Apuntes TEMA 8_Metabolismo Oxidativo (1)

Bioquímica. Carmen Martínez URJC Metabolismo oxidativo

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Tema 8. Oxidación del piruvato y ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Transporte electrónico mitocondrial y fosforilación oxidativa.

� Aspectos generales del metabolismo respiratorio aerobio. Organización estructural de la

mitocondria y sus implicaciones metabólicas.

� Descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA por el complejo multienzimático de la

piruvato deshidrogenasa. Enzimas y coenzimas participantes. Mecanismo de acción. Regulación.

� Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. • Estrategia de la ruta. Reacciones y enzimas que intervienen. Balance global y

rendimiento energético. Regulación.

• Papel central y anfibólico del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en el metabolismo

degradativo y biosintético.

• Reacciones anapleróticas para la reposición de metabolitos del ciclo de los ácidos

tricarboxílicos usados con fines biosínteticos.

� Cadena respiratoria transportadora de electrones. • Visión global de las reacciones redox a favor de caídas de potencial. Termodinámica del

transporte electrónico. Reoxidación de los coenzimas NADH y FADH2. Eficiencia del

transporte electrónico.

• Transportadores electrónicos, la lógica de su secuencia en la cadena respiratoria.

Potenciales redox de los distintos componentes.

• Descripción molecular de los distintos complejos, constitución proteica, grupos

prostéticos, iones y tipos de transferencia electrónica que llevan a cabo. Rutas

propuestas de transporte electrónico (grupos implicados) y bombeo de protones.

� Complejo I: NADH-ubiquinona reductasa.

� Complejo II: Succinato-ubiquinona reductasa.

� Complejo III: Ubiquinona-citocromo c reductasa.

� Complejo IV: Citocromo c oxidasa.

• Determinación de la secuencia de los transportadores electrónicos respiratorios.

Inhibidores respiratorios.

• Sistemas de transporte de poder reductor a través de la membrana interna mitocondrial:

lanzaderas metabólicas.

� Fosforilación oxidativa: • Síntesis de ATP acoplada al transporte electrónico mitocondrial. La relación P/O,

eficiencia de la fosforilación oxidativa.

• Mecanismo de la fosforilación oxidativa: hipótesis quimiosmótica de Mitchell.

Generación de un gradiente electroquímico de protones (∆µH).

• El complejo ATP sintasa: subunidades. Mecanismo de síntesis de ATP. Inhibidores de

la ATP sintasa.

• Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. Función fisiológica del desacoplamiento:

termogénesis. Control respiratorio.

• Utilización de la energía del transporte electrónico en procesos distintos a la síntesis de

ATP.

Bibliografía

Lehninger AL, Nelson DL y Cox MM (1993) Principios de Bioquímica. Caps.16 y19 Mathews CK y van Holde KE (1998) Bioquímica, Caps.14 y 15. Stryer L (1995) Bioquímica. Caps. 20 y 21. Voet D, Voet JG y Pratt CW (2007) Fundamentos de Bioquímica. Caps. 16 y 17.


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Tema 8. Oxidación del piruvato y ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Transporte electrónico mitocondrial y fosforilación oxidativa.

En el tema anterior se vio cómo el piruvato, en condiciones anaeróbicas, es

reducido a lactato en células animales. En presencia de O2 el piruvato va a ser oxidado

completamente a CO2 y H2O. Los electrones liberados durante los múltiples pasos de

oxidación se transfieren a coenzimas (en su forma oxidada), principalmente NAD+,

generándose así transportadores electrónicos reducidos, NADH. Estos transportadores

se reoxidan posteriormente en la cadena respiratoria mitocondrial (de transporte de

electrones). Tales reacciones aportan la energía que impulsa la síntesis de ATP a

través de la fosforilación oxidativa.

Así pues, en condiciones aeróbicas el piruvato entra en la mitocondria y es

convertido en acetil-CoA (el coenzima A activa y transfiere grupos acilo). Esta

constituye la primera etapa de la respiración (la respiración mitocondrial se puede

considerar dividida en tres etapas). En una segunda etapa los dos átomos de carbono

del acetil-CoA se oxidan a CO2 en el ciclo de Krebs, generándose transportadores

electrónicos reducidos. La cadena de transporte electrónico y la fosforilación oxidativa

constituyen la tercera y última etapa.

El ciclo de Krebs está considerado como la ruta central del metabolismo aeróbico: es la ruta oxidativa central de la respiración, proceso mediante el cual se

catabolizan todos los combustibles metabólicos (hidratos de carbono, lípidos y

proteínas) en los organismos y tejidos aerobios. Además, el ciclo de Krebs es una

fuente importante de intermediarios de rutas biosintéticas y, acoplado a la fosforilación

oxidativa, la principal fuente de energía metabólica.

El ciclo de Krebs se llama así en honor de su descubridor (Hans Krebs).

También recibe el nombre de ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), puesto que se

identificó a partir de los ácidos tricarboxílicos que actúan como intermediarios. O

también ciclo del ácido cítrico, dado que el citrato es un intermediario clave de esta

secuencia de reacciones.

El ciclo de Krebs consta de 8 reacciones catalizadas enzimáticamente y

transcurre en la matriz mitocondrial de células eucariotas. Básicamente, consiste en lo

siguiente: el grupo acetilo del acetil CoA se transfiere a un ácido orgánico de 4 C, el

OAA, para dar un ácido tricarboxílico de 6 C, el citrato. El citrato entra en una serie de

reacciones durante las cuales se liberan 2 C en forma de CO2 y los 4 C restantes se

regeneran en forma de OAA, que puede iniciar de nuevo el proceso. De ahí la

naturaleza cíclica de la ruta: el OAA está presente al inicio, para reaccionar con un

fragmento de 2 C activado, y está presente al final, después de que se hayan oxidado 2

C hasta CO2. De las ocho reacciones del ciclo, cuatro son deshidrogenaciones, que

generan 3 NADH y 1 FADH2.


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MITOCONDRIA: estructura, compartimentación y función.

Las mitocondrias son orgánulos del tamaño de una bacteria que se encuentran

en el citoplasma de todas las células eucariotas aeróbicas. Son los centros de la

respiración celular y donde tiene lugar la mayor parte de la producción de energía en

forma de ATP, para cubrir todas las necesidades celulares.

La mitocondria está limitada por dos membranas altamente especializadas, con

propiedades y funciones biológicas distintas. La membrana externa es permeable a

moléculas de bajo peso molecular (menor de 10000). La membrana interna, por el

contrario, es prácticamente impermeable a sustancias polares e iónicas. Estas

sustancias entran en la mitocondria únicamente por la mediación de proteínas

transportadoras específicas. Los complejos proteicos de la cadena respiratoria

transportadora de electrones están localizados en la membrana mitocondrial interna,

igual que la enzima que sintetiza ATP: la ATP sintasa.

La membrana interna mitocondrial está replegada en numerosas crestas que

aumentan considerablemente su superficie total.

El espacio entre las membranas externa e interna se conoce como el espacio

intermembrana. Como la membrana externa mitocondrial es permeable a moléculas

pequeñas, este espacio tiene prácticamente la misma composición iónica que el citosol.

La región limitada por la membrana interna es la matriz mitocondrial. La matriz

contiene una mezcla altamente concentrada de cientos de enzimas diferentes,

incluídas las necesarias para la oxidación del piruvato y de los ácidos grasos y para el

ciclo de Krebs. También posee varias copias idénticas del genoma de DNA

mitocondrial, ribosomas mitocondriales especiales y varias enzimas necesarias para la

expresión de los genes mitocondriales. La mitocondria no es, sin embargo,

genéticamente autónoma, y los genes que codifican para la mayoría de las proteínas

mitocondriales están en el DNA nuclear.

Complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa (PDH)

El piruvato procedente de la oxidación de los hidratos de carbono es tan sólo

uno de los principales suministradores de acetil CoA para la oxidación en el ciclo de

Krebs. La degradación de las grasas, mediante la β-oxidación de los ácidos grasos, y

algunas rutas del catabolismo de los aminoácidos también generan acetil CoA.

Antes de entrar en el ciclo de Krebs el piruvato ha de sufrir una descarboxilación

oxidativa para formar acetil CoA. Esta reacción está catalizada por un complejo

multienzimático denominado piruvato deshidrogenasa (PDH), que está localizado en la

matriz mitocondrial. Puesto que la glucólisis transcurre en el citoplasma, el piruvato

tiene que entrar al interior de la mitocondria, y lo hace gracias a un transportador

específico que existe en la membrana interna mitocondrial.


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En la reacción global catalizada por la PDH el grupo carboxilo del piruvato se

pierde como CO2, mientras que los dos carbonos restantes forman la porción acetilo

del acetil CoA.

Pyr + NAD+ + CoA-SH → Acetil CoA + NADH + CO2 ∆Gº’= - 33.5 kJ/mol

La reacción es altamente exergónica e, in vivo, es básicamente irreversible.

La PDH es un complejo multienzimático formado por 3 enzimas diferentes:

E1 Piruvato deshidrogenasa (PDH)

E2 Dihidrolipoil transacetilasa (DLT)

E3 Dihidrolipoil deshidrogenasa (DLDH)

Y por 5 coenzimas, 3 de los cuales están unidos a las enzimas y no aparecen en la

reacción ajustada:

E1-TPP (pirofosfato de tiamina)

E2-ácido lipoico

E3-FAD

Y los 2 restantes sí aparecen en la reacción ajustada:

CoA-SH

NADH

Veamos ahora cómo actúan todos estos componentes de manera conjunta para

producir la conversión del piruvato en acetil CoA. En la figura se muestra la secuencia

de reacciones.

1) Descarboxilación E1

Pyr + TPP hidroxietil-TPP + CO2

En una primera etapa el enzima PDH (E1), con la participación de TPP,

descarboxila el piruvato. El pirofosfato de tiamina (TPP) es el coenzima para

todas las descarboxilaciones de los α-cetoácidos. El mecanismo de esta

reacción es semejante al de la pyr descarboxilasa (en la fermentación

alcohólica). El átomo de carbono en posición 2 del anillo de tiazol del TPP

reacciona con el grupo carbonilo del piruvato para dar CO2 y un derivado

hidroxietil unido al TPP.

2) El derivado hidroxietil origina tras esta segunda reacción el grupo acetilo del

acetil-CoA. El ácido lipoico se une covalentemente, mediante enlace amida, a un

residuo de lisina de la DLT, formando un grupo lipoil-lisilo que actúa como un

largo “brazo” que oscila entre la PDH y la DLDH. En primer lugar el grupo

hidroxietil se transfiere a la lipoamida (unida a DLT) y se oxida simultáneamente

a grupo acetilo, en tanto que la lipoamida se reduce a su forma ditiol.


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S E1 S-acetil

Hidroxietil-TPP + Lip TPP + Lip

S SH

3) A continuación la DLT (E2) (una transferasa de grupos acetilo) transfiere el grupo

acetilo al grupo tiol del CoA, formándose acetil CoA, que ya puede entrar en el

ciclo de Krebs para ser oxidado.

S-acetil E2 SH

Lip + CoA-SH acetil CoA + Lip

SH SH

4) La lipoamida se vuelve a oxidar a expensas de la tercera enzima del complejo, la

DLDH (E3), para completar el ciclo. Transfiere los electrones al coenzima FAD

(unido a DLDH).

SH E3 S

Lip + FAD Lip + FADH2

SH S

5) El FADH2 producido en esta reacción es entonces reoxidado por el NAD+

generando NADH, que junto con el acetil CoA y el CO2 son los productos finales

de la reacción del complejo PDH.

E3

FADH2 + NAD+ FAD + NADH + H

+

El complejo PDH de eucariotas, con un peso molecular superior a los 8 millones,

contiene múltiples copias de cada una de las actividades enzimáticas E1, E2 y E3, así

como pequeñas cantidades de dos enzimas reguladoras: PDH quinasa y PDH

fosfatasa.

Regulación de PDH

La regulación de la oxidación del piruvato por el complejo PDH es un punto

fundamental de la regulación del metabolismo de los hidratos de carbono. De ahí que la

PDH esté sometida a distintos tipos de regulación.

La actividad de este complejo está controlada por una modulación alostérica y

por una modificación covalente que se controla, a su vez, por el estado energético de la

célula.

E2 (DLT) y E3 (DLDH) están reguladas alostéricamente:

• E2 se inhibe por acetil CoA y se activa por coenzima A libre.

• E3 se inhibe por ATP y NADH y se activa por AMP y NAD+

Así pues, la actividad de la PDH está coordinada con la carga energética, la

relación NAD+/NADH y la relación entre la forma de coenzima A acetilada y libre.


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El estado energético neto de la célula influye directamente en la producción de

acetil CoA: cuando el nivel energético de la célula es bajo, el piruvato es oxidado por

PDH en la mitocondria, pero según aumenta el nivel energético de la célula, la

combinación de ATP y NADH inhiben el ciclo de Krebs, por lo que se acumula acetil

CoA.

El acetil CoA y el NADH son activadores alostéricos de la PDH quinasa, que es

la enzima que está involucrada en la modificación covalente y en la regulación de la

PDH de mamíferos. La modificación covalente consiste en una fosforilación/

defosforilación de residuos de serina de E1.

Cuando dentro de la mitocondria aumenta la concentración de NADH y acetil-

CoA, éstos activan alostéricamente a la PDH quinasa, que fosforila residuos de serina

de E1, dando lugar a una pérdida de actividad PDH.

Una PDH fosfatasa específica elimina hidrolíticamente el Pi unido y reactiva el

complejo. La fosfatasa se activa por Ca2+ y Mg2+.

Dado que el ATP y el ADP difieren en sus afinidades por Mg2+ (ATP tiene más

afinidad por Mg2+ que ADP), la concentración de Mg2+ libre refleja la relación ATP/ADP

dentro de la mitocondria.

Así pues, la PDH responde a las [ATP], quedando desactivada cuando el ATP es

abundante y no es necesaria una mayor producción de energía.

La proteína quinasa es parte integrante del complejo PDH mientras que la

fosfatasa sólo está unida de forma laxa.

CICLO DE KREBS

La función primaria del ciclo de Krebs consiste en oxidar los grupos acetilo que

entran en el ciclo en forma de acetil CoA. Al entrar en el ciclo, el grupo acetilo de 2C se

combina con un compuesto de 4C, el oxalacetato (OAA), para formar otro de 6C, el

citrato, un ácido tricarboxílico. En el curso de este ciclo, 2 de los 6C se oxidan a CO2 y

se regenera el OAA, completándose así el ciclo. El CO2 producido en estas reacciones

sale de la mitocondria por difusión y abandona la célula.

En cada vuelta el ciclo utiliza un grupo acetilo y regenera una molécula de OAA,

que queda lista para volver a iniciar el proceso. A lo largo de estos pasos, parte de la

energía liberada en la oxidación de los átomos de carbono se utiliza para convertir ADP

en ATP (aunque el paso de succinil CoA a succinato produce GTP en lugar de ATP,

todos los nucleósidos trifosfato son energéticamente equivalentes, debido a reacciones

de intercambio tales como ADP + GTP ↔ ATP + GDP). El resto de la energía de

oxidación se utiliza para transformar NAD+ en NADH (3 moléculas por ciclo) y FAD en

FADH2 (una molécula por ciclo).

Las moléculas de NADH y FADH2 van a transferir sus electrones ricos en

energía a la cadena respiratoria, al final de la cual los electrones se utilizan para reducir

el O2 a H2O. En estas reacciones se libera una gran cantidad de energía que es

utilizada por la ATP sintasa para generar ATP (fosforilación oxidativa).


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La reacción global del ciclo de TCA es:

Acetil CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O → 2CO2 + CoA-SH + 3NADH + 3H

+ + FADH2 + GTP

De la misma forma que consideramos dos fases en la glucólisis, también

conviene considerar dos fases diferenciadas en el ciclo de Krebs. La primera fase

(reacciones 1 a 4) se emplea fundamentalmente para oxidar 2C a CO2, mientras que la

segunda fase (reacciones 5 a 8) sirve fundamentalmente para regenerar el OAA.

TCA-1 La primera reacción del ciclo es similar a una condensación aldólica entre el

grupo ceto del OAA y el grupo metilo del acetil CoA, catalizada por la citrato sintasa.

Acetil CoA + OAA + H2O → citrato + CoA-SH + H+

El mecanismo de reacción es el siguiente: un residuo básico de la enzima extrae

un H+ del grupo metilo del acetil CoA, creando un carbanión nucleófilo que ataca al

carbono ceto del OAA. Esta reacción genera el compuesto enormemente inestable

citroil CoA, que espontáneamente se hidroliza mientras está unido al enzima para dar

los productos: citrato y coenzima A.

Como es de prever en el primer paso de entrada a una ruta, la reacción es

altamente exergónica (la hidrólisis del tioéster libera energía) ∆Gº’= -32.2 kJ/mol, y se

ha considerado que constituye un lugar de regulación para el conjunto de la ruta. La

actividad de la citrato sintasa está determinada en gran manera por la disponibilidad de

sustratos: acetil CoA y OAA. Además se inhibe alostéricamente por NADH y succinil-

CoA (compite con acetil CoA).

La citrato sintasa es un dímero. Cada subunidad tiene dos dominios; el centro

activo está situado en una hendidura entre los dos dominios. La unión de los sustratos

provoca un cambio conformacional en la enzima que hace que los sustratos queden

ocultos, protegiendo así al anión intermediario, el carbanión, del H2O y, por tanto, de

una rápida protonación. (ver modelo del ajuste inducido de la catálisis enzimática)

TCA-2 La siguiente reacción, catalizada por la aconitasa, isomeriza el citrato a

isocitrato, con el objetivo de obtener un grupo hidroxilo secundario capaz de ser

oxidado (pues el hidroxilo terciario no puede serlo).

La reacción comporta una deshidratación e hidratación consecutivas, a través

del cis-aconitato como intermediario deshidratado, que se mantiene unido a la enzima.

Citrato ↔ cis-aconitato ↔ isocitrato

Es una reacción endergónica, su ∆Gº’ es positivo (∆Gº’ = + 6.3 kJ/mol), sin

embargo se encuentra desplazada hacia la formación de isocitrato porque la siguiente

reacción es muy exergónica.


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La aconitasa contiene hierro no hemo y azufre que forman un centro hierro-

azufre en el centro activo. El hierro forma un complejo con el citrato, a través de 2

grupos carboxilo y un grupo hidroxilo de la molécula de citrato. Cuando una enzima se

une al sustrato en tres puntos o más, el lugar de fijación es asimétrico y puede unir al

sustrato tan sólo en una dirección. Esto hace que el citrato, una molécula simétrica

(tiene un plano de simetría, que pasa por C3) se haga asimétrica tras la unión a la

superficie asimétrica de la aconitasa.

Por eso se dice que el citrato es una molécula proquiral. La aconitasa convierte

el citrato, proquiral, en isocitrato, quiral. (una molécula quiral es aquella que contiene un

carbono asimétrico, un C con 4 sustituyentes distintos, y en consecuencia tiene

enantiómeros, es decir, isómeros que son imágenes especulares no superponibles

entre sí).

La aconitasa es, pues, estereoespecífica e introduce el grupo –OH en el carbono

que no proviene del acetil CoA recién incorporado.

Un inhibidor específico de la aconitasa es el fluorocitrato, que se forma por la

condensación de OAA y fluoroacetato (fluoroacetil-CoA) catalizada por la citrato

sintasa. El fluoroacetato se encuentra en las hojas de una variedad de plantas

venenosas y se utiliza como veneno para ratas.

El fluoroacetato por sí mismo no es tóxico para la célula, pero cuando se

convierte en fluorocitrato, éste se une y bloquea el centro activo de la aconitasa,

inhibiendo así el ciclo de Krebs.

TCA-3 La primera de las dos descarboxilaciones oxidativas del ciclo la cataliza la

isocitrato deshidrogenasa (dependiente de NAD+). En esta reacción se forma un

intermediario inestable, unido al enzima, que es el oxalsuccinato. Este se descarboxila

espontáneamente antes de ser liberado del enzima.

Isocitrato + NAD+ ↔ α-KG + NADH + CO2 ∆Gº’ = - 20.9 kJ/mol

La isocitrato deshidrogenasa cataliza, pues, la descarboxilación del isocitrato,

convirtiéndolo en α-cetoglutarato (α-KG). Es una enzima alostérica, que requiere Mg2+

como cofactor. Se activa por ADP (a medida que aumenta la [ADP] aumenta la afinidad

del enzima por el sustrato, disminuye la Km). Es fuertemente inhibida por ATP y NADH.

TCA-4 Es la segunda descarboxilación oxidativa del ciclo. Está catalizada por la

α-cetoglutarato deshidrogenasa, un complejo multienzimático análogo al de la PDH,

que contiene también tres actividades enzimáticas y sus coenzimas asociados.

El mecanismo de acción también es análogo. Una diferencia entre estos dos

complejos multienzimáticos es que las actividades reguladoras asociadas con el

complejo PDH no están presentes en el de la α-KG deshidrogenasa.


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α-KG + NAD+ + CoA-SH → succinil CoA + CO2 + NADH

La reacción, a semejanza de la catalizada por PDH, es altamente exergónica:

∆Gº’ = - 33.5 kJ/mol

Se inhibe por succinil CoA y NADH y se activa por AMP.

En este punto del ciclo se han introducido dos átomos de carbono en forma de

acetil CoA (por la citrato sintasa) y se han perdido otros dos en forma de CO2. Dada la

estereoquímica de la reacción de la aconitasa (capaz de distinguir entre las ramas

proquirales del citrato), los dos átomos de carbono perdidos no son los mismos que se

introdujeron al comienzo del ciclo.

Ya tenemos, pues, un intermediario de 4C: el succinil CoA, que ahora ha de ser

convertido en OAA para así completar el ciclo.

TCA-5 La energía almacenada en el grupo tioéster del succinil CoA, rico en energía, se

conserva acoplando la ruptura de este enlace con la síntesis de GTP. Esta reacción

está catalizada por la succinil CoA sintetasa.

Succinil CoA + Pi + GDP ↔ succinato + GTP + CoA-SH ∆Gº’= - 2.9 kJ/mol

El Pi terminal de alta energía del GTP puede ser transferido al ADP por la

nucleósido difosfato quinasa, produciéndose una molécula de ATP.

GTP + ADP ↔ GDP + ATP

Este es otro ejemplo de fosforilación a nivel de sustrato (transferencia de un

grupo fosfato desde un metabolito rico en energía al ADP) comparable a la generación

de ATP durante la glucólisis, en el sentido de que la síntesis de ATP ocurre como parte

de una vía catabólica y no como resultado de la reoxidación de coenzimas (fosforilación

oxidativa).

El succinato generado en esta reacción tiene una estructura idéntica al OAA

excepto en el átomo de carbono 2, que en el OAA es un grupo carbonilo (C=O) y en el

succinato un grupo metileno (-CH2-). Por lo tanto, para que el succinato se convierta en

OAA requiere dos reacciones oxidativas: una que convierta el metileno en hidroxilo y

otra que lo lleve al nivel carbonilo. Esto es lo que van a llevar a cabo las tres últimas

reacciones del ciclo.

TCA-6 La succinato deshidrogenasa (SDH) cataliza la oxidación del succinato a

fumarato (compuesto insaturado), acompañada de la reducción de FAD a FADH2

Succinato + E-FAD ↔ fumarato + E-FADH2 ∆Gº’ = 0 kJ/mol


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La SDH es una flavoenzima, el FAD está unido de forma covalente a la enzima a

través de un residuo de histidina específico.

Es una proteína integral de membrana interna mitocondrial (a diferencia del resto

de las enzimas del ciclo que están localizadas en la matriz mitocondrial). Es un

componente de la succinato-ubiquinona reductasa, un complejo multiproteico que

participa en la cadena respiratoria transportadora de electrones (lo que explica que el

FADH2 pueda ser reoxidado estando como está unido covalentemente a la enzima).

La reacción es estereoespecífica y el compuesto resultante insaturado es

siempre el isómero TRANS (fumarato), nunca el CIS.

Dado que en esta oxidación ambos electrones provienen de átomos de carbono

adyacentes (y no como de costumbre de un C y un O adyacente) y dado que la

oxidación de la unión C-C no es lo suficientemente energética para permitir la

transferencia de electrones al NAD+, el aceptor en este caso será FAD (un coenzima de

menor energía).

Reoxidación de NADH ∆Gº’ = - 220 kJ/mol 3 ATP

Reoxidación de FADH2 ∆Gº’ = - 181 kJ/mol 2 ATP

TCA-7 Una vez formado el doble enlace, se produce una hidratación estereoespecífica,

catalizada por la fumarasa, formándose el L-malato. Esta enzima realiza siempre la

adición en TRANS (el fumarato es una molécula plana y se añade OH y H por encima y

por debajo del plano).

Fumarato + H2O ↔L-Malato ∆Gº’ = - 3.8 kJ/mol

Al generar un enlace C-O se permite la más fácil oxidación de este carbono en el

siguiente paso.

TCA-8 Finalmente se regenera OAA a partir de malato, mediante la oxidación del grupo

hidroxilo a carbonilo, siendo en este caso el NAD+ el aceptor de electrones. La reacción

está catalizada por la malato deshidrogenasa.

L-malato + NAD+ ↔ OAA + NADH + H+ ∆Gº’ = + 29.7 kJ/mol

Es una reacción altamente endergónica en condiciones estándar, pero

transcurre en el sentido de formación de OAA debido a que la reacción de la citrato

sintasa es muy exergónica y mantiene las concentraciones intramitocondriales de OAA

extremadamente bajas.

El secreto del flujo de energía en los sistemas biológicos reside en que la

energía liberada en un proceso se encuentra acoplada a un segundo proceso que, de

otra manera, en las condiciones celulares no ocurriría espontáneamente. Así, la

energía producida en un proceso espontáneo no es desaprovechada, sino que


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constituye la fuerza motriz de otro proceso no espontáneo. La variación estándar de la

energía libre total de un conjunto de reacciones acopladas es igual a la suma de los

∆Gº’ de cada una de las etapas.

Balance del ciclo

Resumiendo:

1. El acetil CoA, de 2C, entra en el ciclo mediante su condensación con una

molécula aceptora de 4C: el OAA.

2. Hay dos reacciones de descarboxilación por cada ciclo, de manera que la

entrada de 2C en forma de acetil CoA se equilibra con la pérdida de 2C en

forma de CO2.

3. Hay 4 reacciones de oxidación: en 3 de ellas se utiliza NAD+ como aceptor

de electrones y en la otra se utiliza FAD.

4. En uno de los pasos del ciclo se genera 1 ATP (vía GTP).

5. El ciclo se completa tras la regeneración del aceptor original: el OAA.

Hasta aquí la producción de ATP por mol de glucosa metabolizada no ha

aumentado mucho respecto a la producción obtenida en la glucólisis: 2 moles de ATP

por glucosa en la glucólisis sola, frente a 4 moles en glucólisis más ciclo de Krebs. La

mayor parte del ATP generado durante la oxidación de la glucosa no se forma

directamente a partir de las reacciones de la glucólisis y del ciclo de Krebs, sino que se

forma a partir de la reoxidación de los transportadores electrónicos reducidos en la

cadena respiratoria. Estos compuestos, NADH y FADH2, son de por sí ricos en energía,

en el sentido de que su oxidación es altamente exergónica. Cuando los electrones se

transfieren desde estos transportadores reducidos hasta el O2 escalonadamente, se

produce de manera acoplada la síntesis de ATP a partir de ADP, con la formación de

alrededor de 3 moles de ATP por NADH oxidado a NAD+ y de alrededor de 2 moles de

ATP por FADH2 oxidado a FAD. De modo que por la oxidación completa de un mol de

glucosa a CO2 y H2O se generan alrededor de 38 moles de ATP.

∆Gº’ para la oxidación de la glucosa es – 2870 kJ/mol

∆Gº’ para la hidrólisis del ATP es – 31 kJ/mol

La eficiencia en condiciones estándar es de ~ 40 %. La eficiencia in vivo es

probablemente superior.

Regulación del ciclo de Krebs

Dado que el ciclo de Krebs es una fuente de intermediarios biosintéticos, así

como una ruta para la generación de energía metabólica, la regulación del ciclo es algo

más compleja que si se tratara solamente de una ruta de generación de energía. Al

igual que en la glucólisis, la regulación se produce a nivel de la entrada de combustible

al ciclo, y a nivel del control de las reacciones clave dentro del ciclo.


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El flujo a través del ciclo de Krebs se controla mediante interacciones

alostéricas, aunque las concentraciones de los sustratos desempeñan también un

papel crucial.

El factor más importante que controla la actividad del ciclo es la relación

intramitocondrial de [NAD+]/[NADH]. El NAD+ es un sustrato de 3 enzimas del ciclo, así

como de la PDH. En las condiciones en las que disminuye la relación NAD+/NADH,

como, por ejemplo, en presencia de una limitación del aporte de O2, la baja

concentración de NAD+ puede limitar las actividades de estas deshidrogenasas.

La citrato sintasa se inhibe por ATP, NADH y succinil CoA.

La isocitrato deshidrogenasa se activa por el ADP y se inhibe por NADH.

La actividad de la α-KG se inhibe por succinil CoA y NADH (los mecanismos son

comparables a los de la inhibición de PDH por acetil CoA y NADH).

En resumen, el flujo a través del ciclo de Krebs es sensible al estado energético

de la célula, al estado rédox de la célula, a través de la limitación de la velocidad de

flujo causada por el descenso de [NAD+] mitocondrial, y a la disponibilidad de

compuestos de alta energía, mediante la inhibición de enzimas relevantes por acetil

CoA o succinil CoA.

Reacciones anabólicas

Hasta el momento sólo hemos hablado de una de las funciones del ciclo de

Krebs: su función catabólica, de generación de energía. Ahora bien, el ciclo desempeña

otra importante función: proporciona intermediarios de rutas biosintéticas. La posibilidad

de utilizar el ciclo con una función catabólica o anabólica es lo que le da su carácter

anfibólico. En la figura se resumen las rutas anabólicas más importantes. Estas rutas

tienden a extraer carbono del ciclo mediante la utilización de algunos de sus

intermediarios.

• El succinil CoA se utiliza en la síntesis del grupo hemo y de otras porfirinas.

• El OAA y el α-KG son los análogos cetoácidos de los aminoácidos aspártico y

glutámico, respectivamente, y se utilizan en la síntesis de éstos y otros

aminoácidos mediante transaminación.

• En algunos tejidos, el citrato se transporta desde las mitocondrias al citosol, en

donde es fragmentado por la ATP citrato liasa para producir acetil CoA para la

biosíntesis de ácidos grasos.

Los intermediarios del ciclo de Krebs utilizados en las rutas biosintéticas deben

reponerse para mantener el flujo a través del ciclo. Las rutas anapleróticas sirven para

este fin.


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13

Reacciones anapleróticas (o de relleno) Son necesarias para reemplazar aquellos compuestos que han sido utilizados

con propósitos biosintéticos, así como para aumentar los niveles de intermediarios

cuando las necesidades celulares requieren una gran actividad del ciclo de Krebs.

Las más importantes son:

• La catalizada por la piruvato carboxilasa: se forma OAA a partir de piruvato y

CO2, con el gasto de una molécula de ATP. Es una enzima alostérica y se activa

por acetil CoA. Si disminuye la velocidad del ciclo porque no hay suficiente OAA,

el resultado es que aumentan los niveles de acetil CoA porque no puede ser

utilizado. El acetil CoA entonces activa la piruvato carboxilasa, que actúa

metiendo OAA, recuperándose así la velocidad del ciclo.

• En plantas y bacterias hay una ruta similar que conduce directamente desde el

PEP hasta el OAA. Está catalizada por la PEP carboxilasa. Dado que el PEP es

un compuesto de muy alta energía, esta reacción no requiere ATP.

• El enzima málico o malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ rellena

metiendo piruvato en forma de malato. Esta enzima cataliza la carboxilación

reductora del piruvato para dar malato.

Pyr + CO2 + NADPH + H+ ↔ L-malato + NADP+

• Las reacciones de transaminación, de las que ya hemos hablado, también

funcionan en la dirección inversa para producir OAA y/o α-KG a expensas de los

aminoácidos análogos, dado que se trata de reacciones reversibles. Funcionan

así también como vías anapleróticas.


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14

CADENA RESPIRATORIA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES

Es un sistema de complejos proteicos localizado en la membrana interna

mitocondrial que, mediante reacciones de óxido-reducción, van a llevar los electrones

desde el NADH y FADH2 hasta el último aceptor, el oxígeno, formándose H2O como

producto final. Se produce una serie de reacciones de oxidación y reducción acopladas,

con un paso de electrones a lo largo de una serie de transportadores: la cadena de

transporte electrónico o cadena respiratoria. El último paso es la reducción de O2 a

H2O.

El transporte de electrones tiene lugar a favor de gradiente electroquímico, a

favor de caída de potencial, es decir, los electrones son cedidos por transportadores

con potencial redox más negativo a transportadores de potencial más positivo (más

alto). El valor de Eo’ de cada transportador aumenta en el mismo orden que la

secuencia de su uso en el transporte electrónico. Este orden sugiere que cada una de

las reacciones de oxidorreducción del transporte electrónico es exergónica en

condiciones estándar (∆E > 0 ⇒ ∆G < 0). La secuencia global de transporte electrónico

es bastante exergónica. Un par de equivalentes reductores, generados a partir de un

mol de NADH basta para dar origen a la síntesis acoplada de unos 3 moles de ATP a

partir de ADP + Pi, mediante la fosforilación oxidativa. En la fosforilación oxidativa, el

potencial de reducción (o potencial de transferencia de electrones) del NADH (y del

FADH2) proporciona una fuente de energía libre para guiar las reacciones de

transferencia de grupo fosfato asociadas con la producción de ATP a partir de ADP+ Pi.

Durante la transferencia escalonada de electrones desde los coenzimas

reducidos al O2 se libera la energía libre que permite la síntesis de ATP.

La cadena de transporte electrónico es necesaria para la reoxidación de los

coenzimas reducidos, NADH y FADH2, regenerando así las moléculas aceptoras de

electrones que se requieren en las reacciones oxidativas dentro de la célula.

Dado que la reoxidación de los coenzimas se realiza a expensas del O2 se

pueden considerar las siguientes reacciones globales:

NADH + H+ + ½ O2 → NAD+ + H2O ∆Gº’= - 220 kJ/mol

FADH2 + ½ O2 → FAD + H2O ∆Gº’= - 181 kJ/mol

Así pues, durante la respiración se consume O2 y se genera H2O, que junto con

el CO2 que se generó en el ciclo de Krebs, constituyen los dos productos finales del

metabolismo energético aerobio.

Lo más importante de estas reacciones es la gran cantidad de energía libre que

se libera durante la oxidación del NADH y del FADH2, debido a que ambos coenzimas

tienen un potencial de reducción muy negativo.


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15

Podemos calcular la eficiencia del transporte electrónico. Experimentalmente

sabemos que la oxidación de 1 mol de NADH en la cadena respiratoria se produce

simultáneamente con la síntesis de unos 3 moles de ATP a partir de ADP y Pi. Dado

que ∆Gº’ para la hidrólisis del ATP es de –31 kJ/mol, la síntesis de 3 ATPs requiere 93

kJ/mol en condiciones estándar, con lo que se obtiene una eficacia de la fosforilación

oxidativa de ~ 40 %. Puesto que el ∆G de la hidrólisis de ATP en condiciones

intracelulares es significativamente mayor (- 40 kJ/mol o más), es probable que la

eficacia intracelular sea algo mayor de 40 %.

Como vemos, la variación de energía libre que se produce durante la oxidación

de NADH y FADH2 por O2 es lo suficientemente grande para permitir la síntesis de

varias moléculas de ATP. Se hace, pues, necesaria la existencia de una serie de

intermediarios para que la liberación de energía sea escalonada y optimizar así la

generación de ATP.

Para comprender el orden de los intermediarios en la cadena respiratoria hay

que observar los potenciales de reducción de cada uno de ellos. Los componentes de

la cadena transportadora de electrones están ordenados de acuerdo a sus potenciales

de reducción, en el sentido de una creciente afinidad por los electrones. Todos estos

intermediarios son componentes de la membrana interna mitocondrial y se requiere

lógicamente su proximidad física, por lo que van a estar organizados en complejos. El

flujo de electrones ocurrirá siempre en el sentido indicado en la figura mencionada. Los

electrones del NADH pasarán siempre primero al FMN, y luego al resto de la cadena en

el orden indicado. No es posible que el NADH transfiera sus electrones a otros

transportadores porque los intermediarios están físicamente ordenados en la

membrana en función de sus potenciales de reducción y la transferencia de electrones

sólo es posible entre transportadores contiguos.

En tres puntos de la cadena la transferencia de electrones de un transportador al

siguiente se acompaña de una variación de energía libre suficiente para generar ATP

(FMN→CoQ, cit b→cit c1 y cit a→O2), lo que coincide con la observación de que se

forman 3 moléculas de ATP por cada par de electrones que fluyen del NADH al O2.

Transportadores de electrones Excepto la ubiquinona o coenzima Q, todos los demás son proteínas con grupos prostéticos específicos, capaces de ser oxidados y reducidos reversiblemente, que están organizados en complejos: I NADH-ubiquinona reductasa: transfiere 2 electrones desde el NADH a UQ. II Succinato-ubiquinona reductasa: transfiere 2 electrones desde FADH2 a UQ. III Ubiquinona-cit C reductasa: transfiere electrones desde UQH2 hasta cit C. IV Cit c oxidasa: cataliza la reducción del O2 a H2O.


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16

La transferencia de electrones desde un complejo a otro se efectúa por las

formas reducidas de la ubiquinona y del citocromo c. Estos portadores de electrones,

más pequeños, son móviles y difunden fácilmente en la bicapa de la membrana.

Complejo I NADH-ubiquinona reductasa

Es probablemente el componente proteico más grande de la membrana interna

mitocondrial. Contiene unas 42 cadenas polipeptídicas distintas, una molécula de FMN

(mononucleótido de flavina) que actúa como grupo prostético y algunos centros hierro-

azufre (6 ó 7).

Los centros hierro-azufre están formados por un hierro no hemo que forma un complejo con azufre en 3 formas conocidas (ver figura). La forma más sencilla,

denominada FeS, contiene un Fe que forma un complejo tetraédrico con los S tiólicos

de 4 cisteínas. La segunda forma, Fe2S2, contiene 2 Fe, cada uno de los cuales forma

un complejo con 2 cisteínas y 2 sulfuros inorgánicos. La tercera forma, que es la más

compleja, Fe4S4, contiene 4 Fe, 4 sulfuros y 4 residuos de Cys.

La NADH-ubiquinona reductasa contiene centros Fe2S2 y Fe4S4. En todos estos

centros, el Fe puede experimentar una oxidorreducción cíclica entre los estados ferroso

y férrico:

Fe2+ ↔ Fe3+

Varías proteínas redox importantes contienen centros hierro-azufre. Se

denominan genéricamente proteínas sulfoférricas. Son componentes esenciales de

NADH-UQ reductasa (I), succinato-UQ reductasa (II) y ubiquinona-Cit c reductasa (III).

También las vamos a encontrar en otras cadenas transportadoras de electrones, como

la fotosintética.

En el complejo NADH-UQ reductasa la secuencia de cesión de electrones sería:

NADH + H+ FMN Fe2+S UQ

NAD+ FMNH2 Fe3+S UQH2

La flavina en FMN tiene tres estados redox –oxidado, semiquinona y reducido-

por lo que puede actuar como transportador de 1 ó 2 electrones, sirviendo así de

enlace entre NADH y FeS.

Este complejo proteico no sólo cataliza una reacción redox, sino que además

bombea protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.


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UBIQUINONA

Es una pequeña molécula liposoluble (una benzoquinona ligada a diversas

unidades de isopreno, generalmente 10). También llamada coenzima Q (CoQ). La cola

isoprenoide proporciona a la molécula su carácter apolar, que permite a la ubiquinona

una difusión rápida a través de la membrana mitocondrial interna.

Dado que la ubiquinona pasa por un estado de semiquinona (como radical libre)

durante su ciclo de óxido-reducción, es una buena transición entre los transportadores

de 2 electrones (FAD, NAD+) y los de un único electrón (citocromos).

Complejo II Succinato-ubiquinona reductasa

En este caso el donador de electrones es el succinato, un intermediario del ciclo

de Krebs. El complejo II participa en la transferencia de electrones desde el succinato a

la ubiquinona (succinato + UQ ↔ fumarato + UQH2). El flujo de electrones desde el

succinato a la ubiquinona tiene lugar vía el FADH2 que es producido por la oxidación

del succinato a fumarato en el ciclo de Krebs.

Succinato FAD Fe2+S UQ Fumarato FADH2 Fe

3+S UQH2

La succinato-UQ reductasa contiene 4 polipéptidos, de los cuales los 2 mayores

son los que tienen el centro activo de la succinato DH (la enzima que oxida el succinato

a fumarato en el ciclo de Krebs), el grupo prostético FAD y 3 centros Fe-S.

El paso de los electrones desde el succinato hasta la ubiquinona no está

acompañado de un transporte de H+ de un lado a otro de la membrana (El ∆Eo’ de la

transferencia de electrones desde el succinato a la UQ es de + 0.069 v, mucho menor

que el ∆Eo’ de la reacción de la NADH-UQ reductasa que es de + 0.42 v. La pequeña

variación de energía no permite al complejo II bombear H+ a través de la membrana

interna mitocondrial), por lo tanto este complejo proteico no contribuye a la creación del

gradiente de H+. Por cada par de electrones que pasan desde el succinato a la cadena

transportadora de electrones se sintetizan ~ 2 moléculas de ATP (a diferencia de los 3

ATPs que se consiguen con la oxidación del NADH).

Complejo III Ubiquinona-citocromo C reductasa

Este complejo oxidorreductasa cataliza la transferencia de electrones desde la

UQH2 al citocromo c. Se trata de un oligómero de al menos 8 proteínas distintas,

incluyendo un citocromo c, 2 citocromos del tipo b (que tienen distinto Eo’) y una

proteína sulfoférrica.


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18

El complejo es transmembrana, atraviesa totalmente la membrana interna

mitocondrial, y bombea H+: una de las etapas de la transferencia de electrones implica

una gran disminución de la energía libre. La energía liberada en este paso es

conservada en la forma de un gradiente de H+.

CITOCROMO C

Es una pequeña proteína periférica de membrana, acepta los electrones de la

UQ-citocromo c reductasa, luego difunde lateralmente por la superficie de la membrana

y transfiere estos electrones a la citocromo c oxidasa.

Los citocromos son un grupo de proteínas que contienen un grupo

hemo y que actúan como portadores de 1 electrón en las cadenas

transportadoras de electrones respiratoria y fotosintética. El átomo de Fe del

grupo hemo del citocromo puede fluctuar entre el estado de oxidación

ferroso y férrico.

Hay 3 clases principales de citocromos, llamados a, b y c en función

de la naturaleza de las cadenas laterales de su grupo hemo. El grupo hemo

presente en el cit b es el tipo que se encuentra en la hemoglobina y en la

mioglobina. En el grupo hemo del cit a dos de las cadenas laterales están

modificadas. En el cit c el grupo hemo está ligado de forma covalente al

componente proteico a través de residuos de cisteína.

Los citocromos, debido al grupo hemo, tienen unos espectros de luz

visible característicos, con 3 picos principales de absorción (o bandas de

absorción): α, β y γ. Se puede distinguir entre los 3 tipos de citocromos por

las diferencias de sus espectros de absorción de luz.

Dentro de una misma clase, los citocromos pueden distinguirse entre

ellos por la longitud de onda de su banda de absorción α (está ausente en

los citocromos oxidados). Estas longitudes de onda se indican a veces con

subíndices (cit b560) o directamente se le pone un subíndice a la subclase: cit

a y a3.

En general son proteínas integrales de membrana, salvo el cit c que

es una proteína asociada débilmente al lado externo de la membrana

mitocondrial interna.

Complejo IV Citocromo c oxidasa

Es el componente final de la cadena transportadora de electrones. Cataliza la

reducción del O2 a H2O y bombea H+ al espacio intermembrana.

Para reducir una molécula de O2 tiene que oxidar 4 moléculas de citocromo c

consecutivamente, cada una de las cuales cede un electrón (son 4 los electrones que

se necesitan).

4 cit cred + O2 + 4 H+ → 4 cit cox + 2H2O


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Contiene entre 6 y 13 subunidades proteicas, 2 iones Cu2+ y los citocromos a y

a3 (estos dos citocromos tienen estructuras idénticas, pero están en diferentes entornos

en el oligómero y tienen diferentes Eo’).

Casi el 90% del consumo celular de O2 se debe a la acción de este complejo.

Determinación de la secuencia de los transportadores electrónicos respiratorios. Para establecer el orden de acción de los transportadores electrónicos en la

cadena respiratoria se han empleado una serie de técnicas que incluyen:

• Medidas espectrofotométricas: ciertas moléculas presentan distintos espectros

de absorción según se encuentren en su estado reducido u oxidado, es el caso

de NADH, FADH2 y citocromos.

• Utilización de inhibidores respiratorios específicos de algunos de los complejos

que participan en la cadena:

o Amital (barbitúrico) y rotenona (toxina vegetal que se utiliza como

insecticida) inhiben al complejo I

o Antimicina A (antibiótico) inhibe al complejo III

o Cianuro, azida y monóxido de carbono inhiben al complejo IV

Han sido de mucha utilidad para determinar la secuencia de los intermediarios

que transportan los electrones. Una vez que se conoce el sitio de acción de un

determinado inhibidor se puede deducir si un transportador está antes o después

de ese sitio dependiendo de si se acumula en su forma oxidada o reducida.

• Utilización de aceptores de electrones artificiales, como el azul de metileno, el

DCPIP (2,6 diclorofenolindofenol) y el ferricianuro, que captan electrones en

puntos específicos de la cadena (en función de sus respectivos potenciales de

reducción).

• Fraccionamiento de la membrana interna mitocondrial mediante el uso de

detergentes como la digitonina, que permite aislar los distintos complejos

proteicos sin desnaturalizarlos. El análisis de cada complejo con respecto a la

presencia de transportadores electrónicos, así como a las reacciones

catalizadas, ha ayudado a establecer la secuencia de transportadores aceptada

actualmente.

Lanzaderas metabólicas

Las lanzaderas son sistemas de transporte de poder reductor a través de la

membrana interna mitocondrial.


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El NADH generado en el citosol durante la glucólisis debe transferir los

equivalentes de reducción a la mitocondria, para su reoxidación por la cadena

respiratoria. Van a ser necesarios sistemas de transporte específicos, ya que el NADH

no puede atravesar por sí mismo la membrana interna mitocondrial. Las lanzaderas son

esos sistemas de transporte específico que transfieren los electrones del NADH

citosólico al interior de la mitocondria. Funcionan básicamente de la siguiente manera:

el NADH citosólico transfiere sus electrones a una molécula orgánica que es capaz de

atravesar la membrana mitocondrial y llevar así los electrones al interior de la

mitocondria. Allí, en la matriz mitocondrial, esta molécula es reoxidada, donando sus

electrones a un coenzima oxidado. La molécula oxidada atraviesa la membrana de

vuelta al citoplasma, en donde puede experimentar de nuevo el mismo ciclo.

Las dos lanzaderas principales conocidas son: Glicerol-3-P / DHAP y Malato /

aspartato.

Glicerol-3-P / DHAP

Es el sistema de lanzadera más primitivo que se conoce. Es especialmente

activo en el cerebro (y en el músculo de vuelo de los insectos).

Los electrones del NADH generado en el citosol se transfieren a la DHAP que

es, por tanto, reducida a glicerol-3-P. Esta reacción está catalizada por la glicerol-3-P

DH citoplásmica. El glicerol-3-P pasa a la mitocondria, donde es reoxidado por una

flavoproteína, la glicerol-3-P DH, unida a la cara externa de la membrana interna

mitocondrial. El FAD de esta flavoproteína es reducido a FADH2 mitocondrial y de allí a

la cadena respiratoria.

En este punto hay que tener en cuenta que el FADH2 tiene un potencial redox

menos negativo que el NADH, por lo que la generación de ATP será menor. Sólo se

sintetizarán 2 ATP por cada NADH citoplásmico que transfiera sus equivalentes de

reducción a la mitocondria por este sistema.

Malato / aspartato

Este sistema de lanzadera es especialmente activo en hígado y corazón. En este

caso, una isoenzima citosólica de la malato DH transfiere los electrones del NADH al

oxalacetato, que se reduce a malato, el cual pasa a la mitocondria a través de un

sistema de transporte específico de la membrana interna mitocondrial (antiporte con

α−KG). El malato es reoxidado a continuación por la malato DH del ciclo de Krebs, que

utilizará también NAD+. Se genera así OAA, que no puede atravesar la membrana

interna. Se requiere una reacción de transaminación: el OAA se transamina a

aspartato, que sí puede atravesar la membrana, y, una vez en el citosol, es de nuevo

transaminado para regenerar el OAA requerido como aceptor electrónico en el inicio del

ciclo. El aspartato sale de la mitocondria por un antiporte con glutamato.

El balance neto ha sido la transferencia de dos equivalentes de reducción del

NADH del citosol a la matriz mitocondrial.


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FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

¿Cuál es el mecanismo por el cual la transferencia de electrones desde los

coenzimas al O2 se acopla a la generación de ATP?

Hablamos de fosforilación oxidativa porque el ATP se genera mediante

reacciones de fosforilación acopladas al transporte de electrones oxidativo y para

distinguirla de la fosforilación a nivel de sustrato.

Fosforilación y oxidación están estrechamente acopladas. Debido a este

acoplamiento existe una proporción entre el ATP generado y el oxígeno molecular

consumido, la llamada relación P/O, que es el número de moléculas de ATP sintetizadas por cada par de electrones transportado en la cadena. En mitocondrias

aisladas la relación P/O es próxima a 3 por cada molécula de NADH oxidada, aunque

la estequiometría aún no está muy clara. En cuanto al FADH2, la relación es próxima a

2, con un menor rendimiento, como corresponde a su potencial redox más positivo.

La relación P/O de 3 para la oxidación del NADH coincide con la observación de

que tres de las reacciones individuales de la cadena respiratoria son lo suficientemente

exergónicas como para impulsar la síntesis de una molécula de ATP cada una. Tres de

estas reacciones tienen unos valores de ∆Gº’ superiores a – 31 KJ/mol, la barrera

mínima que debe superarse (en condiciones estándar) para hacer que la síntesis de

ATP sea exergónica.

Estas tres reacciones son la oxidación del FMNH2 por la ubiquinona, la oxidación

del citocromo b por el citocromo c1 y la reacción de la citocromo c oxidasa.

Su identificación experimental reveló que cada una de estas tres reacciones es

capaz de dar, por sí sola, energía a la membrana para la síntesis de ATP a pesar de

que no actúe el conjunto de la cadena de transporte electrónico. Los experimentos

consistieron en limitar el transporte electrónico a determinadas partes de la cadena

mediante el empleo de aceptores y donadores electrónicos en presencia o ausencia de

inhibidores respiratorios específicos (fig. 15.12 Mathews). Para cada segmento aislado

de esta manera se determinaron las relaciones P/O.

En primer lugar, el succinato se oxida con una relación P/O de 2, no de 3, lo que

sugiere la existencia de un lugar de acoplamiento previo a la ubiquinona en la cadena

respiratoria. Este hecho se confirmó mediante el bloqueo del transporte electrónico

después del cit b con antimicina A. Se añadió ferricianuro como aceptor electrónico

artificial, de manera que pudiera continuar el flujo electrónico. En estas condiciones, los

sustratos ligados al NAD+ se oxidan con una relación P/O de 1, lo cual confirmaba la

existencia de un lugar previo al cit b.

Cuando se utiliza como donador electrónico artificial el par ascorbato/TMPD

(tetrametil-p-fenilen diamina), pueden introducirse los electrones en la cadena

respiratoria a nivel del cit c. La oxidación del cit c por la citocromo c oxidasa se produce

con una relación P/O de 1, con lo que se localiza otro de los lugares de acoplamiento,

más allá del cit c.


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La adición de un inhibidor de la citocromo c oxidasa, como el cianuro, fuerza la

salida de los electrones de la cadena respiratoria a la altura del cit c. En estas

condiciones, el succinato se oxida con una relación P/O de 1, lo que localiza un lugar

entre los citocromos b y c.

En resumen, estos experimentos demuestran que los complejos I, III y IV son

capaces de impulsar la síntesis de ATP, mientras que el complejo II no lo es.

Previamente se comentó que estos tres complejos proteicos de la cadena

respiratoria transportadora de electrones, I, III y IV, son bombas de H+ que translocan

H+ desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, generando un gradiente de

H+ a través de la membrana interna mitocondrial, dado que ésta es impermeable a H+.

Este movimiento de H+ tiene 2 consecuencias principales:

1. Genera un gradiente de pH de ~ 1.4 unidades a través de la membrana

interna mitocondrial, siendo más ácido fuera que dentro.

2. Genera un gradiente de voltaje: la existencia de un gradiente de

concentración de una especie cargada, como es el H+, a través de la

membrana también crea un potencial eléctrico, llamado potencial de membrana, de aproximadamente 0.14 v. Como resultado del flujo neto de salida de iones positivos, el potencial será negativo en el interior y positivo en

el exterior.

Ambas fuerzas, el gradiente de pH y el potencial de membrana, van a actuar

atrayendo a los H+ hacia la matriz mitocondrial, y en conjunto constituyen un gradiente electroquímico de H+. El gradiente electroquímico de H+ ejerce una fuerza protón motriz (fpm), la cual puede medirse en unidades de voltio:

∆µH = ∆ψ − (2.3RT/F) ∆pH

Este gradiente electroquímico de H+ o fuerza protón motriz (∆µH o fpm o ∆p) se

puede descomponer en un potencial eléctrico (el potencial de membrana), ∆ψ, y un

componente puramente químico, de concentración, que es el gradiente de pH, ∆pH.

La fuerza protón motriz proporciona la energía necesaria para la síntesis de

ATP. La energía liberada por la descarga del gradiente electroquímico de H+ puede

acoplarse con la fosforilación de ADP para formar ATP.

Esta es la teoría quimiosmótica de Mitchell, el modelo que mejor explica el

acoplamiento de la síntesis de ATP con el transporte de electrones (es el que mayor

apoyo experimental tiene). Fue propuesta por el bioquímico británico Mitchell en 1961 y

le valió el Premio Nobel en 1978.


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Esta teoría quimiosmótica afirma que el acoplamiento de la oxidación con la

fosforilación es indirecto. Los H+ son translocados hacia el espacio intermembrana por

lo complejos de la cadena respiratoria transportadora de electrones. Estos H+ luego

fluyen de nuevo, debido a su gradiente, hacia la matriz mitocondrial, a través de un

canal de membrana formado por la enzima ATP sintasa. La fosforilación del ADP está

de esta forma acoplada al movimiento de los H+ hacia el interior.

La teoría quimiosmótica consta de 3 postulados:

1. La cadena transportadora de electrones mitocondrial transloca H+ a través de

la membrana interna mitocondrial conforme los electrones fluyen desde un

complejo de la cadena al siguiente.

2. La ATP sintasa utiliza la fuerza protón motriz para llevar a cabo la

fosforilación del ADP.

3. La membrana interna mitocondrial es impermeable a los H+. Si la membrana

es alterada no puede crearse una fuerza protón motriz y no se produce

síntesis de ATP.

Todavía no se conoce la estequiometría exacta de la translocación de H+ ni los

mecanismos por los que se rigen las bombas de H+. Los primeros experimentos de

Mitchell sugirieron que cada oxidoreductasa que bombea H+ transloca 2 H+ pero datos

recientes sugieren que el número de H+ translocados podría ser superior.

Si las proteínas respiratorias han de actuar como bombas de H+, los

transportadores electrónicos que bombean H+, como la NADH-UQ reductasa, deben

estar en contacto tanto con la cara interna como con la cara externa de la membrana,

han de ser proteínas transmembrana. Además, estos transportadores deben estar

situados de manera asimétrica en la membrana, con objeto de facilitar el transporte en

una dirección, hacia fuera. El transporte de H+ ha de ser unidireccional.

Uno de los postulados de la teoría quimiosmótica de Mitchell se refiere al papel

que desempeña la fuerza protón motriz en la síntesis de ATP. La validez de esta parte

del modelo se vio confirmada con unos experimentos en los que se demostraba que el

establecimiento de un gradiente de H+ en mitocondrias aisladas bastaba para impulsar

la síntesis de ATP, incluso en ausencia de transporte electrónico. Uno de estos

experimentos consistía en incubar las mitocondrias en un medio alcalino durante varias

horas y luego transferirlas rápidamente a un medio ácido. De este modo se conseguía

que el interior de la mitocondria estuviese a un pH más básico. Si entonces se añadían

ADP y Pi se producía síntesis de ATP, de manera simultánea con la disipación del

gradiente de pH.


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ATP sintasa (H+-ATPasa o complejo V)

Es el complejo enzimático que acopla la síntesis de ATP al transporte de H+ a

través de la membrana interna mitocondrial.

Consta de dos componentes F1 y F0, constituidos a su vez por varias cadenas

polipeptídicas.

• F1 tiene forma globular y está expuesto hacia la matriz mitocondrial. Posee la actividad catalítica de síntesis de ATP a partir de ADP y Pi.

• F0 es integral de membrana y constituye un canal o poro que permite el paso de H+.

F1, el componente catalítico de la ATP sintasa, puede ser aislado como una ATPasa muy activa. Cuando F1 está unido a F0 la enzima cataliza la síntesis de ATP.

Sin embargo, F1 puede liberarse fácilmente a la matriz (se asocia débilmente a la

membrana). Este componente F1 libre cataliza la hidrólisis de ATP, se comporta como

una ATPasa. Por esta razón la ATP sintasa se denomina también H+-ATPasa. F1 posee

5 tipos de cadenas polipeptídicas diferentes, denominadas: α, β (tres copias de cada

una), γ, δ, ε (una copia de cada una) → α3β3γδε

El componente F0 que forma el poro protónico está constituido por tres subunidades a, b y c, con la estequiometría ab2c10-12. Una de las proteínas del complejo

F0 es el lugar de unión del inhibidor de la síntesis de ATP: la oligomicina (un antibiótico

producido por Streptomyces). Las subunidades c, pequeñas y muy hidrofóbicas, se

disponen en forma de anillo.

La estructura de la ATP sintasa es la de una máquina rotatoria molecular. El

componente rotor (o giratorio) de esta máquina está formado por las subunidades c12, γ

y ε, mientras que las subunidades a, b2, δ, α3 ψ β3 forman el componente estátor (o

estacionario). La corriente de protones a través del “poro” F0 provoca que el cilindro

formado por las subunidades c y la subunidad γ anclada roten alrededor del eje mayor

de γ, que es perpendicular al plano de la membrana.

¿Cuál es el mecanismo mediante el que la energía potencial de la entrada de H+ a través del canal F0 se utiliza para impulsar la síntesis de ATP por F1?: los cambios

conformacionales inducidos por el paso de H+. F1 contiene 3 subunidades α y 3

subunidades β, y las 6 proteínas están dispuestas como los gajos de una naranja, de

forma alternada: α, β, α, β, α, β. Cada uno de los 3 complejos αβ posee una

conformación claramente diferente: L, T, O, de unión débil, fuerte o no unión a los

sustratos. El paso de H+ a través del canal F0 provoca un cambio conformacional que

se transmite a F1. El complejo αβ en conformación L (loose) une débilmente ADP + Pi y

al producirse el cambio conformacional pasa a conformación T (tight), que es la forma

catalíticamente activa, por lo que se genera ATP. Este ATP se libera en el siguiente

cambio conformacional (nuevo paso de H+), quedando así la subunidad αβ en

conformación O (open). Se requieren distintas conformaciones para la unión de ADP, la

síntesis de ATP y la liberación de ATP. El paso dependiente de energía no es la

síntesis de ATP sino su liberación de un lugar de unión fuerte. Cada rotación se


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produce por el paso de H+, y nunca coinciden dos subunidades en la misma

conformación. Los cambios de conformación, esenciales en este mecanismo, están

impulsados por el paso de protones a través de la porción F0 de la ATP sintasa. Así

pues, el proceso de fosforilación oxidativa es posible gracias a los cambios

conformacionales experimentados por la ATP sintasa.

Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa.

El transporte electrónico (la oxidación de NADH y FADH2 mediante el O2) y la

fosforilación oxidativa (la síntesis de ATP) están por lo general fuertemente acoplados.

En estado de reposo, cuando la fosforilación oxidativa es mínima, el gradiente

electroquímico de protones a través de la membrana interna mitocondrial crece hasta el

punto que impide más bombeo de protones y, por tanto, inhibe el transporte

electrónico.

A lo largo de los años, no obstante, se han encontrado muchos compuestos que

desacoplan estos procesos, que son capaces de disociar el proceso de transporte de

electrones del proceso de generación de ATP. Entre estos compuestos se encuentran

el DNP (2, 4-dinitrofenol) y el FCCP (trifluorocarbonilcianuro fenilhidrazona). Son

llamados agentes desacoplantes. La presencia en la membrana interna mitocondrial de un agente que aumente la

permeabilidad de los protones hace que la fosforilación oxidativa se desacople del

transporte electrónico, proporcionando una vía para la disipación del gradiente

electroquímico de protones que no requiere de síntesis de ATP. El desacoplamiento,

por lo tanto, permite que el transporte electrónico continúe libremente, incluso cuando

se inhibe la síntesis de ATP.

El DNP y el FCCP son ácidos débiles lipofílicos que por lo tanto pasan a través

de las membranas. En un gradiente de pH unen protones en el lado ácido, difunden a

través de la membrana y los liberan en el lado alcalino, disipando así el gradiente.

Por lo tanto, estos desacoplantes son ionóforos transportadores de protones.

Disipan el gradiente protónico al transportar los protones al interior de las mitocondrias

a través de lugares distintos del canal F0 de la ATP sintasa.

El desacoplamiento de la fosforilación oxidativa tiene una función fisiológica: generar calor.

La disipación de un gradiente electroquímico de protones, generado mediante

transporte electrónico y desacoplado de la síntesis de ATP, produce calor.

Muchos mamíferos, en especial los que nacen sin pelo y los que hibernan

poseen un tejido adiposo especializado, denominado tejido adiposo marrón (grasa

parda), en la parte alta de la espalda. Las mitocondrias de este tejido están

especializadas en la generación de calor a partir de la oxidación de la grasa de forma

desacoplada de la fosforilación. El color marrón del tejido se debe a la presencia de

grandes cantidades de mitocondrias y, por tanto, de citocromos cuyos grupos hemo

absorben fuertemente la luz visible. En estas mitocondrias el transporte de electrones


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está parcialmente desacoplado de la fosforilación oxidativa al existir una proteína

transmembrana en su membrana interna, la termogenina (o proteína desacoplante,

UCP), que permite el paso de protones a favor de gradiente, disipando la energía

liberada en forma de calor, lo que contribuye a mantener la temperatura corporal del

recién nacido.

El proceso completo de generación de calor por la grasa parda, que se

denomina termogénesis sin tiritera (nonshivering thermogenesis) o termogénesis por

desacoplamiento viene regulada por vía hormonal. La noradrenalina inicia un

mecanismo en cascada que finalmente aumenta la hidrólisis de los triglicéridos. Los

ácidos grasos libres en el lado intermembrana de la mitocondria son quienes activan

directamente la UCP.

Existe otro tipo de termogénesis, la termogénesis con tiritera, en la que se

genera calor por contracción muscular involuntaria.

En el reino vegetal la producción de calor también es a veces necesaria. En el

caso de ciertas plantas sirve para volatilizar determinados compuestos olorosos que

atraen a los insectos, favoreciendo así la polinización.

Regulación de la fosforilación oxidativa. Control respiratorio.

Al igual que cualquier otro proceso metabólico, la fosforilación oxidativa sólo

puede producirse en presencia de cantidades adecuadas de sus sustratos. Se controla

no por mecanismos alostéricos, sino simplemente por la disponibilidad del sustrato.

Estos sustratos incluyen el ADP, el Pi, el O2 y un metabolito oxidable que pueda

generar transportadores electrónicos reducidos, NADH o FADH2. En diferentes

situaciones metabólicas cualquiera de estos cuatro sustratos puede limitar la velocidad

de la fosforilación oxidativa.

El factor más importante a la hora de determinar la velocidad de la fosforilación

oxidativa es el nivel de ADP. La velocidad de consumo de oxígeno por las mitocondrias

aumenta notablemente cuando se añade ADP y recupera su valor inicial cuando el

ADP añadido se ha convertido en ATP. El control de la respiración aerobia por el ADP

se denomina control respiratorio.

La dependencia que presenta la respiración del ADP revela una característica

general importante es este proceso: la respiración está fuertemente acoplada con la

síntesis de ATP. No sólo existe una dependencia absoluta de la síntesis de ATP con

respecto al flujo continuo de electrones de los sustratos al oxígeno, sino que el flujo

electrónico en las mitocondrias normales se produce tan sólo cuando se sintetiza

también ATP. Este control respiratorio tiene sentido desde el punto de vista biológico,

puesto que asegura que los sustratos no se oxiden de manera inútil, sino sólo cuando

exista una necesidad fisiológica de ATP.


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Si las demandas energéticas de una célula hacen que se consuma el ATP de

manera rápida, la acumulación resultante de ADP estimulará la respiración, con la

consiguiente activación de la resíntesis de ATP. Y a la inversa, en una célula relajada y

bien nutrida, el ATP se acumula a costa del ADP, y la depleción de ADP limita la tasa

de funcionamiento del transporte electrónico y de su propia fosforilación a ATP. Así

pues, la capacidad de generación de energía de la célula está armonizada con sus

demandas energéticas.

Experimentalmente, el control respiratorio se demuestra valorando la utilización

de O2 en mitocondrias aisladas. En ausencia de una adición de sustrato o ADP, la

captación de O2 causada por la oxidación de los sustratos endógenos es lenta (ver

figura). La adición de un sustrato oxidable, como el glutamato o el malato, sólo tiene un

efecto pequeño sobre la tasa de respiración. Sin embargo, si se añade ADP, la

captación de O2 se produce con una velocidad muy superior, hasta que todo el ADP

añadido se ha convertido en ATP, con lo que la captación de O2 vuelve a la situación

basal. Esta estimulación de la respiración es estequiométrica, es decir, la adición del

doble de ADP hace que aumente al doble la cantidad de captación de O2.

Transmisión de energía mediante gradientes de protones.

Los gradientes de protones guían muchos procesos celulares, además de la

síntesis mitocondrial de ATP. En células vegetales la fotofosforilación del ADP es

impulsada por un gradiente de protones transmembranal y ocurre mediante un

mecanismo notablemente parecido al de la fosforilación oxidativa mitocondrial. En

células bacterianas el gradiente de protones se utiliza para impulsar la rotación de los

flagelos que permite el movimiento de la célula.

Los gradientes de protones impulsan también el transporte activo mitocondrial:

• Intercambio de ATP/ADP a cargo de la nucleótido de adenina translocasa,

en el que se exporta el ATP generado y se importa su precursor, el ADP.

Dado que este sistema intercambia ATP, con una carga de -4, por ADP,

con una carga de -3, el proceso está dirigido por el potencial de

membrana.

• Intercambio de Pi por la fosfato translocasa, que puede actuar en modo

antiporte, acoplando la entrada de fosfato (H2PO4-) a la matriz con la

salida de un OH-, o en modo simporte, transportando HPO4

2- a la matriz

junto con 2 H+.

El efecto neto de los sistemas de transporte de nucleótido de adenina y de

fosfato es acoplar el transporte hacia el interior de los sustratos de la fosforilación

oxidativa, el ADP y el Pi, con la salida del producto, el ATP.

En cuanto a los sustratos de la oxidación, el principal en el catabolismo de los

hidratos de carbono es el piruvato que, como el fosfato, se intercambia por OH-.

Apuntes TEMA 8_Metabolismo Oxidativo (1)

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