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Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería:
enfermedades hereditarias y no hereditarias
Inmaculada MartInmaculada Martíín n [email protected]@unizar.es
Enfermedad genéticaDesviación del estado de salud debida total o parcialmente a la constitución genética del individuo, en el que factores ambientales pueden cumplir una función importante en la expresión y gravedad de los defectos o síntomas
2
¿Cómo reconocerlas?
Historia familiar – análisis de pedigríes:
Especies: Perros, Caballos, Vacuno lechero
Reconocimiento del modo de herencia
Control de filiación
¿Cómo reconocerlas?Epidemiología de la enfermedad
Aparición de casos puntualesAparición en estirpes
Análisis de pedigríes
Determinación del tipo de herencia
3
¿Cómo reconocerlas?
Examen físico:Buscar cambios estructurales, fenotipos característicos, alteraciones en las manos, pies, piel, pelo, etc.
¿Cómo reconocerlas?
Examen laboratorial:Estudios bioquímicos, inmunológicos, citogenéticos y de genética molecular.
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Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria
Fenotipo (enfermedad) = genotipo + ambiente
Factor genético1. Enfermedades (o rasgos) monogénicas:
• Con herencia mendeliana más o menos regular• Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc.
2. Enfermedades de herencia multifactorial1. Poligénicas2. Monogénicas con importante componente ambiental
3. Enfermedades de origen cromosómico (cromosomopatías)1. Se detectan al microscopio2. Se originan en la meiosis3. No heredables o herencia irregular4. Afectan a muchos genes cuadro grave, muchos letales
Caracteres Mendelianos
Online Mendelian Inheritance in Animals: http://omia.angis.org.au/
395972131135149215229280Modelo en animales
292538689770136126224Modelos humana
3722171513244368Caracterizados a nivel molecular
1310726829354775131Monogénicos
4970179186193215280376489Fenotipos totales
ConejoCabraPolloOvejaCaballoCerdoGatoVacaPerro
20/01/09
5
Enfermedades en bovino
CVM (malformación vertebral compleja)BLADDUMPSHIPERTROFIA MUSCULAR “hm”MULEFOOT O SINDACTILISMOCITRULINEMIA
http://www.gov.on.ca/OMAFRA/english/livestock/beef/facts/93-007.htm
Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias
BLADBLAD
6
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
BLAD GROBET y cols. (1992)
"Enfermedad autosómica
recesiva que afecta a descendientes del toro holstein O. Ivanhoe, abuelo paterno de
C. M. Ivanhoe Bell "
VI JORNADASPRODUCCION ANIMAL
Difusión rápida de enfermedadeshereditarias (con frecuencia baja)17% Mejores toros de EEUU y
Canada son portadores de BLAD
HOLSTEINIZACION
ESPAÑA
MOET IA
Shuster y cols. (1992)
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VI JORNADASPRODUCCION ANIMALBLAD
Un gen autosómico letal recesico
Ganado vacuno Holstein
BASE MOLECULAR:
Deficiencia de la proteína Mac-1(Complejo CD 11B/CD18)
Leucocitos no pueden trasportarse desde lasangre a lugares de infección
BTA 1 (U 10)
CONTROL:
AFECTA:
LOCALIZACION:
VI JORNADASPRODUCCION ANIMALBLADBLAD
SINTOMAS
Muerte de las 7 semanas a los 8 meses
FiebreDiarreas
UlceracionesGingivitisAnorexia
Retraso creto.InfeccionesPneumonia
Ganglios grandes
LESIONES
*Necrosis ganglionar*Riñones atroficos
*Serositis en rumen*Enteritis ulcerativa
*Ausencia de neutrofilos en tejidos blandos*Hiperplasia de foliculos linfoides*Edema en áreas paracorticales
*Congestión esplénica*Vasos dilatados
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VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
Alteraciones del complejo
CD11/CD 18
VACUNO BLAD
HUMANA LAD
PERRO "Sindrome de
granulopatía canina
VI JORNADASPRODUCCION ANIMALBASE MOLECULAR
Dos mutaciones
Silente
Sustitución en la posición 128de A por G
(Glicina por Ac. Aspártico) D128G
ALTERACION DE LA PROTEINAMac1 (CD 11/CD 18)
Secuencia anómala del gen CD18:Defecto de expresión del CD18
Falta subunidad α en laintegrinaβ2
Alelo raro "D128G"
9
VI JORNADASPRODUCCION ANIMAL
FRAGMENTO AMPLIFICADO: 58 b. p. del gen CD11/CD18OLIGONUCLEOTIDOS:
CONDICIONES DE AMPLIFICACION:94º C., 10'
Desnaturalización 94º C.. 15"HibridaciónElongación 69º C., 20"35 x
VISUALIZACION DEL FRAGMENTO:Gel de agarosa al 4 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)
Desnaturalización previa
DIGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION:Taq I 65º C.Hae III 37º C.> 4 horas
VISUALIZACION DEL PRODUCTO DIGERIDO:Gel de agarosa al 5 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)
5' TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3'5' GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG3'
VI JORNADASPRODUCCION ANIMALAMPLIACION POR PCR:
58 bp del gen CD18
D128/D128 :
HeterocigotosSanos, portadores
Homocigotos recesivosEnfermos
Homocigotos dominantesSanos, no portadores
3 GENOTIPOS
D128/D128G :
D128G/D128G :
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VI JORNADASPRODUCCION ANIMAL
G G C C T C G A C C
G G C C T C G G C C
7 bases 13 bases
7 bases 13 bases
30 bases
28 bases
8 9 10 11 25 26 2827
8 9 10 11 25 26 2827 29 30
Hae III
Hae III
Taq I
Hae III
19 bases9 bases
9 bases 49 bases
25 bases 33 bases
58 bases (Taq Ino encuentra secuencia de corte)
Alelo MUTADO (D 128 G)
Secuencia reconocida porTaq I Secuencia reconocida porHae III
Lugar de corte de Taq I Lugar de corte de Hae III
Fragmento originado por digestión con Taq I Fragmento originado por digestión con Hae III
Leyenda
* La mutación se produce en labase 28
Alelo NORMAL(D 128)
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
T H N
T H N
T H N
19 bp
9 bp
25 bp 30 bp 33 bp
49 bp
58 bp
+
_
Individuo NORMAL (TL) D 128 / D 128
Individuo PORTADOR (BL) D 128 / D 128 G Individuo ENFERMO D 128 G / D 128 G
T: DNA digerido con Taq I H: DNA digerido con Hae III N: DNA no digerido
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DIAGNOSTICO DE BLAD
Diagnóstico: PCR + Taq I
G/G D/GD/GD/GD/G D/D
VI JORNADASPRODUCCION ANIMAL
DIAGNOSTICO COLECTIVO
" A partir de la muestra recogida de un tanque lechede una explotación, conocer de forma rápida y
económica la existencia de hembras portadoras "
Método PCR detecta: " Presencia de un portador enuna muestra de un tanque de leche correspondiente al
ordeño de 40 hembras "
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Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias
SSPSSP
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
$
13
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la ryanodina
Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado)
HerenciaAutosomica
recesiva
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
DETECCIÓN POR LIGAMIENTO- Halotano- Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)
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DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
C
199bp
PCR199bp
T 165bp 34bp
BsiHKA I
15
16
Diagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias
Susceptibilidad/ResistenciaSusceptibilidad/ResistenciaGenéticaGenéticaScrapieScrapie
Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
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ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
- hereditaria- esporádica- infecciosa
AnimalesHumanas
KuruEnfermedad de Creutzfeld-JakobInsomnio Familiar Fatal
Encefalopatía Espongiforme BovinaEnfermedad Transmisible del VisónSCRAPIE (Tembladera) ovino y caprino
Susceptibilidad genética
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES
Depósitos de PrPSc Pérdida neuronal y gliosis
Espongiosis Vacuolización
18
Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
Agente causal de tipo infeccioso
PrP (Proteína Prión)
PrPC PrPSc
Cambio de conformación
Proteína sensible a proteasas Proteína resistente a proteasas
depósito en tejidos celulares
Sistema linfoide SNC
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
GEN PRNP (Proteína prión)
• Secuencia muy conservada en un gran número de especies (230-256 aa)
• Alto grado de polimorfismo
relacionado conSUSCEPTIBILIDAD
Período de incubación(humano, ovino ycaprino)
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Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Implicaciones genéticas de las EETsNPU (1961): Selección intra-raza según la resistencia a la infección de scrapie experimental
Interacción entre el genotipo del hospedador y las cepas de scrapie.
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Implicaciones genéticas de las EETs
Gen Sip (Scrapie incubation period): Gen mayor que controla la duración del periodo de incubación de scrapie.
NPU:
sA (p.i. corto) > pA (p.i. largo)
Dickinson (1968):Gen “sinc” (Scrapie incubation): Estudios experimentales en ratones.
Comportamiento dependiente de la cepa de scrapie (ME7 y 22A)
s7 (p.i. corto) > p7 (p.i. largo)
Implicaciones genéticas de las EETs
La proteína priónica PrP aparece en la fracción infecciosa de los homogeneizados de scrapie.Asociación genética entre el gen PRNP y la longitud del periodo de incubación de scrapie en ratón.Identificación de mutaciones del gen PRNP en ciertas patologías humanasEn ovino el gen mayor Sip está estrechamente ligado a PRNP .Ratones knock-out para el gen PRNP son resistentes a la enfermedad
Gen de la proteína prión (PRNP):
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Factores genéticos de las EETsImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Gen PRNPLongitud 16-22 kpb:
2 o 3 exones según la especie
Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb)
Codifica una glicoproteína de membrana de entre 230 y 250 aa según la especie
Altamente conservado entre especies.
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Gen PRNP
ORF 3’UTRExon1 Exon2 Exon3
Proteína PrP murina
Péptido señal
Repet. octapéptidos
1 23 51 90 231 254213178
196180
S S UniónGPI
CHO CHO
Proteína PrP humana
1 245
Http://www.errnm.cbcu.carn.ac.uk
Gen PRNP
23
Gen PRNPIdentificación y localización del gen PRNPEspecie Localización Especie Localización
Bos taurus 13q17 Homo sapiens 20pter-p12
Bufalus bufalis 14q15 Mus musculus 2
Cervus elaphus 2 Ovis aries 13q15
Capra hircus 13q17 Rattus norvegicus 3q35
Equus caballus 22 Vulpes fulva 14
Gen PRNPHomología de secuencia
Humano vs BovinoHumano vs OvinoBovino vs Ovino
66.7 %65.4 %94.0 %
Prusiner (1998)
24
Gen PRNP
Mutaciones puntuales:
Inserciones y delecciones de octapéptidos
GTC GCC Val Ala
PHGGGWGQ
Polimorfismos
Gen PRNP
Prusiner (1998)
Polimorfismos
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Factores genéticos de las EETsImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Genética de las EETs humanas
• Polimorfismo más importante: Codón 129
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Met/MetVal/Val
Susceptibilidad
http://www.bse.org.uk/report/volume2
26
Genética de las EETs humanasEnfermedad de Creutzfeldt-Jakob
• Mutación más común en el codón 200
- Sustitución de Lisina por Glutamina
- 70% de familias
• Patologías distintas dependiendo de la combinación de mutaciones existente
Familiar
Genética de las EETs humanas
http://www.bse.org.uk/report/volume2
27
Genética de las EETs humanas
http://www.bse.org.uk/report/volume2
Genética de las EETs humanas
http://www.bse.org.uk/report/volume2
28
Genética de las EETs humanas
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
• Hipótesis muy probable:
Se produce una mutación somática del gen PRNP
en un número muy reducido de células.
Esporádica
Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
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Genética de las EETs en ratón
Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino
Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan diferencias en el periodo de incubación de scrapie.Utilizado como modelo para confirmar la importancia de las mutaciones detectadas en el gen PRNP humano.Identificación de QTLs ligados al periodo de incubación del la enfermedad.
Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs
QTL: Quantitative Trait LociCaracteres cuantitativos determinados por el efecto aditivo de la acción de varios genes.
El periodo de incubación es un carácter cuantitativoEl ratón como animal modelo:
Razones económicasControl del manejoDisponibilidad de líneas consanguíneas con periodos de incubación muy distintos.
Loyd et al. (2001)
30
Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs
CAST/Ei NZW/OlaHsd CAST/EiNZW/OlaHsd
F1
F2
Loyd et al. (2001)
Genética de las EETs en ratónAnálisis de la F2:• Inoculación intracerebral con scrapie• Determinación del periodo de incubación (1000 anim)• Análisis de 150 microsatélites (marcadores altamente polimórficos dispersos por todo el genoma)• Análisis de ligamiento entre el genotipo de los marcadores y el periodo de incubación.
Chr. 2
Chr. 11
Chr. 12
Loyd et al. (2001)
Otros QTLs:Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001)
Existen otros genes relacionados con el periodo de incubación de la enfermedad
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Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Genética de las EETs en ovinoGen PrP ovino
Tamaño del gen 20kpbProteína de 256 aaHomología con bovino (94%)
Secuencia aminoacídica de la PrP bovina ≠ de la ovina en 7 u 8 posiciones
Localización: 13 (13q17/18)
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INTRODUCCIÓN
GEN PRNP OVINO
• Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007)
Codones136154171
SCRAPIE CLÁSICO
Codón141
SCRAPIE ATÍPICO (Nor98)
4 codones asociados a susceptibilidad
En scrapie y EEB experimentales y ensayos in vitro: M137T, I142K, H143R, R151C, P168L, N176K(Goldmann y cols., 2006; Vaccari y cols., 2007;
Bossers y cols., 2000)
Efecto protector
Estudios de los diferentes codones según la
raza
Codón 136VV136 SusceptibilidadAV136 SusceptibilidadAA136 SusceptibilidadAA depende de la raza:
CheviotIle de FranceFlemishSwifter
ResistenciaSwaledaleTexelLacauneRomanov
Susceptibilidad
Genética de las EETs en ovino
33
Genética de las EETs en ovino
Estudios de los diferentes codones según la raza
Codón 154
Codón 171
RR154 No determinadoRH154 Cierta resistenciaHH154 Resistencia
QQ171 ResistenciaQR171 ResistenciaRR171 Resistencia 1 Suffolk en Japón
Genética de las EETs en ovino
Definidos los codones se establecen las posibles variantes
A R R
A H Q
A R H
A R Q
V R Q
Cierta resistencia
Cierta susceptibilidad
Susceptibilidad
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Según el genotipo del animal y su comportamiento frente a
la enfermedad se definen 5 categorías de riesgo:
R1: Riesgo muy bajo individual y de la progenie
R2: Riesgo bajo individual y de la progenie
R3: Riesgo bajo individual y progenie dependiente del
otro parental
R4: Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo que
R5: El mayor riesgo a scrapie
Genética de las EETs en ovino
Genética de las EETs en ovino
Riesgo 4ARQ/ARQARR/VRQ
Riesgo 5ARQ/VRQVRQ/VRQ
Riesgo 3ARR/ARQRiesgo 1ARR/ARR
Categoría de riesgoGenotipo
Razas: Charolaise y Blue de Maine
35
Genética de las EETs en ovino
Razas: Bluefaced y Leicester
Riesgo 2ARR/AHQAHQ/AHQ
Riesgo 4ARR/ARQARQ/ARQ
Riesgo 5ARQ/ARQ
Riesgo 1ARR/ARR
Categoría de riesgoGenotipo
Genética de las EETs en ovino
¿Qué sucede en nuestras razas?
Comunidad Autónoma de Aragón
¿Qué sucede en los animales con scrapie
pertenecientes a nuestras razas?
¿Qué sucede en otras razas Mediterráneas?
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* Determinación del riesgo genético de las razas ovinas aragonesas:
Rasa Aragonesa.Ojinegra.Cartera.Maellana.Ansotana.
* Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen PRNP.
Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Material y Métodos- Razas estudiadas :
Rasa Aragonesa. (4 Rebaños)Ojinegra. (4 Rebaños)Cartera. (2 Rebaños)Maellana. (2 Rebaños)Ansotana. (1 Rebaño)
- De cada rebaño: Todos los machos reproductores y hasta 50 de hembras.
- Extracción y purificación del DNA de sangre entera, usando el Kit de Amersham® GFX Genomic DNA blood Minikit.
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
37
- Condiciones de la PCR:
0,20,2mMmM0,250,25CebadorCebador--RR
0,2mM0,2mM0,250,25CebadorCebador--FrFr
------2525HH22O hasta O hasta
1,5mM1,5mM0,750,75ClCl22MgMg
120120mMmM2,42,4dNTPsdNTPs
1X1X2,52,5Tp10XTp10X
ConcentraciConcentracióón n finalfinal
Volumen / Volumen / ReacciReaccióónn
((mlml))
Componentes de la Componentes de la reaccireaccióónn
94ºC 5min
72ºC 5min
94ºC 30secTaºC 30sec72ºC 1min
(x40)
Material y Métodos
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
* Codones 136 y 154 con BspHI. (O’Doherty et al., 2000)
* Codón 171 con BslI y AccI. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999)
- PCR/RFLPs:
- SECUENCIACIÓN:
* Amplificación de toda la región codificante.
- F: 5’-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT-3’- R: 5’-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3’
* Purificación del producto PCR (NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel®) y secuenciación.
Material y Métodos
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
38
Resultados
136 y 154
171
- PCR/RFLPs:
368241179+189
AR AH VR
127
R Q/H
918160
PCR
PCR171
R/Q H PCR171149125
PC
RA
RR
/AR
RA
RR
/AH
Q
AH
Q/A
HQ
AR
R/A
RQ
AR
Q/A
HQ
AR
R/A
RH
AH
Q/A
RH
AR
Q/A
RQ
AR
Q/A
RH
AR
Q/V
RQ
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Resultados
R1
R2
R3
R4
R5
Ansotana Cartera Maellana
Ojinegra Rasa Aragonesa
44%31%
15%39%
47%
14%6% 4%
26%
48%
26%
83%
12%2.5% 2.5%
72%
24%
2% 2%
Porcentaje de animales según su nivel de riesgo
Susc
eptib
ilida
d
–
+
R. Aragonesa:46 ARQ/ARQ2 ARR/ARQ
Acín et al. (2004) Vet Rec
Scrapie
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
39
Resultados
* Se detectó (Ojinegra) la variante rara (Lisina) en el codon 171.
* Se detectaron polimorfismos en 14 codones.
* Se detectaron nuevos polimorfismos en la especie ovina:
101 (Q R)151 (R G)151 (R H)172 (Y D)175 (Q E)
- SECUENCIACIÓN:
* Se ha confirmado la mayoría de los resultados de RFLPs.
Codon 171
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Conclusiones
* Las razas ovinas autóctonas analizadas se presentan como razas muy susceptibles al padecimiento de scrapie.
* El gen PRNP presenta una gran variabilidad en el ovino autóctono.
* La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de error en la lectura debido a la presencia de alelos raros.
* La técnica de secuenciación evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo además detectar nuevos polimorfismos.
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
40
POLIMORFISMOS DEL GEN PRNPEN OVINO MARROQUÍ
Serrano et al. (2007) Vet Rec
MATERIAL Y MÉTODOS
OVINO MARROQUÍ: 154 animales• Animales
89 D’man 43 Boujâad 22 Sardi
• Extracción de DNA de sangre enteraGenomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare)
• Amplificación por PCRFragmento de 768 pb: región codificante de PRNP
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Serrano et al. (2007) Vet Rec
41
--
0,05U/µl
100-500ng
0,2
0,2
1,5120µM
1X
Concentración final
0,5Taq polimerasa (5U/ml)
2DNA
0,5Cebador-R (20mM)5’-ACAGGAAGGTTGCCCCTATCC-3’
0,5Cebador-F (20mM)5’-GGCAGTTGGATCCTGGTTCTC-3’
50H2O milliQ hasta
1,5Cl2Mg (50mM)4,8dNTPs (1,25mM)5Tampón 10X
Volumen (µl)Componentes
PROTOCOLO de PCR
Programa
94ºC 2min
94ºC 15seg60ºC 15seg72ºC 20seg72ºC 5min
x 30 ciclos
Purificación del producto de PCR
ExoSAP-IT (USB)
SECUENCIACIÓN
MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Química: Kit Big Dye Terminator (ddNTPs fluorescentes)
• Optimización de la reacción de secuenciación
4H2O milliQ
1Cebador-F / R (3,2mM)
10TOTAL
1Producto PCR4Mix (Big Dye)
Volumen / Reacción(ml)Componentes
Programa 96ºC 1min
96ºC 10seg50ºC 5seg60ºC 4min
x 25 ciclos
Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización
ABI PRISM 3100
MATERIAL Y MÉTODOS
• Análisis estadístico (GENEPOP) : cálculo de frecuencias alélicas, haplotípicas y genotípicas
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Serrano et al. (2007) Vet Rec
42
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Electroferogramas de los fragmentos DNA Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit)
CGT CAT (His Arg)
Raza D’man
Codón 114
Codón 146
AAT AGT (Asn Ser)
Raza Boujâad
171 176
114
146
Nuevo
Nuevo
10 polimorfismos conocidos(112, 136, 141, 143, 154, 171, 172, 176, 231, 237)
RESULTADOS
silentes
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS• Polimorfismos relacionados con susceptibilidadFrecuencias de haplotipo y genotipo / codones 136, 154, 171
ARQ ALTA SUSCEPTIBILIDAD
ARR CIERTA RESISTENCIA
ARQ/ARQ
ARR/ARQ
SUSCEPTIBILIDAD
(razas mediterráneas)
(Mutaciones en codón 171)Haplotípicas Genotípicas
Serrano et al. (2007) Vet Rec
0
20
40
60
80
Boujâad D'man Sardi
Frec
uenc
ia (%
) ARQARRARH
0102030405060
Boujâad D'man Sardi
Frec
uenc
ia (%
) ARQ/ARQARR/ARQARR/ARRARH/ARQ
43
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS• Otros polimorfismos Frecuencias alélicas
228943Total
2.32.252.35KAAA97.797.7597.65NAAC176
017.950DGAT10082.05100YTAT172
001.17SAGT10010098.83NAAT1462.37.8517.5RCGT
97.792.1582.5HCAT1434.5019.8FTTT
95.510080.2LCTT14102.80RCGT
10097.2100HCAT1142.31.70TACG
97.798.3100MATG112
SardiD’manBoujâadAminoácidoSecuenciaCodón
NUEVO
NUEVO(Acín y cols., 2004)
Nor98
Serrano et al. (2007) Vet Rec
438922Total2.332.252.27ARQK176
-17.98-ARQD172
1.16--AS146RQ17.447.874.54AR143RQ19.77-4.54AF141RQ
-2.80-R114ARQ-1.682.27T112ARQ
25.5841.5754.55ARQ3.49--ARH
30.2325.8531.83ARRBoujâadD’manSardiHaplotipos
10 haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS
Frecuencias haplotípicas
Serrano et al. (2007) Vet Rec
44
Primer análisis del gen PRNP en poblaciones ovinas
africanas
Gran variabilidad genética
Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a pesar de ausencia de casos de scrapie (= Australia y Nueva Zelanda)
Las mutaciones detectadas aparecen también en otras
razas mediterráneas, posiblemente debido a la influencia de
las migraciones desde el continente africano
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS Y DISCUSIÓN
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:
EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
45
GEN PRNP CAPRINO
INTRODUCCIÓN
• 24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante(Acutis y cols., 2008)
• 6 codones asociados con susceptibilidad a scrapie:
I142MH154RW102G + 3 repeticiones de octapéptidos
Período de incubación(Goldmann y cols., 1996; Billinis y cols., 2002; Vaccari y cols., 2006)
Resistencia (Billinis y cols., 2002; Papasavva-Stylianou y cols., 2007;Vaccari y cols., 2006)
H143RN146S y N146DQ222K
• Mutación más frecuente: S240P (TCC CCC)
POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES CAPRINAS MARROQUÍES
Serrano et al. (en prensa) An Genet
46
CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales
MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en caprino marroquí
80 D’man 57 Chaouni
• Animales
• Identificación de polimorfismos: Secuenciación (= ESTUDIO 1)
• Análisis estadístico: GENEPOPARLEQUIN (estimación de frecuencias haplotípicas)
• Determinación y diferenciación de haplotipos: PCR alelo-específicaSecuenciación
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
145
138 139
101
Análisis de electroferogramas (BioEdit)3 NUEVAS MUTACIONES
AGCAGG (Arg Ser)
D’man
Codón 139
Codón 145
GGC GAC (Gly Asp)
Chaouni y D’man
CGG CAG (Gln Arg)
D’man
Codón 101
10 polimorfismos conocidos
Serrano et al. (en prensa) An Genet
47
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
• Nuevas mutaciones
98.8100RAGG
98.1100QCAG101
0.61.8DGAC99.498.2GGGC145
1.90RCGG
1.30SAGC139
8057Total
D’manChaouniAminoácidoSecuenciaCodón
Frecuencias alélicas
Frecuencias bajas (< 2 %)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS• Polimorfismos conocidos
4041.2STCC240 6058.8PCCC
99.499.1IATA142 0.60.9MATG77.574.6RCGT154 22.525.4HCAT98.898.2QCAG222 1.31.8KAAG
97.595.6MATG137
10098.2GGGC127 01.8SAGC
2.54.4IATA
8057Total
07VGTG10093GGGG37
D’manChaouniAminoácidoSecuenciaCodón
Frecuencias alélicas
CIERTA RESISTENCIA
FRECUENCIAS INTERMEDIAS
Serrano et al (en prensa) An Genet
48
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
• Mutaciones silentes:
Codón 181: GAC GAT (Asp) (1.8% en raza D’man)
Codón 42:
Codón 138:
CCA CCG (Pro)
AGC AGT (Ser)
LIGADOS AL DIMORFISMO S240P (TCC CCC)
(Goldmann y cols., 1996; Kurosaki y cols., 2005; Acutis y cols., 2006; Babar y cols, 2007)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
CC CCAGCodón 42 Codón 240Codón 138
CCA TCCCA/GG AGCAGG/C GG/AC CG/AT
Codón101
Codón 139
Codón145
Codón 154
GGT(PrP) Rev
42 240138101 139 145 154
PCR alelo-específica
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
PP240 PS240 SS240
Secuenciación (cebador específico- S240)
139138
Heterocigotos
Serrano et al (en prensa) An Genet
49
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
• Determinación de haplotipos PCR alelo-específicaS240
P240
1.31.8SKRGIRMGQG1211.910.5PQHGIRMGQG111014.9SQHGIRMGQG100.61.8SQRDIRMGQG90.60.9PQRGMRMGQG81.30PQRGISMGQG72.54.4PQRGIRIGQG601.8PQRGIRMSQG5
1.90PQRGIRMGRG407SQRGIRMGQV3
43.741.1PQRGIRMGQG226.215.8SQRGIRMGQG1
D’manChaouni24022215414514213913712710137Haplo
Frecuencias haplotípicas17 Estimados
(ARLEQUIN)
10 Chaouni13 D’man
12 haplotipos (3 nuevos)
28 genotipos diferentes
(4 no reales)Serrano et al. (en prensa) An Genet
Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas africanas
Gran variabilidad genética
Cierta resistencia a scrapie (H154)
Proximidad genética con razas caprinas mediterráneas deItalia y Grecia
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Serrano et al. (en prensa) An Genet
50
Genética de las EETs en bovino
Secuencia aminoacídica de la PrP bovina ≠ de la ovina en 7 u 8 posiciones.Polimorfismos:
22 mutaciones silentes12 cambios aminoacídicosRepeticiones de octapéptidos
5 copias (5/5).6 copias (6/6). El más común5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto).
Gen PrP bovino
Sin relación con la susceptibilidad a
BSE
Genética de las EETs en bovinoPosible control genético:
Formas clásicas de BSE: cambios en la expresión de PrPC:
23 bp del en la región promotora elimina un sitio de unión de RP58
12 bp del en intrón 1 elimina el sitio SP1 de unión de FT.
Forma atípica: USA 2006:
E211K: análogo al humano E200K responsable de TSE hereditaria
¿Otros genes?
Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez et al. 2002);
BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6, 13 y 19 (Zhang et al., 2004).
51
Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:No HereditariasNo HereditariasLeishmaniosisLeishmaniosis
ENFERMEDADES ENDEMICAS
SALUDImpacto económico y social
Diagnóstico precoz
SALUDImpacto económico y social
Diagnóstico precoz
PROTOZOOS del género LeishmaniaEnfermedad que afecta al hombre y perroZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON(OMS indicadora de SIDA)
Riesgo calidad de vida - SaludMorbilidad y mortalidad
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LEISHMANIOSIS
Presencia de factores ecológicos:VECTORES
RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO
Presencia de factores ecológicos:VECTORES
RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO
TECNICAS CLASICASObservación microscópica en ganglio o médulaMétodos serológicos:IFI
NUEVAS TECNICASReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Diagnóstico problemático
PCR
SENSIBLE
ESPECIFICA
ECONOMICO
EFICAZ
Cebadores - Zona del genoma del parásito de varias copias
Kinetoplastos:Pequeños círculos de DNA con genes repetidos
SSUrRNA
18SrRNA
Zonas bien conocidas en más de 100 especies: Leishmania infantum, Trypañosoma brucei,
Trypanosoma cruzi, ...
53
Comparar-Zona candidataSecuencias hospedador: humano y perroSecuenias del vector: artrópodoSecuencias del Kinetoplasto: parásito
Diagnóstico directo del agente etiológico:Diferenciar portadores, enfermos y sanos
PCR
Ampliación del DNA
94ºC --- 5'94ºC --- 1'60ºC --- 1'72ºC --- 1'72ºC ---10'4ºC --- hasta recoger muestra
Termociclador 9600 Perkin Elmer
35 ciclos
muestra 15μl.
54
ACTIVIDADES REALIZADAS
Análisis de los fragmentos amplificados
Comprobación: Digestión con enzimas de restricción - RFLP Comparar modelos de Leishmania con bibliografía Evitar falsos positivos: - Análisis de un animal sano - Control negativo ( muestra sin DNA) - Control positivo (DNA de enfermo) - Control de DNA (en muestras de amplificación -)
Electroforesis horizontal gel agarosa 2% Tinción:Bromuro de Etidio - UVA
Fragmento de 603 bp
DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA
Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de 100 veces
Muestra: Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre.
+++ -