BIOQUIMICAAREA: PROTEINAS

Protocolo de procesado de la muestra.

Recogida de la muestra en montacargas y separación de cada muestra según la prueba que se vaya a realizar.

No tiene porque pedirse todas las pruebas, pero si se piediesen este seria el orden a seguir:

Se realiza la determinación en el nefelómetro de las distintas pruebas que se pidan por el facultativo: En orina: cadenas ligeras (kappa y lambda), proteínas totales y

β-2-microglobulina. En suero y liquido cefalorraquídeo (LCR): inmunoglobulinas

(Ig), cadenas ligeras (kappa y lambda), CDT, LPA y RBP.

Determinación de electroforesis capilar. Este aparato lo que hace es crear una curva a partir de las diferentes absorvancias que aprecia y de ahí hace una interpretación según la curva de lo que se vería en agar y es más precisa que la electroforesis en agar que crea la curva a través del agar.

Determinación de Inmunoelectroforesis en suero: Uso previsto: su objetivo es la separación e identificación de gammapatias

monoclonales (estado de enfermedad primario en el que solo un clon de células del plasma produce elevados niveles de una inmunoglobulina de una sola clase y tipo, conocidas como proteínas monoclonales, proteínas M o paraproteinas) por electroforesis con gel de agarosa.

La inmunofijación (IFE) se realiza en dos etapas aplicando electroforesis en agarosa de alta resolución en la primera etapa e inmunoprecipitación en la segunda.

La presencia de proteínas monoclonales puede ser de naturaleza benigna o maligna como en el mieloma múltiple o la macroglobulinemia de Waldenström. Hay que estableces diferencia entre gammapatias policlonales que son un estado de enfermedad secundario debido a desordenes clínicos como enfermedad crónica de hígado, desordenes de colágeno, artritis reumatoide e infecciones crónicas de las monoclonales.

Las proteínas de la orina proceden principalmente de proteínas plasmáticas que se fijan a través del riñon. La aparición de proteínas plasmáticas anormales en la orina tiene un gran valor para la evaluación de las funciones renales. Un estudio de la proteinuria debe incluir la valoración cuantitativa y cualitativa del tipo y cantidad de proteínas escretadas. La combinación de la separación electroforética de proteínas en la orina unida a la identificación de tipos específicos de proteínas mediante inmunoprecipitación, permite diferenciar varios tipos de proteinuria – fisiológica, glomerular (selectiva y no selectiva), tubular y proteinuria asociada con disglobulinemias.

La IFE separa las seroproteinas según la carga en un gel de agarosa. Luego las proteínas son incubadas con antisuero monoespecifico, lavadas y coloreadas para permitir la visualización del inmunoprecipitado para obtener una interpretación cualitativa.

Componentes para la realización de la prueba: Gel de agarosa Colorante violeta acido concentrado Solucion decolorante Solucion de lavado Solucion diluyente de muestras Kit de antisuero (IgG, IgA, IgM, Kappa y Lambda)

Recogida y preparación de muestras:La muestra consistirá en suero recién obtenido, pudiéndose

guardar hasta 4dias entre 15 y 30ºC, 2 semanas entre 2 6 ºC o 6 meses a -20ºC.

Procedimiento: Se programan los siguientes parámetros en el instrumento:

Cargar muestra 30seg. 21ºC Aplicar muestra 30seg. 21ºC Electroforesis 6min. 30seg. 21ºC, voltaje 650 Aplicar antisuero 10min. 21ºC Insertar peine 2 min 21ºC Secante D 5min. 40ºC Secar 8min. 54ºC

Nota: para la inmunifijacion del suero, se necesita 1 aplicación de la muestra. Para la de la orina se necesitan 10 aplicaciones.

Pueden estudiarse simultáneamente muestras de orina y suero en un mismo gel, sin embargo cada fila individual debe contener solo un tipo de muestra. Si se van a combinar suero y orina en las primeras 9 aplicaciones solo iran colocados los peines donde se encuentre la orina. A continuación de añadirá el peine del suero y se procederá a la decima y ultima aplicación.

Para preparar la muestra se mira el resultado de IgG obtenido en el nefelómetro: Si es < de 1000 se diluye a ½. Si es > de 1000 se diluye a 1/6.Nota: Si las IgA son > de 1000 se diluye a 1/5. 

Por cada paciente se preparan 2 tubos de ensayo, uno delante del otro:En el de detrás echamos una parte de la muestra y las demás partes hasta completar la dilución correspondiente de dilución helena (morada). Cada parte será de 130ul. (tubo 1).

En el de delante echamos una parte del diluyente helena y una parte de la dilución del primer tubo preparado, siendo este una dilución a la mitad del primero. (tubo 2).

En las placas hay 6 pocillos para cada paciente y se distribuye las muestras de la siguiente manera: Pocillo 1, 4, 5 y 6: 30ul del tubo 1. Pocillo 2 y 3: 30 ul del tubo 2.

Colocamos la placa de agar en el aparato echando antes debajo de la placa unas gotas de la solución que corresponde para que la corriente pase adecuadamente.

La secamos por encima para quitar el exceso se conservante con papel de filtro C-30.

Colocamos los imanes a cada lado de la placa para crear un circuito cerrado por el que pase la corriente.

Se coloca la placa donde hemos echado las muestras en el lugar correspondiente (al lado del agar).

Se colocan las peinetas en los nº 2, 8 y 14 que serán las encargadas de depositar la muestra en el agar y por eso se colocan en esa posición para que no se mezclen unas muestras con otras.

Conectamos el aparato.

Cuando pite quitamos los imanes. Con una paleta quitamos el gel sobrante que estaba debajo de los imanes que tiene relieve.

Colocamos la placa de cristal que posee ranuras para echar el antisuero correspondiente: 58ul de lambda (1º), 58ul de kappa (2º), 58ul de IgM (3º), 58ul

de IgA (4º), 58ul de IgG (5º), 58ul de proteínas totales (6º)

Colocamos los peines absorbentes para que cojan el exceso de antisuero y damos a enter.

Levantamos la placa y ponemos papel secante D-10 por la cara rugosa y la volvemos a poner y pulsamos enter nuevamente.

Quitamos la placa de cristal y el papel secante y damos a enter.

Cambiamos la placa a otro aparato en el que se lava y tiñe (antes mirar que todos los reactivos necesarios están colocados)La programamos (programa IFE suero), colocamos la placa en el soporte y la iniciamos.

Se identifican cada muestra y se le da el agar al facultativo para su interpretación.

Interpretación de los resultados:La mayoría de la proteína monoclonales migran en la región gamma, del patrón proteínico, aunque debido a su naturaleza anormal pueden migrar a cualquier lugar dentro de la región globulínica durante la electroforesis proteínica. La banda proteínica monoclonal en el patrón de inmunofijación ocupara la misma posición y forma que la banda anormal en el patrón seroproteínico. La proteína anormal se identifica por la forma en que reacciona con ella el tipo de antisuero especifico.Cuando existen varias concentraciones de proteínas anormales, la banda anormal puede aparecer como una banda dentro de la inmunoglobulina policlonal anormal. También se puede observar una banda dentro de un fondo policlonal cuando también se da una fuerte presencia de inmunoglobulina policlonal.