Aplicaciones LC/MS en el campo alimentario · Ideal para HPLC-• Cuantificación de ppgroteinas...
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Aplicaciones LC/MS en el campo alimentario
Juan AybarEspecialista de Producto GCMS/LCMS
Agilent Technologies Spaing g pEnero 2010
Universitat de Lleida
Agendag1. Resumen de tecnologías disponibles y
últimas novedadesúltimas novedadesUHPLCLCMS (QQQ/TOF/QTOF/AJS)( )CEICPMS
2 MRM dinámico aplicado a a la2. MRM dinámico aplicado a a la determinación de plaguicidas en muestras alimentarias
3. Screening de sustancias prohibidas con sistemas de tiempo de vuelo
4. Adulteraciones y su determinación con sistemas TOF
Page 2
Clearly Better LC / LC/MSAgilent FY09 Nuevos Productos
Agilent 1290 Infinity LC (7100 CE)El mejor sistema de • El mayor rango de potencia entre losEl mejor sistema decromatografía líquida paraLC/MS – de la HISTORIA!
• El mayor rango de potencia entre los (U)HPLC disponibles• Nuevo DAD de mayor sensibilidad• Permite conversión de cualquier
6430 Triple Cuadrupolo LC/MSRápido, robusto,
método LC
• Rápido cambio de polaridadp , ,sensible. Ideal para acomplamientos HPLC-Chip
• Rápido cambio de polaridad• MRM más rápidos• Dynamic MRM• Ideal para análisis complejos multi-
6538/40 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS(6230 Accurate Mass TOF LC/MS)
compuesto
Datos de ultra-alta definición;resultados de investigación en un sistema de sobremesa
• Sistema cualitativo de última generación• Ultra alta resolución• Exactitud de masa sub-ppm
E l t ibilid d di á i
Page 3
• Excelente sensibilidad y rango dinámico
1290 Infinity Compatible con cualquier HPLC y UHPLC del mercadoCompatible con cualquier HPLC y UHPLC del mercado
barUn nuevo rango de potencias capaz de proporcionar el máximo
rendimiento, flexibilidad, compatibilidad y protección de la inversión
1290 Infinity
1000
1200
800
Vendor A
Vendor D
600
Agilent RRLCVendor B
200
400
Vendor C
0
200
0 1 2 3 4 5 /
Standard LC0 1 2 3 4 5 ml/min
1290 Infinity posicionamiento del portfolio de LC de AgilentAgilent El máximo rendimiento y flexibilidad preservando/mejorando las características del Sistema Agilent 1200
1290 Infinity LC
1200 RRLC
1290 Infinity = 1200 RRLC + X1200 RRLC = 1200 HPLC + Y
1200Standard
LC
1200 RRLC = 1200 HPLC + Y
1200 HPLC = 1120 HPLC + Z
1120 Compact
LC
Agilent Serie 6400. Triple CuadrupoloLa plataforma cuantitativa más completa en LC/MS (2006-2009)
6410 Triple Cuadrupolo LC/MS • Celda de colisión con aceleración lineal axialRobusto, Facilidad de Uso.Menores coste de mantenimiento.
• Rápido cambio de polaridad• Análisis MRM• Robustez y sensibilidad
6430 Triple Cuadrupolo LC/MS • Optimización rápida con Optimizer
Rá id bi d l id dRápido, robusto,Cuantificación con alta sensibilidad,.Ideal para HPLC Chip
• Rápido cambio de polaridad•Métodos Dynamic MRM• Análisis complejo multi-analito• Cuantificación de proteinas targetIdeal para HPLC-Chip p g
6460 Triple Cuadrupolo LC/MSEl T i l • Agilent Jet Stream – sensibilidad sub-fg!El TripleCuadrupolo LC/MS Más sensible del mercado
Agilent Jet Stream sensibilidad sub-fg!• Perfecto para las aplicaciones más exigentes• Rápido cambio de polaridad
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• Métodos Dynamic MRM
LC/MS – 6230 TOFMasa Exacta en Rutina• El sistema más estable del mercado• Especificación 2 ppm - Típica 1 ppm• Hasta 5 órdenes de magnitud de rango• Hasta 5 órdenes de magnitud de rango
dinámico espectral
Sensibilidad• 5 - 10 x mejor que cualquier otro TOF
de sobremesa del mercado
Facilidad de UsoFacilidad de Uso• Autotune• Autocalibracion con 2 (o más) puntosAutocalibracion con 2 (o más) puntos• Sistema de introduccíón directa de
calibrante (CDS)
Agilent HPLC-Chip/QQQ LCMS TechnologyConfiguración Chip-Nanospray proporciona una nueva era en laConfiguración Chip Nanospray proporciona una nueva era en la cuantificación de alta sensibilidad
HPLC Chip Cube systemNanoLC system foranalytical chromatography
HPLC Chip Cube system
CapLC pump for sample
QQQ LCMS
loading on enrichment column
Sensitivity: down to low amolDynamic range: up to 105
HPLC-Chip/MSB fi iBeneficios
Poliimida InerteMax. Eficiencia & Sensibilidad
µ-filtro
Volumen muerto cero para mejor cromatografíaLC/MS sensibilidad
Columna de Enriquecimiento
Sin problemas. Todo en UnoCanales creados por ablacion láserC l A lítiColumna AnalíticaColumna de EnriquecimientoConexión con MicrovalvulaPunta de nano-electrospray
Columna Analíticap y
Micro-filtros
Sin tiempos perdidos
Aguja de spray
Sin obturaciones de la aguja de sprayRecambios Plug-&-Play
Aguja de spray
Agilent 7100 CE-MS portfolioPl g & spraPlug & spray
Agilent es el único proveedor del portfolio completo de CE MSAgilent es el único proveedor del portfolio completo de CE-MS
Agilent CE-MS proporcionan: •Salida de capilar a tierraSalida de capilar a tierra• La interfase ESI más robusta• El intercambio más rápido entre LC - CE-MS•ChemStation control de CE-MSD - CE-trapChemStation control de CE MSD CE trap• QQQ, TOF, Q-TOF via ChemStation + MH
Aplicaciones clave:p•Compuestos naturales CE-MSD• Impurezas farmaceúticas CE-QQQ, CE-Trap• Estudios metabolómicos CE-TOF•Análisis de proteínas y glicanos CE-TOF
Agilent 6000 Series mass spectrometers
ICP-MS. Historia de Agilent( )Pasado (1994 ‐ 2000) Agilent 4500 Series
Casi 1000 unidades instaladas. El primer ICP‐MS de sobremesa controlado via PC
Futuro!Futuro!7700 Series – la nueva cara de ICP‐MS
Presente (2000 ‐ 2009) Agilent 7500 Series Casi 3000 unidades instaladas – el ICP‐MS con mejores ventas de la historia
MRM di á iMRM dinámico aplicado a a la pdeterminación de plaguicidasde plaguicidas en muestras alimentarias
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Tendencias en análisis li t i / di bi t l
• Necesidad de métodos de screening; confirmacion y cuantificación
alimentario/medioambientalg; y
únicamente de positivos (p.e. directiva marco de la EU para análisis de aguas)
• Necesidad de métodos “listos para usar” incluyendo la fase de preparación Necesidad de métodos listos para usar incluyendo la fase de preparación de muestra (p.e. EPA 1694: “Productos farmaceúticos y de cuidado personal en aguas, suelos, sedimentos, y biosólidos por HPLC/MS/MS”)
• Mayor número de muestras:Mayor número de muestras:• Necesidad de métodos más rápidos con menos preparación de
muestra• Necesidad de análisis multi componente• Necesidad de análisis multi-componente• Necesidad de una solución eficaz de gestión de datos
• Ideal:• Facilidad en la preparación de muestra• Identificación sin riesgo• Screening y cuantificación en el mismo runScreening y cuantificación en el mismo run
Flujo de trabajo habitual en alimentación/medioambiente con LC QQQalimentación/medioambiente con LC-QQQ
Screening Confirmacion Cuantificación
Características del diseñoTriple CuadrupoloTriple Cuadrupolo
Capilar dielectrico frio
Cuadrupolos hiperbolicos
Guía de iones octopolar
Celda de colision hexapolar
Detección Off-axis
Una bomba turbo1º Cuadrupolo 3º Cuadrupolo
p
Espectro con i d l
Q1 sólo deja l ió
Celda Colisión l ió 210
Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158
Guía de iones octopolar Celda de colisión (hexapolo) Detector
210
iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…)
pasar el ión “precursor” 210 pass
210
rompe el ión 210 (y sus productos)
los fragmentos 158 y 191
característicos del ión 210 para cuantificar y
170 210 250 290
210
222
268 280165190 210 150 170 190 210
210158
191
cualificar con máx. sensibilidad
160
158
190191
170 210 250 290 50 0 90 0
Beneficios de los sistemas UHPLC en acoplamientos a LC/MS Triple Quadacoplamientos a LC/MS Triple Quad
Típicamente 1,000 bar o mayoresMS – menores tiempos de análisis
Alta Presión MS menores tiempos de análisis
Típicamente menores de 200 uL
Presión
Bajo Vol pMS – mayor productividad
Bajo Vol. Muerto
MRMs 1 ms dwell por MRM30 P /N S it hirápidos
UHPLC30 ms Pos/Neg Switching> 200 MRMs/ sec
UHPLC combinado con un número muy elevado de MRMs virtualmente elimina la necesidad de las utilidades de scan en la
mayor parte de aplicaciones
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mayor parte de aplicaciones
MRM t d A ti B1 C l 6 (10 / l)Métodos para pesticidas con Agilent 1290 Infinity LC
MRM trazas de Avermectina B1a para Cal_6 (10 ng/ml)2x103 5x103 8x103
Método RRLC (25 min gradiente)
RT 18 98 i
Método 1290 (12 min gradiente)
RT 9 70 i
Método 1290(7 min gradiente)
RT 5 51 iRT 18.98 minWidth 0.346 min
RT 9.70 minWidth 0.127 min
RT 5.51 minWidth 0.091 min
Consideraciones prácticas MS/FastLC
Una cuantificacion para ser aceptable requiere, al menos, entre 10-15 puntos a lo largo del pico cromatográfico.
4x10
4.5
A medida que los picos son más
3
3.5
4
W1/2 = 0.63 s
Buena calidad datos:Avg W1/2 = 0.63 s Avg. W = 1.8 s5 puntos W1/2 13 puntos W
picos son más estrechos … el
detector debe “barrer” más deprisa. Los
1
1.5
2
2.513 puntos WArea RSD [%] = 4.7SNR (3RMS) = 1672
tiempos de ciclo se reducen por lo que,
los MRMs/cambios de polaridad deben ser
0
0.5
1
Counts vs. Acquisition Time (min)
0.49 0.495 0.5 0.505 0.51 0.515 0.52 0.525 0.53 0.535 0.54 0.545 0.55 0.555 0.56
W = 1.8 s
polaridad deben ser más rápidos.
W 1.8 s
MS tiempo de ciclo = 122.5 ms
Durante cada ciclo de medida, el sistema MS tiene que analizar 5 transiciones MRM y cambiar de polaridad.5 ms MRM dwell times + 30 ms cambio de polaridad en el sistema 6430 QQQp QQQ
Análisis por segmentos vs. MRM dinámicox105
4
5 Segmento 1Segmento 2
Segmento 3Segmento 4
2
3
1
Counts vs. Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo
La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interésMenor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico
Principios de funcionamiento de Dynamic MRM
Time (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4
MRM
MRM
Compounds (10/block)
Cycle Time (sec)50 800.5 0.8 1 0.7
100 70
Dynamic MRM
Max Coincident
Cycle Time (sec) 0.4 0.4 0.4 0.420 40 40 30
Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos másestrechos, más analitos y dwell times mayores por compuesto, y y p p
Control de 300 Pesticidas en matriz de manzananiveles de ppb cuantificados en 15 min con 1290 LC/6430 QQQniveles de ppb cuantificados en 15 min con 1290 LC/6430 QQQ
Residuos de Pesticidas La mayor parte de frutas y verduras en nuestras bolsas de la compra se cultivan con la ayuda de productos químicos que previene la presencia de insectos y
l hi bmalas hierbas. Los sistemas de salud pública controlan de modo regular los pesticidas presentes en aguas y alimentosen aguas y alimentos.
Page 24
Puesta en marcha de un método Dynamic MRM1. Crear una tabla con los nombres de los compuestos, transiciones
MRM y parámetros, tiempos de retención y ventanas de tiempos de retención en EXCEL via MassHunter Quant reportingretención en EXCEL via MassHunter Quant reporting
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Puesta en marcha de un método Dynamic MRM2. Seleccionar “Dynamic MRM” como Scan type en la pantalla de
MassHunter Acq (permite hasta 200 MRMs simultáneos y hasta 4000 MRMs en total manteniendo constante el tiempo de ciclo)4000 MRMs en total manteniendo constante el tiempo de ciclo)
1. 2.
3. Copiar la tabla de EXCEL y pegar en MassHunter Acquisitionp y p g qdesde el clipboard o importar las transiciones desde Optimizer (la base de datos aun no contiene los tiempos de retención)
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Puesta en marcha de un método Dynamic MRM4. El botón “Apply” genera el método MRM5. El establecimiento de los segmentos de tiempo y dwell times
se hace automáticamente usando el tiempo de ciclo especificado, los RTs y las ventanas de RTs.
3.
6. Se calcula el máximo número de MRMs concurrentes y los valores mínimos y máximos de dwell timey
Page 27
Método MRM estático para pesticidas seleccionados (25 ng/ml)seleccionados (25 ng/ml)
4x10
6.5
7
+ESI MRM Frag=120.0V CID@** (309.0 -> 281.0) pos_QC_07-r001.d
1 17x104
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
0.5
1
1.5
2
2.5
3
12.96513934
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
• El método final incluye 11 pesticidas con 2 transiciones MRM
• Dwell time 25 ms para cada transición, inter-scan delay 2 ms
Counts vs. Acquisition Time (min)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Método MRM Dynamic para 175 pesticidas (25 ng/ml)ng/ml)
4x10
7.5
8
+ESI MRM Frag=120.0V (309.0 -> 281.0) 250Mix_25 ppb-r001.d
1 18x104
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
12.94814952
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25Counts vs. Acquisition Time (min)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
• El método final incluye 175 pesticidas con 2 MRM (350 MRMs)
• Dwell times flexibles con un cycle time fijo de 750 ms Inter scan delay 3 5 ms• Dwell times flexibles con un cycle time fijo de 750 ms, Inter-scan delay 3.5 ms
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Comparación MRM estático vs dinámico (10 ng/ml)Peak Areas Solvent
(n = 20)Citron(n = 5)
Carrot(n = 5)
Cucumber(n = 5)
Dynamic Static Dynamic Static Dynamic Static Dynamic Static MRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM
MethamidophosAverage
CV276770.95
265792.22
229460.82
216752.40
229522.23
228792.16
224752.68
215911.40
AcephateAverage
CV248131.62
237652.17
238542.30
233281.36
252351.65
244610.75
254281.84
245820.82
CarbendazimCarbendazimAverage
CV897200.94
860271.66
534130.80
518371.20
538141.42
525320.92
919441.00
898120.61
AldicarbA 31069 29859 16687 16260 30924 30245 28214 26707Average
CV310691.21
298591.77
166870.75
162601.23
309241.76
302451.12
282141.37
267071.15
FensulfothionAverage 29533 28304 22060 21476 33777 32610 31789 30235
CV 1.55 1.38 0.73 1.59 1.29 1.78 2.47 0.76
FenhexamidAverage
CV60132.43
57912.54
50091.14
46253.57
93314.48
94332.85
47008.50
54246.98
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Comparación MRM estático vs dinámico (10 ng/ml)Peak Areas Solvent
(n = 20)Citron(n = 5)
Carrot(n = 5)
Cucumber(n = 5)
Dynamic MRM
Static MRM
Dynamic MRM
Static MRM
Dynamic MRM
Static MRM
Dynamic MRM
Static MRMMRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM MRM
Diflubenzuron Average
CV71302.46
67202.40
16396.14
17443.76
68024.68
63981.40
66092.02
62791.57
Spinosyn AAverage
CV153897
1.12151002
1.23142868
0.86143027
0.47114625
0.97114595
0.28112952
0.76109072
0.84
Spinosyn DA 44289 43248 41065 40807 23030 23067 25979 25154Average
CV442890.75
432481.88
410650.48
408070.61
230300.51
230671.13
259790.35
251540.92
CypermethrinAverage
CV19214 20
18174 46
26574 26
27754 30
16056 96
14572 61
17251 11
16845 00CV 4.20 4.46 4.26 4.30 6.96 2.61 1.11 5.00
Avermectin B1aAverage
CV105153.34
42825.90
113941.43
55561.06
105402.50
49024.65
70823.49
35622.55
Page 31
Kits de Aplicaciones para LC/MS QqQLC/MS-QqQKits Base de Datos DMRM• Adaptables a la cromatografía del usuario.
• Chequeo opcional de la aplicación on-site.
• Kit 600 pesticidas i l :• Kit 600 pesticidas incluye:– Columna y mezcla de test específica.– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC’s. 5990-4253EN
• Kit 200 compuestos de interés Toxicológico incluye:– Columna y mezcla de test específica.
5990-4254EN
y p– DVD con los parámetros del métodos/s.– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.– Contiene esencialmente drogas de abuso y fármacos
Página 32
5990 4254EN
Resumen1. Agilent 1290 Infinity LC permite separaciones ultra-
rápidas y con muy buena resolución cromatográficaGran capacidad de pico para separaciones complejasExcelente precisión en inyección y RTBajos volúmenes muertos para métodos ultra-rápidosMuy bajo efecto memoria en AS
2. Agilent MS/MS Triple Cuadrupolo. El complemento perfectoperfecto
Cambio de polaridad pos/neg de alta velocidadMét d á id MRM / D i MRM QQQMétodos rápidos MRM / Dynamic MRM para QQQExcelente sensibilidad y rango dinámico lineal
Page 33
Agilent Application Kits
6230 TOF 6530 QTOF 6540 QTOF
Screening de substancias hibid i t dprohibidas con sistemas de
Tiempo de Vuelop
Aportación de los sistemas de Tiempo de VueloMasa Exacta Inferior a 1 ppmMasa Exacta Inferior a 1 ppm
Aportaciones de la Masa Exacta1. Especificidad en la comparación.2. Muy Elevada Selectividad Cuantitativa para la extracción de informaciónespecífica de cada metabolito/compuesto con métodos de adquisición genéricosespecífica de cada metabolito/compuesto con métodos de adquisición genéricos(modo barrido).Requerimientos en Biociencia
1. “Masa Exacta” independiente de la concentración del analito.2. Buena Sensibilidad en modo barrido (métodos genéricos MS-SCAN).
Exactitud Masa (ppm) Nº posibles fórmulas empíricas Tecnología
165 ppm 209 QUAD/TRAPpp10ppm 135 ppm 72 ppm 2 TOF /Q-TOF
Comp : Reserpina (C33H40N2O9) [M+H]+: 609 281 m/zComp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H] : 609.281 m/z
Molecular Feature Extractor (MFE)Desde la complejidad de los datos iniciales a la obtención de la informacion p jmás relevante
2D2D
3D
Molecular Feature ExtractorPaso efectivo de Datos en Información RelevantePaso efectivo de Datos en Información Relevante
Raw data Background noise removed
Individual m/z peaks grouped into isotope
Isotope clusters grouped intoremoved grouped into isotope
clustersgrouped intomolecular features
Al it d D t Mi i t t d A il t T h l iAlgoritmo de Data Mining patentado por Agilent Technologies.
Mucho más que un simple reporting de presencia de iones con datos de masa exactade masa exacta
Identificación sencilla de 400 compuestos en una muestra de miel con generación automática de fórmula … ¡en 5 g ¡minutos!
Lista de tcompuestos con
fórmulasmoleculares
Superposición de ECCs (Extracted
Compound
Resultadosdetallados del
pChromatograms)
Detailed Formula
detallados del cálculo de la
fórmula
Generation Results
Espectro de masascon superposición
del patrón isotópicoesperadoesperado
Empirical Formula Generation – Mass Hunter
Listas de compuestos con fórmulas empíricas calculadas
Cromatogramas extraídos para cada MF encontrada por el softwarep
Resultados usados para pel cálculo de la fórmula molecular
Espectro de masa con pattern isotópico esperado superpuesto
Búsquedas en librerías comerciales, propias, herramientas para pacotar resultados …
Agilent TOF Solución de ScreeningAgilent 6220/30 TOF• 20K Resolucion• 5 decadas en-scan
S ibilid d i l d b j• Sensibilidad a nivel de pg bajos
Page 40
Agilent Personal Compound Database Base de Datos de masa exacta con 1600 pesticidasBase de Datos de masa exacta con 1600 pesticidas
Masa Monoisotópica(varia en ppm)
Scoring basado en
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
Isotope spacing(varia en ppm)
Distribucion Isotópica(varia en %)
Nuevo, para TOF/Q-TOF screening de pesticidas• Contiene 1600 pesticidas recopilados de 5 laboratorios de control regional en
Europa y AsiaEuropa y Asia• Misma interfase que METLIN – simple e intuitiva, incl. estructuras• Scoring basado en masas monoisotopicas, isotope spacing/distribution
Li k Ch id• Links a Chemspider
Matriz Compleja de Pimiento extraída con método QUECHERS . ¿Cómo identifiar los pesticidas presentes en este cromatograma FS?
Tanto si el cromatograma tiene pesticidas como si no, el aspecto del p , p
cromatograma es muy parecido
Respuesta: Búsqueda automatizada en bases de datos de masa exactadatos de masa exacta
Pero, ¿cómo se llega realmente de la transparencia anterior a esta?
Pesticide Personal Compound Database1600 Pesticides and Related compounds1600 Pesticides and Related compounds
Scoring basado en
Masa Monoisotópica(varia en ppm)
Isotope spacing(varia en ppm)
Distribucion Isotópica(varia en %)
(varia en ppm)
El usuario puede generar sus propias bases de datos en funcion de que el método usado pueda mejorarse para una matriz en particular
Paso 1: Analizar un set o sets de estandares de pesticidas y Procesar con MassHunter (MFE)
6
p y ( )
Paso 2: Importar fichero en PCDB y “Find Compounds” Resolución de posibles conflictosCompounds . Resolución de posibles conflictos
Los posibles conflictos (p.e. misma masa a dos RTs distintos) aparecen en color rojo. Una vez resueltos el color rojo desaparece. La base de datos puede además adaptarse
añadiendo/quitando compuestosañadiendo/quitando compuestos
Paso 3: Batch Summary Actualizar tiempos de retención para análisis target/no-target
Cuando se hace el update de RTs la base de datos puede usarse para compuestos target y no-target Aunque presentes en la base de datostarget …. Aunque presentes en la base de datos
Automatización de la búsqueda desde MassHunter CualitativoCualitativo
Una vez adaptada/comprobada la base de datos suele usarse desde MassHunter Qual
Resultados del Screening usando MFE + PCDB de pesticidaspesticidas
COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados
COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero loresentes en la DB – Estándares no inyectadosp y
Agilent Quick Start Application KitsEl camino más rápido a la productividad
Disponibles para GC, GC/MS, LC y LC/MS para:Análisis alimentario
El camino más rápido a la productividad
Análisis alimentarioAnálisis ambientalAnálisis Forense/ToxicológicoAnálisis Forense/ToxicológicoAnálisis petroquímico
Todo lo necesario para el éxito de su aplicación:• Configuración ideal de instrumento + Bases de Datos & Software• Consumibles específicos para la aplicación• Consumibles específicos para la aplicación• Documentación específica para la aplicación• Muestras de test específicas para la aplicación• Método en CDMétodo en CD• Herramientas de entrenamiento en video• Chequeo opcional en fábrica• Chequeo opcional de la aplicacion on-siteChequeo opcional de la aplicacion on site
Resumen Agilent TOF. Application Kit para screening de pesticidasscreening de pesticidas1. Diseñados para mantener una elevada
sensibilidad2. Elevada resolución MS3. Exactitud de masa mejor que 2 ppm4. Elevado rango dinámico espectral5. Excelentes prestaciones para screening de
compuestos• Nueva base de datos personalizada de
compuestos • Adaptable• Inicialmente con 1600 entradas
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Adulteraciones y su determinaciónAdulteraciones y su determinación con sistemas de tiempo de vuelo
Perfil metabolómico de vinos usando un sistemaHPLC-QTOFMS y herramientas avanzadas de estadísticas de
data mining/comparacióng p
Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb
a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republicb Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA
Objetivos del estudioObjetivos del estudio1. Demostración del potencial del sistema Agilent LC–1. Demostración del potencial del sistema Agilent LC
QTOF-MS para el perfilado metabolómico de alimentos
2. Desarrollo de un procedimiento de data mining y
procesado de datos para obtener información acerca de p p
los potenciales marcadores de cada variedad de vino
3 C t ió d d l t dí ti d l ifi ió3. Construcción de un modelo estadístico de clasificación
4. Identificación de los compuestos marcadores de cada
una de las variedades
Flujo de trabajo propuesto
MUESTRAS
ANÁLISIS INSTRUMENTAL DATA MININGS S S U• RRLC separacion, columna RP• ESI(MM)-QTOFMS (MS - MS/MS)
• extracción molecular features • substracción del fondo
PROCESADOIDENTIFICACION• filtrado de datos• análisis estadístico (ANOVA, PCA)• clasificación (PLS-DA)
• experimentos MS/MS• estimación de formula molecular• busqueda en base de datos ( )busqueda e base de datos
MUESTRAS• Vino Tinto (45 samples total)
• Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)
• Países de Origen: Czech Republic, Slovakia, France, Italy, Macedonia,
Bulgaria, Hungary, Australia, Chile, Germany, USA
• Añadas: 2004 - 2008
d blSet de muestras muy variable
Instrumentación Utilizada
?Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).
Jet Stream ESI source
?Jet Stream ESI sourceMultimode ion source
Software de áAnálisis
Estadístico Multivariante
Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)
Agilent Technologies6530 Accurate‐Mass Q‐TOF LC/MS
Agilent Technologies1200 RRLC system
Procesado de Datos. Total Ion Chromatograms
TIC vino y LC blanco, LC-(ESI+) QTOFMS
?? ??
???
??
??
?
??
???? ? ?
???
??
?
???
?????
??
?
??
?? 6x10
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3+ESI Scan (6.248-6.387 min, 13 scans) Frag=125.0V ESI+_PN…
* 210.1133
Los espectros corresponden
a múltiples compuestos ? ?
BLANCOVINO
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
493.1350
200 400 600 800 1000
coeluyentes
1. Datos muy complejos.2. Compuestos minoritarios
enmascarados
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000
6x10
1.2
1.4
1.6
1.8+ESI Scan (3.888-3.981 min, 9 scans) Frag=125.0V ESI+_PN_…
enmascarados3. Se requiere software que extraiga y
caracterice todos los compuestos ionizados. 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
358.1719
571.3074
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000
Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”
M.F.E. extrae 20.506 “features” del conjunto de todas las muestras
Find compound byMolecular Feature
ExtractorExtractor
Procesado de datos – Mass Profiler P f i l Ali d d MF l t d d tProfesional - Alineado de MFs en el set de datos
20506 entidades
molecularesmolecularesobtenidas
desde todaslas muestras
Procesado de datosFiltración de entradas por frecuencia (P i l )
Filtro por defecto: Presencia de una entidad en el 100% de
Filtración de entradas por frecuencia (Presencia en clases)
una entidad en el 100% de muestras al menos en un grupo
663 entidades de 20506 permanecen
inte
nsity
Aver
age
i
En sets de muestras muy complejos esta aproximacion puedeeliminar algunos compuestos significativoseliminar algunos compuestos significativos
Procesado de datosFiltración por frecuencia Entidad significativa – Pinot NoirFiltración por frecuencia. Entidad significativa – Pinot Noir
Este compuestoestá presente en 14 d l 1514 de las 15 muestras de Pinot NoirPinot Noir
tens
ityAv
erag
e in
t
Solo algunas entidades significativas están presentes en el
A
Solo algunas entidades significativas están presentes en el 100% de las muestras en una clase
Procesado de datosA áli i t dí ti O W ANOVAAnálisis estadístico: One-Way ANOVA
p<0.0540 tid d d40 entidades de
3600 permanecen
Procesado de datosAnálisis estadístico Cambio de forma (fold)Se usa Fold Change Analysis para identificar entidades con abundancias significativamente distintas en las clases seleccionadas
Análisis estadístico. Cambio de forma (fold)
abundancias significativamente distintas en las clases seleccionadas
tyge
inte
nsi
Aver
ag
Cabernet Sauvignon y Merlot son un par problemático se aplica un cut-off FC ≥ 2 0
26 entidades de 40 permanecenproblemático, se aplica un cut-off FC ≥ 2.0 permanecen
Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante Filtrado por Frecuencia y Análisis de Componentes
PCA de datos PCA de datos
Principales (PCA)
Entradas iniciales (20506) Entradas filtradas por frecuencia (3600)
FILTRATION
CABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR
FILTRATION
PINOT NOIR
Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)
PCA de los datos:Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26
y p p ( )
Componentes después de ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26
Un adecuado filtrado de los datos
es esencial para
FILTRACIÓN
puna buena
clasificación
CABERNET SAUVIGNONCABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR
CONCLUSIONES1. LC–QTOFMS es una herramienta extremadamente útil
para el estudio del metaboloma del vino e identificación de sus componentes
2 Mass Profiler Pro software permite un procesado avanzado2. Mass Profiler Pro software permite un procesado avanzado y eficaz de los datos haciendo uso de herramientas quimiométricas comunesquimiométricas comunes
3. Las diferentes variedades de vino puede discriminarse de modo eficaz usando perfiles LCMS y modelos de prediccion multivariantes
4. Para una mayor generalización (siempre) es necesario un mayor número de muestrasmayor número de muestras
Gracias por su atención
Juan AybarEspecialista de Producto GCMS/LCMSp
Agilent Technologies Spain901.11.68.90
This information is subject to change without notice© Agilent Technologies, Inc. 2010Published in Spain, January 15, 2010