OPTIMAZACIÓN DE LA REACCIÓN DE PCR en sangre periférica y deyecciones de triatominos en pacientes chagácicos.

Aragón, Carolina; Sobisch, Leonardo; Zambrano, Karen.Estudios Interdiciplinarios de la Enfermendad de Chagas.Año 2012.UNSL – FQByF.

INTRODUCCIÓN

El presente estudio fue realizado en Chile.

Las regiones rurales y periurbanas de la III y IV región son hiperendémicas.

Se estima que hay 150000 individuos afectados.(2005)

Ubicación Geográfica.

En la imagen se muestran las regiones del país de Chile

Regiones Hiperendémicas ( III y IV)

En Chile existen 3 vectores: -Triatoma infestans - Mepraia spinolai

(autoctono de Chile) - Mepraia gajardoi

La transmisión vertical es el mecanismo mas importante.

Pacientes en fase crónica

Se orienta a la pesquisa la detección de Ac específicos mediantes técnicas serológicas convencionales( ELISA, IFI) métodos de alta sensibilidad y especificidad.

Para el diagnostico parasitológico, las herramientas mas utilizadas son:

- Xenodiagnóstico XD- Reacción en cadena de la polimerasa

PCR

PCR

Se utiliza para el diagnostico y en el seguimiento de individuos tratados.

Acelera la detección del parasito en pacientes de fase crónica.

Es una herramienta complementaria al XD, dada la capacidad del mismo de amplificar a T. cruzi al actuar como medio de cultivo biológico.

OBJETIVO DEL ESTUDIO

Evaluar el diagnostico parasitológico en pacientes chagásicos crónicos mediante PCR en sangre periférica y deyecciones de Triatominos alimentados mediante XD en pacientes chagácicos crónicos, según técnicas de extracción y purificación del DNA.

Materiales y Metodos utilizados

POBLACION: 50 pacientes en fase crónica de la IV región de Chile.

Se determina infección por T. cruzi mediante:

-IFI: con un titulo igual o superior a 1/20.

-ELISA: con D.O mayor o igual a 0,20. OBTECIÓN MUESTRA DE SANGRE:

2ml de sangre venosa con igual volumen de sc guanidina-HCl 6M y EDTA 0,2M.

Se incuba la sangre a 98 °C durante 15 min.

XENODIAGNÓSTICO: esto se realiza de forma paralela a la toma de muestra de sangre.

Se preparó pool con las deyecciones obtenidas de cada período de incubación para la reacción de PCR-XD.

SE OBUVIERON DOS GRUPOS:1. 25 personas XD (+)2. 25 personas XD (-)

Método de extracción y/o purificación de las muestras de sangre periférica.

Extracción con fenol-cloroformo (Caso 1).

Extracción con fenol-cloroformo y purificación con Sephadex (Caso 2).

Extracción y purificación con solución de CHOMEZYNSKI con fenol (Caso 3).

Extracción y purificación con el Kit comercial Jetquick Blood DNA purification (Caso 4).

Métodos y purificación de las muestras de deyecciones.

Purificación con Sephadex G 25 (Caso 5).

Extracción y purificación con la solución de CHOMEZYNSKI con fenol (Caso 6).

Purificación con el Kit comercial Jetquick Blood DNA purification (Caso 7).

Verificación y presencia de DNA por espectofotometría.

Reacción PCR

Mix PCR1. Primers Oligonucleótidos

Kinetoplastídicos 121 y 122: 3 µl (10 µM)

2. Buffer Taq Polimerasa: 4 ml3. MgCl2: 2 µl (2mM)4. 4 desoxiNTP: 0.4 µl (10mM)5. Taq Polimerasa: 0.2 µl (1U)6. H2O destilada: 2.4 µl

Etapas de PCR

Desnaturalización a 98°C durante 1 min.

Hibridación 64°C por 1 min. Extención a 72°C por 2 min.

Se realizaron 33 ciclos intermediarios.

10 µl del amplificado se sometieron a ELECTROFORÉSIS.

Resultados.

Muestras de sangre periférica:

1. Caso 1: XD (-) evidencia que existen niveles indetectables de parásitos en el 96% de los casos. XD (+) el 76 % de los casos no se detectan T. cruzi mediante PCR.

2. Caso 2: XD (-) aumenta el 16 % de la detección de T. cruzi en las muestras. XD (+) no hay variaciones en el rendimiento.

Caso 3: XD (+) tuvo mejor rendimiento en un 24 % con respecto a los dos métodos anteriores.

Caso 4: XD (-) es más eficaz, evidenciando parásitos en el 76 % de los casos. XD (+) evidencia parásitos en el 40% de los casos.

Muestras de deyecciones:

Caso 5: XD (+) el rendimiento fue bajo.

Caso 6: resultados similares al anterior.

Caso 7: XD (-) se detectó parásitos en el 84% de los casos. XD (+) detecta parásitos en el 96% de los casos.

Conclusión.

En relación a las extracción, es mejor trabajar con el Kit comercial, ya que proporciona mayor especificidad tanto en muestras de sangre como en deyecciones.

En cuanto a la elección del tipo de muestra, es óptimo trabajar con deyecciones ya que el Triatoma infestans actúa como medio de cultivo biológico, además, el ADN obtenido es de mayor calidad.

Es crucial la cantidad de muestra a amplificar, debido a que contribuye a la optimización de la técnica.

En pacientes crónicos la parasitemia es baja y oscilante, en los casos negativos un factor a considerar puede ser el volumen de sangre tomado, y es por esto que la PCR es una herramienta eficaz en la detección de T. cruzi.

Muchas Gracias…