,54,64,74,84,9

5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Movilidad relativa Rf

Log

PM

Anexo 5

Ensayos Preliminares. Prueba T de diferencia de medias (<0.005)

1. Actividad POX. Variedad Chandler. Comparación entre sustratos: Guayacol y O-dianisidina.

Sustrato (n) Media Desviación Estándar Error Estándar Media

Guayacol 3 64.43 9.14 5.3

O-dianisidina 3 149.4 13.0 7.5

Estimado para la diferencia: -84,9713 95% CI para la diferencia: (-114,2275. -55,7152) Prueba-T de diferencias = 0(vs no=): Valor T = -9.24 Valor-P = 0.003

2. Actividad POX. Variedad Sweet Charlie. Comparación entre sustratos: Guayacol y O-dianisidina.

Sustrato (n) Media Desviación Estándar Error Estándar Media

Guayacol 3 92.0 17.3 10

O-dianisidina 3 201.3 16.6 9.6

Estimado para la diferencia: -109.276 95% CI para la diferencia: (-153.344. – 65.212) Prueba-T de diferencias = 0(vs no=): Valor T = -7.89 Valor-P = 0.004

3. Actividad PFO. Fragaria x ananassa var. Chandler. Comparación entre la concentración del sustrato catecol: 50mM y 100mM

Concentración Catecol (mM) (n) Media Desviación Estándar Error Estándar Media

100 3 117.6 14.2 8.2

50 3 75.3 21.6 12


4. Actividad PFO. Fragaria x ananassa var. Chandler. Comparación entre la concentración del sustrato catecol: 50mM y 100mM.

Concentración Catecol (mM) (n) Media Desviación Estándar Error Estándar Media

100 3 226.9 12.5 7.2

50 3 156.7 17.9 10


Anexo 6

1. Análisis de Varianza (ANAVA) para la Variable Transformada: Actividad Enzimática Peroxidasa (POX) determinada en plantas de fresa (var. Chandler y Sweet Charlie), luego de ser expuestas a 4ºC y -2ºC por 30

y 60 minutos.

Fuente DF Suma de Cuadrados

Cuadrado de la media

Valor F Pr > F Significancia

Aclimatación 1 278050576 278050576 43.62 <.0001 **

Variedad 1 9500673399 9500673399 1490.45 <.0001 **

Tiempo 1 2699595 2699595 0.42 0.5163 ns

Var*Tiempo 1 233683 233683 0.04 0.8485 ns

Temperatura 2 1792226852 896113426 140.58 <.0001 **

Var*Temperatura 2 58817292 29408646 4.61 0.0116 **

Tiempo*Temp 2 17223525 8611762 1.35 0.2626 ns

Var*Tiempo*Temp 2 6079061 3039530 0.48 0.6218 ns

Aclim*Tiempo 1 4611820 4611820 0.72 0.3966 ns

Error 130 828668849 6374376

Total 143 15711274958

Análisis de Varianza solo con variables significativas para la Variable Transformada: Actividad POX




Aclimatación 1 278050576 278050576 44.49 <.0001 **

Variedad 1 9500673399 9500673399 1520.08 <.0001 **

Temperatura 2 1792226852 896113426 143.38 <.0001 **

Var*Temper 2 58817292 29408646 4.71 0.0106 **

Error 137 856263857 6250101

Total 143 15711274958

2. Análisis de Varianza (ANAVA) para la Variable de Respuesta: Actividad Enzimática Peroxidasa (POX)

determinada en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.




Variedad 1 110817.2727 110817.2727 924.53 <.0001 **

Temperatura 2 96082.8052 48041.4026 400.80 <.0001 **

Var*Temper 2 12986.6074 6493.3037 54.17 <.0001 **

Error 12 1438.3554 119.8629

Total 17 221325.0407

3. Análisis de Varianza (ANAVA) para la Variable Transformada: Actividad Enzimática Polifenoloxidasa (PFO) determinada en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie, luego de ser expuestas a 4ºC y -2ºC

por 30 y 60 minutos.




Aclimatación 1 442390931 442390931 43.93 <.0001 **

Variedad 1 11219943046 11219943046 1114.13 <.0001 **

Tiempo 1 15111014 15111014 1.50 0.2228 ns

Var*Tiempo 1 3122682 3122682 0.31 0.5786 ns

Temperatura 2 3494031364 1747015682 173.48 <.0001 **

Var*Temperatura 2 208898152 104449076 10.37 <.0001 **

Tiempo*Temp 2 5235067 2617534 0.26 0.7715 ns

Var*Tiempo*Temp 2 22542273 11271137 1.12 0.3297 ns

Aclim*Tiempo 1 2408787 2408787 0.24 0.6256 ns

Error 130 1309177298 10070595

Total 143 20516552766

Análisis de Varianza solo con variables significativas para la Variable Transformada: Actividad PFO




Aclimatación 1 442390931 442390931 44.73 <.0001 **

Variedad 1 11219943046 11219943046 1134.44 <.0001 **

Temperatura 2 3494031364 1747015682 176.64 <.0001 **

Tiempo 1 89251487 89251487 9.02 0.0032 **

Var*Temper 2 208898152 104449076 10.56 <.0001 **

Error 136 1345081231 9890303

Total 143 20516552766

4. Análisis de Varianza (ANAVA) para la Variable de Respuesta: Actividad Enzimática Polifenoloxidasa (POX)

determinada en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.




Variedad 1 72021.85373 72021.85373 427.81 <.0001 **

Temperatura 2 92035.86251 46017.93126 273.34 <.0001 **

Var*Temper 2 8318.34909 4159.17454 24.71 <.0001 **

Error 12 2020.21854 168.35154

Total 17 174396.28387

5. Análisis de Varianza (ANAVA) para la Variable Contenido Total de Proteínas determinado en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie expuestas a 4ºC y -2ºC por 30 y 60 minutos.




Aclimatación 1 0.00774371 0.00774371 3.62 0.0494 *

Variedad 1 0.18412859 0.18412859 86.04 <.0001 **

Tiempo 1 0.00103473 0.00103473 3.48 0.04881 *

Var*Tiempo 1 0.15375937 0.15375937 71.84 <.0001 **

Temperatura 2 0.04487060 0.02243530 10.48 <.0001 **

Var*Temperatura 2 0.01436481 0.00718241 3.36 0.0379 *

Tiempo*Temp 2 0.01445583 0.00722792 3.38 0.0372 *

Var*Tiempo*Temp 2 0.01476749 0.00738374 3.45 0.0747 ns

Aclim*Tiempo 1 0.01000355 0.01000355 4.67 0.05924 ns

Error 130 0.27822044 0.00214016

Total 143 0.80621178

6. Análisis de Varianza (ANAVA) para la Variable de Respuesta: Contenido Total de Proteínas determinado

en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.




Variedad 1 0.50160357 0.50160357 119.27 <.0001 **

Temperatura 2 1.27637159 0.63818579 151.75 <.0001 **

Var*Temper 2 0.27230178 0.13615089 32.37 <.0001 **

Error 12 0.05046700 0.00420558

Total 17 2.10074394

Anexo 7

1. Actividad POX. Comparación de promedios de tratamiento por la prueba LSD de Fischer (P<0.05) para los tratamientos T1 a T16.

Prueba LSD para Variable POX

Alfa 0.05 Error de grados de libertad 136 Error de cuadrado medio 1252.151 Valor crítico de t 1.97756 Diferencia menos significativa 23.326

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

Agrupamiento Media N Tratamiento A 191.43 24 5 (var.2 Control) A A 182.22 24 8 (var.2 Aclimatada) A F A 171.94 24 6 (var.2 4ºC) F F B 166.24 24 7 (var.2 -2ºC) B E B 146.88 24 1 (var.1 Control) E E C 130.27 24 4 (var.1 Aclimatada) D 102.13 24 2 (var.1 4ºC) D D 90.25 24 1 (var.1 -2ºC)

2. Actividad POX. Prueba LSD de Fischer (P<0.05) para los tratamientos T17 a T22.

Prueba LSD para Variable POX


Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Agrupamiento Media N Tratamiento A 189.401 12 4 (var.2 Control) B 149.071 12 5 (var.2 4ºC) B B 148.918 12 1 (var.1 Control) C 133.821 12 6 (var.2 -2ºC) D 51.066 12 2 (var.1 4ºC) E 36.918 12 3 (var.1 -2ºC)

3. Actividad PFO. Prueba LSD de Fischer (P<0.05) para los tratamientos T1 a T16.


Medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Agrupamiento Media N Tratamiento A 210.95 12 9 (var.2 Control Tiempo2) A A 204.76 12 12 (var.2 Control Tiempo1) A A 195.04 12 15 (var.2 Aclima. Tiempo1) A A 191.75 12 16 (var.2 Aclima. Tiempo2) A A 190.08 12 10 (var.2 4ºC Tiempo1) A F A 186.25 12 13 (var.2 4ºC Tiempo2) F F B 177.48 12 11 (var.2 -2ºC Tiempo1) F B F B 170.96 12 14 (var.2 -2ºC Tiempo2) C 159.65 12 1 (var.1 Control Tiempo1) C C 157.94 12 4 (var.1 Control Tiempo2) D 119.71 12 7 (var.1 Aclima. Tiempo1) D D 116.93 12 2 (var.1 4ºC Tiempo1) D E D 110.16 12 8 (var1. Aclima. Tiempo2) G E D G E D 102.04 12 5 (var.1 4ºC Tiempo2) G E D G E D 100.78 12 3 (var.1 -2ºC Tiempo1) E E 90.003 12 6 (var.1 -2ºC Tiempo2)

*Tiempo1= 30minutos *Tiempo2= 60minutos

4. Actividad PFO. Prueba LSD de Fischer (P<0.05) para los tratamientos T17 a T22.



Agrupamiento Media N Tratamiento A 201.428 12 4 (var.2 Control) B 168.176 12 1 (var.1 Control) C 156.797 12 5 (var.2 4ºC) D 140.756 12 6 (var.2 -2ºC) E 74.291 12 2 (var.1 4ºC) E E 66.750 12 3 (var.1 -2ºC)

5. Contenido de Proteínas. Prueba LSD de Fischer (P<0.05) para los tratamientos T1 a T16.



Agrupamiento Media N Tratamiento A 0.54135 12 3 (var.1 -2ºC Tiempo2) A A 0.53137 12 2 (var.1 4ºC Tiempo2) A A 0.52568 12 8 (var.1 Aclima. Tiempo2) B 0.46833 12 6 (var.1 -2ºC Tiempo1) B B 0.46432 12 5 (var.1 4ºC Tiempo1) B E B 0.44833 12 7 (var.1 Aclima. Tiempo1) E B E B 0.44020 12 4 (var.1 Control. Tiempo2) E E 0.42531 12 1 (var.1 Control Tiempo1) E E 0.42136 12 13 (var.2 4ºC Tiempo2) E E C 0.41435 12 14 (var.2 -2ºC Tiempo2) C C 0.39931 12 16 (var.2 Aclima. Tiempo2) C F C 0.38932 12 11 (var.2 -2ºC Tiempo1) F C F C 0.38540 12 12 (var.2 Control Tiempo2) F C F C 0.37144 12 10 (var.2 4ºC Tiempo1) F F 0.36241 12 15 (var.2 Aclima. Tiempo1) F F 0.34927 12 9 (var.2 Control Tiempo1) *Tiempo1= 30minutos *Tiempo2= 60minutos

6. Contenido de Proteínas. Prueba LSD de Fischer (P<0.05) para los tratamientos T17 a T22.



Agrupamiento Media N Tratamiento A 0.81800 12 3 (var.1 -2ºC) B 0.72148 12 2 (var.1 4ºC) C 0.56501 12 6 (var.2 -2ºC) D 0.46666 12 5 (var.2 4ºC) D D 0.46525 12 1 (var.1 Control) E 0.37675 12 4 (var.2 Control)

Anexo 8

1. Análisis de Medidas Repetidas mediante el programa SAS para evaluar el efecto del tiempo postratamiento (10, 30 y 60 minutos) sobre la actividad enzimática POX en plantas de fresa var. Chandler y

Sweet Charlie. Análisis de medidas repetidas de la varianza Nivel del Tiempo: 1(10min) 2(30min) 3(60min) Variable dependiente: POX

Fuente

DF

Suma de Cuadrados


Valor F

Pr > F

Significancia

TIEMPO 2 5.356626 2.678313 0.05 0.9498 ns

TIEMPO*Aclim 2 47.859800 23.929900 0.46 0.6330 ns

TIEMPO*Var 2 34.848259 17.424130 0.34 0.7163 ns

TIEMPO*Tiempo 2 9.065641 4.532821 0.09 0.9166 ns

TIEMPO*Var*Tiempo 2 46.886215 23.443108 0.45 0.6389 ns

TIEMPO*Temper 4 127.215533 31.803883 0.61 0.6555 ns

TIEMPO*Var*Temper 4 137.104612 34.276153 0.66 0.6223 ns

TIEMPO*Tiempo*Temp 4 9.300326 2.325082 0.04 0.9961 ns

TIEMPO*Var*Tiempo*Temp 4 42.204149 10.551037 0.20 0.9359 ns

TIMPO*Aclima*Tiempo 2 10.246392 5.123196 0.10 0.9063 ns

Error(TIEMPO) 68 3534.284539 51.974773

2. Análisis de Medidas Repetidas mediante el programa SAS para evaluar el efecto del tiempo postratamiento (2, 4, 6 y 8 día) sobre la actividad POX en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie.

Análisis de medidas repetidas de la varianza Nivel del Tiempo: 1(2día) 2(4día) 3(6día) 4(8día) Variable dependiente: POX




Tiempo 3 2112.758912 704.252971 6.59 0.0012 **

Tiempo*Var 3 26.315271 8.771757 0.08 0.9694 ns

Tiempo*Temper 6 1086.312377 181.052063 1.69 0.1509 ns

Tiempo*Var*Temper 6 732.264215 122.044036 1.14 0.3587 ns

Error(Tiempo) 36 3848.954307 106.915397

3. Análisis de Medidas Repetidas mediante el programa SAS para evaluar el efecto del tiempo postratamiento (10, 30 y 60 minutos) sobre la actividad enzimática PFO en plantas de fresa var. Chandler y

Sweet Charlie.

Análisis de medidas repetidas de la varianza Nivel del Tiempo: 1(10min) 2(30min) 3(60min) Variable dependiente: PFO

Fuente

DF

Suma de Cuadrados


Valor F

Pr > F

Significancia

TIEMPO 2 9.101773 4.550886 0.07 0.9355 ns

TIEMPO*Aclim 2 191.366474 95.683237 1.40 0.2526 ns

TIEMPO*Var 2 413.394900 206.697450 3.03 0.0647 ns

TIEMPO*Tiempo 2 27.100467 13.550234 0.20 0.8201 ns


TIEMPO*Temper 4 281.740605 70.435151 1.03 0.3964 ns





Error(TIEMPO) 68 4633.783758 68.143879

4. Análisis de Medidas Repetidas mediante el programa SAS para evaluar el efecto del tiempo

postratamiento (2, 4, 6 y 8 día) sobre la actividad PFO en plantas de fresa var. Chandler y Sweet Charlie.

Análisis de medidas repetidas de la varianza Nivel del Tiempo: 1(2día) 2(4día) 3(6día) 4(8día) Variable dependiente: PFO




Tiempo 3 1314.325917 438.108639 4.56 0.0083 **

Tiempo*Var 3 31.960163 10.653388 0.11 0.9531 ns

Tiempo*Temper 6 1095.836172 182.639362 1.90 0.1071 ns


Error(Tiempo) 36 3455.711926 95.991998

5. Análisis de Medidas Repetidas mediante el programa SAS para evaluar el efecto del tiempo postratamiento (10, 30 y 60 minutos) sobre el contenido de proteínas en plantas de fresa var. Chandler y

Sweet Charlie.

Análisis de medidas repetidas de la varianza Nivel del Tiempo: 1(10min) 2(30min) 3(60min) Variable dependiente: Contenido de Proteínas

Fuente

DF

Suma de Cuadrados


Valor F

Pr > F

Significancia

TIEMPO 2 0.00091326 0.00045663 0.35 0.7056 ns

TIEMPO*Aclim 2 0.00124709 0.00062354 0.48 0.6217 ns

TIEMPO*Var 2 0.00017245 0.00008623 0.07 0.9360 ns

TIEMPO*Tiempo 2 0.00082297 0.00041148 0.32 0.7302 ns


TIEMPO*Temper 4 0.00341141 0.00085285 0.65 0.6256 ns





Error(TIEMPO) 68 0.08859194 0.00130282

6. Análisis de Medidas Repetidas mediante el programa SAS para evaluar el efecto del tiempo postratamiento (2, 4, 6 y 8 día) sobre el contenido de proteínas en plantas de fresa var. Chandler y Sweet

Charlie. Análisis de medidas repetidas de la varianza Nivel del Tiempo: 1(2día) 2(4día) 3(6día) 4(8día) Variable dependiente: Contenido de Proteínas



Valor F

Pr > F Significancia

Tiempo 3 0.05491064 0.01830355 4.33 0.0105 *

Tiempo*Var 3 0.06367071 0.02122357 5.02 0.0452 *

Tiempo*Temper 6 0.06505001 0.01084167 2.56 0.0360 *


Error(Tiempo) 36 0.15230757 0.00423077

Anexo 9

Datos de las Figuras (Gráficas)

Figura 15. Actividad Peroxidasa (POX). Extracción con tratamiento de acetona a -20ºC y evaluación de dos sustratos de la enzima: Guayacol y O-dianisidina

var. Chandler (Susceptible) var. Sweet Charlie (Tolerante)

Guayacol O-Dianisidina Guayacol O-Dianisidina

Planta1 55,2622 149,5748 104,5698 208,2541

Planta 2 64,4725 162,3458 99,2562 182,3652

Planta 3 73,546 136,2741 72,3145 213,3547

Promedio 64,4269 149,3982 92,0468 201,3246

Desv. Estándar 9,1419 13,0367 17,2939 16,6162

Figura 16. Actividad Polifenoloxidasa (PFO). Extracción con tratamiento de acetona a -20ºC y evaluación de dos

concentraciones del sustrato Catecol (50 y 100mM).


Catecol 50mM Catecol 100mM Catecol 50mM Catecol 100mM

P1 55,2622 149,5748 104,5698 208,2541

P2 64,4725 162,3458 99,2562 182,3652

P3 73,546 136,2741 72,3145 213,3547

Promedio 64,4269 149,3982 92,0468 201,3246

Desv. Estándar 9,14198 13,0367 17,2939 16,6162

Figura 17. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y -2ºC por 30min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min.


10min 30min 60min 10min 30min 60min

Control 136.37 ± 4.69 133.51 ± 5.66 137.61 ± 6.65 190.77 ± 4.90 189.14 ± 5.42 193.29 ± 6.44

4ºC 106.37 ± 11.13 100.34 ± 8.70 99.97 ± 8.05 175.01 ± 4.89 171.00 ± 4.40 172.06 ± 5.59

-2ºC 90.82 ± 11.94 88.01 ± 9.36 92.63 ± 10.63 170.70 ± 5.60 162.52 ± 4.90 168.04 ± 4.90

Aclim. 118.98 ± 13.27 121.62 ± 7.67 115.41 ± 10.18 181.03 ± 5.67 179.46 ± 6.01 182.63 ± 5.00 Figura 18. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y

-2ºC por 60min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min.

var. Chandler (Susceptible) var. Sweet Charlie (Tolerante) 10min 30min 60min 10min 30min 60min

Control 144.73 ± 7.44 137.49 ± 8.43 140.84 ± 8.60 187.77 ± 4.65 192.98 ± 4.86 194.66 ± 7.65

4ºC 97.27 ± 9.22 91.29 ± 8.15 93.65 ± 8.37 173.66 ± 6.40 171.03 ± 4.13 168.92 ± 3.24

-2ºC 87.56 ± 11.24 82.89 ± 9.74 84.48 ± 13.04 167.29 ± 6.14 161.18 ± 4.07 167.74 ± 3.41

Aclim 124.03 ± 9.56 120.15 ± 6.93 121.43 ± 11.19 184.14 ± 5.29 182.43 ± 3.82 183.65 ± 5.61

Figura 19. Actividad POX. Plantas de fresa variedad Chandler (S) aclimatadas y no aclimatadas expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después del tiempo de exposición.

var. Chandler (S) 10min

Control 144,73 ± 7.44

Aclimatadas 124,03 ± 9.56

No aclimatadas 87,56 ± 11.24

Figuras 20 y 22. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (Susceptible) expuestas a

4ºC y -2ºC por ocho días.

var. Chandler (Susceptible)

2día 4día 6día 8día

Control 140,598 ± 13,46 158,087 ± 14,38 149,727 ± 11,60 147,259 ± 11,54

4ºC 68,005 ± 7,81 53,949 ± 10,68 43,830 ± 7,66 38,479 ± 6,65

-2ºC 49,432 ± 8,00 36,384 ± 7,78 31,517 ± 6,15 30,337 ± 5,07

Figuras 21 y 22. Actividad POX. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.

var. Sweet Charlie (Tolerante)


Control 193,421 ± 12,27 191,917 ± 9,52 183,001 ± 10,82 189,262 ± 10,54

4ºC 155,027 ± 10,37 151,046 ± 14,65 144,835 ± 9,58 145,375 ± 9,86

-2ºC 145,250 ± 10,67 138,008 ± 14,22 129,373 ± 9,70 122,654 ± 11,34 Figura 23. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y


var. Chandler var. Sweet Charlie 10min 30min 60min 10min 30min 60min

Control 154,97 ± 6,20 158,10 ± 7,50 165,9 ± 7,73 213,83 ± 6,64 203,59± 5,52 215,43 ± 5,63

4ºC 117,32 ± 15,09 112,50 ± 11,83 120,98 ± 11,48 192,26 ± 6,88 189,27± 3,18 188,71 ± 7,25

-2ºC 108,41 ± 9,29 96,10 ± 11,37 97,84 ± 10,74 183,62 ± 8,30 170,01± 6,67 178,83 ± 9,57

Aclim. 126,34 ± 13,27 117.62 ± 7,67 115,18 ± 10,18 198,25 ± 6,28 194,21 ± 2,50 192,68 ± 7,99 Figura 24. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (S) y variedad Sweet Charlie (T) expuestas a 4ºC y


var. Chandler var. Sweet Charlie 10min 30min 60min 10min 30min 60min

Control 150,20 ± 7,44 163,81 ± 8,43 159,82 ± 8,60 208,14 ± 7,20 203,74 ± 4,56 202,41 ± 6,00

4ºC 100,99 ± 9,22 100,15 ± 8,15 104,98 ± 8,37 189,47 ± 4,13 184,23 ± 5,02 185,05 ± 4,31

-2ºC 91,01 ± 11,24 88,20± 9,74 90,88 ± 13,04 175,41± 2,69 165,40 ± 8,09 172,08 ± 3,05

Aclim. 111,95 ± 9,56 108,91 ± 6,93 109,62 ± 11,19 193,67 ± 5,76 192,54 ± 5,16 189,05 ± 4,03

Figura 25. Actividad PFO. Plantas de fresa variedad Chandler (S) aclimatadas y no aclimatadas expuestas a -2ºC por 60 minutos, a los 10 minutos después del tiempo de exposición.

var. Chandler (S) 10min

Control 150,20 ± 7.44

Aclimatadas 111,95 ± 9.56

No aclimatadas 91.01 ± 11.24 Figuras 26 y 28. Actividad PFO. Plantas de fresa Fragaria x ananassa var. Chandler (Susceptible) expuestas a

4ºC y -2ºC por ocho días.



Control 164,083 ± 13,41 168,327 ± 12,42 165,908 ± 12,952 174,383 ± 12,499

4ºC 85,717 ± 9,82 77,019 ± 10,94 70,422 ± 9,05 64,003 ± 8,68

-2ºC 78,173 ± 12,58 67,045 ± 6,44 59,984 ± 9,44 57,349 ± 7,58 Figuras 27 y 28. Actividad PFO. Plantas var. Sweet Charlie (Tolerante) expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.



Control 202,958 ± 6,23 201,244 ± 7,30 200,769 ± 10,92 200,739 ± 12,02

4ºC 165,116 ± 12,21 156,448 ± 7,47 156,026 ± 9,04 149,597 ± 12,77

-2ºC 150,215 ± 7,45 146,132 ± 9,18 135,389 ± 14,58 131,287 ± 14,16 Contenido de Proteínas. Plantas de fresa variedad S y variedad T expuestas a 4ºC y -2ºC por

30min y las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 30min var. Chandler (Susceptible) var. Sweet Charlie (Tolerante) 10min 30min 60min 10min 30min 60min

Control 0,420 ± 0,029 0,408 ± 0,037 0,448 ± 0,004 0,339 ± 0,041 0,350 ± 0,037 0,358 ± 0,036

4ºC 0,475 ± 0,004 0,473 ± 0,023 0,445 ± 0,055 0,365 ± 0,006 0,381 ± 0,006 0,367 ± 0,016

-2ºC 0,447 ± 0,064 0,487 ± 0,065 0,471 ± 0,061 0,401 ± 0,069 0,376 ± 0,034 0,391 ± 0,034

Aclim. 0,434 ± 0,020 0,452 ± 0,033 0,459 ± 0,021 0,354 ± 0,035 0,367 ± 0,024 0,365 ± 0,037 Figura 29. Contenido de Proteínas. Plantas de fresa variedad S y variedad T expuestas a 4ºC y -2ºC por 60min y

las mismas variedades aclimatadas con posterior exposición a -2ºC por 60min var. Chandler (Susceptible) var. Sweet Charlie (Tolerante) 10min 30min 60min 10min 30min 60min

Control 0,433 ± 0.014 0,451 ± 0.035 0.436 ± 0.022 0,382 ± 0,024 0,380 ± 0,027 0,393 ± 0,016

4ºC 0,538± 0,015 0,559 ± 0,027 0,497 ± 0,060 0,427 ± 0,031 0,408 ± 0,009 0,430 ± 0,059

-2ºC 0,550 ± 0,031 0,541 ± 0,024 0,533 ± 0,047 0,409 ± 0,034 0,409 ± 0,036 0,425 ± 0,079

Aclim 0,509 ± 0.019 0,538 ± 0.030 0,528 ± 0.050 0,394 ± 0,048 0,397 ± 0,009 0,407 ± 0,045

Figura 30. Contenido de Proteínas. Plantas var. Chandler y Sweet Charlie expuestas a 4ºC y -2ºC por ocho días.



Control 0,437 ± 0,0501 0,455 ± 0,0546 0,474 ± 0,0432 0,495 ± 0,0283

4ºC 0,5767 ± 0,0497 0,7196± 0,0598 0,7811± 0,0739 0,8083 ± 0,1163

-2ºC 0,7118 ± 0,1333 0,748± 0,0475 0,9524± 0,1587 0,8588 ± 0,0756



Control 0,3965 ± 0,0261 0,3755 ± 0,0151 0,3716 ± 0,0316 0,3632 ± 0,0068

4ºC 0,4836 ± 0,0467 0,4838 ± 0,0222 0,4349 ± 0,0600 0,4641 ± 0,0517

-2ºC 0,5391± 0,0032 0,5411± 0,0295 0,5801 ± 0,0561 0,5996 ± 0,0472

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