Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia...

Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria

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Coordinación editorial:

Alberto Alcocer, 13, 1.º D. 28036 MadridTel.: 91 353 33 70. Fax: 91 353 33 73www.imc-sa.es • [email protected]

Ni el propietario del copyright, ni el coordinador editorial, ni los patrocinadores, ni lasentidades que avalan esta obra, pueden ser considerados legalmente responsables dela aparición de información inexacta, errónea o difamatoria, siendo los autores los res-ponsables de la misma.

Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reprodu-cida, transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendolas fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de in-formación, sin permiso escrito del titular del copyright.

ISBN: 978-84-7867-202-8

© Real Academia de Ciencias VeterinariasMaestro Ripoll 8 - Madrid 28006Tel.: 91 561 77 99. Fax: 91 562 82 47racveracve.es • www.racve.es

© Fundación Tomás Pascual y Pilar Gómez-CuétaraINSTITUTO TOMÁS PASCUAL SANZ

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CoordinadorD. Alfonso Perote Alejandre

Director de Proyectos del Instituto Tomás Pascual Sanz para la nutrición y la salud.

Autores

Dra. Cristina Acín Tresaco Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.

Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatíasy Enfermedades Transmisibles Emergentes.

Profesora Asociada de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza.

Dr. José Antonio Aínsa ClaverProfesor Titular de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Zaragoza.

Grupo de Genética de Micobacterias, CIBA, Universidad de Zaragoza.CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).

Dr. Juan José Badiola DíezCatedrático de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza.

Director del Centro de Investigación en Encefalopatíasy Enfermedades Transmisibles Emergentes.

Presidente del Consejo General de Colegios Veterinarios de España.

Dr. Carlos Barreiro MéndezInvestigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.

Responsable del Servicio de Proteómica.

Dra. Rosa Bolea Bailo Licenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.

Profesora Titular de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza.Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías

y Enfermedades Transmisibles Emergentes.

Hicham Filali Licenciado en Biotecnología por la Facultad de Ciencias y Técnicas

de la Universidad Abdelmalek Essaadi de Tánger.Becario del Centro de Investigación en Encefalopatías


Dr. Carlos García Estrada Investigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.

Responsable del Área de Biofarmacia y Biomedicina.

Dra. M.ª Carmen Garza GarcíaLicenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.


Aplicaciones de la Biotecnologíaen la Ciencia Veterinaria

Dr. Jesús Gonzalo AsensioDoctor en Bioquímica y Biología Molecular y Celular.

Investigador Programa Juan de la Cierva. Servicio de MicrobiologíaHospital Universitario Miguel Servet,

IIS Aragón. Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina,Universidad de Zaragoza. CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).

Carlos Alfonso Hedman AltamiranoLicenciado en Veterinaria por la Universidade Estadual Do Ceará (Brasil).

Becario del Centro de Investigación en Encefalopatíasy Enfermedades Transmisibles Emergentes.

Rodrigo Salomón Hernández AcoLicenciado en Veterinaria por la Facultad de Veterinaria

de la Universidad Autónoma de Tlaxcala (México).Becario del Centro de Investigación en Encefalopatías


William Jirón ToruñoProfesor Titular de Anatomía Patológica de la Escuelade Medicina Veterinaria de la UNAN-León (Nicaragua).

Profesor invitado del Centro de Investigación en Encefalopatíasy Enfermedades Transmisibles Emergentes.

M.ª Belén Marín GonzálezLicenciada en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.Contratada del Centro de Investigación en Encefalopatías


Dr. Carlos Martín MontañésCatedrático de Microbiología de Universidad de Zaragoza.

Director Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina,Universidad de Zaragoza.

CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).Servicio de Microbiologia Hospital Universitario Miguel Servet, IIS Aragón

Dra. Eva Monleón MoscardóLicenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.

Profesora Titular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza.Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías


Dra. Marta Monzón GarcésLicenciada y Doctora en Ciencias Biológicas por la Universidad de Navarra.

Contratada Doctora Investigadora de la Universidad de Zaragoza.Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías


Dr. Bernardino Moreno BurgosLicenciado y Doctor en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.

Investigador del Centro de Investigación en Encefalopatíasy Enfermedades Transmisibles Emergentes.

Profesor Asociado de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza.

Dra. Isabel Otal GilProfesora Titular de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud y del Deporte,

Universidad de Zaragoza. Grupo de Genética de Micobacterias, Facultad de Medicina,Universidad de Zaragoza. CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).

José Luis Pitarch MoréLicenciado en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.

Becario del Centro de Investigación en Encefalopatíasy Enfermedades Transmisibles Emergentes.

Dr. Martí Pumarola i BatlleLicenciado en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza y

Doctor en Veterinaria por la Universidad Autónoma de Barcelona.

Dr. Elías F. Rodríguez FerriCatedrático de Sanidad Animal (Microbiología e Inmunología).

Universidad de León. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.

Dr. Antonio Rodríguez GarcíaInvestigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.

Servicio de Genómica, Transcriptómica y Análisis de Ácidos Nucleicos.

Dr. José Luis Rodríguez-Marín RoyTeniente Coronel Veterinario Servicio de Bromatología

y Seguridad Alimentaria del Centro Militar de Veterinaria.Jefatura de Apoyo Veterinario. Inspección General de Sanidad de la Defensa. MINISDEF.

Dra. Sofía Samper BlascoInvestigadora Senior del Instituto de investigación Sanitaria de Aragón.

Laboratorio de Investigación Molecular, Hospital Universitario Miguel Servet. IIS Aragón.Grupo de Genética de Micobacterias, CIBER enfermedades respiratorias (CIBERES).

Dra. Rocío Sarasa OrcasteguiLicenciada y Doctora en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza.


Dra. M.ª Antonia Vargas VargasLicenciada en Medicina por la Universidad de Sevilla y Doctora en Veterinaria

por la Universidad de Zaragoza. Profesora Titular de la Universidad de Zaragoza.Investigadora del Centro de Investigación en Encefalopatías


Dr. Alberto Zamora BenitoComandante Veterinario. Servicio de Bromatología

y Seguridad Alimentaria del Centro Militar de Veterinaria.Jefatura de Apoyo Veterinario. Inspección General de Sanidad de la Defensa. MINISDEF.

Dr. José Luis Vega PlaTeniente Coronel Veterinario. Director del Laboratorio de Investigación Aplicada.

Organismo Autónomo Cría Caballar de las Fuerzas Armadas. Ministerio de Defensa.

Dr. Ricardo Vicente UllánInvestigador. Instituto de Biotecnología de León. INBIOTEC.

Responsable del Área de Energía y Medio Ambiente.

Índice

9 Prólogo

Ricardo Martí Fluxá

11 Prólogo

Dr. Elías F. Rodríguez Ferri

17 Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativaa los métodos clásicos de detección y cuantificaciónde microorganismos: aplicación al diagnóstico preventivoen équidos

Dr. José Luis Vega Pla

35 Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisismicrobiológico de alimentos

Dr. José Luis Rodríguez-Marín Roy y Dr. Alberto Zamora Benito

57 Bases moleculares de la producción de antibióticosbeta-lactámicos

Dr. Carlos García Estrada

105 El glioma canino como modelo animal natural de los gliomashumanos: estudio de las células madre cancerosas parala determinación de nuevas dianas diagnósticas y terapéuticas

Dr. Martí Pumarola i Batlle

117 Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI

Dr. Jesús Gonzalo Asensio, Dra. Sofía Samper Blasco, Dr. José AntonioAínsa, Dra. Isabel Otal Gil y Dr. Carlos Martín Montañés

135 Las enfermedades priónicas, un antes y un despuéspara la seguridad de los alimentos

Dra. Marta Monzón, Dra. Cristina Acín, Dra. Rosa Bolea,Dra. Eva Monleón, Dra. M.ª Antonia Vargas, Dr. Bernardino Moreno,M.ª Belén Marín, Rodrigo Salomón Hernández,José Luis Pitarch, Carlos Alfonso Hedman, William Jirón,Hicham Filali, Dr. Rocío Sarasa, Dr. M.ª Carmen Garzay Dr. Juan José Badiola

179 Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos

Dr. Ricardo Vicente Ullán

209 Avance en el trasplante de órganos mediado por el usode inmunosupresores. Nuevos retos de la biología molecular

Dr. Carlos Barreiro Méndez

237 Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices

Dr. Antonio Rodríguez García

253 Sanidad animal y biotecnología

Dr. Elías F. Rodríguez Ferri

Prólogo

Estimado lector,

En nuestro país, para la consecución de los objetivos y prioridades en investi-gación, desarrollo e innovación tecnológica a medio plazo, se establece un ins-trumento de programación y agenda en el sistema español de Ciencia,Tecnología y Empresa que se denomina Plan Nacional de InvestigaciónCientífica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (Plan Nacional de I+D+i).

En su epígrafe 8 se establecen las acciones estratégicas y los programas relacio-nados, y reconociendo la Biotecnología como su segunda acción estratégica.

El objetivo de ésta es “potenciar la participación española en el desarrollo deuna Bioeconomía basada en el conocimiento que mejore la competitividad denuestras empresas en los sectores de la salud, agroalimentarios, industriales yque protejan y mejoren el medio ambiente”.

Según se explica en el citado documento “La Biotecnología es uno de los fac-tores clave de la revolución de la economía basada en el conocimiento… Lainvestigación en este campo es una actividad muy importante para el éxito decualquier estrategia que se proponga mejorar la salud de los ciudadanos, lamejora de la producción agraria, la alimentación, las tecnologías de produc-ción, la generación de energía, el desarrollo sostenible y la conservación y me-jora del medio ambiente.”

A su vez, el Plan Nacional de I+D+i establece las líneas de actuación en la es-trategia de biotecnología:

“Línea 1. Biotecnología para la salud.

Línea 2. Biotecnología agraria y alimentaria.

Línea 3. Biotecnología industrial.

Línea 4. Bioenergía y desarrollo de biocombustibles.

Línea 5. Biotecnología ambiental.

Línea 6. Biología de sistemas, Biología sintética y Nanobiotecnología.”

Como seguramente usted ya ha deducido, toda esta introducción me ha ser-vido para evidenciar la oportunidad e interés del libro que tiene entre susmanos. Durante todo el año 2011 y 2012 celebramos, junto con la RealAcademia de Ciencias Veterinarias de España, un ciclo de conferencias titu-lado “Aplicación de la Biotecnología en la Ciencia Veterinaria”, en la que setrataron muchas de las líneas y sublíneas recogidas en el Plan Nacional de


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Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (Plan Nacional deI+D+i) comentado anteriormente.

Los autores, todos ellos de reconocido prestigio en investigación en sus dife-rentes campos, trataron en profundidad temas de la máxima actualidad enBiotecnología tales como las nuevas metodologías de la genética molecular yla genómica, su aplicación en la detección de enfermedades en animales deproducción, las aplicaciones de los microarrays y micromatrices, los nuevosretos en ingeniería genética en el trasplante de órganos mediante inmunosu-presores, la Biotecnología y bases moleculares de la producción de antibió-ticos, la utilización de modelos animales para comprender el mecanismo delas células madre cancerígenas, las nuevas técnicas de análisis microbiológicode alimentos, los avances en la comprensión de las enfermedades priónicas ylos retos en la erradicación de enfermedades reemergentes como la tubercu-losis; posteriormente, los mismos autores recogieron estas conferencias y lasampliaron en los documentos que han dado lugar a esta publicación digital.

Nuestro Instituto se caracteriza por ser un firme defensor de la divulgación cien-tífica para el público en general y también para aquellos que, siendo más espe-cializados, reclaman la información de una forma rigurosa, veraz e indepen-diente. Por ello, dedicamos una parte importante de nuestros esfuerzos a laorganización de ciclos de conferencias, cursos y seminarios relacionados con losavances en la ciencia en la mayoría de los campos de la salud, con especial én-fasis en las nuevas tecnologías; fruto de este ambicioso objetivo es este libro.

Es obligación para mí dedicar unas palabras de agradecimiento a todos los au-tores por el esfuerzo que supuso la preparación de todo este material y de susconferencias, sin ellos no habría sido posible esta obra. También quiero agra-decer la aportación del Dr. Elías Rodríguez Ferri, Presidente de la Academia deCiencias Veterinarias de Castilla y León y Académico de Número de la RealAcademia de Ciencias Veterinarias de España, cuyo empeño, ayuda y desinte-resado trabajo ha empujado de forma importante esta obra. El prólogo de estaobra es suyo, así como un extenso capítulo en el que re recorre detalladamentela importancia de la Biotecnología en nuestra sociedad a través de la CienciaVeterinaria, que es su vocación profesional.

Y por último, un sentido y póstumo reconocimiento a una magnífica persona,gran profesor y amigo, el profesor Carlos Luis de Cuenca y Esteban, Presidentede la Real Academia de Ciencias Veterinarias de España, principal impulsor deesta iniciativa junto con nuestro Instituto, que falleció durante la celebracióndel citado ciclo y al que deseamos dedicar esta obra. Descanse en paz.

Gracias.

Ricardo Martí FluxáPresidente Instituto Tomás Pascual Sanz

Prólogo

Representa para mí un gran honor y una oportunidad única, que agradezco,tanto al Instituto Tomás Pascual Sanz, Fundación Tomás Pascual y Pilar Gómez-Cuétara, como a la Real Academia de Ciencias Veterinarias de España, de pre-sentar esta recopilación de textos recogidos con motivo de las Jornadas quesobre la “Aplicación de la Biotecnología a las Ciencias Veterinarias”, patroci-nadas por ambas instituciones, se celebraron a lo largo de 2011 en distintascapitales de España (Córdoba, Valencia, Santander, Zaragoza, Lugo y León),en las que intervinieron destacados especialistas de la universidad, centros tec-nológicos y de investigación, y empresas.

Primero de todo es justo reconocer que fue el entusiasmo y buen hacer denuestro querido amigo y respetado Presidente de la RACVE, D. Carlos Luis deCuenca y Esteban a cuya memoria dedicamos este libro, el iniciador y gestorprincipal de la idea, con la colaboración de D. Alfonso Perote, por parte de laFundación Tomás Pascual, en el marco del convenio de colaboración que man-tenían ambas instituciones. El Dr. Cuenca, tuvo la gentileza de encargarme la or-ganización de varias de las Jornadas que configuraron el periplo de la ‘Aplicaciónde la Biotecnología a las Ciencias Veterinarias’ y a ello me dediqué con entrega,coincidiendo con él, desde el primer momento, sobre la importancia e interésdel tema, que ya había sido con anterioridad objeto de manifestaciones por miparte, y que coincidía, a propuesta del Rector de la Universidad de León, con elencargo de dirigir los destinos del Instituto de Biotecnología de León, INBIOTEC.En cualquier caso, por mi especialidad (Microbiología e Inmunología, parte dela Sanidad Animal), nada podía resultar más atractivo.

Las Ciencias Veterinarias, la Veterinaria, es una profesión milenaria cuya apari-ción coincide con el comienzo de la domesticación animal. Su progreso, en laantigüedad, estuvo ligado principalmente a los équidos, cuyo papel fundamentalen los ejércitos, el transporte y las labores agrícolas exigía disponer de animalesen buenas condiciones de uso, lo que impuso la necesidad de desarrollar mé-todos y técnicas dirigidas a su cuidado y a combatir o mitigar sus dolencias. Enla etapa más reciente, los antiguos albéitares cedieron el testigo a los modernosveterinarios, surgidos de las primeras Escuelas de Veterinaria, con el encargoprincipal de organizar y coordinar la lucha contra las grandes enfermedades delos animales, como la peste bovina. Los veterinarios fueron de los primeros pro-fesionales que abrazaron con convicción en las postrimerías del siglo XIX lasnuevas doctrinas de Pasteur y Koch, que abrieron el camino a la teoría micro-biana de las enfermedades infecciosas y a la aplicación de recursos de interés


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diagnóstico y preventivo-curativo (desarrollo de vacunas y sueros) para su luchay control. No en vano fueron animales los modelos en los que se apoyaron losprimeros descubrimientos, como en los casos del carbunco bacteridiano, el có-lera aviar, el mal rojo porcino, la rabia y otros muchos. Durante el siglo XX se pro-dujeron grandes y revolucionarios descubrimientos científicos, y las profesionesse abrieron a campos nuevos. La Medicina Veterinaria tradicional, por ejemplo,amplió sus horizontes a la Producción Animal, incluyendo la nutrición, la mejora,la identificación, la etología, etc., y a la Higiene, Inspección y Tecnología de losAlimentos, buscando cualidades que mejorasen sus propiedades, abaratasen sucosto de producción, estableciesen nuevos procedimientos de conservación yasegurasen su inocuidad; en la Medicina Veterinaria tradicional, también el am-plio campo de las enfermedades producidas por agentes patógenos de todaslas naturalezas (bacterias, hongos, protozoos, virus, helmintos o priones), queen los últimos años, y como consecuencia de alarmas de gran trascendencia,han configurado muchas novedades de interés.

Los años 40 y 50 fueron especialmente fértiles en descubrimientos científicos.Avery, MacLeod y McCarty demostraron en 1944 que el ADN era el material ge-nético, y Watson y Crick, en 1953, establecieron su estructura en doble hélice.A ello se sumó en 1960 el descubrimiento de la polimerasa, la enzima que de-fine el sitio de inicio de la síntesis del ácido desoxirribonucleico. A partir de aquí,los acontecimientos se han sucedido de forma vertiginosa, hasta llegar a la se-cuenciación del genoma de la primera bacteria en 1997 y del genoma humanoen 2001. El descubrimiento de la renaturalización o hibridación del ADN en 1961después de su desnaturalización por calentamiento marcó el comienzo de todaslas técnicas de hibridación. La utilización de enzimas capaces de cortar el ADNen secuencias específicas (palindrómicas) permitió obtener y estudiar fragmentos,lo que, unido al descubrimiento de otras enzimas (ADN ligasa) capaces de unirfragmentos separados, condujo a estudios de recombinación in vitro y dio origena la tecnología del ADN recombinante, es decir, a la Ingeniería Genética o, loque es lo mismo, a la Biotecnología Moderna. Decimos Biotecnología Modernaporque el término ya había sido utilizado en 1919 para describir procesos de ob-tención de productos a partir de distinto tipo de materias primas, con el con-curso de organismos vivos. Su desarrollo se produjo cuando se incorporaron téc-nicas que permitieron la selección y extracción de fragmentos del ADN de unmicroorganismo introduciéndolos después en otro, haciendo que este expresaray produjera moléculas ajenas. La Ingeniería Genética hizo de la Biotecnologíauna ciencia principal, permitiendo una nueva revolución biológica. En esencia,la Biotecnología supone la aplicación de métodos y técnicas derivadas de la in-vestigación en biología molecular y celular, microbiología, parasitología, inmu-nología, bioquímica, epidemiología, bioinformática y otras disciplinas afines, uti-lizadas donde quiera que se utilicen microorganismos (bacterias, virus, hongos,protozoos, etc.) o células (vegetales o animales).

Prólogo

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El desarrollo más espectacular de la Biotecnología se produjo en el campo dela fabricación de medicamentos y vacunas, y en la obtención de cultivos y ani-males modificados genéticamente con el propósito de producir alimentos, peroen la actualidad su campo de trabajo se ha diversificado mucho más. Desdela síntesis biotecnológica de insulina por recombinación genética en Escherichiacoli, en 1978, ha tenido lugar una carrera de vértigo para obtener nuevos pro-ductos que hoy incluyen hormonas, proteínas de interés, antibióticos, antitu-morales, antiparasitarios, anticuerpos monoclonales y un sinfín de moléculasmás. Se ha generado, así, una pujante industria que representa ya un sectorestratégico para muchos países y que, por su bajo coste, supone también unaoportunidad para los países en desarrollo.

Las Ciencias Veterinarias se ocupan de cuanto tiene que ver directa o indirec-tamente con los animales y sus relaciones útiles para el hombre. De este modo,la columna vertebral de las Ciencias Veterinarias es médica (MedicinaVeterinaria), incluyendo las patologías producidas por agentes infecciosos (yagentes de zoonosis) y no infecciosos, igual que las de naturaleza espontánea,como consecuencia del envejecimiento, traumatismos, exposición a agentesfísicos o químicos o el medio ambiente, pero los otros capítulos se ocupan delos animales sanos, vistos desde la óptica de su utilidad como productores dealimentos o útiles por una larga lista de motivos diferentes (animales de com-pañía, de ocio, de trabajo, de experimentación, salvajes, etc.), consagradospor el deseable bienestar y la mayor rentabilidad de sus producciones, su me-jora genética dirigida a las opciones que en cada caso correspondan, inclu-yendo también la industria derivada del ocio para el hombre, y finalmente, elcapítulo que se refiere a los alimentos para el hombre y los animales, desde latecnología de su producción y conservación a su higiene y seguridad, para elconsumo humano o animal, respectivamente.

Cualquiera que sea la óptica con la que se decida analizar las CienciasVeterinarias, se puede afirmar, sin temor a equivocarse, que está detrás laBiotecnología o que esta puede colaborar a su desarrollo con ventaja, y elloindependientemente del campo objeto de análisis. En el plano médico, laBiotecnología proporciona recursos que facilitan el conocimiento de las causasde enfermedad y sus consecuencias, las interacciones entre los agentes de en-fermedad y la respuesta orgánica (innata y adquirida), permite conocer en pro-fundidad los caracteres de los agentes patógenos que intervienen en la gé-nesis de las enfermedades, la base genética de los factores de virulencia y lascomplicadas reacciones que configuran la respuesta inmune. La Biotecnologíapermite el desarrollo de herramientas e instrumentos útiles para el diagnós-tico, el tratamiento y la prevención (fármacos antimicrobianos, antiparasita-rios o antitumorales, pongamos por caso, vacunas más precisas, más segurasy más eficientes), incluyendo el desarrollo, hoy todavía a nivel experimental,de estrategias que representarán alternativas en los próximos años para el con-


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trol de todo tipo de enfermedades. No se puede entender la vigilancia epide-miológica, la Epidemiología en el más vasto de los sentidos, aplicada a cual-quier actividad, sin recurrir a la Biotecnología. La OIE se ha referido, en rela-ción con la Biotecnología, al desarrollo de estudios cuantitativos de genéticade poblaciones para la investigación de marcadores de caracteres de interéssanitario, a los estudios de genómica funcional para las interacciones pató-geno-hospedador, al desarrollo de herramientas para el diagnóstico y controlde las enfermedades de los animales y al apoyo integral en las CienciasVeterinarias.

En Producción Animal tampoco puede entenderse la mejora de las especies do-mésticas y útiles sin la integración de la Biotecnología, mejorando los caracteresque más convienen, generando incluso procedimientos de selección basados encaracterísticas de resistencia natural a las enfermedades o permitiendo conocerlos mejores métodos de manejo que faciliten la expresión del caudal genéticopara lograr éxitos en cualquier campo. La Biotecnología, aquí, modifica genéti-camente cultivos vegetales productores de alimentos, especialmente con des-tino a los animales, pero también al hombre, como sucede en el caso del maízresistente a diferentes plagas, cuya primera variedad comercial se obtuvo ya en1996, o el de otras materias primas, cuya lista aumenta continuamente. Todavíamás, la Biotecnología es una pieza inexcusable en la recuperación de especiesen peligro de extinción, en este caso animales, pero también vegetales, mediantela creación de bancos de germoplasma, una garantía para la creciente pérdidade biodiversidad que la civilización trae consigo.

De todos son conocidos los éxitos logrados por la Biotecnología en materia dereproducción, iniciados en 1997 con la clonación de la famosa oveja Dolly (apartir de una célula única, procedente de una oveja adulta), aunque muchosde los resultados en esta y otras especies no han dejado satisfechos a todos,pero ahí están, sin embargo, los resultados de la transgénesis relativos a la hor-mona del crecimiento que han permitido obtener animales con mayor creci-miento, mayor producción cárnica, como es el caso de cerdos que no solocrecen más y más rápido, sino que incorporan a sus tejidos menos grasa. Enel caso de los peces, se han obtenido truchas y salmones en los que se ha re-ducido el periodo de crecimiento necesario para la comercialización, con ma-yores tamaños y pesos. De igual modo, la Biotecnología es clave para el desa-rrollo de modelos animales con modificaciones genéticas dirigidas, quepermiten su uso en experimentos destinados a la Medicina (Humana y Animal),y en cualquier caso, la Ciencia de los Animales de Experimentación ha contri-buido a lo largo de los años, y lo sigue haciendo, al desarrollo de la Biología yla Medicina.

Y otro tanto sucede en el campo de los alimentos para consumo humano oanimal, en el que la Biotecnología contribuye al desarrollo de herramientas

Prólogo

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que permiten la vigilancia de su seguridad e inocuidad y, en último término,también su control. La industria alimentaria fía de la Biotecnología, antes deforma empírica y ahora con base científica conocida, más segura y eficaz,que aporta a los alimentos el valor añadido de su procesado, transforma-ción y conservación, poniendo al alcance del consumidor gamas de productosde mayor calidad, más seguros, diversos y apetecibles, y todo ello mediantela intervención de agentes microbianos seleccionados de forma natural otransformados por intervención humana para orientar tal o cual actividaddeseable. Apurando la esencia de la industria alimentaria, podría afirmarseque ha sido (y sigue siendo) desde su origen, consecuencia de laBiotecnología, aunque cuando ni tan siquiera se sospechara la intervenciónmicrobiana, como sucede en el caso del pan, las bebidas alcohólicas, los de-rivados lácteos, etc. ¿Cómo podría hoy entenderse, en fin, la industria ali-mentaria sin el concurso de iniciadores, de sensores biológicos, probióticos,prebióticos e innumerables productos más, cuyo origen o aplicación es bio-tecnológico? Y esto solamente considerando los aspectos que se refieren amodificaciones buscadas, a los que si se suma la infinidad de recursos origi-nados igualmente a partir de la Biotecnología para garantizar su inocuidado vigilar puntos o etapas de riesgo, configura un todo que de ningún modopuede prescindir de ella.

En el campo de la Salud Pública y la Sanidad Animal, a las que ya nos hemosreferido, todo es de aplicación o aplicable, particularmente respecto del es-tudio de la patogénesis, diagnóstico, prevención y tratamiento. Dicho queda.

En la actualidad, las perspectivas no pueden ser más alentadoras. El sector delas bioempresas, en España (sociedad ASEBIO), por ejemplo, supera ya las milempresas, y en casi la mitad la biotecnología es actividad principal o exclusiva,con una cifra de negocio que supera los 50.000 millones de euros, contribu-yendo de forma transversal en sectores muy diversos, identificados por lo quehoy conocemos como Biotecnología Roja, Blanca, Gris, Verde o Azul; distintasorientaciones para un núcleo común de inmejorables expectativas.

En España, la Biotecnología es considerada por el Plan Nacional deInvestigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica, una prioridad es-tratégica, “uno de los factores clave de la revolución de la economía basadaen el conocimiento… cuyo avance potencia nuevas disciplinas científicas,aporta respuestas y genera aplicaciones socioeconómicas múltiples... la inves-tigación en este campo es una actividad muy importante para el éxito de cual-quier estrategia que se proponga mejorar la salud de los ciudadanos, la me-jora de la producción agraria, la alimentación, las tecnologías de laproducción… podemos afirmar que la Biotecnología no es una ciencia per se,sino que aglutina varias disciplinas, como agricultura, biología, bioquímica, ge-nética, ingeniería, medicina, microbiología, veterinaria, etc.”.


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Poco más se puede añadir para justificar el acierto de las Jornadas sobre la“Aplicación de la Biotecnología a las Ciencias Veterinarias”. La respuesta ob-tenida en las intervenciones realizadas por los especialistas que participaronen las mismas, de forma especial en aquellos lugares en los que coincidíancentros relacionados con la formación veterinaria, pone de manifiesto la in-quietud de las nuevas generaciones por estos campos tan atractivos.

Vaya desde aquí nuestra felicitación a los organizadores, el agradecimiento alos participantes y el deseo de que acontecimientos como estos puedan se-guir marcando la pauta en el futuro de las Ciencias Veterinarias.

Dr. Elías F. Rodríguez FerriPresidente de la Academia de CienciasVeterinarias de Castilla y León

IntroducciónLas pruebas de diagnóstico basadas en lastecnologías de amplificación de ácidosnucleicos están adquiriendo cada vez másimportancia e interés en los laboratoriosde Microbiología clínica desde hace al-gunos años. La aplicación de este tipo detecnología, combinada con métodos efi-cientes de extracción y de preparación delas muestras, puede proporcionar ventajasmuy importantes sobre los métodos tra-dicionales en términos de sensibilidad,simplicidad y rapidez. La aceptación deeste tipo de pruebas ha estado tambiéncondicionada al desarrollo de kits comer-ciales que faciliten las labores de diagnós-tico (David et al., 2010).

Sin embargo, la implantación masiva deesta tecnología no es tan rápida como alos microbiólogos les gustaría. Se estánpublicando numerosos trabajos científicosproponiendo protocolos cada vez más pre-cisos y sofisticados, pero validar una téc-nica para que se pueda confiar plena-mente en su sensibilidad y especificidad esuna tarea muy complicada. Uno de loscasos más relevantes que ha dado un im-pulso a la investigación y desarrollo denuevas pruebas fue la propuesta oficial de

un protocolo de detección de mico-plasmas en la producción de vacunas deorigen vírico en EE.UU., aunque dicha pro-puesta parecía estar condicionada al fra-caso de los métodos tradicionales: “insome cases, culture-based procedurescannot be used due to an inability to com-pletely neutralize vaccine viruses, thus ne-cessitating the use of PCR-based assays totest for mycoplasma in these products”(Center for Biologics Evaluation andResearch, 2010). En 2007, la FarmacopeaEuropea aceptó este tipo de pruebascomo una alternativa a los métodos tradi-cionales de detección de Micoplasma spp.después de una validación del método.

Durante los últimos 25 años se han desa-rrollado muchas metodologías para el aná-lisis de los ácidos nucleicos con fines diag-nósticos, siendo la reacción en cadena dela polimerasa o PCR (Polimerase ChainReaction) la más empleada. El proceso in-cluye tres pasos fundamentales: la extrac-ción, la amplificación y la detección. Elpaso de la extracción del ADN, que servirácomo diana y molde para el desarrollo dela PCR, es crítico, habiéndose diseñadomultitud de protocolos, kits comerciales ydiversos aparatos que facilitan la produc-tividad de los laboratorios. El paso de am-

Amplificación de ADN a tiempo real,una alternativa a los métodosclásicos de detección y cuantificaciónde microorganismos: aplicaciónal diagnóstico preventivo en équidosDr. José Luis Vega Pla


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plificación persigue generar multitud decopias fieles a la original, para lo que seusan diversos reactivos y tampones cuyaselección y proporciones influyen directa-mente en esta fidelidad y rendimiento dela reacción. Finalmente, hay un paso dedetección del producto amplificado quecon ayuda de patrones y controles debeser capaz de tipificarlo e identificarloinequívocamente, se emplean sistemasde electroforesis, inmunológicos o se de-tecta el producto directamente medianteel empleo de sustancias fluorescente(http:// www.bioqtforum.com/295).

La PCR fue desarrollada por Kary Mullis enlos años 80 y muy rápidamente llegó a seruna de las técnicas más ampliamenteusadas por varias razones de peso: era rá-pida, económica y simple, aportando el po-tencial de amplificar copias de ADN proce-dentes de pequeñas cantidades de materialbiológico de muy diverso origen e inclusode baja calidad. El nombre de la técnicaproviene de la enzima polimerasa de ADNempleada durante la reacción para pro-ducir miles o millones de copias de ADN invitro. Cada una de las copias tiene la pro-piedad de servir de molde para el siguienteciclo de amplificación, de aquí su nombrede reacción en cadena. Así, la secuenciadiana original se copia en el primer ciclo,se multiplica por dos en el siguiente ciclo yasí sucesivamente para generar millones decopias después de 30 o 40 ciclos (figura 1).Los requerimientos de la PCR son básica-mente cuatro: ADN molde procedente dela muestra; una enzima polimerasa deADN, siendo la más común la procedentede una bacteria denominada Thermusaquaticus, que tiene la propiedad de so-portar las fuertes variaciones de tempera-tura de la reacción sin deteriorarse excesi-

vamente; cebadores, que son una parejade oligonucleótidos que delimitan la se-cuencia a amplificar, y los dideoxinucleó-tidos, que son los que después de pasar delestado trifosfato al monofosfato daránlugar a la secuencia complementaria delADN diana. Se requiere también un instru-mento capaz de calentar y enfriar la reac-ción en cada ciclo de una manera precisay un medio adecuado para que la reacciónse lleve a cabo.

La PCR convencional requiere que, para de-tectar el producto amplificado, el tubo dela reacción sea abierto para someterlo a di-ferentes tipos de pruebas, fundamental-mente electroforesis; esta circunstancia leconfiere una gran desventaja, pues los pe-queños fragmentos de ADN producidosson susceptibles de formar aerosoles me-diante las técnicas de pipeteo y manipula-ción y contaminar el ambiente, reactivos eincluso muestras. Higuchi y col. (1993) pu-blicaron las características de la primera PCRcuantitativa a tiempo real (qPCR), que per-mite el análisis de los productos amplifi-cados a medida que transcurre la reacción,lo cual representó un salto tecnológico im-portante; esto se consigue incorporandouna serie de fluorocromos que se activancon el producto amplificado y son suscep-

Figura 1. Esquema del proceso de amplificaciónmediante PCR (http://www.nanodic.com).

Amplificación de ADN a tiempo real, una alternativa a los métodos…

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tibles de ser detectados por el propio ins-trumento donde se desarrolla la reacción;también se pueden incorporar oligonu-cleótidos marcados que se hibridan con lasecuencia amplificada, añadiendo un gradomás de especificidad a la reacción. Además,mediante el uso de muestras de referencia,la qPCR permite inferir la cantidad de par-tida de dicho ADN (figura 2).

Las polimerasas termoestables de ADN re-quieren ADN como materia, sin embargo,en ocasiones es necesario detectar la pre-sencia de algún virus cuyo genoma estéconstituido por ARN, y también es muy in-teresante poder acceder a secuencias deARN ribosomal altamente conservadasentre especies de microorganismos. Enestos casos se recurre a un primer paso, de-nominado retrotranscripción o transcrip-ción inversa, durante el cual el ARN de lamuestra es transcrito a ADN. A la retro-transcripción seguida de una PCR se le de-

nomina RT-PCR. En algún momento tam-bién se le ha denominado a la PCR entiempo real RT-PCR (Real Time PCR), poresa razón es necesario denominar las dosreacciones de forma diferente, qPCR parala PCR en tiempo real y RT-PCR para retro-transcripción de ARN seguido de una PCR.De esta manera, cuando se emplea unaqPCR posteriormente a una retrotranscrip-ción de ARN en ADN se puede referircomo RT-qPCR para evitar equivocaciones.

La técnica de la PCR en tiemporeal o PCR cuantitativa (qPCR)

La qPCR pone de manifiesto la cantidadde ADN presente en cada ciclo de ampli-ficación mediante el uso se flouróforos.Durante la amplificación, la rapidez conque la señal fluorescente alcanza el nivelumbral (Threshold level) se correlacionacon la cantidad inicial de ADN molde, per-

Figura 2.

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35

40

40

45

45

30

30

25

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15

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10

5

050

Flu

ore

scen

cia

Ciclo

Fase Meseta

Fase Exponencial óptima

Fase Exponencial

inicialFase Lineal


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mitiendo de esta manera poder cuantifi-carlo. El número de ciclos necesarios paraque la señal fluorescente alcance el nivelumbral se conoce como Threshold cycle(Ct) o ciclo de cuantificación (Cq), y es elparámetro en el cual se fundamenta lacuantificación. A mayor Cq, menor serála cantidad de ADN molde o diana inicial.En los últimos años el número de casascomerciales que ofrecen instrumentos yreactivos para qPCR, sumado a la inmensacantidad de trabajos científicos publi-cados, ponen en evidencia la importanciade esta tecnología.

Una de las ventajas fundamentales de laqPCR en relación a la PCR tradicional depunto final es que en la primera las me-diciones se realizan en la etapa exponen-cial de la reacción donde, en teoría, porcada ciclo de amplificación se acumula eldoble de producto respecto al ciclo ante-rior, asumiendo una eficiencia del 100%.Por el contrario, en la PCR de punto finalla detección del producto de amplifica-ción se realiza en la fase de meseta de lareacción, donde la misma ya se detuvo;por lo tanto, las medidas realizadas enesta fase no ofrecen resultados fiables encuanto a la cantidad inicial de ADN moldede la muestra. Otras ventajas de la qPCRson la rapidez en la obtención de resul-tados, el amplio rango dinámico de cuan-tificación, la seguridad al evitar la mani-pulación del producto amplificado.

Dentro de los flouróforos, el más utilizadoes el SYBR Green I®, que tiene la pro-piedad de unirse al ADN doble hebra demanera inespecífica, emitiendo hasta1.000 veces más fluorescencia cuando seencuentra unido al ADN que cuando estálibre en solución (absorbe luz de 480 nmde longitud de onda y emite a 520 nm).

Por lo tanto, el incremento de la señal defluorescencia es proporcional a la cantidadde ADN doble hebra presente en el tubode reacción y la misma se mide al final dela fase de extensión de la PCR (figura 3).

Su principal desventaja es la inespecifi-cidad, ya que se une independientementede la secuencia del ADN, pudiendo ge-nerar resultados falsos positivos al de-tectar ADN espurios, como son, porejemplo, los dímeros de cebadores de lareacción. Una forma de asegurar en estoscasos la especificidad de la detección esanalizando las curvas de disociación.

Por otra parte, están los sistemas de identi-ficación basados en oligonucleótidos fluo-rescentes. Básicamente se encuentran mar-cados con dos flourocromos (reporter yquencher) que interfieren entre sí mientrasestán próximos, de forma que mediante hi-drólisis o hibridación se separan o se juntanambos y uno de ellos emite luz a una deter-minada longitud de onda detectable con elinstrumento adecuado (figura 4). Hay variossistemas basados en sondas fluorescentes,los más conocidos son: TaqMan® probes,Molecular Beacons®, Hybridization probes,Locked Nucleic Acid (LNA) probes, LightUpprobes, etc. En cada caso, múltiples colo-rantes fluorescentes (p. ej.: Fluorescein,6-FAM, JOE, VIC, Cal Fluor, etc.) pueden serutilizados con una variedad de inhibidores(p. ej.: TAMRA, DABCYL, BHQ, etc.).

Es importante, cuando se diseña el sis-tema de amplificación a utilizar, tener encuenta las ventajas y desventajas que pre-sentan las diferentes opciones descritas.Utilizando sistemas basados en sondasfluorescentes, se suma la posibilidad dellevar a cabo reacciones multiplex, quetanta relevancia tienen a nivel diagnóstico


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por su rapidez y economía. Sin embargo,es una técnica más cara y menos sensible,aunque en la mayoría de los casos es lade elección por su alta especificidad.

Hay una amplia variedad de equipos ade-cuados para qPCR, que consisten en untermociclador para realizar la reacción yuna parte óptica. La química elegida y elequipo están íntimamente relacionados.Hay tres formas básicas en que los instru-mentos pueden aportar la energía de ex-citación para los fluoróforos: mediantelámparas, diodos o láser, combinados condistintos tipos de fotodetectores paramedir la fluorescencia emitida (figura 5).Además es imprescindible el empleo de unordenador que posea un software apro-piado para la recolección y análisis de losdatos generados. Las curvas de amplifica-ción generadas por dicho software deter-

minan el número de ciclo en el cual la fluo-rescencia alcanza el valor umbral (Cq). Estevalor de Cq es inversamente proporcionala la cantidad inicial de la secuencia espe-cífica del ADN a cuantificar, en la muestraoriginal. A partir del mismo, el software re-aliza los cálculos de cuantificación.

Un tipo de cuantificación es la absoluta,que se utiliza para cuantificar muestrasdesconocidas por interpolación a partir de

Figura 3. Sistema de detección mediante el usode fluorocromos intercalantes (http://classic.the-scientist.com).

Figura 4. Sistema de detección mediante hidrólisis desondas específicas (http://classic.the-scientist.com).

Figura 5. Sistema de excitación y detección en untermociclador (www.quigen.com).


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una curva estándar, generada a partir dediluciones en serie de una muestra deconcentración conocida del ADN blanco.

La cuantificación relativa es utilizada paraanalizar cambios en la expresión de ungen en una muestra dada en relación aotra muestra de referencia, por ejemplo,en respuesta a un tratamiento. Esasmuestras de referencia contienen genesinvariables (genes de referencia o house-keeping), los cuales normalmente no su-fren cambios bajo las condiciones experi-mentales, sirviendo por lo tanto comoestándares internos.

Las aplicaciones más importantes de estatecnología, además de incluir las de laPCR convencional, son, entre otras, los es-tudios de la expresión génica (RT-qPCR),detección y cuantificación de microorga-nismos, identificación de mutaciones opolimorfismos de base simple (SNP), etc.Áreas como la Microbiología, Genética yFarmacogenética, Oncología y Trasplantese han visto beneficiadas por la imple-mentación de la qPCR. Otros campos deaplicación de esta tecnología de gran po-tencial son: Agricultura, Veterinaria,Alimentos y Medicina Forense.

En definitiva, cualquier necesidad de me-dición rápida y precisa de pequeñas can-tidades de ácidos nucleicos representa unfuturo potencial para innovaciones ba-sadas en qPCR.

Guía MIQE para publicacionescientíficas con ensayos qPCRLa popularidad que ha ido adquiriendo laqPCR se ha traducido en la aparición denumerosas publicaciones científicas dondese describen diversos protocolos, reactivos,

metodologías de análisis estadístico ydonde se presentan los resultados con di-ferentes formatos. Esta importante falta deconsenso sobre cómo desarrollar de lamejor manera un experimento basado enqPCR ha tenido como consecuencia la pu-blicación de trabajos con graves deficien-cias de diseño y escasa información técnicaque hacen poco reproducibles los experi-mentos y poco creíbles los resultados ennumerosas ocasiones (Bustin et al., 2009).Algunas de estas deficiencias tienen quever con las muestras y su preparación; enocasiones no se tiene en cuenta el tipo dealmacenamiento (crítico para estudios deARN mensajero), o el protocolo de extrac-ción no es el adecuado, proporcionandoun rendimiento muy bajo de la cantidad deácidos nucleicos obtenidos. Otro tipo dedeficiencia es una selección de los ceba-dores y sondas inadecuada que hace quela técnica sea poco robusta. Finalmente, seemplean a menudo tratamientos estadís-ticos inadecuados que arrojan resultadospoco creíbles. El problema se exacerba porla escasa información proporcionada enmuchas publicaciones, que impiden allector evaluar de forma crítica la calidad delos resultados presentados o la repeticiónde los experimentos.

En este sentido Bustin y col. (2009) elabo-raron una guía para autores, revisores yeditores, con especificaciones acerca de lamínima información que debería ser pro-porcionada en una publicación con expe-rimentos basados en qPCR para asegurarsu relevancia, precisión, correcta interpre-tación y repetibilidad; a esta guía se la de-nomina MIQE por las siglas en inglés deMinimum Information for Publication ofQuantitative Real-Time PCR Experiments.Sin embargo la supuesta “mínima” infor-


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mación es tan exhaustiva que la aplicaciónde la guía MIQE se hace tan compleja queBustin y col. (2010) publicaron una serie de

recomendaciones para aplicarla, inclu-yendo una lista de chequeo útil para edi-tores, revisores y autores (tabla 1).

Tabla 1. Relación de aspectos que deben revisarse para publicar una técnica qPCR denuevo diseño según las recomendaciones de Bustin y col. (2009).

Sample/Template DetailsSource If cancer, was biopsy screened

for adjacent normal tissue?Method of preservation Liquid N2/RNAlater/formalinStorage time (if appropriate) If using samples > 6 months oldHandling fresh/frozen/formalinExtraction method TriZol/columnsRNA: DNA-free Intron-spanning primers/no RT control

Concentration Nanodrop/ribogreen/microfluidicsRNA: integrity Microfluidics/3':5' assayInhibition-free Method of testing

Assay optimisation/validationAccession number RefSeq XX_1234567Amplicon details exon location, amplicon sizePrimer sequence even if previously publishedProbe sequence* identify LNA or other substitutionsIn silico BLAST/Primer-BLAST/m-foldempirical primer concentration/annealing temperaturePriming conditions oligo-dT/random/combination/target-specificPCR efficiency dilution curveLinear dynamic range spanning unknown targetsLimits of detection LOD detection/accurte quantificationIntra-assay variation copy numbers not Cq

RT/PCRProtocols detailed description, concentrations, volumesReagents supplier, Lot numberDuplicate RT ΔCqNTC Cq & melt curvesNAC ΔCq beginning:end of qPCRPositive control inter-run calibrators

Data analysisPSpecialist software e.g., QBAsePlusStatistical justification e.g., biological replicatesTransparent, validated normalisation e.g., GeNorm summary


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Diseño e implantación de laqPCR en los laboratorios deMicrobiologíaLas técnicas de análisis de ácidos nucleicosy en concreto la qPCR se han extendido yse ha incrementado su uso en muchos la-boratorios; sin embargo, su implantaciónen laboratorios de Microbiología estásiendo relativamente lenta. Los principalesobstáculos se han descrito recientemente(Denoya, 2009):

• Universalidad: frecuentemente se nece-sita disponer de la capacidad para de-tectar todos los posibles microorganismosque se encuentran contaminando unamuestra. Se plantean una serie de cues-tiones acerca de si los cebadores emplea-dos son lo suficientemente universales osi se puede aplicar la qPCR en forma múl-tiple.

• Límite de detección: aún no está clarosi la qPCR puede proporcionar mayori-tariamente una probabilidad superior dedetectar unidades formadoras de co-lonia a la alcanzada con los métodos decultivo tradicionales.

• Microorganismos viables no cultivables ymuertos: se plantea la duda sobre si haysuficientes protocolos de qPCR para dis-criminar metabólicamente entre célulasdurmientes, viables y muertas, lo quepuede influir en un diagnóstico preciso.

• ADN de fondo: el ADN extraído junto alARN puede dar lugar a falsos positivosen lo que se refiere a las técnicas de RT-PCR.

• Contaminaciones cruzadas: la PCR esmuy sensible a contaminaciones cru-zadas y sobre todo a contaminacionesde producto amplificada que pueden

dar falsos positivos y, en algunos casosfalsos negativos, por la inhibición de laamplificación de la muestra en favor deotras secuencias.

¿Cuáles son entonces los criterios elemen-tales que se deben aplicar para confiar enun ensayo determinado? La selecciónadecuada de muestras, la instrumenta-ción calibrada y la metodología pertinentepara lograr el fin perseguido son ele-mentos de importancia crítica en la vali-dación de pruebas. La continuidad de losexperimentos queda asegurada cuandose escogen las muestras y los reactivos, sepreparan de forma adecuada, divididas enalícuotas y almacenadas para su uso encada experimento. Eso reduce al mínimoel número de variables, ayuda a prevenirfallos una vez iniciado el proceso de vali-dación. Este enfoque reduce la variabi-lidad y proporciona los datos necesariospara establecer controles adecuados a finde asegurarse de que cada aplicación dela prueba es válida.

La puesta a punto de un protocolo deqPCR incorpora un escenario no contem-plado en los criterios de validación clá-sicos. Se trata de usar las herramientas yalgoritmos de comparación de secuenciasque permiten conocer si un fragmento deADN concreto se encuentra representadoen otras partes del genoma del individuoo en cualquier otro espécimen previa-mente secuenciado. Hay diferentes basesde datos públicas y privadas que se estánalimentando continuamente con secuen-cias de microorganismos, muchos de ellosimplicados en las enfermedades descritas,como GenBank NCBI (National Center forBiotechnology Information), EMBL(European Molecular Biology Laboratory),RDP (Ribosomal Database Project), RIDOM


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(Ribosomal Differentiation of MedicalMicroorganisms), MicroSeq (AppliedBiosystems) y SmartGene IDNS (IntegratedDatabase Network System). Este marco decomparación permite escoger las secuen-cias dianas más convenientes. A la vezque se publican trabajos con propuestasde protocolos de diagnóstico, se puedentomar las secuencias propuestas para am-plificar y compararlas con nuevas que vanapareciendo en las bases de datos. Deesta manera se observa si mutacionespuntuales pueden afectar a la especifi-cidad o sensibilidad de la técnica pro-puesta.

El diseño de una qPCR que ofrezca garan-tías de especificidad, sensibilidad, ro-bustez y repetibilidad pasa por el empleode modernas herramientas basadas en lasecuenciación del ADN, manejo de basesde datos y programas informáticos queincorporen sofisticados algoritmos paracalcular posibles acoplamientos y reorde-namientos de los oligonucleótidos que seemplean en la qPCR.

Una de las regiones diana más empleadasen bacteriología es la responsable de la co-dificación del ARN ribosómico (Rodicio yMendoza, 2004). Los tipos de ARN ribosó-mico se han venido denominando tradicio-nalmente según su coeficiente de sedimen-tación, medido en svedbergs (S). De estamanera, en organismos procariotas existentres ARN ribosómicos distintos (5S, 16S y23S) y en organismos eucariotas cuatro(5S, 5'8S, 18S y 28S). Los genes para elARN ribosomal están entre los más esta-bles e inmutables genes conocidos. Haymutaciones viables, pero no frecuente-mente. En particular, los genes de launidad pequeña del ARN (16S en proca-riontes o 18S en eucariontes) se usan ex-

tensivamente para comparar organismosvivos, tan diversos como bacterias, hongosy eucariotas. Cada región codificante deARN ribosómico incluye genes para losARNr 23S, 16S y 5S, separados por re-giones espaciadoras o intergénicas.

El análisis de la secuencia de los ARNr 16Sde distintos grupos filogenéticos reveló unhecho adicional de gran importancia prác-tica: la presencia de una o más secuenciascaracterísticas que se denominan oligo-nucleótidos firma. Se trata de secuenciasespecíficas cortas que aparecen en lamayor parte de los miembros de un de-terminado grupo filogenético, y rara-mente están presentes en otros grupos,incluidos los más próximos. Por ello, losoligonucleótidos firma pueden utilizarsepara ubicar a cada bacteria dentro de supropio grupo.

Aunque existen otras regiones alternativasal ARNr 16S, hasta el momento ningunaha conseguido desplazarle, siendo muyútiles como cronómetros moleculares. Dehecho, esta macromolécula presenta unaserie de características, en base a lascuales fue considerada por Woese comocronómetro molecular definitivo (Rodicioy Mendoza, 2004):

• Se trata de una molécula muy antigua,presente en todas las bacterias actuales.Constituye, por tanto, una diana uni-versal para su identificación.

• Su estructura y función han permane-cido constantes durante un tiempo muyprolongado, de modo que las altera-ciones en la secuencia reflejan proba-blemente cambios aleatorios.

• Los cambios ocurren de manera sufi-cientemente lenta como para aportarinformación acerca de todos los proca-


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riotas y, junto con las variaciones en losARNr 18S, a lo largo de toda la escalaevolutiva. Los ARNr contienen, sin em-bargo, suficiente variabilidad para dife-renciar no solo los organismos más ale-jados, sino también los más próximos.

• El tamaño relativamente largo de losARNr 16S (1.500 nt) minimiza las fluc-tuaciones estadísticas.

• La conservación en estructura secun-daria puede servir de ayuda en las com-paraciones, aportando una base para elalineamiento preciso.

• Dado que resulta relativamente fácil se-cuenciar los ADNr 16S, existen bases dedatos amplias, en continuo crecimiento.

Si no existe ningún trabajo publicado selleva a cabo la búsqueda de secuenciasdel microorganismo de interés en lasbases de datos y se elige una región queidentifique inequívocamente a dicho mi-croorganismo. En ocasiones se recurre alas zonas intergénicas del ADNr que no seexpresan y que acumulan mayor variabi-lidad, lo que permite separar especies másfácilmente.

Una vez que se dispone de una secuenciadiana es necesario definir el tamaño delfragmento a amplificar que se encuentraacotado por los cebadores directo y re-verso; además hay que seleccionar la se-cuencia donde se va a hibridar la sonda osondas marcadas con fluorocromos, lascuales confirman que el fragmento am-plificado es el adecuado. El diseño de lostres o, en su caso, cuatro oligonucleótidoses determinante para el éxito de la qPCR.Existen diversas aplicaciones para realizarel diseño con una cierta garantía de éxito,como:

GeneFisher 2 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de).

AlleleID (http://www.premierbiosoft.com).

Beacon Designer (http://www.premierbio-soft.com).

Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl).

FastPCR (http://primerdigital.com).

PrimerExpress (http://www.appliedbiosys-tems.com).

Es importante comprobar que la se-cuencia definitiva no hibrida con otras si-milares, por lo que se recurre de nuevo alos programas de alineamiento y bús-queda como GenBank NCBI, EMBL, RDPo RIDOM. A continuación es necesario en-cargar la síntesis de los cebadores ysondas y comenzar con un proceso básicode validación del ensayo.

Validación de ensayos para laOrganización Mundialde Sanidad Animal (OIE)La necesidad de combatir las enferme-dades de los animales a nivel mundialconstituyó el motivo por el cual se creó laOficina Internacional de Epizootias (OIE)gracias a un acuerdo internacional fir-mado el 25 de enero de 1924. En mayode 2003, la OIE se convirtió en laOrganización Mundial de Sanidad Animal,pero conserva su acrónimo histórico OIE.

El Comité Internacional de la OIE asignóa la Comisión de Estándares Biológicos dela organización la tarea de elaborar elManual de animales terrestres. El propó-sito de este manual es facilitar el comerciointernacional de animales y productos ani-males, así como contribuir a la mejora delos servicios de salud animal en todo el


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mundo. El manual fija los estándares dellaboratorio para todas las enfermedadesde las listas A y B de la OIE, así como paraotras varias enfermedades de importanciaglobal. Sin embargo, el complejo procesode validación de nuevos ensayos ralentizaenormemente la incorporación de nuevastecnologías con la velocidad que lostiempos requieren.

En la práctica se están incorporando tec-nologías como la qPCR para comple-mentar y, en muchas ocasiones, acelerar

los procesos de discriminación de enfer-medades, tanto las denominadas comode declaración obligatoria como otrosprocesos patógenos.

El problema más importante que ralen-tiza la incorporación de este tipo de téc-nicas es el complejo sistema de valida-ción del ensayo. En la gráfica 1 se puedeobservar un flujograma con el procesoque se debería seguir para validar unatécnica para su empleo como herra-mienta de diagnóstico.

Gráfica 1. Flujograma con el proceso de validación según la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) 2010.

Adecuación del ensayo a la necesidad

Requisitosesenciales

Desarrollodel ensayo

Validacióndel ensayo

Optimización yestandarización

Reactivos y controles

Diseño yprotocolos

Ensayo candidatovs. oficial

Límite de detección

Reconocimientoprovisional

SensibilidadEspecificidad

Reproducibilidad inicialRepetitividad

Animales de referenciaAnimales

experimentales

Característicasanalíticas

Laboratoriosparticipantes Panel de muestras

Muestrasde referencia Implementación

Reconocimiento oficial por la OIE(OIE Terrestrial Manual/2010)

Característicasdiagnósticas

Reproducibilidad

Normasde interpretación


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A continuación se comentan algunos delos puntos críticos del proceso de valida-ción:

• Comparación y armonización de los en-sayos: normalmente, se elaboran nuevosensayos para mejorar las técnicas envigor. Para demostrar que un nuevo en-sayo supone una mejora de una técnicaya existente, debe existir alguna formade comparación que demuestre esa me-jora. La comparación puede estar relacio-nada con las características de realizaciónanalítica y/o diagnóstica. También puedeestar relacionada con características detipo operativo, como el coste, la ro-bustez, el tiempo para la obtención deresultados, el rendimiento, etc. Si elnuevo ensayo se va a integrar en un ré-gimen de diagnóstico que incluye otrosmétodos de prueba, debería establecersela razón de ser de su utilización, la inter-pretación de los datos y la toma de deci-siones.

• Optimización y estandarización de losreactivos: la elección y caracterizaciónde los reactivos debe abordarse deforma cuidadosa o de lo contrario po-drán peligrar las condiciones de realiza-ción de la prueba. Cuando un reactivo,como una muestra de control, está apunto de agotarse, resulta necesariopreparar y probar repetidamente otrode repuesto antes de que se acabe. Lanueva muestra de control se incluye ensucesivas realizaciones del ensayo antesdel agotamiento del control originalpara establecer su relación proporcionalcon el que se está acabando.

• Estudios de viabilidad y selección demuestras: se necesitan muestras paralos experimentos a fin de determinar si

la prueba propuesta es viable. Las mues-tras deberían representar tanto a ani-males que se consideran infectadoscomo a aquellos no infectados dentrode la población que finalmente va a serobjeto de la prueba una vez que esta sehaya validado. Por otra parte, las mues-tras deben haber dado los resultados es-perados en uno o más ensayos clásicosademás de aquel en el que se está vali-dando. Con preferencia, las muestrasdeben proceder de animales indivi-duales, aunque también pueden derivarde la acumulación de muestras de va-rios animales. Estas muestras puedenutilizarse en experimentos para deter-minar si la prueba es capaz de distinguirdiferentes cantidades del componenteanalizado y para optimizar las concen-traciones de reactivos y perfeccionar elprotocolo.

• Selección del método para lograr resul-tados normalizados: la normalizaciónajusta los resultados directos de la pruebapara todas las muestras con relación a losvalores de los controles incluidos en cadadesarrollo del ensayo. El procedimientode normalización requiere un algoritmosofisticado, que usa varios controles ajus-tados a valores esperables, para obteneruna curva estándar desde la que puedeextrapolarse el valor de la muestra. Estemétodo también permite la exclusión deun valor control que puede caer fuera delos límites de confianza esperados. Seacual sea el método usado para la norma-lización de los datos, es esencial incluircontroles adicionales para cada reactivoque pueda introducir variabilidad y quepueda limitar por tanto los intentos delograr un ensayo validado. Los valoresnormalizados para tales controles tienen


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que caer dentro de límites predetermi-nados (dentro de un múltiplo apropiadode la desviación estándar de la media demuchas reacciones de cada control). Loslímites escogidos deberían reflejar unatasa tolerable de rechazo de ensayo y unriesgo aceptable de que algunas mues-tras de prueba puedan estar mal clasifi-cadas.

• Reproducibilidad: la evidencia preliminarde reproducibilidad (concordancia entrelos duplicados dentro de un mismo en-sayo y entre distintas realizaciones de laprueba) resulta necesaria para garan-tizar el posterior desarrollo del ensayo avalidar. Esto se lleva a cabo evaluandolos resultados de, como mínimo, tres delas cuatro muestras internas que repre-sentan la actividad dentro del rango li-neal del ensayo. Se ensayan cuatro co-pias de esas muestras en al menoscuatro realizaciones del ensayo para de-terminar la variación (entre ensayos)dentro de una misma realización. La va-riación entre diferentes realizaciones delmismo ensayo se analiza utilizando lasmismas muestras en un mínimo de 20realizaciones (en total), por dos o másoperarios, preferiblemente en fechas di-ferentes. Todas las realizaciones debenllevarse a cabo de forma independiente.

• Determinación de la especificidad y sen-sibilidad analíticas: la especificidad ana-lítica es el grado en que el ensayo nomuestra reacción cruzada con otras se-cuencias de ADN. La sensibilidad analí-tica de un ensayo puede evaluarse me-diante la cuantificación de la cantidadmás pequeña de ADN que es detectableen la muestra.

• Sensibilidad y especificidad diagnóstica:los valores de sensibilidad y especifi-cidad diagnóstica constituyen los pará-metros más importantes que se esta-blecen durante la validación de unensayo. Dichos valores deben estable-cerse tras el ensayo y se optimizarán yestandarizarán los reactivos; la altera-ción de los protocolos o los reactivospuede requerir una revisión de las ca-racterísticas de realización. Constituyenla base para el cálculo de otros paráme-tros a partir de los cuales se realizan de-ducciones sobre los resultados. Por con-siguiente, es muy importante que lasestimaciones sobre la sensibilidad y laespecificidad diagnóstica sean tanexactas como sea posible. En teoría,estos valores derivan del ensayo de unaserie de muestras procedentes de ani-males de referencia cuya historia es co-nocida, así como su estado de infec-ción/enfermedad, y que son ademásanimales representativos de la región opaís donde se pretende usar la prueba,pero tal cosa no siempre es posible.Debe elegirse un diseño de prueba quepermita estimar las características derealización diagnóstica. No obstante, setrata de un proceso complicado porcausa de limitaciones de tipo logístico yfinanciero. Los resultados de las pruebastienen primero que reducirse a la cate-goría de positivo o negativo. Esto im-plica considerar un punto de corte (um-bral o límite de decisión) en la escalacontinua de resultados de la prueba.Para establecer la sensibilidad y la espe-cificidad diagnóstica, tanto el númerocomo el origen de los animales de refe-rencia y los métodos utilizados para de-terminar la sensibilidad y especificidad


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analíticas son aspectos clave cuando seintenta una validación adecuada del en-sayo para su uso con la población deanimales a la que va dirigida.

En definitiva, son muy pocos los en-sayos validados con técnicas qPCR porla dificultad de validación de los mismosy por las frustrantes experiencias pre-vias con las técnicas de PCR por la faltade rigor en la estandarización.

Aplicación de las técnicasde análisis de ácidos nucleicosen el diagnósticode enfermedades equinas

La OIE, por las circunstancias anterior-mente descritas, tan solo ha validado al-gunas técnicas para diagnóstico vírico enla versión on-line de su último Manual deEnfermedades Terrestres de 2010 refe-rentes a caballos (OIE, 2010):

• Virus de la arteritis vírica equina.

• Virus de la fiebre del Nilo Occidental.

• Virus de la peste equina.

• Virus de la anemia infecciosa equina.

• Virus de la gripe equina.

Sin embargo, se han publicado técnicasde qPCR sin validar para detectar la pre-sencia de otros microorganismos de in-terés equino que pueden ser útiles paraanálisis de discriminación y estudios epi-demiológicos. A continuación se citan al-gunos ejemplos:

• Taylorella equigenitalis (Wakeley et al.,2006).

• Babesia caballi (Bhoora et al., 2010).

• Theileria equi (Kim et al., 2008).

• Pseudomonas aeruginosa (Cattoir et al.,2010).

• Klebsiella pneumoniae (Kurupati et al.,2004).

• Rodococcus equi (Rodríguez-Lázaro et al.,2006).

En el Reglamento (UE) n.º 176/2010 de laComisión Europea, de 2 de marzo de2010, por el que se modifica el anexo Dde la Directiva 92/65/CEE del Consejo enlo que respecta a los centros de recogiday almacenamiento de esperma, losequipos de recogida y producción de em-briones y las condiciones aplicables a losanimales donantes de las especies equina,ovina y caprina y a la manipulación de es-perma, óvulos y embriones de dichas es-pecies, se indica en el punto 1.5 del capí-tulo II que cada semental deberá sersometido a las pruebas siguientes, reali-zadas y certificadas en un laboratorio re-conocido por la autoridad competente,con arreglo al programa que se estableceen el punto 1.6:

a) Prueba de inmunodifusión en gel deagar (prueba de Coggins) o ELISA parala detección de la anemia infecciosaequina, con resultado negativo.

b) Prueba de aislamiento del virus de laarteritis vírica equina con resultado ne-gativo, realizada en una parte alícuotade todo el esperma del caballo se-mental donante, salvo que se obtengaun resultado negativo con una diluciónde suero de 1:4 en una prueba de neu-tralización sérica para la detección dedicha enfermedad.

c) Una prueba para la detección de lametritis contagiosa equina, realizadaen dos ocasiones con muestras to-


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madas del caballo semental donantecon un intervalo de 7 días, medianteaislamiento de Taylorella equigenitalisen el líquido preeyaculatorio o en unamuestra de esperma y en hisopos ge-nitales tomados, como mínimo, delprepucio, la uretra y la fosa uretral,con resultados negativos en todos loscasos.

En ningún caso se cita el empleo de téc-nicas moleculares para el diagnóstico deestas enfermedades cuando tanto para ladetección de T. asinigenitalis como parael virus de la arteritis vírica equina hay téc-nicas descritas que pueden ayudar a con-firmar los aislamientos de ambos micro-organismos (Mankoc et al., 2007;Wakeley et al., 2006). A continuación secitan algunos de estos ejemplos:

Metritis equina contagiosa

La metritis equina contagiosa consiste enuna inflamación del endometrio de las ye-guas causada por Taylorella equigenitalis,y que normalmente origina una inferti-lidad temporal. Se trata de una infecciónno sistémica, cuyos efectos se encuentranrestringidos al tracto reproductivo de layegua. La identificación del agente se rea-liza a partir de frotis, que deben transpor-tarse al laboratorio con precaución paraevitar pérdida de viabilidad. Los frotisdeben sumergirse en medio de transporteAmies con carbón y transportarse al labo-ratorio de pruebas, preferiblemente conla temperatura controlada, para su re-siembra dentro de las 48 horas siguientesa la recogida. El crecimiento de T. equige-nitalis puede llevar al menos 72 horas, ypuede extenderse hasta 14 días, aunque,normalmente, no le lleva más de 6 días a37 ºC en medio enriquecido con sangre

caliente y en una atmósfera del 5-10% deCO2. Es aconsejable realizar una incuba-ción de al menos 7 días antes de certificarque los cultivos son negativos para T.equigenitalis. La naturaleza compleja deT. equigenitalis dificulta su aislamiento, yse han empleado pruebas realizadas enmanadas de sementales para detectar elestado de portador como una ayuda va-liosa al examen de los cultivos.

Recientemente, otra especie de Taylorella,T. asinigenitalis, se ha aislado a partir demachos de burro y caballos sementales delos EE.UU. y caballos sementales deEuropa. Se ha descrito que esta bacteria noproduce ninguna enfermedad natural; ha-bita en el tracto genital de los machos deburro, y puede transmitirse a otros burrosy caballos durante la cópula. Puede adqui-rirse un sistema de aglutinación con bolasde látex para la identificación antigénica deT. equigenitalis, y se basa en el empleo deanticuerpos policlonales. Este método seutiliza ampliamente por los laboratorios deanálisis rutinario para la confirmación de laidentidad de las colonias que crecen en elmedio selectivo, y que dan una reacciónbioquímica consistente con T. equigenitalis.Debería recalcarse que esta prueba no dis-tinguirá necesariamente a las cepas deT. equigenitalis de las de T. asinigenitalis.

Durante el comienzo de la temporada decría, se toman frotis de los sementales, in-cluyendo a aquellos que se encuentren ensu primera temporada, en dos ocasionesseparadas por no menos de 7 días. Las ye-guas se clasifican de acuerdo con el gradode riesgo que presentan, y la frecuenciadel muestreo se ajusta de manera apro-piada.


32

Este tipo de análisis es tedioso y exige larepetición de los análisis por la frecuenciade los falsos negativos que se presentandada la dificultad de crecer en el labora-torio. La incorporación de técnicas máságiles se impone como medida preventivapara el mantenimiento de la explotacióncontrolada frente a esta enfermedad.Wakeley y col. (2006) proponen una téc-nica de qPCR que tiene la ventaja de dis-criminar entre T. equigenitalis y T. asinige-nitalis. Este aspecto es importante, puesun aislamiento de Taylorella spp. conlle-varía la declaración del estado de por-tador del animal y la toma de medidaspreventivas para evitar la difusión de labacteria cuando es posible que se trate deT. asinigenitalis que no produce metritis.El frotis destinado a ser analizado me-diante qPCR puede ser congelado inme-diatamente para detener el crecimientobacteriano y, una vez en el laboratorio, elanálisis se lleva a cabo en apenas 2 horas.

Esencialmente se trata de amplificar unfragmento de 112 pares de bases de la re-gión del ADN que codifica para la subuni-dad 16S de ARN ribosómico. La secuenciadel fragmento amplificado presenta dife-rencias según se trate de T. equigenitaliso T. asinigenitalis.

T. equigenitalisGGTTTGTGTTAATACCATGGACTGCT

T. asinigenitalisGTTTTAGGATAATACCCTAGGATGCT

Se añaden a la reacción dos sondas mar-cadas con fluorocromos diferentes, unacon la secuencia de T. equigenitalis y laotra con la secuencia de T. asinigenitalis.Según se trate de una bacteria u otra sehibridará una de las dos sondas. La sonda,una vez hibridada, se hidroliza por acción

de la polimerasa y comienza a emitir luzde una determinada longitud de onda.Según el color de la luz emitida se puedesaber si la secuencia diana es de T. equi-genitalis o de T. asinigenitalis. Mediantefiltros se puede observar qué ocurre en lareacción con cada tipo de sonda.

Arteritis vírica equina

Según el Manual de EnfermedadesTerrestres (2008): “La arteritis vírica equina(AVE) es una enfermedad vírica y conta-giosa de los équidos causada por el virus dela arteritis equina (EAV), un virus con ARNclasificado en la familia Arteriviridae. La ma-yoría de las infecciones adquiridas natural-mente con el EAV son subclínicas. Cuandoaparecen, los síntomas clínicos de la AVEvarían en extensión y gravedad”.

Se debe tratar de aislar el virus del semende los sementales seropositivos con anti-cuerpos contra el EAV que no tengan an-tecedentes de vacunación contra AVE. Elaislamiento del EAV debe realizarse conpreferencia en una porción del eyaculadocompleto. El problema del aislamiento esque en ocasiones el efecto citotóxico delsemen sobre las células de la monocapaprovoca su destrucción, siendo imposiblelograr un cultivo del virus aceptable quepermita su identificación. Se han ido pro-poniendo diferentes técnicas de qPCR(Mankoc et al., 2007), aunque perma-necen las dudas sobre las regiones mejorconservadas del genoma para evitar quemutaciones puntuales puedan dar lugara falsos negativos (Zhang et al., 2007).

Conclusiones• La PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)

es una técnica rápida, sensible, especí-


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fica, robusta y de fácil implantación quela hace idónea para su aplicación en di-ferentes aspectos de la Microbiología.

• La qPCR tiene una aplicación funda-mental en el diagnóstico preventivo deenfermedades de declaración obligatoriaen los caballos porque permite la detec-ción temprana de focos epidemiológicos.

• La proliferación de trabajos científicosexige cautela y prudencia, siendo nece-saria una validación de las técnicasantes de su aplicación masiva.

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IntroducciónLa higiene alimentaria es labor básica dela profesión veterinaria; además, no seríadescabellado considerarla como labor ex-clusiva de los veterinarios. Esta afirmacióntan categórica viene apoyada por dife-rentes argumentos de índole legal, profe-sional e histórica.

La legislación, en diferentes preceptos,atribuye a los veterinarios la exclusividaden la higiene de los alimentos de origenanimal, tal es el caso de la Ley General deSanidad (1) y de la Ley de ProfesionesSanitarias (2); así mismo, parece lógicodeducir que los profesionales conoce-dores de la patología animal sean los quedictaminen sobre los productos alimenti-cios procedentes de los animales deabasto y de los derivados de las produc-ciones animales de diferente índole.

Históricamente no hace falta remontarsemás que al siglo XIX para encontrar lasprimeras referencias a la inspección ve-terinaria de los alimentos. Los veterina-rios municipales fueron incorporados ala inspección de víveres un lejano 10 demarzo de 1840 (3) por acuerdo delExcmo. Ayuntamiento de la Villa y Cortede Madrid, sancionado más tarde porReglamento Municipal aprobado el 14de diciembre de 1842, que decía: “ElAyuntamiento le expide el presente títulopara que sea reconocido, respetado yobedecido como inspector, quedando

autorizado para reconocer los mataderosy las reses que existan en ellos, tantovivas como después de muertas; lascarnes, los pescados, caza, leche, frutay, en una palabra, todo lo que sirva dealimento para el hombre y pueda com-prometer su salud, por hallarse malsanoo poco sazonado, como igualmentetodo sitio que, por su situación topográ-fica o por el poco aseo que en él haya,sea foco de infección”.

Años más tarde, otras ciudades, comoBarcelona, Valencia, Oviedo, Granada yNavarra, copiaron este modelo de inspec-ción veterinaria.

Posteriormente le han seguido numerosasdisposiciones, entre las que destaca elReal Decreto de 22 de diciembre de 1908,que, según Martín-Martínez Conde (3), esuna verdadera obra maestra de la higienede los alimentos.

Las herramientas técnicas con las que losveterinarios han desarrollado su labor dehigiene alimentaria han evolucionadodesde la simple inspección de visu y el mi-croscopio monocular con luz natural am-plificada por lupa hasta las modernas téc-nicas de análisis inmunoenzimático o lacromatografía líquida de alta resolución.

Por otra parte, el autocontrol en materiade inocuidad microbiológica de los ali-mentos es un concepto básico que se hadesarrollado desde hace pocos añoscomo pilar fundamental del control de las

Ecología microbiana y nuevas tecnologíasde análisis microbiológico de alimentosDr. José Luis Rodríguez-Marín Roy y Dr. Alberto Zamora Benito

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enfermedades de transmisión alimentaria.Este autocontrol se ha plasmado en lossistemas de calidad alimentaria denomi-nados APPCC (acertada traducción delHACCP inglés).

A nuestro entender el APPCC se ha reve-lado como una magnífica herramientapara evitar la transmisión de las enferme-dades alimentarias, pero su correcta im-

plantación está condicionada por unaserie de disciplinas, de las cuales la deci-siva es la Ecología Microbiana de losAlimentos, es decir, el conocimiento enprofundidad de las bacterias, virus y pa-rásitos presentes de una forma inevitableen los productos alimenticios durante lasdiferentes fases de la cadena alimentaria(figura 1).

Figura 1.

Ciencia veterinariaConocimientos de anatomía,fisiología y patología animal

ALIMENTOSSANITARIAMENTEAPTOS PARA EL

CONSUMO

Monitorizaciónde puntos

de control críticos

Verificación del sistema APPCCy comprobación de la calidad

sanitaria del productoalimentario final

Bromatología descriptivaConocimientos de calidad,

propiedades nutritivas ycomposición de los alimentos

Tecnología alimentariaConocimientos de los

procesos de transformaciónde los alimentos y su

repercusión sobre estos

Legislación alimentariaConocimientos de la normativa

alimentaria vinculante

Determinaciónde peligros

Ecología microbianaConocimientos de carga

microbiana de los productosalimenticios en las diferentes

fases de la cadena alimentaria

Evaluación ygestión delos riesgos

Análisis de alimentosRealización de ensayos acreditados portécnicas rápidas de tipo microbiológico

y de tipo físico-químico

ANÁLISIS DE PELIGROSY PUNTOS DE CONTROL CRÍTICO

APPCC


Ecología microbiana y nuevas tecnologías de análisis microbiológico de alimentos

37

Esta “presencia inevitable” es conse-cuencia de:

• El medio en el que se desarrollan ycrecen los animales y plantas que daránlugar a determinados productos alimen-ticios; tal es el caso de los tubérculos yla presencia de microorganismos espo-rulados de origen telúrico.

• Las fases de producción y transforma-ción primaria a las que son sometidosestos productos; como ejemplo claro esla presencia de enterobacteriáceas enlas canales de animales de abasto des-pués de su faenado en mataderos.

• Las diferentes operaciones que se rea-lizan durante las fases de la cadena ali-mentaria, sobre todo en el picado o tro-ceado de determinados alimentosanimales.

Además, los diferentes tipos de ali-mentos, la complejidad de la industriaalimentaria y las necesidades del mer-cado están obligando a las industrias acontratar expertos sanitarios que seanespecialistas en higiene alimentaria, eco-logía microbiana y análisis de alimentos,todo ello por diferentes sectores del mer-cado alimentario.

Figura 2. Instalaciones del Servicio de Bromatología del Centro Militar de Veterinaria de la Defensa (fotografíasde los autores).



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La comprobación de la viabilidad de los sis-temas APPCC se debe realizar por mediode análisis de alimentos que nos ofrezcanresultados fiables en el menor tiempo po-sible y, por supuesto, económico.

Así pues, la conjunción de conocimientosde Ecología Microbiana que nos permitadeterminar los riesgos a los que nos en-frentamos, junto con la aplicación de unsistema APPCC, que nos ayude a eliminar

o minimizar esos peligros por medio deun adecuado control de los riesgos, y conla inestimable ayuda de unos ensayos mi-crobiológicos baratos, fiables y rápidos,que nos ayuden a monitorizar el planAPPCC y a comprobar la inocuidad delproducto alimenticio final, será el sistemahigiénico-sanitario ideal para el control delas enfermedades de transmisión alimen-taria.

Figura 3. Sistema TEMPO® (bioMérieux) basado en el número más probable (NMP) para análisis microbiológicode los alimentos utilizado en el Servicio de Bromatología y Seguridad Alimentaria del CEMILVET (fotografía de losautores).



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Ecología Microbiana

Generalidades

Se puede definir la Ecología Microbianacomo la ciencia que estudia el compo-nente microbiológico de los alimentos,tanto animales como vegetales, en las di-ferentes fases de la cadena alimentaria,así como el entorno de los alimentos y suinfluencia sobre estos y, por lo tanto,sobre la citada microbiota (4).

Además, en los diferentes procesos demanipulación de estos alimentos se in-fluye cuantitativa y cualitativamente en lamicrobiota que sobrevive a aquellos y enla que se desarrollará en los subsiguientesprocesos de manipulación y almacena-miento.

Existen dos campos de interés de entre losdiversos aspectos que abarca laMicrobiología Alimentaria:

• Sanitario: relacionado con la proteccióndel consumidor frente a enfermedadestransmitidas por los alimentos.

• Comercial: dirigido hacia la prevenciónde las alteraciones de los alimentos através de los microorganismos.

En líneas generales, el origen y las pro-piedades bioquímicas son diferentes enlos microorganismos de interés sanitariorespecto a los microorganismos respon-sables de la alteración comercial de losalimentos; esto motivaría tres situa-ciones:

• Los alimentos que presentan una cargamicrobiana de patógenos o de sus to-xinas suficientes como para provocarsintomatología clínica tras su ingesta nosuelen ocasionar una modificación evi-dente en sus caracteres organolépticos.

• Las medidas de control que se muestraneficaces frente al crecimiento de pató-genos no tienen por qué serlo necesa-riamente frente al crecimiento de alte-rantes. Un ejemplo claro de esto es laleche pasteurizada.

• Las medidas tendentes a reducir o in-hibir el crecimiento de alterantes no sa-nean el alimento, es decir, no lo haceninocuo en todos los casos, por dos mo-tivos:

– Ciertos patógenos existentes siguenconservando su poder infectivo.

– Ciertos patógenos requieren dosis in-fectivas muy pequeñas.

En vista de que la contaminación resultamuy difícil de evitar, las medidas prácticasen la industria alimentaria tienden a in-hibir o reducir la multiplicación de los mi-croorganismos contaminantes.

Inicialmente se puede decir que la indus-tria cuenta con suficientes conocimientoscientíficos y tecnológicos como para pro-ducir alimentos de buena calidad micro-biológica, aunque el problema de su apli-cación se halla condicionado al factorhumano.

El aseguramiento de la calidad microbio-lógica de los alimentos se basa en el con-trol de la multiplicación de los microor-ganismos en el nicho ecológico,constituido por el sustrato que este pro-porciona y por el tipo de ambiente en elque se conserva.

Así pues, el tipo de alimento, junto conuna serie de factores externos al propioalimento, determinarán el tipo de micro-biota presente en cada fase de la cadenaalimentaria (figura 4).



40

Los factores que influyen en la selecciónde la microbiota inicial y que son la causade la multiplicación de solo una parte deella (resistencia a la colonización del ali-mento) pueden ser (5):

1. Factores intrínsecos: propiedades físico-químicas y biológicas.

2. Tratamientos tecnológicos.

3. Factores extrínsecos: condiciones am-bientales.

4. Factores implícitos: antagonismo/siner-gismo.

Factores que afectan a la microbiotapresente en el alimento (substrato)

Factores intrínsecos: propiedadesfísico-químicas y biológicas

Actividad de agua (aw)

Agua de la que disponen los microorga-nismos para crecer; es inversa a la presiónosmótica del alimento.

Ecología microbiana de los alimentosLa rama de la Microbiología Alimentaria que estudia las relacionesentre las poblaciones microbianas presentes en el alimento y losdiferentes factores tanto relativos como ajenos a este, recibe el

nombre de Ecología Microbiana de los Alimentos

Microbióticade carnes Factores intrínsecos:

• Actividad de agua aw

• pH (acidez)• Nutrientes• Potencial de óxido-reducción

Tratamientos tecnológicos:• Calor• Cambios en la composición

química de los alimentos

Factores implícitos:• Sinergismo• Antagonismo

Factores intrínsecos:• Temperatura

Microbióticade pescados

Microbióticade huevos

Microbiótica deleche y derivados

Microbiótica dealimentos vegetales

Microbiótica deotros alimentos

APPCC

}IDENTIFICACIÓN DE PELIGROS GESTIÓN DE RIESGOS

Figura 4.



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• aw = 0,98-1, casi todos los microorga-nismos se desarrollan.

• aw < 0,95, se mantienen cocos y lacto-bacilos.

• aw < 0,87, proliferan únicamentemohos (p.ej.: el almíbar).

Los microorganismos patógenos crecencon unos valores de aw < 0,86.

pH (acidez)

La mayoría de los alimentos, como lacarne, la fruta y el pescado en su estadonatural, son ligeramente ácidos, a excep-ción de la clara de huevo, que tiene un pHalcalino.

Todos los microorganismos se desarrollanbien con rangos de pH comprendidosentre 5 y 8, pero casi ningún patógeno sedesarrolla con un pH de 4,5.

Las bacterias sensibles a la acidez, comolos bacilos gramnegativos, no puedenmultiplicarse en alimentos de pH ácido,tales como las frutas o los encurtidos. Deigual modo, Clostridium botulinum noprolifera a valores de pH < 4,5 (6), hecho

Los pH alcalinos también dificultan el cre-cimiento de ciertos microorganismos; deforma que un pH de 9 (clara de huevo re-cién puesto) constituye uno de los meca-nismos de protección del huevo frente ala invasión por microorganismos.

Potencial de óxido-reducción

El potencial redox indica las relaciones deoxígeno de los microorganismos vivos ypuede ser utilizado para especificar el am-biente en el que un microorganismo escapaz de generar energía y sintetizarnuevas células sin recurrir al oxígeno mo-lecular.

• Microorganismos anaerobios: valoresredox negativos (+ 300 mV).

que permite que los alimentos enlatadosde carácter ácido no requieran de un tra-tamiento térmico tan intenso como aque-llos de menor acidez.

Su efecto inhibidor depende:

• Del tipo de ácido: láctico o cítrico.

• Otros factores limitantes: nutrientes, aw,temperatura...

Figura 5. Cecina, ejemplo de alimento conservado pordesecación y con baja aw (Mercado de Oviedo, foto-grafía de los autores).

Figura 6. Alimentos conservados a pH bajo (Mercadode Valencia, fotografía de los autores).



42

• Microorganismos aerobios: valoresredox positivos (– 420 mV).

Nutrientes

• Glúcidos: la degradación de alimentosricos en almidón (patata, grano) re-quiere de microorganismos con una ca-pacidad de subsistencia a partir de unsuministro mínimo de nitrógeno y sales,así como un equipo enzimático amilasaeficaz frente a almidón no degradado.

De igual forma, la asociación alterantede la celulosa, presente en los alimentosde origen vegetal, es muy restringidapor la rareza de la presencia de enzimascelulolíticas en los microorganismos.

El efecto selectivo de otros glúcidos depeso molecular más pequeño que el al-midón o la celulosa también se da,aunque en menor medida. Así, en los pro-ductos lácteos predominan las especieslactosa positivas de Enterobacteriaceae,en contraste con la mayoría de los ali-mentos en los que son aventajadas porlas cepas lactosa negativas.

• Lípidos: la presencia de grasas en los ali-mentos estimula el predominio de mi-croorganismos lipolíticos en los mismos.Estos microorganismos producen lipasasque hidrolizan las grasas dando lugar ala aparición de metabolitos, como losácidos grasos, que a su vez sufren cam-bios, originando, entre otros, cetonas.

En conjunto, estos cambios metabólicosdetectables organolépticamente se hanenglobado en lo que se denomina ran-cidez microbiana (7).

• Proteínas y péptidos: en general, lasproteínas complejas no son frecuente-mente atacadas por los microorga-nismos, por lo que no constituyen una

fuente universal de nitrógeno. Sin em-bargo, existen bacterias productorasde colagenasa que desempeñan unpapel importante en la alteración de lacarne.

Estas especies proteolíticas pueden des-doblar las moléculas nitrogenadas demayor tamaño presentes en los ali-mentos, posibilitando la proliferación deotras especies no proteolíticas, que uti-lizan el nitrógeno de los compuestos dedegradación originados por el ataque alas proteínas.

• Vitaminas: muchos microorganismos nopueden crecer si no cuentan con unaporte adecuado de vitaminas del com-plejo B, incluso en medios óptimos encuanto a otros requerimientos.

Parece significativo que las frutas, po-bres en vitaminas del grupo B, sean ata-cadas por mohos y levaduras, capacesde sintetizarlas por sí mismos.

Por el contrario, los alimentos de origenanimal, ricos en vitaminas del grupo B,son atacados por bacterias.

• Otros nutrientes: constituyentes natu-rales antimicrobianos: aceites esencialesen productos de origen vegetal o liso-zima y la conalbúmina en el huevo.

Tratamientos tecnológicos

Temperatura: calor

Constituye el procedimiento más impor-tante utilizado por la moderna tecnologíay el más eficaz en lo que se refiere a lainocuidad para el consumidor de los ali-mentos así tratados.

En general, las células calentadas mues-tran una mayor sensibilidad a las condi-ciones externas desfavorables, sensibilidad



43

que aumenta cuanto más drástico es eltratamiento. Este hecho implica que losfactores antimicrobianos que tienen soloun pequeño efecto sobre las células li-mitan e incluso inhiben completamentela multiplicación de las mismas, si previa-mente han sufrido un tratamiento térmicosubletal.

Tras un tratamiento de pasteurización(72 ºC/20 s), solo se encuentran en los ali-mentos tratados bacterias esporuladas dela familia Bacillaceae. Cuando aumenta laintensidad del tratamiento, incluso seinactivan los esporos de los microorga-nismos pertenecientes a la mencionadafamilia, sobreviviendo únicamente los mástermorresistentes.

Pero estas consideraciones son válidas enlos casos en que los alimentos estén pro-tegidos de una contaminación posterioral tratamiento térmico, circunstancia queno siempre se da (8).

La contaminación posterior al tratamientode enlatados pocas veces se presenta,siendo más frecuente en los productosenvasados en películas flexibles y apare-ciendo de forma regular en alimentos yplatos cocinados que no se protegen me-cánicamente de la contaminación.

Los riesgos que supone la contamina-ción de estos últimos, que no se man-tienen o manipulan con la debida pre-

caución por la falsa creencia de su inal-terabilidad, son aun potencialmente ma-yores que los vinculados a los alimentoscrudos, conservados a temperaturas derefrigeración.

Cambios en la composición química de los

alimentos

• Modificación en la aw: puede reducirse,bien por eliminación de agua (deseca-ción y deshidratación) o bien por au-mento de la concentración de solutos(salazones y mermeladas).

• Modificación del pH: por adición directade un ácido (ácido acético en pescadoen escabeche) o por una fermentaciónláctica (yogur).

• Adición de conservadores químicos:ácido cítrico en mermeladas.

Factores extrínsecos

Temperatura de conservación

Los diversos microorganismos que sonresponsables de la alteración de los ali-mentos pueden crecer a temperaturascomprendidas entre –10 y 80 ºC. Cadauno de ellos tiene unas temperaturas“cardinales” de crecimiento: mínima, óp-tima y máxima, en función de las cualespueden clasificarse:

Tipo Temperatura Temperatura Temperatura

mínima (en ºC) óptima (en ºC) máxima (en ºC)

Psicrófilos –15 10-15 18-20

Psicrótrofos –5 20-30 35-40

Mesófilos 5-10 30-37 ~45

Termófilos 25-42 50-80 60-85



44

Las temperaturas de conservación re-sultan determinantes en la bioquímica delproceso alterativo.

En carne refrigerada predominan pro-cesos proteolíticos por desarrollo de mi-crobiota psicrófila y psicrótrofa, reducién-dose la acidez del medio.

En carnes a temperaturas superiores sonmayoritarios los microorganismos esporu-lados y los de la familia Lactobacillaceae,produciendo al principio ácidos a partir delos glúcidos disponibles.

Los alimentos congelados se conservanpor debajo de los –15 ºC, cesando todamultiplicación microbiana como resultadono solo de la temperatura, sino tambiénde la disponibilidad de agua (aw = 0,84para una temperatura de –20 ºC).

Además, a esta temperatura se inicia in-cluso una lenta inactivación de los micro-organismos no esporulados, aunque estainactivación carece de repercusiones prác-ticas.

Factores implícitos

Sinergismo

Los fenómenos de sinergismo entregrupos de microorganismos son fre-cuentes: un microorganismo produce uncambio en el sustrato que favorece el cre-cimiento de otro microorganismo o grupode microorganismos.

La relación sinérgica se establece a travésde diferentes mecanismos:

• Disponibilidad de nutrientes: produc-ción de vitamina B por levaduras queposibilita el crecimiento de bacterias lác-ticas.

• Cambios en el pH: reducción de ácidoacético por el género Bacillus.

• Cambios en la aw: el crecimiento de ae-robios esporulados en pan de una aw

cerca del límite de desarrollo deClostridium botulinum eleva el conte-nido en agua, aumentando la posibi-lidad de multiplicación del primero.

• Deterioro de las estructuras biológicas:proliferación de un moho determinantede podredumbre en una fruta intacta yposterior penetración de levaduras através de la estructura dañada.

Antagonismos

Los mecanismos son muy similares a losexplicados para el sinergismo:

• Competición en la utilización de nu-trientes: Micrococcus spp. frente aStaphylococcus spp.

• Cambios de pH: Leuconostoc spp.frente a Lactobacillus spp.

• Formación de sustancias antimicro-bianas: CO2, H2O2, etanol, ácidos fór-mico, láctico y propiónico, y bacterio-cinas.

Las relaciones de antagonismo son de granimportancia en el campo de la SaludPública. Estos fenómenos contribuyen enparte a la incidencia relativamente baja deintoxicaciones por toxina estafilocócica,dada la alta sensibilidad de este microbio ala competencia por otros microorganismos,como Pseudomonas spp., Lactobacillusspp., Bacillus spp. y Micrococcus spp., entreotros (9).

Del mismo modo, la baja frecuencia regis-trada de casos de gastroenteritis porBacillus cereus y por Clostridium perfrin-gens puede ser debida a la inhibición na-



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tural de estas bacterias por la microbiotasaprófita que se desarrolla al mismotiempo.

Los alimentos como sustratode la microbiota. Presenciade determinados microorganismoscaracterísticos en la producciónprimaria (2) (resumen en la tabla 1)

Carnes

La carne es un substrato alimenticio idealpara el crecimiento de diversos microor-ganismos.

La cría intensiva del ganado incrementaen gran medida la difusión de los micro-organismos de animal a animal, y en elmatadero y durante el procesado, decanal a canal.

La persistencia de Salmonella spp. en lacarne cruda de los animales de abastovaría, dependiendo de la especie animaly del método de cría.

Los pollos y otras aves son los más frecuen-temente contaminados por este microbioy una gran proporción de las canales deventa al por menor pueden estarlo.Microorganismos como Salmonella enteri-tidis fago tipo 4 pueden contaminar a loshuevos mientras se forman en el oviducto.

Campylobacter spp. suele contaminar lascanales de pollo, sobre todo en el pro-ducto fresco. La incidencia de estos mi-croorganismos en los puntos de venta dela carne de animales de abasto es menor,aunque los despojos suelen estar máscontaminados.

Los pollos albergan con frecuencia Listeriamonocytogenes y Yersinia enterocolitica,habiéndose señalado también la presencia

de Aeromonas spp. en la carne cruda deanimales de abasto. La carne de cerdo con-taminada puede ser una fuente esporádicaimportante de infecciones por Yersinia spp.Las temperaturas de refrigeración puedenno ser lo suficientemente bajas como parafrenar el crecimiento de estas bacterias (10).

La presencia de Escherichia coli yClostridium perfringens puede esperarseen las canales, pero su número es bajocuando se obtienen con buenas prácticasde higiene.

En algunos países, la carne de vacuno pi-cada, en particular las hamburguesas in-suficientemente calentadas, pueden serfuente importante de infecciones porEscherichia coli verocitotoxigénico.

La mayoría de las bacterias alterantes sonaerobias y crecen en la superficie de lacarne, pudiendo distribuirse irregularmentea consecuencia del picado o la trituración.

En el caso de las carnes cocinadas, el tra-tamiento culinario destruye las formas ve-getativas de las bacterias, pero las esporascomo las de Clostridium perfringenspueden sobrevivir y germinar si los ali-mentos no se refrigeran inmediatamentedespués.

Todo proceso de cocinado extrae el oxí-geno de los tejidos y da lugar a un am-biente que favorece el crecimiento de lasbacterias anaerobias.

En embutidos crudos curados su elabora-ción se desarrolla en cinco etapas: picadoy amasado, fermentación, secado y ma-duración. Durante la etapa fermentativaacontece una multiplicación de las bacte-rias lácticas de la carne que se acompañade una disminución de la microbiotagramnegativa.



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Se han señalado brotes de intoxicación es-tafilocócica por estos productos. La mul-tiplicación de Staphylococcus aureuspuede limitarse manteniendo la carne enrefrigeración durante la fermentación ini-cial, dado que la acidificación rápida ini-cial favorece su crecimiento.

Los derivados cárnicos tratados térmica-mente, como el jamón cocido, presen-tados en lonchas envasadas al vacío, deun pH > 6 y una aw > 0,95, se alteran conel tiempo aun cuando se conserven refri-gerados, principalmente por la prolifera-ción de micrococos, bacterias acidolác-ticas, Brochotrix thermosphacta (11) yestreptococos de los grupos N y D. Estosúltimos son bastante resistentes y pocopuede hacerse para eliminarlos por com-pleto; el resto se puede reducir en granmedida realizando las operaciones de cor-tado y envasado en las mejores condi-ciones higiénicas.

Huevos

Es un alimento que se caracteriza portransmitir Salmonella enteritidis debidotanto a la contaminación interna (micro-organismos acantonados en los oviductosde las gallinas que producen la contami-nación interna del huevo) como a la con-taminación externa (cáscara sucia y conexcrementos de las aves).

La importancia de la transmisión de la sal-monelosis por productos alimenticios encuya composición interviene el huevo estal que se ha prohibido la elaboración desalsas frías caseras (mayonesa) para su uti-lización en restaurantes y bares por unadisposición legal de carácter nacional (12).Solo se permite la utilización de mayo-nesas producidas, envasadas y pasteuri-zadas por empresas autorizadas.

Productos lácteos

Dado que la mayoría de los productos lác-teos que consumimos están tratados tér-micamente, la transmisión de enferme-dades de origen alimentario por estosresulta muy rara.

A pesar de todo se sigue consumiendolecha fresca y cruda (sin tratamiento culi-nario) que puede transmitir los siguientesmicroorganismos: S. aureus, B. cereus, Y.enterocolitica, L. monocytogenes, Brucellaspp.

Pescados y mariscos

Salvo que se capturen en aguas contami-nadas, los pescados frescos raramenteson fuente de microorganismos pató-genos para la salud humana. Los micro-organismos de interés en Salud Públicaque se asocian al pescado son Salmonellaspp., Staphylococcus spp., Escherichiacoli, Vibrio parahemolyticus, Clostridium

Figura 7. Carne de bovino (Mercado de Oviedo, fo-tografía de los autores).



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perfringens, Clostridium botulinum E yEnterovirus (13), que se encuentran fun-damentalmente en el de origen marino, yClostridium botulinum, implicado enbrotes de botulismo debidos al consumode pescado crudo escabechado.

La biota del pescado es fundamental-mente psicrótrofa y en el de origen ma-rino también es halofílica. Las contamina-ciones más importantes se deben a queel pescado, pero sobre todo el marisco, secría y recoge en aguas contaminadas.

En el pescado son importantes las toxiin-feciones alimentarias producidas porVibrio parahaemolyticus.

En los mariscos, Salmonella spp., Escherichiacoli, Vibrio parahaemolyticus, virus y mitilo-toxinas.

Alimentos vegetales

En cuanto a la transmisión de enferme-dades alimentarias, los productos alimenti-cios más significativos son los “vegetales te-rrestres”, es decir, los productos vegetalesque crecen a ras del suelo. La contamina-ción microbiana en estos casos puede serpor microorganismos de origen telúrico opor microorganismos procedentes de aguasno tratadas, como las aguas residuales.

Alimentos desecados

Se producen pocas toxiinfeciones, pero losmicroorganismos implicados suelen ser:

• Clostridium spp.

• Bacillus spp.Figura 8. Pescado y marisco (Mercado de Santander,fotografías de los autores).

Tabla 1. Principales fuentes de los microorganismos responsables de lastoxiinfecciones alimentarias.

Agente Fuente alimenticiaSalmonella spp. Carne, leche fresca y huevos.Clostridium perfringens Carne, alimentos desecados, especias.Staphylococcus aureus Comidas preparadas en frío, productos lácteos.Bacills spp. Cereales, alimentos desecados, productos lácteos,

carne, productos cárnicos, especias, frutas, verdurasy tubérculos.

Escherichia coli Alimentos crudos.Vibrio parahaemoliticus Pescado y marisco crudo y cocinado.Yersinia enterocolitica Carne cruda, leche, productos lácteos y vegetales.Campylobacter jejuni Carne cruda, leche fresca o sometida a un tratamiento

térmico inadecuado, agua no tratada.Listeria monocytogenes Carne, productos lácteos, vegetales y mariscos.Virus Mariscos crudos, alimentos no cocinados (ensaladas)

preparados por manipuladores infectados.



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Comidas rápidas (platos preparados yprecocinados)

Son platos con una compleja ecología mi-crobiana debido a los diferentes compo-nentes que tienen y a la laboriosidad ensu preparación, que implica una excesivamanipulación. Se suelen aislar los si-guientes microorganismos:

• Clostridium spp.

• Bacillus spp.

• Y. enterocolitica: en platos con carne.

• L. monocytogenes: en platos con carne.

Métodos rápidos de análisismicrobiológico de losalimentosLeotta (14) define como “método rápido”a cualquier método destinado a la detec-ción, el recuento, la caracterización y lasubtipificación de microorganismos (pa-tógenos y del deterioro) mediante el cualse obtienen resultados de manera sencilla,fiable y en menor tiempo que con los mé-todos convencionales.

La instauración de métodos rápidos de aná-lisis microbiológicos en laboratorios sedebe, sin lugar a dudas, a la economía detiempo; en nuestro laboratorio, donde laprontitud en la respuesta es esencial debidoa la operatividad que deben tener las dife-rentes unidades de las Fuerzas Armadas, hadado un resultado inmejorable.

Además, estos métodos tienen otras ven-tajas que ha determinado perfectamenteMachanie (15):

• Liberar rápidamente para el consumolotes de alimentos intervenidos sanitariao comercialmente: esta es una ventaja

considerable, sobre todo para la indus-tria alimentaria.

• Ahorrar coste financiero: debido a la in-movilización de partidas de alimentosmientras se están analizando.

• Ahorrar trabajo manual: es un factormuy importante frente a la Microbiologíatradicional de alimentos; un solo analistapuede procesar, en nuestro laboratorio,hasta 80 ensayos diarios. Todo estofrente a los 60 ensayos semanales de laMicrobiología tradicional, sin contar lapreparación de medios de cultivo, queimplicaría invertir un tiempo de 3 días yla preparación del material utilizado (au-toclaves, material de vidrio, tubos, cam-panas de Durham, matraces de diversotipo y tamaño, etc.), y, por supuesto, ellavado de este material y su correspon-diente esterilización, así como la gestiónde residuos biosanitarios, que es muchomás voluminosa (tabla 2).

• Racionalizar el recurso humano: el per-sonal técnico que antes se ocupaba delabores propias de análisis microbioló-gico tradicional de los alimentos puedededicarse a otras labores técnicas en ellaboratorio, y lo que es más importante,ampliar la cartera de servicios del labo-ratorio con la implantación de nuevastécnicas.

• Usar equipos semi o totalmente auto-máticos, con la facilidad que implica ala hora de manejarlos por medio delsoftware adecuado.

• Facilitar la ejecución de los ensayos: laimportancia radica en la simplicidad enla ejecución.

• Analizar cantidades importantes de ali-mentos.



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• Contribuir a realizar ensayos microbio-lógicos en momentos de crisis: como encasos de toxiinfecciones alimentarias, enlas que se necesita un resultado rápidopara poder tratar adecuadamente a laspersonas afectadas y localizar el ali-mento responsable del brote.

• Ahorrar espacio en almacenes.

• Facilitar la eliminación de residuos bio-lógicos por su menor volumen, lo queimplica un menor coste.

• Aumentar la velocidad de los análisis osu respuesta.

• Disponer de kits sensibles, precisos, conbuen límite de detección: en la actua-lidad, en nuestro laboratorio se hanacreditado por la Entidad Nacional deAcreditación (ENAC) ensayos realizadoscon Tempo®.

• Ahorrar espacio de los propios instru-mentos y aparatos de análisis por minia-turización.

No obstante, cabe señalar una serie dedesventajas, como son:

• En algunos casos se consideran descreening, ya que se deben confirmarlos resultados positivos de microbios pa-tógenos por Microbiología tradicional.

• Algunos métodos necesitan enri-quecer el analito que se busca antesde detectarlo: esto no es en sí unadesventaja y solo en las analíticas paradeterminación de patógenos por en-zimoinmunoensayo (método VIDAS®,bioMérieux) se invierte un tiempo con-siderable.

• Usualmente, costes algo más elevadosque los métodos tradicionales: esto noes del todo exacto, ya que existen mé-

Tabla 2. Comparación de los tiempos de análisis microbiológico entre técnicas deMicrobiología automatizada y tradicional.

Microorganismos Microbiología Microbiología Distribucióntradicional automatizada de tiempo según

Sistema Tempo®/VIDAS® el resultado: Microbiología tradicional

Aerobios mesófilos 72 horas 40 horastotalesMohos y levaduras 5 días 48 horas, incluido

2 horas en revitalizaciónEnterobacteriaceas 4 días 24 horas Si – 48 horas

Si + 4 díasColiformes 5 días 24 horas Si – 3 días

Si + 5 díasE. coli 5 días 24 horas Si – 2-3 días

Sí + 5 díasS. aureus 4 días 24 horas Si – 2 días

Si + 4 díasSalmonella spp. 6 días 48 horas (24 horas Si – 3 días

de revitalización) Si + 6 díasListeria spp. 3 días 48 horas Si – 2 días

Si + 3 días



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todos más baratos, sobre todo en elcaso de utilización del método del NMPpor Microbiología tradicional. No obs-tante, sería necesario realizar de uncoste por ensayo realizado.

• El horario del laboratorio podría modi-ficarse según el método: este sí es unode los inconvenientes importantes, yaque en muchos casos se amplían loshorarios del personal técnico de labo-ratorio.

• No siempre son flexibles; es decir, el kitno permite más de un tipo de uso.

• No siempre hay disponibilidad regularde los kits en el mercado: este aspecto,junto con la exclusividad de las casas co-merciales respecto al método de en-sayo, ha hecho que tengamos que dis-poner de alternativas que se puedanusar rápidamente, manteniendo ennuestro caso los ensayos microbioló-gicos por método clásicos.

• Algunos métodos también detectan losmicroorganismos muertos.

Técnicas de análisis rápidoen Microbiología de los alimentos

Con relación a los diferentes métodos deMicrobiología rápida, el estudio realizadopor la Dra. Martín de Santos (16) es el

más completo, si bien existen otras clasi-ficaciones más generales, pero siemprebasadas en la clasificación por funda-mentos técnicos de análisis.

A continuación enumeramos los que es-tamos utilizando dentro de nuestro ám-bito de trabajo, como laboratorio de re-ferencia en seguridad alimentaria delMinisterio de Defensa.

Recuentos de células viables

• Sistema Iso-Grid (QA laboratories Ltd.,San Diego, Calif., EE.UU.): está acep-tado por la Association of OfficialAnalytical Chemists International(AOAC International) para la enumera-ción de bacterias, mohos y levaduras enmuchos tipos de alimentos.

Este sistema lo estamos utilizando paraanálisis microbiológico de aguas de con-sumo humano y se encuentra acredi-tado por ENAC, con unas ventajas con-siderables en tiempo de trabajo,simplicidad a la hora de realizarlo, perocon periodos de incubación muy pare-cidos a los empleados en Microbiologíatradicional.

• Sistema Petrifilm (3M Co., St. Paul, Minn.,EE.UU.): utiliza medios de cultivo deshi-dratados sobre películas plásticas de ta-maño y grosor similares al de una tarjeta.

Figura 9. Utilización del Sistema Iso-Grid en el Servicio de Bromatología y Seguridad Alimentaria (fotografía de losautores).



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Existen equipos para la lectura automati-zada de los resultados (lector de placas3M Petrifilm, 3M®). Este método es muyutilizado en la monitorización de los pro-tocolos de limpieza y desinfección (L + D),como parte de los prerrequisitos de lossistemas de APPCC. Se han realizado es-tudios comparativos del uso de los me-dios tradicionales y del sistema Petrifilmpara Staphylococcus spp., no hallando di-ferencias significativas (p > 0,05) entre losrecuentos medios, realizados en lechecruda y queso fresco contaminados concepas de Staphylococcus spp. coagulasapositivos (19), para los sistemas de ensayocomparados.

Sistemas miniaturizados y kits dediagnóstico

• Los sistemas miniaturizados surgen apartir del concepto de placa microtitula-dora (96 pocillos, formato 8 x 12); es unsistema muy utilizado para la identifica-ción de microorganismos hasta el nivelde especie.

• Para la automatización del método delNMP se han desarrollado tarjetas dematerial plástico que contienen tresgrupos de 16 pocillos, con un loga-

ritmo de diferencia en volumen paracada grupo de pocillos, y medios decultivo con indicadores fluorescentes(Tempo®, bioMérieux, Hazelwood, Mo,EE.UU.).

Es un sistema que nuestro laboratorioha acreditado por ENAC y que estádando unos magníficos resultados encuanto a la rapidez de respuesta en aná-lisis de alimentos que consumen los mi-litares españoles en operaciones en elextranjero.

Las ventajas frente a la Microbiología tra-dicional se han definido en la tabla 2.

Figura 10.Sistema API (bioMérieux Hazelwood, Mo,EE.UU.). Galerías que permiten la identificación demás de 800 especies de bacterias y levaduras comoSalmonella spp. (fotografía de los autores).

Figura 11. Sistema Tempo®: determinación de indicadores microbiológicos de calidad y de sanidad.



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Equipos de medida de la biomasa mi-crobiana

• Bioluminiscencia o medida del ATP: seestá utilizando este tipo de equipospara monitorización de limpieza y de-sinfección en servicios de restauracióncolectiva del Ejército de Tierra.

• Turbidimetría: la turbidimetría o nefe-lometría es una técnica utilizada paraevaluar el crecimiento de un cultivomicrobiano. Se basa en la propiedadde las partículas de pequeño tamañode refractar la luz incidente. Dentro deciertos límites, existe una relaciónentre la cantidad de luz que atraviesauna suspensión celular y el número demicroorganismos presentes en ella. Esimportante destacar que en el año2004 se leyó una tesis doctoral reali-zada en nuestro Servicio de Broma-tología y Seguridad Alimentaria cuyafase experimental se basó en estatécnica.

Técnicas inmunológicas

Sistema VIDAS® (bioMérieux, Ha-zelwood, Mo, EE.UU.), que permitecompletar la reacción de ELISA entre 45minutos y 2 horas dependiendo del mi-croorganismo diana o toxina que se pre-tenda detectar. Puesto que la técnica in-corpora un sistema de detecciónfluorescente recibe el nombre de ELFA(Elisa Linked Fluorescent Assay). Ennuestro laboratorio está dando unosmagníficos resultados. En la tabla 1 secomparan los tiempos de análisis entreesta técnica y las equivalentes deMicrobiología tradicional.

Técnicas de Biología Molecular

Reacción en cadena de la polimerasa(PCR) en tiempo real: se trata de unatécnica basada en la amplificación delADN de los microorganismos diana, conel fin de disponer de una cantidad sufi-ciente que permita su detección. Es unatécnica específica, sensible y rápida.

Los procedimientos de análisis de ADNmediante PCR constan de tres etapas: pu-rificación del ADN, amplificación de las se-cuencias específicas y detección de losproductos de amplificación.

En la PCR a tiempo real se emplean dostipos de sistemas de detección por fluo-rescencia: agentes intercalantes y sondasespecíficas marcadas con fluorocromos.Los agentes intercalantes son fluoro-cromos que aumentan notablemente laemisión de fluorescencia cuando se unena una molécula de ADN de doble hélice.El más empleado es el SYBR® Green I. Lafluorescencia emitida se incrementa demodo proporcional al ADN que se formaen cada ciclo de PCR. Este sistema tienela ventaja de ser más barato que lassondas específicas; sin embargo, tienecomo inconveniente su baja especificidad,

Figura 12. Equipo MINIVIDAS® del Servicio deBromatología y Seguridad alimentaria del CEMILVET(fotografía de los autores).



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puesto que se unen de manera indistintaa productos que se pueden generar ines-pecíficamente o a dímeros de los propiosoligocebadores de la reacción.

Las sondas de hibridación específicas semarcan con dos tipos de fluorocromos: undonador y un aceptor. El proceso se basaen la transferencia de energía fluorescentemediante resonancia (FRET) entre las dosmoléculas. Las más utilizadas son las sondasde hidrólisis, también conocidas comosondas TaqMan®. Gracias a la alta especifi-cidad de los cebadores y las sondasTaqMan® es posible distinguir el patógenode estudio entre las especies filogenética-mente más relacionadas en el alimento, porlo que su uso es el más extendido en lacuantificación de bacterias (17).

Las sondas TaqMan® son oligocebadoresmarcados con un fluorocromo donador enel extremo 5´ que emite fluorescencia al serexcitado y un aceptor o apantallador en elextremo 3´ que absorbe la fluorescencia li-berada por el donador. La ADN polimerasase desplaza sobre la cadena de ADN, sinte-tizando la hebra complementaria a partirde un fragmento de ADN que sirve demolde. Como consecuencia de la actividad5´-3´ exonucleasa de la polimerasa, se pro-duce la hidrólisis de la sonda, la separaciónfísica de los dos fluoróforos y un aumentoen el rendimiento cuántico que permite lacuantificación del producto acumulado encada ciclo.

En la PCR en tiempo real se cuantificaciclo a ciclo el producto de la reacción,para lo que se requieren sistemas de de-tección sensibles que permitan mostrar laacumulación de productos en la fase ex-ponencial de la reacción (momento en elque existe una buena correlación entre

concentración de producto amplificado yconcentración inicial de moléculas diana).

El parámetro que se emplea en la cuan-tificación es el ciclo umbral (Ct), definidocomo el número de ciclos necesariospara generar una señal estadísticamentesignificativa por encima de la señal deruido. La cuantificación se basa en quecuanto mayor sea la concentración desecuencia diana, antes se alcanzará el Ct.Cuando la eficiencia es constante, elciclo umbral es inversamente propor-cional al logaritmo de la cantidad inicialde moléculas (18).

Los valores Ct obtenidos con cantidadesconocidas de la secuencia diana se usanpara establecer una recta de calibrado,que permite calcular la concentración ini-cial de secuencia diana en la muestra pro-blema.

Las principales ventajas de la PCR entiempo real son:

• Minimiza el riesgo de contaminación,puesto que la amplificación y la detec-ción se realizan en el mismo tubo.

• Intervalo amplio de concentraciones deensayo.

• Alta capacidad de procesamiento.

• Tiempos de análisis cortos.

Respecto a estos dos últimos sistemas des-critos (VIDAS® y PCR), se han realizadoevaluaciones a partir de muestras conta-minadas naturalmente con S. aureus coa-gulasa positivo (20), empleando los mé-todos cuantitativos clásicos de agarBaird-Parker, agar plasma de conejo y elsistema Petrifilm. Las colonias de morfo-logía típica aisladas se estudiaron por elsistema VIDAS® y la PCR-rt; estos últimospresentaron mejor rendimiento para la



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identificación de toxina del Staphylococcusaureus en comparación con los mediostradicionales descritos anteriormente, in-cluyendo una mayor frecuencia de toxina-positivos en colonias aisladas y mejores ín-dices de correlación entre los recuentostípicos y los ya mencionados toxina-posi-tivos. Entre todos los medios de cultivoevaluados, no hubo diferencia significativa(p > 0,05).

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Figura 13. Equipo PCR-rt del Servicio de Bromatologíay Seguridad Alimentaria del CEMILVET (fotografía delos autores).

Figura 14.

ECOLOGÍA MICROBIANADE LOS ALIMENTOS

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICODE LOS ALIMENTOS

Sistemas de análisis rápidoy automatizado

APPCC

ALIMENTOS SANITARIAMENTESEGUROS Y, POR LO TANTO, AUSENCIADE ENFERMEDADES DE TRANSMISIÓN

ALIMENTARIA

• Identificación de peligros• Gestión de riesgos• Establecimiento de PCC

• Monitorización de APPCC• Verificación de PCC• Establecimiento de PCC



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5. International Comission on MicrobiologicalSpecifications for Foods (ISMSF). EcologíaMicrobiana de los Alimentos 1. Factores queafectan a la supervivencia de los microorga-nismos de los alimentos. Editorial Acribia.1980; vol. I.

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ResumenCon cientos de millones de prescripcionesanuales, los antibióticos beta-lactámicosson unos de los medicamentos más fre-cuentemente empleados en la MedicinaHumana y Veterinaria a nivel mundial. Lasíntesis de penicilina se lleva a cabo porun número limitado de hongos ascomi-cetos de los géneros Aspergillus yPenicillium. Dentro de este último génerose incluye al productor industrial de peni-cilina, Penicillium chrysogenum. La peni-cilina no fue descubierta mediante sofis-ticados sistemas de selección y análisis decompuestos, sino por un científico que alvolver de vacaciones se dio cuenta delpoder antibacteriano que ejercía unhongo (poco después se sabría que eraPenicillium notatum) que por casualidadhabía contaminado una placa de Petrisembrada con Staphylococcus aureus.Recientemente, se han cumplido 80 añosdesde que Alexander Fleming hizo estedescubrimiento, logrando así uno de loshitos más importantes que han marcadola historia reciente de la medicina.

La tremenda colaboración existente entreuniversidades y laboratorios de Inglaterray Estados Unidos durante la SegundaGuerra Mundial dio lugar a ensayos clí-nicos de gran escala con la penicilina paratratar a los heridos en batalla. El interésde las empresas farmacéuticas por el pro-ducto llevó a la búsqueda de cepas del

hongo productor que tuviesen mayoresrendimientos en la producción de antibió-tico. Tras el aislamiento de P. chryso-genum NRRL 1951 a partir de un melónen un mercado local de Peoria (IL, EE.UU.)hace casi siete décadas, los programas in-dustriales de mutagénesis clásica y selec-ción han dado lugar al desarrollo de cepasindustriales con una productividad au-mentada en al menos tres órdenes demagnitud respecto al aislado inicial. Estascepas industriales han sufrido numerososcambios durante este largo proceso. Úni-camente unos pocos de estos cambios sehabían caracterizado hasta la llegada dela era de las “ómicas“ estos últimos años.Tras la publicación del genoma de P. chry-sogenum en el año 2008, se aportó infor-mación relevante acerca de los aspectosreguladores y del desarrollo que controlanlos procesos moleculares que se encuen-tran detrás de la síntesis del fármaco mi-lagroso del siglo XX, la penicilina. Además,estudios más recientes de proteómica ymetabolómica han proporcionado la clavepara comprender los mecanismos mole-culares subyacentes del proceso de me-jora de cepas. Estos estudios han reveladoque el incremento en la producción porparte de las cepas industriales de P. chry-sogenum es consecuencia de un cuida-doso reequilibrio entre diversas rutas me-tabólicas, mostrando así la versatilidad deeste hongo filamentoso para la produc-ción de antibiótico.

Bases moleculares de la producción deantibióticos beta-lactámicosDr. Carlos García Estrada


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Introducción a los antibióticosbeta-lactámicosEl descubrimiento de los antibióticos fueuno de los avances más trascendentalesen la historia de la medicina, puesto quecon ellos se ha podido hacer frente a lasenfermedades infecciosas que han cau-sado la muerte de millones de seres hu-manos a lo largo de la historia de la hu-manidad, consiguiendo estos reducirdrásticamente el índice de mortalidad.

Los antibióticos (palabra de origen griegoque significa anti: contra y bios: vida; esdecir, inhibidores de la vida de otros seresvivos) pueden definirse como sustanciasquímicas orgánicas de bajo peso mole-cular producidas por microorganismosque son capaces de inhibir selectiva-mente, a bajas concentraciones, el creci-miento de otros microorganismos(Waksman, 1947). Estos compuestos sonmayoritariamente sintetizados una vezque la densidad del cultivo del microorga-nismo productor llega a su valor máximo,a su vez coincidiendo con una velocidadespecífica de crecimiento baja. Por estemotivo y en función de que son com-puestos no indispensables para la viabi-lidad del microorganismo productor, los

antibióticos son considerados como me-tabolitos secundarios. La función bioló-gica de estos compuestos en los microor-ganismos productores se atribuyegeneralmente a que confieren una ven-taja ecológica cuando dichos microorga-nismos deben competir con otros por losnutrientes del medio ambiente (Martín yDemain, 1980).

Clasificación y estructura química delos antibióticos beta-lactámicos

Los antibióticos beta-lactámicos se in-cluyen dentro de los antibióticos de tipopeptídico. Se pueden clasificar según suestructura química en cinco grupos(tabla 1) (O´Sullivan y Sykes, 1986;Aharonowitz y col., 1992). La caracte-rística estructural común a todos ellos esun anillo beta-lactámico de cuatromiembros, formado por la condensaciónno ribosómica de tres aminoácidos:L-valina, L-cisteína y ácido L-α-aminoa-dípico. Exceptuando las monolactamas,que solo presentan el anillo beta-lactá-mico, estos compuestos están formadospor un sistema bicíclico, siendo la es-tructura de este segundo anillo la quepermite su clasificación.

Tabla 1. Clasificación de los antibióticos beta-lactámicos según su estructura química.

Estructura química Antibióticos Microorganismos productoresHongos Bacterias

Gram+ Gram–

Penicilinas P. chysogenumP. notatumA. Nidulans

Cefalosporinas A. chysogenumP. persinicus Flavobacterium sp.

Cefamicinas S. clavuligerus L. lactamgenusCefabacinas N. lactamdurans

RO

O

S

COOH

CH3

CH3

NH

N

R R

OO

S

COOH

CH2R

NH

N

Penam

Ceph-3-em

Bases moleculares de la producción de antibióticos beta-lactámicos

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En el caso de las penicilinas, el núcleo cen-tral es el 6-APA, formado por el anillo beta-lactámico asociado a un segundo anillo tia-zolidínico. Sin embargo, las cefalosporinas

y las cefamicinas contienen como núcleocentral el ácido 7-aminocefalosporánico,formado por el anillo beta-lactámico unidoa un anillo dihidrotiazínico (figura 1).

Tabla 1. Clasificación de los antibióticos beta-lactámicos según su estructura química(continuación).


Gram+ Gram–

Ácido S. clavuligerusclavulánico

Tienamicinas S. clavuligerus E. carotovoraÁcidos olivánicos S. olivaceus Serratia sp.Epitienamicinas

Nocardicinas N. uniformisSubsp. Tsuyamanensis

Monobactamas E. radiobacterP. acidophila

R

RO

O

HN

HClavam

COOH

RR

O

HN

HCarbapenem

R R

O

H

N

N

SO3H

COOH

R

O

H

H

N

N OH

O

O

Monolactam

Figura 1. Estructura química general de penicilinas y cefalosporinas.

R N

NO

O

S

COOH

H

Anillo tiazolidínico

Anillo ß-lactámico

N

N

R

O

O

S

COOH

H

Anillo dihidrotiazínico


R

Penicilinas Cefalosporinas


60

Los antibióticos beta-lactámicos poseencadenas laterales (la R indica las diferentescadenas laterales), que confieren un ca-rácter hidrofílico o hidrofóbico; así, al-gunas penicilinas son de carácter hidrofó-bico al presentar una cadena lateral deácido fenilacético (penicilina G o bencil-penicilina) o ácido fenoxiacético (penici-lina V), mientras que otras presentan unacadena lateral hidrofílica de ácido L-α-aminoadípico (isopenicilina N).

Las penicilinas con una cadena lateral hi-drofóbica son exclusivamente sintetizadaspor hongos filamentosos, como es el casode especies del género Penicillium (P. chry-sogenum, P. nalgiovense y P. griseo-fulvum). Sin embargo, la producción deantibióticos beta-lactámicos de tipo hidro-fílico tiene lugar en hongos filamentosos,como Acremonium chrysogenum, y enmuchos actinomicetos, como especies delgénero Streptomyces sp., además de al-gunas especies bacterianas gramnegativas(Aharonowitz y col., 1992).

Algunas de las penicilinas son producidasde forma natural por los microorganismosque las sintetizan. A partir de las produ-cidas naturalmente pueden sintetizarsequímicamente otras penicilinas de mayorinterés farmacéutico que se denominanpenicilinas semisintéticas (ver más ade-lante).

Mecanismo de acción de losantibióticos beta-lactámicos

Los antibióticos beta-lactámicos sonagentes bactericidas que bloquean la úl-tima etapa en la síntesis de la pared ce-lular: el entrecruzamiento de las distintascadenas del peptidoglicano, que es uncomponente indispensable de la pared ce-

lular bacteriana que consta de cadenas depolisacáridos lineales que están entrecru-zadas con péptidos cortos.

La penicilina inhibe las enzimas DD-transpeptidasa y DD-carboxipeptidasa,proteínas llamadas “PBP“ (penicillin bin-ding proteins) o de unión a penicilina,responsables de dicho entrecruzamiento,llegando al centro activo de estas porquese confunden con el sustrato normal delas enzimas, el compuesto acil-D-alanina-D-alanina, mimetizándolo en la reacciónde entrecruzamiento. Estas penicilinil-en-zimas ya no reaccionan más y, por lotanto, quedan inhibidas de forma irre-versible. Esto provoca que la pared ce-lular se vuelva osmóticamente sensible,con la consiguiente autolisis de la bac-teria (Giesbrecht y col., 1991; Frère ycol., 1993). Además, estos antibióticosdesencadenan la activación de hidrolasasde la pared celular y de autolisinas, loque conduce a la lisis celular (Kong et al.,2010).

La actividad de estos antibióticos esmucho mayor frente a bacterias grampo-sitivas que frente a gramnegativas. La ex-plicación a esta diferencia en la actividadse encuentra en el diferente porcentaje depeptidoglicano en la composición de lapared celular de ambos grupos. Mientrasque el peptidoglicano es el componentemayoritario de la pared celular de las bac-terias grampositivas, constituye solo unafina capa en la pared celular de las bacte-rias gramnegativas. En todo caso, el es-pectro de actuación se ha ido ampliandoa lo largo de los años con la incorporaciónde nuevas moléculas que poseen unamayor actividad frente a los microorga-nismos Gram negativos.


61

Farmacocinética de las penicilinas

Las penicilinas naturales son antibióticostiempo-dependientes. La dosis de penici-lina que se administra es de 10.000 a20.000 UI/kg. Con esto se obtiene unaconcentración del antibiótico en el plasmade 2 μg/ml. Tras la administración paren-teral intramuscular o subcutánea, las peni-cilinas se absorben rápidamente, se distri-buyen a casi todo el organismo y alcanzanniveles muy altos en pulmones, riñones,útero, ubre e hígado. No atraviesan la ba-rrera placentaria, ni el peritoneo ni lapleura. Tras su aplicación intrauterina, seabsorbe al torrente sanguíneo y difunde ala glándula mamaria.

La penicilina G sódica y la penicilina G po-tásica son las de más rápida absorción, al-canzan niveles terapéuticos en 15-30 mi-nutos y su vida media se prolonga hasta 60minutos después de su aplicación. La pe-nicilina G procaínica alcanza niveles tera-péuticos a las 4 horas y tiene una vidamedia de 24 horas. La penicilina G benza-tínica es una combinación de la bencilpe-nicilina con benzatina, para que se absorbalentamente desde el punto de inyección.Es una opción cuando se requiere de tra-tamientos prolongados. Alcanza su má-xima absorción a las 24 horas, con nivelesséricos que permanecen hasta 48 horasdespués de la inyección.

Las penicilinas se eliminan sin ser biotrans-formadas, no son metabolizadas o solomínimamente metabolizadas y son excre-tadas en un 80% por los riñones y en un20% por otras vías, que incluyen el hí-gado y la glándula mamaria.

Las penicilinas son inestables ante la tem-peratura y la luz solar, son higroscópicas,se hidrolizan rápidamente, se oxidan fá-

cilmente y son sensibles a las variacionesde pH.

Penicilina: descubrimiento y caracterización

Aunque el año que se suele tomar comopunto de partida de la historia de los an-tibióticos es el del descubrimiento de lapenicilina (1928), ya en el siglo XIX algunosinvestigadores, como Cornil y Babés(1885), llevaron a cabo experimentos conmicroorganismos vivos sobre antago-nismo microbiano, sugiriendo que existiríaun agente inhibidor de naturaleza quí-mica producido por uno de los microor-ganismos que interferiría en el creci-miento del otro, denominando a estefenómeno con el nombre de antibiosis.Algo más tarde, otros investigadores,como Ernest Duchesne y Andre Gratia,también observaron el efecto de antibiosisejercido entre hongos y bacterias.

En septiembre de 1928, AlexanderFleming, profesor de bacteriología del St.Mary´s Hospital de Londres, estaba inten-tando aislar la bacteria Staphylococcusaureus. Para este propósito desarrolló labacteria en placas de cultivo y cuando ob-servó estas después de un periodo cortovacacional, apreció la contaminación dealguna de ellas con un hongo. Las placascontaminadas deberían haber sido des-cartadas; sin embargo, Fleming se diocuenta de la ausencia de crecimiento debacterias alrededor de las colonias delhongo que contaminó accidentalmentelos cultivos bacterianos.

Fleming aisló el hongo y lo identificó,viendo que se trataba del géneroPenicillium; por su morfología concluyóque era Penicillium rubrum y denominó al


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compuesto capaz de inhibir el crecimientode las bacterias “penicilina“. Tratóademás de concentrar y purificar el anti-biótico, pero encontró que la penicilina sedestruía fácilmente y todos los intentos ypropósitos fracasaron. El hallazgo deFleming fue publicado el 10 de mayo de1929 en el British Journal of ExperimentalPathology (Fleming, 1929). El artículo des-cribe una extensa serie de experimentosdonde se establece claramente el poten-cial de la penicilina como agente terapéu-tico. El artículo de Fleming describiendola penicilina no causó mucho interés alprincipio, y el descubrimiento quedó re-ducido a una mera observación, mante-niéndose desconocido fuera del círculocientífico. Solo unas pocas publicacionesreferentes a la penicilina aparecieron enlos siguientes 10 años, siendo la más im-portante la que identificó correctamenteel hongo aislado por Fleming comoPenicillium notatum en lugar de P. rubrum(Clutterbuck y col., 1932).

Un segundo capítulo en la historia de lapenicilina comenzó en el año 1938,cuando el médico patólogo australianoHoward Walter Florey y el bioquímico deorigen alemán Ernst Boris Chain, juntocon el británico Norman Heatley, iniciaronuna investigación detallada de las propie-dades terapéuticas de la penicilina. Floreyse ocupó de los aspectos biológicos y far-macológicos, Chain se ocupó de las pro-piedades químicas y bioquímicas y Heatleyse ocupó de la producción, de cómo cul-tivar la mayor cantidad posible del micro-organismo para que produjese gran can-tidad del principio activo y, finalmente, desepararlo del caldo de cultivo y purificarlo.

Fruto de este trabajo se consiguió aislar elantibiótico con una pureza aceptable me-

diante las nuevas técnicas cromatográ-ficas en columna. En agosto de 1940 sedescribieron métodos para la producciónde la penicilina y la utilización con éxitodel antibiótico para curar infecciones enratones (Chain y col., 1940). El éxito deestos experimentos iniciales permitiótomar la decisión de llevar a cabo elprimer ensayo clínico en humanos.

La importancia médica de la penicilina,gracias a los buenos resultados obtenidos,fue comprendida de inmediato. Debido alconflicto de la Segunda Guerra Mundial,Florey y Heatley fueron a los EstadosUnidos y convencieron al Departamentode Agricultura Americano (USDA) y a va-rias compañías farmacéuticas (CharlesPfizer & Co., E.R. Squibb & Sons, y Merck& Co., entre otras) para que produjesenpenicilina. La mejora del proceso y su pro-ducción a escala industrial fue llevada acabo en los Estados Unidos en el NorthernRegional Research Laboratory (NRRL) dePeoria, Illinois. En agosto de 1941,Abraham y colaboradores (1941) descri-bieron en detalle las condiciones idealespara la producción de penicilina engrandes cantidades. El descubrimiento dela penicilina y el desarrollo de un métodode producción masiva supuso la conce-sión del Premio Nobel de Medicina yFisiología en el año 1945 a los científicosSir Alexander Fleming, Ernst Boris Chainy Sir Howard Walter Florey.

Las innovaciones más relevantes en la pro-ducción de penicilina a gran escala fueronel aislamiento y selección de nuevas cepasy la optimización del proceso de fermen-tación, sustituyendo el cultivo en super-ficie por cultivos sumergidos (Moyer yCoghill, 1946a, b), la utilización de líquidode maceración de maíz como fuente de


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nitrógeno y la adición de precursores dela cadena lateral, tales como el ácido fe-nilacético (Moyer y Coghill, 1947). El in-cremento de la producción también fueposible gracias al desarrollo de la tecno-logía del proceso industrial, introduciendomejoras como la ingeniería de aireación yel sistema de mezclado en fermentadores.Paralelamente a las investigaciones desti-nadas a producir penicilina a gran escala,se llevaron a cabo estudios que permi-tieron determinar la estructura química dela penicilina (Clarke y col., 1949).

El ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) fuedetectado en fermentaciones en el año1957 y aislado en forma pura 1 año mástarde (Batchelor y col., 1959). Este ha-llazgo fue el punto de partida para el de-sarrollo de las penicilinas semisintéticasmediante la incorporación de diferentescadenas laterales al núcleo de 6-APA porun proceso químico (ver apartado másadelante).

Mejora de cepas productorasde penicilina

La cepa original de Penicillium aislada porFleming y que fue designada como P. no-tatum NRRL-1249 producía alrededor de2-3 μg/ml de penicilina. En la búsquedapor conseguir cepas con un incrementoen los títulos de penicilina se enviaronmuestras de tierra de todas partes delmundo (recogidas durante la SegundaGuerra Mundial) al Northern RegionalResearch Laboratory (NRRL) de Peoria,Illinois, donde fueron analizadas, consi-guiéndose cepas que incrementaban laproducción de penicilina en cultivos su-mergidos.

Sin embargo, la mejor cepa aislada fuehallada en Peoria a partir de un melón en-mohecido obtenido en el mercado local.Esta cepa fue designada como P. chryso-genum NRRL-1951, la cual presentabamayor capacidad de producción (0,25 mM;60 μg/ml) que la cepa de Fleming y eramás adecuada para cultivos sumergidos(Raper, 1946). A partir de la cepa P. chry-sogenum NRRL-1951 y por mutagénesisal azar utilizando mutágenos tanto físicos(luz UV, rayos X) como químicos (nitroso-guanidina), se fueron obteniendo suce-sivas cepas que se seleccionaron según sumayor producción. Tras varios pasos demutación se consiguió aislar la cepa WisQ-176 con un título de hasta 1.000 μg/mlde penicilina. Esta cepa fue adoptada porla mayor parte de los fabricantes de peni-cilina y fue la original de la conocida líneaWisconsin en los distintos programas demejora de cepas (Backus y Stauffer,1955).

Dichos programas han conseguido au-mentar la productividad más de 1.000veces (Lein, 1986; Elander, 2003). No soloha sido importante el aumento del rendi-miento en el desarrollo de las cepas, sinoque también han sido optimizados otrosfactores que tienen un efecto muy impor-tante sobre la recuperación del producto,como, por ejemplo, la eliminación de pig-mentos que se purificaban junto con lapenicilina.

Aparte de la Universidad de Wisconsin, al-gunas compañías farmacéuticas desarro-llaron sus propios programas industrialesde mejora de cepas con el fin de obtenercepas de alta producción de penicilina. Sinembargo, se disponen de pocos datosacerca de dichos programas. Por ejemplo,Panlabs Inc. (Taiwán) comenzó el programa


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con las cepas P1 y P2, ambas derivadas dela cepa Wis Q-176 (Lein, 1986); la empresaholandesa DSM, con sede en Delft, desa-rrolló la cepa DS04825 a partir de laWisconsin 54-1255 (Gouka y col., 1991);Wyeth Lab (West Chester Pa, EE.UU.) de-sarrolló las cepas M (obtenidas a partir dela cepa Wisconsin 51-20 strain, uno de losancestros de Wisconsin 54-1255), yAntibióticos S.A. (León, España) produjolas cepas AS-P-78, AS-P-99 y E1 a partir dela familia de cepas Wisconsin (Fierro y col.,1995). Los mutantes superproductores quese emplean actualmente por la industriapueden alcanzar títulos de más de 50mg/ml (83.300 u.i./ml) en fermentacionesindustriales (Peñalva y col., 1998).

Biosíntesis de penicilina

La ruta de biosíntesis de penicilina ha sidoestudiada en detalle a nivel molecular ybioquímico (Martín y col., 2010). En la fi-gura 2 se muestra un esquema de la rutabiosintética de penicilina con las activi-dades enzimáticas implicadas en cada unade las tres etapas.

El primer paso consiste en la formación deltripéptido ACV: δ-(L-α-aminoadipil)-L-cis-teinil-D-valina por condensación no ribo-sómica de los tres aminoácidos que lo con-forman (ácido L-α-aminoadípico, L-cisteínay L-valina), llevada a cabo por la enzimaACV sintetasa (ACVS). El segundo paso dela vía biosintética es la ciclación oxidativadel tripéptido ACV para dar lugar al com-

Figura 2. Ruta biosintética de penicilina en P. chrysogenum.

L-α-aminoadípico L-cisteína L-valina

COOH

SHH2N

COOH

H2NCOOHCOOH

H2N L

H

ACV sintetasapcbAB (acvA)

COOH

COOH OO

NH

SH

NH

H2NH

Isopenicillin N

δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina(LLD-ACV)

Isopenicilina N sintasapcbC (acvA)

COOHCOOH O

O

NH

S

N

H2N L

H

COOH

OO

NH

S

N COOHO

S

N

H2N

6-APA

Isopenicilina Naciltransferasa

penDE (aatA)

PAA-CoA

L-α-aminoadípico L-α-aminoadípico

PAA-CoAHS-CoA

Bencilpenicilina


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puesto isopenicilina N (IPN), ya con unadébil actividad antibiótica. La enzima res-ponsable de la ciclación es la isopenicilinaN sintasa (IPNS), también denominada ci-clasa. El paso final de la biosíntesis de pe-nicilinas consiste en la sustitución de la ca-dena lateral de L-α-aminoadípico por unácido orgánico activado mediante coen-zima A (CoA), que en el caso de la bencil-penicilina es el ácido fenilacético. Este úl-timo paso es llevado a cabo por la enzimaacil-CoA: isopenicilina N aciltransferasa(IAT).

Genes y proteínas biosintéticos

El gen pcbAB y la ACVS

El gen que codifica la enzima ACVS fuedenominado pcbAB porque se suponíaque eran dos los genes implicados en labiosíntesis de L-α-aminoadipil-L-cisteinil(AC) en primer lugar y ACV a continua-ción (Martín y col., 1990). Algunas evi-dencias genéticas posteriores demos-traron la existencia de un único gen quecodifica una única enzima que contienetodas las actividades necesarias para labiosíntesis de ACV. Estudios transcripcio-nales revelaron la existencia de un ARNmensajero de aproximadamente 11,5 kb,tamaño que fue confirmado al secuen-ciarse el gen y comprobarse la existenciade un ORF (Open Readin Frame) de11.376 pb, que codifica una proteína de3.792 aminoácidos con un peso mole-cular deducido de 426 kDa. Este gen hasido clonado en P. chrysogenum (Díez ycol., 1990; Smith y col., 1990). El ORF deeste gen no está interrumpido por ningúnintrón y en su secuencia se observa la pre-sencia de tres regiones repetidas o mó-dulos. Cada uno de estos módulos pre-

senta una gran similitud a dominios depéptido sintetasas de Bacillus brevis,además de regiones de unión a 4´-fosfo-panteteína similares a las de policétido yácido graso sintetasas (Martín, 2000a).

La ACVS es una enzima multimérica conun peso molecular de 426 kDa. Los mó-dulos que la conforman presentan las di-ferentes actividades catalíticas necesariaspara realizar la síntesis del tripéptido ACV:reconocimiento y activación de los tresaminoácidos precursores (L-valina, L-cis-teína y L-α-aminoadípico), formación delos enlaces peptídicos, isomerización dela L-valina a D-valina y tioesterificaciónpara liberar el tripéptido formado. Estaenzima ha sido purificada a partir de P.chrysogenum (Theilgaard y col., 1997).

El gen pcbC y la IPNS

El gen que codifica la IPNS se denominapcbC, tiene un tamaño de 1 kb, su se-cuencia no se encuentra interrumpida porningún intrón y se clonó a partir de P.chrysogenum en la década de 1980 (Carry col., 1986; Barredo y col., 1989a).

La enzima codificada por este gen (IPNS)tiene una masa molecular de 48 kDa. Parallevar a cabo la reacción de ciclación deltripéptido ACV que origina el anillo beta-lactámico, esta enzima requiere Fe+2 yoxígeno molecular como cofactores y as-corbato como donador de electrones. Laciclasa ha sido purificada a partir de P.chrysogenum (Ramos y col., 1985; Carr ycol., 1986).

El gen penDE y la IAT

El último paso en la biosíntesis de bencilpe-nicilina está catalizado por la enzima acil-transferasa. En este paso se produce el in-tercambio de la cadena lateral de


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L-α-aminoadípico de la isopenicilina N porun ácido activado en forma de acil-CoA. Seha propuesto un proceso de dos pasos en-zimáticos (Queener y Neuss, 1982). Enprimer lugar, una actividad amidohidrolasaelimina la cadena lateral de L-α-aminoadi-pato de la isopenicilina N generando 6-APA, y a continuación, una actividad acil-CoA: 6-APA-aciltransferasa incorpora lanueva cadena lateral activada. Estas dos ac-tividades enzimáticas residen en una pro-teína heterodimérica (Tobin y col., 1990,1993; Álvarez y col., 1993) denominadaIAT. La forma activa de la enzima IAT resultadel procesamiento del precursor monomé-rico de 40 kDa a un heterodímero que con-tiene dos subunidades: una de 11 kDa (su-bunidad α correspondiente a la regiónamino terminal) y otra 29 kDa (subunidadβ correspondiente a la región carboxilo ter-minal).

En P. chrysogenum, se ha conseguido pu-rificar la subunidad de 29 kDa de la IAT(Álvarez y col., 1987), mientras que enAspergillus nidulans (otro hongo pro-ductor de penicilina) se han purificado lasdos subunidades (Whiteman y col., 1990).Ambas subunidades están codificadas porun único gen denominado penDE (Tobiny col., 1990, 1993). Dicho gen ha sidoclonado en P. chrysogenum (Barredo ycol., 1989b; Tobin y col., 1990) y en A. ni-dulans (Montenegro y col., 1990; Tobin ycol., 1990).

En contraste con los otros genes de la bio-síntesis de penicilina, el gen penDE con-tiene tres intrones en similares posicionesen ambos organismos (Barredo y col.,1989b; Tobin y col., 1990; Fernández-Cañón y Peñalva, 1995). La presencia deintrones indica un posible origen fúngico(Aharonowitz y col., 1992), aunque este

aún no está claro, ya que no se conocenanálogos cercanos en organismos euca-riotas o procariotas. Algunas caracterís-ticas de este gen indican que derivó deuna fusión de un gen eucariota con otroprocariota (Martín y col., 1994).

En A. nidulans se ha descubierto el genaatB, un gen homólogo al gen aatA (quecodifica la IAT), con una estructura similary un modelo de expresión génica igual algen aatA, lo que sugiere un origen a partirde un gen ancestral común. La proteínacodificada por este gen posee actividadaciltransferasa e interviene en la biosíntesisde penicilina en A. nidulans. En otras espe-cies de hongos productores de penicilinalos genes homólogos al aatA forman partede la agrupación de genes de biosíntesisde penicilina, mientras que los genes ho-mólogos al aatB también están presentesen hongos no productores (Spröte y col.,2008). El análisis del genoma de P. chryso-genum reveló la presencia de un gen(Pc13g09140) denominado gen ial debidoa que codifica una proteína de gran simi-litud (IAL por IAT-like) a la IAT. Al contrarioque el producto del gen aatB de A. nidu-lans, la IAL no tiene actividad relacionadacon la biosíntesis de penicilina. Estos resul-tados sugieren que los genes ial y penDEde P. chrysogenum podrían no haberse for-mado a partir de un mismo gen ancestralpor duplicación génica. Por lo tanto, estosgenes podrían no tener una función similar,sino distintas funciones dentro del orga-nismo (García-Estrada y col., 2009).

Organización génica de los genesbiosintéticos en los microorganismosproductores de penicilinas

En bacterias y en hongos los genes impli-cados en la biosíntesis de antibióticos


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beta-lactámicos tienden a localizarse enagrupaciones génicas denominadas clus-ters (Martín y Liras, 1989a; Martín, 1992).

En los hongos productores de penicilinasA. nidulans y P. chrysogenum, los tresgenes de la ruta biosintética de penici-

lina se encuentran agrupados en un

cluster localizado en el cromosoma I, en

el caso de P. chrysogenum (Fierro y col.,

1993), y en el cromosoma VI, en el caso

de A. nidulans (Montenegro y col., 1990)

(figura 3).

Los genes pcbAB y pcbC se transcriben enorientación divergente, existiendo entreellos una región intergénica común quefunciona como un promotor bidireccional.La expresión de estos genes que están si-tuados en una región del genoma quecontiene dos promotores divergentes hasido asociada con la reorganización de laestructura de la cromatina, que permitela interacción facilitada de las regionespromotoras con la ARN polimerasa II ycon factores transcripcionales (García ycol., 2004; Ishida y col., 2006; Shwab ycol., 2007). El gen penDE, situado aguasabajo del gen pcbC, se transcribe a partirde su propio promotor.

Regulación de la biosíntesis depenicilina

La penicilina es, posiblemente, el metabo-lito secundario más estudiado y su biosín-

tesis la más investigada y conocida, de-bido en parte a que actualmente la peni-cilina sigue siendo uno de los antibióticosmás importantes en términos de uso te-rapéutico y de volumen de producciónanual.

La producción de penicilina tiene lugar,preferentemente, en condiciones de dese-quilibrio de nutrientes y a velocidades decrecimiento bajas. El desequilibrio nutri-cional se refiere sobre todo a la limitaciónen las fuentes de carbono, nitrógeno y fós-foro. Además de estos factores, aminoá-cidos como la lisina ejercen un marcadoefecto en la producción de penicilina en al-gunos microorganismos. Diversos compo-nentes del medio de cultivo, como, porejemplo, el líquido de maceración de maízy determinadas características del mediode cultivo, como pueden ser el pH y el oxí-

Figura 3. Agrupación de los genes de biosíntesis de penicilina en los hongos productores P. chrysogenum y A. ni-dulans.

pcbAB pcbC penDE

acvA ipnA aatA

P. chrysogenum (cromosoma I)

A. nidulans (cromosoma VI)


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geno disuelto, juegan un papel importanteen el proceso de regulación.

La producción de penicilina es un procesorelativamente ineficiente, ya que solo un20% de la fuente de carbono consumidadurante la fermentación termina incorpo-rándose a la molécula de penicilina,aunque los análisis de flujos metabólicosen las cepas de alta producción estimanun rendimiento teórico de la conversiónhasta valores del 50% (Jørgensen y col.,1995). La mejora en la producción y en elporcentaje de rendimiento de las cepasque actualmente se emplean se ha con-seguido, en mayor medida, mediante lautilización de técnicas clásicas de muta-ción y selección.

La introducción de la tecnología del ADNrecombinante ha llevado a la clonación ycaracterización de los genes estructuralesde la ruta biosintética de penicilina y haceposible la investigación sobre su regulacióna nivel molecular. Debido a que la expre-sión de los genes de biosíntesis de penici-lina está sujeta a sofisticados controles,bien sea por factores nutricionales y/o fac-tores reguladores, los conocimientos sobrelos circuitos reguladores y la sobreexpre-sión de los posibles genes reguladorespueden llevar a incrementos importantessobre la producción y el rendimiento en labiosíntesis de la penicilina.

Reguladores transcripcionales

La biosíntesis de penicilina está afectadapor diversos factores nutricionales, comola regulación catabólica por fuente de car-bono, nitrógeno y fósforo (Martín y col.,1999), y complejos procesos reguladores(Chang y col., 1990; Aharonowitz y col.,1992; Feng y col., 1994; Martín, 2000b;Brakhage y col., 2004).

Diversos factores transcripcionales hansido identificados en diversos hongos fi-lamentosos. Algunos de estos factorestranscripcionales se unen a la región pro-motora de los genes pcbAB y pcbC y a laregión corriente arriba del gen penDE enA. nidulans (Brakhage, 1998) y P. chryso-genum (Martín, 2000b).

Estos factores transcripcionales actúancomo elementos reguladores de la expre-sión de los genes de biosíntesis de penici-lina (Chu y col., 1995; Feng y col., 1995;Kosalková y col., 2000, 2007, 2009). Sinembargo, no se ha encontrado ningún genregulador específico en la región amplifi-cada que contenga los tres genes biosinté-ticos (Fierro y col., 2006; Van den Berg ycol., 2007), lo cual indica que la biosíntesisde penicilina debe ser controlada directa-mente por “reguladores globales“ másque por un regulador específico.

Regulación por pH externo.Regulador PacC

La producción de penicilina en A. nidu-lans está regulada mediante el pH am-biental o externo, siendo mayor en loscultivos incubados con valores de pH al-calinos. Este efecto se observa también enP. chrysogenum (Chu y col., 1997;Gutiérrez y col., 1999). Existen diferenciasen el comportamiento de estos doshongos, ya que mientras en A. nidulansun valor de pH alcalino contrarresta la re-presión catabólica ejercida por el azúcarsacarosa sobre el gen pcbAB cuando seutiliza esta como fuente de carbono(Espeso y col., 1993), en P. chrysogenumun valor de pH alcalino, aunque estimulala transcripción de los genes pcbAB, pcbCy penDE, no elimina la fuerte represióncatabólica por glucosa que se ejerce sobre


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los dos primeros genes de la ruta de bio-síntesis de penicilina (Gutiérrez y col.,1999).

En A. nidulans, el efecto regulador por pHexterno está mediado a través del factortranscripcional PacC. Esta proteína es sin-tetizada como producto primario de latraducción, siendo inactiva en la regula-ción de los genes estructurales debido alas interacciones intramoleculares entrelas regiones carboxilo y amino terminal(Arst y col., 1994; Tilburn y col., 1995). ApH ambiental alcalino la proteína PacCcambia su conformación y aproximada-mente un 60% de la proteína inactiva (dela región carboxilo-terminal) es eliminadamediante proteolisis, dando lugar a unaproteína funcional que contiene tres do-minios de unión al ADN en forma dededos de zinc que activa la transcripciónde genes que se expresan bajo un pH al-calino y reprime la transcripción de losgenes que se expresan a pH ácido (Tilburny col., 1995). Suárez y Peñalva (1996) handeterminado los sitios de unión in vitro dela proteína PacC de P. chrysogenum en laregión intergénica pcbAB y pcbC. Dicharegión intergénica contiene siete sitios deunión PacC mediante la secuencia con-senso 5´-GCCARG-3´.

Regulación catabólica por fuente decarbono. Regulador CreA

La regulación por la fuente de carbono esun mecanismo general conocido en bac-terias y hongos que impide la síntesis y/ola actividad de enzimas necesarias para laasimilación de las diversas fuentes de car-bono cuando esté presente una fuente decarbono fácilmente utilizada, como puedeser la glucosa. Desde el punto de vista fi-siológico, este tipo de regulación es be-

neficioso para el microorganismo, ya quese utiliza la fuente de carbono más ener-gética y no se desperdicia energía en lasíntesis de otros sistemas catabólicos parafuentes de carbono alternativas. Losgenes sujetos a represión por fuente decarbono pueden dividirse en tres grupos:los que codifican enzimas implicadas enel metabolismo de fuentes de carbonomenos favorables, los que codifican en-zimas implicadas en la gluconeogénesis yen el ciclo del glioxilato, y los relacionadoscon el metabolismo secundario. El mejorejemplo del último grupo es la regulaciónpor fuente de carbono de la produccióndel antibiótico penicilina.

El término represión por fuente de car-bono (o, más específicamente, represiónpor glucosa) se refiere a un efecto re-presor que ejerce la glucosa sobre la ex-presión de algunos genes. La glucosa esuna de las fuentes de carbono con las quese produce un mayor crecimiento de mi-celio, pero ejerce un efecto represor sobrela producción de penicilina. En A. nidu-lans se ha observado el mismo fenómenode represión catabólica en la biosíntesisde penicilina mediada por la fuente decarbono que en P. chrysogenum.

La mejor caracterización del fenómeno dela regulación catabólica por la fuente decarbono en hongos se consiguió en S. ce-revisiae. La regulación por glucosa en le-vaduras puede tener lugar mediante la ac-tivación o represión a nivel transcripcionalo postranscripcional. En levaduras, el re-presor MIG1, codificado por el gen Mig1,es el efector responsable de la represiónde los genes regulados por glucosa. Laproteína MIG1 contiene dominios deunión de tipo dedos de zinc y se une a


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cajas GC, motivo presente en muchosgenes reprimidos por glucosa.

El gen homólogo al Mig1 en A. nidulansse denomina creA. El factor regulador oproteína CreA contiene dos dedos de zincdel tipo Cys2-His2 y una región rica enalaninas indicativa de una proteína repre-sora de unión al ADN. La proteína CreAse une a determinadas regiones del ADNcon el propósito de modular la expresióngénica. Se ha conseguido definir la se-cuencia de unión consenso para CreA: 5´-SYGGRG-3´ (S = C o G; Y = C o T; R = Ao G) que coincide en gran medida con lade Mig1: 5´-GCGGRG-3´. Se ha demos-trado que la represión por la fuente decarbono del metabolismo primario es me-diada por la proteína reguladora CreA. Sinembargo, la deleción de un fragmento de29 pb protegido por el factor reguladorCreA no alteró la represión catabólica enA. nidulans, lo que indica que la represióncatabólica por la fuente de carbono delgen que codifica la ACV sintetasa (acvA)es independiente del represor transcrip-cional CreA.

Estos resultados sugieren que en la bio-síntesis de penicilina en A. nidulans estáinvolucrado otro mecanismo de regula-ción independiente del gen creA. Sin em-bargo, en P. chrysogenum, una mutacióndirigida a los sitios de unión del factor re-gulador CreA, indica que este tiene unpapel importante en la regulación por glu-cosa en la biosíntesis de penicilina.

La biosíntesis de penicilina en P. chryso-genum está fuertemente regulada por glu-cosa, sacarosa y, en un nivel más bajo, porotros azúcares, como la maltosa, la fruc-tosa y la galactosa. Esta regulación no apa-rece cuando se utiliza como fuente de car-

bono la lactosa, por este motivo inicial-mente la producción industrial de penici-lina en P. chrysogenum fue llevada a caboutilizando como fuente de carbono lac-tosa, ya que se comporta de forma con-traria a la glucosa, siendo menor el creci-miento en biomasa del microorganismo,pero no poseyendo un efecto represorsobre la producción de penicilina. La lac-tosa no ejerce efecto represor debido, pro-bablemente, a una lenta hidrólisis de esteazúcar como resultado de la muy baja ac-tividad β-galactosidasa en este hongo.

La glucosa en altas concentraciones re-prime la formación del tripéptido ACV (re-primiendo la enzima ACVS) y la represiónno es reversible por la adición del ácidoα-aminoadípico, cisteína o valina, y tam-bién reprime la ciclasa (IPNS), pero notiene efecto sobre la isopenicilina N acil-transferasa (IAT) (Revilla y col., 1986).También la biosíntesis de penicilina es re-primida por 2-desoxiglucosa. Este análogode glucosa es fosforilado a 2-desoxiglu-cosa-6-fosfato, pero parece que no esmetabolizado en la ruta glucolítica.

Martín y colaboradores (1999) demos-traron que los niveles de ARN mensajerode los genes pcbAB, pcbC y penDE estándrásticamente reducidos en presencia deglucosa. Además, los cultivos crecidos conglucosa como fuente de carbono muestranniveles reducidos del ácido α-aminoadí-pico, efecto aparentemente causado porestimular la biosíntesis del aminoácido li-sina y estimular a su vez el crecimiento delmicroorganismo (Revilla y col., 1984). En elaño 1988 se aisló un mutante de P. chry-sogenum (Barredo y col., 1988) desregu-lado en la represión ejercida por la glucosasobre la biosíntesis de penicilina. Este mu-tante es incapaz de fosforilar la D-glucosa,


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lo que sugirió que podría carecer de la ac-tividad glucoquinásica. En relación con estahipótesis, se demostró que la hexoquinasaII de S. cerevisiae posee un importantepapel en la represión catabólica ejercidapor la glucosa en levaduras (Entian yFröhlich, 1984; Gancedo, 1998). Estehecho en hongos filamentosos no está deltodo aclarado (Ruijter y Visser, 1997) dadoque una deficiencia en la hexoquinasa pro-voca una disminución de la tasa de capta-ción de glucosa, con lo que su efecto sobrela biosíntesis de penicilina podría explicarseen términos de una reducción de captacióndel compuesto represor.

Todas las evidencias disponibles sugierenque la regulación catabólica por fuente decarbono en la biosíntesis de penicilina esejercida por una proteína reguladora, elfactor transcripcional CreA, que regula laproducción de penicilina mediante dosmecanismos: uno indirecto, controlandoel metabolismo general del hongo, y otrodirecto, regulando la expresión del genpcbAB uniéndose a las cajas CreA. La mu-tación de las cajas CreA presentes en la re-gión intergénica pcbAB-pcbC disminuye latasa de represión de, al menos, el primergen de la ruta biosintética de penicilina.Actualmente, el problema de la represiónpor glucosa ha sido parcialmente supe-rado usando como fuente de carbono glu-cosa, pero en dosis no represoras. De estemodo, la producción de penicilina es fa-vorecida bajo condiciones subóptimaspara el crecimiento del microorganismo(Demain y col., 1998).

Regulación por la fuente denitrógeno. Regulador NRE

La represión por la fuente de nitrógenoen hongos es un ejemplo de un meca-

nismo regulador global necesario para lacoordinación de la expresión de los genesque aseguren un aporte de fuente de ni-trógeno necesario para el crecimiento enrespuesta a cambios medioambientales.El ión amonio y la glutamina o el gluta-mato son las fuentes de nitrógeno prefe-riblemente usadas por los hongos.

En ausencia de fuentes de nitrógeno fa-vorables se inicia una síntesis de novo depermeasas y enzimas catabólicas, cuya ex-presión es altamente controlada por el cir-cuito regulador, que permiten el uso delas fuentes de nitrógeno secundarias,como pueden ser nitratos, purinas, pro-teínas y amidas (Marzluf, 1993; Caddicky col., 1994).

En el hongo Neurospora crassa la regula-ción por la fuente de nitrógeno es llevadaa cabo por el producto del gen nit-2 (Fuy Marzluf, 1990) y en A. nidulans por elproducto del gen areA (Kudla y col.,1990). Ambos genes codifican los fac-tores reguladores que contienen un dedode zinc tipo Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys.

En P. chrysogenum la regulación por lafuente de nitrógeno es mediada por elproducto del gen nre, homólogo a losgenes nit-2 y areA (Hass y col., 1995). Losfactores transcripcionales de los genes re-guladores reconocen una secuencia con-senso GATA en el ADN (Marzluf, 1997).En el hongo P. chrysogenum hay seis se-cuencias o cajas GATA en el promotor bi-direccional pcbAB-pcbC, aunque se hadescrito que el producto del gen nre, elfactor regulador NRE, únicamente inte-ractúa fuertemente con solo dos de ellas(Haas y Marzluf, 1995). Cabe pensar, porlo tanto, que la regulación de la biosín-tesis de penicilina esté mediada por la


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misma proteína reguladora NRE que par-ticipa en el circuito regulador de la fuentede nitrógeno.

Regulador transcripcional PENR1

De los circuitos reguladores conocidos, al-gunos de ellos han sido encontrados me-diante el análisis de mutantes (creA, pacC)o mediante análisis bioquímicos o fisioló-gicos (nre). El análisis delecional de la re-gión intergénica entre los genes pcbAB ypcbC en A. nidulans ha revelado la pre-sencia de otro factor transcripcional de-nominado PENR1 (PENicillin Regulator 1)que se une específicamente a la secuenciaque contiene la caja 5´-CCAAT-3´.

La deleción de la región que contiene lasecuencia 5´-CCAAT-3´ de la región inter-génica pcbAB-pcbC o el cambio de cuatropares de bases, provoca el incremento dehasta 8 veces, la expresión del gen pcbABy una reducción simultánea del 30% delnivel normal de la expresión del gen pcbC.Estos datos indican que la proteína PENR1está involucrada en la expresión de losgenes de la biosíntesis de penicilina en A.nidulans y que la secuencia de la unióndel PENR1 manifiesta un efecto opuestoen la expresión de los genes pcbAB ypcbC.

Las cajas CCAAT están presentes en lospromotores de aproximadamente el 30%de los genes de eucariotas y son sitios deunión de diferentes factores transcripcio-nales. Los complejos de unión a la se-cuencia 5´-CCAAT-3´ se denominan HAP,AnCF, CBF o NF-Y. Son requeridos para laactivación de un amplio grupo de genesy fueron caracterizados inicialmente en S.cerevisiae y posteriormente en A. nidulans(Papagiannopoulos y col., 1996). Estecomplejo, en S. cerevisiae, está formado

por cuatro subunidades, HAP2, HAP,HAP5 (formando un complejo heterotri-mérico esencial para la unión al ADN) yHAP4, que es una proteína ácida queactúa como el dominio de activacióntranscripcional.

El complejo HAP también se identificó enA. nidulans (denominado PENR1) (Berghy col., 1996; Litzka y col., 1998; Steidl ycol., 1999). La deleción o mutagénesis delos sitios de unión de la proteína PENR1(409 pb corriente arriba del codón de ini-ciación del gen pcbAB) incrementó hastaun valor de 8 veces la expresión del genacvA, mientras la expresión del gen ipnAfue reducida hasta un 30% del valornormal (Bergh y col., 1996). En resumen,la caja CCAAT I media un efecto positivoen la expresión del gen acvA y un efectonegativo sobre el gen ipnA.

Otra caja CCAAT II, que es reconocida porel complejo proteico PENR1, está locali-zada 250 pb aguas arriba del inicio de latranscripción del gen penDE. La sustitu-ción de la secuencia 5´-CCAAT-3´ por 5´-GATCC-3´ resulta en una reducción de laexpresión de este gen (Litzka y col.,1996).

En P. chrysogenum, el complejo HAP estáformado por los factores transcripcionalesHAPB (fuerte similitud a la proteína HAPBde A. nidulans), HAPC (fuerte similitud ala proteína HAPC que se une a la se-cuencia 5´-CCAAT-3´ de Aspergillusoryzae) y HAPE (fuerte similitud a la pro-teína HAPE de A. oryzae).

La contribución real del complejo PENR1al control de la expresión de los genes debiosíntesis de penicilina no está muy clara.La deleción del complejo PENR1 deberíapermitir niveles de transcripción más altos


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del gen pcbAB e incrementar la produc-ción de penicilina en A. nidulans, dondees conocido que la expresión del genpcbAB es limitante en la producción depenicilina.

Regulador transcripcional PTA1

En P. chrysogenum, la expresión de losdos primeros genes de la ruta biosintéticade penicilina, pcbAB y pcbC, se deben ex-presar de forma coordinada, ya queambos muestran un modelo regulatorio yde expresión similar. El análisis de la se-cuencia de ADN de la región intergénicade estos dos genes revela la presencia demúltiples secuencias reguladoras que ac-túan en cis y que son objetivo de diversosreguladores transcripcionales como se havisto hasta ahora. Así, un total de siete se-cuencias consenso para PacC, seis paraCreA, seis para NRE y seis cajas CCAT sondistribuidas a lo largo de la región del pro-motor bidireccional.

Estudios realizados sobre la región inter-génica muestran que al menos hay cuatroregiones que parecen ser importantes enla regulación de la expresión del promotordel gen pcbAB. Cuando se deleciona laregión más distal del promotor pcbAB(posición 933 a -789 en referencia alpunto de inicio de la transcripción), el re-sultado es un incremento de la expresióndel gen pcbAB en un medio donde se hautilizado como fuente de carbono lactosa.Además, hay otras tres regiones impor-tantes en la regulación del promotor, de-nominadas cajas A, B y C, que producenun bajo nivel de expresión cuando son de-lecionadas, tanto si se utiliza como fuentede carbono glucosa o lactosa.

Dos de estas regiones contienen secuen-cias que actúan en cis (cajas A y B).

Ambas cajas contienen la mayoría de losmotivos de unión al ADN de las diferentesproteínas que actúan como factores regu-ladores de la expresión génica (Martín ycol., 1999). En la caja A aparece una se-cuencia heptamérica (TTAGTAA), que esel sitio de unión de una proteína regula-dora denominada PTA1 (penicillin trans-criptional activator 1). La deleción de lasecuencia heptamérica provoca una drás-tica reducción de la expresión del genpcbAB, por lo que este factor reguladores requerido para un alto nivel de expre-sión del gen pcbAB (Kosalková y col.,2000). La secuencia 5´-TTAGTAA-3´ se pa-rece a la secuencia del factor reguladorBAS2 (PHO2) requerido para la expresiónde diversos genes en levaduras (Tice-Baldwin y col., 1989).

Regulador transcripcional penRFX

Recientemente, se ha identificado unnuevo factor transcripcional en el hongoA. chrysogemun (CCPR1) y que muestragran homología con la familia de factoresreguladores animales RFX (Gajiwala yBurley, 2000).

En A. chrysogenum, la proteína CPCR1 seune a una secuencia palindrómica imper-fecta en la región promotora de los genespcbAB-pcbC. La localización del sitio deunión de la proteína es aproximadamente350 pb corriente arriba del lugar de iniciode la transcripción del gen pcbC, lo quesugiere que el factor de transcripciónCPCR1 está involucrado en la regulaciónde la ruta biosintética de cefalosporina C.

El gen homólogo del cpcR1 de A. chryso-genum se ha identificado en P. chryso-genum (penRFX), el cual presenta una ho-mología del 60% con el gen cpcR1. Hastael momento, muy poco se sabe del po-


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sible papel regulador de penRFX en la bio-síntesis de penicilina en P. chrysogenum,pero los resultados de nuestro laboratorioindican que está implicado en el controltranscripcional de los genes biosintéticosy de la biosíntesis de este antibiótico(Domínguez-Santos y col., 2012).

Regulador global laeA

En P. chrysogenum se ha identificado elgen que codifica un regulador global delmetabolismo secundario denominadolaeA. Este gen codifica una proteína nu-clear (PcLaeA) con un dominio metiltrans-ferasa. El gen laeA está presente comocopia única en el genoma de cepas debaja y alta producción de penicilina y noestá localizado en la región amplificadade 56,8 kb donde se encuentra el clusterde genes de biosíntesis de penicilina enlas cepas de alta producción de este anti-biótico, lo que significa que no ha ocu-rrido amplificación génica en el procesode selección de las cepas de alta produc-ción (Kosalková y col., 2009).

Estudios realizados de sobreexpresión deeste gen dieron como resultado un incre-mento de un 25% en la producción depenicilina, lo que indica que la proteínaPcLaeA actúa como un regulador de la ex-presión del cluster de genes de biosíntesisde penicilina. Estudios realizados en mu-tantes donde se había interrumpido elgen dieron como resultado un descensodrástico de la producción de penicilina,una baja pigmentación y esporulación.Estos resultados evidencian que el genlaeA codifica un regulador global trans-cripcional que afecta a la esporulación,pigmentación y biosíntesis de penicilinaen P. chrysogenum (Kosalková y col.,2009).

Complejo regulador Velvet

Velvet (VeA) es otro regulador global delmetabolismo secundario que ha sido ca-racterizado en A. nidulans y más recienteen P. chrysogenum (Hoff y col., 2010).VeA forma parte de un complejo de altopeso molecular que contiene al menos 10proteínas diferentes, entre las que se en-cuentra también LaeA. Ambos factoresjuegan un papel fundamental en la bio-síntesis de penicilina y en diferentes pro-cesos de desarrollo (Hoff y col., 2010).

Regulación por aminoácidos

La penicilina es sintetizada a partir de tresaminoácidos precursores, L-cisteína, L-va-lina y L-α-aminoadípico, por lo que estoscompuestos tienen un papel importante ensu regulación. Altas concentraciones de li-sina reducen la producción de penicilina(Demain, 1957; Luengo y col., 1979). En P.chrysogenum, las rutas biosintéticas de lapenicilina y de la lisina tienen varias etapasen común. El punto de ramificación de lasdos rutas es el ácido α-aminoadípico. En labiosíntesis del aminoácido lisina este ácidoes convertido en α-aminoadipato-δ-semial-dehído mediante la enzima α-aminoadi-pato reductasa, mientras que en la ruta dela biosíntesis de la penicilina, el ácido α-ami-nodípico es condensado junto con L-valinay L-cisteína dando lugar al tripéptido ACV.La L-lisina ejerce la inhibición de la biosín-tesis de penicilina en varios pasos.Masurekar y Demain describieron en 1974que la primera enzima de la ruta biosinté-tica de la lisina en P. chrysogenum, la ho-mocitrato sintasa, era inhibida por el ami-noácido lisina. Resultados similares fuerondescritos por otros investigadores (Friedrichy Demain, 1978; Luengo y col., 1979).


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La lisina también inhibe la actividad de laα-aminoadipato reductasa y se ha obser-vado que esta inhibición se producía enmayor o menor intensidad según la cepaestudiada. El hecho de que algunas en-zimas de la biosíntesis de lisina sean inhi-bidas mediante el proceso de retroalimen-tación ejercido por la L-lisina ocasiona unareducción del flujo del ácido α-aminoadí-pico disponible para la producción de pe-nicilina (Brakhage, 1998). El α-aminoadí-pico tiene un papel importante en labiosíntesis de penicilina, puesto que laadición de α-aminoadipato externo(Friedrich y Demain, 1978) o la inducciónde condiciones que incrementen el flujointracelular de α-aminoadípico (Hönligery Kubicek, 1989) aumentan la tasa deACV y de biosíntesis de penicilina. Lascepas de alta producción de penicilina deP. chrysogenum presentan altos niveles deflujo intracelular de α-aminoadípico(Jaklitsch y col., 1986). Mediante la dis-rupción génica del gen lys2, que codificapara la enzima α-aminoadipato reduc-tasa, Casqueiro y colaboradores (1999)consiguieron aumentar el flujo de α-ami-noadípico disponible para la biosíntesis depenicilina.

Regulación por la adición de líquidode maceración del maíz

El líquido de maceración del maíz (cornsteep liquor o CSL) es un subproducto dela manufactura del almidón de maíz yviene siendo empleado como ingredientede los medios de cultivo microbiológicodesde hace muchos años. El CSL es el lí-quido resultante del proceso de moliendahúmeda del maíz para la fabricación delalmidón y del gluten. El agua empleadaen sucesivas operaciones a lo largo de la

manufactura del almidón va arrastrandocompuestos solubles contenidos en unprincipio en el grano y que han de sepa-rarse de los productos finales: almidón,gluten, germen y fibra.

La adición de CSL al medio de produc-ción de P. chrysogenum estimula la pro-ducción de penicilina (Ligget y Koffer,1948). Una explicación de las propie-dades básicas del CSL podría ser que ensu composición hay un alto contenido enaminoácidos, polipéptidos, minerales yácido láctico que favorecen la biosíntesisde penicilina. Las búsquedas de los com-puestos simples, que son parte de estamezcla tan compleja y que son respon-sables del efecto positivo que provoca suadición en el medio de fermentación,han sido infructuosas (Demain y Elander,1999), debido en parte al fenómeno dela variabilidad en los CSL de diferenteorigen y debido a las enormes oscila-ciones del porcentaje en la composiciónde este dependiendo de la intensidad dela fermentación que tiene lugar en lafabricación del CSL. Según Ligget yKoffer (1948), la fracción proteica delCSL tiene el importante papel de servircomo fuente de nitrógeno al organismoP. chrysogenum. Los aminoácidos pre-sentes no parecen tener proporcionesconstantes, dependiendo del tipo demaíz del que proceden y del grado desolubilidad proteica que hayan sufrido.

Regulación mediada por oxígeno

Para la producción de penicilina, conse-guir una buena aireación del micelio conoxígeno es una de las condiciones impres-cindibles. Diversas enzimas, como la ci-clasa (IPNS), requieren oxígeno para suactividad. Sin embargo, el análisis trans-


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cripcional descrito por Renno y colabora-dores (1992) demostró que la expresiónde los genes pcbAB y pcbC en P. chryso-genum puede ser también inducida,como la respuesta al estrés, por la reduc-ción de los niveles de oxígeno.

Regulación mediada por la fuente defósforo

El efecto represor de la glucosa sobre labiosíntesis de penicilina depende de laconcentración del fosfato inorgánico enel medio de fermentación. En el mediocomplejo de fermentación con la fuentede fósforo limitada, el efecto represor esdel 13% cuando la fuente de carbono(glucosa) es añadida en el tiempo de ino-culación, mientras que se incrementahasta un 59% cuando el medio es suple-mentado a la vez con glucosa y con fos-fato inorgánico a una concentración de100 mM. La adición de fosfato inorgánicoa una concentración de 100 mM no tieneefecto sobre la producción de penicilinaen medios con la concentración de glu-cosa limitada o con lactosa como fuentede carbono (Martín y col., 1999).

Compartimentalización de labiosíntesis de penicilina

Las diferentes reacciones bioquímicas in-volucradas en la biosíntesis de penicilinaocurren entre el citosol y los peroxisomas(microcuerpos) (Martín y col., 2010), loque significa que los sustratos y las en-zimas de biosíntesis están separadas físi-camente.

Localización de la ACVS

Como ya se ha indicado en apartados an-teriores, el primer paso en la ruta de bio-síntesis de penicilina consiste en la forma-

ción del tripéptido ACV por condensaciónno ribosómica de los tres aminoácidosque lo conforman (ácido L-α-aminoadí-pico, L-cisteína y L-valina), llevada a cabopor la enzima ACVS. Estudios iniciales lo-calizaron esta enzima asociada a estruc-turas membranosas del aparato de Golgi(Kurylowicz y col., 1987). Posteriormente,mediante experimentos de fracciona-miento celular, se localizó la enzima ACVSen el interior de vacuolas o vinculada a lamembrana de estas (Müller y col., 1991;Lendenfeld y col., 1993).

La purificación de la ACVS mostró queesta enzima era soluble (aunque alta-mente inestable) en ausencia de deter-gentes y que, además, su actividad noparecía depender de la presencia de de-tergentes o de lípidos (Van Liempt y col.,1989; Baldwin y col., 1990, 1991;Theilgaard y col., 1997). Un posterioranálisis de la secuencia de aminoácidosde la ACVS mostró que era una proteínahidrofóbica, pero que no contenía nin-guna región transmembrana (Lendelfeldy col., 1993) ni ninguna señal de locali-zación (targeting) reconocible a retículoendoplásmico o vacuolas (Van de Kampy col., 1999). Todos estos hechos hi-cieron replantearse de nuevo la localiza-ción de esta proteína y se realizaron másexperimentos empleando las técnicastradicionales de fraccionamiento, lascuales no mostraron ningún resultadoclaro dada la inestabilidad de la ACVS ysu sensibilidad a la degradación proteo-lítica. La mejora de los protocolos de lisiscelular, unida al uso de la técnica de in-munocitoquímica asociada a la micros-copía electrónica, permitieron la locali-zación subcelular de la proteína ACVS enel citosol (Van der Lende y col., 2002a).


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En A. nidulans se ha conseguido ademásmostrar la localización de la ACVS en elcitosol fusionándola a una proteínaverde fluorescente (Vousden y Turner,2001; Evers y col., 2004). Esta localiza-ción citosólica es más acorde con las pro-piedades bioquímicas de la ACVS, comoun pH neutro (el pH de las vacuolas esácido), requerimiento de cofactores ysensibilidad a proteasas (la vacuola tienegran actividad proteolítica).

Localización de la IPNS

La segunda etapa de la biosíntesis de pe-nicilina consiste en la ciclación oxidativade LLD-ACV a IPN, catalizada por una pro-teína de 38 kDa denominada ciclasa(IPNS). Los resultados de los experimentosde fraccionamiento mostraron claramenteque la IPNS era una enzima soluble y ci-tosólica (Kurzatkowski y col., 1991;Müller y col., 1991). Esta localización estáde acuerdo con la ausencia de regionestransmembrana y de señales de localiza-ción específicas en la secuencia aminoa-cídica deducida (Ramón y col., 1987;Barredo y col., 1989a), y también contodas las características bioquímicas y es-tructurales conocidas de la misma (Martíny Liras, 1989b; Roach y col., 1995, 1997).Esta enzima ha sido localizada también enel citosol utilizando técnicas de micros-copía electrónica (Müller y col., 1991; Vander Lende y col., 2002a). La presencia dela IPNS en el citosol implica que puede uti-lizar directamente como sustrato el LLD-ACV producido por la ACVS. Se ha plan-teado que estas dos enzimas, ACVS eIPNS, podrían estar organizadas formandoun metabolón o gran complejo, pero estoes algo de lo que no se tiene ninguna evi-dencia experimental.

Localización de la IAT

El tercer y último paso de la síntesis depenicilinas es el intercambio, catalizadopor la IAT, de la cadena lateral L-α-ami-noadípica de la IPN por el grupo fenila-cetilo o fenoxiacetilo activado con coen-zima A, dando como resultado laformación de bencilpenicilina o fenoxi-penicilina, respectivamente. Estudiosbioinformáticos muestran que una de lasdos subunidades que forman la IAT (lasubunidad β de 29 kDa), una vez reali-zado el procesamiento autocatalítico dela preproteína de 40 kDa (Aplin y col.,1993a, b), posee en el extremo carboxiloterminal una señal PTS1 que permite sulocalización en la matriz peroxisomal. Portanto, el sustrato de esta enzima, la IPN,tiene que entrar en el peroxisoma parapoder ser convertida en bencilpenicilinao fenoxipenicilina.

El uso de técnicas inmunocitoquímicasasociadas a la microscopía electrónica hapermitido confirmar la localización de laIAT en el interior de los peroxisomas(Müller y col., 1991, 1992, 1995; García-Estrada y col., 2008a). Se ha demostradoque el transporte de la enzima IAT al in-terior del peroxisoma no depende del es-tado de procesamiento de la enzima, yaque un mutante no procesable de la IAT(variante IATC103S) se transporta activa-mente al interior del peroxisoma aunqueno sea activo (García-Estrada y col.,2008a). Finalmente, la localización de laIAT y dos ligasas (encargadas de la activa-ción de la cadena lateral) en el interior delos peroxisomas ha sido confirmada poraislamiento físico de estos orgánulos eidentificación de las proteínas perixomalesmediante espectrometría de masas (Kiel ycol., 2009).


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Otras enzimas implicadas en labiosíntesis de penicilina

Además de las tres proteínas de la rutabiosintética de penicilina, existen algunasenzimas implicadas en el metabolismo pri-mario que son necesarias para la forma-ción de penicilina. Tres de las más impor-tantes son la fosfopanteteinil transferasa(PPTasa), la fenilacetil-CoA ligasa (PCL) yla disulfuro reductasa.

La ACVS es sintetizada como una apopro-teína inactiva, cuya activación se logramediante la adición de 4´-fosfopanteteínagracias a la acción catalizada por laPPTasa. Esta clase de enzimas son las res-ponsables de la modificación postraduc-cional de enzimas implicadas en la biosín-tesis de ácidos grasos, policétidos ypéptidos no ribosómicos. Por lo tanto, laenzima PPTasa es necesaria para la biosín-tesis de penicilina tanto en A. nidulans(Lambalot y col., 1996; Keszenman-Pereyra y col., 2003; Márquez-Fernándezy col., 2007) como en P. chrysogenum(García-Estrada y col., 2008b). Además deactivar a la enzima ACVS, la PPTasa activatambién en el citosol a la enzima α-ami-noadipato reductasa, que convierte elα-aminoadipato en α-aminoadipato se-mialdehído en la ruta biosintética de la li-sina en hongos (Casqueiro y col., 1998;Ehmann y col., 1999; Guo y col., 2001).

Para que se lleve a cabo la reacción desustitución catalizada por la IAT, los ácidosfenilacético o fenoxiacético que van a ac-tuar como precursores de la cadena la-teral tienen que estar activados en sus co-rrespondientes tioésteres. Teóricamente,esta activación la puede realizar una en-zima de actividad acil-CoA sintetasa (ACS)o de actividad PCL. En 1997, se identificó

una enzima PCL que contenía una señalPTS1 (SKI) de localización en peroxisomas(Gledhill y col., 1997). Años más tarde, seconsiguió clonar el gen phl que codificabaesta enzima PCL, comprobándose su ac-tividad y su implicación de forma directaen la ruta biosintética de penicilina(Lamas-Maceiras y col., 2006). También seencontró que no era la única enzima quepresentaba esta actividad en el microor-ganismo, ya que aunque su inactivaciónsuponía una notable reducción, no blo-queaba completamente la biosíntesis depenicilina (Lamas-Maceiras y col., 2006).De hecho, también se ha clonado enP. chrysogenum un segundo gen impli-cado en la activación del ácido fenilacé-tico, el gen phlB, el cual codifica una pro-teína que posee actividad PCL y una señalde localización peroxisomal en su extremocarboxilo terminal (Wang y col., 2007).Sin embargo, recientes estudios deKoetsier y colaboradores (2009, 2010)han puesto en evidencia que este gen(también denominado aclA) no intervieneen la activación del ácido fenilacético y,por tanto, en la biosíntesis de penicilina,tratándose de un gen que codifica unaacil-CoA ligasa de amplio espectro queactiva ácido adípico. Un estudio aún másreciente ha identificado un tercer gen(phlC) en P. chrysogenum, que codificauna proteína que también tiene una señalde tipo PTS2 y estaría involucrada en laactivación de ácido fenilacético (Yu et al.,2011). La localización subcelular en pero-xisomas de la PCL es ventajosa, ya que esla misma localización que posee la IAT.Además, puesto que los ácidos fenilacé-tico y fenoxiacético muy probablementedifunden a través de la membrana pero-xisomal, su activación proporciona un mé-


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todo muy útil para acumularlos en estemicrocuerpo en concentraciones másaltas que en el citosol sin ejercer efectostóxicos.

Una vez que el tripéptido ACV se sintetizaen la célula, tiende a oxidarse y formar eldímero bis-ACV debido a las condicionesde aireación que existen en el medio decultivo. Este dímero no puede ser utilizadocomo intermediario de la ruta biosinté-tica, puesto que la IPNS solo admite comosustrato la ACV monomérica. Más aún, elbis-ACV inhibe la actividad de la ACVS(Theilgaard y col., 1997). La reincorpora-ción del bis-ACV a la biosíntesis de peni-cilina es posible por la acción de un sis-tema tiorredoxina disulfuro reductasa(TrxAB) dependiente de NADPH. Este sis-tema está presente en el citosol y ha sidocaracterizado en P. chrysogenum a nivelgenético y proteico (Cohen y col., 1994).

Importancia de lacompartimentalizaciónde la biosíntesis de penicilina

La organización subcelular de la biosín-tesis de penicilina en diferentes compar-timentos permite la regulación y la opti-mización de los procesos implicados. Elelevado rendimiento de la producción depenicilina en las cepas industriales suponeun elevado gasto de precursores y cofac-tores tales como CoA, ATP y NADPH(Hersbach y col., 1984; Nielsen, 1995). Lacompartimentalización facilita la canaliza-ción de los cofactores necesarios y de losprecursores procedentes del metabolismoprimario (aminoácidos) hacia la ruta me-tabólica específica de la biosíntesis de pe-nicilina, en lo que se conoce como con-trol del flujo metabólico por una barrerafísica.

La razón exacta de por qué el último pasode la ruta biosintética de penicilina se rea-liza en el interior del peroxisoma no estáclara. Lo que sí se conoce es que estehecho proporciona una serie de condi-ciones favorables que pueden explicar queocurra de este modo. Por ejemplo, crea unentorno específico para las enzimas queactúan en él. El pH de los microcuerpos deP. chrysogenum se ha investigado con ex-perimentos de fluorescencia y se ha con-cluido que es ligeramente alcalino (pH 7,0-7,5) (Van der Lende y col., 2002b), lo cualestá en concordancia con el pH óptimo(pH 8,2) de la enzima biosintética IAT ytambién de la PCL (Álvarez y col., 1993;Lamas-Maceiras y col., 2006).

Otras posibles ventajas de la compartimen-talización de algunas etapas enzimáticaspueden ser las altas concentraciones deproteínas y sustratos que se encuentran enlos peroxisomas y que favorecen las reac-ciones que catalizan estas enzimas, la pre-vención de la pérdida de intermediarios deestas rutas por derivación de los mismos arutas laterales no deseadas y la regulaciónde la ruta biosintética.

La importancia de los peroxisomas en labiosíntesis de penicilina fue evidentecuando se demostró que la IAT estaba lo-calizada en este orgánulo (Müller y col.,1991). Tratando de delimitar las implica-ciones de esta localización, se realizaronunos experimentos en los que, tras la eli-minación de la señal de localización a pe-roxisomas, se observaba que la IAT perma-necía en el citosol, interrumpiéndose enestas condiciones la producción de penici-lina, pese a que la enzima se expresaba invivo y se mostraba activa in vitro (Müller ycol., 1992). La explicación más factible aestos resultados es que la activación del


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precursor por la PCL tiene lugar en el inte-rior peroxisomal y, por tanto, al estar la IATen el citosol, estos precursores activados seencuentran fuera de su alcance. Otra ex-plicación que se planteó en su momentofue que la IAT no era capaz de desarrollarsu actividad catalítica en el citosol. La ob-tención de un mutante de A. nidulans quecarece de peroxisomas funcionales y quemantiene la producción de penicilina conlas enzimas del peroxisoma localizadas enel citosol (De Lucas y col., 1997) hace queesta posibilidad sea menos probable.

Además, estos resultados sugieren que losperoxisomas no son esenciales para laproducción de la penicilina per se, peroque existe una correlación positiva entreel rendimiento de la producción de peni-cilina y el número de peroxisomas. Larazón de esta correlación no se conoce,pero podría deberse a un incremento enla cantidad de enzimas de la ruta biosin-tética (Evers y col., 2004).

Una evidencia clara de la importancia deestos microcuerpos en la biosíntesis de pe-nicilina ha sido subrayada a través de la al-teración del número y forma de estos orgá-nulos como resultado de la sobreexpresiónde la proteína Pc-Pex11p (una peroxina queestá involucrada en la abundancia de pero-xisomas). La sobreexpresión de esta pro-teína se traduce en un incremento en labiosíntesis de penicilina. Este efecto posi-tivo viene a estar relacionado con un au-mento en el transporte de penicilina y/o delos precursores a través de los peroxisomas(Kiel y col., 2005), lo cual evidencia que eltransporte a través de membrana en los or-gánulos es muy importante.

Además de los peroxisomas, orgánuloscomo la mitocondria y las vacuolas son im-

portantes en la biosíntesis de penicilina. Lasmitocondrias son esenciales para la biosín-tesis del aminoácido precursor α-aminoa-dípico, ya que las enzimas responsables desu biosíntesis, como la homocitrato sintasay la homoisocitrato deshidrogenasa, se lo-calizan en la matriz mitocondrial (Kubiceket al., 1990; Jaklitsch y Kubicek, 1990). Lavacuola fúngica está implicada en una am-plia variedad de procesos celulares(Klionsky y col., 1990), entre los que se en-cuentran el control activo de la concentra-ción en el citosol de muchos y muy dife-rentes componentes. La mayor parte de losaminoácidos libres básicos y neutros, y unaparte sustancial de los aminoácidos ácidos,están localizados en las vacuolas (Klionskyy col., 1990; Kubicek-Pranz y Kubicek,1991). Estudios acerca de los niveles deaminoácidos utilizados en la biosíntesis depenicilina en el citosol indicaron que existíauna transferencia elevada desde las va-cuolas (Jaklitsch y col., 1986; Hönlinger yKubicek, 1989; Kubicek y col., 1990;Lendenfeld y col., 1993). Además, el ácidoL-α-aminoadípico y la L-cisteína son tóxicosa concentraciones moderadas, siendo portanto sus niveles citosólicos cuidadosa-mente regulados a través de su almacena-miento en la vacuola (Klionsky y col., 1990;Kubicek-Pranz y Kubicek, 1991). El trans-porte a través de la membrana de la va-cuola tanto al interior como al exterior im-plica un sistema de antiporte de tipoH+-aminoácido, el cual está presente en lamembrana vacuolar fúngica (Klionsky ycol., 1990; Harvey y Nelson, 1992).

Procesos de transporte

La compartimentalización de la ruta debiosíntesis de penilicina implica el trans-porte de enzimas, precursores, interme-


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diarios y del producto final a través de losorgánulos celulares, además de crearsedistintas condiciones medioambientalesespecíficas para cada etapa de biosíntesis.

Transporte de precursores:aminoácidos y ácido fenilacético

Los hongos filamentosos pueden sinte-tizar cualquier aminoácido, pero tambiénson capaces de incorporarlos del mediode cultivo al interior celular para usarloscomo fuente de nitrógeno y de carbonoo como unidades estructurales para la sín-tesis de proteínas y péptidos (Horak,1986), estando implicadas en este pro-ceso permeasas activas de aminoácidos.

La mayoría de las permeasas fúngicas deaminoácidos muestran similitudes muysignificativas en la secuencia y forman unaúnica familia conocida como AAP (perme-asas de aminoácidos) (Andre, 1995), lacual pertenece a la superfamilia de prote-ínas APC (aminoácidos/poliaminas/orga-nocationes) (Jack y col., 2000). Las per-measas tienen una estructura común con12 posibles segmentos α-hélice trans-membrana y regiones hidrofílicas en losextremos carboxilo y amino terminal loca-lizadas en el citoplasma (Horak y Wolf,1997; Regenberg y col., 1999). La incor-poración de aminoácidos transcurre através de un transporte secundario, me-diante un gradiente electroquímico deprotones como fuerza conductora quepermite dicha incorporación contra el gra-diente de concentración (Andre, 1995;Jack y col., 2000).

En P. chrysogenum se han clonado y ca-racterizado tres permeasas de aminoá-cidos (Trip y col., 2002) y se han determi-nado y clasificado otras actividades enbase a ensayos de competición y trans-

porte. Se han publicado hasta el momentonueve sistemas de transportadores de ami-noácidos: sistema I para la L-metionina(Benko y col., 1967), sistema II para la L-cisteína (Skye y Segel, 1970), sistema IIIpara todos los aminoácidos (Benko y col.,1969; Hunter y Segel, 1971), sistema IVpara aminoácidos ácidos, sistema V parala L-prolina, sistema VI para L-lisina y L-ar-ginina, sistema VII para L-arginina, sistemaVIII para L-lisina y sistema IX para L-cisteína(Hunter y Segel, 1971).

La incorporación del aminoácido α-ami-noadípico podría ser realizada medianteambos sistemas, el sistema de transportede aminoácidos ácidos (Hunter y Segel,1971) y un sistema de transporte de ami-noácidos general (Horak, 1986). Estudiosmás recientes muestran que la permeasageneral de aminoácidos es la principalruta para la incorporación a la célula deeste aminoácido (Evers y col., 2004).

Los ácidos fenilacético y fenoxiacético sonácidos débiles que entran rápidamente enlas células de P. chrysogenum mediantedifusión pasiva y se distribuyen a lo largode la membrana de acuerdo con el gra-diente transmembrana de pH (Eriksen ycol., 1995; Hillenga y col., 1995). Estehecho actualmente aceptado fue duranteun tiempo objeto de discusión, pues otrosautores habían postulado un transporteactivo para la adquisición del ácido feni-lacético desde el medio de cultivo(Fernández-Cañón y col., 1989a, b;Martínez-Blanco y col., 1989). Las princi-pales diferencias en estos estudios se en-contraban en las concentraciones emple-adas de ácido fenilacético y en el tipo decepas (de bajo y alto rendimiento). Unanálisis pormenorizado de estas variablescondujo de nuevo a la misma conclusión,


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que durante la biosíntesis de penicilinasse consumen grandes concentraciones deácidos fenilacético o fenoxiacético, loscuales entran en la célula utilizando comoruta predominante la difusión pasiva(Eriksen y col., 1998).

Por otro lado, este tipo de transporte su-pone que, a concentraciones muy ele-vadas de ácido fenilacético en el medio,se produciría una difusión masiva de esteácido hacia el interior celular, lo que con-duciría a un colapso del gradiente electro-químico (Henriksen, 1996). Esto podríaexplicar en parte el efecto tóxico de estasmoléculas cuando están presentes en ele-vadas concentraciones o en un medio depH bajo (Barrios-González y col., 1993;Henriksen, 1996).

Transporte de intermediarios

El hongo P. chrysogenum secreta al mediode cultivo los tres intermediarios de la rutabiosintética de penicilina, además del pro-ducto final de la misma, la bencilpenici-lina, cuando se utiliza ácido fenilacéticocomo precursor de la cadena lateral. Sehan encontrado en dichos caldos tanto eltripéptido ACV (López-Nieto y col., 1985),como la IPN y el 6-APA (Demain, 1983).En todos estos casos no está claro si la se-creción de intermediarios se debe a un so-breflujo de la ruta biosintética en las cepasde alta producción o si es un proceso na-tural con un significado ecológico.

La cantidad de cada uno de los interme-diarios que se secretan al medio durantelas fermentaciones es diferente. Mientrasque el ACV se va acumulando en el caldode cultivo llegando a ser una tercera partede la concentración intracelular, las con-centraciones de IPN extracelulares perma-necen bajas y más o menos constantes

durante toda la fermentación (Jørgenseny col., 1995).

Aunque no hay evidencia experimental deello, se ha propuesto que el ACV podríaser transportado fuera de la célula por elsistema de exportación del glutatión(GSH) (Meister y Anderson, 1983;Schwartz y col., 1988; Del CarmenMateos y Sánchez, 1990), el cual se pare-cería al sistema glutatión S-conjugado(GSX) dependiente de ATP que se ha lo-calizado en la membrana plasmática deeucariotas superiores (Deeley y Cole,1997; Rea y col., 1998). Una vez que eltripéptido ACV es transportado al exteriorcelular, no es importado de nuevo haciael interior, ni en forma dimérica, ni mono-mérica (García-Estrada y col., 2007).

La IPN es el siguiente intermediario de laruta biosintética de penicilina y, al igualque el tripéptido ACV, se sintetiza en elcitosol y también se secreta parcialmenteal caldo de cultivo. Mediante estudios detransporte realizados utilizando una cepamutante que carece del cluster de genesde biosíntesis de penicilina (P. chryso-genum npe10 pygG–), transformada conun plásmido que contiene el gen penDE,se ha observado que la IPN atraviesa condificultad la membrana plasmática. Noocurre lo mismo con el paso a través dela membrana peroxisomal desde el ci-tosol, ya que en este caso probablementeeste sea muy efectivo (García-Estrada ycol., 2007).

El 6-APA es el último intermediario de laruta biosintética de penicilina antes deformarse bencilpenicilina cuando seañade ácido fenilacético como precursorde la cadena lateral. El 6-APA es un com-puesto más hidrofóbico que los ante-


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riores, ya que posee un grupo carboxilomenos. Esto, unido a su menor tamaño,hace más factible su transporte por difu-sión pasiva a través de las membranas. Enestudios realizados de conversión de 6-APA en bencilpenicilina utilizando elmismo microorganismo mutante que enel caso de la IPN, se ha podido apreciarque el 6-APA es transportado al interiorcelular mediante un transporte por difu-sión que depende de la concentración ex-tracelular (García-Estrada y col., 2007).Hasta el momento, no se ha identificadoningún transportador que pueda estar im-plicado en el transporte de los com-puestos intermediarios de la ruta al exte-rior celular.

Transporte de penicilina

Las penicilinas aromáticas producidas por P.chrysogenum son compuestos anfipáticos,moderadamente hidrofóbicos y cargadosnegativamente al pH normal del citosol(Kirschbaum, 1986). Estas característicashacen posible su secreción al exterior ce-lular por difusión a través de las membranasperoxisomal y plasmática. Aparte de estasindicaciones, no se conoce mucho másacerca del mecanismo por el que los anti-bióticos beta-lactámicos son secretados almedio por las células de los hongos produc-tores (Martín y col., 2010).

Existen varias razones que apuntan a unsistema de transporte activo, primario osecundario, como el más probable para lasecreción de penicilinas a través de lamembrana plasmática. En primer lugar,factores físicos relacionados con las carac-terísticas de la membrana plasmática,como el apretado empaquetamiento desu capa lipídica debido al alto contenidoen ergosterol y diferentes factores super-

ficiales y electroquímicos, que probable-mente son suficientes para inhibir drásti-camente la difusión pasiva de penicilinas(Hillenga y col., 1994). En segundo lugar,la difusión pasiva no puede explicar unadistribución de penicilinas con concentra-ciones más altas fuera que dentro de lacélula (Van de Kamp y col., 1999).

Tampoco se puede excluir una terceraopción, situada entre la difusión pasivay el transporte activo, que es el trans-porte vesicular (Luengo y col., 1986;Kurylowicz y col., 1987; Müller, 1991;Martín y col., 2010). Este tipo de trans-porte está implicado, por ejemplo, en lasíntesis de la pared celular, en la secre-ción de feromonas, en la liberación deneurotransmisores y en el transporte ysecreción de ácidos biliares en los orga-nismos eucariotas. El hecho de que lapenicilina sea sintetizada en el interior demicrocuerpos, otorga posibilidades aeste tipo de transporte mediado por ve-sículas, de modo que la bencilpenicilina,además, sea transportada desde el pero-xisoma hasta la membrana citoplasmá-tica sin encontrarse libre por el citosol.Aunque, por otro lado, el flujo de ben-cilpenicilina a través del citosol podríaservir para explicar en parte la formaciónde 6-APA, atribuyéndola a una actividadacilasa citosólica (Nielsen, 1995).

Con respecto al transporte activo, hastael momento no se ha identificado ningúntransportador de penicilina en P. chryso-genum. La búsqueda de transportadoresha tenido algún resultado en A. nidulans,donde se ha encontrado un transportadorde tipo ABC codificado por el gen atrD,que está implicado, de algún modo, en lasecreción de penicilina (Andrade y col.,2000).


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Transporte a través de la membranaperoxisomal

Los peroxisomas se han estudiado en va-rios hongos filamentosos como A. nidu-lans (Valenciano y col., 1996; 1998; DeLucas y col., 1997), A. niger (Van Dijkeny Veenhuis, 1980; Schilling y Lerch,1995) o N. crassa (Wanner y Theimer,1982; Kionka y Kunau, 1985; Thieringery Kunau, 1991a, b; De Zoysa yConnerton, 1994). El microcuerpo de P.chrysogenum es un compartimento pe-queño de membrana sencilla con un diá-metro de 200-800 nm, por lo que es deesperar que el flujo a través de este or-gánulo sea alto.

Aunque se han aislado microcuerpos deP. chrysogenum, la contaminación conotros orgánulos ha impedido su completacaracterización (Müller y col., 1995). Losperoxisomas están implicados en dife-rentes rutas metabólicas que varíansegún los distintos organismos. Enhongos, el único lugar en el que se llevaa cabo la β-oxidación de ácidos grasos esen los peroxisomas. Además, estos orgá-nulos están implicados en otras funcionescomo la biosíntesis de penicilina y el de-sarrollo sexual.

Durante mucho tiempo se pensó que losperoxisomas eran permeables a molé-culas pequeñas debido a la presencia deporinas en sus membranas. Pero estudiosposteriores realizados in vivo mostraronque estas membranas constituían unabarrera efectiva, siendo impermeable alos protones (lo que permite la existenciade diferente pH entre la matriz peroxi-somal y el citosol) y a otros pequeños so-lutos, como NADPH, acetil-CoA y ácidosgrasos activados, para los cuales eran ne-

cesarios transportadores especializados(Singh y col., 1992; Tabak y col., 1995;Van Roermund y col., 1995; Hettema ycol., 1996). De todos modos, debido albajo contenido en esterol de la mem-brana peroxisomal, se ha sugerido quees más permeable que la membranaplasmática (Sulter y col., 1993; Zinser yDaum, 1995).

No existen datos disponibles de la perme-abilidad de la membrana peroxisomalpara el ácido fenilacético, ácido fenoxia-cético, CoA y ATP, sustratos de la PCL, opara el fenilacetil-CoA, fenoxiacetil-CoAe IPN, sustratos de la IAT, ni tampoco paralos productos de la reacción catalizadapor la IAT, la bencilpenicilina y el ácidoL-α-aminoadípico.

En vista de las propiedades de permeabi-lidad de los ácidos fenilacético y fenoxia-cético (Hillenga y col., 1995), es probableque tanto el ácido fenilacético como elácido fenoxiacético difundan librementea través de la membrana del microcuerpo.Del mismo modo, tomando como baselas propiedades hidrofílicas y de peso mo-lecular de la IPN y del ácido L-α-aminoa-dípico, es de esperar que se necesitentransportadores específicos para estoscompuestos.

En cuanto a las penicilinas hidrofóbicasformadas, podrían liberarse del micro-cuerpo tanto por difusión como por trans-porte activo. Pero esto hasta el momentoson suposiciones, ya que no existe nin-guna evidencia experimental de la impli-cación de transportadores activos en eltransporte de IPN, ácido fenilacético,ácido L-α-aminoadípico o penicilinas hi-drofóbicas a través de la membrana pe-roxisomal.


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Implicaciones biotecnológicasen la producción de penicilinasy otros antibióticos beta-lactámicosderivados

Junto con los programas industriales demejora de cepas, la caracterización de losgenes y proteínas implicados en la ruta bio-sintética de antibióticos beta-lactámicos hapermitido el desarrollo de diferentes estra-tegias a través de la ingeniería genéticapara modificar P. chrysogenum con el finde obtener penicilinas semisintéticas yotros antibióticos beta-lactámicos, talescomo cefalosporinas semisintéticas.

Penicilinas semisintéticas

Es bien conocido que si se añade al mediode cultivo un precursor de la cadena la-teral se producirá de forma mayoritaria untipo de penicilina. Las penicilinas así ob-tenidas se denominan biosintéticas siendolas más importantes la bencilpenicilina openicilina G (cuando se añade como pre-cursor de la cadena lateral el ácido feni-lacético) y la penicilina V (cuando seañade como precursor de la cadena la-teral el ácido fenoxiacético). Esta es la es-trategia que se sigue para la producciónde penicilinas semisintéticas, cuyo procesode obtención se describe a continuación.

Las penicilinas biosintéticas obtenidas me-diante procesos fermentativos se purificanmediante cristalización tras añadir acetatopotásico. Estas penicilinas no solo consti-tuyen los precursores de las penicilinas se-misintéticas, sino también de cefalospo-rinas, ya que tras la desacilación químicao enzimática de la cadena lateral se ob-tiene el núcleo de 6-APA, que es la basepara la síntesis de estos compuestos.

La producción clásica de penicilinas semi-sintéticas comenzó en los años 70 y con-

sistía en una desacilación química de lapenicilina G obtenida mediante fermen-tación. Este proceso requería compuestosy solventes peligrosos, por lo que estuvoen uso hasta finales de los 80, cuando sesustituyó por la hidrólisis enzimática de lapenicilina G o de la penicilina V. Para ello,se utilizan las enzimas penicilina G acilasay penicilina V acilasa, ambas de gran efi-ciencia y que se obtienen como enzimasrecombinantes a partir de Escherichia coli(en el caso de la penicilina G acilasa) oFusarium oxysporum (en el caso de la pe-nicilina V acilasa) (Arroyo y col., 2003).Aunque la penicilina V muestra unamayor estabilidad en soluciones acuosasa bajo pH durante la extracción a partirde caldos fermentados, la penicilina G esla molécula de elección en la producciónde 6-APA (un 85% del 6-APA producidomundialmente se obtiene a partir de pe-nicilina G).

Tras la obtención del núcleo de 6-APA, sele adicionan químicamente diferentes ca-denas laterales, dando lugar a las penici-linas semisintéticas, las cuales se agrupanen cinco categorías: penicilinas antistafilo-cócicas (cloxacilina, dicloxacilina, metici-lina, nafcilina y oxacilina), aminopenicilinas(ampicilina, amoxicilina), carboxipenicilinas(carbenicilina, ticarcilina), ureidopenicilinas(piperacilina y mezlocilina) y penicilinas re-sistentes a beta-lactamasas (combinaciónde las anteriores con inhibidores de la en-zima beta-lactamasa; por ejemplo, amoxi-cilina-ácido clavulánico, ampicilina-sul-bactam) (Oshiro, 1999).

Modificación de P. chrysogenum paraproducir cefalosporinas semisintéticas

Las cefalosporinas derivadas de la peni-cilina se basan principalmente en el nú-


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cleo del ácido 7-aminodesacetoxicefalos-poránico (7-ADCA), el cual se originatras la expansión química del anillo de labencilpenicilina (dando lugar al com-puesto fenilacetil-7-ADCA) seguida deuna desacilación enzimática que eliminala cadena lateral aromática (Barber y col.,2004) (figura 4). La expansión del anilloes un proceso complejo y contaminante,por lo que la producción de 7-ADCA através de otros procesos, tales como lamodificación genética de P. chryso-genum (que no produce cefalosporinasde modo natural), es conveniente.

La gran capacidad que tiene P. chryso-genum para producir antibióticos, juntocon el alto coste que tienen las fermenta-ciones realizadas con A. chrysogenum (elhongo productor de cefalosporinas), hanpromovido la producción de antibióticosderivados del anillo cefalosporánico enP. chrysogenum. Este hongo filamentosoha sido modificado genéticamente, demodo que sea capaz de expresar dife-rentes combinaciones de genes biosinté-ticos de cefalosporinas provenientes dediversos microorganismos productores decefalosporinas y cefamicinas.

Mediante la introducción del gen cefE(expandasa) de Streptomyces clavuli-gerus o del gen cefEF (expandasa/hidro-xilasa) de A. chrysogenum en P. chryso-genum, el microorganismo modificadoresultante fue capaz de expandir el anillotiazolidínico de la penicilina para formar

un anillo dihidrotiazínico de seis miem-bros. La adición en exceso de ácido adí-pico como precursor de la cadena lateraldio como resultado la producción deadipil-6-APA, que fácilmente se expandióa adipil-7-ADCA (figura 4). Esta estra-tegia también condujo a la producción

Figura 4. Estrategias para la producción de cefalosporinas semisintéticas usando P. chrysogenum.

Expansión químicaACV

Isopenicilina N

Ácidofenilacético

Bencilpenicilina

Fenilacetil 7-ADCA

Expansión vía adipyl 6-APA(Crawford y col., 1995)

Carbamilación(Harris y col., 2009)

Expansión vía penicillin N(Cantwell y col., 1990,Beckman y col., 1993)

ACV

Isopenicilina N

Ácidoadípico

Adipil 7-ADCA

Adipil 6-APA

S. clavuligeruscefE (expandasa)

Expansión químicadel anillo

Penicilinaacilasa

Glutarilacilasa

ACV

Isopenicilina NÁcido

adípico

Adipil 7-ADCA

Adipil 6-APA

A. chrysogenumcefEF (hidr-exp)

Adipil 7-AHCA

A. chrysogenumcefEF (hidr-exp)

ad7-ACCCA7-ADCA

A. clavuligeruscmcH (carbamoiltr)

ACV

Isopenicilina N

DAOC

Penicilina N


S. clavuligeruscefD (epimerasa)

H2N

CH3

S

NOCOOH


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de ácido adipil 7-aminocefalosporánico(adipil-7-ACA) cuando se introdujo elgen que codifica la acetiltransferasa(cefG) de A. chrysogenum.

De modo similar, la introducción de losgenes cefEF de A. chrysogenum y cmcH(carbamoil transferasa) de S. clavuligerusen P. chrysogenum dio como resultado laproducción del ácido adipil-7-amino-3-carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico(ad7-ACCCA), que es un precursor de ce-falosporinas muy interesante desde elpunto de vista de la estabilidad (Harris ycol., 2009) (figura 4).

Bases moleculares de lamejora de la producción depenicilina en P. chrysogenumComo consecuencia de los programas in-dustriales de mejora de cepas, se introdu-jeron numerosas modificaciones respon-sables de los títulos de penicilina tanimpresionantes producidos por P. chryso-genum. Algunas de estas modificacionesse han caracterizado en detalle, y se rela-cionan a continuación.

El fenómeno de amplificación de laagrupación de genes biosintéticos

Como se ha mencionado anteriormente,los genes pcbAB, pcbC y penDE se en-cuentran agrupados en un único cluster(figura 3) localizado en una región génicaque está presente a modo de única copiaen el genoma de las cepas de P. chryso-genum NRRL 1951 y Wisconsin 54-1255.Sin embargo, en cepas de alta produc-ción, esta región, cuyo tamaño varía entre56,8 kb y 106,5 kb (dependiendo de lacepa), sufre un fenómeno de amplifica-ción en tándem, dando lugar a varias co-

pias de la agrupación de genes biosinté-ticos (Fierro y col., 1995; Newbert y col.,1997). De este modo, la cepa AS-P-78tiene 5-6 copias del cluster, la cepa E1tiene 12-14 copias y la cepa DS0485 tiene5-6 copias (Fierro y col., 1995; Van denBerg y col., 2007). El mecanismo que llevaa la amplificación no es del todo cono-cido, pero se ha sugerido que los hexanu-cleótidos conservados que se encuentranlocalizados en los bordes de la región am-plificada pueden actuar de “sitios ca-lientes“ para la recombinación (Fierro ycol., 1995).

Cabe señalar que además de los tresgenes biosintéticos, la región amplificadatambién contiene otros genes (Fierro ycol., 2006; Van den Berg y col., 2007).Puesto que estos genes adicionales tam-bién sufren el fenómeno de amplificación,cabría esperar que pudiesen jugar unpapel en la biosíntesis, regulación o secre-ción de penicilina. Sin embargo, estosgenes son esenciales para este propósito,ya que, como se comprobó posterior-mente, la mera presencia de los tresgenes biosintéticos fue suficiente para res-taurar la producción de antibiótico en unmutante que carecía de la región com-pleta (García-Estrada y col., 2007; Vanden Berg y col., 2007).

No se han encontrado reguladores especí-ficos de la biosíntesis de penicilina en dicharegión, lo que indica que tal regulacióncorre a cargo de reguladores globales delmetabolismo secundario, tales como LaeAo el complejo Velvet. Tampoco se encuen-tran presentes dentro de la región amplifi-cada otros genes que codifican enzimasque contribuyen a la ruta biosintética depenicilina, como es el caso del gen ppt,que codifica la enzima PPTasa encargada


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de activar postraduccionalmente la ACVS(García-Estrada y col., 2008b), o del genphl, que codifica la fenilacetil-CoA ligasaencargada de activar la cadena lateral aro-mática de la bencilpenicilina (Lamas-Maceiras y col., 2006). Curiosamente, laamplificación de los genes laeA, ppt o phlmediante ingeniería genética tiene comoconsecuencia el aumento de los títulos depenicilina (Lamas-Maceiras y col., 2006;García-Estrada y col., 2008b; Kosalková ycol., 2009).

Aunque las cepas de alta produccióntienen varias copias de la región amplifi-cada, se ha visto que no existe una corre-lación directa entre la producción de pe-nicilina y el número de copias de losgenes biosintéticos (ni tampoco con losniveles de transcritos o proteínas) (Smithy col., 1989; Newbert y col., 1997; Nijlandy col., 2010; Smidák y col., 2010), lo queindica que existen otras modificacionesque también juegan un papel importanteen el incremento de la producción de an-tibiótico.

Disminución del catabolismodel ácido fenilacético

Otra de las modificaciones que ha sido ca-racterizada en detalle está relacionadacon el catabolismo del ácido fenilacético(el precursor de la cadena lateral de labencilpenicilina).

El ácido fenilacético es un ácido débil tó-xico para las células en función de su con-centración y del pH del cultivo. Este com-puesto puede metabolizarse en P.chrysogenum al menos a través de dosrutas metabólicas: incorporación a la mo-lécula de bencilpenicilina o catabolismo através de la ruta del homogentisato

(Fernández-Cañón y Peñalva, 1995;Mingot y col., 1999; Arias-Barrau y col.,2004; Ferrer-Sevillano y Fernández-Cañón,2007).

La primera etapa de la ruta del homogen-tisato consiste en la 2-hidroxilación delácido fenilacético y la formación de 2-hi-droxifenilacetato, el cual, en sucesivasetapas, se cataboliza a fumarato y acetoa-cetato. Esta 2-hidroxilación está catalizadapor un citocromo P450 monooxigenasamicrosomal denominada fenilacetato 2-hi-droxilasa (EC: 1.14.13), la cual está codifi-cada por el gen pahA. La secuenciación delgen pahA a partir de varias cepas de P.chrysogenum reveló que mientras que lacepa silvestre (NRRL 1951) contiene una Cen la posición 598 del gen, la cepa 49-133(y también su descendiente, Wisconsin 541255) sufrieron una mutación en esa po-sición, reemplazando la C por una T. Estamutación en el gen da lugar a una modifi-cación en la proteína (L181F), la cual es res-ponsable de la reducción en la actividadenzimática. Por tanto, el catabolismo delácido fenilacético está disminuido en lacepa Wisconsin 54-1255 y presumible-mente, en las cepas derivadas de esta, loque tiene como consecuencia un mayoracúmulo de este compuesto y una mayorproducción de bencilpenicilina (Rodríguez-Saiz y col., 2001).

La importancia de la fenilacetato 2-hidro-xilasa en la producción de penicilina sehizo más patente al comparar el genpahA de P. notatum (el aislado original deFleming) con el de P. chrysogenum NRRL1951 (la cepa silvestre aislada de unmelón en Peoria, IL). Esta última muestrauna mutación en el gen (C1357T), lo cualse traduce en una modificación de la pro-teína (A394V). Esta modificación también


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está presente en la cepa Wisconsin 54-1255 (y probablemente en sus cepas des-cendientes), lo que conduce a una dismi-nución de la activad fenilacetato2-hidroxilasa con la consiguiente reduc-ción en la oxidación de ácido fenilacéticoy la mayor producción de penicilina,hecho que justifica la selección históricade P. chrysogenum como productor in-dustrial de penicilina (Rodríguez-Saiz ycol., 2005). Por tanto, la acumulaciónconsecutiva de mutaciones puntuales enla fenilacetato 2-hidroxilasa es otro de losmotivos por los que P. chrysogenum estan buen productor de penicilina.

Aumento en el número demicrocuerpos (peroxisomas)

Los microcuerpos son orgánulos involu-crados en la última etapa de la ruta bio-sintética de penicilina (sustitución de la ca-dena lateral a través de la IAT) y en laactivación de dicha cadena lateral me-diante la enzima PCL. Se ha visto queexiste una relación directa entre la abun-dancia de microcuerpos (peroxisomas) yel incremento en los títulos de penicilina(Kiel y col., 2005). De hecho, se ha com-probado que el número de microcuerposse encuentra aumentado en las cepas dealta producción de penicilina (Van denBerg y col., 2008).

El hecho de que la ruta de biosíntesis depenicilina esté compartimentalizadaentre el citosol y los microcuerpos hasido crucial para la productividad, y pa-rece que P. chrysogenum ha perdido sucapacidad de sintetizar penicilinas en elcitosol (Müller y col., 1992), ya que losperoxisomas son esenciales para una efi-ciente biosíntesis de penicilina (Meijer ycol., 2010).

Modificaciones de la expresióngénica:Genómica y Transcriptómica

Las modificaciones detalladas anterior-mente fueron descubiertas y caracteri-zadas a lo largo de los años y no suponíanmás que la punta del iceberg. Muchasotras modificaciones se mantuvieronocultas hasta la llegada de la era de las“ómicas“.

La publicación de la secuencia completadel genoma de P. chrysogenum Wisconsin54-1255 (Van den Berg y col., 2008) su-puso el trampolín definitivo para que sedesarrollasen varios estudios encaminadosa descifrar los secretos que se encuentrandetrás de la producción de penicilina. Unade las modificaciones que se encontraronfue la introducción de una repetición de14 pb en un gen homólogo a una cefa-losporina esterasa cuando se modificó lacepa Q-176 para dar lugar a la cepaWisconsin 54-1255 (alterando el marcode lectura), lo que sugiere una reducciónen la degradación no deseada de beta-lactamas. Otro ejemplo lo constituye la in-troducción de una mutación en un trans-portador de tipo ABC cuando se modificóla cepa Q-176 para dar lugar a la cepaWisconsin 54-1255, lo que sugiere unamodificación en las capacidades de trans-porte (Van den Berg, 2010).

Los datos proporcionados por los estudiosde transcriptómica indican que la expresiónde los genes implicados en la biosíntesis deaminoácidos precursores de la penicilina(cisteína, valina y ácido α-aminoadípico)está aumentada en las cepas de alta pro-ducción. Varios genes que codifican prote-ínas de microcuerpos siguen la misma ten-dencia (Van den Berg y col., 2008).Curiosamente, también se observó que la


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transcripción de los genes biosintéticospcbAB, pcbC y penDE se incrementa única-mente entre 2 y 4 veces en las cepas de altaproducción (Van den Berg y col., 2008), loque sugiere que otras modificaciones enotras rutas metabólicas han contribuidotanto como el fenómeno de amplificacióngénica anteriormente mencionado a la pro-ducción de penicilina.

Aunque los datos provenientes de laGenómica y Transcriptómica han propor-cionado una visión global de algunos delos mecanismos que han contribuido al in-cremento de la producción de antibiótico,la integración de otras “ómicas“ era aúnnecesaria para aumentar el conocimientode las bases moleculares responsables delincremento de la producción.

Modificaciones globales delmetabolismo: Proteómicay Metabolómica

La reciente aplicación de las técnicas deProteómica y la optimización de la elec-troforesis bidimensional para P. chryso-genum permitió realizar un análisis com-parativo detallado entre la cepa silvestreNRRL 1951, la cepa de baja producciónWisconsin 54-1255 y la cepa de alta pro-ducción AS-P-78 (Jami y col., 2010) conel fin de analizar las modificaciones acon-tecidas en el metabolismo durante el pro-grama industrial de mejora de cepas.

Una visión global de las proteínas expre-sadas diferencialmente en estas tres cepasreveló que la representatividad de algunasrutas y funciones se había ampliado du-rante el proceso de mejora, mientras quepara otros casos estas habían disminuido.Se observó que en la cepa silvestre predo-minan las proteínas implicadas en la viru-

lencia y la degradación de la pared celularde plantas para la obtención de nutrientes(esta cepa fue aislada de un melón y, portanto, es capaz de infectar y crecer sobrefrutas). Un ejemplo lo constituye la glu-cosa oxidasa. La escasa representación deesta enzima asociada con la infectividadde plantas en las cepas de alta producciónno es sorprendente, ya que los cultivos lí-quidos sumergidos han sustituido al cre-cimiento natural sobre frutas.

Probablemente, la pérdida más notableque se produjo durante la selección deestas cepas fue la que implica a algunasrutas del metabolismo secundario, lo cualpotenció la biosíntesis de antibióticosbeta-lactámicos. Algunas de las proteínascuya síntesis estaba aumentada en la cepasilvestre llevó a plantear que una de las ra-zones de la escasa cantidad de penicilinaproducida por la cepa silvestre podría serel uso de los precursores y la energía parala biosíntesis de otros metabolitos secun-darios, tales como los terpenoides (3-hi-droxi-3-metilglutaril-CoA sintasa), porfi-rinas (coproporfirinógeno oxidasa) opigmentos como violaxantina (zeaxantinaepoxidasa) y la melanina (scytalone des-hidratasa), lo cual desviaría los flujos me-tabólicos lejos de la ruta de biosíntesis depenicilina. Los pigmentos constituyen unode los mejores ejemplos de metabolitossecundarios que se perdieron durante lamanipulación de la cepa silvestre para ob-tener la cepa Wisconsin 54-1255, comoes el caso del pigmento amarillo. Comose mencionó anteriormente, durante lostratamientos mutagénicos desde la cepaQ-176 a la cepa BL3-D10 (precursores dela cepa Wisconsin 54-1255), se seleccio-naron cepas sin pigmentación. Durante laselección de la cepa de alta producción


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AS-P-78, otras rutas del metabolismo se-cundario parecen haber sido bloqueadas,como sugiere la ausencia en la cepa AS-P-78 de una supuesta isoflavona reduc-tasa, la cual participa en la última partede la ruta biosintética de medicarpina.

Las proteínas implicadas en la biosíntesiso degradación de los aminoácidos precur-sores están representadas en las trescepas de modo distinto. En la cepa sil-vestre NRRL 1951, el aumento de los ni-veles de la metilmalonato semialdehídodeshidrogenasa podría ser otra de las ra-zones de la baja biosíntesis de penicilinapor parte de esta cepa. Esta enzima estáimplicada en la “vía distal“ del catabo-lismo de la valina (Goodwin y col., 1989;Zhang y col., 1996), conduciendo al ago-tamiento de las reservas de valina. La bio-síntesis de cisteína parece ser una de lasprincipales mejoras que se produjeron du-rante el proceso de selección. El flujo deproducción de penicilina está fuertementeinfluenciado por la disponibilidad de cis-teína para la formación de ACV (Nasutiony col., 2008). La cisteína sintasa (encar-gada de la biosíntesis de cisteína a partirde serina) está más representada en lacepa Wisconsin 54-1255 que en la cepasilvestre. Esta mejora se conserva en lacepa AS-P-78 que, además, mostró mayorcontenido de la enzima cistationina betasintasa, una enzima implicada en la bio-síntesis de cisteína a partir de metioninapor transulfuración. Esto indica que en lacepa AS-P-78 se han mejorado las dosvías de biosíntesis de cisteína.

En la cepa Wisconsin 54-1255 son predo-minantes las proteínas encargadas de laobtención de energía a partir de carbohi-dratos. Estas proteínas pertenecen en sumayoría al ciclo de los ácidos tricarboxí-

licos, aunque también hay enzimas de laglicolisis y de la ruta de la fosforilación oxi-dativa. Es probable que durante el pro-ceso de mejora de cepas, los mecanismosde obtención de energía fuesen benefi-ciosos para satisfacer la creciente de-manda para la biosíntesis de penicilina.

Un hallazgo interesante es que la cepaWisconsin 54-1255 produce mayores can-tidades, en comparación con la cepa dealta producción AS-P-78, de una proteínaque podría estar relacionada con la mo-dificación o degradación de penicilina.Esta enzima es similar a una 1,4-butano-diol diacrilato esterasa BDA1 (implicadaen la conversión de 1,4-butanodiol diacri-lato en 4-hidroxibutil acrilato) y contieneun dominio que está conservado en laclase C de beta-lactamasas y otras prote-ínas de unión a penicilina. Esta proteínamuestra similitud con una supuesta tran-sesterasa (LovD) de Aspergillus clavatus(85% de homología, 72% de identidad)y una beta-lactamasa de Paracoccidioidesbrasiliensis (48% de homología, 32% deidentidad). La transesterasa LovD añade2-metilbutirato a monacolina J paraformar lovastatina. Por lo tanto, la pro-teína 1,4-butanodiol diacrilato esterasapodría unirse al núcleo de la penicilinacontribuyendo a su modificación o degra-dación. La disminución de los niveles deesta proteína en la cepa AS-P-78 en com-paración con las cepas silvestre yWisconsin 54-1255 podría ser uno de losmecanismos que han contribuido al au-mento de los títulos de la penicilina enesta cepa industrial.

Otra modificación que podría haber ser-vido de base para el aumento de los tí-tulos de penicilina en la cepa AS-P-78 esla sobreproducción de enzimas de la ruta


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de las pentosas fosfato. Las enzimas de lafase no oxidativa de esta ruta, como la ri-bosa-5-fosfato isomerasa o la transceto-lasa, son predominantes en la cepa dealta producción. Además, algunas en-zimas que intervienen en la síntesis denovo de pirofosfato de tiamina se en-cuentran más representadas en la cepa dealta producción. El pirofosfato de tiaminaes un grupo prostético presente en nume-rosas enzimas. Una de estas enzimas es latranscetolasa (Shreve y col., 1983), queconecta la ruta de las pentosas fosfatocon la glicolisis mediante la introduccióndel exceso de azúcares fosfato en las prin-cipales rutas metabólicas de carbohi-dratos. Es probable que se originen altasconcentraciones de ribulosa-5-fosfato(junto con poder reductor en forma deNADPH) en la cepa de alta producción através de la fase oxidativa de la ruta de laspentosas fosfato, por lo que el exceso deeste azúcar fosfato sería convertido por laribosa-5-fosfato isomerasa en ribulosa-5-fosfato (precursora de nucleótidos yácidos nucleicos) y por la transcetolasa enprecursores para la glicolisis. El aumentoen los niveles de NADPH se ha correlacio-nado positivamente con la producción deantibióticos beta-lactámicos (Jørgensen ycol., 1995; Henriksen y col., 1996; VanGulik y col., 2000). Se sabe que la produc-ción de penicilina en las cepas de alta pro-ducción implica un gran suministro deNADPH (Kleijn y col., 2007) (la biosíntesisde un mol de penicilina requiere 8,10moles de NADPH). Además, se ha descritoque la producción de penicilina está fuer-temente influenciada por el nivel de ATPy la concentración de cisteína. Ya que elNADPH es necesario para la biosíntesis deeste aminoácido, existe una relación po-

sitiva entre los niveles de cisteína yNADPH y la producción de penicilina(Nasution y col., 2008). El NADPH tam-bién es necesario para reducir el glutatiónoxidado que se deriva de las tasas de ai-reación intensa durante el estrés oxidativo(Díez y col., 1998). Los resultados obte-nidos en este trabajo demostraron quevarias proteínas implicadas en la respuestaal estrés oxidativo (glutatión S-transferasa,citocromo P450 monooxigenasa, quinonaoxidorreductasa de NADPH, etc.) estánmás representadas en la cepa AS-P-78.

Algunas diferencias observadas en la cepaAS-P-78 se corresponden con los datosproporcionados por la respuesta transcrip-cional de una cepa de P. chrysogenummodificada para producir ad7-ACCCA.Esto puede ser debido a que la cepa deP. chrysogenum utilizada en este estudioera una cepa superproductora de penici-lina. Esta respuesta incluía una regulaciónpositiva de la transcripción de una su-puesta aflatoxina B1 aldehído reductasa,dos glutatión S-transferasas, una cito-cromo P450 monooxigenasa y una qui-nona oxidorreductasa de NADPH (Harrisy col., 2009). Estos resultados apuntan aque la respuesta al estrés oxidativo cons-tituye un mecanismo de adaptación a lasuperproducción de penicilina.

Es curioso que otra proteína que está másrepresentada en la cepa Wisconsin 54-1255 comparado con la cepa silvestre ytambién en la cepa AS-P-78 en compara-ción con la cepa Wisconsin 54-1255, hayasido identificada como una enoilrreductasaLovC (Pc20g05830). También se ha des-crito que existe una regulación positiva delgen que codifica la enoilrreductasa LovCcomo una de las respuestas transcripcio-nales de la cepa de P. chrysogenum que


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produce ad7-ACCCA (Harris y col., 2009).Dicha proteína participa en la biosíntesisdel precursor de lovastatina, dihidromona-colina L. Queda por establecer si esta pro-teína está verdaderamente implicada en labiosíntesis de lovastatina o si es una pro-teína indirectamente relacionada con labiosíntesis de penicilina.

ConclusionesLa era de las “ómicas“ ha permitido a loscientíficos, 80 años después del descubri-miento de Fleming del hongo productor depenicilina, empezar a comprender las basesmoleculares del incremento de la produc-ción de antibiótico como consecuencia deseis décadas de mejora clásica de cepas.Los avances en la Microbiología, Bioquí-mica, Genética y Biología Molecular hancontribuido al conocimiento de los genesy enzimas estructurales, auxiliares y regu-ladores, junto con la caracterización de loscompartimentos subcelulares involucradosen la biosíntesis de antibióticos beta-lactá-micos. Los datos proporcionados por laGenómica, Transcriptómica, Proteómica yMetabolómica han revelado las modifica-ciones principales del metabolismo pri-mario y secundario que han ocurrido du-rante los programas de mejora de cepas,dando lugar al cuidadoso reequilibrio entreprocesos celulares y metabólicos responsa-bles de los impresionantes títulos de peni-cilina alcanzados por las cepas industrialesactuales. Estos hallazgos servirán de ayudaa la comunidad científica pertenecientetanto a la industria farmacéutica como alámbito académico, no solo para continuarla explotación de la exitosa sinergia exis-tente entre P. chrysogenum y la producciónde antibióticos beta-lactámicos, sino tam-bién para explorar la producción de otros

compuestos usando este hongo, que hademostrado ser tan versátil como factoríacelular.

AgradecimientosLos avances en el conocimiento de la pro-ducción de antibióticos beta-lactámicos hansido fruto del trabajo llevado a cabo por va-rios grupos de investigación, siendo uno delos más importantes el formado por el pro-fesor Juan Francisco Martín y su equipo deinvestigadores de la Universidad de Leóny del Instituto de Biotecnología de León(INBIOTEC). Gran parte de los trabajos hansido financiados a través de distintos orga-nismos, entre los que destacan la UniónEuropea (Proyectos Eurofung QLRT-1999-00729 y Eurofungbase), Ministerio deIndustria (Proyecto PROFIT: FIT-010000-2007-74), Ministerio de Ciencia yTecnología, Programa Torres Quevedo(PTQ04-3-0411 y PTQ05-02-02553), Juntade Castilla y León (Proyecto LE13/04),Agencia de Inversiones y Servicios deCastilla y León (Proyecto Genérico deDesarrollo Tecnológico 2008) y DSMAntiinfectives.

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La finalidad de este proyecto es confirmarla utilidad del perro como modelo animalpara el diagnóstico, pronóstico y terapiade los tumores gliales humanos. La es-pecie canina es un modelo animal natural,con una incidencia de gliomas espontá-neos similar, y en algunos casos inclusosuperior, a la de la especie humana.Además, el perro comparte con la especiehumana su medio natural, está sometidoa los mismos factores ambientales, dieté-ticos e incluso tóxicos. La profundizaciónen el estudio de los gliomas caninos, me-diante el estudio de las células madre tu-morales, su identificación, estudio in vitrode sus propiedades biológicas (división,diferenciación, invasividad, etc.), así comosu comportamiento in vivo (inoculaciónen ratones inmunodeficientes para repro-ducir el tumor canino original), permitiráidentificar nuevas dianas diagnósticas, depronóstico y terapéuticas que podrán en-sayarse en la especie canina y aplicarse,posteriormente, a la especie humana.

Antecedentes y estado actualde los conocimientosLas células madre (stem cells) se definencomo aquellas que tienen la capacidad de

perpetuarse mediante autorrenovación yde generar células maduras de un tipoparticular de tejido mediante su diferen-ciación (1). Estas células han sido bien es-tudiadas y caracterizadas durante el de-sarrollo embrionario, son las llamadascélulas madre embrionarias (embryonicstem cells); se caracterizan por ser pluri-potentes, es decir, pueden diferenciarseen células de linajes diferentes pertene-cientes a las tres hojas embrionarias. Enlos últimos años se han identificado cé-lulas madre en tejidos y órganos de ani-males adultos. Estas células madreadultas, en algunos órganos, son las en-cargadas de la sustitución y de la restau-ración de la funcionalidad celular. Su po-tencial de proliferación y diferenciación esmucho menor que el de las embrionariaso fetales. Se localizan en nichos, formadospor células especializadas y células madreadultas. Son multipotentes, dan célulasdel tejido al que pertenecen, a no ser quese reduzca su transdiferenciación.

En el tejido nervioso adulto se han iden-tificado zonas neurogénicas, donde re-siden células madre neurales (neural stemcells) (2), localizadas en nichos (3), locali-zadas tanto en el encéfalo como en lamédula espinal. Además, se ha compro-

El glioma canino como modelo animalnatural de los gliomas humanos:estudio de las células madre cancerosaspara la determinación de nuevas dianasdiagnósticas y terapéuticasDr. Martí Pumarola i Batlle


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bado su capacidad multipotencial, gene-rando in vitro tanto en neuronas como encélulas gliales (2, 4).

Células madre tumorales

El potencial de proliferación indefinido quedetermina la formación y el crecimiento deun tumor, así como la similitud de los me-canismos que regulan la autorrenovaciónde las células madre normales con el de lascélulas cancerosas, ha llevado a la hipótesisde que una parte de la población tumoralpodría originarse directamente de célulasmadre adultas y con ello se ha establecidola hipótesis de las células madre tumorales(en adelante las llamaremos CSC, abrevia-tura de cancer stem cells) (1, 5, 6). Segúnesta nueva hipótesis, no todas las célulasde un tumor tienen las mismas habilidadesde proliferar y de mantener el crecimientodel tumor. Únicamente las llamadas CSCtienen la particularidad de proliferar y deautorrenovarse (7). Estas células, debido asu longevidad, son dianas para la acumu-lación de mutaciones genéticas, las cualesalterarían la regulación de su ciclo de reno-vación y podrían, así, cambiar su destino.Esta hipótesis justificaría el modelo jerár-quico descrito en los tumores (8) por el queúnicamente un grupo de células dentro deltumor tiene una capacidad de proliferaciónsignificativa y la habilidad de generarnuevos tumores similares al primario. Estanueva hipótesis se añade a la llamada hi-pótesis tumorigénica tradicional por la cuallos tumores se originan a partir de la des-diferenciación de células maduras en res-puesta a alteraciones genéticas. En estecaso, todas las células tienen un potencialtumorigénico parecido que se activa sin-crónicamente y con una frecuencia baja(hipótesis estocástica clásica) (8).

Esta nueva hipótesis se ha visto refren-dada por diferentes grupos, especial-mente en tumores malignos o de altogrado (5, 9), aunque también se ha de-mostrado en tumores benignos (6). Lostumores nerviosos también cumplendicha hipótesis (7, 10-15) especialmentelos gliomas (8, 15).

Para confirmar esta hipótesis en los tu-mores nerviosos se requieren como mí-nimo diferentes estudios (15-17):

• Marcadores de superficie celular e intra-celulares: su número es muy grande y sueficacia muchas veces cuestionada (verapartado siguiente: Identificación y es-tudio de las CSC en el tejido nervioso).

• In vitro:

– Ensayo de neuroesferas: se usa para de-finir la identidad de las células madreneurales. A partir de células individualesobtenidas de la disociación de célulasdel tejido germinal, se exponen a fac-tores de crecimiento en un sistema decultivo no adhesivo. Su expansiónclonal forma esferas que contienenNSC mezcladas con células más dife-renciadas de líneas específicas. Su ca-racterización evalúa la multipotencia-lidad de las neuroesferas. Su capacidadde autorrenovación se evalúa aislandocélulas de la neuroesfera primaria y ge-nerando nuevas neuroesferas.

– Disociación de las neuroesferas y ge-neración en medios de cultivo selec-tivos, de líneas celulares diferenciadas(neuronales, βIII tubulina+; astrocita-rias, GFAP+...).

• In vivo:

– Para evaluar la capacidad tumorigé-nica totipotente, se inoculan células

El glioma canino como modelo animal natural de los gliomas humanos: estudio de…

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de las neuroesferas subcutáneamenteen ratones inmunodeficientes, con loque se puede seguir fácilmente la ge-neración y desarrollo del tumor y sucaracterización histológica.

– Implantación en encéfalo de ratonesinmunodeficientes de células de lasneuroesferas disociadas. Deberá ge-nerarse un tumor fenotípicamente si-milar al que generó las neuroesferasal desarrollarse en un microentornopropio de estas células, confirmandocon ello su capacidad tumorigénicaespecífica.

Identificación y estudio de las CSC enel tejido nervioso

A mediados de los años 60 del siglo pa-sado se empezaron a publicar los pri-meros estudios que demostraban la exis-tencia de zonas neurogénicas en elencéfalo adulto: el bulbo olfatorio, el hi-pocampo y zonas del neocórtex del encé-falo de rata y de gato adultos (18, 19).Dichos hallazgos se fueron confirmandoen encéfalos de roedores (20, 21) y enotras especies, como en las aves (22). Sinembargo, estudios posteriores en monoadulto rechazaron o limitaron dicha hipó-tesis (23). A partir de los años 90, graciasa la utilización de nueva metodología, sereemprendieron los estudios previos y seconfirmaron los hallazgos de neurogé-nesis en encéfalo adulto en las diferentesespecies animales descritas (24, 25).Finalmente, se confirmó dicha hipótesisen la especie humana, demostrándoseneurogénesis en el gyrus dentatus del hi-pocampo adulto (26). Con posterioridad,se han publicado muchos trabajos queconfirman la neurogénesis en el encéfaloadulto, ampliando el número de zonas

neurogénicas a la zona subventricular, es-triado, bulbo olfatorio, córtex piriforme,amígdala, hipotálamo, substantia nigra,N. del vago, médula espinal, etc. (2).

Como hemos mencionado en el apartadoanterior, las mejoras introducidas en las téc-nicas de estudio aplicadas al tejido nervioso(3H-thymidine, BrdU, retrovirus,14C, etc.)son las que han permitido demostrar yconfirmar la presencia de células madre ac-tivas en el encéfalo adulto (2). Ello ha per-mitido no solo localizarlas sino determinarlas características de la neurogénesis en eladulto, evaluando su funcionalidad y losfactores que regulan su mantenimiento, suproliferación, la elección de su destino, sumigración y orientación, así como su inte-gración en circuitos neuronales preestable-cidos mediante su integración sináptica (4).Una atención especial está mereciendo elnicho, o microambiente, que rodea a lascélulas madre y que regula su supervivenciay proliferación en el encéfalo adulto (3).

Para el estudio e identificación de las cé-lulas madre en el tejido nervioso adulto,tanto normal como tumoral, se hanusado diferentes técnicas y marcadorescelulares (5, 8, 0). La nestina, un filamentointermedio de clase IV, ha sido conside-rada durante mucho tiempo como unaproteína específica del citoesqueleto delas células madre y de los neuroblastos,tanto en el embrión como en el adulto(27, 28). Sin embargo, se ha visto que noes tan exclusiva de dicha población ce-lular, ya que se ha demostrado su pre-sencia en células no nerviosas, como en-dotelios, músculo estriado y cardiaco, piely anejos cutáneos, hígado, páncreas,riñón, adrenal y testículo (27, 29).Además, cuando el tejido nervioso se al-tera debido a lesiones traumáticas, exci-


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totóxicas o isquémicas, inflamación o epi-lepsia, se reexpresa en astrocitos activados(27, 30). Lo mismo ocurre en muchos tu-mores nerviosos, como neurocitomas yneuroblastomas, gliomas, en especial glio-blastomas, astrocitomas y ependimomas,meduloblastomas y schwannomas (27), locual indicaría el grado de desdiferencia-ción de sus células (8). En la actualidad seconsidera un marcador de células madresiempre que se acompaña de otros mar-cadores que así lo confirmen y se utilizaen la mayoría de estudios que se estánpublicando sobre tumores nerviosos, enespecial, los que estudian tumores degrado alto o poco diferenciados (31).

Otro marcador ampliamente utilizado esCD133 (prominina-1), una glicoproteínatransmembrana típica de células madreneuroepiteliales de ratón y humanas,aunque no exclusivo de las mismas, ya quelas células madre hematopoyéticas tambiénlo expresan (7, 8). Su función no es del todoconocida; se le relaciona con la polariza-ción, migración e interacción entre las cé-lulas y la matriz extracelular. Se ha vistocómo células CD133+ aisladas de tumoresnerviosos muestran propiedades de célulasmadre y pueden iniciar y dirigir la progre-sión del tumor in vivo (5, 7, 8, 32). Además,estas células CD133+ poseen resistencia adrogas y toxinas, activando su capacidad dereparación del ADN y su resistencia a laapoptosis, la irradiación y la quimioterapia(8). También se relacionan dichas célulascon la sobreexpresión del receptor de laquemoquina de superficie celular CXCR4,el cual regula la dirección de la migracióncelular y, con ello, la actividad invasiva tu-moral (8). También se han utilizado en tu-mores nerviosos para identificar el nicho enel que se encuentran las células madre (12).

Ante la variabilidad de resultados obte-nidos se ha recurrido a la combinación denestina y CD133 para asegurar unamayor fiabilidad en la identificación de cé-lulas madre neurales (5, 8, 32), especial-mente para el estudio de tumores ner-viosos (13-15).

La activación de vías de señalización quenormalmente regulan las células progeni-toras puede tener un papel importante enla formación de tumores (3, 4, 33); un ex-ceso de dichas vías puede provocar latransformación fenotípica de dichas cé-lulas. Así, se ha utilizado la familia de re-ceptores transmembrana Notch –1, 2, 3y 4–, esenciales para el mantenimiento deles células madre neurales, promoviendosu autorrenovación e inhibiendo la dife-renciación neuronal o glial (8). En elmismo sentido se utilizan otros factores(5, 11, 34), como: BMI-1, esencial para laautorenovación de les células madre neu-rales; Sonic Hedgehog, relacionado congliomas; las BMP, que regulan la homeos-tasis en diferentes órganos y tejidos con-trolando la diferenciación, proliferación yla apoptosis; PTEN, Hox, Wnt, etc.

Los factores de crecimiento también hanresultado de interés en el estudio de lascélulas madre neurales y su transforma-ción. PDGF (platelet derived growhtfactor) y sus receptores, identificados enel encéfalo adulto, en neuronas y astro-citos, especialmente en la zona subventri-cular, muestran activación durante la glio-magénesis, en especial en glioblastomas(8, 10). EGF (epidermal growth factor) es-timula la proliferación y la diferenciaciónde las células madre neurales; cuando sunivel es alto se convierten en célulasgliales altamente invasivas típica de losgliomas; muchos astrocitomas expresan


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EGF (10). TGF y sus receptores también sehan asociado a la generación de gliomas(35, 36) en especial de glioblastomas (37).

Está surgiendo una nueva línea de inves-tigación con el análisis de la nucleoste-mina, un gen presente en las célulasmadre que codifica para una proteína delnucléolo celular y que, aparentemente,tiene un papel crítico para la autorreno-vación de estas células (38). Esta proteína,expresada especialmente en precursoresneuroepiteliales durante la embriogénesis,desaparece cuando la célula empieza sudiferenciación, volviéndose a expresar entumores nerviosos (39).

CSC y tumores nerviosos caninos

Existe una abundante bibliografía que des-cribe la incidencia de tumores espontáneosen el sistema nervioso central de animales,siendo el perro la especie animal conmayor número de referencias (40, 41). Lostumores intracraneales se presentan conuna incidencia anual superior en la especiecanina que en la humana (14,5 por cada100.000 perros, comparados con los 4-5por 100.000 en humanos) (17).

En el perro, el glioblastoma intracranealse presenta con mayor incidencia en razasbraquiocefálicas, en particular Bóxer(30%) y Boston Terrier; no se ha descritopredilección por sexo y su incidencia au-menta a partir de los 6 años (40). Las lo-calizaciones más frecuentes son cerebro ydiencéfalo. Las técnicas de imagen apli-cadas a su diagnóstico, como la tomo-grafía axial computarizada (TAC) y la re-sonancia magnética nuclear (RMN),permiten detectar características tumo-rales similares a las descritas en la especiehumana (17).

El estudio de la hipótesis de las CSC entumores de animales domésticos es muyincipiente. En la literatura solo aparecenpublicados dos trabajos realizados en tu-mores de piel y mama caninos y felinos(42, 43), uno en un osteosarcoma canino(44) y otro en carcinomas hepáticos ca-ninos (45). En estos estudios, sus autoresse limitan a demostrar la presencia de lasCSC mediante ensayo de mamoesferas osarcoesferas y a tipificar las poblacionescelulares diferenciadas a partir de dichoscultivos primarios.

Hasta el momento, existe un único es-tudio llevado a cabo a partir de un glio-blastoma canino (17) en el que, ademásde demostrar la presencia de CSC in vitro,mediante ensayo de neuroesferas y su di-ferenciación en células pertenecientes adistintas poblaciones neurales, repro-ducen in vivo el tumor canino original ino-culándolo, intracerebralmente, en ratonesinmunodeficientes.

CSC, tumores nerviosos humanos ymodelos animales

En la especie humana, los tumores ner-viosos constituyen menos del 2% de lasneoplasias malignas, pero son el se-gundo tumor más frecuente en niños,después de las leucemias (46). De entrelos tumores intracraneales, un 60% sonde origen neuroepitelial, un 28% me-níngeo y un 7,5% derivado de los ner-vios craneales. La mortalidad en pa-cientes con tumores encefálicos es muyalta, dependiendo del tipo y grado deltumor; los pacientes con tumores degrado IV, como es el caso del glioblas-toma, tienen una supervivencia menor alos 2 años desde el momento de su diag-nóstico. El Glioblastoma es el tumor en-


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cefálico más frecuente (un 12-15% delas neoplasias intracraneales y un 50-60% de los tumores astrocíticos) conuna incidencia de dos-cuatro nuevoscasos por cada 100.00 personas/año. Laratio mortalidad/incidencia de los tu-mores nerviosos en la especie humanarefleja la efectividad del diagnóstico y delas medidas terapéuticas (46).

Los modelos animales utilizados hasta elmomento para el estudio de la hipótesisde la CSC en tumores nerviosos se limitana (46, 47):

• Tumores creados mediante métodos queno se focalizan en un gen específico:

– Desde los años 70 se utilizan inyec-ciones intravenosas repetidas de com-puestos, como la methylnitrosourea(MNU) y la N-ethyl-N-nitrosourea(ENU), provocando gliomas en ratasinmunocompetentes.

– Inyección de células de glioma de rataen hospedadores singénicos como lalínea C6 de glioma, el modelo Fisher,la línea CNS-1 y sobre todo, la líneaGL261.

– Inyección de células de glioma hu-mano implantadas en ratones atí-micos.

• Tumores creados por una mutación gé-nica dirigida y conocida que tambiénestá presente en tumores humanos,como, por ejemplo, p53, INK4a/ARF,PTEN, EGF-R, PDGF, etc.

También se están utilizando ratones en losque se provoca el tumor nervioso utili-zando vectores virales (lentivirus) (48).Finalmente, se utilizan ratones modifi-cados genéticamente (knockout condicio-nales, usando promotores como GFAP,

S-100, nestina…), los cuales presentanuna incidencia alta de tumores nerviososespontáneos (49).

La fiabilidad de los resultados obtenidosal extrapolarlos a los tumores nerviososde la especie humana se han puesto encuestión (47) debido, principalmente, alas deficiencias inmunológicas existentesen los modelos murinos descritos: muybaja expresión de antígenos de superficiee inmunosupresión local y sistémica aso-ciada.

Las ventajas de utilizar un modelo animalcomo es el perro, más cercano a la es-pecie humana, resultan cada vez más evi-dentes y son defendidas por un mayornúmero de grupos de investigadores.Destacamos entre ellas (50-52):

• Los estudios longitudinales son simi-lares, debido a la vida más larga delperro respecto del ratón.

• El perro comparte características bioquí-micas y fisiológicas con los humanos: lapresentación de la enfermedad y la res-puesta clínica del perro son más seme-jantes a la de la especie humana.

• Más de la mitad de las enfermedadeshereditarias del perro tienen equivalenteen el hombre (cardiomiopatía, distrofiamuscular, cáncer de próstata, etc.) in-cluso las multifactoriales (diabetes, epi-lepsia, cáncer, asma).

• Se ha secuenciado el genoma canino, loque permite su estudio.

• El perro ha sido fundamental como ins-trumento para el estudio y desarrollodel trasplante de médula ósea y de losprotocolos de terapia génica, cardiovas-cular y ortopédica.


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• En los trasplantes, la cinética de las cé-lulas madre en el perro es biológica-mente comparable a la humana en re-lación a necesidades hematopoyéticas yrespuesta a citoquinas.

• Posibilidad de clonación terapéutica decélulas caninas.

• Existen líneas celulares embrionarias ca-ninas obtenidas a partir de blastocistoso de embriones de 13-14 días.

• La reprogramación de células somáticascaninas hacia un fenotipo pluripotencialda como resultado células equivalentesa les células madre.

Estado actual de grupos quetrabajan con materias afinesal proyectoEn Medicina Humana, en los últimos añoshan proliferado enormemente los gruposque se dedican al estudio de las CSC en di-ferentes tipos de tumores, incluidos los ner-viosos. Dentro de este último grupo desta-camos los grupos liderados por el Dr. O.Brüstler (Institute of ReconstructiveNeurobiology, Life and Brain Center,Universidad de Bonn, Alemania), el Dr.Schiffer (Departamento de Neurociencia dela Universidad de Turín, Italia), la Dra.Cattaneo (Centre for Stem Cell Research,Universidad de Milán, Italia), el Dr. Pollard(Wellcome Trust Centre for Stem CellResearch, Universidad de Cambridge, ReinoUnido), Dr. Frisen (Department of Cell andMolecular Biology, Medical Nobel Institute,Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia). Ennuestro país son ya numerosos los gruposque desarrollan tanto investigación básica(Facultad de Medicina, Universidad deBarcelona, IDIBAPS; Insituto de Oncología

del Hospital Vall d’Hebron, Barcelona;Centro Nacional de InvestigacionesOncológicas –CNIO–, Madrid; Instituto deInvestigación Biomédica –INIBIC–, ACoruña, etc.) como aplicada (Instituto deBiología Molecular y Celular del Cáncer,CSIC/Universidad de Salamanca; HospitalUniversitario Dr. Negrín, Las Palmas de GranCanaria, etc.) aplicada a la Neurooncología.

En Medicina Veterinaria, tal como hemoscitado en la sección anterior, existen aúnpocos grupos que se dediquen al estudiode las CSC en tumores espontáneos ani-males. Citamos a continuación, los cuatrogrupos que han publicado resultados alrespecto:

• Department of Medical Sciences,University of Wisconsin, Madison, WI,EUA, en colaboración con la Royal (Dick)School of Veterinary Studies, de laUniversidad de Edimburgo, Reino Unido(43, 44).

• Facultad de Medicina Veterinaria de laUniversidad de Milán, Italia, en colabo-ración con el Max Planck Institute,Muenster, Alemania (42).

• Departments of Veterinary Pathobiologyand Small Animal Medicine and Surgery,College of Veterinary Medicine, TexasA&M University, College station, TX,EUA (17).

• Departamentos de Patología y Cirugía,Facultad de Medicina Veterinaria y deCiencia Animal, Universidad de SaoPaulo, Brasil (45).

En el Estado español no existe aún ningúngrupo que haya publicado ningún trabajoen este ámbito en animales de compañía(perro o gato).


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Experiencia de nuestro grupoen el estudio de las CSC entumores gliales caninosNuestro Grupo de Neuropatología Veteri-naria (GNPV) tiene amplia experiencia enel estudio y diagnóstico de las enferme-dades neuropatológicas en animales tantodomésticos como salvajes y de laboratorio.Queremos destacar las siguientes.

• Estudios clínico-patológicos en medicinade animales de compañía, general y deespecialidad (Neurología, MedicinaInterna, Dermatología, Imagen, Exóti-cos, Équidos), realizados por convenioscon empresas o dirigidos a proyectos deinvestigación integrados y multidiscipli-nares.

• Enfermedades infecciosas: participaciónen programas de vigilancia de enferme-dades emergentes en nuestro país:lengua azul en rumiantes domésticos ysalvajes, enfermedades víricas (flavivirus)vehiculadas por artrópodos (West Nileen équidos). Desarrollando técnicas deevaluación clínica y de diagnóstico his-topatológico.

• Neurooncología: colaboración con el Dr.Kaspar Matiasek, neuropatólogo de laFacultad de Veterinaria de laUniversidad de Múnich, Alemania, ensu proyecto de estudio epigenético detumores caninos en colaboración con elbanco de tejidos (colección de tumores,estudios de expresión génica, etc.).

• Neurodegeneración: líneas abiertas enel estudio de las enfermedades neuro-degenerativas animales (enfermedad deneurona motora, mielopatías degenera-tivas, leucodistrofias) en colaboracióncon grupos de investigación de medi-

cina humana. Creación de una nuevalínea de estudio del envejecimiento deltejido nervioso animal en colaboracióncon otros grupos (Parc Zoològic deBarcelona, Dr. Isidro Ferrer-Bellvitge),evaluando la utilidad de primates yperro como modelos para el estudio delenvejecimiento humano.

• Enfermedades priónicas en animales(Laboratorio PRIOCAT): estudio de la pa-togenia de la neurodegeneración usandomodelos animales modificados genética-mente complementados con material decampo (casos autóctonos) en colabora-ción con el BTAC. Estudios de expresióngénica en ovejas afectadas de scrapie encolaboración con el grupo que dirige elDr. Juan Badiola, de la Universidad deZaragoza. Evaluación de nuevas técnicasque mejoren los niveles de detección dela proteína priónica para detectar casosclásicos y atípicos, tanto en ovino comoen bovino. Estudio de priones en espe-cies no sensibles con el grupo del Dr.Joaquín Castilla, CIC-bioGUNE, Derio,Bilbao.

• Animales modificados genéticamente:desde la Unidad de Patología Murina delCBATEG: servicio de fenotipado de ra-tones transgénicos (mouse clinic). Estudiode la patogenia de enfermedades meta-bólicas (diabetes, Sanfilippo).

• Banc de Teixits Animals de Catalunya(BTAC): único biobanco con tejidosanimales existente en nuestro país.Participación en estudios clínicos yproyectos de investigación de gruposde investigación externos aportandomuestras del banco. Disminución deluso de animales para experimenta-ción.


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Desde hace aproximadamente año ymedio, hemos iniciado en nuestro grupoel estudio de las células madre del tejidonervioso, especialmente en el encéfalo deanimales adultos.

El primer paso ha sido poner a punto téc-nicas que nos permitieran identificar célulasmadre adultas en encéfalos animales en te-jidos fijados en formol e incluidos en para-fina. Para ello, gracias a nuestra experienciaen estudios inmunohistoquímicos, pusimosa punto diferentes marcadores de lasmismas. El primero de ellos fue nestina. Apartir de encéfalos de diferentes especiesanimales, perro y ratón, identificamos cé-lulas nestina+ en diferentes localizacionesencefálicas: zona subventricular y gyrusdentatus. A pesar de que los resultados ob-tenidos coincidían con los publicados porotros autores, ponían en cuestión la espe-cificidad de este marcador, ya que en al-gunas zonas resultaban también positivascélulas maduras con morfología neuronalo glial (astrocitos).

Con el anticuerpo contra Olig2, marcadorde precursores gliales de la línea oligoden-drocítica, no tuvimos problemas, ya queobtuvimos un marcaje específico y clarotanto en perro joven como en viejo.

A continuación pusimos a punto CD133.En este caso, la puesta a punto la hicimosen riñón de perro, obteniendo positividaden los epitelios de los túbulos contor-neados. En los tumores gliales, la positi-vidad se correspondía con los vasos y concélulas aisladas.

Una vez puestos a punto los nuevos mar-cadores, aplicaremos todos ellos al es-tudio de los distintos tumores gliales ca-ninos. Estos resultados preliminares hansido presentados en dos congresos:

• Como una comunicación oral titulada“Caracterización y clasificación de neo-plasias de células gliales en perro, es-tudio histológico e inmunohistoquí-mico“, presentada en la XXI Reunión dela Sociedad Española de AnatomíaPatológica Veterinaria (SEAPV), cele-brada del 24 al 26 de junio de 2009 enLugo.

• Parte de una comunicación oral titulada“Cancer stem cells in canine gliomas: pre-liminary results in a study of 17 cases”,presentada en el 22nd SymposiumEuropean Society of Veterinary Neuro-logy-European College of VeterinaryNeurology (ESVN-ECVN), celebrado del24 al 26 de septiembre de 2009, enBoloña (Italia).

En paralelo a esta puesta a punto de téc-nicas de laboratorio, hemos organizado larecolección de tumores gliales caninos.Para ello, contamos con la colaboraciónimprescindible del SNN-FHCV-UAB, dirigidopor la Dra. Sònia Añor y con su equipo deresidentes. El primer paso ha sido la forma-ción del grupo clínico para la detección deperros afectados de gliomas intracebre-brales inoperables o intratables; a estosanimales únicamente se les puede reco-mendar una eutanasia humanitaria. Unadificultad adicional ha sido conseguir do-naciones de cadáveres por parte de los pro-pietarios de dichos perros. Para ello se ins-taló un póster en la consulta de Neurologíadel hospital informando a los propietariosdel proyecto y animándoles a colaborar enel mismo, donando el cadáver de sus pe-rros una vez eutanasiados.

Inmediatamente después de practicada laeutanasia se procedió a la necropsia y ex-tracción del encéfalo (post mórtem máximo


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de 30 minutos). Se extrajeron muestras detejido tumoral, de tejido nervioso adyacenteal tumor y de tejido nervioso alejado deltumor (hemisferio contralateral). Las mues-tras en fresco fueron sumergidas en mediode cultivo. Se tomaron muestras en conge-lación para posteriores estudios inmunoquí-micos. El resto del encéfalo fue sumergidoen solución de formol tamponado. Una vezfijado, fue tallado e incluido en parafina deforma rutinaria.

A partir de las muestras en fresco se pro-cedió al cultivo de células madre cance-rosas en flotación. El tejido disociado per-mitió el crecimiento y expansión decélulas madre formando glioesferas man-tenidas en un estadio indiferenciado. Elcultivo de células madre en medios de di-ferenciación permitió la obtención de di-versos fenotipos neurales, tanto gliales(GFAP y Olig2) como neuronales (Tuj1).

A estos tumores se les están aplicando lastécnicas de inmunohistoquímica usandolos marcadores descritos para detectarCSC, así como otros marcadores conven-cionales para tipificar las diferentes pobla-ciones celulares.

Parte de estos últimos resultados han sidopresentados en forma de póster titulado“Hipótesis de las células madre cancerosas(cancer stem cells) en tumores gliales ca-ninos: resultados preliminares“, en la XXIIReunión de la Sociedad Española deAnatomía Patológica Veterinaria (SEAPV),celebrada del 16 al 18 de junio de 2010 enValencia.

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En la actualidad, las tres enfermedades in-fecciosas que causan mayor número demuertes en el mundo son las llamadas en-fermedades de la pobreza, que incluyenla tuberculosis, el sida y la malaria.

La tuberculosis es una enfermedad tanantigua como la humanidad. Se han des-crito manifestaciones de tuberculosis enmomias egipcias con más de 3.000 añosde antigüedad, así como en momias pre-colombinas. La tuberculosis causó unagran mortalidad en las ciudades europeasdurante los siglos XVIII y XIX, siendo en elsiglo XIX la principal causa de mortalidadde la juventud europea.

Tras el descubrimiento por Robert Kochdel bacilo causante de la tuberculosis y sudescripción pública el 24 de marzo de1882, las medidas de higiene y preven-ción se fundamentaron en la detección decasos y en el aislamiento de los enfermosque eran tratados en los sanatorios anti-tuberculosos. En los años sucesivos, la“lucha organizada contra la tuberculosis”unida a la mejora de las condiciones devida permitió disminuir drásticamente elnúmero de muertos en los países indus-trializados.

En los años 20, Albert Calmette y CamilleGuérin, tras 13 años de cultivos sucesivosdel bacilo de la tuberculosis en el labora-torio, logran que pierda su virulencia y de-sarrollan la vacuna denominada BCG (ba-

cilo de Calmette y Guérin). Esta vacuna hamostrado su eficacia contra las formas másgraves de tuberculosis, como son las loca-lizaciones meníngea y diseminada. Conjun-tamente a la utilización de la vacuna BCG,en la segunda mitad del siglo XX se descu-brieron fármacos eficaces contra esta en-fermedad. Administrados de forma con-junta y durante prolongados periodos detiempo, constituyen un arsenal terapéuticoeficaz para el tratamiento de la tuberculosis.

Situación actual de latuberculosis en el mundoEl conocimiento de la historia natural dela enfermedad, la mejora de los métodosde diagnóstico y la existencia de un trata-miento eficaz llevaron a considerar en lospaíses industrializados que la enfermedadse encontraba bajo control. Sin embargo,en los años 90, saltó la alarma en dichospaíses industrializados. El número decasos experimentó un aumento, registrán-dose un número de enfermos superior alesperado y se detectaron formas epidé-micas de tuberculosis resistentes a los fár-macos convencionales en hospitales deestos países; la tuberculosis se convertíade nuevo en una enfermedad incurable.En 1993, la Organización Mundial de laSalud declaró la tuberculosis como unaemergencia global, estimando que, anual-mente, el número de nuevos casos supe-

Los retos de la erradicación de latuberculosis en el siglo XXIDr. Jesús Gonzalo Asensio, Dra. Sofía Samper Blasco,Dr. José Antonio Aínsa Claver, Dra. Isabel Otal Gil y Dr. Carlos Martín Montañés


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raría los 10 millones y causaría 2 millonesde muertos.

Desde los años 60, en que se iniciaron losprimeros tratamientos, se han descritocepas resistentes a los distintos antituber-culosos. Sirva de ejemplo que, en abril de1991, el 33% de las cepas aisladas enNueva York eran resistentes al menos a unantibiótico. El mal cumplimiento del trata-miento está considerado el principal factorasociado con la aparición de resistencias.Actualmente, los países en vías de desa-rrollo, especialmente África subsahariana,amplias zonas de Asia y algunas nacioneslatinoamericanas, son los que presentan unmayor número de casos de tuberculosis re-sistente a los principales antituberculostá-ticos. También supone un grave problemaen algunos países de la antigua UniónSoviética, donde se han detectado epide-mias de tuberculosis multirresistente, con-siderándose el control de estas epidemiasuna prioridad (OMS, 2004). Con el fin dedescribir este problema global, la OMS, en1994, implementó un programa de vigi-lancia de resistencias que de manera ruti-naria recoge datos y analiza las resistenciasdetectadas en los distintos países. Comodato alarmante, el último informe de2012, que incluye datos de 80 países yocho territorios, recoge el mayor índice detasas de multirresistencia desde su inicio(Zignol, 2012).

La estrategia del bacilode la tuberculosisComparado con otras bacterias, el bacilode la tuberculosis se multiplica muy lenta-mente (24 horas). Crece dentro de las cé-lulas del hospedador que infecta; en la tu-berculosis humana, su único hábitat es el

ser humano, transmitiéndose entre per-sonas por vía respiratoria. Tras ser infec-tadas por el bacilo, entre un 5 y un 10%de las personas infectadas desarrollan laenfermedad, ya que la susceptibilidad a laenfermedad es multifactorial. Entre lasmúltiples causas que se asocian con desa-rrollar una tuberculosis se encuentran fac-tores genéticos, pero también factores am-bientales que pueden disminuir lasdefensas del individuo, como una mala ali-mentación asociada a la pobreza o enfer-medades que afectan al sistema inmunoló-gico, como el sida.

Estudios moleculares recientes muestranque la estrategia de crecimiento lento delbacilo de la tuberculosis es muy eficaz yque, en comparación con otros microbios,su adaptación al ser humano es relativa-mente reciente, existiendo una gran simi-litud entre todos los aislamientos del ba-cilo de la tuberculosis, que seríandescendientes de un antecesor común(Mostowy, 2005). La hipótesis es que elbacilo infectó a los primeros humanos,aproximadamente hace 15.000 o 20.000años, cuando el ser humano comenzó avivir en sociedad en comunidades agrí-colas y ganaderas (Brosch, 2002, 2007).

Epidemiología molecularde la tuberculosis: siguiendoel rastro del bacilode la tuberculosisLos estudios moleculares permiten dife-renciar una cepa del bacilo de la tubercu-losis que ha producido la enfermedad enun determinado paciente. La posibilidadde detectar secuencias de ADN repetidas,en localizaciones y/o número diferentepara cada bacilo, nos permite la diferen-

Los retos de la erradicación de la tuberculosis en el siglo XXI

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ciación de cepas y seguir el rastro del ba-cilo de la tuberculosis. Estos estudios seiniciaron con el descubrimiento de una se-cuencia de inserción denominada IS6110,específica del bacilo de la tuberculosis. Elnúmero de copias de la secuencia IS6110es variable y estas se localizan en distintasposiciones del cromosoma de forma po-limórfica en las diferentes cepas. El es-tudio de esta secuencia, en cada cepa,permite obtener un patrón similar a uncódigo de barras.

Nuestros primeros trabajos se dirigieronal estudio de la estabilidad de este poli-morfismo. Se estudiaron las cepas aisladasde pacientes tuberculosos y cepas aisladasde los mismos pacientes años más tarde(Otal, 1991). Confirmar que el patrón eradiferente entre distintos pacientes y quea su vez permanecía estable en un mismopaciente nos permitió considerar su po-tencial utilidad en la detección de futurasepidemias. Posteriormente, nuestros es-fuerzos se dirigieron a conocer el meca-nismo biológico de ese polimorfismo, des-cubriendo que era debido al salto otransposición de esta secuencia IS6110(Mendiola, 1992). Comprobada la utilidaddel método, por su estabilidad en eltiempo y su universalidad entre cepas, aldeberse a un mecanismo de transposicióno salto común a otras bacterias, el mé-todo de diferenciación de cepas de bacilosde la tuberculosis comenzó a ser em-pleado por diferentes laboratorios detodo el mundo, pero, al utilizarse dife-rentes sitios de corte del genoma de ba-cilo y marcando ese polimorfismo deforma diferente, no permitía la compara-ción entre laboratorios. En una reunióncelebrada en los CDC (Centers for DiseaseControl) de Atlanta, se planteó la nece-

sidad de estandarizar el método de dife-renciación de las cepas por RFLP (polimor-fismo de la longitud de los fragmentos derestricción), con la secuencia de inserciónIS6110, para su uso universal en la medi-cina humana. En este consenso participóactivamente la Universidad de Zaragozajunto con, entre otros, los CDC deAtlanta, el Instituto Pasteur de París, elRVIM de Holanda o la UCLA (VanEmbden, 1993). Actualmente, este es elmétodo universalmente utilizado para ladiferenciación del bacilo de la tuberculosisy es utilizado sistemáticamente para estu-dios epidemiológicos. El método publi-cado en 1993 por Van Embden continúasiendo el patrón universal de la epidemio-logía molecular de la tuberculosis.Después de más de 20 años de uso en es-tudios de epidemiología molecular del ba-cilo de la tuberculosis por RFLP-IS6110,sigue siendo el patrón oro, y decenas demiles de cepas en todo el mundo han sidoestudiadas de forma estandarizada, per-mitiendo la comparación de bases dedatos, lo que facilita el estudio del com-portamiento del bacilo. Los resultados deestas técnicas se pueden analizar me-diante programas informáticos de análisisde imágenes y son almacenados en basesde datos. Cada patrón o código de barrasde las nuevas cepas se compara con lasya existentes en la base de datos y, si coin-ciden, se estudia la relación entre los pa-cientes. La Universidad de Zaragoza sigueparticipando en el estudio comparativo in-ternacional de diferentes métodos de ti-pado, colaborando en la búsqueda denuevos métodos que permitan acortartiempos o mejorar la técnica (Otal, 1997),comparándolos con los métodos utili-zados en la actualidad (Kremer, 1999).


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Actualmente, la técnica RFLP-IS6110 estásiendo reemplazada por métodos más rá-pidos, basados en la reacción en cadenade la polimerasa, que necesitan menorcantidad de bacilos para realizarse, y cuyalectura se realiza mediante 24 dígitos, lla-mada MIRU-VNTR (Supply, 2006).

Estas técnicas moleculares nos permitenidentificar una transmisión de tuberculosis(un individuo sano es contagiado por unindividuo enfermo), una reactivación (unacepa que infectó previamente y que seencontraba en fase silente en un indi-viduo) o una reinfección con una cepanueva, dependiendo de que los patronesgenéticos de las cepas aisladas de los in-dividuos sean idénticos o no.

Estudios de epidemiologíamolecular en la ComunidadAutónoma de AragónLos estudios efectuados entre los años1993 y 1995 fueron pioneros en nuestropaís (Samper, 1993). Permitieron establecerlas similitudes y diferencias de la transmi-sión de la tuberculosis con estudios inter-nacionales y posteriormente nacionales(Iglesias, 1998; Samper, 1998). Para estosestudios fue fundamental la colaboraciónde los Servicios de Microbiología de los dosgrandes hospitales de la provincia deZaragoza: el Hospital Clínico UniversitarioLozano Blesa y el Hospital Miguel Servet, asícomo la de los otros hospitales de Aragón.Desde el año 2004, en colaboración y co-ordinación con la Consejería de Sanidad delGobierno de Aragón, se realiza la caracte-rización molecular sistemática de las cepasaisladas en Aragón. Este trabajo permitedetectar y estudiar la presencia de los brotesactivos, y posibilita a los microbiólogos des-

cartar contaminaciones de laboratorio y di-ferenciar, dentro del complejo Mycobacte-rium tuberculosis, las subespecies queafectan a humanos: M. tuberculosis, M.bovis, M. bovis BCG y M. africanum. Estasinvestigaciones también permiten a los epi-demiólogos realizar estudios poblacionalese identificar grupos y factores de riesgo, ya su vez a los sistemas de vigilancia epide-miológica el seguimiento de casos y la de-tección de brotes para un mejor control dela enfermedad (Iglesias, 2002). Desde elpunto de vista de la investigación básica,estos estudios nos permiten reconocercepas que puedan tener aumentada su vi-rulencia, posibilitando el estudio de los me-canismos de patogenicidad del bacilo de latuberculosis.

Las técnicas de epidemiología moleculartambién se han aplicado a los bacilos de latuberculosis aislados en animales para suutilización en medicina veterinaria. Se es-tudiaron aislamientos de bóvidos y cabras(Gutiérrez, 1995), siendo posible detectaren algún caso la transmisión de determi-nadas cepas a humanos (Gutiérrez, 1997).

Por otra parte, se estudió la localizaciónde la secuencia de inserción IS6110 encepas causantes de tuberculosis tanto envacas como en humanos que presentabanuna reactivación de la enfermedad, con lafinalidad de estudiar la posible relación dedicha secuencia con la capacidad del ba-cilo para permanecer en estado de la-tencia en el hombre (Otal, 2008).

Estudios de epidemiologíamolecular a nivel nacional einternacionalNuestro grupo participa de forma muy ac-tiva en estudios de epidemiología de la tu-


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berculosis con otras comunidades autó-nomas como, entre otras, Galicia, Navarra(Dorronsoro, 2000), la Comunidad deMadrid (Cacho, 2005) y la ComunidadValenciana (García, 2002). En GranCanaria (Pena, 2003), estos estudios handescrito la posibilidad de reinfección connuevas cepas del bacilo, en pacientes conuna tuberculosis previa (Caminero,2001a), y que la introducción en el año1993 en la isla de Gran Canaria de unacepa de un determinado patrón genético,denominado “Beijing”, produjera ese añoel mayor brote de tuberculosis en la isla.Estudios de años posteriores demostraronque, en 4 años, esta cepa pasó a repre-sentar el 27% de los casos de tuberculosisde toda la isla (Caminero, 2001b), indi-cando la enorme capacidad de transmi-sión del brote “Beijing”. Posteriores estu-dios de esta cepa denominada GC1237nos han permitido la localización de 19copias de la secuencia de inserción IS6110en su genoma (Alonso, 2011), lo que a suvez ha posibilitado diseñar un ensayo parala rápida detección de esta cepa (Millán-Lou, 2012). Se han estudiado los factoresque pueden afectar el comportamientode este aislado y se ha desarrollado unaprueba rápida de diagnóstico con la fina-lidad de ser introducida en los laborato-rios de origen para detectar rápidamentelos casos, ya que el control de ese broteespecífico reduciría de forma considerablela incidencia de la tuberculosis en la isla(Alonso, 2011; Millán-Lou, 2011).

Las técnicas de epidemiología moleculartambién las hemos aplicado a los bacilosbovinos de la tuberculosis aislados en ani-males, en colaboración con la Facultad deVeterinaria de la Universidad de Zaragoza,para su utilización en medicina veterinaria,

y a aislados en humanos, en colaboracióncon el Instituto Carlos III de Madrid; se es-tudiaron aislamientos de bóvidos y cabras(Gutiérrez, 1995), los patrones predomi-nantes entre estos animales. En cuanto a lasituación respecto a los humanos, se de-tectó en algún caso la transmisión de de-terminadas cepas a humanos (Gutiérrez,1997), y que los casos de tuberculosis pro-ducidos por M. bovis y M. caprae enEspaña representan una proporción pe-queña respecto al total de casos de tuber-culosis, y están ligados a exposición ocupa-cional y a la procedencia de paísesendémicos (Ervalin, 2009).

En colaboración con grupos de veterinarianacionales, se estudió la epidemiología dela tuberculosis en animales de ganaderíay salvajes (Gortazar, 2005). Igualmente,con grupos de veterinaria latinoameri-canos, para el estudio epidemiológico detuberculosis en explotaciones ganaderasargentinas (Zumarraga, 1999b) y en ani-males salvajes, como los lobos marinos delas costas argentinas y de la Patagonia(Zumarraga, 1999a).

Estudio de los mecanismosde adaptación del bacilo a losfármacos antituberculosos:estudio de los mecanismosde resistencia Como hemos indicado anteriormente, lautilización de antibióticos constituye una delas formas más eficaces de luchar contra lasinfecciones bacterianas. El estudio de losmecanismos por los que una bacteria sevuelve resistente a los antibióticos ayuda aprevenir este fenómeno, que representa ungrave problema sanitario. Hasta el presente,las cepas resistentes a los fármacos que se


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utilizan en el tratamiento de la tuberculosisque se han estudiado a nivel genéticotienen modificaciones en el sitio diana deacción del fármaco, lo que les confiere unosniveles de resistencia significativos desde elpunto de vista clínico. Sin embargo, se hanencontrado bacilos resistentes en los quelas proteínas diana no están alteradas, porlo que la resistencia está producida por otromecanismo diferente. Nos interesamos enel estudio de los mecanismos por los cualesel bacilo de la tuberculosis aumenta la ca-pacidad de hacerse más resistente, comoes el aumento de tasas de mutación (Rad,2003).

Siguiendo la línea de investigación clásicainiciada por el profesor Gómez-Lus en elestudio de los mecanismos de resistenciaen bacterias, nos enfocamos en el estudiode los mecanismos de resistencia aplicadoa las micobacterias. Inicialmente, estu-diamos las enzimas modificantes de anti-bióticos (Aínsa, 1996, 1997) y actualmenteestamos investigando la contribución delas bombas de eflujo en el fenómeno de laresistencia a antibióticos en el bacilo de latuberculosis, en colaboración con otros la-boratorios europeos (Aínsa, 1998; Silva,1998; De Rossi, 2002). Las bombas deeflujo actúan como sistemas de expulsiónde determinadas sustancias, entre ellas ele-mentos tóxicos para la bacteria, como losantibióticos, y por este motivo podrían fa-cilitar la adquisición de mutaciones queconfieren altos niveles de resistencia. El ba-cilo tiene más de 40 bombas de eflujo dedistintas familias (De Rossi, 2006) y, al igualque sucede en otras especies bacterianas,además de la resistencia a fármacos, lasbombas de eflujo están implicadas en otrosprocesos metabólicos (Ramón-García,2009, 2012). En consecuencia, resulta in-

teresante explorar la posibilidad de utilizarinhibidores de eflujo en la terapia de la tu-berculosis (Rodrigues, 2011).

Epidemiología molecular de latuberculosis multirresistenteDe los fármacos disponibles actualmentepara el tratamiento de la tuberculosis, dosde ellos, la isoniazida y la rifampicina, sonde enorme importancia. La bacteria queadquiere resistencia, al menos a estos dosfármacos, la denominamos tuberculosismultirresistente. Por la dificultad de su tra-tamiento, se convierten en las formas másgraves de tuberculosis. Su estudio y con-trol están considerados de enorme impor-tancia desde el punto de vista sanitario,epidemiológico y de Salud Pública.

Tradicionalmente, en modelos animales seha estudiado que los bacilos que se hacenresistentes a los fármacos son menos viru-lentos, perdiendo su capacidad de infectartanto al ratón como al cobayo. Estos estu-dios han sido corroborados por nuestrostrabajos de epidemiología molecular, en losque encontramos que las cepas sensibles alos fármacos, en general, se transmiten másque las cepas multirresistentes. Sin em-bargo, determinadas cepas multirresistentesse transmiten de forma epidémica. Tras laocurrida en los años 90 de Nueva York, seestudió, en colaboración con hospitales deMálaga y de Madrid, la primera epidemiade tuberculosis multirresistente ocurrida enEspaña (Samper, 1997), con una alta tasade reinfección (Rivero, 2001), que, poste-riormente, afectó a gran número de comu-nidades autónomas, incluida la aragonesa.Una cepa resistente a la mayor parte de losfármacos conocidos contra la enfermedadse diseminó entre enfermos con sida pro-


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vocando una elevadísima mortalidad.Después de este suceso, con la idea de de-tectar posibles epidemias de tuberculosismultirresistente, y en colaboración con lamayoría de los Servicios de Microbiologíade los hospitales del país, nuestra univer-sidad se planteó el estudio sistemático delas cepas multirresistentes de tuberculosis yse estableció una red de vigilancia de la tu-berculosis multirresistente española, pio-nera a nivel mundial (Samper, 2000, 2005).

Estudio de la tuberculosismultirresistente a nivelnacionalDesde enero de 1998 se realiza de formasistemática el estudio genético de cepas delbacilo de la tuberculosis, multirresistentesa los fármacos, en coordinación con elInstituto de Salud Carlos III de Madrid,donde se informan los casos idénticos queaparecen entre diferentes comunidades au-tónomas. Este sistema de alerta de brotesde tuberculosis multirresistente posibilita laactuación en caso de epidemias.

La red de vigilancia española de la tuber-culosis multirresistente se denomina GrupoEspañol de Trabajo sobre TB-MR. Está for-mada por los laboratorios de micobacte-rias del Sistema Nacional de Salud, y coor-dinada por el grupo de Genética deMicobacterias de la Facultad de Medicinade la Universidad de Zaragoza (http://gen-mico.unizar.es/).

Estudio de la tuberculosismultirresistente a nivelinternacionalDesde enero de 1998 se realiza de formasistemática el estudio genético de cepas

del bacilo de la tuberculosis, multirresis-tentes a los fármacos, en coordinacióncon el Instituto de Salud Carlos III deMadrid, donde se informan los casosidénticos que aparecen entre diferentescomunidades autónomas. Con más de 10años de continuidad, esta red de vigi-lancia molecular de la tuberculosis multi-rresistente en España la forman los labo-ratorios de micobacterias del SistemaNacional de Salud, y está coordinada porel grupo de Genética de Micobacterias dela Universidad de Zaragoza (http://gen-mico.unizar.es/) (Gavín, 2011). Este sis-tema de alerta de brotes de tuberculosismultirresistente posibilita la detección deepidemias en nuestro país o en el país deorigen de nuestros inmigrantes (Gavín,2009).

A nivel europeo, el ECDC apoya el man-tenimiento de una base de datos de loscasos de tuberculosis multirresistentes, lo-calizada en Holanda, que contiene los pa-trones genéticos de la cepas de tubercu-losis multirresistente aisladas en loslaboratorios de la Unión Europea, dondese posibilita la comparación de cadanuevo caso. El intercambio de datos haceposible detectar brotes entre diferentespaíses (Devaux, 2009).

El trabajo en red nos permitió estudiar eltraspaso de fronteras del bacilo de la tuber-culosis. En el caso de un estudio con inves-tigadores latinoamericanos de Argentina,Brasil, Chile, Colombia, Colombia yVenezuela, pudimos comprobar que la tu-berculosis multirresistente predominante ennuestros países no se detectaba en el restode los países; sin embargo, es importantemantener esta vigilancia (Ritacco, 2011). EnEuropa, el ECDC trabaja en ello desde2008, y en su nuevo programa para luchar


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contra la enfermedad ve importante la con-tinuidad de los estudios moleculares (PRog).

Desarrollo de herramientasgenéticas para estudiar elbacilo de la tuberculosisEn los años 70 se desarrolla la Genética yBiología Molecular, utilizando distintasbacterias y virus como modelos. Las téc-nicas moleculares aplicadas al bacilo de latuberculosis se desarrollaron con más de20 años de retraso. Las razones de estademora son diversas. El bacilo es difícil demanipular, debe manipularse en labora-torios de seguridad biológica, por tratarsede un patógeno que se transmite por víarespiratoria, y presenta un crecimientomuy lento. Experimentos que en otrasbacterias no patógenas se realizan endías, con el bacilo de la tuberculosis se re-trasan meses o años. A todo esto, sesumó el optimismo de los años 70, enque se pensaba que era posible la erradi-cación de la tuberculosis, menospreciandoal enemigo, creyendo que no sería nece-sario estudiar y conocer el bacilo para lu-char contra él.

Para manipular directamente el bacilo dela tuberculosis ha sido necesario desarro-llar útiles genéticos en microorganismosemparentados que nos sirven de modelo.Para la puesta a punto de estos nuevosútiles genéticos se eligen las especies nopatógenas.

El bacilo de la tuberculosis pertenece algénero de las “micobacterias”. La inves-tigación genética del género se inicia pordos grupos a finales de los años 80: unoen Estados Unidos y otro en Europa. Elgrupo americano está dirigido por el pro-fesor Jacobs de la Facultad de Medicina

del “Albert Einstein Institut” de NuevaYork, y al grupo europeo lo dirige la pro-fesora Gicquel del Instituto Pasteur deParís.

Por esta época, distintos miembros del ac-tual Grupo de Genética de Micobacteriasse formaron en el Instituto Pasteur. En esteperiodo, se aísla el transposón Tn610, quefue modificado genéticamente, introdu-ciendo un marcador de resistencia a kana-micina, denominándose al nuevo trans-posón Tn611 (Martín, 1990). Con este sedemostró, por primera vez, la transposiciónen micobacterias. También participamos enel desarrollo de las técnicas de manipula-ción genética por introducción de DNA porelectrotransformación (Hermans, 1991) ydesarrollamos vectores que permiten in-sertar genes de forma estable en las mico-bacterias (Martín, 1991).

Participamos en la construcción de unaserie de vectores que replican de formacondicional, como los plásmidos termo-sensibles para la replicación, para poderseleccionar gran número de sucesos detransposición. La replicación del plásmido,a una temperatura permisiva, permite quela transposición ocurra en el interior de labacteria. Al aumentar la temperatura, labacteria pierde el plásmido termosensible,pudiendo seleccionar los sucesos de trans-posición ocurridos durante la incubacióna temperaturas permisivas. Estos plás-midos mutantes termosensibles para la re-plicación en micobacterias fueron obte-nidos por mutagénesis química in vitrocon hidroxilamina. Se obtuvo un plásmidoderivado de pAL5000 seleccionando mu-tantes resistentes a kanamicina a 30 ºCpero sensibles a 39 ºC (Guilhot, 1992;Gavigan, 1995), que pueden ser utilizadospara el reemplazamiento génico, por re-


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combinación homóloga en el bacilo de latuberculosis (Jackson, 1996).

En 1992 se crea el Grupo de Investigaciónen Genética de las Micobacterias en laUniversidad de Zaragoza. El grupo seplantea contribuir al desarrollo de las he-rramientas necesarias para poder mani-pular el bacilo de la tuberculosis y buscarnuevos elementos genéticos móviles,“transposones”, como útiles de mutagé-nesis en micobacterias, que faciliten el es-tudio de los mecanismos de patogeni-cidad del bacilo de la tuberculosis. Seaíslan otros transposones (Guilhot, 1992;García, 1994) y se desarrolla un sistemade mutagénesis por transposición de altaeficacia (Guilhot, 1994; Gavigan, 1998;Pérez, 1998).

Desde nuestro grupo también contri-buimos a la identificación y construcciónde plásmidos en micobacterias quepueden ser útiles para la manipulación delbacilo de la tuberculosis. Se aíslan nuevosplásmidos de cepas clínicas (Gavigan,1997) y se realizan construcciones deplásmidos para simplificar la manipulaciónen el laboratorio (Aínsa, 1996).

Hoy, el conocimiento generado por de-cenas de equipos de investigación en tu-berculosis, que desde los años 90 se in-corporaron al estudio molecular delbacilo, es enorme, destacando la posibi-lidad de estudios genómicos a partir delaño 1998, en que el equipo del profesorCole publica la primera secuencia del ge-noma completo de un bacilo de la tuber-culosis. El importante esfuerzo invertidoen capital humano y recursos en investi-gación contra la tuberculosis hace quehoy dispongamos de las herramientas ne-cesarias para poder manipular los bacilos

y podamos plantearnos metas tan ambi-ciosas como desactivar el bacilo de la tu-berculosis.

El sueño de una nueva vacunacontra la tuberculosis

La experiencia de la vacuna viva BCG

La vacuna actual contra la tuberculosis,BCG, es una vacuna viva atenuada, queconfiere protección para los casos gravesde tuberculosis. Su uso es recomendadopor la Organización Mundial de la Saluden países con alta incidencia de tubercu-losis, siendo actualmente la vacuna másutilizada en todo el mundo. En los casosde tuberculosis respiratoria, el grado deprotección que confiere es muy variable,encontrándose entre el 70% en estudiosrealizados en Inglaterra y una falta de pro-tección en estudios realizados en la Indiay en personas en las que la tuberculosisse presenta asociada a sida. Desarrollarvacunas más eficaces que la actual BCGcontra las formas respiratorias y erradicarla tuberculosis es una prioridad.

La vacuna BCG se obtuvo cultivando su-cesivamente más de 200 veces en el la-boratorio, con las técnicas rudimentariasmicrobiológicas de la época, un bacilotuberculoso aislado de vacas, hasta quedisminuyó su patogenicidad para los hu-manos. Los estudios genéticos actualesde la vacuna BCG señalan que más de100 genes se han perdido en la cepa va-cunal en diferentes regiones del ge-noma, sugiriendo que esta extrema ate-nuación sea causa de la pérdida de sueficacia. A esto debemos añadir que dis-tintos laboratorios de todo el mundo hansubcultivado esta cepa, lo que ha provo-


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cado la aparición de diferencias gené-ticas e inmunológicas entre las distintasvariantes de BCG.

Los avances en investigación en el campode las vacunas, de la inmunología y el de-sarrollo de la genética de micobacterias,anteriormente descrito, hacen posible quenos planteemos la investigación y desa-rrollo de nuevas vacunas contra la tuber-culosis.

Mejorar la eficacia de la actual vacunaBCG

Dos son las estrategias fundamentales enla investigación de nuevas vacunas contrala tuberculosis. Por un lado, mejorar la in-munidad conferida por la actual BCG, y porotro, la construcción de nuevas vacunasmás eficaces y capaces de reemplazar la ac-tual vacuna BCG (Martín, 2005).

Desde el inicio del Proyecto Europeo“Tuberculosis Vaccine Development” delV Programa Marco de la Unión Europea,se han desarrollado y estudiado más de100 candidatos a vacuna, basados en pro-teínas del bacilo (vacunas subunidades), ymás de una veintena de vacunas vivas.Actualmente, se están ensayando diversoscandidatos en diferentes modelos ani-males para determinar su grado de ate-nuación, de inmunidad y de protección,que permita garantizar su eficacia contrala tuberculosis en humanos.

Es la primera vez, en más de 80 años,que nuevos candidatos a vacuna contrala tuberculosis han pasado a evaluarseen ensayos clínicos en humanos. Los pri-meros estudios se han publicado a fi-nales de 2004 por la Universidad deOxford. Estos primeros ensayos tratan deaumentar la inmunidad de BCG, en indi-

viduos previamente vacunados, utili-zando virus recombinantes que con-tienen un antígeno del bacilo de la tu-berculosis con la idea de mejorar laprotección de BCG.

Desarrollo de vacunas vivas capacesde reemplazar a BCG

El desarrollo de una nueva vacuna conmayor grado de protección, que puedasustituir a la actual BCG, es un reto parala comunidad científica que permitiría,con un bajo coste, el plantearse erradicarla tuberculosis a medio plazo y reemplazara la actual BCG (Martín, 2005). Nuevoscandidatos vacuna, que hagan posibleerradicar la tuberculosis en áreas endé-micas, han de conferir una protección su-perior a la de BCG en las formas de tuber-culosis respiratoria en adultos, teniendoen cuenta la población coinfectada conVIH, y que puedan ser producidas a granescala y bajo coste. Para este objetivo, lasvacunas vivas se plantean como buenoscandidatos potenciales.

Desarmar al bacilo de la tuberculosis.Elección de la estrategia

La estrategia elegida por el Grupo deGenética de Micobacterias de laUniversidad de Zaragoza, en colaboracióncon el Instituto Pasteur, ha sido –a partirdel conocimiento del bacilo y del desa-rrollo de las herramientas genéticas parasu manipulación– partir de una cepa viru-lenta de tuberculosis y eliminar genes deforma racional para construir una nuevavacuna. Una estrategia similar, pero utili-zando distintos genes, es la elegida por elotro grupo pionero en genética de mico-bacterias, el grupo del “Albert EinsteinInstitut” de Nueva York.


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Empezar desde el principio de unaforma racional con la tecnología y co-nocimiento actual. ¿Qué genes elegir?

Nos planteamos construir una nueva va-cuna viva a partir de un bacilo aislado deun paciente e inactivar genes de virulenciade forma racional. Esta estrategia es máslaboriosa, implica partir de cero y demos-trar, en una primera etapa, la atenuacióndel candidato a vacuna construido y, ensegundo lugar, una inmunidad superior aBCG, con el ambicioso objetivo de reem-plazar a la actual BCG.

Nuestra hipótesis de partida tuvo suorigen en nuestros estudios sobre epide-miología molecular de cepas multirresis-tentes: si solo unas pocas cepas se trans-miten más fácilmente que el resto, seráporque estas poseen alguna característicaque las hace aumentar su virulencia. Porlo tanto, si logramos saber a nivel gené-tico cómo aumentan su virulencia, po-dremos inactivar ciertos genes para dismi-nuir su virulencia.

Tras las investigaciones de epidemiologíamolecular de tuberculosis multirresistentesen nuestro país, concentramos nuestrosestudios en la cepa causante del mayorbrote (Samper, 1997), y encontramos queun gen llamado phoP, y anotado comoposible regulador de genes de virulenciaen el genoma de M. tuberculosis descritopor Cole, estaba altamente expresado enesta cepa (Soto, 2004), por lo que su inac-tivación podría disminuir la virulencia delbacilo de la tuberculosis.

En un aislamiento clínico de tuberculosisinactivamos únicamente el gen phoP, me-diante las técnicas de ingeniería genéticadesarrolladas anteriormente (Pérez, 2001).La inactivación de este único gen conducía

a una enorme atenuación, tanto en el mo-delo celular como en el modelo ratón(Pérez, 2001). Estudios posteriores demos-traron una mayor atenuación que BCG enmodelo ratón con sistema inmunológicodisminuido (Martín, 2006).

Hoy sabemos que el gen phoP forma partede un sistema de dos componentes, quees el mecanismo usado por las bacteriaspara hacer frente a cambios en su alre-dedor. Como consecuencia de la elimina-ción del gen phoP, el bacilo de la tubercu-losis no puede responder a ciertos cambiosen el medio ambiente –como, por ejemplo,la infección de un paciente– y, por tanto,pierde virulencia. Nuestros estudios permi-tieron desvelar el mecanismo de acción delgen phoP en el bacilo de la tuberculosis(Gonzalo-Asensio, 2008a) y aprovechareste conocimiento para identificar los apro-ximadamente 80 genes bajo el control delgen phoP (Gonzalo-Asensio, 2008b). Entredichos genes se encuentran algunos impli-cados en la síntesis de lípidos de virulencia,la ausencia de estos lípidos en el mutantephoP contribuye a la gran atenuación deeste nuevo candidato a vacuna (Gonzalo-Asensio, 2006).

Los ensayos de protección realizados encolaboración con equipos nacionales e in-ternacionales de Inglaterra, Francia yMéxico contra la infección por el bacilode la tuberculosis han mostrado muybuenos resultados en modelo ratón, y unaprotección superior a BCG en modelo co-bayo, con una inmunidad mayor que laactual vacuna BCG (Martín, 2006).Recientes ensayos con primates, reali-zados en el PBRC de Holanda, demues-tran que el mutante phoP es capaz deproteger a estos animales frente a una in-fección con el bacilo de la tuberculosis.


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Ensayos del prototipo de vacunahacia el ensayo clínico en humanos

Los buenos resultados en fase preclínicade este candidato a vacuna, construidode forma racional por la inactivación degenes que regulan la virulencia, hacendel mutante phoP un prometedor candi-dato a vacuna y apuntan a su futuro en-sayo en humanos. Uno de los principalesretos de las vacunas vivas es su absolutaseguridad para su uso en humanos. Unavez demostrada su atenuación y protec-ción, en ambos casos mejor que la ac-tual vacuna BCG, estamos trabajandoen una nueva generación de vacuna ba-sada en el mutante phoP, añadiendouna nueva mutación que aumente suseguridad.

Los futuros retos de la investigaciónen nuevas vacunas contrala tuberculosis

La vacunación contra la tuberculosisplantea grandes retos. Un tercio de la po-blación mundial está infectada con el ba-cilo de la tuberculosis y, recientemente,los estudios de epidemiología molecularde la tuberculosis han comprobado quela reinfección con nuevas cepas es másfrecuente de lo que inicialmente se pen-saba, por lo tanto, a diferencia de otrasenfermedades, la propia infección con elbacilo no genera una respuesta inmuneeficaz ni duradera (Martín, 2005). Las va-cunas vivas atenuadas de forma racionalpor la inactivación de genes que regulanla virulencia están siendo unas promete-doras candidatas a vacuna.

El desarrollo de una nueva vacuna conmayor grado de protección, que puedasustituir a la actual BCG, es actualmente

un reto para la comunidad científica, quepermitiría, con un bajo coste, el plante-arse erradicar la tuberculosis a medioplazo.

Otro reto en la vacunación contra la tu-berculosis es proteger a la población queactualmente está vacunada con BCG o in-fectada con M. tuberculosis (Martín,2006). Recientes experimentos, utilizandovacunas de subunidades proteicas en ani-males previamente vacunados con BCG,están dando buenos resultados.

Las vacunas vivas derivadas de un mu-tante phoP en una cepa de tuberculosisconstruida de forma racional se encuen-tran en avanzados ensayos preclínicos.Con el horizonte de erradicar la tubercu-losis, las vacunas vivas atenuadas sonbuenas candidatas por su bajo coste deproducción, así como por la enorme ex-periencia acumulada durante más de 90años, tanto en el uso de BCG como en suproducción.

Actualmente, el proyecto “vacuna tuber-culosis” cuenta con un socio fabricante,CZ Veterinaria, que tiene una amplia ex-periencia en la producción de vacunas deuso en veterinaria, y recientemente haconstituido una filial para el desarrollo devacunas para humanos, BIOFABRI.Nuestro plan de investigación aplicada esel desarrollo de una vacuna viva atenuadacontra la TB para su evaluación clínica enhumanos.

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La aparición de la encefalopatía espongi-forme bovina en el Reino Unido, y con pos-terioridad en el resto de países de la UniónEuropea, desencadenó la crisis alimentariamás importante que se ha producido enEuropa en las últimas décadas. El impactosocial, mediático, político, sanitario, gana-dero y en las industrias derivadas ha sidoenorme. La desconfianza de los consumi-dores europeos hacia los productos bovinosy en general hacia la cadena alimentaria noha tenido parangón, y las consecuenciaseconómicas han sido de una gran dimen-sión, aunque todavía no se han evaluadoen su totalidad.

La lucha contra esta enfermedad ha sidoespecialmente complicada, dadas las difi-cultades inherentes a las características sin-gulares y poco conocidas del agente causaly a las particularidades de sus mecanismospatogénicos y vías de transmisión y de losmétodos de diagnóstico. No obstante, losavances científicos experimentados sobreesta enfermedad y las relacionadas con ellaen estas dos últimas décadas, y la instaura-ción por la Comisión Europea de programasde vigilancia y control bien diseñados y eje-cutados, ha posibilitado minimizar el im-pacto sobre la salud pública europea y re-ducir de manera muy ostensible la

incidencia y prevalencia de la enfermedaden todo el territorio de la Unión Europea.

Una herencia adicional y muy positiva de lacrisis alimentaria provocada por la encefa-lopatía espongiforme bovina ha sido unamejoría muy sustancial del sistema de con-trol de los alimentos, que ha supuesto laasunción de una mayor responsabilidad porlos operadores de la cadena alimentaria,bajo el principio de garantizar la seguridadde los alimentos “desde el campo a lamesa”, lo que ha sido percibido como algomuy positivo por los consumidores euro-peos y ha situado a la UE como uno de loslugares con mejores estándares de segu-ridad alimentaria del mundo.

La proteína prión PrPsc es la responsablede un grupo de enfermedades neurodege-nerativas letales, conocidas como enferme-dades priónicas o encefalopatías espongi-formes transmisibles (EET), que afectan nosolamente a humanos sino también a di-ferentes especies de animales, tanto do-mésticos como salvajes (1-3), que pre-sentan una serie de hechos comunes,aunque no únicos, entre los que destacan:hipertrofia e hiperplasia de astrocitos, for-mación de vacuolas en las células del sis-tema nervioso, pérdida de neuronas y acú-mulo de la proteína PrPsc (PrP 27-30).

Las enfermedades priónicas, un antes y undespués para la seguridad de los alimentosDra. Marta Monzón Garcés, Dra. Cristina Acín Tresaco, Dra. Rosa Bolea Bailo,Dra. Eva Monleón Moscardó, Dra. M.ª Antonia Vargas Vargas, Dr. BernardinoMoreno Burgos, M.ª Belén Marín González, Rodrigo S. Hernández Aco,J. Luis Pitarch Moré, Carlos Alfonso Hedman Altamirano,William Jirón Toruño, Hicham Filali, Dra. Rocío Sarasa Orcastegui,Dra. M.ª Carmen Garza García y Dr. Juan J. Badiola Díez


136

Estas enfermedades de origen animal sepropagan generalmente por infección,asumiendo como causa probable la in-gesta de alimento contaminado. Hayque destacar que, aunque genérica-mente se las clasifique como “infec-ciones”, no son realmente infecciones enel concepto clásico, ya que el agente in-

fectante no se reproduce a sí mismo enla célula huésped, como hacen los virus,sino que induce a una proteína para quecambie de conformación. Así, ambasproteínas, aunque muy parecidas en susecuencia, no son la misma molécula, yaque la proteína infectante es de otroanimal.

Respecto a las EET humanas, la etiologíaes más variada, ya que pueden ser infec-ciosas, hereditarias y esporádicas. Las in-fecciosas, no solo son ritualistas como elkuru (los nativos de la tribu Fore de las tie-rras altas de Nueva Guinea se comían, por

costumbres rituales, el cerebro de sus di-funtos), sino que un porcentaje impor-tante, dentro de la rareza de este tipo depatologías, puede ser de origen iatrogé-nico (tratamiento con hormonas de creci-miento, trasplante de médula, otro tipo

Tabla 1. Especies animales afectadas y etiopatogenia.

Enfermedad Especie Etiopatogenia

EEB Bovino Infección

Scrapie Ovino y caprino Infección

CWD Cérvidos Infección

ETV Visones Desconocida

EEF Felinos Infección

EEB: encefalopatía espongiforme bovina; CWD: caquexia crónica del ciervo;ETV: encefalopatía transmisible del visón; EEF: encefalopatía espongiforme felina.

Tabla 2. Enfermedades humanas y etiopatogenia.

Enfermedades Etiopatogenia

Kuru. Infección. Canibalismo ritualista.

Creutzfeldt-Jakob iatrogénico (i-ECJ). Infección por contaminación priones (hormona crecimiento).

Variante de Creutzfeldt-Jakob (v-ECJ). Infección por priones ¿bovinos?

Creutzfeldt-Jakob familiar (f-ECJ). Hereditaria.

Creutzfeldt-Jakob esporádico (s-ECJ). Mutación somática o ¿conversión PrPc en PrPsc?

Gerstman-Sträussler-Sheinker (GSS). Hereditaria.

Insomnio familiar fatal (FFI). Hereditaria.

Insomnio esporádico fatal (FSI). Mutación somática o ¿conversión PrPc en PrPsc?

Las enfermedades priónicas, un antes y un después para la seguridad de los alimentos

137

de operaciones quirúrgicas cuando el ma-terial no ha sido esterilizado adecuada-mente para eliminar el prión) o por in-gesta de alimento contaminado conproteína prión de origen animal. Las he-reditarias conllevan modificaciones en elgen de la proteína y pueden ser inser-ciones y mutaciones.

El scrapie es la enfermedad prototipo delas EET y la que se conoce desde hace mástiempo. La primera descripción de estaenfermedad data del año 1732.

El agente causalTodas las EET están originadas por unagente transmisible de propiedades extra-ordinarias, tales como i) largos tiempos deincubación (meses, años e incluso dé-cadas), ii) resistencia a altas temperaturas,iii) resistencia al tratamiento con formalde-hído, iv) resistencia a la radiación ultravio-leta, y v) resistencia a las radiaciones ioni-zantes. Todas estas propiedades sonincompatibles con la presencia de ácidosnucleicos, lo cual hizo sospechar que elagente causante de estas enfermedadestransmisibles carecía de material genético.Ello dio lugar a la especulación sobre talorigen molecular, y así se propusieron ini-cialmente varias hipótesis sobre su origenmolecular, entre las cuales se incluyen estarformados por un “polisacárido replicante”(4), un ácido nucleico y proteína (5) o so-lamente por proteínas (1), o bien ser unvirus lento. De todas las hipótesis plante-adas sobre el origen de la enfermedad, laúnica aceptada actualmente es la pro-puesta por Prusiner en 1982 (“solamentees una proteína”), que cuenta con gran nú-mero de evidencias experimentales,aunque todavía no se ha podido cristalizar,

lo que da pie a que algunos autores argu-menten que además de la proteína existealgo más; así, Aiken et al. (6) y Manuelidis(7), entre otros, han mantenido durantelargos años que la proteína envuelve unfragmento del DNA mitocondrial.

La hipótesis predominante basada en queestá constituido “solamente por una pro-teína” fue inicialmente propuesta porGriffith en una publicación en Nature en elaño 1967 (8). Pero no fue hasta 1982cuando Stanley B. Prusiner actualizó yenunció de forma detallada esta teoría, pro-vocando con ello un debate en la comu-nidad científica al afirmar que el agenteinfeccioso responsable de ciertas enfer-medades degenerativas del sistemanervioso central en animales y más rara-mente en el hombre era simplemente unaproteína a la cual le dio el nombre de prión(Proteinaceous infectious particles), contra-viniendo con ello una creencia, hasta en-tonces admitida por la comunidad cientí-fica, de que todo agente responsable deenfermedades transmisibles necesita mate-rial genético (DNA o RNA), imprescindiblepara que la enfermedad prevalezca en elhuésped. La conversión de PrPc (proteínacelular normal) en PrPsc (isoforma anormalcausante de la enfermedad) implica uncambio en la conformación de la proteína:el contenido en α-hélice disminuye mien-tras que aumenta el contenido en hoja ple-gada β, pero ambas proteínas tienen lamisma secuencia de aminoácidos. Existenabundantes apoyos experimentales paraasegurar que la proteína celular de mem-brana (PrPc) y la proteína prión patológica(PrPsc) tienen la misma estructura primaria(secuencia de aminoácidos; Prusiner, 1990).Por lo tanto, se acepta que esta estructuraprimaria de PrPc puede adoptar dos dife-


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rentes conformaciones que explican la exis-tencia de PrPc y PrPsc. Cuando las dos es-tructuras secundarias se comparan por téc-nicas espectroscópicas, FTIR (fouriertransformer infrared), RMN (resonanciamagnética nuclear) (9, 10), muestran quela proteína celular tiene un 40% de estruc-tura en α-hélice y apenas un 3% de hojaplegada en β, mientras que la isoforma pa-tológica tiene un 30% de α-hélice y un40% de hoja plegada en β.

Estudios comparativos de ambas prote-ínas con marcadores metabólicos de-muestran que el cambio de conformaciónes un proceso postraduccional, que con-lleva un cambio drástico en las propie-dades de la proteína (Pan et al., 1993).Así, mientras que la proteína normal ce-lular es soluble en detergentes suaves nodesnaturalizantes y se digiere fácilmentecon proteasas (proteinasa K), la isoformapatológica es resistente a los detergentesy solo es parcialmente digerida por prote-asas, produciendo la isoforma conocidacomo PrPsc 27-30, llamada así debido aque deriva de la PrPsc y que su tamaño esde 27-30 kDa (2, 3).

El gen que codifica a la proteína celularPrPc se expresa de forma constitutiva entejidos neuronales y no neuronales de losanimales adultos, pero se encuentra bajoun control muy riguroso durante el desa-rrollo embrionario (11-13). Los nivelesmás altos de mRNA y PrPc se localizan enel tejido neuronal, especialmente en el hi-pocampo, y más específicamente en lassinapsis, mientras que existen niveles sen-siblemente más bajos en otros tejidos,como son corazón, músculo esquelético,y no se encuentran en el páncreas e hí-gado. El hecho es que los genes de la pro-teína PrP de humanos y ratones están lo-calizados en los cromosomas homólogos20 y 2, respectivamente, que se hayaidentificado en más de 15 especies demamíferos y que su secuencia genéticaestá altamente conservada, con una ho-mología del 90%. En casi todos ellos, elgen está compuesto por dos exones, unode los cuales no se traduce, y se encuen-tran separados por un intrón de aproxi-madamente 10 kb. Solamente tiene unmarco de lectura (ORF), que en humanos(14), hámster (15), ratón (16), rata (17) yoveja (18) han sido secuenciados. La pro-teína que codifica tiene aproximadamente250 aminoácidos y está localizado a 10nucleótidos del extremo 3´ del aceptor desplicing (corte y empalme) del exón 2. Enratones, ovejas y ratas, el gen que codi-fica la PrP tiene tres exones siendo el exón3 muy semejante al exón 2 de hámster(19). El promotor contiene regiones ricasen GC y carece de caja TATA, por lo quela región rica en GC funciona como unposible sitio de unión del factor de trans-cripción SP1 (20).

Ante la incertidumbre causada por la dua-lidad conformacional de la proteína prión


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se han tratado de buscar, tanto en losgenes humanos como en los ovinos, otrosmotivos genéticos que expliquen estadoble conformación, pero hasta la fechano se han encontrado ni posibles exones,ni otros marcos de lectura (ORF) que per-mitan splicing alternativo, ni otros motivosgenéticos que expliquen la existencia deestas dos proteínas de propiedades tan di-ferentes.

La síntesis de la proteína PrPc se realiza enel retículo endoplasmático rugoso, enforma de una pre-proteína que consta de254 aminoácidos (según la especie animal)y en la que se pueden destacar las si-guientes características estructurales:

1. En el extremo amino-terminal, una se-cuencia señal de 22 aminoácidos (pép-tido señal).

2. Desde el aminoácido 51 al 91, cinco re-peticiones de un octapéptido.

3. Un núcleo hidrofóbico de unos 30 ami-noácidos –112 al 145– muy conservadosen todas las especies de mamíferos.

4. Cuatro segmentos separados que, porestudios de predicción de modelos es-tructurales por ordenador, son candi-datos para formar estructuras secun-darias.

5. Tres aminoácidos susceptibles de glu-cosilarse: Asn 181, Asn 197 y Ser 232.

6. Dos Cys (179 y 214) que forman unpuente disulfuro que estabiliza la mo-lécula.

7. Una región hidrofóbica de 22-23 ami-noácidos en el extremo carboxi-terminal.

Una vez terminada la síntesis, la proteínasufre un proceso de maduración complejoantes de convertirse en la proteína celularnormal. El proceso de maduración empieza

en el retículo endoplasmático rugoso y ter-mina de completarse en el aparato deGolgi con el proceso de glicosilación.

El descubrimiento de la proteína prión su-puso un gran avance para caracterizar laetiología de las EET, al proporcionar unmarcador molecular específico de dichasenfermedades. Así, aceptando como vá-lida la teoría de Prusiner, por la que laPrPsc es una variante conformacional dela PrPc, los diferentes estudios de conver-sión postulan un modelo de propagacióndel prión que involucra una interacciónproteína-proteína, entre la PrPc delhuésped y la PrPsc externa, que actúapromoviendo la conversión de PrPc aPrPsc en un proceso autocatalítico, que asu vez procede muy eficientemente al in-teraccionar proteínas con la misma estruc-tura primaria (21). Sin embargo, el meca-nismo concreto de formación de la PrPsctodavía se desconoce. Algunos estudiosespeculan que esta proteína tiene una ca-pacidad inherente para promover supropio cambio conformacional, mientrasotros piensan que es necesaria una aso-ciación de esta proteína con un agente in-feccioso (proteína X) para su propagación(2, 3, 22).

Aunque se ha avanzado mucho en el co-nocimiento del papel de la proteína priónen las EET, la función biológica de la PrPcno es del todo conocida. Sin embargo, seha sugerido que debe jugar un impor-tante papel en el mantenimiento y/o re-gulación de las funciones neuronales.Estudios realizados demuestran su capa-cidad para unir cobre a la PrPc, y se hapropuesto su relación en la regulación dela concentración de cobre presináptico yen la transmisión sináptica. También se laha relacionado con la señalización en la


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superficie celular o con la adhesión ce-lular, debido a su unión a la membranaplasmática a través de la GPI anterior-mente mencionada.

Métodos de diagnósticoLas técnicas de diagnóstico de este grupode enfermedades se basan en la observa-ción de las lesiones características de estegrupo de enfermedades y en la detecciónde la PrPsc en el sistema nervioso central,principalmente mediante técnicas inmu-noquímicas (OIE, 23). Al contrario queotras enfermedades infecciosas, las enfer-medades causadas por la proteína priónno se pueden diagnosticar mediante lamayoría de los métodos convencionales.Dado que el agente causal de las EET ca-rece de ácidos nucleicos, no se pueden uti-lizar técnicas como la PCR que se basanen la detección del genoma. Asimismo, losindividuos infectados no reconocen como“extraña” la proteína PrPsc, por lo que nose produce una respuesta inmunológicaespecífica y no son aplicables técnicas se-rológicas. Tampoco existen técnicas in vitropara aislar el agente causal, por lo que elmétodo utilizado para demostrar la infec-

tividad del agente es la inoculación en ani-males de experimentación.

Los métodos laboratoriales de diagnósticode las EET reconocidos oficialmente se re-alizan post mórtem en muestras de tejidodel sistema nervioso central (OIE, 23).Actualmente no existe ningún test dediagnóstico de la EEB que se puedaaplicar en animales vivos. En el caso delscrapie; dado que la PrPsc se puede dis-tribuir por el sistema linforreticular engran cantidad, la detección de esta pro-teína en tejido linfoide obtenido mediantebiopsias es el único método fiable dediagnóstico in vivo (24), aunque su sensi-bilidad no es del 100%.

Tradicionalmente, el diagnóstico de lasEET se ha basado en la observación de laslesiones características de estas enferme-dades mediante microscopía óptica. Estaslesiones son únicamente microscópicas yse localizan exclusivamente en el sistemanervioso central (25); se caracterizan poruna neurodegeneración espongiforme,acompañada generalmente de gliosis, de-generación y pérdida neuronal y, en de-terminados casos, amiloidosis cerebral(26). La lesión característica es la vacuoli-

Figura 1A. Vacuolización del pericarion neuronal deuna oveja afectada de scrapie.

Figura 1B. Vacuolización del neuropilo de una ovejaafectada de scrapie.


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zación, generalmente bilateral y simétrica,del pericarion neuronal y del neuropilo dela sustancia gris (espongiosis; figura 1) lo-calizada en regiones neuroanatómicasconcretas (23, 26, 27). Las principalesáreas del sistema nervioso central dondese localiza la vacuolización son las astasdorsales en la médula espinal, el núcleodel tracto solitario, el núcleo dorsal delnervio vago, el núcleo del tracto espinaldel nervio trigémino, los núcleos vestibu-lares y la formación reticular en la médulaoblongada, la sustancia gris central en elmesencéfalo, el área paraventricular en elhipotálamo y el tálamo y el área septal.Con menor frecuencia e intensidad sepueden observar también vacuolizadasotras áreas del sistema nervioso central,como el hipocampo, la corteza cerebelaro cerebral y los núcleos basales (25, 28).

Un estudio realizado al inicio de la epi-demia de EEB en Reino Unido demuestraque mediante el examen histopatológicode una única sección de la médulaoblongada a nivel del óbex (figura 2), va-lorando el núcleo del tracto solitario y elnúcleo del tracto espinal del nervio tri-gémino, se pueden detectar el 99,6% delos casos que presentan lesiones (29). En

el caso del scrapie ovino, la vacuolizaciónes más destacada en la médula espinal,tronco del encéfalo y tálamo, pero, a di-ferencia de la EEB, existe una gran varia-ción en la distribución topográfica de laslesiones entre los individuos (23, 30, 31).La vacuolización puede afectar a la sus-tancia gris de diversas áreas del encéfalo,observándose en un alto porcentaje delos casos en la corteza cerebral y cere-belar (31). Entre los factores que puedeninfluir en el perfil lesional, se han des-crito: la cepa del agente causal delscrapie, el genotipo del gen PRNP, la víade infección, la edad del hospedador enel momento de la infección y la duraciónde la fase clínica (27, 32). A pesar de lavariabilidad existente, el área que conmayor frecuencia e intensidad está afec-tada es la médula oblongada al nivel delóbex, siendo generalmente el núcleodorsal del nervio vago la primera locali-zación de la vacuolización. Otras locali-zaciones que frecuentemente se encuen-tran afectadas en las primeras fases dela enfermedad son el núcleo del tractosolitario, el rafe medio, el núcleo deltracto espinal del nervio trigémino y elnúcleo de la oliva (33, 34).

Figura 2A. Extracción del tronco del encéfalo. Ovinoafectado de scrapie.

Figura 2B. Médula oblongada en el tronco del encé-falo (punta del bisturí). Ovino afectado de scrapie.


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En 1998 se detectaron unos casos atípicosde scrapie, de los que se hablará más ade-lante, que no presentan vacuolización enla médula oblongada al nivel del óbex,siendo las áreas más afectadas la cortezacerebelar y cerebral y, en menor medida,el mesencéfalo. Este perfil lesional atípicose acompaña de una distribución de laPrPsc y un patrón de glicosilación dife-rente a otros casos de scrapie, se presentaen mayor proporción en ovejas con almenos un haplotipo AHQ y se ha aso-ciado a una nueva cepa de scrapie, posi-blemente de origen espontáneo (35, 36).

A pesar de la uniformidad en el perfil le-sional presente en la EEB y en menor me-dida en el scrapie, el examen histopatoló-gico del encéfalo no garantiza laconfirmación del diagnóstico de todos loscasos clínicos de estas enfermedades. Laslesiones vacuolares varían en intensidad yen determinados casos pueden ser mí-nimas o insuficientes para confirmar eldiagnóstico, dando lugar a resultados noconcluyentes (29, 33).

Por otro lado, se puede observar una va-cuolización del tejido nervioso atribuiblea otras causas, tanto patológicas como nopatológicas. Por ejemplo, en bovinos consignos neurológicos, así como en ani-males sanos, se ha observado una vacuo-lización del pericarion neuronal en di-versas regiones neuroanatómicas cuyacausa se desconoce; se presenta frecuen-temente en el núcleo rojo y en el núcleohabenular, y ocasionalmente en otrasáreas, como la formación reticular, la sus-tancia gris intermedia de la médula es-pinal, el núcleo parasimpático y el núcleomotor del nervio facial, el núcleo motordel nervio oculomotor, el núcleo gracilis yel núcleo cuneado lateral (37, 38). En el

caso del ovino también se puede detectarvacuolización en neuronas, y en el neuro-pilo en diferentes localizaciones en ani-males no afectados por una EET, entre lasque se encuentra el núcleo dorsal delnervio vago (23, 39). Asimismo, diversascausas debidas a la toma o procesado de-fectuoso de la muestra pueden producirartefactos que se asemejan a las lesionesproducidas por una EET (29, 40, 41).

Finalmente, destacar que el término en-cefalopatía espongiforme es un términodescriptivo que en neuropatología aludea cualquier enfermedad en la que la es-pongiosis o vacuolización es la lesión pre-dominante (42). La espongiosis puedeafectar tanto a la sustancia gris como a lablanca, siendo las enfermedades priónicasel principal ejemplo de enfermedades quecursan con vacuolización de la sustanciagris. La necrosis cerebrocortical o la into-xicación por plomo produce una espon-giosis laminar en el neuropilo de la cor-teza cerebral (43). La espongiosis de lasustancia blanca es característica de di-versas alteraciones tóxicas y metabólicas,como la encefalopatía hepática o la ence-falopatía renal (37).

Respecto a la gliosis, consiste en una res-puesta común e inespecífica de las célulasde la glía frente a diferentes estímulos yque también está presente frecuente-mente en las enfermedades priónicas(43). En este grupo de enfermedadespuede observarse una astrogliosis hiper-trófica y una activación de la microglía,generalmente asociadas a los depósitosde PrPsc, la vacuolización y la degenera-ción neuronal (28, 44-46). Los astrocitos,como la microglía, pueden acumular PrPsctanto en casos naturales como experi-mentales de EET (47,48).


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Otra lesión característica de las EET es ladegeneración y pérdida neuronal, estu-diada principalmente en animales de ex-perimentación inoculados con el agentecausal. En casos de infección natural deEEB y scrapie se han observado, ademásde la vacuolización, otras formas de de-generación neuronal, como neuronas ne-cróticas diseminadas acompañadas enocasiones por neuronofagia, neuritas dis-tróficas y neuronas contraídas y basofílicas(31). En la EEB se observa un despobla-miento neuronal en determinados nú-cleos del sistema nervioso central, lle-gando a producirse una reducción dehasta el 50% de las neuronas en los nú-cleos vestibulares (49, 50) y en el núcleode la oliva (51). Entre los núcleos en losque no se ha detectado una pérdida sig-nificativa de neuronas se encuentran eldorsal del nervio vago, el hipogloso, elcaudado y el rojo (50, 51). En el scrapiese han detectado alteraciones intensas,con una apariencia laminar, en las neu-ronas piramidales de la lámina V de la cor-teza cerebral frontal (31).

En diversas EET humanas y animales se haobservado la presencia de placas densas deamiloide en el sistema nervioso central coin-cidentes con un inmunomarcaje frente a laPrPsc (26, 28, 52-54). Estas placas sonabundantes en determinadas EET hu-manas. Concretamente en el kuru, las de-nominadas placas de “tipo kuru” puedenobservarse junto con finas espículas ra-diales, mientras que en la v-ECJ reciben elnombre de placas floridas al encontrarse ro-deadas de vacuolas (55). La amiloidosis ce-rebral es también frecuente en el scrapieovino y, en menor medida, en el caprino.Se localiza en el cerebelo y en áreas ros-trales del encéfalo, principalmente en la

corteza cerebral. Se presentan como placasgeneralmente con forma estrellada, rode-adas por áreas de vacuolización del neuro-pilo y una marcada astrocitosis; tambiénson frecuentes las placas con disposiciónperivascular (31, 53, 56). La presencia deeste tipo de placas en la EEB es muy escasa.

Por otro lado, puesto que una caracterís-tica común y específica de las EET es laacumulación en el sistema nervioso cen-tral de la proteína PrPsc (figura 3), este seconsidera el único marcador molecularidentificado asociado a estas enferme-dades (2, 3). La acumulación de PrPsc enel tejido nervioso es previa a la neurode-generación espongiforme (57, 58), por loque la utilización de métodos sensibles dedetección de la PrPsc permite el diagnós-tico de los animales infectados en los quelas lesiones neuropatológicas son mínimaso no están presentes. Además, dada laalta resistencia de los priones a la degra-dación y a diversos agentes fisicoquímicos(59), estas técnicas se pueden aplicar entejidos autolíticos o congelados en los quela falta de integridad del tejido impide eldiagnóstico histopatológico.

La mayoría de los métodos de diagnósticoactuales se basan en la detección del frag-mento resistente a la proteinasa K (PrPres)de la PrPsc mediante el uso de anti-cuerpos específicos. Los anticuerpos quese utilizan en el diagnóstico de las EET nodiscriminan entre ambas isoformas de laproteína, por lo que previamente a la de-tección de la PrPres es necesario degradarla PrPc, generalmente con proteinasa K(PK).

La inmunohistoquímica detecta la PrPsc insitu, lo que permite determinar tanto lapresencia de la PrPsc como su distribución


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en el tejido, su localización celular y lascaracterísticas morfológicas de la acumu-lación. Diversos trabajos demuestran lacapacidad de la inmunohistoquímica paradetectar la PrPsc en tejidos en los que noes posible realizar un diagnóstico histopa-tológico, ya que han perdido su morfo-logía por la autolisis o por la congelación(60-62). Los depósitos de PrPsc puedenobservarse, tanto asociados a las lesioneshistopatológicas, como en áreas dondeno se presenta vacuolización o esta es mí-nima (61, 63). La inmunotinción suele serbilateral (64) y se localiza principalmenteen el tronco del encéfalo, aunque en elcaso del scrapie con frecuencia se distri-buye por todo el sistema nervioso central(65, 66).

El diagnóstico de las EET por inmunohis-toquímica debe realizarse mediante laidentificación del patrón característico deinmunotinción, a través de su distribucióntopográfica y una localización celular es-pecífica (25, 64). Los diferentes tipos deinmunotinción específicos del depósito dePrPsc en el scrapie (60, 63, 64, 67) hansido descritos detalladamente porGonzález et al. (66, 68) siendo estos lossiguientes: intraneuronal, intraglial, estre-

llado, subpial, perivascular, subependi-mario, ependimario, lineal, punteado fino,partículas gruesas, coalescente, perineu-ronal y en placas.

La especificidad y sensibilidad de la téc-nica inmunohistoquímica depende engran medida de la metodología y los an-ticuerpos utilizados (63, 65, 69, 70).Como se ha descrito anteriormente, losanticuerpos utilizados para la detecciónde la PrPsc reconocen las dos isoformasde la proteína prión y tanto el proceso defijación como la acumulación y formaciónde agregados de la PrPsc ocultan los epí-topos necesarios para la reacción con elanticuerpo. Ello implica la necesidad deutilizar una metodología que permita lasupresión de la PrPc, así como una recu-peración e incremento de la exposición delos epítopos ocultos de la PrPsc (63). Paraello, diversos pretratamientos han sidoaplicados previamente a la inmunotinciónpara desenmascarar epítopos, poten-ciando la inmunotinción específica y mi-nimizando la inespecífica.

Al contrario que en la EEB, en el scrapiese produce una amplia distribución de laPrPsc en el organismo, principalmente enel sistema linforreticular (71). En la actua-

Figura 3. Acúmulos de PrPsc en el tejido nervioso de la médula oblongada. Bovino afectado de EEB.


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lidad, la demostración de la presencia dela PrPsc en el tejido linfoide está utilizán-dose cada vez más para el diagnóstico delscrapie tanto in vivo como post mórtem(72-76). La aplicación de técnicas inmu-nohistoquímicas sobre muestras de tejidolinfoide obtenido mediante biopsia, prin-cipalmente de tonsilas palatinas (72),tercer párpado (73) y mucosa rectal (77,78), permite diagnosticar la enfermedadincluso en fases preclínicas de la misma.En animales con genotipos susceptibles seha descrito una sensibilidad del test reali-zado en biopsia de tejido linfoide aso-ciado al tercer párpado y a la mucosarectal del 85-90% (73, 79). Sin embargo,esta técnica presenta algunas limitaciones,debido principalmente a que algunos ani-males infectados únicamente presentandepósitos de PrPsc en el sistema nerviosocentral.

La técnica de Western blot para la detec-ción de la PrPsc es un método de diagnós-tico de las EET de una alta sensibilidadcon el que se obtienen resultados cualita-tivos que permiten confirmar la especifi-cidad de la señal (80). Puesto que, comose ha mencionado anteriormente, tantola PrPc como la PrPsc tienen un peso mo-lecular (Pm) de 33-35 kDa (2, 3, 81), siambas proteínas se someten a un procesode digestión con PK, la PrPc se degradacompletamente, mientras que en la PrPscse elimina el extremo N-terminal que-dando una fracción de la misma resistentea la PK de un Pm de 27-30 kDa, denomi-nada PrP 27-30 o PrPres (12). La técnica deWestern blot permite la detección del frag-mento PrPres de la PrPsc mediante la reac-ción específica con anticuerpos (figura 4).La metodología básica consiste en la ex-tracción del fragmento resistente de la

PrPsc mediante una digestión con PK, laseparación de las proteínas en un gel depoliacrilamida mediante una electroforesisy su transferencia a una membrana de ni-trocelulosa. En este protocolo general, laOIE recomienda incluir una extracción condetergentes (N-laurilsarcosina) y variospasos de ultracentrifugación, lo que per-mite obtener una mayor concentración deproteína y, por lo tanto, una mayor sensi-bilidad de la técnica (82). La sensibilidadde esta técnica depende también de otrosfactores, como el proceso de extracción olos anticuerpos utilizados (83).

La detección de la PrPres mediante la téc-nica de Western blot se utiliza frecuente-mente en el diagnóstico de la EEB y delscrapie, especialmente para confirmaraquellos casos en los que las lesiones neu-ropatológicas son mínimas o no estánpresentes o el tejido no es adecuado parael examen histopatológico por autolisis,congelación o destrucción de las áreas delocalización de las lesiones (84-89). La de-tección de la PrPsc en animales preclínicosque no presentan lesiones en el sistemanervioso central indica una mayor sensi-bilidad de la técnica respecto al examenhistopatológico (34, 90). También se hademostrado una mayor sensibilidad de latécnica de Western blot con respecto a lademostración de las SAF (ScrapieAssociated Fibrils) (91). Además, en ani-males afectados por EEB se han detectadodepósitos de PrPsc en áreas del sistemanervioso central donde las lesiones histo-patológicas no suelen presentarse, comoen el cerebelo o la corteza cerebral,aunque las señales más intensas se ob-tienen en la médula oblongada y el me-sencéfalo (85, 88).


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Las fibrillas asociadas a scrapie (SAF), ob-servables mediante microscopía electró-nica, son marcadores ultraestructuralesespecíficos de las EET (92) cuyo constitu-yente principal es la PrPsc (93). Se obser-varon por primera vez en ratones y háms-teres infectados experimentalmente conel agente causal del scrapie (94), y poste-riormente se han detectado en diversasEET, como el scrapie ovino (92) y el ca-prino (95). Su detección en los primeroscasos de EEB en Reino Unido constituyóuna evidencia adicional al cuadro clínicoy lesional para incluir a esta nueva enfer-medad dentro del grupo de las EET (96).

Estas fibrillas se pueden observar mediantemicroscopía electrónica utilizando técnicasde tinción negativa en fracciones subcelu-lares de tejido nervioso de animales afec-tados por la EEB y el scrapie, y se puedenidentificar por su morfología característica.La metodología consiste básicamente en eltratamiento de fracciones subcelulares deltejido nervioso con detergentes que solu-bilizan la PrPc, mientras que la PrPsc seagrega en forma de varillas o fibrillas queposteriormente se pueden separar me-diante ultracentrifugación y visualizar en elmicroscopio electrónico (81, 92).

Las SAF miden entre 100-500 nm de lon-gitud, presentan una disposición lineal yestán compuestas de dos o cuatro fila-

mentos de 4-6 nm de ancho. En funciónde su morfología se pueden identificarprincipalmente dos tipos, tipo I y II,aunque también se han observado fibri-llas que tienen propiedades de ambostipos (94).

La alta especificidad de la técnica y su efi-cacia en tejidos autolíticos o congelados(92, 97, 98), dio lugar a que se utilizaraen el diagnóstico del scrapie y la EBBcomo un criterio de diagnóstico indepen-diente y de apoyo a las técnicas histopa-tológicas en el programa de vigilancia deestas enfermedades en Reino Unido (99).

Patogenia y transmisiónLa puerta de entrada más habitual delagente etiológico en los casos de EEB yscrapie es la vía oral. Así, se acepta que seproduce a través del consumo de piensoso leches maternizadas contaminados conla proteína prión (25). En la enfermedaddel scrapie, otro de los procedimientosmás importantes de acceso del agente esla ingesta de la placenta. También se con-templan otras vías en el caso de la enfer-medad de scrapie (la presencia de pe-queñas heridas en la piel, por ejemplo),que también podrían contribuir a la en-trada de la PrPsc en animales de las espe-cies ovina y caprina cuando están en con-tacto con otros animales infectados osimplemente por la contaminación pre-sente en el medio en rebaños afectadosde la enfermedad (61, 100).

En la infección natural, el agente causalpenetra en el organismo por vía oral através del tracto intestinal. Sin embargo,en los estudios experimentales se handescrito otras vías efectivas, como la in-tracerebral, la intraperitoneal, la intrave-

Figura 4. Bandas específicas de la PrPsc en unamuestra de médula oblongada de ovino afectado descrapie.


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nosa, la intraocular y conjuntival y a travésde escarificaciones en la piel (61, 101-103). Los puntos de entrada del agentetras la ingestión de material contaminadopueden ser distintos, aunque siempre im-plican al sistema inmunitario (104). Tantoen la EEB como en el scrapie, la PrPscentra en el organismo principalmente através del tejido linfoide asociado al intes-tino (GALT), sobre todo a la altura delíleon, ya que este alberga la placa dePeyer ileal, que actúa como tejido linfoideprimario e involuciona con la edad. Enconsecuencia, parece que existe mayorsusceptibilidad a contraer la enfermedada edades tempranas (105). En el meca-nismo de incorporación desempeñan unpapel importante las células M, que se lo-calizan adyacentes a las placas de Peyer,intercaladas en el epitelio de recubri-miento intestinal. Las células M son ente-rocitos modificados (presentan linfocitosB subyacentes) capaces de captar prote-ínas sin su posterior degradación a fin depresentarlas como antígenos al sistemalinforreticular. Así, la PrPsc pasa al sistemalinforreticular, donde se acumula y se re-plica en células macrofágicas y en célulasdendríticas foliculares (104). Estos tiposcelulares, junto con los linfocitos B, soncruciales en la patogenia de las EET.Estudios efectuados en ratones transgé-nicos demostraron que, en ausencia delinfocitos B, los ratones eran resistentes ala infección por PrPsc. Más tarde se de-mostró que la ausencia de linfocitos B im-pedía que maduraran las células dendrí-ticas foliculares, evitando así que estasacumularan la proteína prión (106).Asimismo, otros autores sostienen que laexpresión de PrPc en linfocitos B no es ne-cesaria para que se produzca neuroinva-

sión (107). Los folículos linfoides, estruc-turas en las que se encuentran las célulasdendríticas foliculares, son muy eficacespara la replicación de la PrPsc. De hecho,se ha demostrado que la presencia deestas estructuras en localizaciones no ha-bituales, como sucede en casos de infla-mación crónica, permite la acumulaciónde PrPsc. Eso hace que, por ejemplo, enlas mamitis crónicas que cursan con la for-mación de folículos linfoides, pueda ex-cretarse PrPsc a través de la leche (porejemplo, coinfección con lentivirus de lospequeños rumiantes) o, en el caso de ne-fritis crónicas, por la orina (108-110). Enresumen, las células M captan la PrPsc yla incorporan al tejido linfoide subepite-lial (104), donde son procesados por lascélulas dendríticas foliculares.

La tonsila palatina se considera otro puntode entrada del agente; desde el punto devista histológico, en este punto el tejidolinfoide se caracteriza por intercalarse conepitelio escamoso del paladar. El objetivodel tejido linfoide en esta localización y encondiciones normales es la identificaciónde antígenos que penetren en el orga-nismo por vía oral. Tras un tiempo de per-manencia variable en dicho tejido, elagente se dirige al sistema nervioso cen-tral por dos rutas principales: una directa,a través del sistema nervioso periférico, yotra indirecta, que implica la participacióndel sistema linforreticular (nódulos linfá-ticos, bazo, amígdalas) y del sistema ner-vioso periférico (104, 111). En el caso delscrapie se ha observado una amplia par-ticipación del sistema linforreticular (100),mientras que en la EEB esa participaciónes mínima (112). En el sistema linforreti-cular, la participación más relevante es ladel bazo, aunque depende de la vía de


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inoculación (101, 113). Una vez que laPrPsc está presente en el bazo, su concen-tración aumenta hasta estabilizarse, pre-viamente a la neuroinvasión del sistemanervioso central (113). De hecho, en laenfermedad del scrapie algunos autoresseñalan que el diagnóstico de la enfer-medad, tomando como muestras objetode estudio tanto la médula oblongadacomo el sistema linforreticular (nódulo re-trofaríngeo, tonsila palatina, biopsia detercer párpado, por el tejido linfoide aso-ciado a la membrana nictitante, o de mu-cosa rectal), permitiría diagnosticar tam-bién gran parte de los casos preclínicos,debido a la temprana distribución de laproteína prión en el tejido linforreticular(74-76, 79, 114). No obstante, la replica-ción de la proteína prión en el sistema lin-forreticular no es requisito indispensableen todos los casos (115, 116). De hecho,la participación del citado sistema puedeverse influida por factores endógenos oexógenos (por ejemplo, dosis infectivaselevadas) al individuo (117, 118). Así, enanimales de experimentación se ha des-crito neuroinvasión de prión en ausenciade sistema linforreticular (119), realizán-dose el proceso directamente por trans-porte axonal (120).

En el caso de los pequeños rumiantes, laruta de neuroinvasión de la proteína priónvaría sustancialmente dependiendo delagente infeccioso implicado, de la especiedel huésped y de la susceptibilidad gené-tica propia del individuo (100, 111, 121,122). Así, factores como el genotipo delhuésped pueden hacerla variar conside-rablemente. En ovinos que portan los ge-notipos más resistentes al codón 136 delgen PRNP (por ejemplo, ARR), la implica-ción del sistema linforreticular en la repli-

cación de la proteína prión es muy pe-queña, y la neuroinvasión se produce sinque el sistema linforreticular acumulePrPsc (119).

En la EEB, la replicación del prión se res-tringe al sistema nervioso central (123),siendo mínima la replicación del prión enel tejido linforreticular. Es importante des-tacar que el tejido linfoide intestinal se ex-tiende proximal y distalmente a lo largo deltracto gastrointestinal. En el sistema linfo-rreticular, la PrPsc se distribuye por su ex-tensión (sobre todo en la especie ovina, de-pendiendo también de genotiposespecíficos) y se transfiere al sistema ner-vioso entérico (111), que se considera elpunto de entrada del agente causal delscrapie en el sistema nervioso, ya que se hadetectado PrPsc en dicho sistema durantelas primeras fases de la infección. No se co-noce con precisión el mecanismo de trans-ferencia del agente causal desde el sistemalinforreticular al sistema nervioso central,pero diversos estudios sugieren que se pro-duce desde las células dendríticas folicu-lares hasta las fibras nerviosas que inervanlos folículos linfoides, siendo mayor la ve-locidad de neuroinvasión cuanto menor esla distancia topográfica entre estas célulasy las terminaciones nerviosas (122, 124).La difusión del agente puede ser pasiva,desde las células degeneradas que lo li-beran hasta las terminaciones nerviosas, omediante el transporte de células móviles,como los macrófagos o las células dendrí-ticas (115). Inicialmente se pueden ob-servar depósitos de PrPsc, en los gangliosde los plexos que se encuentran en el íleon,que se van distribuyendo progresivamentea lo largo de todo el sistema nervioso en-térico, presentando un patrón de disemi-nación similar al del sistema linforreticular


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(122, 125). Desde el sistema nervioso en-térico, utilizando estructuras nerviosas delsistema nervioso autónomo, y en concretodel sistema parasimpático, la PrPsc podríallegar al sistema nervioso central por dospuntos: a través de la médula espinal anivel torácico (columna intermediolateral,segmentos T5-L1), mediante el nervio es-plácnico y los ganglios mesentéricos cra-neal y celíaco, o a través de la médulaoblongada, en el núcleo motor dorsal delnervio vago. Estos hallazgos han sido des-critos en trabajos realizados sobre la distri-bución tisular de la PrPres mediante téc-nicas inmunohistoquímicas en modelosexperimentales murinos (111, 126).

No obstante, los primeros lugares del sis-tema nervioso central donde se acumulala PrPsc, tanto en casos naturales delscrapie y de EEB como en diversos mo-delos experimentales, son la médulaoblongada y la médula espinal torácica(127, 128). Una vez alcanzado el sistemanervioso central, el agente se disemina deforma ascendente y descendente a travésdel mismo (129). Asimismo, desde la des-cripción de los primeros casos de scrapieatípico, se sabe que en animales que pre-sentan esta variante de la enfermedad, eldepósito de PrPsc no se realiza principal-mente en la médula oblongada, sino quesu mayor concentración se localiza en elcerebelo (35).

Sin embargo, no se puede descartar queel proceso de neuroinvasión ocurra enparte por la fracción de PrPsc que circulapor la sangre, y que el agente acceda alencéfalo a través de este fluido (101,107). En 2002 se publicaron trabajos quedescriben la transmisión del scrapie me-diante transfusiones sanguíneas (130), loque reforzó la teoría de que la disemina-

ción de esta proteína se produjese tam-bién por la vía hematógena. Por ello, estavía de distribución del prión puede repre-sentar una ruta alternativa de neuroinva-sión a la del sistema nervioso entérico/sis-tema nervioso autónomo, que se apoyaen la descripción de la presencia de depó-sitos de PrPsc en los órganos circunventri-culares del cerebro, en los que la barrerahematoencefálica no existe (131).

Otra vía de diseminación descrita ha sidola linfática, ya que se ha detectado PrPscen los senos subcapsulares de los ganglioslinfáticos (116).

Actualmente, todavía no se conocen porcompleto las rutas naturales de transmi-sión de las EET. Se acepta que la transmi-sión horizontal se produce sobre todo me-diante la excreción alimentaria y laingestión oral, pero los largos periodos deincubación que caracterizan a estas enfer-medades hacen que sea muy difícil rela-cionar los casos clínicos con sus fuentesde infección originales.

Los estudios epidemiológicos sugierenque la transmisión natural del scrapie clá-sico ocurre principalmente por vía hori-zontal, ya sea por contacto directo entreanimales o, indirectamente, mediante lacontaminación del ambiente (132). Se haobservado que este tipo de transmisión seproduce de forma natural cuando ovejassanas sin ninguna exposición previa seponen en contacto con ovejas infectadasde scrapie. En consecuencia, se asumeque la PrPsc se elimina a través de excre-ciones (heces y orina) o secreciones (lechey saliva) (133).

Se estima que las principales fuentes decontaminación ambiental en la enfer-medad de scrapie son la placenta (134,


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135), las heces (101) y las canales de ani-males infectados. En el scrapie ovino se re-conoce la transmisión materna en condi-ciones naturales, aunque resulta difícil deevaluar, dado el posible contagio lateralentre animales de todas las edades. Existeun relativo desconocimiento respecto a lavía de infección de una oveja afectada descrapie hacia su descendencia y si la infec-ción ocurre in utero, en el periodo posnatalo en ambos momentos. La transmisiónvertical “pura”, aquella que se producein utero, nunca ha sido demostrada (6). Lapresencia de PrPsc e infectividad en la pla-centa, incluso en estados preclínicos de laenfermedad, sugiere que la transmisióntendría lugar desde las madres infectadasde scrapie a su descendencia y a otros ani-males durante el periodo de parto a travésde la placenta. Se ha observado que notodos los animales infectados acumulanPrPsc en la placenta y que el mismo animalno acumula PrPsc en todas las gestaciones.Dicha acumulación parece depender delgenotipo del feto (134-136), ya que no sehan detectado depósitos de PrPsc en pla-centas de ovejas infectadas de scrapie cuyofeto presenta genotipo resistente al scrapieclásico. En las ovejas ARR/VRQ con scrapieno se acumula PrPsc en sus placentas, in-cluso cuando el genotipo fetal es VRQ/VRQ(considerado susceptible). Esto podría estarasociado a la falta de PrPsc en el tejido lin-foide en animales infectados con genotipoARR/VRQ y, en consecuencia, a una inefi-ciente diseminación de PrPsc en la placenta(137). Sin embargo, la acumulación dePrPsc en la placenta no solo depende delgenotipo de la madre y del genotipo delfeto, sino también de la posición del fetoen el útero. La proteína patológica puedeestar presente en cotiledones de fetos con

genotipos resistentes a scrapie cuando seproduce un parto múltiple, en que los fetos(con genotipo resistente y susceptible)están compartiendo el mismo cuerno ute-rino. Esto se podría explicar por la exis-tencia de anastomosis sanguíneas entre co-tiledones de los diferentes fetos (136). Laduración de la exposición de los corderosa las placentas tras la época de partosafecta a la transmisión a la descendencia.Así, los corderos que se separan inmedia-tamente después del parto de sus madresinfectadas de scrapie y del rebaño pre-sentan menos incidencia de scrapie en laedad adulta que aquellos que se separanmás tarde o que los que no son segre-gados. La progenie de ovejas que desarro-llan scrapie presenta más probabilidad decontraer la enfermedad que la procedentede ovejas aparentemente sin scrapie, de-bido tanto a la influencia de la genéticacomo a la transmisión de la enfermedad.No obstante, aunque de forma excep-cional, existen animales nacidos de ambospadres infectados de scrapie que no desa-rrollan la enfermedad. Cuando solo uno delos padres está afectado, sobre todo si esel macho, el riesgo para la descendencia sereduce. En consecuencia, se acepta que latransmisión materna es mucho más impor-tante que la paterna, aunque esta dife-rencia es menor si la progenie es separadatras el parto, protegiéndose de este modode una posterior infección horizontal (132).

En el ganado vacuno, todas las evidenciasindican que en condiciones naturales elagente de la EEB no se propaga horizon-talmente en el entorno mediante excre-ciones y/o secreciones, ni verticalmente através de transmisión materna (138, 139).Así, se acepta que la epidemia de la EEBfue debida a la intervención humana, al


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utilizarse canales de animales infectadoscon priones para la producción de harinasde carne y hueso como fuente de alimen-tación del ganado vacuno. La retirada deestas harinas para la alimentación animalha tenido un claro efecto sobre la inci-dencia de la EEB, que se ha reducido deforma drástica.

La transmisión materna y/o vertical en laEEB, desde la madre al ternero, parece sermuy rara o incluso inexistente en estadiostempranos de incubación de la enfer-medad, pero el riesgo aumenta depen-diendo del periodo transcurrido entre elnacimiento del ternero y el comienzo delos signos clínicos en la madre. Así, seconsidera que, en una vaca afectada deEEB que tenga el parto hasta 6 mesesantes o después de la aparición de lossignos clínicos, la probabilidad de que suternero adquiera la enfermedad aumentaconsiderablemente (140, 141). Sin em-bargo, no se sabe si la transmisión puedeocurrir por vía transplacentaria durante lagestación o tempranamente en el periodoposnatal a través de secreciones o excre-ciones maternas (133).

Se han sugerido otras posibles vías de en-trada de la PrPsc, como la mucosa olfatoriaen humanos (142) o las heridas en lalengua en un modelo de enfermedad trans-misible del visón (ETV) en hámsteres (143).

Todos los estudios realizados sobre la pato-genia y transmisión del scrapie y la EEB sonlos que han precisado qué órganos y tejidospueden ser considerados peligrosos para elconsumo humano, siendo calificados comomaterial específico de riesgo (MER). EnEspaña, el RD 3454 del año 2000 define elprograma integral coordinado de vigilanciade las EET, y por tanto, regula su retirada,

tratamiento y control documental. No obs-tante, es el Real Decreto 1911 del año 2000y sus posteriores modificaciones el que de-fine concretamente qué materiales debenser retirados de la cadena alimentaria comomedida de protección del consumidor. Deesta forma, quedan definidos en funciónde la especie los siguientes tejidos y ór-ganos:

• Bovinos:

– El cráneo, excluida la mandíbula e in-cluidos el encéfalo y los ojos, y la mé-dula espinal de los bovinos de más de12 meses.

– La columna vertebral, excluidas lasvértebras de la cola, las apófisis espi-nosas y transversas de las vértebrascervicales, torácicas y lumbares, y lacresta sacra media y las alas del sacro,pero incluidos los ganglios de la raízdorsal, de los animales mayores de30 meses.

– Las amígdalas, los intestinos, desde elduodeno hasta el recto, y el mesenteriode los bovinos de todas las edades.

• Ovinos y caprinos:

El cráneo, incluidos el encéfalo y los ojos,las amígdalas y la médula espinal de losovinos y caprinos de más de 12 meses oen cuya encía haya hecho erupción un in-cisivo definitivo, así como el bazo y elíleon de los ovinos y caprinos de todas lasedades.

Factores genéticosLos factores genéticos que influyen en lasusceptibilidad y el desarrollo de una EETanimal continúan todavía en fase de es-tudio. Es una cuestión relevante, ya queel descubrimiento de un gen directa-


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mente implicado en el desarrollo de estegrupo de enfermedades ha permitido laaplicación de un sistema de control me-diante la selección de animales resis-tentes, lo que se ha llevado a cabo en laespecie ovina en la Unión Europea.

El gen de la proteína prión (PRNP) tieneuna longitud variable, entre 16.000 y22.000 bases, y está formado por dos otres exones (dependiendo de la especie),si bien toda la región codificante (ORF) seencuentra en un único exón. Este gen co-difica una glicoproteína de membrana, laPrPc, que posee entre 230 y 255 amino-ácidos, y cuya secuencia está altamenteconservada entre especies. Este gen se haidentificado en un gran número de espe-cies, tanto domésticas como salvajes. Lahomología entre las distintas especies esmuy elevada; por ejemplo, un 94% de lasecuencia nucleotídica de las especies bo-vina y ovina es idéntica. A su vez, estas es-pecies muestran una homología con elgen humano del 66,7 y el 65,4%, respec-tivamente. En relación con él se ha des-crito un gran número de polimorfismos ovariantes genéticas en distintas especiesque se pueden clasificar en:

• Mutaciones puntuales: un cambio de unnucleótido en un codón da lugar a uncambio aminoacídico en la proteína.

• Inserciones y deleciones: se producen enla región de octapéptidos, dando lugara un número distinto de repeticiones(según los diferentes individuos).

El desarrollo de una EET de forma naturalestá muy influido por las alteraciones enel gen del hospedador que codifica parala proteína PrP (144). Estos polimorfismospueden influir en la conversión de PrPc enla isoforma PrPsc (145). Los mecanismos

por los que una variante alélica individualconduce a una susceptibilidad alterada oa un cambio en el periodo de incubaciónno han sido bien definidos. Se ha pro-puesto que, en humanos, los polimor-fismos del gen PRNP pueden presentarseen sitios críticos implicados en la transi-ción de conformación de PrPc a PrPsc(146).

El gen de la proteína PrPc humana se lo-caliza en el cromosoma 20, tiene una lon-gitud de 16.000 bases y codifica una pro-teína de 253 aminoácidos. Ciertasmutaciones dan lugar a un cambio ami-noacídico que, al provocar una modifica-ción conformacional del plegamiento dela proteína prión, origina una EET. Se hanobservado mutaciones en las formas fa-miliares de la ECJ, en el síndrome deGerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) yen el insomnio familiar letal. Por ejemplo,la mutación que supone el cambio deprolina por leucina en el codón 102 es su-ficiente para causar una forma de GSS.Los distintos polimorfismos observados enla especie humana se deben a insercioneso deleciones de octapéptidos o a muta-ciones puntuales. En la actualidad se handescrito 25 mutaciones en el gen PRNPhumano, pero no todas ellas ligadas al de-sarrollo de la enfermedad. La causa másfrecuente de ECJ familiar es la mutaciónpuntual en el codón 20, que aparece enmás del 70% de las familias con ECJ he-reditaria en todo el mundo.

La predisposición genética tiene su in-fluencia en todos los tipos de ECJ (fami-liar, iatrogénica y esporádica). El codón129 parece ser el que está implicado enesta predisposición. Así, los casos iatrogé-nicos resultantes del uso de la hormonadel crecimiento están asociados con el ge-


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notipo homocigoto valina en este codón.Por otro lado, los casos de la v-ECJ hanaparecido en individuos homocigotos me-tionina.

El gen que codifica para la proteína priónbovina tiene un tamaño de 20-22.000bases y se encuentra en el cromosoma 13(13q17). La secuencia aminoacídica de laproteína codificada difiere de la ovina ensiete u ocho posiciones. Como conse-cuencia de la epidemia de EEB sufrida enel Reino Unido, se han llevado a cabo di-versos trabajos con el fin de detectar labase genética de esta enfermedad en laespecie bovina. Además de la necesidadde contacto con el agente (relacionadacon el consumo de alimentos contami-nados), la epidemiología de esta enfer-medad induce a pensar que, al igual queocurre en otras especies (humanos uovinos), existe un componente genético.

Se han descrito algunos polimorfismos enel gen PRNP de esta especie (W84R,G100S, K113R, V115M, H143R, S146N yN177S), pero la demostración de su rele-vancia respecto a la susceptibilidad frentea la EEB está todavía en fase de estudio(147, 148).

Recientemente, se ha demostrado la aso-ciación entre la susceptibilidad a EEB y lainserción/deleción de 12 y 23 pares debases (pb) en la región promotora del genPRNP (149, 150). El mayor efecto lo pro-duce la deleción en homocigosis, tanto delas 12 como de las 23 pb. Las primeras in-vestigaciones destinadas a la identifica-ción de una base genética que pudieraexplicar la diferencia en cuanto a la sus-ceptibilidad y al desarrollo de una EET sellevaron a cabo en la especie ovina. Dehecho, la influencia de la genética del

hospedador en esta especie es una de lasmejor conocidas, incluso se han llegado aestablecer relaciones entre algunos poli-morfismos del gen PRNP y la susceptibi-lidad al scrapie. En la actualidad, como yase ha indicado, se están aplicando estosconocimientos en el control de esta en-fermedad.

La revisión realizada por Kimberlin, en1979 (151), resume los conocimientos dela época respecto a la susceptibilidad o laresistencia genética frente a la enfer-medad, tanto experimental como natural.En esta revisión se hacía referencia a doshechos fundamentales que ayudaron acomprender la complejidad de la enfer-medad. Uno de ellos consistía en pro-poner que los animales podían mostrarresistencia a la enfermedad, pero tal vezno a la infección, de forma que podríanexistir animales que tuvieran un periodode incubación más largo que su propiavida, pero no por ello dejar de transmitirel agente causal. Otro era la posibilidadde que los animales fueran resistentes ala única cepa utilizada en todos los expe-rimentos realizados hasta el momento(SSBP-1), pero que no lo fueran para otrasnuevas cepas de scrapie todavía no carac-terizadas.

El descubrimiento de un gen celular quecodificaba la proteína PrPc fue una de lasaportaciones más importantes que revo-lucionó la genética del scrapie (12). Apartir de ese momento, todos los estudiosde susceptibilidad genética a la enfer-medad giraron en torno a diferentes po-limorfismos descritos en el gen PRNP. Apartir de esta información, se comprobóla existencia de un polimorfismo en elcodón 171 que codificaba dos amino-ácidos (glutamina/arginina) (152). Pese a


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que en aquel momento se desconocía laimportancia de este descubrimiento, elpolimorfismo del codón 171 ha sido unode los más importantes en el control delscrapie, y está asociado, como se referirámás adelante, a la susceptibilidad o la re-sistencia a la enfermedad.

En 1995, el equipo de investigación deBelt estableció las cinco variantes haplo-típicas presentes en el gen PRNP ovino ysu asociación con el scrapie. Aunqueexisten diferencias en la frecuencia de loshaplotipos entre las razas ovinas y en loshaplotipos asociados a la enfermedad, sehan observado algunas características co-munes entre ellas. Por ejemplo, el haplo-tipo VRQ está asociado a una alta inci-dencia de scrapie y el haplotipo ARR auna incidencia baja; este último tiene unefecto dominante, ya que tanto los ani-males homocigotos como los heteroci-gotos presentan un menor riesgo de pa-decer la enfermedad; respecto a loshaplotipos AHQ, ARQ y ARH, su asocia-ción con la enfermedad depende en granmedida de la raza (153).

En la especie ovina, el gen PRNP tiene untamaño de 20.000 pb y codifica para unaproteína de 256 aminoácidos. Este gen hasido localizado en el cromosoma 13. Elgen presenta un alto grado de polimor-fismo, y hasta la fecha se han descrito 40mutaciones que suponen un cambio ami-noacídico en 27 codones distintos (154).La mayoría son raros y no se han asociadoa ningún fenotipo de la enfermedad, nien la infección natural ni en la experi-mental. Sin embargo, las variantes gené-ticas de los codones 136, 154 y 171 pa-recen tener influencia en la susceptibilidada la enfermedad. Del conjunto total deposibles alelos (2x2x3), solo cinco se de-

tectan con una frecuencia relativamentealta. La forma original del gen parece serla variante ARQ, habiéndose originado elresto de haplotipos mediante mutacionespuntuales. La frecuencia y la distribuciónde las distintas combinaciones varíansegún la raza. En los últimos años se hanpublicado numerosos trabajos en los quese determina la distribución de estosalelos en otras razas europeas. Concreta-mente, parece ser que los haplotipos pre-dominantes en las poblaciones ovinas es-pañolas son ARQ, ARR, ARH (155) y ARQen las poblaciones ovinas afectadas por laenfermedad (156). Resultados similares sehan obtenido en la raza sarda italiana yen razas portuguesas. Según los datos ob-tenidos principalmente de razas británicasy francesas, existe una clara influencia delgenotipo de PRNP para los codones 136,154 y 171 en la susceptibilidad del animala presentar el scrapie clásico. El genotipode PRNP se muestra como el principalfactor asociado a la incidencia de esta en-fermedad si se tiene contacto con elagente causal. Las conclusiones que seobtuvieron a partir de estas investiga-ciones se resumen a continuación:

• El haplotipo VRQ es el más estrecha-mente relacionado con la susceptibi-lidad al scrapie. Los animales homoci-gotos para este haplotipo son los quepresentan mayor riesgo. Los heteroci-gotos con el haplotipo resistente (ARRy AHQ) tienen menor riesgo.

• La forma original ARQ también se haasociado a la susceptibilidad a presentaresta enfermedad, aunque con unmenor riesgo o una penetrancia menorque el VRQ.


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• Los haplotipos ARR y AHQ se han aso-ciado a la resistencia a esta EET.

El grupo nacional de información descrapie establecido en el Reino Unido de-sarrolló una Guía universal para clasificarlos 15 posibles genotipos del gen PRNPen niveles de riesgo. Con este objetivo, seestablecieron distintas clasificaciones degenotipos teniendo en cuenta los alelospredominantes en las distintas razas. Losgenotipos se agrupan en función del nivelde riesgo del animal y del de su posibleprogenie. Dawson et al. (153) propor-cionan las tablas de riesgos, resaltandoque las interpretaciones de esta clasifica-ción están basadas en probabilidades y noen certezas. Las tablas se revisan de formaperiódica y pueden estar sujetas a modi-ficaciones. Las distintas agrupaciones delos genotipos se basan en el riesgo al de-sarrollo de la enfermedad (R) y han sidovaloradas de R1 a R5:

• R1: indica un riesgo muy bajo de desa-rrollar la enfermedad en el individuo yun riesgo muy bajo en la progenie deprimera generación.

• R2: indica un riesgo bajo del individuoy de la progenie.

• R3: indica un riesgo bajo individual,pero el de la progenie puede aumentaren función del genotipo del otro pa-rental.

• R4: indica que el scrapie se puede en-contrar de forma ocasional y que la pro-genie tiene mayor riesgo que la delgrupo anterior.

• R5: indica que este ovino tiene el mayorriesgo de desarrollar scrapie.

Esta guía realiza distintas clasificacionesen función de los alelos predominantes de

las razas; no obstante, se ha establecidouna única clasificación universal paratodas las razas.

En los últimos años, como se ha adelan-tado, se han descrito casos de scrapiecuyas características clínicas, patológicas,inmunoquímicas y estructurales difierenen gran medida de la enfermedad clásica.En la actualidad, se considera que estoscasos se han producido como conse-cuencia de la aparición de cepas atípicasde scrapie diferentes de las descritas hastaahora, denominadas genéricamentecepas clásicas.

La primera descripción de la presencia decepas atípicas de scrapie en Europa se re-alizó en Noruega; su descubrimiento enel año 1998 dio origen al propio nombrede una de estas cepas, la Nor98. Una delas características más importantes delscrapie atípico es que parece estar aso-ciado a animales con un genotipo resis-tente al scrapie clásico, incluidos los ARRhomocigotos. Además, pocos casos descrapie atípico están asociados al haplo-tipo sensible (VRQ). Del mismo modo, seha observado una relación entre el poli-morfismo 141 leucina (L)/fenilalanina (F)y la susceptibilidad a las cepas atípicas(157).

Ante la imposibilidad de disponer de unmétodo fiable para el diagnóstico in vivode las EET, su control se debe realizar me-diante la ejecución de una vigilancia ac-tiva y pasiva. Como complemento, el ge-notipado se utiliza como una herramientapara pronosticar el riesgo de padecer laenfermedad. Cuando se detecta un casopositivo, una vez que se realiza el análisisde los restantes animales del rebaño, muypocos animales son diagnosticados como


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positivos, de forma que el sacrificio ma-sivo de toda la explotación podría ser unamedida desmesurada. Sería preferibleanalizar el genotipo de los animales delrebaño y sacrificar solo a los que poseanuna clínica compatible con EET y los quetengan un genotipo sensible. Los pro-gramas de vigilancia basados en el geno-tipo de los animales se están aplicando endiversos países y, aunque todavía es unpoco precipitado extraer conclusiones, pa-recen estar dando resultados alentadoresen el control del scrapie clásico.

Por otro lado, además de los programasde vigilancia activa y pasiva, distintasDecisiones de la Comisión Europea se di-rigen hacia el establecimiento de pro-gramas de mejora enfocados a la selec-ción de una resistencia del ganado ovinoa las EET, junto con la definición de me-didas que cabría tomar en caso de ser de-tectado un foco de scrapie; ambas me-didas están basadas principalmente en elgenotipo para el gen PRNP.

Epidemiología y programas devigilancia y control de la EEBy scrapieLos estudios epidemiológicos llevados acabo al inicio de la epidemia de la EEB,confirmaron que la fuente común detodos los casos investigados era el uso depiensos comerciales fabricados con ha-rinas de carne y hueso, por lo que se sos-pechó que estas eran el principal vehículode transmisión de la enfermedad (158).La aceptación de que la causa inicial de laEEB era el consumo de piensos contami-nados motivó la prohibición en el ReinoUnido en 1988 de alimentar a los ru-miantes con harinas procedentes de ru-

miantes. Se asume que el origen de la en-fermedad se produjo a consecuencia deuna modificación efectuada a comienzosde los años 80 en los procesos de trans-formación de restos de matadero para laproducción de las harinas de carne yhueso, utilizadas como suplemento de lospiensos destinados a alimentar a animalesde producción. Dicha modificación se pro-dujo en los sistemas de producción utili-zados en las plantas transformadoras, quehasta entonces eran sistemas continuos,que fueron sustituidos por otros disconti-nuos o en fases. Asimismo, se suprimió eluso de solventes orgánicos hidrocarbo-nados para la separación más eficiente dela materia grasa de las harinas de carne yhueso, factor al que se atribuye una grantranscendencia causal (159), y se llevarona cabo cambios en el tratamiento térmicoque muy probablemente impidieron lainactivación completa del agente causalde la enfermedad de scrapie en dichosproductos, manteniéndose así una ele-vada carga infectiva (160). Aunque estahipótesis basada en la transmisión de laenfermedad por harinas de carne y huesoes la más aceptada, existen otras teoríasdiferentes que tratan de explicar suorigen, como las que apuntan la posibi-lidad de que un nuevo agente, originadoposiblemente por una mutación del genPRNP bovino u ovino, fuera el origen dela EEB.

Hasta julio de 1991, en torno al 70% delas explotaciones afectadas solo presen-taron uno o dos casos de EEB, lo que pa-rece indicar que la dosis de exposición fuebaja. Aun así, se supone que una propor-ción importante de la cabaña bovina bri-tánica (unos 4 millones de adultos) estuvoexpuesta al agente causal desde 1981-


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1982 hasta el verano de 1988, fecha enque se implantó la prohibición del con-sumo de proteínas de origen animal. Estoexplica por qué el número de casos deEEB en el Reino Unido ha sido tan elevado(159). A partir de 1993, en este mismopaís, el número de animales afectados porEEB fue decreciendo gracias al descensode nuevas infecciones, como conse-cuencia principalmente de la prohibiciónestablecida en 1988 de alimentar a los ru-miantes con harinas de carne y hueso(161). Sin embargo, se continuaron de-tectando varios casos en animales nacidostras la prohibición, por la contaminaciónde los alimentos para el ganado bovinocon ingredientes que se utilizaban en laalimentación de otras especies (162). Paraevitar esta contaminación cruzada, en2001 se prohibió el uso de este tipo deharinas procedentes de cualquier mamí-fero para la alimentación animal. No obs-tante, se han detectado nuevos casos deEEB en animales nacidos tras esta prohi-bición y, aunque el origen de la infeccióntodavía está investigándose, los datos pre-liminares sugieren que se debe a la impor-tación de alimentos contaminados (163).

Al principio se pensó que el problemaafectaba únicamente al Reino Unido, peroel paso del tiempo ha demostrado que noera así. Desde 1990, cada vez fueron máslos países que detectaron casos de la en-fermedad, y como resultado del estable-cimiento en 2001 del Programa de vigi-lancia de la EEB en la Unión Europea(Reglamento CE 999/2001), muchos pa-íses que se consideraban libres de la en-fermedad fueron identificando casos,aunque el único en el que se ha produ-cido una verdadera epidemia ha sido elReino Unido.

Los programas sistemáticos de vigilanciacomunes de las EET llevados a cabo en laUnión Europea a partir de 2001 se hancentrado en la investigación de casos deEEB en el ganado vacuno, de scrapie enel ovino y caprino y, más recientemente,de la enfermedad crónica caquectizanteen ciervos domésticos y de vida silvestre.Estos programas se basan en sistemas devigilancia pasiva y activa.

La información que se ha obtenido sobrela epidemiología de este grupo de enfer-medades ha sido extraída en buena partede los informes anuales que publica laComisión Europea (Dirección GeneralSANCO) sobre los programas de análisisy monitorización para la detección de lapresencia de las EET en los rumiantes dela Unión Europea (EU TSE Annual Reports2010).

En lo que se refiere a los bovinos, el pro-grama de vigilancia ha sido obligatoriopara todos los animales que hubieran su-perado una determinada edad, que,según señala la legislación comunitaria,fue establecida a partir de 2001 en losanimales de más de 30 meses (en Españae Italia 24 meses, por decisión de cadapaís), habiéndose procedido a una pro-gresiva elevación de la edad límite de aná-lisis, en la actualidad, entre 48 y 72meses, dado que en la actualidad la in-mensa mayoría de casos se detectan enanimales de más de esa edad.

El programa establece varios grupos diana:

• Bovinos sanos sacrificados en el mata-dero para consumo humano.

• Bovinos muertos o que se han sacrifi-cado en la explotación o en el trans-porte. En este caso se establece que losEstados miembros pueden no llevar a


158

cabo la toma de muestras en zonas re-motas con una baja densidad de ani-males, aunque ese grupo de animalesno puede superar el 10% de la pobla-ción total del país.

• Bovinos que han sido sacrificados de ur-gencia.

• Bovinos que muestran signos de enfer-medad en la inspección ante mortem enel matadero.

• Bovinos pertenecientes a explotacionesen las que se ha detectado algún casode EEB, bien de la cohorte de edad (na-cidos 1 año antes o después del caso deEEB), de la cohorte de alimentación(criados junto con el caso de EEB du-rante el primer año de vida) y cualquierotro sacrificado por tener un vínculoepidemiológico con un caso de EEB.

• Bovinos clínicamente sospechosos deestar afectados de una EET por pre-sentar síntomas compatibles con ella(Reglamento CE 999/2001, artículo 3) ysujetos a las medidas que se establecenen los artículos 12 y 13 de dicha norma.

En cuanto al programa llevado a cabo enla investigación de una EET en ovinos ycaprinos, se analiza una muestra repre-sentativa de la población ovina y caprinade cada país. En este caso se consideranlos siguientes grupos diana:

• Animales sacrificados para consumo hu-mano, en los que se analiza un mínimoanual de animales de más de 18 meses.

• Animales que no se sacrifican para con-sumo humano, grupo constituido porlos muertos en la explotación, los sacri-ficados de urgencia y los que presentansignos de enfermedad en la inspecciónante mortem. El muestreo, constituido

por animales de más de 18 meses, tieneque cubrir unos mínimos.

• Animales sacrificados a consecuencia delas actuaciones que se llevan a cabopara erradicar la enfermedad en re-baños con casos detectados de EET.

• Animales clínicamente sospechosos deestar afectados de una EET por pre-sentar síntomas compatibles con ella.

Recientemente, y para dar cumplimiento alo establecido en la Decisión 2007/182/EC,de 19 marzo de 2007, se ha establecidoun programa de vigilancia para detectar loscasos de encefalopatía crónica y caquecti-zante en cérvidos domésticos y silvestres,que incluye diferentes especies y grupos.

El establecimiento de programas de vigi-lancia en otras especies es voluntario porparte de los Estados miembros de la UE.

El muestreo y la analítica en el caso de lavigilancia activa se han llevado a cabo me-diante la toma de fragmentos de tejidonervioso procedente de la médula oblon-gada y su análisis mediante los test rápidosautorizados por la CE (Reglamento CE999/2001). La confirmación de los casospositivos o no concluyentes de la vigilanciaactiva y la de los animales sospechosos serealiza mediante estudios histopatológicos,inmunocitoquímicos, con un immuno-blotting o mediante la demostración de lasfibrillas SAF con microscopía electrónica.

Además, la discriminación entre EEB yscrapie es obligatoria desde junio de 2005(Reglamento CE 36/2005). Los procedi-mientos utilizados se basan en test de im-munoblotting, inmunocitoquímica o ELISA.Adicionalmente, ciertas muestras deben so-meterse a pruebas de bioensayo en ra-tones.


159

Finalmente, se lleva cabo un programa degenotipado en ovinos, como ya se ha ci-tado antes, mediante el muestreo y aná-lisis del genotipo del gen PRNP. Este deberealizarse en todos los ovinos afectadosde scrapie y en una muestra de ovinosmayores de 18 meses de edad.

Los últimos datos sobre los resultados delprograma de vigilancia y monitorizaciónde la EEB publicados por la ComisiónEuropea corresponden al año 2010. En loque se refiere al muestreo, se estima quedesde 2001 se han analizado en la UniónEuropea alrededor de 96 millones de va-cunos. La mayoría de los análisis se lle-varon a cabo en la población de animalessacrificados para consumo humano (entorno al 80% de media). Alrededor del5% del total de los análisis de la UE sehan realizado en España.

A la hora de valorar los casos de EEB de-tectados en la UE, hay que tener en cuentaque el programa de vigilancia activa co-menzó a aplicarse en 2001, en concreto apartir del mes de julio de ese año. Existeuna clara diferencia entre el tipo de vigi-lancia aplicado en el Reino Unido y el delresto de la UE. De hecho, la mayoría de loscasos del Reino Unido han sido detectadosa través de la sospecha clínica (vigilanciapasiva), a diferencia de lo ocurrido en losdemás países de la UE, en los que la ma-yoría de casos se han identificado me-diante el sistema de vigilancia activa.

Tras la aparición de los primeros casos deEEB en 1987 en el Reino Unido, donde seregistraron cifras crecientes hasta alcanzarun máximo de casos en 1992, en que sediagnosticaron 37.280 en todo el país, laincidencia de casos anuales comenzó adecrecer progresivamente como conse-

cuencia de la medida adoptada por lasautoridades británicas en junio de 1988,en que deciden prohibir el uso de harinasde carne y hueso de origen rumiante parala elaboración de piensos destinados alconsumo bovino.

En 1989 se describen los primeros casosen la República de Irlanda, en 1990 enPortugal y Suiza, en 1991 en Francia y en1992 en Alemania y Dinamarca. A partirde ese año siguen incorporándose nuevospaíses de dentro y fuera de la UE a la listade países afectados. Como ya se ha indi-cado, el país que ha registrado un númeromás elevado de casos en términos abso-lutos ha sido el Reino Unido. En otrospaíses también se ha producido un nú-mero apreciable de casos, aunque las ci-fras son muy inferiores a las del ReinoUnido: Irlanda, Portugal, Francia, España,Suiza y Alemania. Sin embargo, la ma-yoría de ellos cuentan con los censos debovino de más de 2 años de edad máselevados de la UE.

Desde 2001 se observa una clara ten-dencia a la disminución del número decasos en el conjunto de la UE. La tasa deincidencia anual de casos de EEB (nú-mero de casos autóctonos por millón debovinos de más de 24 meses de edad) enlos países del mundo que han registradocasos ha experimentado amplias varia-ciones, dependiendo de las fechas deaplicación de las medidas de luchacontra la enfermedad y, muy en parti-cular, de la aplicación de la medida clavede prohibir la utilización de las harinasde carne y hueso de origen animal parala alimentación del ganado bovino. Estascifras las facilita la Organización Mundialde la Sanidad Animal (www.oie.int) apartir de la información suministrada por


160

los distintos países. En el Reino Unido, elpaís que ha presentado la epizootía másdestacada, en el que se registraron losprimeros casos de EEB y en el que pri-mero se aplicaron las medidas para re-ducir el número de casos, la tasa de in-cidencia anual de casos comienza adecrecer a partir de 1993, tendencia quese ha mantenido hasta la actualidad. EnEspaña, la tasa de incidencia máxima decasos se produce en 2003 y comienza adisminuir a partir de 2004, en una ten-dencia que se ha mantenido de formacontinuada hasta la actualidad. Portugal,Irlanda, España y Reino Unido son lospaíses de la UE que presentan las preva-lencias más altas.

La prevalencia de la enfermedad (ratio decasos positivos de EEB por 10.000 ani-

males analizados) en los 27 países de laUE se ha ido reduciendo año tras año, in-dependientemente de que el número deanálisis realizados se haya incrementadoo haya permanecido estable. Esa reduc-ción progresiva se ha observado en losprincipales grupos diana de población, esdecir, tanto en animales sacrificados paraconsumo como en los grupos de riesgo.La mayoría de los positivos se detectancada año en los meses de otoño e in-vierno (en verano y primavera el númeroes menor).

Por todo lo comentado, puede afirmarseque en el conjunto de la Unión Europea,y en particular en los 15 países previos ala incorporación de los 12 últimos, aunqueel número de análisis realizado a partir de2001 se ha mantenido estable (figura 5),

Figura 5. Número de análisis realizados anualmente en el periodo 2001-2010 en la UE (EU. DG Health &Consumers).

10.000.000

12.000.000

8.000.000

6.000.000

4.000.000

2.000.000

02008 20092006 20072004 20052001 2002 2003 2010

7.504.7877.528.862

10.051.7359.728.273

10.113.91410.123.880

11.057.72710.996.023

10.425.549

8.487.675


161

es evidente que se ha producido una re-ducción gradual de la incidencia (figura 6)y la prevalencia (figura 7) de la EEB. Otra

conclusión que cabe extraer es que la ca-pacidad de detección precisa de casosestá claramente relacionada con la im-

Figura 6. Evolución del número de casos positivos de EEB en la UE desde 2001 (EU. DG Health & Consumers).

2000

2500

1500

1000

500

02008 20092006 20072004 20052001 2002 2003 2010

4567125175320

561

865

1.376

2.1242.167

Figura 7. Evolución de la prevalencia de casos positivos de EEB en los animales analizados en la UE desde 2001(EU. DG Health & Consumers).

2,50

3,00

2,00

1,50

1,00

0,50

0,002008 20092006 20072004 20052001 2002 2003 2010

2,04

2,55

1,25

0,78

0,55

0,320,18

0,12 0,09 0,06


162

plantación generalizada de la vigilanciaactiva en el año 2001.

Otra cuestión de interés es la distribuciónde los casos de EEB por edades en lospaíses de la UE. De hecho, un fenómenogeneral y claramente apreciable en elconjunto de los 15 países iniciales de laUE es la tendencia a detectar los casosde EEB en animales de edad cada vezmayor y, recíprocamente, la reducciónprogresiva del número de casos de EEBen animales jóvenes (figura 8). Estehecho no es tan claramente observable

en los bovinos de los 12 países de másreciente incorporación a la UE. Esa dis-tribución característica de los casos deEEB se observa también en las dos prin-cipales poblaciones vacunas analizadas(animales sacrificados para consumo yanimales de riesgo) en la UE en el pe-riodo 2001-2008. Todo ello indica sinduda que las medidas adoptadas, y par-ticularmente la prohibición del consumopor los bovinos de piensos elaboradoscon harinas de carne y hueso, han sidorealmente efectivas.

Un dato importante es conocer el gradode cumplimiento de la medida de prohi-bición del uso de harinas de carne yhueso en la fabricación de piensos. Para

ello resulta relevante conocer la distribu-ción de los casos de EEB en la UE segúnel año de nacimiento (figura 9). Deacuerdo con la información proporcio-

Figura 8. Edad media (en meses) de los casos positivos de EEB detectados de la UE en el periodo 2001-2010 enpoblaciones bovinas sacrificadas para consumo (marrón) y de riesgo (azul) (EU. DG Health & Consumers).

160

180

140

120

100

80

602008 20092006 20072004 20052001 2002 2003

Healthy slaughtere Risk animals

2010


163

nada por los Estados miembros de la UE,esta distribución es variable e indica elgrado de uso de harinas de carne yhueso contaminadas de la alimentaciónbovina de cada país y el cumplimiento delas prohibiciones de su utilización.

El Reino Unido y Portugal registraron elmayor porcentaje de casos entre 1993 y1995, aunque Portugal registró otropico de casos en 1996-1997, Francia eIrlanda en 1994-1996, Alemania, Italiay Holanda en 1995-1997, y España en1995-1999. El número de casos de EEBen animales nacidos después de laprohibición definitiva y generalizada deluso de harinas de carne y hueso en laalimentación bovina en 2001 ha sidobajo (35 en 2001, 15 en 2002, 10 en2003, 7 en 2004 y 1 en 2005). Ello in-dica que la medida ha sido efectiva,aunque existen diferencias por paísessegún las distintas fechas de aplicaciónde la prohibición, sobre todo entre losque la aplicaron con anterioridad a 2001y los 12 países que se incorporaron a laUE después de 2001.

Un dato relevante es que, a partir de2006, se han detectado muy pocos ani-males con EEB, y entre ellos, solo dos te-nían menos de 48 meses. Esta es la razónpor la que se ha decidido elevar la edadlímite de análisis a los 4 o 6 años. Otrodato importante es que solo tres animalestenían menos de 30 meses; dos de ellosse detectaron en 2001 y uno en 2007.

Los primeros casos de EEB en Españafueron diagnosticados a finales de 2000 enel Centro Nacional de Referencia de las EETde Zaragoza en dos vacas de Galicia, me-diante el sistema de vigilancia pasiva. Unade ellas, confirmada el 22 de noviembre de2000, procedía del municipio de Carballedo(Lugo), había nacido el 30 de mayo de1995 y era de raza cruzada. La segunda,confirmada en diciembre del mismo año yprocedente del municipio de Coristanco (ACoruña), había nacido en septiembre de1995 y era de raza Fleckwich (164). A prin-cipios de 2001, en consonancia con lo es-tablecido por la legislación europea, se in-troduce en España el sistema de vigilanciaactiva (RD 3454/2000). A partir de ese año

Figura 9. Distribución de los casos de EEB detectados en el periodo 2001 a 2010 por año de nacimiento en ochopaíses de la UE (EU. DG Health & Consumers).

900

1000

800

700

600

500

400

300

200

100

0

<19

90

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

Irlanda Reino Unido

140

160

120

100

80

60

40

20

0

<19

90

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2004

Francia Alemania España Italia Holanda Portugal


164

Figura 10. Distribución anual de los focos de EEB detectados en España en el periodo 2001 a 2010 (Ministeriode Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).

200

150

100

50

02008 20092006 20072004 200520012000 2002 2003 2010

13182539

68

98

137

167

127

82

2

N.º focos/año

Figura 11. Distribución anual de los test realizados para la detección de la EEB en el periodo 2001 a 2010 (Ministeriode Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).

700.000

600.000

500.000

400.000

300.000

200.000

100.000

02009 20102007 20082005 200620022001 2003 2004

386.588

546.056 567.366 578.125621.818

539.856

466.833524.543

468.168424.943

Número de test

y en los siguientes, comenzaron a detec-tarse nuevos casos en todas las comuni-dades autónomas, aunque con especial fre-cuencia en algunas de ellas. Los datos delas analíticas realizadas a partir de ese añoy sus resultados constan en los informesepidemiológicos anuales sobre las EET enEspaña publicados por la Dirección General

de Sanidad de la Producción Agraria delMinisterio del Agricultura, Alimentación yMedio Ambiente (www.eeb.es), y en los fa-cilitados periódicamente a la CE y la OIE.

El número de focos de EEB detectados enEspaña desde el año 2000 hasta finalesde 2011 ha sido de 783. El número mayorse registró en el año 2003 (figura 10).

El número de análisis realizados desde2001 hasta la actualidad se ha mante-

nido relativamente constante (figura11).


165

En relación con la distribución geográ-fica de los focos de EEB en España, lamayoría de casos se concentran funda-mentalmente en la mitad noroccidentaldel país, coincidiendo con el área demayor densidad de vacuno de más de 2años de edad (Galicia, Castilla y León,Asturias, Cataluña, Cantabria, Balearesy Extremadura) (figura 13). Galicia yCastilla y León han reunido cerca de losdos tercios de los casos registrados enEspaña. Se han observado algunas con-centraciones de casos en ciertas co-marcas o zonas concretas, como el occi-dente de A Coruña, la Tierra Llana deLugo, el occidente de Asturias, el nortede Navarra y Cataluña, Menorca y a lolargo de la carretera nacional 630. Al

principio la mayoría de los casos se de-tectaban en vacas más jóvenes (media de6,4-6,8 en 2001-2003), para progresiva-mente detectarse en animales mayores(media de 9,1 y 10,25 en 2007 y 2008),de forma similar a lo ocurrido en otrospaíses de la UE. En lo que respecta a laraza y tipo de producción, la gran ma-yoría de los casos de EEB se han regis-trado en vacunos de leche, en concretode raza frisona y en animales mestizos.Y en cuanto a la incidencia en las dis-tintas poblaciones de riesgo, al inicio sedetectó un número importante en ani-males sacrificados para el consumo hu-mano en el matadero, y gradualmentese han diagnosticado mayoritariamenteen la población de animales de riesgo.

Como se hizo referencia con anterio-ridad, los animales afectados de EEB en

España habían nacido mayoritariamenteentre los años 1995 y 1999 (figura 12).

Figura 12. Distribución anual de los casos de EEB detectados en España y su relación con los años de nacimientoen el periodo 2001 a 2010 (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995

Nacimiento casos Casos detectados

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


166

Respecto al programa de vigilancia delscrapie, se establece no tanto por elriesgo para la seguridad alimentaria quepodía suponer el agente del scrapie, yaque hasta ahora no ha sido demostrado,sino por la sospecha de la posible trans-misión del agente de la EEB al ganadoovino y caprino, a través del consumo dealimentos elaborados con harinas decarne y hueso contaminadas. De hecho,se sabe que los ovinos y caprinos son re-ceptivos al agente bovino, lo que ha sidodemostrado experimentalmente. El sis-tema de vigilancia llevado a cabo en la UEen el caso del scrapie ovino y caprino hasido muy similar al utilizado para la vigi-lancia de la EEB. Las diferencias esencialesson que, en este caso, el programa de vi-

gilancia activa se implantó en 2002, y queno es obligatorio para toda la poblaciónovina y caprina, sino para una muestra re-presentativa de ella (distintas razas, sis-temas de producción, estaciones delaño...). Los métodos de análisis son simi-lares a los utilizados para el ganado va-cuno. La cifra de animales analizados enla UE se incrementó sustancialmente aconsecuencia de la introducción de la vi-gilancia activa en 2002, ya que con ante-rioridad el sistema mayoritario de análisisera la vigilancia pasiva. La población dianaen la que se ha llevado a cabo el mayornúmero de análisis ha sido la de los ani-males sacrificados para consumo hu-mano. El número de muestras analizadasse reduce significativamente en 2008,

Figura 13. Distribución provincial de los focos de EEB detectados en España en el periodo 2001 a 2011 (Ministeriode Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).


167

como consecuencia de la introducción enjulio de 2007 del Reglamento (EC)727/2007, que enmienda los programasde monitorización de las EET en los pe-queños rumiantes.

La incidencia y prevalencia de casos descrapie ha sido superior en el ovino que enel caprino. Se han detectado casos en la

mayoría de los países de la UE, aunque seha registrado un mayor número de casospor 10.000 ovinos analizados en los ani-males sacrificados para consumo humanoen Chipre, Eslovenia, Grecia, Eslovaquia yHolanda (figura 14). En la población de ani-males de riesgo, los países con cifras máselevadas fueron Chipre, Grecia, Rumania,Italia y Reino Unido (figura 15).

Figura 14. Prevalencia de casos de scrapie en ovinos sacrificados para consumo en los países miembros de la UEen el periodo 2002-2010 (EU. DG Health & Consumers).

BE1

10

100

1.000

BG CZ DK DE EE EL ES FR iE IT CY LV LT LU HU MT NL AT PL PT RO SI SK FI SE UK NO

3,4

9,8

3,7

1,0

16,0

32,5

5,69,0

0,0

10,5

0,00,00,0 0,0

5,9

382,3

6,6

2,1

6,25,6

24,2

0,0

3,21,8

7,2

0,9

2,7

Figura 15. Prevalencia de casos de scrapie en animales de riesgo en los países miembros de la UE en el periodo2002-2010 (EU. DG Health & Consumers).

BE1

10

100

1.000

10.000

BG CZ DK DE EE EL ES FR iE IT CY LV LT LU HU MT NL AT PL PT RO SI SK FI SE UK NO

10,5

26,8

4,1

8,0

19,219,1

64,5

13,0

3,7

0,0

12,8

0,00,00,0 0,0

5,2

1.190,4

39,921,8

10,919,1

187,2

3,15,2

1,5

6,6

1,5

7,7


168

La prevalencia de esta enfermedad en lasdos principales poblaciones diana (ani-males sacrificados para consumo y ani-males de riesgo) fue significativamentesuperior en los animales de riesgo que en

los destinados a consumo humano.Respecto a la edad de presentación de loscasos, la mayoría de los diagnosticados enel periodo 2000-2008 tenían entre 18 y60 meses (figura 16).

Figura 16. Evolución de la distribución de la edad de los casos de scrapie en la UE y Noruega en el periodo 2002-2010 (EU. DG Health & Consumers).

35%

30%

25%

20%

15%

10%

5%

0%< 12 12-23 24-35 36-47 48-59 60-71 72-83 84-95 > 95

2002 2004 20062003 2005 2007 2008 2009 2010

Figura 17. Comparación de las edades medias de aparición de casos de scrapie clásico y atípico en la UE en el pe-riodo 2002-2010 (EU. DG Health & Consumers)

30%

25%

20%

15%

10%

5%

0%< 12 12-23 24-35 36-47 48-59 60-71 72-83 84-95 > 95

OthersAtypica


169

Se han detectado casos de scrapie atípicoen varios países miembros de la UE, lle-gando a representar en algunos de ellos unnúmero importante respecto al total decasos. En cuanto a la edad de presentación,los casos de scrapie atípico se diagnosti-caron en animales de mayor edad (figura17). Tras aplicar los test discriminatorios,que permiten diferenciar el agente de laEEB del agente del scrapie en los pequeñosrumiantes en los casos en que se ha diag-nosticado una EET, en 2008 no se detectóninguno positivo, aunque hubo 10 ani-males que ofrecieron resultados no conclu-yentes (nueve ovinos y un caprino).

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Normativa reguladora

EuropeaReglamento (CE) n.º 999/2001 del ParlamentoEuropeo y del Consejo, de 22 de mayo de2001, por el que se establecen disposicionespara la prevención, el control y la erradicaciónde determinadas encefalopatías espongi-formes transmisibles.

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Reglamento (CE) n.º 36/2005 de la Comisión,de 12 de enero de 2005, por el que se modi-fican los anexos III y X del Reglamento (CE) n.º999/2001 del Parlamento Europeo y delConsejo, por lo que se refiere a la vigilanciaepidemiológica de las encefalopatías espongi-formes transmisibles en animales bovinos,ovinos y caprinos.

Reglamento (CE) n.º 727/2007 de la Comisión,de 26 de junio de 2007, por el que se modi-fican los anexos I, III, VII y X del Reglamento(CE) n.º 999/2001 del Parlamento Europeo ydel Consejo, por el que se establecen disposi-ciones para la prevención, el control y la erra-dicación de determinadas encefalopatías es-pongiformes transmisibles.

NacionalReal Decreto 3454/2000, de 22 de di-ciembre, por el que se establece y regula elPrograma Integral coordinado de vigilanciay control de las encefalopatías espongi-formes transmisibles de los animales (y susposteriores modificaciones).

Real Decreto 1911/2000, de 24 de noviembre,por el que se regula la destrucción de los ma-teriales especificados de riesgo en relación conlas encefalopatías espongiformes transmisibles(y sus posteriores modificaciones).


177

Antibióticos β-lactámicosLos antibióticos son compuestos de bajopeso molecular producidos por microor-ganismos y que a bajas concentracionesson capaces de inhibir selectivamente elcrecimiento de otros microorganismos(acción bacteriostática) o provocarles lamuerte (acción bactericida). Pertenecen algrupo de agentes quimioterapéuticos enel que se engloban antivirales, antifún-gicos y antiparásitos (Davies, 1990). Estoscompuestos son considerados metabo-litos secundarios, puesto que no son ne-cesarios para el crecimiento, desarrollo oreproducción de los microorganismos quelos producen. Su función biológica es con-trovertida y se atribuye a que su produc-ción confiere una ventaja frente a otrosmicroorganismos en la competencia porlos nutrientes (Martín y Demain, 1980).

Los antibióticos β-lactámicos son antibió-ticos de naturaleza peptídica que seforman mediante síntesis no ribosomal detres aminoácidos: L-valina, L-cisteína yácido L-α-aminoadípico. Su estructura quí-mica da nombre al grupo y se basa en unanillo β-lactámico de 4 átomos(3 átomos de carbono y 1 átomo de nitró-geno). Con la excepción de las mono-bactamas y nocardicinas, que solo pre-sentan el anillo β-lactámico, estosantibióticos están formados por un sistemabicíclico, siendo la estructura de este se-gundo anillo la que permite su clasifica-

ción. Adicionalmente, este tipo de antibió-ticos posee cadenas laterales que le con-fieren carácter hidrofóbico o hidrofílico.

Los antibióticos β-lactámicos se clasificanen cinco grandes grupos (O´Sullivan y Sykes,1986; Kycers y col., 1997; Asbel y Levison,2000; Petri y col., 2001; Chambers y col.,2005) (figura 1):

• Penicilinas: son producidas por hongosfilamentosos y se caracterizan porqueposeen el núcleo penam en su estruc-tura química.

• Cefalosporinas: en su estructura quí-mica poseen el núcleo ceph-3-em y sonsintetizadas tanto por hongos filamen-tosos como por bacterias Gram posi-tivas y Gram negativas.

• Clavamas: producidas por especies del ac-tinomiceto Gram positivo Streptomyces;poseen en su estructura química el núcleoclavam.

• Carbapenemas: en su estructura quí-mica poseen el núcleo carbapenema,estando producidas tanto por bacteriasGram positivas como Gram negativas.

• Monolactamas: son producidas por bac-terias Gram positivas y Gram negativas;agrupa las nocardicinas y las monobac-tamas.

Los antibióticos β-lactámicos actúan comoagentes bactericidas al inhibir la biosín-tesis del peptidoglicano de la pared ce-lular bacteriana durante la división celular.

Biotecnología de la producción deantibióticos beta-lactámicosDr. Ricardo Vicente Ullán


180

Su mecanismo de acción consiste en launión covalente a las proteínas PBP (pe-nicillin binding proteins) dada su similitudestructural con su sustrato natural acil-D-alanina-D-alanina. Las enzimas PBPquedan bloqueadas de manera irrever-sible y no pueden catalizar la unión de lasmoléculas de peptidoglicano en la reac-ción de entrecruzamiento en la últimaetapa de la síntesis de la pared celular. Elresultado, tras la acción de los antibióticosβ-lactámicos, es una pared celular defec-tuosa que finalmente se degrada porcompleto tras la activación de hidrolasasy autolisinas endógenas (Kong y col.,2010).

Estructura química depenicilinas y cefalosporinas

Las penicilinas son antibióticos β-lactámicosque contienen el núcleo penam como es-tructura química esencial. Su estructura tri-dimensional fue determinada en el año1945 por Dorothy Crowfoot Hodgkin, apli-cando la difracción por rayos X (Hodgkin,1949). El núcleo penam o anillo 6-amino-penicilánico consiste en un anillo tiazolidí-nico unido a un anillo β-lactámico. Ademásdel núcleo penam, anclado a su grupoamino poseen una cadena lateral, consis-tente en diferentes derivados del grupoacilo en función del tipo de penicilina (fi-

Figura 1. Clasificación de los antibióticos β-lactámicos según su estructura química.


filamentosos Gram+ Gram–

Penicilinas P. chysogenumP. notatumE. nidulans

Cefalosporinas A. chysogenumCefamicinas P. persinicus Flavobacterium sp.Cefabacinas K. tethys S. clavuligerus L. lactamgenusCitinovorinas A. lactamdurans

Ácido S. clavuligerusclavulánico

Tienamicinas S. clavuligerus E. carotovoraÁcidos olivánicos S. olivaceus Serratia sp.Epitienamicinas

Nocardicinas N. uniformisSubsp.

Tsuyamanensis

Monobactamas A. radiobacterP. acidophila

RO

O

S

COOH

CH3

CH3

NH

N

R R

OO

S

COOH

CH2R

NH

N

Penam

Ceph-3-em

R

RO

O

HN

HClavam

COOH

RR

O

HN

HCarbapenem

R R

O

H

N

N

SO3H

COOH

R

O

H

H

N

N OH

O

O

Monolactam

Biotecnología de la producción de antibióticos beta-lactámicos

181

gura 2A). La formación del anillo β-lactá-mico es previa a la formación del anillo tia-zolidínico en el proceso de síntesis del nú-cleo penam (Cooper, 1993; Burzlaff y col.,1999). El anillo tiazolidínico y la cadena la-teral, conjuntamente, son responsables delas propiedades farmacológicas, el espectroantibacteriano, la susceptibilidad a β-lacta-masas y la potencia antibiótica de cada tipode penicilina, mientras el anillo β-lactámicoes el responsable de la acción antibacte-riana. Las penicilinas hidrofóbicas son ex-clusivamente sintetizadas por algunas es-pecies del género Penicillium y Emericellanidulans (Aspergillus nidulans).

Las cefalosporinas contienen el núcleoceph-3-em (cefen) que está constituidopor el anillo β-lactámico y un anillo dihi-drotiazínico (figura 2B) diferente al sis-tema de anillos β-lactámico-tiazolidínico

de las penicilinas (Abraham y Newton,1961; Loder y col., 1961; Hodgkin yMaslen, 1961). La cefalosporina posee ca-racterísticas hidrofílicas debidas a la ca-dena lateral de D-α-aminoadípico queaparece unida al anillo β-lactámico en elgrupo amino del carbono 7 (figura 2B).

Las cefalosporinas son sintetizadas por loshongos Acremonium chrysogenum(Cephalosporium acremonium), Paecilo-myces persicinus y Kallichroma tethys,junto con las bacterias Gram positivasStreptomyces clavuligerus y Amycola-topsis lactamdurans (Nocardia lactamdu-rans), que sintetizan también cefamicinas,además de bacterias Gram negativas,como Lysobacter lactamgenus y Flabo-bacterium sp. (además sintetizan cefaba-cinas) (Brakhage y col., 2009; Martín ycol., 2010).

Ruta biosintética de losantibióticos penicilina ycefalosporina C en hongosfilamentososLa biosíntesis de penicilina y cefalosporina(figura 3), tanto en bacterias como en

hongos filamentosos (Brakhage y col.,

2009; Martín y col., 2010), comienza con

la condensación no ribosómica de tres pre-

cursores aminoacídicos: ácido L-α-aminoa-

dípico, L-cisteína y L-valina para formar el

tripéptido δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-

Figura 2. Penicilinas y cefalosporinas (A) Estructura química de las penicilinas donde se muestran los anillosβ-lactámico y tiazolidínico característicos del núcleo penam. (B) Estructura química de las cefalosporinas formadapor los anillos β-lactámico y dihidrotiazínico correspondientes al núcleo cefen junto con la cadena lateral hidro-fílica D-α-aminoadípico.

R N

NO

OS

COOH

H

Anillo tiazolidínico


H

D R1N

NO

OS

COOH

COOHCH2R2

H2NH

Anillo dihidrotiazínico


A B


182

valina (LLD-ACV) (Aharonowitz y col., 1992;Martín, 2000). Esta reacción la cataliza laACV sintetasa (codificada por el genpcbAB) (Díez y col., 1990; Gutiérrez y col.,1991; MacCabe y col., 1991).

El siguiente paso en la ruta biosintética con-siste en la ciclación del tripéptido paraformar isopenicilina N (IPN), que es el primerintermediario de la ruta con actividad anti-biótica. Esta reacción está catalizada por laIPN sintasa (codificada por el gen pcbC)(Samson y col., 1985; Carr y col., 1986;Ramón y col., 1987; Barredo y col., 1989a).

Estas dos primeras reacciones enzimáticasson comunes en todos los procesos biosin-téticos de antibióticos β-lactámicos. A partirde aquí la ruta puede dirigirse hacia la bio-síntesis de penicilinas hidrofóbicas, comoocurre en Penicillium y E. nidulans con laproducción de las penicilinas G y V, o bienhacia la biosíntesis de cefalosporina C en elcaso de Acremonium chrysogenum,Paecilomyces persicinus y Kallichromatethys.

Los hongos filamentosos P. chrysogenum yE. nidulans sintetizan penicilina G (benzil-penicilina) y penicilina V (fenoximetilpenici-lina) por la sustitución de la cadena lateraldel L-α-aminoadipil de la IPN por cadenaslaterales no polares, como son el ácido fe-nilacético o fenoxiacético, respectivamente.El proceso tiene lugar en dos pasos catali-zados por dos actividades enzimáticas co-dificadas por el gen penDE (Barredo y col.,1989b; Montenegro y col., 1990). En unprimer paso la cadena lateral de L-α-ami-noadípico de la IPN se elimina formando elácido 6-aminopenicilánico (6-APA) en unareacción catalizada por la actividad isope-nicilinil N amidohidrolasa. Posteriormente,al 6-APA se le incorpora una cadena lateral

hidrofóbica de un ácido aromático previa-mente activado como CoA por una aril-CoA ligasa (Gledhill y col., 1997; Lamas-Maceiras y col., 2006; Wang y col., 2007;Yu y col., 2011). En el caso de la penicilinaG (PenG), el ácido fenilacético es activadocomo fenilacetilcoenzima A en una reac-ción catalizada por la actividad acil-CoA: 6-APA aciltransferasa (Álvarez y col., 1993).El ácido fenoxiacético es el que se incorporaal 6-APA para formar la penicilina V (PenV).

En P. chrysogenum el gen penDE posee unmarco de lectura abierto que codifica unaproteína de 39,94 kDa y, al igual que enE. nidulans, posee tres intrones en la mitadfinal del gen (Barredo y col., 1989b;Montenegro y col., 1990; Tobin y col.,1990). La conversión de IPN a PenG está ca-talizada por una única enzima (isopenicilinaN aciltransferasa) con dos subunidades(Whiteman y col., 1990) que se sintetizacomo una preproteína de 40 kDa, sufriendoposteriormente un procesamiento postra-duccional (Tobin y col., 1990).

El primer paso específico de la ruta queconduce hacia la biosíntesis de cefalospo-rina C (CPC) implica la epimerización de lacadena lateral del ácido L-α-aminoadípicoa D-α-aminoadípico, formándose penicilinaN (PenN), que es el precursor común atodas las cefalosporinas. Esta reacción estácatalizada por una IPN epimerasa(Kovacevic y col., 1990; Coque y col., 1993)en el caso de bacterias, y por un sistema deal menos dos enzimas en A. chrysogenum.Dichas enzimas son una isopenicilinil N-CoAsintetasa (codificada por el gen cefD1) yuna isopenicilinil N-CoA epimerasa (codifi-cada por el gen cefD2), pudiendo existiruna tioesterasa, probablemente inespecí-fica, que libera la PenN del CoA (Ullán ycol., 2002a).


183

Figura 3. Estructura química y ruta biosintética de los antibióticos penicilina G y cefalosporina C.

L-α-aminoadípico(L-α-AAA)

L-cisteína L-valina

ACV sintetasa

COOHCOOH

H2N

COOH

SHH2N

COOH

H2N

pcbAB

Isopenicilina N sintetasa(Ciclasa)

pcbC

COOH

COOH OO

NH

SH

NH

H2N

δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina(LLD-ACV)

COOHCOOH O

O

NH

S

N

H2N L

H

Isopenicilina N

Fenilacetil-CoA

Isopenicilina N-CoA sintetasaIsopenicilina N-CoA epimerasa

cefD1cefD2

Isopenicilina Naciltransferasa

COOHCOOH O

O

NH

S

N

H2N D

H

Penicilina N

cefEF Desacetoxicefalosporina Csintetasa (expandasa)

cefEF Desacetoxicefalosporina Csintetasa (hidroxilasa)

cefG Desacetilcefalosporina Cacetiltransferasa

COOH

COOH OO

NH

S

N

H2N D

H

Desacetoxicefalosporina C(DAOC)

COOH

COOH OO

NH

S

N

H2N D

H OH

COOH

COOH OO

NH

S

N

H2N D

H OCOCH3

Desacetilcefalosporina C(DAC)

Acetil-CoA

CoA

Cefalosporina C(CPC)

Penicilina G(PenG)

COOH

OO

NH

S

N

Fenilacetil-CoA

CoA

CoAL-α-AAA

L-α-AAA

H2O

penDE

6-APA


184

A continuación la PenN es convertida endesacetoxicefalosporina C (DAOC) en unareacción catalizada por una DAOC sintetasa(conocida como expandasa). Mediante estareacción, el anillo tiazolidínico de la PenNsufre una expansión para originar el anillodihidrotiazínico (que poseen todas las cefa-losporinas) y el núcleo ceph-3-em (Kupka ycol., 1983; Dotzlaf y Yeh, 1987).

En el siguiente paso, el grupo metilo delcarbono 3 de DAOC es hidroxilado y pos-teriormente oxidado para originar desa-cetilcefalosporina C (DAC). Dicha reacciónestá catalizada por una DAC sintetasa (hi-droxilasa).

En bacterias, estas reacciones sucesivas dehidroxilación y oxidación están catalizadaspor dos enzimas diferentes (Jensen y col.,1985), mientras que en A. chrysogenumambas están catalizadas por una única en-zima bifuncional, denominada DAOC sin-tetasa (expandasa)/DAC sintetasa (hidroxi-lasa), codificada por el gen cefEF (Samsony col., 1987).

El último paso para la formación de CPCen A. chrysogenum conlleva la acetilaciónde la cadena lateral de DAC, procediendoel grupo acetilo que se transfiere delacetil-CoA. Esta reacción está catalizadapor la acetil-CoA: DAC acetiltransferasa,una enzima de 49 kDa codificada por elgen cefG (Gutiérrez y col., 1992; Matsuday col., 1992; Mathison y col., 1993).

Organización de los genes debiosíntesis de penicilina ycefalosporina C en hongosfilamentososEn los hongos filamentosos E. nidulans yP. chrysogenum, los tres genes implicados

en la biosíntesis de penicilinas (pcbAB,pcbC y penDE) forman parte de una agru-pación génica (cluster) situada en el cro-mosoma VI y en el cromosoma I, respec-tivamente (figura 4A) (Fierro y col., 1993;Montenegro y col., 1990). En el caso deP. chrysogenum, el cluster se localiza enel centro de una región de ADN de 120 kb,que aparece amplificada en tándem en lascepas industriales (Fierro y col., 2006; Vanden Berg y col., 2007). Las repeticionesaparecen separadas entre sí por un hexa-nucleótido altamente conservado, cuyasecuencia es TGTAAA/T (Barredo y col.,1989c; Fierro y col., 1995, 2006; Newberty col., 1997).

En A. chrysogenum, los genes de biosín-tesis de CPC están disponibles en unasola copia en el genoma y se organizanen dos clusters: el temprano y el tardío(figura 4B). El cluster temprano agrupaa los genes pcbAB y pcbC, los cuales setranscriben en sentido opuesto (Skatrudy col., 1989; Skatrud, 1992). A continua-ción del gen pcbC (corriente abajo) seencuentran los genes cefD1 y cefD2 bajoel control de un único promotor bidirec-cional (Ullán y col., 2002a). Este clusterse encuentra localizado en el cromosomaVII (4,6 Mb) en A. chrysogenum C10(Gutiérrez y col., 1999) y en el cromo-soma VI en la cepa 394-4 (Skatrud yQueener, 1989).

Por otro lado, los genes cefEF y cefG, quese transcriben de manera divergente apartir de un único promotor bidireccional,se encuentran agrupados en el clustertardío localizado en el cromosoma I(2,2 Mb) en A. chrysogenum C10 (ATCC48272) (Gutiérrez y col., 1999) y en el IIen el caso de A. chrysogenum 394-4(Skatrud y Queener, 1989).


185

En A. chrysogenum, el cluster tempranose encuentra en el cromosoma VI y eltardío en el cromosoma II. Sin embargo,en las cepas de alta producción, comoATCC 48272, la localización cromosómicade estos clusters es diferente (Smith y col.,1991), indicando que durante la mejorade las mismas han ocurrido reordena-mientos significativos en los cromosomas(Gutiérrez y col., 1999).

Compartimentación de lasrutas de biosíntesis depenicilina y cefalosporina C

Los pasos específicos de la ruta biosintéticade penicilinas en P. chrysogenum estáncompartimentados dentro de las célulasfúngicas, transcurriendo en el citosol y en

los peroxisomas (revisiones de Van deKamp y col., 1999; Evers y col., 2004). Así,la condensación no ribosómica de los ami-noácidos L-cisteína, L-valina y L-α-amino-adípico, catalizada por la ACV sintetasa, esuna reacción citosólica (Van der Lende ycol., 2002). Igualmente está descrita comocitosólica la reacción de ciclación de LLD-ACV en IPN catalizada por la IPN sintasa(Ramos y col., 1985; Müller y col., 1991).Finalmente, el reemplazamiento de la ca-dena lateral de L-α-aminoadípico de la IPNpor una cadena hidrofóbica es una reac-ción que transcurre en el interior de los pe-roxisomas. Este reemplazamiento com-prende tanto la activación de la cadenahidrofóbica (Gledhill y col., 1997; Lamas-Maceiras y col., 2006; Wang y col., 2007;Yu y col., 2011) como la incorporación de

Figura 4. (A) Organización cromosómica de los genes de biosíntesis de penicilina en P. chrysogenum y E. nidu-lans. (B) Organización cromosómica de los genes de biosíntesis, de cefalosporina C en A. chrysogenum. En elcluster temprano se muestra la localización de los genes de secreción cefT, cefM y cefP junto con la del gen re-gulador cefR (ver más adelante).

Emericella nidulans

pcbAB pcbC penDE

Acremonium chrysogenum

cefR

cluster temprano

cefP cefT ORF3

cefEF

cluster tardío

cefG

pcbAB pcbC cefD2 cefD1 cefM

Penicillium chrysogenum

pcbAB pcbC penDE

A

B


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dicha cadena (Müller y col., 1991, 1992,1995) en el 6-APA procedente de la elimi-nación de la cadena lateral de IPN. Otrodato que avala la localización de estas en-zimas en peroxisomas es que la sobreex-presión de la peroxina Pc-Pex11p (proteínaimplicada en la biogénesis de peroxisomasen P. chrysogenum) duplica la producciónde PenG (Kiel y col., 2005). Estos autoresrelacionan dicho incremento de la produc-ción con el aumento en el número de pe-roxisomas presentes en la célula fúngica.En resumen, la ruta biosintética de penici-linas transcurre entre dos compartimentos:el citosol y los peroxisomas.

En el caso de A. chrysogenum se presu-ponía que todas las enzimas están locali-zadas en el citosol a pesar de no haberserealizado estudios directos sobre este tema(Van de Kamp y col., 1999; Evers y col.,2004). Esta localización citosólica no teníaaún en cuenta el descubrimiento de losgenes cefD1 y cefD2 responsables de laepimerización de IPN en PenN (Ullán y col.,2002a). El análisis bioinformático de las se-cuencias de las proteínas CefD1 y CefD2muestran señales PTS de localización enperoxisomas (Reumann, 2004); en con-creto, señales PTS-1 (Secuencia consenso:S/C/A-K/R/H-L) y PTS-2 [Secuencia con-senso: (R/L)(L/V/I)-X5-(H/Q)(L/A)] paraCefD2 y señal PTS-1 para CefD1 (Teijeira ycol., 2009; Martín y col., 2010; Ullán y col.,2010). De tal forma que si dicha epimeri-zación transcurre en los peroxisomas, se re-quiere un transporte tanto del sustrato(IPN) como del producto (PenN) a través dela membrana peroxisomal en el cual esta-rían implicadas proteínas transportadorasde membrana. En el cluster temprano debiosíntesis de CPC (figura 4B) se encuen-tran dos genes denominados cefP (Ullán y

col., 2010) y cefM (Teijeira y col., 2009),que codifican dos proteínas de membrana.El análisis de las proteínas CefM y CefP me-diante herramientas bioinformáticas revelala presencia de dominios Pex19p en ambasproteínas. Este dominio es característico deproteínas de membrana peroxisomal declase I que son reconocidas por la peroxinaPex19p para ser internalizadas en dichamembrana (Rottensteiner y col., 2004;Matsuzono y col., 2006).

El gen cefM está localizado corriente abajodel gen cefD1 (figura 4B) y codifica unaproteína de 482 aminoácidos (con un pesomolecular deducido de 52,2 kDa) formadapor 12 segmentos transmembrana (TMS) ycon los motivos conservados A, B, C, D2 yG característicos del grupo de proteínastransportadoras de la superfamilia MFS(Major Facilitator Superfamily). La presenciade estos motivos y los 12 segmentos trans-membrana en la proteína CefM la incluyendentro de la familia 3. Dichas proteínas ac-túan mediante un mecanismo de antiporteprotón motriz. La interrupción del gen cefMcausa un acúmulo intracelular de PenNjunto con una drástica reducción en la pro-ducción tanto de CPC como de PenN(Teijeira y col., 2009).

En el mismo cluster temprano de cefalos-porinas está localizado el gen cefP(figura 4B), el cual codifica una proteínacon 11 dominios transmembrana consti-tuida por 866 aminoácidos y con un pesomolecular deducido de 99,2 kDa. Lostransformantes interrumpidos en cefP sonincapaces de sintetizar cefalosporinas deforma eficiente y acumulan IPN en loscaldos de cultivo, lo cual indica que laconversión de IPN en PenN está blo-queada (Ullán y col., 2010).


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Estudios de microscopía confocal de fluo-rescencia muestran que ambas proteínasestán localizadas en la membrana peroxi-somal (Teijeira y col., 2009; Ullán y col.,2010). Estos resultados en su conjunto in-dican que la ruta biosintética de CPC en A.chrysogenum está compartimentada ytranscurre entre el citosol y los peroxisomas.Según esta hipótesis (figura 5), la proteínaCefP importa IPN desde el citosol a la ma-triz peroxisomal para su conversión en PenNmediante la acción combinada de las pro-teínas CefD1 y CefD2. Posteriormente, elintermediario PenN es transportado desdeel lumen peroxisomal al citosol mediante laproteína CefM para su conversión en DACy CPC, reacciones catalizadas por las en-zimas expandasa/hidroxilasa y DAC-acetil-transferasa, respectivamente.

El gen cefT está localizado en el clustertemprano de genes de biosíntesis de cefa-losporina (figura 4B) y codifica una pro-teína de 561 aminoácidos con un pesomolecular deducido de 61,3 kDa (Ullán ycol., 2002b). La proteína CefT pertenece ala familia de transportadores de drogas(MDR), y en concreto a la familia MFS(Major Facilitator Superfamily). Dicha pro-teína tiene 12 segmentos transmembranay contiene los motivos A, B, C, D2 y G ca-racterísticos de la familia 3 (transportadoresantiporter droga H+) dentro de la superfa-milia MFS (la misma que la proteína CefM).La sobreexpresión del gen cefT incrementahasta el 100% la secreción de cefalospo-rinas; sin embargo, su interrupción no blo-quea la producción de dicho antibiótico.Además, la expresión heteróloga del gencefT en P. chrysogenum indica que la pro-teína CefT está implicada en la secreciónde β-lactamas hidrofílicas (que contienenla cadena lateral de ácido α-aminoadípico)

(Ullán y col., 2008) y que está localizada enla membrana plasmática (Nijland y col.,2008). Adicionalmente, en el cluster tem-prano, corriente arriba del gen pcbAB, seencuentra la ORF3 (figura 4B), que codificauna D-hidroxiácido deshidrogenasa de fun-ción desconocida (Ullán y col., 2002b).

En cuanto a la regulación de la secreciónde los intermediarios y del producto finalde la ruta biosintética de CPC en el clustertemprano corriente arriba del gen cefP seencuentra el gen CefR (figura 4B), que co-difica una proteína reguladora con un do-minio fungal-trans (dominio característicode múltiples reguladores fúngicos). Lainactivación dirigida del gen cefR dismi-nuye y retrasa la producción de cefalos-porinas e incrementa la secreción dePenN. Por otro lado, la sobreexpresión delgen cefR disminuye la secreción de PenN,evitando la pérdida de este intermediarioy por tanto incrementando la producciónde CPC. El análisis transcripcional de losgenes biosintéticos y de los transporta-dores de la ruta biosintética de CPC en lostransformantes interrumpido y sobreex-presado en cefR reveló que la proteínaCefR actúa como un represor de los genescefT y cefM (figura 5), evitando así la pér-dida de intermediarios (IPN, PenN y DAC)y favoreciendo la síntesis de CPC (pro-ducto final). Así, mientras la interrupcióndel gen cefR provoca un incremento de laexpresión de los genes cefM y cefT (pro-voca pérdida de intermediarios), su sobre-expresión la disminuye (retiene los inter-mediarios e incrementa la producción delproducto final CPC). La proteína CefRconstituye el primer ejemplo de un mo-dulador de transportadores de β-lactamasen hongos filamentosos (Teijeira y col.,2011).


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Biotecnología en laproducción de penicilinas

Historia del descubrimientode la penicilina

En 1928, Fleming aisló la primera cepaproductora de penicilina (Fleming, 1929)conocida como Penicillium notatumNRRL-1249 (Clutterbuck y col., 1932).Posteriormente, en 1938, Howard WalterFlorey (médico patólogo), Ernst BorisChain (bioquímico) y Norman Heatley(bioquímico) iniciaron una investigacióndetallada de las propiedades terapéuticasde la penicilina. De esta forma, mientrasFlorey se ocupaba de los aspectos bioló-gicos y farmacológicos, Chain se encargóde evaluar las propiedades químicas y bio-

químicas. Por otro lado, Heatley se ocupóde los aspectos relacionados con la pro-ducción del antibiótico estudiando laforma de cultivar la mayor cantidad po-sible del hongo y cómo recuperar el prin-cipio activo del caldo. Como resultado deestos trabajos se establecieron las basespara la producción de la penicilina y suuso tal y como lo conocemos actualmente(Chain y col., 1940).

Posteriormente, en 1943, en un mercadode la localidad de Peoria en Illinois(EE.UU.) y a partir de un melón canta-loupe de aspecto mohoso, se aisló unanueva cepa conocida como Penicilliumchrysogenum NRRL-1951 (ATCC 9480).En dicha cepa, la capacidad productoraestaba mejorada con respecto a la ante-

Figura 5. Modelo propuesto para la compartimentación de la ruta biosintética de cefalosporina C en A. chryso-genum. Se muestra la localización de los transportadores CefT, CefM y CefP. CefR actúa como un represor de laexpresión de los genes cefM y cefT. L-α-AAA, ácido L-α-aminoadípico; L-Cys, L-cisteína, L-Val, L-valina; ACV,δ-(L-α-aminoadipill)-L-cisteinil-D-valina; ACVS, ACV sintetasa; IPNS isopenicilina N sintasa; IPN, isopenicilina N;IPN-ACS, isopenicilina N-CoA sintetasa; IPN-ACE, isopenicilina N-CoA epimerasa; PenN, penicilina N; EH, expan-dasa/hidroxilasa; DAC, desacetilcefalosporina C; DAC-AT, DAC acetiltransferasa; CPC, cefalosporina C.


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rior y además era adecuada para el creci-miento en cultivos sumergidos (Raper yAlexander, 1945; Raper, 1946). Esta capa-cidad de crecimiento en medio líquidopermitía llevar a cabo fermentaciones, porlo cual se potenciaba aún más la capa-cidad productora.

Programas de mejora industrial en laproducción de penicilinas

Partiendo de la P. chrysogenum NRRL-1951y mediante el uso de agentes mutagénicosse fueron seleccionando las cepas que pre-sentaban una mayor producción. De estamanera se llegó a la cepa WisQ176, pa-sando de una producción de penicilina de60 μg/ml en P. chrysogenum NRRL-1951 auna de 2.500 μg/ml.

P. chrysogenum WisQ176 fue incluida endistintos programas de mejora de cepas,en busca de una cepa con un gran rendi-miento productivo (Backus y Stauffer,1955; Hopwood y Merrick, 1977). Losagentes mutagénicos más utilizados fueronlos rayos X, los rayos UV, mostazas nitro-genadas y, más recientemente, nitrosogua-nidina, agentes alquilantes y nitritos. Enestos programas de mejora de cepas tam-bién han sido aplicadas otro tipo de téc-nicas como son la fusión parasexual deprotoplastos y la ingeniería genética.

La fusión parasexual de protoplastos pre-tendía conseguir el intercambio de ADNentre dos cepas superproductoras para fa-cilitar una hibridación interespecífica en laque los organismos recombinantes presen-taran un genotipo diferente al de las cepasparentales. El genotipo del organismo re-combinante sería el producto de la uniónde todas las mutaciones que conducen auna mayor capacidad productiva en las dos

cepas de partida. Teóricamente, la capa-cidad productora del fenotipo resultantesería igual a la de las dos cepas parentalesjuntas (Anné, 1977; Tahoun, 1993).

Mediante ingeniería genética, la mejorade la producción se ha llevado a cabo re-alizando mutagénesis dirigida, incremen-tando la dosis génica de enzimas involu-cradas en etapas limitantes del proceso debiosíntesis y expresando de forma hete-róloga los genes biosintéticos (Chiang,2004). De esta manera, la sobreexpresióntanto del gen ppt (que codifica la enzimaPPTasa encargada de activar la ACVS)(García-Estrada y col., 2008) como delgen LaeA (que codifica la proteínaPcLaeA, un regulador global del metabo-lismo secundario que regula positiva-mente la expresión de los genes de bio-síntesis de penicilina) (Kosalková y col.,2009) tienen como consecuencia un in-cremento en la producción de penicilina.

El resultado de los programas de mejorason cepas industriales como P2 (Panlabs,Taiwán), DS04825 (DSM antiinfectives,Holanda) o AS-P-78 y E1 (Antibióticos S.A,España) cuya producción de penicilina encultivo sumergido (feed-batch) puedellegar a los 70 g/l (Olano y col., 2008). Estamayor producción en estas cepas indus-triales es el resultado del elevado númerode copias del cluster de biosíntesis que,como se indicó anteriormente, están in-cluidas en una región de ADN que apareceamplificada en tándem en las cepas indus-triales. De esta forma, mientras P. chryso-genum NRRL-1951 tiene una sola copia delcluster de biosíntesis, P. chrysogenum E1cuenta con un número de entre 12 y 14copias (Fierro y col., 2006). Además, en lascepas industriales existe una mayor expre-sión de los genes biosintéticos de penici-


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linas (Barredo y col., 1989c; Fierro y col.,1995; Newbert, 1997; Kosalková y col.,2007).

Por otro lado, la vía del homogentisatotambién ha sufrido modificaciones durantelos programas de mejora industrial de lascepas. Esta vía, que se utiliza para el cata-bolismo del ácido fenilacético (el precursorde cadena lateral en la biosíntesis dePenG), está disminuida en P. chrysogenumWisconsin 54-1255 y en buena lógica enlas cepas derivadas. La causa es la modifi-cación de una fenilacetato hidroxilasa (ci-tocromo P450 monooxigenasa) codificadapor el gen pahA, que conduce a una re-ducción de la degradación de ácido fenila-cético y, por lo tanto, a una mayor dispo-sición de este ácido para la síntesis dePenG (Rodríguez-Saiz y col., 2001).

Más recientemente, Van der Berg y col.(2008) han visto que la abundancia de pe-roxisomas y el aumento de la transcrip-ción de los genes que codifican las en-zimas encargadas de la biosíntesis de losaminoácidos precursores también estándirectamente relacionados con el au-mento de la producción. Los estudios deproteómica muestran que durante el pro-ceso de mejora de cepas el incremento enla producción de penicilina parece ser unaconsecuencia de la disminución tanto dela biosíntesis de otros metabolitos secun-darios como de la capacidad infectiva delhongo, además del resultado de un au-mento en el metabolismo redox y en labiosíntesis de NADPH (Jami y col., 2010).

Producción de penicilinassemisintéticas

La estrategia seguida para producir peni-cilinas biosintéticas consiste en una fer-

mentación de la cepa industrial en cultivofeed-batch sumergido, donde se añadenlos precursores de cadena lateral, ácidofenilacético para PenG o ácido fenoxiacé-tico para PenV. La fermentación transcurreen reactores de acero inoxidable con ca-pacidades de 20.000 a 500.000 litros y auna temperatura óptima de 25 a 27 ºC.Al ser un proceso aeróbico requiere unaporte continuo de O2 (0,05-0,1 vol O2

vol cultivo-1 min-1) que se mezcla con elmedio de cultivo gracias a impulsores detipo turbina (Elander, 2003).

Una fermentación típica de PenG constade dos-tres fases iniciales de crecimientode 40 horas con un tiempo de duplicaciónde 6 horas (durante las que se genera lamayor parte de la masa celular) seguidade una fase de producción de penicilinaque puede extenderse hasta las 120-160horas. Una vez concluida la fermentación,se separa el micelio del medio de cultivopor filtración, empleando un filtro rota-torio a vacío tipo cilindro. A continuación,el caldo de cultivo filtrado, rico en PenG,es inmediatamente enfriado a 0-4 ºC conel objeto de disminuir la degradación en-zimática y química en etapas posteriores.El antibiótico PenG, al ser un ácido, es al-tamente soluble en solventes orgánicos,por lo se que extrae eficientemente conacetato de amilo, butilo o isobutilo y a unpH ácido (2,5-3,0), que se consigue aña-diendo al medio de cultivo filtrado H2SO4

o H3PO4. Además puede hacerse un tra-tamiento con carbón activo para eliminarpigmentos y otras impurezas. La PenG ex-traída se cristaliza añadiendo excesos deNa+ o K+ y los cristales obtenidos se lavancon un solvente volátil y se secan.

Ambas penicilinas biosintéticas (PenG yPenV) pueden ser empleadas directamente


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o para obtener el 6-APA, mediante una de-sacilación química o enzimática. El 6-APAse utiliza como núcleo estructural para pro-ducir una gran variedad de penicilinas se-misintéticas, al incorporarle diferentes ca-denas laterales (Rollinson y Geddes, 2007).La síntesis química tradicional de 6-APA co-menzó alrededor de 1970 y se mantuvodurante 15-20 años. Este procedimientoera altamente contaminante, ya que re-quería productos químicos y solventes,siendo desplazada por la síntesis enzimá-tica que la convirtió en no rentable (Demainy Elander, 1999). Actualmente, la produc-ción industrial de 6-APA se realiza por la hi-drólisis enzimática de la PenG o PenV me-diante la inmovilización de las enzimasPenG acilasa y PenV acilasa, respectiva-mente. Estas enzimas se obtienen a partirde cepas recombinantes de Escherichia coli,Bacillus megaterium (ambas para la PenGacilasa) y Fusarium oxysporum (para la PenVacilasa), cuyas actividades enzimáticas estánmejoradas (Arrollo y col., 2003; Rajendhrany Gunasekaran, 2004; Sio y Quax, 2004).

El principal problema que presentan laspenicilinas es la pérdida de su funciona-lidad dada su susceptibilidad al ataque deβ-lactamasas y su ligera inestabilidad enmedio ácido. Para solucionar este pro-blema se crearon las penicilinas semisinté-ticas, en las cuales al núcleo 6-APA se leincorporan diferentes cadenas laterales. Lapresencia de estas cadenas laterales lesconfiere diferentes propiedades a las pe-nicilinas, como son la biodisponibilidad, elespectro antibacteriano, la estabilidad, latolerancia, así como la eficacia contra unaamplia gama de bacterias, incluidas variasespecies de estreptococos y estafilococos,Gram negativas aerobias y muchas anae-robias. Las penicilinas semisintéticas se

pueden agrupar en cinco categorías: pe-nicilinas penicilinasa resistentes o anties-tafilocócicas (meticilina, oxacilina, nafcilina,cloxacinina y dicloxacilina), aminopenicilinas(ampicilina, amoxicilina y bacampicilina),carboxipenicilinas (carbenicilina y ticarci-lina), ureidopenicilinas (mezlocilina, azlo-cilina y piperacilina) y penicilinas con inhi-bidor de β-lactamasas (amoxicilina-ácidoclavulánico, ampicilina-sulbactam, ticarci-lina-ácido clavulánico y piperacilina-tazo-bactam) (Jacoby y Medeiros, 1991; Kalanty Roschlau, 1998; Oshiro, 1999; Kadurinay col., 2003).

Biotecnología en laproducción de cefalosporinas

Historia del descubrimiento de lacefalosporina C

La historia del descubrimiento de las ce-falosporinas (Hamilton-Miller, 2000) se re-monta al año 1945, cuando en la loca-lidad de Cagliari (Cerdeña, Italia)Giusseppe Brotzu observó que, a pesar deque la fiebre tifoidea era endémica enCerdeña, las personas que se bañaban yconsumían marisco crudo en las proximi-dades donde se vertían aguas residualesal mar no enfermaban. Consciente deeste hecho pensó que en el mar podríahaber algún tipo de proceso de autode-puración, posiblemente debido a la pro-ducción de antibióticos por la flora autóc-tona. Por lo tanto, se puso a trabajaraislando y bioensayando, frente a pató-genos, los microorganismos procedentesdel mar. Como resultado de esta bús-queda aisló un hongo productor de anti-bióticos que procedía de aguas residualesvertidas al mar (Brotzu, 1948). Este autor


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observó que en los cultivos había sustan-cias que inhibían el crecimiento deSalmonella typhi, S. paratyphi B, Yersiniapestis, Brucella melitensis, Vibrio choleraey Staphylococcus aureus. Sin embargo, nopresentaba actividad aparente frente a lascepas bacterianas Escherichia coli yShigella dysenteriae. Brotzu también rea-lizó ensayos clínicos en los que trataba pa-cientes afectados por infecciones cau-sadas por estafilococos o estreptococosmediante la inyección intramuscular orectal de los extractos crudos (filtrados)procedentes del cultivo de este hongo. Elefecto del tratamiento en los pacientes(salvo por una sensación desagradable deardor local) era la desaparición del dolor,la reducción de la inflamación, la dismi-nución de la fiebre y finalmente la resolu-ción bacteriológica de la infección.

Todos estos trabajos se publicaron en unarevista médica italiana denominadaTrabajos del Instituto de la Higiene deCagliari, con el título: “Búsqueda de unnuevo antibiótico” (Brotzu, 1948). Estehongo inicialmente denominado Cephalos-porium acremonium fue rebautizado mástarde con el nombre de Acremonium chry-sogenum (Gams, 1971). Estos primeros es-tudios realizados por Brotzu no concluyeronen la purificación del antibiótico debido ala falta de financiación y tuvieron su conti-nuidad en el laboratorio Sir Willian DunnSchool of Pathology en la Universidad deOxford. El grupo de Oxford demostró quela cepa de Brotzu producía los antibióticoscefalosporina P y cefalosporina N. La cefa-losporina P es un compuesto de naturalezaesteroide químicamente relacionado conlos ácidos fusídico y helvólico y que es ac-tivo frente a bacterias Gram positivas. Lacefalosporina N es una penicilina hidrofílica

que es activa frente a bacterias Gram posi-tivas y Gram negativas (Burton y Abraham,1951; Crawford y col., 1952) a través delgrupo carboxilo de su cadena lateral D-α-aminoadipil (Abraham y col., 1953). Esteúltimo compuesto fue denominado penici-lina N (PenN) (Florey, 1955) y nunca se co-mercializó.

Durante los estudios sobre PenN,Abraham sospechaba que otra sustanciaestaba presente en las preparaciones, yaque aparecía una absorción considerablede luz ultravioleta a una longitud de ondade 260 nm que no correspondía a PenN.Este compuesto fue el tercer antibióticoaislado de A. chrysogenum y se deno-minó cefalosporina C (CPC). La CPCposee algunas ventajas con respecto a laspenicilinas, como son la resistencia a pe-nicilinasas estafilococales y el hecho detener una mayor estabilidad en medioácido.

Programas para la obtenciónde cepas industriales deA. chrysogenum; condicionesde fermentación

Los programas de mejora comenzaron amediados de los años 50 y se realizaron apartir de la cepa original de A. chryso-genum aislada por Brotzu mediante el usode agentes mutagénicos, concretamenteradiación UV. De esta manera se obtuvo lacepa M-8650, que constituyó en la cepade partida en numerosos programas in-dustriales de mejora de la producción decefalosporinas (Elander y Aoki, 1982).Como ejemplo de estos programas de me-jora, la compañía americana Eli Lilly & Co.obtuvo el mutante CW-19, el cual puedeproducir 15 veces más CPC que el aislado


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original de Brotzu (Elander y Espenshade,1976).

Actualmente, la producción de las cepasindustriales de A. chrysogenum se sitúaen torno a los 20-25 g/l y, a diferencia deP. chrysogenum, estas cepas contienenúnicamente una sola copia de los genesbiosintéticos.

El desarrollo de las técnicas de ADN recom-binante sobre A. chrysogenum ha permi-tido la actuación directa sobre los genesimplicados en la biosíntesis, regulación ysecreción de CPC. De esta forma, el incre-mento del número de copias del gen cefEFconduce a un incremento en la producciónde un 47% con respecto a la cepa controly a una falta del indeseado intermediarioPenN en los caldos de fermentación(Skatrud y col., 1989). Posteriormente, sedemostró que el efecto de este incrementoera también resultado del incremento enla dosis del gen cefG (Gutiérrez y col.,1992, 1999). En esta línea, Gutiérrez y col.(1997) incrementaron el nivel de transcrip-ción del gen cefG tras colocar este genbajo el control de promotores de expresiónfuerte. El resultado fue una mayor produc-ción de CPC de hasta 4-5 veces con res-pecto a la de la cepa parental, como con-secuencia de una mayor actividadDAC-acetiltransferasa que procuraba unaconversión más eficiente de DAC en CPC.Esta misma ingeniería genética ha hechoposible que la sobreexpresión del gen cefTo del tándem de genes cefD1-cefD2 du-plique la producción de cefalosporinas conrespecto a la de la cepa control (Ullán ycol., 2002b, 2004).

Otro aspecto a tener en cuenta son lascondiciones en las cuales se fermentaA. chrysogenum para maximizar la pro-

ducción de CPC. Así, se observó que laadición de DL-metionina estimula la pro-ducción de CPC, proporcionando elátomo de azufre del antibiótico (Demain,1963) e induce las enzimas de síntesis deCPC (Drew y Demain, 1973; Komatsu ycol., 1975; Sawada y col., 1980; Velascoy col., 1994; Martín y Demain, 2002).Igualmente, estos estudios determinaronque la L-cisteína y la L-valina son precur-sores del núcleo 7-ACA (ácido 7-amino-cefalosporánico) (Trown y col., 1963a;Demain, 1963), mientras que el L-α-ami-noadípico es precursor de la cadena la-teral D-α-aminoadipil (Trown y col.,1963b). Por otro lado, la concentraciónde oxígeno disuelto en el medio (DOC)tiene que mantenerse por encima de un20%, ya que valores inferiores tienencomo consecuencia un acúmulo del inter-mediario PenN en los caldos, disminu-yendo de manera considerable la produc-ción de CPC. De esta manera, mantenerlos niveles de DOC en un 40% conducea una mayor producción de CPC. Esto esdebido no solo a las características aero-bias de A. chrysogenum sino a los reque-rimientos de oxígeno por parte de las en-zimas de la ruta biosintética de CPC (Zhouy col., 1992).

La composición del medio de cultivo varíadependiendo de la cepa industrial deA. chrysogenum, pero en líneas generalesse trata de medios complejos cuyos com-ponentes principales son líquidos de ma-ceración de maíz (principal fuente de ni-trógeno y fósforo), soja y harina desemillas de algodón o de cacahuete(fuentes de proteínas). Como fuentes decarbono de consumo rápido está la glu-cosa, y de consumo lento, el almidón o elaceite de soja. También se incluyen sales


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y, por supuesto, el aminoácido DL-metio-nina (Barber y col., 2004).

Los procesos fermentativos para la pro-ducción industrial de CPC se inician conel inóculo de la biomasa fresca (de la cepaindustrial de A. chrysogenum) procedentede placas de medio sólido en un mediode cultivo líquido que proporcionan bio-masa. Dicha biomasa se utiliza como inó-culo de los llamados estados vegetativosde la fermentación, un total de tres quesirven para producir suficiente cantidadde biomasa para inocular fermentadoresde 100 m3 en la llamada fase de produc-ción, en la cual se sintetiza CPC (Barber ycol., 2004). Finalizada la fermentación, laCPC tiene que ser purificada a través deun proceso sumamente complejo en elque se incluye una costosa purificacióncromatográfica. En el primer paso, la bio-masa y el caldo que contiene el antibió-tico se separan por filtración. A continua-ción, el caldo filtrado se pasa a través deun par de columnas de cromatografía deinteracción hidrofóbica para separar lasproteínas, péptidos, sales y otras impu-rezas que incluyen los intermediarios DACy DAOC. La primera columna, conocidacomo scavenger, se llena de una resina deadsorción (por ejemplo, Diaion HP20) quepresenta una mínima adsorción de CPC yque permite la unión de compuestos co-loreados e hidrofóbicos. La segunda co-lumna, denominada adsorber, consiste enuna resina hidrófoba, como SepabeadsSP700, a la que se une la CPC. La eluciónde los antibióticos es resultado de uncambio de pH y su purificación se lleva acabo a través de cromatografía de inter-cambio iónico, lo que elimina las impu-rezas coloreadas. Finalizado el proceso seobtiene una solución acuosa de CPC, la

cual puede ser cristalizada en forma de susal sódica o potásica o utilizada para pro-ducir 7-ACA.

Producción industrial decefalosporinas semisintéticas

A nivel farmacológico, las cefalosporinassemisintéticas más importantes derivan delos anillos 7-ACA y 7-ADCA. Dichos ani-llos cefalosporánicos se obtienen me-diante la ingeniería genética de loshongos filamentosos A. chrysogenum yP. chrysogenum.

Producción industrial de 7-ACA

La escasa eficacia como antibiótico de laCPC impulsó el desarrollo de nuevos de-rivados semisintéticos más activos me-diante la introducción en el núcleo 7-ACAde diferentes cadenas laterales en la po-sición 7´ y modificaciones en 3´. Estas al-teraciones mejoran el espectro antibacte-riano, la estabilidad frente a β-lactamasasy, en general, incrementan las propie-dades farmacocinéticas de la molécula.

El 7-ACA puede obtenerse con métodosquímicos o enzimáticos mediante la elimi-nación del grupo 7-aminoadipil de la ca-dena lateral de la molécula de CPC.Básicamente, en los métodos químicos,después de la protección del grupo aminoy carboxilo de la CPC, se emplea penta-cloruro fosfórico para eliminar el 7-ami-noadipil, obteniendo una molécula de 7-ACA con una calidad excelente (figura6A). El uso de los métodos químicos parala producción industrial de 7-ACA fue ini-ciado por Morin y col. (1969) y, si bien hasido notablemente mejorado, resulta me-dioambientalmente insostenible, ya queson necesarios solventes orgánicos que


195

generan residuos químicos sumamentetóxicos (Barber y col., 2004).

Actualmente, la conversión industrial deCPC en 7-ACA se realiza a través de unproceso enzimático en dos pasos (figura6A) empleando las enzimas D-aminoácidooxidasa (DAO) y glutaril acilasa (GLA)(Conlon y col., 1995; Riethorst y Reichert,1999). En el primer paso, la CPC es desa-minada oxidativamente a ceto-adipyl-7-ACA (CA-7-ACA) por medio de la acti-vidad enzimática DAO. El peróxido dehidrógeno producido en la reacción pro-voca de manera espontánea la descarbo-xilación oxidativa del CA-7-ACA, origi-nando el glutaril-7-ACA (GL-7-ACA).Finalmente, en la segunda etapa estecompuesto se hidroliza a 7-ACA y gluta-rato por la acción de la enzima GLA.Dicha enzima también acepta CA-7-ACAcomo sustrato, pero su afinidad es baja yla reacción es fuertemente inhibida enpresencia de GL-7-ACA.

Otro proceso alternativo para la conver-sión enzimática de CPC en 7-ACA resultade la acción combinada de DAO, GLA yuna catalasa. De esta manera, la enzimaDAO cataliza la desaminación oxidativade CPC a CA-7-ACA y la catalasa eliminatodo el peróxido de generados durante lareacción, evitando así la formación deGL-7-ACA. Bajo estas condiciones, GLAconvierte CA-7-ACA en 7-ACA y cetoglu-tarato (Guisan y col., 2002).

Un intento significativo para una produc-ción directa de 7-ACA (recuperable de loscaldos de fermentación) fue llevada acabo por Isogai y col. (1991). En A. chry-sogenum se introdujo un operón biosin-tético de 7-ACA formado por dos genes:uno que codifica una DAO de Fusarium

solanarum y otro que codifica una GLA dePseudomonas diminuta. La cepa resul-tante transforma directamente CPC en 7-ACA (figura 6B), junto con los ácidos

7-aminodesacetilcefalosporánico (7-DAC)y 7-aminodesacetoxicefalosporánico (7-ADCA). Sin embargo, los niveles produ-cidos de 7-ACA no resultaron industrial-mente rentables, pero ponían demanifiesto la posibilidad de expresargenes bacterianos en hongos.

Producción industrial de 7-ADCA

El proceso tradicional para la producciónindustrial del 7-ADCA tiene lugar tras lafermentación de P. chrysogenum me-diante un proceso con múltiples pasos,que además es costoso y contaminante(figura 6D). En dicho proceso tiene lugarla expansión química del núcleo de laPenG a fenilacetil-7-ADCA, seguido de laeliminación de la cadena lateral aromáticamediante una desacetilación enzimáticacatalizada por una penicilina acilasa(Herbasch y col., 1984).

La alta capacidad de P. chrysogenum paraproducir antibióticos, el mayor coste delos procesos fermentativos de A. chryso-genum y la ingeniería genética han pro-movido la creación de cepas de P. chryso-genum con capacidad de producir elanillo cefalosporánico. La primera aproxi-mación fue la fermentación de cepas re-combinantes de P. chrysogenum que por-taban los genes cefD (epimerasa) y cefE(expandasa) de S. clavuligerus, pero que,sin embargo, presentaron una baja pro-ducción de la molécula DAOC, que es laprecursora del 7-ADCA tras la eliminaciónen el carbono 7 de la cadena lateral alifá-tica D-α-aminoadipil (figura 6F) (Cantwelly col., 1992; Beckman y col., 1993).


196

Figura 6. Estrategias para la producción de 7-ACA y 7-ADCA en A. chrysogenum y P. chrysogenum.

C P. chrysogenum TA98

ACV

IPN

Pen N

DAC(extracelular)

CPC(intracelular)

penDE

A. chrysogenumcefD1-cefD2

A. chrysogenumcefEF

A. chrysogenumcefEG

G A. chrysogenum(cepa cefEF)

ACV

IPN

Pen N

DAOC

cefEF


B A. chrysogenum

ACV

IPN

Pen N

DAC

CPC

Operón DAO-GLA

A A. chrysogenum

Pentaclorurofosfórico

ACV

IPN

Pen N

DAC

CPC

DAO

GLA

CA-7-ACA GL-7-ACA

7-ACA

NH2

OCOCH3

S

NOCOOH

GL-7-ADCA

CA-7-ADCA

DAO

F P. chrysogenum

ACV

IPN

Pen N

DAOC

S. clavuligeruscefD (epimerasa)


E P. chrysogenum

ACV

IPN

Adipil-6-APA

Adipil-7-ADCA


Ácidoadípico

GLA

D P. chrysogenum

ACV

IPN

Penicilina G

Fenilacetil-7-ADCA

Expansiónquímicadel anillo

Ácidofenilacético

GLA

7-ADCA

NH2

CH3

S

NOCOOH

Penicilinaacilasa


197

Un método alternativo a la expansión quí-mica para producir 7-ADCA se basa en uti-lizar cepas de P. chrysogenum que expresanlos genes cefE de S. clavuligerus o el gencefEF de A. chrysogenum. De esta forma,cuando en la fermentación se añade ácidoadípico como precursor de la cadena lateralen lugar de ácido fenilacético se formaadipil-6-APA, el cual, por la acción de la ac-tividad enzimática expandasa, se expandea adipil-7-ADCA (Crawford y col., 1995).Posteriormente, el tratamiento enzimáticocon DAO elimina la cadena lateral de ácidoadípico produciendo 7-ADCA (figura 6E).Siguiendo un enfoque similar, los genescefEF de A. chrysogenum y cmcH de S. cla-vuligerus (que codifica una carbamoil trans-ferasa) se expresaron en P. chrysogenum,dando lugar a la producción de ad7-ACCCA (ácido adipoil-7-amino-3-carba-moiloxymethil-3-cefem-4-carboxílico). Estecompuesto es altamente estable y se utilizacomo precursor en la elaboración de cefa-losporinas semisintéticas (Harris y col.,2009).

Durante la búsqueda de cepas de P. chry-sogenum con aplicación industrial para laproducción de cefalosporinas, se obtuvo lacepa P. chrysogenum TA98 (Ullán y col.,2007). Este transformante deriva del mu-tante P. chrysogenum npe6 pyrG– (Cantoraly col., 1993), que carece de la actividad IPNaciltransferasa como consecuencia de unamutación en el gen penDE (Fernández ycol., 1994) y tiene integrados en su ge-noma todos los genes cefD1, cefD2, cefEFy cefG (genes específicos de la ruta biosin-tética de CPC de A. chrysogenum). De estaforma, en P. chrysogenum TA98, la IPN, quees normalmente transformada en penicilinaG o penicilina V en la cepa parental, estransformada en DAC y CPC (figura 6C).

Sin embargo, en los caldos de cultivo solose detecta DAC y no CPC que sí se detectaa nivel intracelular. La ausencia extracelularde CPC puede ser el resultado de su degra-dación en los caldos de fermentación o porla falta de un transportador apropiado delque carece P. chrysogenum (Ullán y col.,2008).

Velasco y col. (2000) desarrollaron otro pro-ceso alternativo al expresar el gen cefE deS. clavuligerus en una cepa industrial deA. chrysogenum previamente interrumpidaen el gen cefEF. El resultado es un transfor-mante que produce mayoritariamenteDAOC, que es el sustrato para la produc-ción de 7-ADCA mediante dos pasos enzi-máticos (figura 6G). En el primer paso,DAOC se transforma en ácido cetoadipil-7-ADCA (C-7-ADCA) mediante una DAO deRhodotorula gracilis (Alonso y col., 1998).Este compuesto reacciona espontánea-mente con el peróxido de hidrógeno pro-ducido en la reacción, originándose el ácidoglutaril-7-ADCA (GL-7-ADCA). Finalmente,el GL-7-ADCA se hidroliza a 7-ADCA poruna GLA de Acinetobacter sp. La ventajaprincipal de este sistema de producción essu eficiencia tanto a nivel industrial comomedioambiental, ya que evita el uso de pro-cesos químicos.

Cefalosporinas semisintéticas

La base de las cefalosporinas comercialesen la elaboración de las cefalosporinas se-misintéticas la constituyen los núcleos7-ACA, 7-ADCA y 7 DAC, aparte de losnúcleos derivados de las cefamicinas. Laadición en estos núcleos de una nueva ca-dena lateral en la posición 7' o la altera-ción de los 3' conduce a la modificaciónde las propiedades farmacocinéticas de lacefalosporina semisintética resultante,


198

cambiando el espectro antibacteriano yposibilitando una mayor estabilidad frentea β-lactamasas. En función de su espectroy la resistencia enzimática a la degrada-ción se han desarrollado cefalosporinascomerciales de hasta cuatro generaciones(Demain y Elander, 1999; Barber y col.,2004).

Las cefalosporinas de primera generaciónaparecieron en la década de los 60 (1964-1969), presentan un espectro de acciónmoderado, son generalmente susceptiblesa β-lactamasas y son menos eficaces quelas penicilinas frente a microorganismosanaerobios. Son activas contra numerosasbacterias Gram positivas y su espectro seextiende también a muchas Gram nega-tivas, como cepas de E. coli, varias espe-cies de Klebsiella (como K. pneumoniae),Proteus indol negativos (no positivos)Salmonella, Shigella y especies deEnterobacter. Sin embargo, no tienen nin-guna actividad contra Bacteroides fragilis,enterococos, estafilococos resistentes ameticilina, Pseudomonas, Acinetobacter,Enterobacter o Serratia. Los miembros deesta familia de antibióticos son la cefra-dina, la cefalexina, el cefadroxilo, la cefa-lotina, la cefaloridina, la cefapirina, la ce-fazolina y la cefradina. La cefradina ycefalexina son ácido resistentes, por loque pueden administrarse por vía oral, adiferencia de la cefalotina, que solo sepuede hacer por vía intravenosa.

Las cefalosporinas de segunda generaciónaparecieron en la década de los 70 y po-seen un espectro antibacteriano mayorque las de la primera. Son en líneas gene-rales más resistentes a β-lactamasas, perotienen una escasa penetración de la ba-rrera hematoencefálica. Presentan acti-vidad frente a un mayor número de bac-

terias Gram positivas y Gram negativas,especialmente frente a estas últimas.Entre su espectro antibacteriano se sitúanHaemophilus influenzae, E. coli,Klebsiella, cepas de enterobacter, cepasindol positivas, Neissseria gonorreae,Neissseria meningitidis y microorganismosanaerobios. Son ineficaces frente aPseudomonas aeruginosa, especiesActinobacter y un buen número de ana-erobios estrictos. Ejemplos de la segundageneración de cefalosporinas son el cefa-clor, la cefuroxima, la cefatrizina, el cefa-mandol, la ceforanida, el cefonicid y elcefmetazol. Dentro de esta generacióntambién se incluyen el cefmetazol, el ce-fotetán y la cefoxitina (con actividadfrente a bacterias anaeróbicas), a pesar depertenecer al grupo de cefamicinasdentro de los antibióticos β-lactámicos.

Las cefalosporinas de tercera generación(década de los 80) poseen en líneas ge-nerales una actividad similar a las de laprimera generación frente a bacteriasGram positivas. Sin embargo, las de ter-cera generación son más resistentes a lasbetalactamasas y poseen una mayor acti-vidad antibacteriana frente a numerosasinfecciones provocadas por gérmenesGram negativos, como Proteus vulgaris, ydiferentes especies de los génerosEnterobacter, Citrobacter, Haemophilus,Neisseria y Moraxella. Por otro lado, su ac-tividad es menor frente a estafilococos,aunque por lo general son eficaces contralas cepas de Streptococcus pneumoniaeresistentes a la penicilina. Algunas cefa-losporinas de esta generación puedenatravesar la barrera hematoencefálica conrelativa facilidad (alcanzando importantesconcentraciones en el líquido cefalorra-quídeo) y penetrar en el sistema nervioso


199

central, lo que los hace efectivos en el tra-tamiento de la meningitis bacteriana cau-sada por bacterias sensibles a este anti-biótico. Algunos ejemplos de estascefalosporinas son la cefixima, el ceftibu-teno, la cefotaxima, la ceftriaxona, la cef-tazidima y la ceftizoxima (Klein y Cunha,1995).

La cuarta generación de cefalosporinastiene una mayor resistencia a las β-lacta-masas que la generación anterior. Su es-pectro de actividad es más amplio (Grampositivas y Gram negativas, pobre contraanaerobios) con una reducción de la re-sistencia por parte de las bacterias Gramnegativas debido a las características dela estructura química de la molécula anti-biótica. Además, la mayoría puede cruzarla barrera hematoencefálica, lo cual lashace eficaces contra la meningitis.También estos antibióticos se utilizan paracombatir las infecciones causadas porP. aeruginosa. Como ejemplo de la cuartageneración de cefalosporinas está la ce-fepima, la cefpiroma, la cefquinoma, lacefclidina, el cefoselis, el cefluprenam y elcefozoprán.

Para mejorar la actividad antibiótica de lascefalosporinas y minimizar la aparición demicroorganismos resistentes, algunas deestas cefalosporinas semisintéticas han sidocombinadas con inhibidores de β-lacta-masas. Un ejemplo es la combinación de lacefalosporina de tercera generación cefo-perazona y el inhibidor sulbactam en el pro-ducto comercial Sulperazone® (Demain yElander, 1999). Por otro lado, las cefalospo-rinas de quinta generación se han desarro-llado en el laboratorio para luchar específi-camente contra cepas resistentes a losantibióticos. En particular, el ceftobiprol y lacefatarolina son eficaces contra bacterias

Gram negativas y Gram positivas, incluidaslas cepas resistentes a meticilina (SARM) deStaphylococcus aureus y Streptococcuspneumoniae (Kollef, 2009; Steed y Rybak,2010). Actualmente, los programas de in-vestigación están centrados en el desarrollode nuevas generaciones de cefalosporinassemisintéticas con las cuales se pretende in-crementar la estabilidad frente β-lacta-masas, el espectro de acción y su biodispo-nibilidad.

Perspectivas futurasLos antibióticos β-lactámicos destacansobre las demás familias de antibióticosporque son los más prescritos en todo elmundo. La mayoría de estos antibióticos,concretamente las penicilinas y cefalospo-rinas, presentes en el mercado son comer-cializados como genéricos. Únicamenteun pequeño porcentaje, como el ceftobi-prole, son nuevas moléculas sujetas a pa-tentes farmacéuticas. Sin embargo, la pre-sencia de los β-lactámicos en el mercadode los antibióticos ha pasado de un 50%en 1998 a un 65% en la actualidad. Encifras, se ha pasado de 11 a 18 billonesde dólares, 10 en el caso de las cefalos-porinas y 8 en el caso de las penicilinas(Schmidt y col., 2010). Los estudios de ge-nómica y proteómica han contribuido alconocimiento de las bases molecularesque justifican la mayor producción de an-tibiótico por parte de las cepas indus-triales. Las líneas de investigación actualesse centran en el estudio del transporte,tanto de los intermediarios biosintéticoscomo de la secreción del producto final.Igualmente es objeto de estudio la inte-racción entre el metabolismo primario ysecundario, así como las interacciones delos componentes involucrados en la bio-


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síntesis de los antibióticos β-lactámicos.También es relevante el conocimiento delos circuitos reguladores y las vías detransducción de señales. La presencia tanfuerte de los β-lactámicos hace que, apesar de llevar más de 50 años en el mer-cado de los antibióticos, son un impor-tante pilar para el tratamiento de las in-fecciones bacterianas. Por este motivo seestá intentando tanto economizar los pro-cesos de producción de los antibióticosβ-lactámicos como innovar con nuevosderivados semisintéticos.

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“Jesus, Dit gant werk!”(“¡Jesús, esto va afuncionar!”)“Jesus, Dit gant werk!” fue la frase queel Dr. Christiaan Neethling Barnard pro-nunció mientras incrédulamente obser-vaba cómo latía el corazón que acababade implantar. El escenario sobre el queactuaba este cirujano de 45 años era unquirófano del hospital Groote Schurr deCiudad de El Cabo y el receptor era uncomerciante de ultramarinos llamadoLouis Washkansky. Esto sucedió un do-mingo 3 de diciembre de 1967. La do-nante (Dénise Darvall), una joven ofici-nista de 25 años, había sido atropelladapor un automóvil horas antes. Este fueel primer trasplante de corazón en hu-manos, el cual catapultó a cirujano y re-ceptor a la fama mundial. Desafortuna-damente, 18 días después el pacientemurió de una neumonía. Pero la semilladel proceso quirúrgico ya estaba plan-tada y esta permitió al Dr. Barnard con-tinuar con los trasplantes cardiacos. Esteprimer trasplante se produjo 3 díasantes de que el Dr. Adrian Kantrowitzdel Maimonides Medical Center deBrooklyn realizara el primer trasplantepediátrico de corazón. Posteriormente,el tercer trasplante cardiaco se produjo

el 2 de enero de 1968, no sin un aurade polémica, ya que el receptor era unhombre blanco (Dr. Philip Blaiberg) y eldonante era un hombre negro (CliveHaupt). Este corazón latió durante 563días y ayudó a incrementar la fama delDr. Barnard, que pasó a formar parte delstar-system mediático, llegando a la por-tada de la revista Time y algunas de laprensa rosa. Aunque el Dr. Barnard per-manece en el subconsciente colectivocuando se piensa en trasplantes, mu-chos otros fueron los que previamentese habían dedicado a los trasplantes deórganos.

El origen de los injertos vegetales noestá muy claro, pero las antiguas civili-zaciones que se dedicaban al cultivo ar-bóreo ya observaron la unión natural deárboles compatibles a través de ramascreciendo contiguas. Al igual que su-cede con estos injertos en las plantas,donde se puede conseguir que un únicotronco produzca diferentes variedadesde manzana o inclusive almendras y me-locotones a la par, el hombre ha tratadode conseguir desde antiguo el éxito enlos trasplantes. Ya en la Ilíada (siglo VIII

a.C.) Homero hace referencia a Quimera(mitológico animal mezcla de león,cabra y serpiente matado porBelerofonte), presentando la idea de

Avance en el trasplante de órganosmediado por el uso de inmunosupresores.Nuevos retos de la biología molecularDr. Carlos Barreiro Méndez


210

mezcla de partes procedentes de dife-rentes especies en un solo cuerpo.Posteriormente, Jacobo de la Vorágineen su libro La Leyenda Dorada (siglo XIII),donde describe la vida de unos 180santos y mártires cristianos, relata elprimer alotrasplante u homotrasplante(dentro de la misma especie) al citarcómo los santos Cosme y Damián (pa-trones de cirujanos, farmacéuticos, mé-dicos, peluqueros, dentistas y trabaja-dores de los balnearios) trasplantaronuna pierna completa, procedente de uncriado etíope muerto la noche anterior,a un presbítero de una iglesia de Parísencomendada a la protección de los dossantos (Calne, 1965). Pero ya en el sigloVII a.C. se tuvo la primera noticia de au-totrasplantes (mismo individuo) atri-buidos al cirujano hindú Sushruta, elcual reconstruyó narices y orejas controzos de piel tomados del propio indi-viduo. Este método no fue conocido porlos cirujanos europeos hasta queGaspare Tagliacocci en el siglo XVI injertóun colgajo de brazo en la nariz de un ri-notomizado, consiguiendo que este serevascularizase. Posteriormente, JosephConstantine Carpue lo reintrodujo enEuropa a finales del siglo XVIII tras su ex-periencia como médico militar británicoen la India, donde aprendió estas téc-nicas de rinoplastia. Jacques LouisReverdin, en 1870, detalló el injerto libredesde el propio individuo, con la sal-vedad de que el injerto era grueso, loque facilitó la rápida revascularización,al contrario de los anteriores, que eranfinos. Actualmente hay autotrasplantesde piel, vena, arteria, hueso y otros te-jidos (Gracia, 1996). En lo relativo a xe-notrasplantes (entre especies), la pri-

mera referencia documentada provienede 1668, cuando el médico holandésJob van Meeneren realizó el primer tras-plante exitoso con hueso craneal deperro para reparar el craneo herido deun soldado ruso. Posteriormente, laiglesia ortodoxa rusa lo tacharía de an-tinatural.

Como suele suceder en casi todas lasaplicaciones técnicas, el avance en unadeterminada área de conocimientoviene determinado por el progreso enotras áreas paralelas que resuelven difi-cultades técnicas colaterales. Así, en1901, Karl Landsteiner descubrió y tipi-ficó los grupos sanguíneos (sistemaABO), lo que abrió las puertas a los tras-plantes de órganos líquidos, como es elcaso de la sangre (Pace, 1997). Un añodespués, el investigador galo AlexisCarrel describió la anastomosis vascular,presentando las técnicas conocidas hoyen cirugía vascular para la ligación devenas y arterias. Este avance hizo fac-tible realizar trasplantes de riñón, peroseguían produciéndose rechazos, salvoen el caso de gemelos univitelinos.Habría de pasar casi una generaciónpara que en 1958 Jean Dausset y JanVan Rood consiguieran explicar ese re-chazo en los trasplantes gracias al des-cubrimiento del sistema HLA (HumanLeukocyte Antigen) de histocompatibi-lidad en humanos (Carral y Parellada,2003). El propio Jan Van Rood creó 10años después la Fundación Eurotras-plante con el fin de encontrar receptorescompatibles para los riñones donados anivel europeo. En la tabla 1 se resumenalgunos de los principales avances en elcampo de los trasplantes a nivel mun-dial.

Avance en el trasplante de órganos mediado por el uso de inmunosupresores. Nuevos retos...

211

Tabla 1. Relación cronológica de los principales hitos en la evolución de los trasplantes.

Fecha Hitos históricos para los trasplantes

VII a.C. Primeros autotrasplantes para la reconstrucción de narices y orejas (Sushruta; Varanasi,India).

1597 Gaspare Tagliacozzi describe su método de reconstrucción nasal utilizando autoinjertosde piel (Universidad de Bolonia, Italia).

1667 Primera transfusión sanguínea de un cordero a un niño de 15 años (Dr. Jean-BaptisteDenis; Francia).

1668 Primer trasplante óseo documentado de cráneo de perro a un soldado ruso (Job vanMeeneren; Amsterdam, Holanda).

1770 John Hunter trasplantó el espolón de un gallo a su cresta (Royal College of Surgeons,Reino Unido).

1816 Joseph Constantine Carpue describe su sistema de reconstrucción nasal con tejido dela frente (Londres, Reino Unido).

1846 William TG. Morton utiliza dietiléter en una demostración pública para produciranestesia quirúrgica (Massachusetts General Hospital, Boston, EE.UU.).

1865 Joseph Lister describe los antisépticos (Glasgow Royal Infirmary, Glasgow, Escocia).

1901 El Dr. Karl Landsteiner describe los grupos sanguíneos (Universidad de Viena, Austria).

1902 El Dr. Alexis Carrel describe sus técnicas para la unión de arterias y venas (Montreal,Canadá).

1905 Primer trasplante de córnea duradero (Dr. Eduard Zirm; Hospital Olomouc, Moravia).

1913 Primer riñón artificial creado en Gran Bretaña. Permitía limpiar la sangre utilizandoanticoagulantes de sanguijuelas.

1932 Se crea el primer banco de sangre desde individuos muertos en Leningrado (Rusia). En1936 se crearía el primer banco de sangre desde vivos en el Chicago's Cook CountyHospital debido al desarrollo de los anticoagulantes. Esto abriría las puertas a los bancosde hueso, córneas...

1933 Primer trasplante de riñón entre humanos. Funcionó 2 días (Dr. Yu Yu; Voronoy, Ucrania).

1954 Trasplante de riñón entre gemelos univitelinos (Dr. Joseph Murray y Dr. David Hume;Brigham Hospital, Boston, EE.UU.).

1959 Trasplante de riñón entre gemelos no univitelinos previa irradiación del receptor (Dr.Joseph Murray; Brigham Hospital, Boston, EE.UU.).

1962 Primer trasplante de riñón desde donante muerto (Dr. Joseph Murray y Dr. DavidHume; Brigham Hospital, Boston, EE.UU.).

1963 Primer trasplante de pulmón (Dr. James Hardy; University of Mississippi Medical Center,Jackson, EE.UU.).

1966 Primer trasplante de páncreas/riñón (Dr. Richard Lillehei y Dr. William Kelly; University ofMinnesota, Minneapolis, EE.UU.).

1967 Primer trasplante de hígado (Dr. Thomas Starzl; University of Colorado, Denver, EE.UU.).

1967 Primer trasplante de corazón (Dr. Christiaan Barnard; Groote Schuur Hospital, CapeTown, Sudáfrica).

1968 Una mujer texana de 20 años se convierte en la primera donante multiorgánica.


212

Tabla 1. Relación cronológica de los principales hitos en la evolución de los trasplantes

(continuación).


1968 Se establece la Uniform Donor Card como documento para legalizar la donación de

órganos post mórtem.

1970 Descubrimiento de la ciclosporina A producida por el hongo Tolypocladium inflatum

por la compañía Sandoz (Basilea, Suiza).

1973 Primer trasplante de médula ósea de un donante no pariente (Memorial Sloan-Kettering

Cancer Center, New York City, EE.UU.).

1981 Primer trasplante corazón/pulmón (Dr. Brice Reitz; Stanford University Medical Center,

Stanford, EE.UU.).

1982 Primer trasplante de un corazón artificial (Jarvik-7) (William DeVries; University of Utah,

EE.UU.).

1983 La FDA (Food and Drugs Administration) aprueba el uso del inmunosupresor

ciclosporina A.

1983 Primer trasplante de un único pulmón (Dr. Joel Cooper; Toronto General Hospital,

Toronto, Canadá).

1984 Científicos de la compañía Fujisawa (Japón) descubren el FK506 o tacrolimus producido

por la bacteria Streptomyces tsukubaensis como un inmunosupresor más potente que

la ciclosporina A.

1986 Primer trasplante doble de pulmón (Dr. Joel Cooper; Toronto General Hospital, Toronto,

Canadá).

1988 La FDA aprueba el Viaspan, solución para la conservación de órganos donados (hígado,

riñón, páncreas, corazón…).

1989 Primer trasplante de intestino delgado en un niño desde donante fallecido (Dr. Olivier

Goulet; París, Francia).

1989 Primer trasplante de hígado de donante vivo (Dr. Christoph Broelsch; University of

Chicago Medical Center, Chicago, EE.UU.).

1990 Primer trasplante de pulmón de donante vivo (Dr. Vaughn Starnes; Stanford University

Medical Center, Palo Alto, EE.UU.). Se trasplantó el lóbulo de un pulmón de mujer

adulta a su hija de 12 años.

1990 El Papa Juan Pablo II apoya la donación de órganos como la última expresión del amor

y la caridad humanas.

1992 Primer trasplante de hígado de babuino a humano (Dres. Satoru Todo, Andreas Tzakis y

John Fung; University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, EE.UU.).


213

Tabla 1. Relación cronológica de los principales hitos en la evolución de los trasplantes(continuación).


1992 El Concilio Rabínico Ortodoxo de América reconoce el trasplante de órganos para elcumplimiento de pikuach nefesh (requerimiento de salvar vidas siempre que seaposible). Las principales religiones mundiales apoyan la donación de órganos y tejidos.

1994 La FDA aprueba el tacrolimus en la presentación Prograf®.

1995 El Dr. Charles Vacanti del Centro Médico de la Universidad de Massachusetts(Worcester, EE.UU.) logró injertar en un ratón una oreja previamente cultivada enlaboratorio con forma humana.

1997 Sarah Marshall fue la paciente más joven en recibir un trasplante múltiple de hígado,estómago, páncreas e intestino grueso con 6 meses de vida.

1998 Primer trasplante de mano (Dr. Earl Owen y Dr. Jean-Michel Dubernard; Lyon, Francia).

1999 La FDA aprueba la rapamicina (sirolimus).

2005 Primer trasplante facial parcial (Dr. Bernard Devauchelle y Dr. Jean-Michel Dubernard;Amiens, Francia).

2010 Primer trasplante total de rostro (Hospital Vall d'Hebron, Barcelona, España).

Legislación y éticade trasplantes

Como diría Sebastián en la verbena dela Paloma: “Hoy las ciencias adelantanque es una barbaridad”. Y afortunada-mente así ha sido en el caso de los tras-plantes de órganos en las últimas dé-cadas, lo que casi de una manerainmediata ha presentado los primerosproblemas éticos. Así, la bioética naciópor pura necesidad como consecuenciade la revolución científica y técnica ope-rada en las ciencias biosanitarias a partirde los años 50. El término bioética surgeen los años 70 de la mano del oncólogonorteamericano Van Rensselaer Potter yel obstetra de origen holandés AndréHellegers con la idea de actuar depuente en la ruptura existente entre la

cultura científica y la cultura humanís-tica. Y así trata de responder a pre-guntas que a lo largo del siglo XIX y prin-cipios del XX no se plantearon, ya que sepensaba que lo científico y técnicamentecorrecto no podía ser malo. Al igual quesucedió con la moratoria de Asilomar(península de Monterrey, California) en1975, donde se planteó un periodo deanálisis sobre los peligros biológicos po-tenciales de las moléculas de ADN re-combinado, así los propios integrantesde la comunidad médico-científicafueron planteándose los límites éticos delos trasplantes. Son muchas las disquisi-ciones que la nueva técnica de tras-plantes presenta, ya que muchos son losfactores que se ponen en juego. Porejemplo: i) no todo el mundo que nece-sita un trasplante lo obtiene en el mo-

Basada en los datos obtenidos de: New York Organ Donor Network (http://www.donatelifeny.org/all-about-transplantation/organ-transplant-history/); The Gift of a Lifetime (Fusionspark Media: http://www.organtrans-plants.org/ understanding/history/index.html); Gracia (1996) y Tilney (2000).


214

mento, como indica el Centro para laBioética de la Universidad de Minnesota(http://www.ahc.umn.edu/bioethics/); ii)¿se debe hacer todo lo que técnica-mente se puede? (Gracia, 2001); iii)¿deben poner los médicos en riesgo lavida de un donante sano para salvar omejorar la de un enfermo? (Troug,2005). A todo esto debemos sumar quede los 66.000 trasplantes de riñón, los21.000 de hígado o los 6.000 de co-razón descritos en 2005 por laOrganización Mundial de la Salud(OMS), el 10% fueron a través del "tu-rismo de trasplantes de órganos”(Biggins et al., 2009), donde paísescomo China obtienen, en gran medida,estos órganos de prisioneros ejecutados(Delmonico, 2011). Para evitar esta úl-tima situación se publicó la declaraciónde Estambul sobre tráfico de órganos yturismo de trasplantes, sumándose a lacondena que la OMS ha hecho durantedécadas e instando a la prohibición deeste tipo de comercio (The Declarationof Istanbul on Organ Trafficking andTransplant Tourism, 2008).

Cabría esperar que a todos los pro-blemas o cuestiones técnicas, metodo-lógicas y morales se pudieran unir las di-ferentes interpretaciones religiosas de ladonación o el trasplante de tejidos hu-manos. Así, se podría pensar, como dijonuestro hidalgo caballero Don Quijotede La Mancha a su inseparable Sancho:“Con la iglesia hemos topado”. Pero porcontra, actualmente las principales reli-giones aceptan la donación de órganoscomo manera de preservar la vida hu-mana. Algunas lo hacen de manera co-lectiva y en otros casos lo dejan comodecisión personal del individuo.

La evolución de la ética de los trasplantesha seguido un camino paralelo a las ne-cesidades que la técnica iba solucionandoo planteando en cada época. Así, si la di-vidimos por décadas desde los años 50,siguiendo la reflexión de Diego Gracia(2001), estas podrían ser las etapas:

• Años 50, ética de la mutilación: a raízde los primeros trasplantes se plantea laduda de hasta dónde se podía crear unmal a una persona en aras de un bienfuturo.

• Años 60, ética de la experimenta-ción: tras el éxito de los primeros tras-plantes y ante el aumento de losmismos se planteó si se estaban usandoa los humanos como cobayas.

• Años 70, ética de la donación: seplantea la problemática de la donaciónin vivo y los problemas que el comerciode órganos puede acarrear. También setratan de fijar los límites de la muertepara la donación.

• Años 80, ética de la distribución: seplantean los criterios de selección de pa-cientes ante un recurso escaso comoson los órganos.

• Años 90, ética de la organización: seve que el éxito o fracaso de los pro-gramas de trasplantes dependen sobre-manera de factores organizativos.

Aunque parece que la teoría y la prácticade los trasplantes están bastante com-pletas, en épocas venideras surgiránnuevos problemas morales que se de-berán solventar desde la visión de la éticabiomédica. La tabla 2 recoge algunos delos momentos más importantes de la his-toria de los trasplantes que se han vistorefrendados por la legislación.


215

Tabla 2. Avances legales en el campo de la donación y trasplante de órganos y tejidoshumanos.

Año Avances legales1963 La FDA publicó el nuevo reglamento para regir la experimentación de nuevos fármacos.1964 Declaración de Helsinki, estableció los requisitos éticos para los experimentos o ensayos

con seres humanos.1966 Los NIH (National Institutes of Health) y el Departamento de Salud y Bienestar (DHEW)

publicaron: Clinical Investigations Using Human Subjects, obligando a la revisión previade los protocolos de experimentación en humanos por un comité de la institución.

1971 El Department of Health, Education and Welfare (DHEW) publicó el denominadoYellow book (The Institutional Guide to DHEW Policy on Protectionn of HumanSubjects). En 1974 pasó a ser norma.

1971 Mohandas y Chou publicaron los denominados “criterios de Minnesota” estableciendocriterios para la definición de la muerte cerebral. 1976 y 1979: los Reales Colegios deMédicos del Reino Unido definen el “Código del Reino Unido”, describiendo laBrainstem Death o Clinical Death (muerte clínica). En 1981 se publica el UniformDetermination of Death Act. Con ello se define la muerte cerebral.

1972 En EE.UU. se establece la Uniform Organ Donor Card que permite a cualquiera mayorde 18 años ser donante.

1972 El congreso de los EE.UU., mediante el programa End Stage Renal Disease (ESRD),incluye el trasplante de hígado a través de Medicare (seguro social administrado por elgobierno de EE.UU.).

1979 Mediante la Ley 30/1979 se establece la “muerte cerebral” y se regula la extracción ytrasplante de órganos de forma oficial en España.

1984 La NOTA (National Organ Transplant Act, EE.UU.) establece un registro computarizadode trasplantes. Se prohíbe la compra/venta de órganos en EE.UU.

1986 El Omnibus Reconciliation Act incluye la obligación de los hospitales americanos quetraten pacientes Medicare o Medicaid a preguntar a sus familiares sobre la donación deórganos.

1989 Creación de la ONT (Organización Nacional de Trasplantes) en España.1996 Se regulan las actividades relativas a la utilización de tejidos humanos en España.1998 El Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. indica que las

organizaciones de trasplantes deben ser informadas de cada muerte hospitalaria.1999 Se regulan las actividades de obtención y utilización clínica de órganos.2001 Se regulan las buenas prácticas clínicas en la experimentación con productos clínicos

para humanos dentro de la Unión Europea.2002 Se establece la Convención de Derechos Humanos y Biomedicina en lo relativo a

trasplante de órganos y tejidos de origen humano en Europa.2009 Se aprueba el estatuto de la ONT.2010 Se publica la directiva de la UE sobre normas de calidad y seguridad de los órganos

humanos destinados al trasplante.

Basada en la información obtenida del documento Ethics of Organ Transplantation de la Universidad deMinnesota (EE.UU.); la Organización Nacional de Trasplantes de España y Gracia (2001).


216

Estado de los trasplantes enEspañaLos avances técnicos y farmacológicos hanfacilitado que el número de trasplanteshaya aumentado casi de manera exponen-cial en España en las últimas décadas.Según la ONT, durante 2010 se registraronen España 1.502 donantes reales de ór-ganos sólidos, situando la tasa por millónde población (pmp) en 32,0 (figura 1). Deestas donaciones, 210 fueron donantes enlos que desafortunadamente ningún ór-gano pudo ser finalmente utilizado, lo quepresentó una cifra de donación efectiva de1.292 y una tasa de donantes efectivospmp de 27,5. Estos datos en 2009 fueronde 206 donantes no efectivos, por lo tanto,una tasa real de donación efectiva de 29,9donantes pmp. Estas cifras de donación na-cional son las más altas del mundo, muypor encima de la Unión Europea, Estados

Unidos u otras zonas del mundo, segúnconfirmó en enero de 2011 el secretario ge-neral de Sanidad, José Martínez Olmos,siendo el español un modelo consideradocomo “ejemplo a imitar”.

En lo referente a la distribución por sexos,el 60,7% de las donaciones provienen dehombres, mientras que un 39,3% pro-ceden de mujeres. Así, el donante tipo deEspaña sería hombre con más de 45 añoscuya causa de muerte sería el accidente ce-rebrovascular. Por comunidades, la mayortasa por millón de población la presentóCantabria (44,1), seguida de La Rioja (43,8),el País Vasco (42,2) y Castilla y León (40,2),aunque esta última fue la primera en su es-fuerzo por incrementar el número de do-nantes (+18,4%). A la cola de esta tasa dedonantes se situó Extremadura (19,8),Cataluña (26,8) y Castilla-La Mancha (27,6).Si los datos se analizan por el número de

Figura 1. Número de donantes y tasa de donación (pmp: por millón de población) en España entre 1993 y 2010.(Datos obtenidos de la ONT).

1.200

1.400

1.600

1.800

1.000

800

600

400

200

0

30

35

40

50

45

25

20

15

10

5

01993 1995 1997 1999 2007200520032001 2009

Número Tasa (PMP)

1.502

32,034,434,234,333,835,134,633,833,7

32,533,933,6

31,529,0

26,827,025,0

22,6

1.6061.5771.5501.5091.5461.4951.4431.409

1.3351.3451.3341.250

1.1551.0311.037

960869


217

Figura 2. Número de trasplantes de corazón, riñón e hígado en España entre 1988 y 2010. (Datos obtenidos dela ONT).

300

350

400

250

200

150

100

50

01988 1990 1992 1994 1996 1998 2008200620042000 2002 2010

2.000

2.500

1.500

1.000

500

01988 1990 1992 1994 1996 1998 2008200620042000 2002 2010

1.000

1.200

800

600

400

200

01988 1990 1992 1994 1996 1998 2008200620042000 2002 2010

217

274

241

274294

310

341353349318

254232

164

9773

282278292287 292287290

336

2.098

2.3282.2112.1572.125

2.0321.9241.9381.996

1.861

1.4921.371

1.240

1.039873

1.7071.800

1.6331.488

2.2292.2002.1312.023

873

971

1.0991.1121.0511.0401.033

972954899

790

468412

313

170123

700698614

495

1.1081.0701.037

960

Corazón Riñón Hígado


218

donantes, el primer puesto lo ocupaAndalucía (261), seguido de Madrid (231)y Cataluña (201).

Las cifras de 2010 suponen una ruptura enla tendencia ascendente en la donación deórganos de los años anteriores, cuyas posi-bles causas son múltiples, apareciendoentre ellas la evolución descendente de lamortalidad por accidente cerebrovascular,el descenso de traumatismos craneoence-fálicos ligado a la reducción de los acci-dentes de tráfico y cambios cualitativos enlos cuidados al final de la vida.

El creciente número de donaciones hatenido su reflejo en el número de ór-

ganos trasplantados, que, como se ve enla figura 2, en el caso de corazón, riñóne hígado ha ido incrementándose paula-tinamente. Además, según los datos dela ONT, España presenta un éxito de su-pervivencia postrasplante equiparable alos existentes a nivel mundial (tabla 3).Así, hasta octubre de 2004 se habían re-alizado 35.763 trasplantes renales,11.529 trasplantes hepáticos, 4.607 tras-plantes cardiacos, 1.226 trasplantes pul-monares, 568 trasplantes pancreáticos y15 trasplantes intestinales, lo que su-maron un total de 53.708 trasplantes deórganos realizados.

Aparición de losinmunosupresores

La acumulación de avances experimen-tales y tecnológicos en el ámbito biosani-tario ha permitido llegar hasta el actualnúmero de trasplantes que exitosamentese han conseguido, llegando muchos deellos a una longevidad inimaginable haceescasamente unas décadas. Según laONT, en los años 80 se produjo un autén-tico despegue de la técnica de trasplantesinfluenciada de manera muy importante

por el uso de inmunosupresores. Estoscompuestos son sustancias que anulan oreducen (según dosis) la respuesta del sis-tema inmunitario, lo que facilita el man-tenimiento de los órganos trasplantados.La necesidad de sustancias que reprimanel sistema inmune se hizo presente desdeel momento en que se intentaron realizarhomotrasplantes o xenotrasplantes, o seaaquellos que no provenían del propio in-dividuo. Esta necesidad se fue haciendomás acuciante según los descubrimientos,como los grupos sanguíneos o el com-

Tabla 3. Mayor supervivencia postrasplante (en años) de diferentes órganos a nivelmundial y español. (Datos de la ONT, 1 de enero de 2005).

Supervivencia (años)Órgano Mundial España

Riñón 41 35

Hígado 34 19

Corazón 25 20

Páncreas 21 17

Pulmón 16 13


219

plejo de histocompatibilidad, fueron ex-poniendo las diferencias existentes entredistintos individuos, lo que mostraba queestamos lejos de ser todos iguales, inmu-nológicamente hablando.

Una vez conocido el sistema que permitíala compatibilidad entre órganos, el si-guiente paso fue evitar el rechazo, para locual en 1959 se realizó el primer trasplantede riñón entre gemelos no univitelinosprevia radiación del receptor. Tras este pro-ceso, el receptor vivió 26 años (Gracia,1996), pero en términos generales los re-sultados de la radiación no fueron la solu-ción deseada, ya que los receptores que-daban indefensos antes las infecciones.Este problema de las infecciones ha sidouna de las mayores causas iniciales de mor-talidad entre trasplantados.

La historia reciente de los trasplantes deórganos está plagada de episodios de re-chazo agudo. A raíz de la introducción denuevos agentes inmunosupresores el éxitoen los trasplantes ha llegado a ser algocomún (McPartland y Pomposelli, 2007).Actualmente, dos son los inmunosupre-sores que se vienen empleando en tras-plantes de órganos (riñón, hígado, co-razón...) para su mantenimiento: laciclosporina y el tacrolimus.

Inicialmente se utilizaron corticoides comotratamiento antirrechazo tras el tras-plante, pero estos compuestos afectan avarias líneas de leucocitos, mientras quelos inhibidores de la calcineurina, como laciclosporina y el tacrolimus, son especí-ficos sobre las células T. Asimismo, su usoha reducido los casos de rechazo y las in-fecciones secundarias provocadas por eltratamiento con corticoides (Duncan yWilkes, 2005).

Ciclosporina: orígenes y aplicaciones

En 1969 y 1970 dos especies de hongosimperfectos (o mitospóricos: se repro-ducen asexualmente) fueron aisladas demuestras de suelo de Wisconsin (EE.UU.)y Hardanger Vidda (Noruega) por cientí-ficos de la compañía Sandoz Ltd. (actual-mente Novartis). Estos hongos fueron cla-sificados como Cylindrocarpon lucidum yTolypocladium inflatum, respectivamente(Tribe, 1998). Ambos sintetizaban meta-bolitos neutros y lipofílicos con estructurade ciclopéptidos (Kürnsteiner et al.,2002). Estos compuestos presentaban unestrecho rango de actividad antifúngicaprincipalmente contra Aspergillus niger yNeurospora crassa. Las pruebas de acti-vidad inmunosupresora mostraron que setrataba de metabolitos únicos, ya que in-hibían muy selectivamente la proliferaciónde linfocitos y no la de otras células so-máticas. Asimismo, se observó que supri-mían la inmunidad mediada por células ypor anticuerpos. La mezcla inicial de me-tabolitos presentó dos compuestos: ciclos-porina A y ciclosporina B, viéndose que laprimera era mucho más activa (Tribe,1998). La estructura de ciclosporina A fueidentificada como un péptido cíclico de11 aminoácidos presentando la configu-ración en “S” de los L-aminoácidos natu-rales, con la excepción de la D-alanina dela posición 8. Siete de los aminoácidos de-mostraron estar N metilados y el presenteen la posición 1 servía para diferenciar lasciclosporinas.

Mientras el hongo C. lucidum no presentóinterés comercial debido a la baja produc-ción de ciclosporina A, T. inflatum fue de-positado en la colección de cultivos NRRL(Northern Regional Research Lab), tambiénconocida como ARS (Agricultural Research


220

Service), bajo el número de acceso 8044(=ATCC34921). Inicialmente esta especiehabía sido denominada Trichodermapolysporum, pero cuando Grams en 1971describió el género Tolypocladium a partirde un aislado en Obergurgl (Austria), pasóa denominarse Tolypocladium inflatum yeste ha sido el nombre utilizado porSandoz desde 1978 para denominar estacepa. Esta especie fue posteriormente re-clasificada en 1983 como Tolypocladiumniveum, para que posteriormente Von Arx(1986) fusionase los géneros Beauveria yTolypocladium pasando a denominarse alproductor de la ciclosporina A comoBeauveria nivea. Actualmente, la colecciónamericana de cultivos tipo (ATCC:American Type Culture Collection) man-tiene esta última nomenclatura, aunquese ha demostrado que diferentes aisladosdepositados en diferentes colecciones pre-sentan patrones que permiten diferenciarB. nivea de T. Inflatum, lo que presenta se-rias implicaciones en el ámbito de las pa-tentes (Kürnsteiner et al., 2002).

La ciclosporina fue el primer metabolitoprocedente de un microorganismo utili-zado en clínica para regular el crecimientoy la función de células de mamífero nor-males. En 1973, el mercado de los tras-plantes era demasiado pequeño y cuandoSandoz evaluó los costes que suponía laaprobación por la FDA del uso de la ciclos-porina en humanos (250 millones de dó-lares) decidió abandonar el proceso. La so-lución para proseguir venía de la mano dehallar alguna aplicación dentro de un áreade investigación ya aprobada por la FDA.Así, se probó como antiinflamatorio, yaque en los primeros test se había incluidosu administración a ratas con encefalomie-litis alérgica (en humanos, esclerosis múl-

tiple), observándose una marcada mejora.Los primeros análisis mostraron su efi-ciencia en reacciones inflamatorias me-diadas por el sistema inmune. Evitando, alcontrario de lo que sucedía con otros an-tiflogísticos, la formación de úlceras. Porello, su primera indicación fue en el trata-miento de la artritis reumatoide, auncuando sus propiedades inmunosupre-soras eran incuestionables. Finalmente, en1976 se determinó su estructura (figura3), viéndose que el segundo aminoácidoen la ciclosporina A era un alfa-amino bu-tírico mientras que en la ciclosporina B erauna alanina. En 1976, Borel y colabora-dores publicaron las características de laciclosporina: i) selectivo con los linfocitos(principalmente células T ayudadoras yefectoras); ii) suprime la repuesta inmunemediada por células y anticuerpos y la in-flamación crónica; iii) inhibe la fase de in-ducción de las células linfoides; iv) no eratóxico para los linfocitos al tener un efectoreversible; v) era efectiva en todos los ma-míferos testados (ratón, conejo, mono,perro...); vi) no presentaba efectos cardio-vasculares, psicotrópicos u otros que afec-tasen su efectividad en humanos. Comocasi cualquier nuevo compuesto, en los es-tudios iniciales comenzó a mostrar al-gunos efectos secundarios, como disfun-ciones hepáticas, que se redujerondisminuyendo la dosis y combinándolacon esteroides (Tribe, 1998; Heusler yPletscher, 2001). Finalmente, la ciclospo-rina fue aprobada por la FDA en 1983 ysalió al mercado comercializada porSandoz como Sandimmun®. Trece añosdespués, en 1996, 200.000 trasplantadosutilizaban la ciclosporina. Actualmente sepueden encontrar diferentes formula-ciones y proveedores de la ciclosporina.


221

Así, en España existen al menos 15 formu-laciones diferentes (desde 25 a 100 mg),tanto en cápsulas como en solución, de di-ferentes fabricantes (p. ej.: CantabriaPharma SL, Germed Pharma).

En definitiva, el descubrimiento de la ci-closporina supuso un hito en el avancedel tratamiento postrasplante, facilitandola supervivencia de muchos de los ór-ganos trasplantados.

Tacrolimus: el relevo generacional

La importancia de la ciclosporina es inne-gable como primer fármaco antirrechazo,permitiendo la disminución de fallos pos-trasplante, rechazo agudo e infección sis-témica. A pesar de ello, según su uso sefue generalizando se detectaron efectossecundarios que debían tenerse encuenta. Así, Patel y Kobashigawa en 2004revisaron los efectos colaterales descritospara la ciclosporina tras 20 años de expe-riencia en trasplantes cardiacos: i) hiper-tensión; ii) hiperlipemia; iii) infecciones;iv) riesgo de cáncer; v) efectos sobre el

sistema nervioso central; vi) hipertricosis;vii) hepatotoxicidad; viii) efectos sobre lamédula ósea; ix) nefrotoxicidad. Aun así,nuevas dosificaciones y sistemas de apli-cación más eficaces han permitido reducirlos efectos secundarios de la ciclosporina(Patel y Kobashigawa, 2004).

Estos efectos adyacentes, y posiblementeel hecho del pujante éxito en el mercadode la ciclosporina, hicieron que comen-zase una búsqueda de nuevos com-puestos inmunosupresores procedentesde otros microorganismos. Se buscabaque estos presentasen menores efectos

Figura 3. Estructura de la ciclosporina descrita por Sandoz en 1976.

H3CH3C

H3CH3C

H3C

H3C

H3CH3C

H3CH3C

CH3

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3

CH3

O O O

O

O O O

O O

O OHO

HN

HN

HN

HN N

N

NN N N

N


222

secundarios y un mayor efecto inmuno-supresor. En los análisis de producción deciclosporina se había observado que estainhibía la generación de células T citotó-xicas y liberación de las linfoquinas de lascélulas T-ayudadoras, especialmente la in-terleucina 2 (IL2), la cual sirve de factorde crecimiento de las células T. Por ello,la búsqueda de nuevos inmunosupre-sores se realizó mediante la denominada“reacción de linfocitos mezclados” (MLR:mixed lymphocyte reaction), la cual co-rrelaciona in vitro el rechazo a alotras-plantes con una reacción dependiente deIL2. De esta manera se testaron las mues-tras de los caldos de cultivo de miles demicroorganismos aislados del suelo.Como resultado se descubrió una cepa,denominada 9993, que producía un po-tente inmunosupresor. Dicha cepa, queprovenía de un aislado obtenido deTsukuba (Prefectura de Ibaraki, Japón), re-sultó pertenecer al género Streptomyces y

de ahí el nombre de Streptomyces tsuku-baensis (figura 4). El género Streptomycesse encuadra dentro de las actinobacteriasy está compuesto por bacterias Gram po-sitivas cuyo genoma presenta un alto con-tenido en G+C (guanina y citosina). Dichogénero es el mayor productor de com-puestos de interés industrial (Olano et al.,2008), muy por encima de los hongos, porlo cual no era de extrañar que entre su ba-tería de compuestos se encontrase algunocon efecto inmunosupresor. Y así fuecómo en 1984 un caldo de S. tsukuba-ensis presentó un claro resultado positivoen los test MLR sin inhibir la proliferaciónconstitutiva de las células. Este compuestoque inicialmente fue denominadoFR900506 (FK 506), posteriormente tam-bién se llamó fujimicina o tacrolimus(Tsukuba Macrolide Inmunossupresant)(Kino y Goto, 1993; Wallemacq y Reding,1993).

Figura 4. Micrografías de S. tsukubaensis. A) Colonias de S. tsukubaensis en medio ISP4. B) Micrografía electró-nica de barrido. Fotos cedidas por M. Martínez-Castro (Instituto de Biotecnología de León-INBIOTEC).

A B


223

La búsqueda de este compuesto se rea-lizó por la empresa farmacéutica japo-nesa Fujisawa Pharmaceutical Co. (desde2004 denominada Astellas Pharma Inc.,tras la fusión entre Yamanouchi yFujisawa) (Kino et al., 1987a, 1987b;Kino y Goto, 1993). Este compuesto, pro-ducido por especies filogenéticamente di-

ferentes del género Streptomyces (Garrityet al., 1993), fue el primer inmunosu-presor macrólido descubierto. Poste-riormente, se han descubierto varias mo-léculas similares en estructura y función,como la rapamicina (sirolimus) y la asco-micina (FK520 o FR 900520), entre otros(figura 5).

La estructura de FK-506 fue deducidamediante degradación química, estudiosde espectroscopía y cristalografía derayos X. Finalmente se vio que era unanueva clase de macrólido lactona, cuyoanillo consta de 23 miembros (figura 5),cuyo análogo más próximo, cuando sedescubrió, era la rapamicina (sirolimus).Este último compuesto fue inicialmentedescrito como un antifúngico producidopor Streptomyces, pero posteriormentetambién se describió su actividad inmu-nosupresora, aunque con diferente me-canismo de acción. A pesar de presentardiferentes estructuras (figuras 3 y 5), eltacrolimus y la ciclosporina poseen lapropiedad de inhibir los linfocitos T.

Diferentes análogos relacionados estruc-turalmente con el tacrolimus fueron ini-cialmente aislados por los investigadoresde Fujisawa: i) metil- (FR900425); ii) etil-(FR900520); iii) prolina- (FR900525),pero el más activo fue el tacrolimus (FK-506) (Kino y Goto, 1993). La ascomicina,por su parte, es un compuesto práctica-mente idéntico con una única diferenciaen el carbono 21, donde el tacrolimuspresenta una cadena lateral alilo(-CH=CH2) y la ascomicina una cadenaetilo (-CH2-CH3), mientras que la rapa-micina, de estructura menos similar, estácompuesta por un anillo de 31 átomoscon tres enlaces dobles conjugados(Reynolds y Demain, 1997).

Figura 5. Estructura química del tacrolimus y otros macrólidos inmunosupresores. La ascomicina solo difiere deltacrolimus en la cadena lateral del carbono 21 (indicado con un óvalo) mientras que la rapamicina (sirolimus) pre-senta una estructura más diferente.

HO

HON N

OH

OCH3 OCH3

CH3

CH3

CH2CH3

H3C

CH3O

CH3

O

OO

O

O

O

HO

HO

OH

OCH3 OCH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3O

CH3

O

OO

O

O

O

N

HO

HO

HOOCH3

OCH3CH3CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3O

H3C

O

OO

O O

O

O

Tacrolimus Ascomicina Rapamicina


224

Aplicaciones de tacrolimus

En los últimos años, el uso de la ciclospo-rina A ha disminuido en favor del tacro-limus debido a la menor toxicidad y espe-cialmente a la mayor efectividad de esteúltimo (Gummert et al., 1999; Meier-Kriesche et al., 2006) (figura 6). El tacro-limus presenta una actividad entre 100 y200 veces superior a la descrita para la ci-closporina A en la supresión de la res-puesta inmune (Ochiai et al., 1987;Sawada et al., 1987) y reduce en gran me-dida los efectos metabólicos adversos quela ciclosporina produce en el organismo(Mor et al., 1997). También puede utili-zarse para el tratamiento del rechazo aaloinjertos cuando otros medicamentos noson eficaces como inmunosupresores (Pately Kobashigawa, 2007), otros fármacos es-teroides (Westhoff y Van der Giet, 2007),antirreumáticos (Kitahara y Kawai, 2007)o inmunomoduladores en inflamacionesintestinales (Chow y Leong, 2007).Durante más de una década, el tacrolimusse ha comercializado por la compañíaAstellas Pharma bajo la marca comercialPrograf® (adultos) Advagraf® (adultos, deliberación más lenta que Prograf®) yModigraf® (niños) (www.emea.europa.eu).Actualmente otras compañías han apare-cido en el mercado debido a la expiraciónde las patentes, como es el caso de Sandozdesde 2009, o Watson Laboratories, Inc.,Mylan Pharma y Dr Reddys Labs LTD desde2010 (www.fda.gov).

Los inhibidores de la calcineurina tambiénson efectivos como pomada para uso tó-pico en el tratamiento de la dermatitisatópica (Koo et al., 2005; Ingram et al.,2009), seborreica o la balanitis de Zoon(Rallis et al., 2007). El tacrolimus se co-mercializa en formato pomada bajo el

nombre de Protopic® y la ascomicinacomo Pimecrolimus®. Además, estos com-puestos presentan una potente actividadantifúngica, lo que sugiere un papel en lanaturaleza como inhibidores de microor-ganismos competidores de la especie deStreptomyces que los produce (Arndt etal., 1999).

El tacrolimus presenta un amplio rango deaplicaciones, especialmente en enferme-dades autoinmunes. Aunque estos usosaún se encuentran en fase experimental,actualmente se ha probado la eficacia y se-guridad en el tratamiento de la artritis reu-matoide (Akimoto et al., 2008) y tambiénse han obtenido buenos resultados en eltratamiento de la colitis ulcerosa, la enfer-medad de Crohn y otras enfermedades au-toinmunes. También se ha descrito su po-sible aplicación como antiviral en cultivoscelulares infectados con ortopoxvirus (Reiset al., 2006). Estos resultados aún debenser confirmados con estudios clínicos másamplios (Benson et al., 2008).

Los agentes inmunosupresores, como el ta-crolimus y la rapamicina, también pre-sentan propiedades antimitóticas, antico-agulantes y antiinflamatorias, lo quepermite su uso en stents, dispositivos me-tálicos colocados en arterias coronariaspara evitar su obstrucción (Romano et al.,2010). La neurorregeneración y la neuro-protección son otras de las propiedadesque presenta el tacrolimus, por lo que po-dría ser efectivo en el tratamiento de tras-tornos neurodegenerativos como la enfer-medad de Parkinson (Guo et al., 2001).Todas estas posibles nuevas aplicacionesestán siendo cuidadosamente analizadaspara valorar los riesgos y ventajas de las te-rapias con tacrolimus, ya que el trata-miento con este compuesto presenta


225

efectos secundarios, como nefrotoxicidado hipertensión, que hay que valorar (Bai etal., 2010).

En el caso de la clínica veterinaria, el ta-crolimus se utiliza para el tratamiento dela queratoconjuntivitis Sicca, la cual se ca-racteriza por el enrojecimiento e inflama-ción de la conjuntiva debido a una ca-rencia de lágrimas (Hendrix et al., 2011).

Biosíntesis del inmunosupresortacrolimus

La ruta de biosíntesis de tacrolimus es si-milar a la de otros policétidos macrólidos

descritos hasta el momento, como la eri-tromicina (Cortes et al., 1990) o la rapa-micina (Schwecke et al., 1995), y sigueun mecanismo similar a la síntesis deácidos grasos. Dicha ruta consiste en unacondensación secuencial de ácidos car-boxílicos de cadena corta (normalmente2-4 átomos de carbono), activados enforma de ésteres de coenzima A (CoA).Esta síntesis implica complejos sistemasenzimáticos conocidos como policétidosintasas codificados por genes de ta-maños superiores a 20 kb (kilopares debases). La síntesis de los inmunosupre-

Figura 6. Evolución del empleo de los inmunosupresores (ciclosporina y tacrolimus) en trasplantes de órganos. A) Tendencia en el tratamiento para el mantenimiento de la inmunosupresión en trasplantes de hígado. B)Empleo de inhibidores de calcineurina expresados por órgano trasplantado en 2004 (modificado de: Meier-Kriesche et al., 2006).

80

100

60

40

20

01995 1996 1997 1998 1999 2004200320022000 2001

Tacrolimus

% P

acie

ntes

% P

acie

ntes

Año

75

100

50

25

0Riñón Hígado Intestino Corazón Pulmón Corazón

y pulmónPáncreas Páncreas

tras riñónPáncreasy riñón

Ciclosporina

A

B


226

sores tacrolimus, rapamicina y ascomi-cina es llevada a cabo por sistemas hí-bridos de policétido sintasas (PKS: poly-ketide synthases)/sintasas de péptidos noribosomales (NRPS: nonribosomal pep-tide synthases).

La unidad iniciadora en la biosíntesis de ta-crolimus es dihidrociclohexil carbonil CoA,un derivado del ácido siquímico (precursorde los aminoácidos aromáticos). Las uni-dades que van a constituir el esqueleto car-bonado comprenden 2 moléculas de ma-lonil-CoA (pasos 3 y 10), 5 moléculas demetilmalonil-CoA (pasos 1, 2, 5, 6 y 9), 2

moléculas de metoximalonil-CoA (pasos 7y 8) y una molécula de 5 átomos de car-bono (propilmalonil-CoA o alilmalonil-CoA)(paso 4). En la biosíntesis de la ascomicinase ha descrito que la unidad que se incor-pora en el paso 4 es etilmalonil-CoA; dichaunidad supondrá la diferencia con la mo-lécula de tacrolimus. Tras 10 rondas decondensación, una molécula de pipecolato(derivado del metabolismo de la lisina) seune a la cadena mediante la formación deun enlace amida con un grupo acilo se-guido de la ciclación de la cadena for-mando el anillo macrólido. Dicho anillo

Figura 7. Ruta de biosíntesis de tacrolimus. Las flechas que aparecen en la parte superior representan las policé-tido sintasas y los rectángulos marcan los módulos (Mod.) de los que se componen cada policétido sintasa. Losdiferentes dominios catalíticos se representan con círculos: ACP, proteína transportadora de grupos acilo; AT, aciltransferasa; CAS, CoA-sintasa; DH, deshidratasa; ER, enoil-reductasa; KR, oxoacil-reductasa; KS, oxoacil-sintasa.La cadena policetídica aparece en diferentes colores dependiendo de la policétido sintasa que está implicada (rosaFkbB, verde FkbC y azul FkbA), la unidad iniciadora se representa en negro y en naranja el ácido pipecólico. Enla parte inferior izquierda se recoge la estructura completa del tacrolimus con las diferentes modificaciones pos-policétido sintasa. Algunos de los genes implicados en la biosíntesis de tacrolimus se representan con flechas an-chas marcando la función que desempeñan. (Tomado de Martínez Castro, 2011; modificado de Motamedi yShafiee, 1998).

ACPCAS ER ACPKS AT

DH KR DH DHKR DH KR

ACPKS AT

KR

ACPKS AT

KR

ACPKS ATACPKS AT ACPKS AT

DHER

KR

ACPKS AT

DHER

KR

ACPKS AT

DHER

KR

ACPKS AT ACPKS AT

Módulo deiniciación Mód. 1 Mód. 2 Mód. 3 Mód. 4 Mód. 5 Mód. 6 Mód. 7 Mód. 8 Mód. 9 Mód. 10

fkbB fkbC fkbA

SO

HO OH

S S S S S S S S S S SO26O O18

HO OH

H

HO OH

H

OH26

O O O

O

HO OH

H

OH26

HO OH

H

OH

OH26

21

HO OH

H

OH O

OH26

21

HO OH

H

OH

O

18

O

OH26

21

HO OH

H

OH

18

14

14

O O

O

OH26

21

HO OH

H

OH

18

O

OH26

21

HO OH

H

OH

OH

14

10 O

O

OH26

21

HO OH

H

OH

OH

14

10

8

O

O

O

OH26

21

HO OH

H

OH

OH

ácidosiquímico

O-Metilación

HidroxilaciónOxidación

fkbM

fkbD

fkbO

fkb

L

3234

29

2724

21 20

31

30

HO

H3CO CH3 CH2

HO OCH3

CH3

176

2

H3CO

OCH3

OH

H3C

O

O

OO

1514

1311

9O

N

fkbP

Lisina

+O

N

O

N

S

S

14

10

8

O

O

O

OH26

21

HO OH

H

OH

OH


227

sufre diferentes modificaciones pospolicé-tido sintasa: el carbono 9 es hidroxilado yoxidado dando lugar a la configuración ·cetoamida y el grupo hidroxilo presente enel carbono 31 es metilado (Motamedi etal., 1997; Wu et al., 2000; Goranovic et al.,2010).

Especies productoras de tacrolimusdentro del género Streptomyces

El descubrimiento de S. tsukubaensis comoproductor de tacrolimus supuso un boomen la búsqueda de nuevas cepas deStreptomyces productoras que todavíacontinúa en nuestros días. Esto ha hechoque hayan aparecido una o dos nuevas es-pecies de “supuestos” Streptomyces pro-ductores de tacrolimus cada año durantela última década (tabla 4). Muchas de estasespecies son de compañías o centros queno las ceden para investigación ni las depo-sitan en colecciones, por lo que es prácti-camente imposible verificar su producción.

Uno de nuestros más grandes cómicos,Paco Martínez Soria, protagonizó en 1969la comedia “Se armó el belén”. Este seríael título que actualmente mejor definiría lasituación de muchos de estos supuestosproductores de tacrolimus. Aun así, se hanrealizado diferentes estudios taxonómicoscon el objetivo de profundizar en la rela-ción entre estas cepas, poniendo de mani-fiesto la gran lejanía filogenética entre lasmisma. Esto sugiere la transferencia hori-zontal de genes como explicación a queestas cepas compartan rutas de biosíntesissimilares (Garrity et al., 1993; Muramatsuet al., 2005).

Mecanismo de acción de losinmunosupresores

El mecanismo de acción de estos com-puestos inmunosupresores se basa en elbloqueo de la actividad de los linfocitos T.Aunque químicamente no están relacio-nados, el tacrolimus y la ciclosporina A

Tabla 4. Especies del género Streptomyces productoras de compuestos inmunosupresoresutilizados en trasplantes de órganos (modificado de Martínez-Castro, 2011).

Inmunosupresor Sinónimo Productor

S. tsukubaensisStreptomyces sp. ATCC 55098 (MA 6858)

Streptomyces sp. ATCC 53770 (MA 6548)

Tacrolimus FK506 Streptomyces sp. MA 6949

Fujimicina Streptomyces kanamiceticus KCC-S0436

Streptomyces glaucescensStreptomyces clavuligerus CKD 1119

Ascomicina FK520 Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensisFR9520 S. tsukubaensisInmunomicina Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus

Streptomyces tubercidicus

Rapamicina Sirolimus Streptomyces hygroscopicus

Everolimus Derivado de la rapamicina Streptomyces hygroscopicus


228

ejercen su efecto de manera muy similarmediante la inactivación de la calcineurina(Wiederrecht et al., 1993), mientras que larapamicina, compuesto macrólido similarestructuralmente al tacrolimus, bloqueauna ruta diferente de activación de los lin-focitos T, el conocido como sistema mTOR(mammalian target of rapamycin) (Neuhauset al., 2001).

El tacrolimus o FK506 difunde a través dela membrana plasmática de las célulasT (figura 8), uniéndose en el interior cito-plasmático a una proteína denominada in-munofilina FKBP12 (FK506-binding pro-tein-12kDa) (Siekierka et al., 1989). Laciclosporina A actúa de manera similaruniéndose a una inmunofilina denominadaciclofilina (CpN). Los complejos formadospor los fármacos inmunosupresores y lasinmunofilinas bloquean la función de lacalcineurina, una serina/treonina fosfatasa

dependiente de calcio, impidiendo su ac-ceso y desfosforilación a determinados sus-tratos (Clipstone y Crabtree, 1992), comoel NF-AT (nuclear factors of activatedT cells). Si la fracción citosplasmática delNF-AT no es desfosforilada no puede ac-ceder al núcleo donde se uniría a la fracciónnuclear formando el complejo activo deeste factor transcripcional. Entre los genesregulados por los factores NF-AT, se en-cuentran genes que se requieren para la ac-tivación de las células B, como la interleu-cina 4 (IL-4) y el ligando CD40 y genesimplicados en la proliferación de las célulasT, como la interleucina 2 (IL-2). Por lo tanto,la presencia de los fármacos inmunosupre-sores en las células T origina una depresiónen el sistema inmune, evitando así el re-chazo al órgano trasplantado (Ho et al.,1996; Dumont, 2000).

Figura 8. Mecanismo de acción del tacrolimus. Obsérvese cómo la unión del tacrolimus a la proteína de unión ci-tosólica FKBP12 crea un complejo que impide la acción de la calcineurina-fosfatasa dependiente de calcio, la cualimposibilita al factor nuclear de las células T activadas (NF-AT) penetrar en el núcleo y activar la producción de ci-toquinas (modificado de Dé Tran et al., 2001).


229

Beneficios económicos generados porlos inmunosupresores

EvaluatePharma® (http://www.evaluate-pharma.com) es la página web dedicada asuministrar información sobre empresas delsector farmacéutico y biotecnológico, asícomo de sus productos. En ella se puedeseguir la evolución de los distintos pro-ductos prescritos en clínica. Basándonos ensus datos podemos ver cómo se encuentraactualmente el mercado de los inmunosu-presores. Estos compuestos incrementaronsus ventas un 8% en 2010 con respecto al2009. En términos económicos, el tacro-limus en su formulación Prograf® fue el in-

munosupresor más vendido, generando susventas 1.826 millones de dólares, lo que su-pone un 29% del mercado mundial de in-munosupresores (figura 9) y 585 millonesmás de beneficios que el compuesto si-tuado en segundo lugar.

Actualmente existen 1.605 sustancias oformulaciones inmunosupresoras en elmercado según EvaluatePharma®. Estenúmero se prevé que siga aumentandoya que hay dos nuevos inmunosupre-sores listos para salir al mercado, dos enfase clínica III, cinco en fase clínica II,cinco en fase clínica I y once en fase pre-clínica.

Figura 9. Ventas de inmunosupresores a nivel mundial. Superior: tabla de beneficios de los 5 inmunosupresoresmás vendidos entre 2008 y 2010, indicándose la marca comercial, compuesto, compañía productora y benefi-cios generados en millones de dólares y en porcentaje. Inferior: representación de los porcentajes de ventas delos inmunosupresores en 2010. Datos obtenidos de EvaluatePharma® (http://www.evaluatepharma.com).

Otros 24% Prograf® 29%

Stelara® 6%

Myfortic® 7%

Neoral® 14%CellCept® 20%

Inmunosupresores (2010)

Ventas por años (mill. $) Porcentaje

Posición Marca Compuesto Compañía 2008 2009 2010 2008 2009 2010

1 Prograf® Tacrolimus Astellas Pharma 1.882 1.945 1.826 31% 33% 29%2 CellCept® Micofenolato mofetil Roche 1.942 1.455 1.241 32% 25% 20%3 Neoral® Ciclosporine Novartis 956 919 871 16% 16% 14%4 Myfortic® Ácido micophenólico Novartis 290 353 444 5% 6% 7%5 Stelara® Ustekinumab Johnson & Johnson - 33 393 - 1% 6%

Otros 1.037 1.117 1.518 17% 19% 24%Total 6.107 5.823 6.293


230

Nuevas tendenciasHaddad y colaboradores (2006), en un es-tudio sobre pacientes trasplantados de hí-gado, comparaban la eficiencia de la ciclos-porina versus tacrolimus concluyendo que:“el tacrolimus es superior a la ciclosporinatras el trasplante de hígado, pero estos pa-cientes deben tener controlado el desarrollode diabetes”. Asimismo, recomiendan quese realice más investigación para disociar losefectos no deseables de estos inhibidoresde la calcineurina de su beneficioso efectoinmunosupresor. El tacrolimus a veces esutilizado solamente con pacientes en esta-dios severos de enfermedad o hipersensi-bles a otros tratamientos debido a susefectos colaterales (disfunción renal, efectosgastrointestinales, neurológicos, hipertri-cosis o hiperplasia gingival). Tratamientosprolongados con este compuesto requierenun estricto seguimiento terapéutico debidoa su estrecho índice terapéutico (medida delmargen de seguridad de un medicamento)y a la gran variabilidad entre individuos, quepuede llevar a daños debido a sobre o in-fradosis (Roy et al., 2006). Esto se debe asu baja biodisponibilidad (fracción de ladosis administrada que alcanza su diana),que acarrea una variable exposición sisté-mica cuando se dosifica oralmente, lo quea veces requiere su aplicación intravenosa(Tamura et al., 2003). Por ello, la investiga-ción en análogos que permitan mejorar labiodisponibilidad oral, que reduzcan la to-xicidad sistémica debida a la incorrecta do-sificación y faciliten la administración orales de gran interés (Borris et al., 1990; Mosset al., 2010). Esta investigación debe ir en-caminada a explorar diferentes perfiles far-macocinéticos e interacciones entre com-puestos para la mayor supervivencia delpaciente y del órgano trasplantado, con los

menores efectos secundarios (Haddad etal., 2006).

La figura 7 muestra la biosíntesis del tacro-limus, en la cual grandes genes denomi-nados policétido sintasas (PKS) presentanvarios módulos que realizan la incorpora-ción de las diferentes precursoras que con-forman la molécula. La modificación deestos módulos, de los genes que realizanlas modificaciones post-PKS (p. ej: fkbO, fi-gura 6), el reemplazamiento de los genesque inician el proceso para que utilicenotras moléculas precursoras o inclusive eluso de moléculas iniciadoras no naturalesson soluciones que se están aplicado paraobtener moléculas con propiedades farma-cocinéticas mejoradas (Moss et al., 2010).Para poder realizar estas modificaciones esnecesario poseer un conocimiento muy de-tallado de los procesos de síntesis de los in-munosupresores. Esto se consigue me-diante la obtención de la secuenciacompleta de las agrupaciones de genes im-plicadas en la síntesis e inclusive de los ge-nomas de los microorganismos produc-tores, como ha sucedido con el genomade S. tsukubaensis (Barreiro et al., 2012).Con la llegada de los nuevos sistemas desecuenciación ultrarrápida, como 454 lifes-cience® (Roche), Solexa® (Illumina), IonTorrent® (Applied Biosystems), se han po-dido obtener genomas completos en unospocos días. Aunque actualmente el cuellode botella se encuentra en el editado dedichos genomas, la actual velocidad de ob-tención de secuencia génica está abriendola puerta a la aplicación de otras ómicas.Este neologismo engloba a aquellas áreasde la biología molecular que estudian losconstituyentes de esa área de manera co-lectiva, como puede ser la Proteómica, queestudia el conjunto de las proteínas gene-


231

radas por un genoma en un tiempo y con-diciones concretas. Así, la Proteómica,Transcriptómica, Lipidómica o Metaboló-mica (Greenbaum et al., 2001) facilitan lasíntesis de nuevos análogos con mejorescaracterísticas funcionales. En el caso delinmunosupresor rapamicina (sirolimus, fi-gura 5) producida por Streptomyces hy-groscopicus ha aparecido una batería dederivados con diferentes propiedadescomo antitumorales o inmunosupresores.Así el temsirolimus, comercializado comoTorisel® (Wyeth Pharmaceuticals), es unéster soluble de la rapamicina de recienteaprobación por la FDA que presenta acti-vidad contra los carcinomas renales avan-zados. Otros análogos de la rapamicina seencuentran en fase III o han sido apro-bados para determinados usos (Rini, 2008).El everolimus producido por Novartis[marca comercial: Zortress® (EE.UU.),Certican® (Europa y otros países) para tras-plantes y Afinitor® para oncología] ha sidorecientemente aprobado para su uso encáncer de riñón (marzo de 2010), preven-ción de rechazo en trasplante renal (abrilde 2010) o metástasis progresiva en tu-mores neuroendocrinos de páncreas (mayode 2011) y se encuentra en fase III en otrostipos de cáncer. El ridaforolimus (AP23573,MK-8669 o deforolimus) desarrollado porMerck y Ariad Pharmaceuticals ha supe-rado la fase III en junio de 2011 para me-tástasis de tejidos blandos y sarcomas dehueso. El zotarolimus (ABT-578), un deri-vado sintético de la rapamicina diseñadopara su uso en stents producido porMedtronic, Inc. bajo el nombre deEndeavor®, se comercializa desde 2008.Igualmente el umirolimus (biolimus o bio-limus A9) es un derivado altamente hidro-fóbico de la rapamicina utilizado también

para recubrir stents propiedad de Biosen-sors International.

Por otra parte, la mejora en la eficacia delos inmunosupresores también se puedelograr a través de la dosificación. Actual-mente, los médicos disponen de un com-pleto arsenal de sustancias inmunosupre-soras. Obviamente cada uno de estoscompuestos, como hemos visto a lo largodel capítulo, presenta una serie de efectossecundarios que en muchos casos acarreanenfermedades cardiovasculares. Esto esalgo que también se tiene en cuenta a lahora de dosificar inmunosupresores. Portodo ello, la monitorización de los fármacos(TDM: Therapeutic Drugs Monitoring), queasegure el mantenimiento de los nivelesplasmáticos correctos de los inmunosupre-sores dentro de sus rangos terapéuticos, lle-vará a la inmunosupresión individual, lo queprevendrá la sobre e infradosificación(Sprangers et al., 2011), aunque esto ac-tualmente no es completamente posibledebido a varias razones: i) no existen testfiables que permitan predecir el estado in-munológico del paciente; ii) no se ha esta-blecido plenamente la contribución de cadainmunosupresor a las diferentes complica-ciones producidas; iii) no existen pruebassuficientemente representativas para la su-presión del uso de determinados inmuno-supresores comerciales (Sprangers et al.,2011).

Por tanto, se puede concluir que la evo-lución en el trasplante de órganos y sumantenimiento es el resultado de la acu-mulación de diferentes conocimientos.Entre ellos, el descubrimiento de los com-puestos inmunosupresores, que ha su-puesto un importante avance sobre el quese debe seguir investigando desde todaslas ramas biosanitarias.


232

AgradecimientosQuiero agradecer al grupo de Streptomycesespecializado en tacrolimus de INBIOTEC(Instituto de Biotecnología de León), espe-cialmente a mi colaboradora, Dra. MiriamMartínez-Castro.

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6 Leon 15 DICIEMBRE 368.qxd 17/12/12 13:05 Página 236

Introducción: tecnología ybiología molecularSegún defiende el físico Freeman Dyson(Dyson, 2001), el desarrollo de nuevastecnologías es el principal motor del pro-greso científico. Un ejemplo clásico es lautilización del telescopio por Galileo, quele permite descubrir montañas en la luna,nuevas estrellas, satélites en torno aJúpiter, etc. Gracias a estos descubri-mientos y por medio del razonamiento in-ductivo, Galileo argumenta a favor de lateoría copernicana e inicia la era de la fí-sica moderna. Sin embargo, el impacto delas innovaciones tecnológicas es más pa-tente en las modernas ciencias biológicas.Si la biología molecular se concibe comoel estudio de la estructura, replicación yexpresión de los genes y de la estructura,interacción y función de los productos gé-nicos, este estudio ha sido posible graciasa las técnicas usadas para identificar, aislary estudiar el ADN, el ARN y las proteínas.Por medio de la clonación, hibridación deácidos nucleicos, secuenciación del ADNy reacción en cadena de la polimerasa(PCR), además del análisis funcional gé-nico, se ha podido determinar la se-cuencia de genomas completos. En esteaspecto, la tecnología de micromatricesofrece la posibilidad de interrogar sobrela actividad de todo el genoma.

Inicialmente, el estudio de la expresión gé-nica se ha basado en el principio de hibri-

dación específica entre moléculas de ácidosnucleicos con secuencias complementarias.Este fenómeno se utilizó en primer lugarpara la detección de fragmentos de ADNseparados electroforéticamente en gelesde agarosa por medio de la hibridación conuna sonda complementaria. La sonda co-rrespondía a la secuencia de estudio y es-taba marcada radiactivamente (Southern,1975). El mismo fundamento fue aplicadopara el análisis de los transcritos de unúnico gen, la denominada habitualmentecomo técnica Northern (Alwine y col.,1977). En esta técnica, las moléculas deARN diana se fijan a un filtro de nailon des-pués de una electroforesis en gel de aga-rosa que las separa por tamaño. La sondade ADN corresponde a un fragmento delgen de estudio y está marcada con un isó-topo radiactivo o químicamente. Tras la hi-bridación, la señal proporcionada por lasonda del gen de estudio permite detectarel tamaño del ARN mensajero y cuantificarla transcripción en el momento de la ex-tracción de la muestra.

Con el desarrollo de la tecnología de mi-cromatrices se puede analizar en un ex-perimento la transcripción, no de unúnico gen, sino de todo el genoma de unorganismo. Micromatrices de ADN (o mi-croarreglos, más frecuente en la literaturaamericana) es el término castellano paralos denominados microarrays (del griegomikro, pequeño, y del francés arayer, a suvez del latín arredrare, arreglar) o DNA

Aplicaciones de la tecnología demicroarrays o micromatricesDr. Antonio Rodríguez García


chips. Las micromatrices permiten la me-dición simultánea de la transcripción decientos, miles o de todos los genes de unorganismo. Una vez que, hoy en día ycada vez más, se dispone de la secuenciagenómica de miles de organismos, las mi-cromatrices constituyen una herramientafundamental de la genómica funcional.

Además de aumentar el conocimiento dela función génica, la tecnología de las mi-cromatrices, junto con otras técnicasómicas, colabora a la revolución en la quese bate la biología molecular, una revolu-ción en el abordaje del estudio de la vida.Durante los años 80 y 90, la biología mo-lecular se preocupó principalmente del es-tudio de la función biológica de genes yde proteínas considerados individual-mente. Este enfoque reduccionista se en-frenta a la visión del organismo biológicocomo un sistema. No cabe duda de queel funcionamiento biológico surge de lasinteracciones entre los genes, sus pro-ductos y el ambiente celular. La descrip-ción matemática de las redes reguladorasy de las interacciones entre genes y pro-ductos, esto es, la biología de sistemas, esel futuro del estudio de la vida y necesitadel inventario lo más completo posible delos componentes moleculares en un mo-mento o estado del sistema.

Desarrollo histórico de latecnología de micromatricesDurante los años 90 se desarrollaron enparalelo dos tecnologías de micromatrices.La primera tecnología en lograr la publica-ción de un análisis de expresión génica fuela tecnología de matrices impresas de ADNcomplementario (cDNA microarrays). Estatecnología fue desarrollada en el labora-

torio de Patrick Brown en la Universidadde Stanford. Consiste en la impresión declones de ADN complementario (ADNc)sobre un cristal del tamaño de un porta-objetos de los usados en microscopía. Seobtiene una matriz ordenada de pequeñaszonas circulares o puntos que contienenlas moléculas de ADN depositadas sobreel cristal (spotted microarrays). Dos mues-tras de ARN se marcan con sendos fluoró-foros y se hibridan simultáneamente sobreuna misma micromatriz para comparar laabundancia de transcritos entre ambas(genotipo control y mutante, por ejemplo).El uso de dos fluoróforos es característico(two-color microarrays o micromatrices dedos colores). En el primer ensayo se ana-lizó la expresión diferencial de 45 genesde Arabidopsis (Schena y col., 1996). Estatecnología se hizo accesible a laboratoriosde cierto tamaño y abrió la posibilidad delestudio masivo (high throughput) de la ex-presión génica en muchas áreas de la in-vestigación biomédica aun cuando la se-cuenciación de genomas completosestaba iniciándose. Ya en 1997, Lashkariy col. publican el primer trabajo propia-mente genómico con el análisis de la ex-presión génica de 2.479 genes de la leva-dura Saccharomyces cerevisiae. En estecaso utilizaron como ADN sondas pro-ductos de PCR en vez de clones de ADNc.

La segunda tecnología también se desa-rrolló en California y no por casualidad,ya que aplicaba los procedimientos parala fabricación de microprocesadores delvecino Silicon Valley para la síntesis foto-litográfica de oligonucleótidos sobrecristal (Fodor y col., 1991, 1993). Se nece-sita un equipamiento industrial caro y so-fisticado, y por ello este método de fabri-cación no es accesible a un laboratorio


238


universitario. De hecho, su desarollo estáasociado a la empresa Affymetrix, que,desde entonces, es referente mundial y fa-brica y comercializa las micromatrices deoligonucleótidos con la marca GeneChip®.El primer análisis de la expresión génicautilizando esta tecnología se publicó en1996 (Lockhart y col.).

En los primeros años del siglo XXI la tec-nología de micromatrices se pone demoda por lo que promete en el campo delas investigaciones científicas y de las apli-caciones médicas y biotecnológicas. Estaexpansión del uso de las micromatrices semanifiesta en el crecimiento rápido delnúmero de publicaciones que contienenlos términos microarray y gene en la Webof Knowledge (el último término de bús-queda sirve para descartar artículos de in-geniería: figura 1). Por esta época tam-bién crece el número de genomassecuenciados, lo que posibilita el análisisgenómico de la transcripción diferencialen varios organismos modelo. Como entoda implantación de una nueva tecno-logía, durante los primeros años se per-feccionan los métodos de fabricación delas micromatrices y los procedimientosbioquímicos. A su vez, aparecen nuevosmétodos estadísticos y programas bioin-formáticos para hacer posible, fiable ypráctico el análisis de los grandes con-juntos de datos que se generan. No obs-tante, la utilización de las micromatricesha estado limitada por el coste elevadodel material fungible y del equipamientopara la fabricación en el laboratorio y parala lectura de la fluorescencia una vez hi-bridada la micromatriz; también por la di-ficultad técnica para efectuar los ensayosde una tecnología novedosa, y por lacomplejidad y tamaño de los datos gene-

rados, que exigían un cambio en el modode planificar la investigación y de inter-pretar los resultados experimentales. Porúltimo, los resultados publicados en losprimeros años de expansión no siemprese hicieron con el rigor experimental apro-piado, lo que hizo recelar de la técnica.

Hoy en día, la tecnología de micromatricesestá madura. La fabricación industrial ga-rantiza una gran calidad, los procedi-mientos bioquímicos están desarrolladosy estandarizados para que la fiabilidad delos resultados no dependa de las presta-ciones de la propia técnica.

Fundamento metodológico¿Qué se entiende por una micromatriz?El fundamento metodológico ha sido de-sarrollado por Schena (2003), que definela micromatriz como una colección orde-nada de elementos microscópicos sobreun sustrato plano que permite la uniónespecífica de secuencias o productos gé-nicos. Esta definición abarca otras aplica-

Aplicaciones de la tecnología de microarrays o micromatrices

239

Figura 1.

7.000

6.000

5.000

4.000

3.000

2.000

1.000

0

Número de referencias en Web of Knowledgeque contienen “microarray” y “gene”

1996

1997

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ciones además del estudio de la transcrip-ción génica, que es el campo al que estadiscusión se ciñe. En este ámbito, los “ele-mentos” hacen referencia a las moléculasde ADN que están fijadas en áreas defi-nidas del soporte. Estas moléculas sonconsideradas como las sondas, ya que seconoce su naturaleza: a qué gen hacenreferencia las moléculas de cada ele-mento. Estos elementos están ordenadosy dispuestos sobre un sustrato plano parafacilitar su fabricación, la lectura de las se-ñales que emitan y su identificación. Elsustrato plano, además, permite la reduc-ción del volumen de la muestra, a dife-rencia de lo que ocurre con el soporte denailon de los experimentos de tipoNorthern. Son elementos microscópicos(15-30 µm para la técnica fotolitográfica,50-350 µm para las micromatrices im-presas) para posibilitar el análisis paraleloy cinéticas rápidas de reacción. En unamatriz de expresión habitual el número deelementos es de unos diez mil, peropuede llegar a contener cientos de miles,lo que posibilita el análisis de un genomaentero. Por último, la técnica ha de favo-recer la unión específica de las moléculasque están en solución (moléculas diana)con las moléculas fijadas (sonda). En elcaso de las matrices de ADN, la unión es-pecífica se realiza por la hibridación entrecadenas complementarias. La unión espe-cífica permite que la señal proveniente deun elemento se relacione con la abun-dancia (análisis cuantitativo, por tanto) deltranscrito de un gen. Es este un factorfundamental para la exactitud de los re-sultados.

Schena (2003) ha definido el ciclo meto-dológico (figura 2) del análisis con micro-matrices que nos sirve para explorar las

fases y requerimientos para utilizar conéxito esta tecnología. Consta de cincoetapas, que empiezan por la definicióndel problema o pregunta que queremoshacer al sistema biológico y terminan conel análisis de los resultados experimentalesobtenidos. A diferencia de las técnicas nomasivas, el trabajo en la poyata del labo-ratorio emplea mucho menos tiempo queel trabajo delante del ordenador para ana-lizar e interpretar los datos obtenidos. Esde esperar que, si el diseño del experi-mento fue adecuado, podamos contestara la pregunta inicial, aunque es posible,de ahí lo de ciclo metodológico, quesurjan nuevas preguntas que inicien unnuevo proceso de análisis.

Diseño experimentalPara que el uso de las micromatrices seafructífero, esto es, que merezca la pena lainversión económica, en tiempo y en es-fuerzo, se deben cuidar todas las fases delciclo metodológico, pero la etapa crucialy probablemente más importante es laprimera. Se debe establecer cuidadosa-mente la pregunta biológica con la queinterrogaremos a nuestro sistema experi-mental, pregunta que en análisis de expre-sión trata sobre saber qué genes se trans-criben, cuánto, cuándo y dónde (el porquéque completaría las “cinco W” de la prác-tica periodística quedaría para la fase finalde interpretación de los resultados). Elcuánto se transcriben los genes necesitauna matización. Generalmente, los valoresque se obtienen son valores relativos, noabsolutos, e implican la comparación entredos condiciones experimentales. Se pue-den comparar: a) genotipos (genotipo ogenotipos mutantes comparados con lareferencia, el genotipo parental, silvestre


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o salvaje); b) tratamientos a fármacos, tó-xicos o estreses en experimentos quecomparan el organismo tratado con el notratado o control; c) muestras obtenidasde distintos tejidos u órganos para desen-trañar la expresión espacial de los genesen un organismo pluricelular; d) muestrasde tejidos enfermos para compararlas conmuestras del mismo tejido sano; e) mues-tras obtenidas en una serie temporal paraver la evolución de un sistema biológico,como pueda ser un cultivo bacteriano opara estudiar el desarrollo de un orga-nismo. Este último diseño se puede com-binar con los anteriores para ver el cambiode expresión inducido como respuesta aun tratamiento o estrés.

Una vez establecido qué queremos averi-guar sobre la expresión génica de nuestrosistema, se aborda el diseño experimental.Se debe determinar, antes que nada, quétipo de plataforma usar. Los distintos fa-bricantes de micromatrices se listarán másadelante, pero la cuestión clave es si usar

micromatrices de un canal o color(Affymetrix) o de dos colores, ya que estodetermina el diseño experimental. Las mi-cromatrices monocanal tienen una granflexibilidad a la hora de hacer compara-ciones entre condiciones, ya que lasmuestras se ensayan por separado (unamuestra, una matriz). En cambio, con lasmicromatrices de dos colores se analizandos muestras distintas simultáneamente.Si pretendemos comparar la expresiónentre solo dos condiciones (silvestre frentea mutante, por ejemplo), el diseño seríael más sencillo: muestras de las dos con-diciones se hibridarían en la misma micro-matriz. Este diseño de comparación di-recta [figura 3, i)] presenta la ventaja deser más económico (se requieren la mitadde micromatrices que muestras) y de darlugar a una mayor precisión, ya que se mi-nimizan las variaciones técnicas de una hi-bridación a otra (como en el caso de lasmatrices monocanal o de las compara-ciones indirectas).


241

Figura 2.

Diseño del experimento

Pregunta biológica

Ajuste del lector, obtención delas imágenes

Detección

Hibridación y lavados

Reacciones bioquímicas

A) Cuantificación, preprocesamiento, análisis estadístico, agrupamiento,representación; B) Interpretación

Análisis y modelado

1) Fabricación de la micromatriz;2) Obtención de los ác. nuc. diana

marcados con fluoróforos

Preparación de las muestras



242

La comparación directa está limitada porel número de condiciones que se quiereensayar. Si tenemos tres condiciones, laalternativa es hacer comparaciones di-rectas entre las condiciones más rele-vantes y comparar indirectamente lasdemás condiciones [A con C, figura 3, ii)]o hacer todas las combinaciones entrecondiciones [figura 3, iii)], lo cual es máscostoso en tiempo, esfuerzo y material.Esta opción será más costosa cuantasmás condiciones distintas se ensayen.Otro inconveniente de este plantea-miento es que es más dificultoso ampliarel experimento a nuevas condiciones(nuevos mutantes, por ejemplo), ya quelas muestras iniciales pueden haberseagotado. La alternativa es hacer compa-raciones indirectas por medio de unamuestra de referencia que se incluya entodas las hibridaciones [figura 3, iv)]. Estareferencia puede prepararse a partir deuna mezcla de ARN de las condicionesensayadas, puede ser comercial (en casode ensayos con organismos modelo mul-ticelulares, especialmente de tejidos hu-manos) o, una solución muy convenientey frecuente en procariotas, puede serADN genómico. El ADN genómico esmucho más estable y fácil de extraer que

el ARN. Además, no sufre de las varia-ciones en su composición (número decopias de cada gen) por factores bioló-gicos que sufre el ARN. Las ventajas deeste diseño es que un experimentohecho en un determinado momento sepuede ampliar muy fácilmente a nuevascondiciones y muestras, que el diseño essencillo e inmediato, y que todas lascomparaciones se efectuarán con lamisma precisión [a diferencia de, porejemplo, el diseño ii) de la figura 3]. Losinconvenientes es que se emplea unamatriz por muestra (como en las ma-trices monocanal) y en que las compara-ciones son indirectas y, por ello, se pierdealgo de precisión. Un valor añadido im-portante cuando se utiliza ADN genó-mico como referencia es que se obtieneun valor de expresión para condición ygen que se aproxima a un valor absolutode expresión. Es un valor similar al quese obtiene con las matrices monocanal.Estos valores ayudan a la interpretaciónde los resultados, especialmente en lasseries temporales.

El diseño experimental se completa deter-minando el número de réplicas biológicaspara cada condición. Esto es, de cuántosorganismos (pluricelulares) o de cuántoscultivos (unicelulares) se obtienen mues-tras. Es claro que cuantas más réplicas,mayor poder tendrá la prueba estadística;la limitación viene del coste y de la dispo-nibilidad. En general, se suelen utilizar unmínimo de tres réplicas biológicas. En se-ries temporales, no obstante, puede sersuficiente con una única réplica biológicapara un análisis detallado con un gran nú-mero de muestras, apoyada por otra uotras réplicas para corroborar los cambiosmás importantes.

Figura 3.

A A AC C

BBB

A B C D

i)

iv)

…

Referencia

ii) iii)


Preparación de las muestras:fabricación de las micromatrices

Por el método de fabricación se puedendistinguir dos grandes grupos de micro-matrices: el depósito del ADN sondasobre el soporte o la síntesis del ADNsonda en el mismo soporte (síntesis insitu). El primer tipo corresponde a las mi-cromatrices impresas y se obtienen depo-sitando los ADN sondas sobre cristalesportaobjetos por medio de un robot. Elequipamiento es asequible para un labo-ratorio universitario. Se requiere la síntesisprevia de las sondas: clones de ADN com-plementario, productos de PCR o bien oli-gonucleótidos obtenidos de un servicio desíntesis. En un principio este método defabricación permitió la expansión de latecnología de micromatrices cuando losproveedores industriales eran escasos ocaros sus productos, o no se contaba conla matriz industrial para el organismo deestudio. Sin embargo, hoy en día este tipode matrices queda confinado para usosespeciales, como la utilización comosonda de grandes fragmentos de ADN(BAC) en micromatrices teseladas (tiling)para análisis genómicos que exceden elobjetivo de esta discusión. Ello es debidoa que se han abaratado los precios de lasmicromatrices industriales de síntesis insitu y a la preferencia por las sondas deoligonucleótidos.

En el transcurso del desarrollo de la tec-nología ha habido un debate sobre la lon-gitud más adecuada del ADN sonda parael análisis de la expresión diferencial. Elconsenso indica que las sondas más ade-cuadas son las sondas de oligonucleótidosy la obtención de sondas de oligonucleó-tidos está accesible para la síntesis in situ.Las micromatrices de este tipo son todas

industriales y, dado que estas matrices noadolecen de los problemas de variabilidadtécnica en la deposición de más o menoscantidad de sonda en cada elemento de lamicromatriz, han desplazado a las micro-matrices impresas. La calidad y fiabilidadde las micromatrices industriales, además,está garantizada. Otras ventajas impor-tantes son la flexibilidad en la fabricación(no se necesita la síntesis previa de una co-lección de oligonucleótidos) y la densidadde sondas. Dos fabricantes representativosson Affymetrix, ya mencionado, y Agilent.El primero utiliza la síntesis fotolitográfica,el segundo la tecnología de chorro detinta. Estas distintas tecnologías se tra-ducen en que las micromatrices de Affy-metrix tienen limitado el tamaño de losoligonucleótidos sondas a 25 nucleótidos,mientras que las de Agilent alcanzan los60 nucleótidos. En principio, el tamañomayor de las sondas de Agilent indica unamejor calidad en los resultados. La con-trapartida es que la tecnología fotolito-gráfica logra una mayor densidad desondas. En estos momentos, las densi-dades máximas logradas por estos fabri-cantes corresponden a 6 millones desondas por micromatriz de Affymetrixfrente al millón de Agilent. Una ventajaimportante de Agilent es su flexibilidad:aceptan pedidos de tan solo una micro-matriz, con un conjunto personalizado yúnico de sondas. Affymetrix requiere unpedido mínimo de micromatrices para or-ganismos fuera de catálogo y cobra el ser-vicio de diseño. Las micromatrices deAffymetrix son monocanal, mientras quelas de Agilent se usan generalmentecomo de doble canal, aunque puedenusarse como de un solo color.


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Dada la buena calidad y reproducibilidadde las micromatrices industriales y quehoy se cuenta con procedimientos de la-boratorio estandarizados, el factor másdeterminante para la calidad de los resul-tados es el diseño de las sondas. Una vezque se ha secuenciado el genoma de unorganismo o que se cuenta con un bancode secuencias expresadas (EST, expressedsequence tag), por medios bioinformá-ticos se eligen las secuencias que definiránlas sondas de la micromatriz y sus propie-dades. Son cuatro los factores que deter-minan el rendimiento de las sondas: es-pecificidad, sensibilidad, ruido y sesgo. Laespecificidad de una sonda (que sola-mente hibride con ella las moléculas dianaprovenientes del gen correspondiente) au-menta con la longitud de la sonda hastaunos 100 nucleótidos, aproximadamente.Para maximizar la especificidad de lassondas se utilizan programas bioinformá-ticos que buscan coincidencia total o par-cial en la secuencia elegida con otras re-giones del genoma potencialmenteexpresadas. La sensibilidad es la capacidadpara detectar cantidades mínimas de lasmoléculas diana. Aumenta con la lon-gitud de la sonda y depende de factoresmenos controlables a la hora del diseño(propiedades termodinámicas de la se-cuencia, concentración de la sonda en elelemento de la matriz, química de la su-perficie de la matriz y accesibilidad de ladiana en las condiciones de hibridación).El ruido de una sonda se define como lavariación aleatoria entre hibridaciones re-plicadas. Disminuye con la longitud de lasonda. El sesgo constituye una desviaciónsistemática de la medida que proporcionala sonda respecto del valor real y es difícilde eliminar, aunque disminuye con la lon-

gitud de la sonda. De lo expuesto se de-duce que la longitud de la sonda mejorala sensibilidad, el ruido y el sesgo, y hasta100 nucleótidos, la especificidad. Las es-trategias que han adoptado los fabri-cantes para optimizar el diseño de sussondas son básicamente dos: o bien con-siguen la síntesis in situ de sondas de untamaño cercano al óptimo, como Agilent(60 nucleótidos), o bien compensan la in-suficiente longitud de las sondas con lainclusión de sondas múltiples por cadagen, caso de Affymetrix (sondas de 25nucleótidos, pero mayor densidad de fa-bricación). El promediado de sondas múl-tiples por gen consigue cancelar el ruido,ya que es aleatorio, y minimiza el sesgo silas sondas poseen sesgos distintos.

Preparación de las muestras:obtención de los ácidos nucleicosdiana marcados con fluoróforos

La obtención de las moléculas diana conlas que se van a hibridar las micromatricesconstituye obviamente un paso clave parael éxito del experimento. El material departida habitual son muestras de tejidosu órganos, o muestras de cultivos de cé-lulas de las que se extrae el ARN. Es fun-damental que la muestra sea representa-tiva de la condición experimental deestudio. Esto puede ser un auténtico de-safío en el caso de muestras de tumores,pues células cancerígenas pueden estarentremezcladas con células normales.

El método de extracción de ARN puedeinfluir en los resultados, por lo que, unavez establecido el método adecuado, nose debe variar. El ARN es un material de-licado, fácilmente degradable por las ri-bonucleasas. Hay que asegurar que los


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tubos y soluciones estén libres de estasenzimas ubicuas y llevar guantes siempre,además de renovarlos frecuentemente.Existen detergentes comerciales, comoRNaseZap® de Ambion, para la limpiezade pipetas y gradillas. Además, los sis-temas de reactivos comerciales para la pu-rificación de ARN de diversas fuentes aho-rran la necesidad de la preparación dereactivos libres de ribonucleasas.

A la hora de la toma de la muestra es ne-cesario determinar la cantidad de tejidoo células para extraer la suficiente can-tidad de ARN. Habitualmente son sufi-cientes 10 µg de ARN, que se obtienencon 2 mm3 de la mayoría de tipos de te-jidos. Otro factor importante es evitar loscambios en el ARN durante la manipula-ción de la muestra. Para ello, o bien se con-gela inmediatamente en nitrógeno líquido,o bien se utilizan reactivos comerciales queparalizan la maquinaria celular de síntesisy degradación del ARN, además de au-mentar la estabilidad del ARN, mientras seconservan las muestras refrigeradas o con-geladas hasta el momento de la extracción.Soluciones estabilizantes habituales sonRNAlater® (Ambion) y RNAprotect Bacteria®

(Qiagen), para muestras de células euca-riotas o de procariotas, respectivamente, ylos tubos PAXgene® para muestras desangre.

El ARN extraído debe ser analizado paracomprobar la concentración, pureza e in-tegridad. Por medio de un barrido espec-trofotométrico se detectan contamina-ciones de la preparación, además deobtenerse una estimación de la concentra-ción por medio de la relación de la absor-bancia a 260 nm. Así, una unidad de A260

indica una concentración de 40 µg/ml deARN total. Además, la relación A260/A280

debe ser 2:1 o superior como indicadorde la pureza del ARN. Estas medidas se re-alizan idealmente en instrumentos queemplean cantidades mínimas de la solu-ción de ARN, de 1 a 2 µl, como es el casodel espectrofotómetro NanoDrop™. Porotro lado, el análisis de la integridad delARN es esencial para que los transcritosno estén degradados y para evitar sesgosen los resultados por comparar muestrasde distinta calidad. En electroforesis en gelde agarosa desnaturalizante se puede vi-sualizar las bandas correspondientes a losARN ribosomales, que deben ser nítidas,guardar una relación próxima a 2 entresus intensidades y no mostrar trazas dedegradación. No obstante, el instrumentoque se ha convertido en el estándar parael control de la integridad del ARN en elanálisis de expresión es el aparato de elec-troforesis capilar en chip Bioanalyzer 2100de Agilent. Además de ahorrar tiempo ytrabajo, proporciona una cuantificaciónprecisa de la integridad del ARN pormedio del valor del denominado RIN (RNAintegrity number), que debe idealmenteser superior a 8 (el valor máximo es de10). En ciertos tipos de muestras es difícilalcanzar ese valor. En ese caso, se debecuidar que todas las muestras tengan va-lores comparables para evitar el sesgo téc-nico en caso contrario.

Las muestras de ARN deben ser marcadaspara poder identificar la señal debida a suabundancia cuando son hibridadas conlas micromatrices. El procedimiento habi-tual implica la síntesis de ADN comple-mentario a partir de la retrotranscripción,utilizando como molde las muestras deARN y como cebadores, o bien oligonu-cleótidos de secuencia aleatoria (normal-mente una mezcla de hexanucleótidos


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con todas las combinaciones de cuatro nu-cleótidos en cada posición), o bien polí-meros de timina para obtener ADN com-plementario de los ARN mensajerosexclusivamente en el caso de los orga-nismos ecuariotas. En el proceso de retro-transcripción se puede incorporar el fluo-róforo si se sustituye parte de undesoxinucleótido por el desoxinucleótidounido al fluoróforo. Este es el marcaje di-recto. El desoxinucleótido marcado usadohabitualmente es dCTP-Cy3 (unido al fluo-róforo cianina 3) o dCTP-Cy5 (unido a cia-nina 5). En las matrices de dos colores, lasdos muestras que van a ser hibridadascon la misma micromatriz son marcadascon estos dos fluoróforos, una con uno yla otra con el otro, para poder diferenciarla señal de fluorescencia que proviene decada una. Los fluoróforos Cy3 y Cy5 (si-glas utilizadas frecuentemente para refe-rirse a ellos) no son totalmente equiva-lentes como marcadores. Ello es debidoen gran parte a que tienen distinto ta-maño molecular y en el marcaje directono se incorporan con la misma tasa en elproceso de retrotranscripción. Para evitarel sesgo en los resultados debido al fluo-róforo utilizado, se realiza un intercambiode los fluoróforos (dye-swap) entre ré-plicas biológicas de las condiciones. Porejemplo, si se comparan dos condicionesA y B, en una hibridación se marca unamuestra de A con Cy3 y una muestra deB con Cy5, pero en una segunda hibrida-ción se intercambian los fluoróforos (Acon Cy5 y B con Cy3), idealmente usandomuestras que sean réplicas biológicas delas primeras. El sesgo debido al distintotamaño del fluoróforo se evita haciendoun marcaje indirecto. En la retrotranscrip-ción, en vez del dCTP unido al fluoróforo

se incorpora aminoalil-dCTP. Este nucleó-tido modificado puede, en un segundopaso del marcaje, incorporar el fluoróforoen la reacción química denominada deacoplamiento (coupling). Aun usandomarcaje indirecto, se suele recomendar elintercambio de fluoróforos, porque estosno tienen las mismas propiedades de fluo-rescencia.

Reacciones bioquímicas: hibridación ylavados

El fin último de esta fase es maximizar lahibridación específica entre las moléculasdiana en solución y las moléculas sondafijadas al soporte de la micromatriz. Unavez marcadas con los fluoróforos lasmuestras de las moléculas diana, se di-luyen en la solución de hibridación decomposición adecuada y se ponen encontacto en la superficie de la microma-triz. A continuación se incuba a una tem-peratura adecuada durante un tiempo de-terminado para que la cinética de lasreacciones de hibridación permita la má-xima señal y la máxima especificidad enlas condiciones de salinidad de la soluciónde hibridación y de concentración de lasmoléculas diana y sonda.

En la hibridación, además de los ante-riores, es necesario cuidar los factores si-guientes. Primero, la cantidad de marcajeque se añade a la hibridación de cadamuestra. Es necesario cuantificar tanto lacantidad total de fluoróforo incorporadocomo la tasa de incorporación en lasmuestras marcadas (porcentaje de nucleó-tidos con fluoróforo). Este control tam-bién se realiza espectrofotométricamenteen instrumentos como el NanoDrop™, queemplea volúmenes mínimos de muestra.Para evitar la desecación del mínimo vo-


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lumen de hibridación, la micromatriz seincuba en un compartimento hermético.Por último, la solución debe repartirse ho-mogéneamente por la superficie de la mi-cromatriz. En el caso de las micromatricesde portaobjetos, la solución de hibrida-ción se distribuye y se mantiene homogé-neamente plana depositando un cubre-objetos sobre el líquido. El conjunto deambos cristales se introduce en un es-tuche estanco. Otros sistemas son, porejemplo, el de Agilent, en el que la estan-queidad de la solución se garantiza conun cristal del mismo tamaño del portaob-jetos con una goma toroidal que abarcael área de la matriz. Cuando se sella coneste cristal la solución de hibridación, sedeja un espacio de aire, una burbuja quepermite la agitación continua de la solu-ción sobre la superficie de la matrizcuando el conjunto de cristales se intro-duce en un horno rotatorio. Además, estesistema permite la hibridación indepen-diente de hasta ocho micromatrices repli-cadas sobre la superficie de un mismoportaobjetos, lo que resulta en una mayoreconomía, pues el precio del cristal es elmismo tanto si lleva una única matriz (de244.000 sondas) como 8 matrices (de15.000 sondas).

Tras el periodo de incubación, los lavadosse realizan con soluciones salinas con pHamortiguado de composición semejantea las utilizadas en las hibridaciones tipoSouthern o Northern. El objetivo es eli-minar restos de moléculas diana hibri-dadas de forma inespecífica o depositadassobre la superficie del cristal.

Detección

Las moléculas diana que han quedadounidas a los elementos de la matriz

portan con ellas los fluoróforos. Para de-tectar los fluoróforos se utilizan lectoresde fluorescencia especialmente diseñadospara micromatrices. La mayor parte de losmodelos pueden leer micromatrices deformato portaobjetos; sin embargo, lasmicromatrices de Affymetrix requieren elescáner del propio fabricante. El coste delescáner constituye la mayor inversióndentro del equipamiento necesario parautilizar esta tecnología.

El escáner excita cada fluoróforo utili-zando una luz láser de longitud de ondacorrespondiente al máximo de absorcióndel fluoróforo y recoge la luz de la lon-gitud de onda del máximo de emisión pormedio de filtros. Para detectar la luz emi-tida, en la mayor parte de los dispositivosusan tubos fotomultiplicadores. El barridode la micromatriz para detectar la fluores-cencia emitida por uno u otro fluoróforopuede hacerse de forma simultánea o se-cuencialmente. En cualquier caso se ob-tienen dos archivos de imagen tipo “tiff”,uno para cada canal.

Análisis e interpretación de los datos

Esta fase final requiere obligatoriamenteel uso de ordenadores y de aplicacionesbioinformáticas específicas para podermanejar la gran cantidad de datos que segeneran en el experimento. Esta fasebioinformática se puede subdividir en unaserie de tareas. La primera consiste en ex-traer de las imágenes “tiff” la señal defluorescencia de cada elemento y la fluo-rescencia de fondo. Esta cuantificación serealiza por medio de programas de aná-lisis de imágenes diseñados especialmentepara el tipo y estructura de las imágenesgeneradas por el escáner. Lo que se ob-tiene es un conjunto de valores, tales


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como el promedio de los valores de los pí-xeles que están comprendidos por el con-torno de cada elemento de la microma-triz, para definir la señal de fluorescenciabruta, y el promedio de los valores de lospíxeles del entorno de cada elementopara definir la señal de fondo local.Ambos valores se aplican a cada elementode la matriz y a cada canal.

Los valores de los archivos de cuantifica-ción son normalizados usando programasespecíficos. La normalización consiste enuna serie de operaciones con los datoscrudos para eliminar la parte de la varia-ción de los datos que es debida a factorestécnicos y no a la propia biología. Los pro-cedimientos de normalización más emple-ados asumen que la expresión de lamayor parte de los genes no cambia entrecondiciones y que los cambios son apro-ximadamente simétricos, es decir, que lamagnitud del incremento de la expresióntotal es igual a la magnitud del descensode la expresión. A veces estos requisitosno se cumplen y es necesario buscar fór-mulas alternativas.

Los valores de fluorescencia normalizadosson utilizados para realizar pruebas esta-dísticas que comparan dos condicionespara determinar qué genes presentan di-ferencias significativas en sus valores. Otroabordaje de los datos implica el agrupa-miento de los genes que se comportan dela misma forma en una serie de condi-ciones ensayadas, esto es, que tienen elmismo perfil de transcripción (términoadecuado para resumir los valores detranscripción especialmente en series tem-porales). En uno y otro caso se trata declasificar los genes según su comporta-miento. Otra forma de abordaje consisteen comprobar qué funciones están afec-

tadas por los cambios transcripcionales yde qué forma. Dado que estos resultadosdel análisis implican conjuntos de valoresnumerosos, se hace muy importante elpapel de las representaciones, tanto paraobtener una visión totalizadora de loscambios observados como para comu-nicar y presentar los resultados del aná-lisis. El producto final de esta fase sería lainterpretación biológica de los cambiosobservados: qué función y explicacióntienen los cambios de expresión, y con-testar a la pregunta formulada al inicio delexperimento.

Los resultados del experimento con micro-matrices han necesitado de la validacióncon pruebas complementarias, por ejem-plo, comprobando por PCR cuantitativa loscambios en los genes más significativos yrepresentativos. Gracias al aumento de lacalidad y fiabilidad general de los resul-tados, estos ensayos de validación han de-venido menos exigentes, aunque no ha de-saparecido su requerimiento totalmente.

Campos de aplicación de lasmicromatrices: estudio de laexpresión génica enorganismos modeloInaugurada la época de la genómica fun-cional con la secuenciación completa degenomas, se ha hecho necesario contarcon herramientas capaces de analizar lafunción génica de forma que abarquentodo el genoma de los organismos. En elestudio de la expresión de los genes, lasmicromatrices han hecho posible esteanálisis masivo. Un campo principal deaplicación ha sido y es la investigación deorganismos modelo con el objetivo deprofundizar en el conocimiento de su bio-


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logía molecular. Los objetivos de estas in-vestigaciones son varios. Uno de loscampos más fructíferos, por la facilidaddel diseño experimental y de la interpre-tación de los datos, y por lo valioso del co-nocimiento generado para la explicacióndel funcionamiento del organismo, es elestudio de las redes reguladoras. La com-paración entre genotipos de un reguladortranscripcional (silvestre, inactivado, so-breexpresado) permite determinar quégenes están bajo el control del regulador,bien sea un activador o un represor. Losfenómenos biológicos que se desenca-denan por sí mismos en el tiempo, talescomo el desarrollo de organismos plurice-lulares, procesos de diferenciación, o laevolución de cultivos, se estudian adecua-damente con series temporales de mues-tras. El estudio de las respuestas a cam-bios ambientales, sean nutricionales ocomo defensa ante agentes estresantes,también han ganado en conocimientopor medio del análisis con micromatrices.

Todos estos estudios transcriptómicos nohan de considerarse aisladamente de otrastécnicas. La integración de los datos trans-criptómicos con otros estudios ómicos,como la proteómica, la metabolómica, ladeterminación de sitios de unión en el ADNde proteínas reguladoras, etc., es un pasoobligado para avanzar en el enfoque de labiología de sistemas.

Aplicación de lasmicromatrices en el campode la biomedicina en generaly de las ciencias veterinariasen particularDesde el inicio de la tecnología, un campode aplicación en el que se depositaron

grandes esperanzas fue el estudio de lasbases moleculares de enfermedades, es-pecialmente del cáncer. La comparaciónde tejidos o células sanos con enfermosha permitido la identificación de genesque aumentan o disminuyen la expresióncon la enfermedad. Estos genes indicanqué procesos están alterados por la enfer-medad, con lo que se apuntan dianaspara el tratamiento. Además, es posibleidentificar con esta metodología biomar-cadores que ayuden al diagnóstico y alpronóstico. Cabe señalar que se han rea-lizado estudios de hasta 40 tipos decáncer en humanos con micromatrices deexpresión, y un objetivo que se ha se-guido es poder identificar de forma fiabley rápida el tipo de cáncer. Gracias a estatécnica se han podido discriminar tiposque por otras técnicas no es posible.

La industria farmacéutica ha empleado yemplea con profusión el análisis de expre-sión con micromatrices en todas las fasesdel desarrollo de un nuevo fármaco. Unprimer paso, como se ha comentadoantes, sería la identificación de posiblesdianas terapéuticas. En segundo lugar, elanálisis de expresión, ampliando el nú-mero de muestras o utilizando modelosanimales, incluyendo incluso el análisis demutaciones, serviría para validar esasdianas. Una vez elegida la diana o dianas,el análisis de la expresión ayuda en el ras-treo de sustancias activas, al identificarcambios en la diana terapéutica tras la ad-ministración de tales fármacos poten-ciales. Por lo mismo, puede aplicarse paraelegir la sustancia más activa y para anti-cipar efectos adversos usando modelosanimales o líneas celulares. En la fase deensayos clínicos, el análisis de la expresión


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génica sirve para monitorizar la efecti-vidad y la toxicidad.

La identificación de biomarcadores quepermitan el diagnóstico, incluso de varie-dades de una misma enfermedad, es uncampo con un gran interés, como se haindicado anteriormente. Asimismo, losbiomarcadores pueden servir para pre-decir la eficacia de un tratamiento. Las mi-cromatrices permiten el análisis de expre-sión para identificar tales biomarcadores,pero también se emplean para el análisisde genotipos mediante la comparación demuestras de ADN en vez de ARN. En elcampo de la biomedicina, el estudio delos genotipos asociados con enferme-dades sirve, además de para identificar elorigen genético, para evaluar el riesgo depadecer una enfermedad.

En la lucha contra las enfermedades in-fecciosas, el estudio de los agentes infec-ciosos encuentra un gran campo de apli-cación en el análisis con micromatrices.Numerosos trabajos de investigación sehan centrado en determinar qué genes seexpresan en el patógeno durante la infec-ción, para diferenciarlos de genes impli-cados en un modo de vida libre, o biengenes que se expresen durante determi-nadas fases de su ciclo vital. Un objetivopráctico es, de nuevo, establecer dianaspara el combate farmacológico del pató-geno. Además, permiten el análisis de losprocesos de interacción con el hospe-dador. Otro campo de aplicación es la de-tección de patógenos por medio del aná-lisis del ADN extraído. Esta aplicación esespecialmente útil en la identificación devirus pues evita su complicado cultivo. Enel desarrollo y evaluación de vacunas, latécnica sirve para la evaluación de la res-

puesta inmune y también ha sido aplicadapara la evaluación de la toxicidad.

En el área de la farmacogenómica, la tec-nología de micromatrices ha dado el saltode la investigación básica a un productocomercial, desarrollado por la farmacéu-tica Roche. El denominado AmpliChipCYP450® sirve para determinar cuál de las90 variantes del gen CYP2D6 y cuál de lastres variantes de CYP2C19 presenta undeterminado paciente. Las variantes deestos genes determinan la capacidad deeliminación de fármacos y, por tanto, elconocimiento derivado de la prueba per-mite establecer la dosis personalizada másadecuada. Recientemente, las autoridadeseuropeas han aprobado el uso de la ins-trumentación de Affymetrix (GCS 3000Dx)para realizar los ensayos con esta micro-matriz, con lo que se abre la puerta a lageneralización de este tipo de pruebas.

En el campo de la biomedicina, especial-mente en lo que concierne a la salud hu-mana, la cantidad de datos generados ennumerosos ensayos hace que se necesitecontar con bases de datos públicas (GEOy ArrayExpress) en las que los investiga-dores puedan consultar y reinterpretar losresultados de otros laboratorios a la luzde los nuevos conocimientos. La disponi-bilidad de los datos crudos, conveniente-mente anotados, también permite que sepuedan realizar estudios que combinenexperimentos realizados independiente-mente en distintos laboratorios y que alser analizados conjuntamente revelennuevos resultados. Para que estos meta-análisis den el mayor fruto es necesarioque los datos depositados hayan sido ge-nerados con procedimientos robustos. Elesfuerzo más importante para promoverla generalización de la calidad en el pro-


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cedimiento experimental es el MicroarrayQuality Control Project (Shi y col., 2008).

La tecnología de micromatrices prometeaportar la potencia de generación dedatos y conocimiento en las siguientesaplicaciones específicamente veterinarias:el estudio de las bases fisiológicas de laproducción animal se beneficia, porejemplo, del análisis de la expresión gé-nica en músculo, comparando los pa-trones de expresión de razas con distintacalidad de carne, para averiguar quégenes o rutas metabólicas favorecen o de-terminan unas u otras cualidades. Por otraparte, lo que sería un enfoque nutrigenó-mico, el conocimiento sobre el efecto enla expresión génica de la dieta y de los su-plementos alimenticios, ayudará a diseñardietas y piensos más sanos o productivos.En sanidad animal, además del estudio delos patógenos, las micromatrices sirvenpara determinar los genotipos más resis-tentes a enfermedades. Bien con el aná-lisis genotípico, proteómico o de expresióngénica, la determinación de biomarca-dores útiles para la selección promete ace-lerar la obtención de razas y variedadescon características mejoradas. Comoejemplo de las posibilidades que se abren,cabe citar aquí que la empresa Affymetrixofrece ya micromatrices de última gene-ración para el análisis genotípico bovino,la denominada Axiom® Genome-WideBOS 1 Array. Es de desear que este tipode estudios se extienda para obtener elmáximo beneficio de una tecnología tan

potente y que hoy en día ya está maduray accesible a muchos laboratorios.

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Introducción

Antecedentes

El escalado progresivo de la poblaciónhumana, que, según previsiones reali-zadas recientemente, puede alcanzar los9.500 millones para el 2050 (2), suponeun incremento espectacular, de más del50% si se compara con los valores del2000 (6.000 millones) o de 6 veces másde la población existente en 1900 (1.600millones) (3). Los últimos cálculos apuntana la duplicación de la población humanacada 30 años, lo que arroja valores másque preocupantes, con multitud de pro-blemas asociados, comenzando por la ne-cesidad de abastecimiento de agua y ali-mentos.

Por otra parte, la importancia creciente delos alimentos de origen animal en la dietahumana es un hecho constatado. A nivelmundial, en el periodo 1983-93, pasaronde 14 a 21 kg de carne per cápita y de 35a 40 kg en el caso de la leche, siendo elcambio especialmente importante en lospaíses en desarrollo. Puede afirmarse quela demanda y consumo relativos de pro-ductos de origen animal crece a mayor ve-locidad que lo que sucede con otro tipode alimentos, como, por ejemplo, los ce-reales, y todo dentro de un contexto pre-visible de crecimiento progresivo expo-nencial de la población humana, parasatisfacer su demanda de abastecimiento.

Para satisfacer esta demanda, en 2009 seprodujeron en el mundo un total de 61,8

millones (M) de Tm de carne de bovino y13 M de Tm de carne de ovejas y cabras(4); a los que se suman 106,1 M de Tm decarne de cerdo y 79,6 de carne de pollo.La producción de leche, por su parte, as-cendió a 696,5 M de Tm y la de huevos a67,4 M de Tm. El conjunto de capturas depescado, crustáceos, moluscos, cefaló-podos, etc., ascendió en 2008 a 142,2 Mde Tm. Los censos mundiales de ganadobovino y búfalos ascendieron en 2009 a1.570,547 M de cabezas y los de ovejas ycabras (conjuntamente) a 1.939,243 M,siendo los de cerdos de 941,213 M de ca-bezas y los de pollos de 18.555 M.

Sin duda, son tan espectaculares las cifrasanteriores que resulta difícil pensar quesean insuficientes, pero los cálculos másoptimistas contemplan la necesidad demultiplicar los efectivos para abastecer lasnecesidades que impone la demanda. Encualquier caso, los cambios no supon-drán, simplemente, un incremento (nece-sario) de los censos, sino toda una serie

Sanidad animal y biotecnologíaDr. Elías F. Rodríguez Ferri (1)

Figura 1. Población mundial. Proyección a 2050(http://snus-news.blogspot.com/2010/09/develo-ping-world-lifestyle-related.html).


de modificaciones en estructuras e infra-estructuras que van desde las que afectana la producción de alimentos-pienso parala alimentación de los animales a la trans-formación de la tierra, etc. Resulta muydifícil llevar a cabo este tipo de previ-siones-estimaciones, pero no hay duda deque ocuparán a nuestros hijos de formapreferente en las próximas décadas.

Pecaríamos de muy incompletos e impar-ciales si la representación de los animalesen relación con el ser humano quedara re-ducida a la simple y única presencia deuna fuente de alimento de primera nece-sidad y de calidad. Los animales formancon el hombre un todo indivisible y com-plementario, ocupando el supernichoecológico que representa la Tierra, con in-teracciones necesarias e imprescindibles.Los animales que viven en libertad, losanimales salvajes de todos los órdenes,mamíferos y aves, vertebrados e inverte-brados, terrestres y acuáticos, constituyenel mayor activo de este planeta y man-tienen con la tierra o el agua que les sus-tenta, con el hombre y su espacio vital, unequilibrio consecuencia de la evolucióniniciada en el mismo momento en que elreloj de la Tierra comenzó su andadura,ahora hace ya más de 4.000 millones deaños. A estas utilidades de los animalespara el hombre, tan simples en apariencia,pero tan necesarias, se suma una largalista de otros apoyos que van, desde suuso como elementos de compañía o deocio humanos a su utilidad en la experi-mentación, como modelos animales parala ciencia médica, o su uso como motoresde trabajo aún en amplias zonas delmundo, como parte elemental de terapiasasistidas, etc., o simplemente como cola-boradores de la sociedad actual como pe-

rros policía, perros utilizados en la bús-queda de supervivientes en los desastresnaturales, perros lazarillo, etc.

Este panorama obliga de forma, siquierainteresada, a conocer todo cuanto afectade forma positiva y negativa a su exis-tencia, que de forma directa o indirecta-mente condicionan la vida humana.

Veterinaria. Medicina Veterinaria yciencias veterinarias

A lo largo del siglo XX se ha producido unainteresante transición de la tradicional Me-dicina Veterinaria a lo que podríamos de-nominar Ciencias Veterinarias, denomina-ción a la que con frecuencia se acude paradar idea de la extensión de funciones de laVeterinaria actual, que forma parte de unmundo muy complejo, con interconexionesde todo tipo, culturales, económicas y so-ciales, y, naturalmente, profesionales. LaVeterinaria actual cumple funciones muyrelevantes para la sociedad, todas ellas cla-ramente interrelacionadas: Sanidad Animaly Salud Pública, Biomedicina, ProducciónAnimal, Seguridad y Tecnología de laProducción Alimentaria y Bienestar Animaly Medio Ambiente.

Para hacer frente a este complicado pa-norama de actividades y servicios, actual-mente muy atomizados, se precisa que elveterinario adquiera capacidades nuevasdotándose de una mentalidad que le per-mita conseguir el éxito en todos estos co-metidos. Algunos expertos (5) han seña-lado la necesidad de vertebrar todas estasactividades en torno a un eje central queconstituya el punto de apoyo necesario,proponiendo para ello el concepto “unsolo mundo de medicina veterinaria” conel que pretenden que el veterinario “co-


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necte”, “se interconexione” con su en-torno vital, comprenda el alcance de sus“habilidades” y de las obligaciones que lasociedad le impone, y obtenga la iden-tidad que necesita a los ojos del mundo.

Sanidad Animal

La Sanidad Animal se ocupa del estudiode los procesos infecciosos que afectan ala salud de los animales, incluyendo suscausas (microorganismos y parásitos), susconsecuencias (la enfermedad), así comolos procedimientos relacionados con suprevención, control y erradicación (epide-miología, diagnóstico, terapia, biosegu-ridad, vacunaciones, medidas relacio-nadas con las relaciones comerciales entrepaíses, etc.).

Antes del nacimiento de la Microbiología,la Sanidad Animal formaba parte de laMedicina Veterinaria integral, empírica-mente. Igual que el animal representa untodo que constituye a la vez medio detransporte, fuente de alimento, vestido,combustible, recreo y compañía, la dedi-cación a la prevención y curación de lasenfermedades infecciosas de los animalescarece de conocimientos acerca de su etio-logía y de instrumentos y métodos parapoder controlarla. A finales del siglo XIX,los avances conseguidos a partir de lostrabajos de Pasteur y Koch y sus respec-tivas escuelas acerca de la etiología micro-biana de las enfermedades infecciosas,igual que el papel de los microorganismosen otras responsabilidades (producción yalteración de los alimentos, etc.), per-miten entender la presencia de vínculosentre la Sanidad Animal y la Salud Huma-na (Salud Pública), lo que facilita, igual-mente, abordar la Medicina Comparaday la investigación biomédica. Igual que

ella, el carbunco bacteridiano o la tuber-culosis (humana y bovina) lo estuvieron enel origen del conocimiento de la etiologíamicrobiana de las enfermedades infec-ciosas (7).

Un Mundo, una Medicina, una Salud

Ha sido, precisamente, la interfaz entre laSanidad Animal y la Salud Pública, conocasión de la emergencia de la gripe aviarpor el virus influenza H5N1 y el riesgo depandemia, lo que ha hecho renacer anti-guas propuestas que en la actualidadestán siendo defendidas con pasión poralgunos sectores, tanto de la MedicinaHumana como Veterinaria. Nos referimos,claro está, a la corriente que demanda laintegración de la Medicina Humana y laVeterinaria, de la Salud Pública y laSanidad Animal, para ser más precisos, enparticular en lo que se refiere a las enfer-medades emergentes, especialmente zo-onosis emergentes, bajo el mensaje “UnMundo, una Salud”, inicialmente, “UnMundo, una Medicina, una Salud”.

La emergencia y reemergencia de enfer-medades infecciosas con potencial pandé-mico están teniendo lugar desde el pasadosiglo, con una alarmante regularidad, yuna gran mayoría de las mismas son zoo-nosis. De hecho, de los más de 1.400 pa-tógenos humanos reconocidos, el 61,6%son de origen animal, son zoonósicos (8).Como término medio, desde la SegundaGuerra Mundial, cada año ha emergido oreemergido una enfermedad nueva y el76% de ellas son zoonosis (9). Jones et al.(2008) (10) han señalado recientementeen un estudio llevado a cabo sobre 335enfermedades infecciosas emergentesdescritas en los EE.UU. entre 1940 y2004, que el 60% de las mismas fueron

Sanidad animal y biotecnología

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zoonosis y que más del 70% de ellas co-rrespondían a fauna salvaje. Como se ve,todos los datos apuntan en la direcciónde una gran importancia relativa de laszoonosis en las enfermedades emer-gentes que afectan al hombre, al menosa lo largo de todo el siglo pasado y la si-tuación se mantiene en el presente.

Los factores que dirigen la emergencia delas enfermedades infecciosas, incluidas laszoonosis emergentes, pueden agruparseentre aquellos que se suceden en el en-torno humano, los que lo hacen en el sis-tema agroganadero y de producción dealimentos y, finalmente, los que tienenlugar en los ecosistemas naturales. Losprimeros son, sin duda, muy numerosose incluyen los cambios en la demanda dealimentos, la urbanización, el aumento dela densidad y concentración de la pobla-ción humana y/o animal, la proximidad dehumanos y animales, los cambios demo-gráficos, el incremento de la movilidad,las tasas de pobreza y el deterioro de losservicios de salud pública y servicios vete-rinarios. En relación con los segundosdeben considerarse, por su parte, loscensos ganaderos y la concentración es-pacial de explotaciones animales, la au-sencia de sistemas de bioseguridad, el in-cremento en el comercio de animales

vivos y de productos de origen animal, lavacunación inapropiada o el uso indebidode fármacos, sobre todo antibióticos, o lossistemas de explotación intensiva. Por úl-timo, en lo que se refiere a la influencia delos ecosistemas naturales, deben conside-rarse también el efecto de la invasión hu-mana en territorios salvajes y el uso inde-bido de la tierra, incluyendo las prácticasde deforestación, la caza furtiva incontro-lada, el comercio de animales exóticos oel comercio clandestino de animales vivosy el consumo de carne procedente de ani-males salvajes, todo lo cual condiciona einfluye en la fragmentación del hábitat,pérdida de biodiversidad y cambio climá-tico. A estos factores deben sumarse tam-bién los dependientes de los propiosagentes patógenos y su evolución y adap-tación particular, dependiente de su natu-raleza (principalmente virus, pero tambiénbacterias, protozoos, hongos o priones),sobre la que influyen muchas de las varia-bles enunciadas antes y otras propias.

Tanto la vigilancia (detección y diagnós-tico), como el control de las enferme-dades zoonósicas emergentes han sido yson, actualmente, cuestiones de grancomplejidad, en las que cuentan, y no


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Figura 2. Zoonosis emergentes (AVMA, 2008) (11).

Figura 3. La interfaz entre el hombre y los animalesy sus consecuencias en la aparición de enferme-dades emergentes (12).


poco, problemas de comunicación y con-sulta entre las autoridades e institucionesde Salud Pública y de Veterinaria. Hoy sesabe bien que estos canales de comuni-cación deben establecerse con claridad ymejorarse, para incluir los animales sal-vajes y los ecosistemas.

Tanto los hábitats naturales como elmedio ambiente que está manejado porhumanos, como ocurre con los sistemasy las cadenas de producción de alimentos,constituyen hábitats en los que puedenemerger, circular, cambiar su dinámica depresentación, e incluso cambiar de es-pecie hospedadora, los agentes pató-genos productores de enfermedades in-fecciosas (de los animales y del hombre).El reconocimiento de la interrelación delos respectivos dominio de Salud y losriesgos que representan las zoonosis (es-pecialmente para el hombre), demandauna interacción más horizontal entreSanidad Animal y Salud Pública, o lo quees lo mismo, entre todos los sectores queposeen responsabilidades y competenciassobre ellas (instituciones, departamentos,ministerios y profesiones), incluyendo laMedicina Humana y la Veterinaria. Esta esla idea de “Una Salud”, que se viene re-clamando desde muchos sectores comouna necesidad ya desde 2003, con oca-sión de la emergencia de la influenza aviaraltamente patógena, o gripe aviar, en elsudeste asiático. Desde aquella fecha, ladetección, prevención y control de lagripe aviar ha sido una especie de cru-zada, con atención al más alto nivel inter-nacional, que ha propiciado reuniones anivel ministerial en Beijing y Bamako en2006, en Nueva Delhi en 2007, en Sharmel-Sheikh en 2008 y una consulta sobreSalud en Winnipeg en 2009. Nunca antes

había sucedido nada parecido; de todoello ha surgido el “Global Program onAviar Influenza” (GPAI), que, aunque nocumpla con todas las aspiraciones con lasque fue diseñado, ha establecido un pre-cedente significativo para el control de lasenfermedades emergentes, cuyo progresoy desarrollo futuro corresponde tanto alas organizaciones internacionales comoa las instituciones nacionales. La tarea im-plica la detección, identificación, predic-ción, prevención y control de las enferme-dades infecciosas emergentes, incluyendoen ellas a las que se ocupan de la faunasalvaje y el medio ambiente.

La iniciativa “Una Salud”, que representael reconocimiento de las interconexionesentre la salud humana, animal y ecológica(ambiental), busca incrementar la comu-nicación, colaboración y cooperación através de un amplio número de disciplinasque incluyen la Medicina Humana yVeterinaria, la Salud Pública, la Microbio-logía, la Parasitología, la Inmunología, laEcología, la Epidemiología y otras. Puededefinirse como “una estrategia mundialpara ampliar las colaboraciones y comu-nicaciones interdisciplinarias en todos losaspectos de la salud referidos al hombre,los animales y el ambiente” (13). “UnaSalud” representa una ocasión extraordi-naria de convergencia y sinergia en el ám-bito de las enfermedades infecciosas,principalmente emergentes, entre las


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Figura 4. Iniciativa “Una Salud”. http://www.onehe-althinitiative.com/.


oportunidades de los países industriali-zados y los países en desarrollo (14).

En la mitología griega ya se hace refe-rencia a la figura del centauro Quirón, alque se refiere Lucio Moderato Columela(4-70 d.C.) en su obra De re rustica, queademás de maestro prudente, juicioso ysabio, era músico, y conocía las artes dela curación con las que aliviaba el sufri-miento de humanos y animales. Era, pues,un claro precedente del médico y veteri-nario actuales. Como señala Cordero(1987) (15), Quirón representa el símbolode la unidad, pues no solo actuó comomédico, veterinario y naturalista, sino quecompartió su sabiduría con numerososdiscípulos, incluidos Asclepio (Esculapio)en Medicina (considerado el padre de laMedicina) y Melampo, en Veterinaria.

Las Facultades de Veterinaria en España y,en otros lugares, han elegido el simbo-lismo de su figura (“el primer médico deanimales”) para representarlas. El exce-lente vitral que figura en el vestíbulo dela Facultad de Veterinaria de León, obradel artista leonés D. Luis García Zurdo, re-presenta al centauro Quirón, y la reciénnacida Academia de Ciencias Veterinariasde Castilla y León ha adoptado esta figuracomo parte de su emblema. La figura deQuirón se acompaña, en la vidriera, detextos de Virgilio y San Isidoro (Geórgicas

y Etimologías) que han sido referidos porCordero (1987).

La Historia, por su parte, se encarga deunir la Medicina Humana y la Veterinariaen alguno de los acontecimientos másnotables que sucedieron en el pasado,como el que se refiere al que fuera unode los más grandes azotes del ganadobovino a lo largo de los años, la peste bo-vina, la segunda enfermedad infecciosaque se ha declarado extinguida, despuésde la viruela, merced a los beneficios dela vacunación.

Giovanni Maria Lancisi (1654-1720) (16)que fue médico personal de varios Papas,anatomista y epidemiólogo, es reconocidocomo un precursor del concepto de “UnaMedicina, una Salud” cuando fue encar-gado por Clemente XI para llevar a caboun estudio sobre la enfermedad, con elpropósito de su control. Publicó De bovillapeste (1715), en la que describe la enfer-medad y propone medidas para su con-trol; la más relevante de todas, la que hoyconocemos como stamping out, consis-tente en el sacrificio y destrucción de losanimales sospechosos (vaciado sanitario)alrededor del foco de infección, propor-cionando instrucciones precisas acerca delenterramiento de los animales sacrifi-cados, de la prohibición del movimientode los animales y de la adopción de me-


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Figura 5. Vidriera de Quirón en la Facultad de Veterinaria de León. Autor: Luis García Zurdo.


didas higiénicas y políticas pertinentes,principios que fueron aplicados posterior-mente (aún hoy lo siguen siendo) a otrasmuchas enfermedades en los programasde control y erradicación. Aunque la pestebovina no es una zoonosis, su repercusiónsobre la Salud Pública es evidente, al sercausa de hambre y desolación económica,reiteradamente descrita y temida. No envano fue esta enfermedad una de las ra-zones que justificaron, como ya hemosseñalado, (ver notas 6 y 7, al final), la cre-ación de las primeras escuelas deVeterinaria, igual que de la OrganizaciónMundial de la Sanidad Animal (OIE).

A comienzos del siglo XVIII, E. Jenner, elprimer inmunólogo, realizó la primera va-cunación de la que se tiene noticia, ino-culando virus de la viruela de las vacas alniño James Phipps, protegiéndole delvirus humano. Más recientemente, RudolfVirchow (1821-1902), un médico y pató-logo alemán, considerado el padre de laMedicina Moderna, llegó a afirmar que“entre la Medicina Humana y Animal, nodeberían existir líneas divisorias”. Virchow,que era hijo de un carnicero, fue el pri-mero en utilizar el término “zoonosis” ensus estudios sobre triquinosis, descri-biendo el ciclo de Trichinella spiralis en eltejido muscular del cerdo.

En 1964, Calvin Schwabe, considerado elfundador de la Epidemiología Veterinaria,acuñó el término “Una Medicina” paraexpresar la interrelación existente entre lasalud humana y la animal y las realidadesnecesarias para la prevención de las zoo-nosis. “Una Medicina” significaba el re-conocimiento de los riesgos que las zoo-nosis representan para el ser humano, susnecesidades alimentarias y su economía.Reconocidas las interrelaciones de la salud

del hombre, de los animales y del ecosis-tema, la forma más racional de coordinarlas políticas y la acción entre las institu-ciones responsables de Salud Pública,ciencia médica y servicios veterinarios con-duce a la definición del mensaje “UnaSalud”, al que aquí nos referimos.

En 1975, la FAO, la OIE y la OMS editaronun informe conjunto titulado “La contribu-ción de la Veterinaria a la práctica de laSalud Pública” (The Veterinary Contribu-tion to Public Health Practice), que esta-bleció el concepto de Salud PúblicaVeterinaria (también se ha referido comoVeterinaria de Salud Pública) como un áreade cooperación entre las tres organiza-ciones que puede considerarse el embriónde lo que, años más tarde, se convertiríaen la plataforma para respuesta interna-cional frente a la peste aviar. El conceptode “Una Salud” fue ampliado después in-corporando la salud de los ecosistemasademás de la del hombre, animales do-mésticos y animales salvajes. El mismoCordero (1987), referido antes, se mani-fiesta a favor de la unidad de la ciencia y,como tal, de la existencia de una únicaMedicina, “una ciencia y arte de curar,cualquiera que sea el ser vivo al que seaplique”. En 2004, la Sociedad Mundial deConservación (World Conservation Society)celebró en la Universidad Rockfeller un sim-posio titulado “Un Mundo, una Salud”.

Todas las especies de animales, inclu-yendo el hombre, y las plantas, loshongos, protozoos y bacterias, en defini-tiva, todas las formas de vida que pueblanla Tierra (excepción hecha de los virus queson parásitos absolutos, dependientes deotras formas de vida), comparten princi-pios básicos de metabolismo, reproduc-ción y desarrollo. La mayoría de los


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agentes patógenos pueden infectar másde una especie hospedadora y solo unospocos se restringen a una, aunque esteno sea un hecho definitivo, ni perma-nente, pues constantemente se producencambios o saltos de la “barrera de es-pecie” que hacen que agentes conocidosaparezcan (emerjan) como nuevos en unaespecie hospedadora diferente.

El hombre siempre ha estado sometido alriesgo de contraer enfermedades infec-ciosas, desde su época de cazador a laépoca en la que se asienta y se convierteen agricultor y ganadero. Es más, la do-mesticación y cría de los animales para subeneficio (producción de alimentos, ropay trabajo) supone un evidente incrementodel riesgo, relacionado con la proximidad,más estrecha de aquellos y este. La per-sistencia de enfermedades emergentes deorigen zoonósico ha sido especialmentesubrayada en el siglo XX sobre numerosasenfermedades de los animales, como larabia, la brucelosis, la tuberculosis o elcarbunco bacteridiano. El último tercio secaracterizó por la emergencia de enfer-medades víricas, destacando sobre todasellas el síndrome de inmunodeficienciaadquirida (sida) y, mas recientemente, elsíndrome respiratorio agudo grave (SARS),encefalopatía espongiforme bovina (EEB)y, principalmente, la influenza o gripeaviar y su potencial riesgo de pandemiapor el virus influenza H5N1.

Estas enfermedades unen, a su interés sa-nitario, un no menos importante interéseconómico, calculado tanto en función delos costes directos como indirectos y enconjunto. Se ha calculado, por ejemplo,que la emergencia de la EEB, el SARS, lagripe aviar por H5N1 y la influenza porH1N1 han supuesto pérdidas económicas

directas (pérdidas derivadas de costes porservicios de Salud Pública y SanidadAnimal, indemnizaciones por pérdidas deanimales o pérdidas en producciones) demás de 20.000 millones de dólares en losúltimos años, a lo que se suman nomenos de 200.000 millones de dólares depérdidas indirectas (pérdidas en otraspartes de la cadena de producción ali-mentaria, comercio, turismo, etc.). Soloen el Reino Unido, entre 1990 y 2008, laspérdidas económicas debidas a la EEB su-maron más de 7.000 millones de dólaresy la influenza aviar, en el sudeste asiático,fue causa de más de 10.000 millones dedólares de pérdidas en el sector ganadero.Si la influenza aviar se resolviera en la te-mida pandemia de gripe (lo que todavíano se ha descartado), las pérdidas alcan-zarían los 2 billones de dólares (17).

Todavía, al lado de las enfermedades in-fecciosas emergentes, hay que contar conotras enfermedades, las denominadas“enfermedades desatendidas”, como larabia, la tuberculosis bovina, la brucelosiso diferentes enfermedades parasitariasque suponen cargas significativas para lasalud, la mayoría de las cuales tienen unagran importancia en los países más po-bres. Cada año fallecen en el mundo másde 55.000 seres humanos como conse-cuencia de la rabia, de los que el 95% omás de los casos tienen lugar en Asia yÁfrica. De tuberculosis se cuentan casi 2millones, de los que hasta el 8% de losmismos son de origen bovino (18) (nosiendo este el único origen animal). Lalista podría continuar con infecciones otoxiinfecciones transmitidas por ali-mentos, principalmente salmonelosis,campilobacteriosis, infecciones entéricaso extraintestinales por E. coli y otras,


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cuyos costes alcanzan valores extraordi-narios, computando tratamientos, hospi-talizaciones, fallecimientos y secuelas. Porejemplo, un reciente informe del BancoMundial relativo a los costes directos e in-directos por enfermedades transmitidaspor alimentos en Vietnam daba la cifra de1.000 millones de dólares al año (19), yeso que unánimemente se admite una su-bestimación de las cifras.

Pese al progreso científico, existe una am-plia variedad de factores que facilitan yjustifican el incremento actual de la inci-dencia de las enfermedades emergentes.Debe considerarse, por ejemplo, la explo-tación intensiva y la concentración de losanimales, la presión de los sistemas deproducción de alimentos, el incrementomundial de los viajes y el comercio, en ge-neral, que afecta al hombre, los animalesy los productos de origen animal, todo locual ha permitido la evolución de losagentes patógenos que al final produceuna creciente y variada gama de riesgos.En cualquier caso, las fuentes de infecciónen las enfermedades zoonósicas no se li-mitan al hombre y los animales domés-ticos, sino que también se extienden a lafauna salvaje, que representa, además,uno de los puntos principales. Los ecosis-temas salvajes se caracterizan por un ajus-tado equilibrio dinámico entre todos suscomponentes, que incluyen flujos de ma-teria orgánica y energía, y de organismosvivos. Mientras que los agentes pató-genos son una parte muy importante deeste balance, la previsión de su excesoestá compensada con circuitos negativos,como los que inducen más resistencia enlos hospedadores. Conceptualmenteexisten dos tipos de factores que puedendesestabilizar los ecosistemas salvajes y su

papel en la salud global: por un lado, sudestrucción y fragmentación, como su-cede por ejemplo en el caso de la defo-restación, que rompe el equilibrio entrelas diferentes especies y que puede hacerque una en particular se convierta en do-minante. Por otro lado, también se puededesestabilizar el sistema como resultadode la interacción de los ecosistemas conel hombre, pues de ello pueden derivarsemás oportunidades para el intercambio depatógenos, incluyendo la transmisión a in-dividuos “vírgenes” o sin protección. Lasexplotaciones animales en las zonas tro-picales, el consumo de carne de animalessalvajes o el ecoturismo son ejemplos detipos de interacciones que pueden crearoportunidades para que los agentes pa-tógenos ejecuten “saltos” de la barrerade especie. En la práctica, ambos factorespueden solaparse y facilitar la aparición oemergencia de agentes patógenos “apa-rentemente nuevos” en ecosistemas denuevo origen.

Uno de los factores más importantes en elcontrol de cualquier enfermedad emer-gente es su detección precoz, así como elconocimiento de su epidemiología. Amboselementos permitirán a los organismoscompetentes organizar y ejecutar las me-didas que correspondan en relación conel control de la enfermedad, actuandosobre la fuente de infección, reduciendosu difusión y previniendo la progresión auna forma endémica. Cualquier retraso oerror en las primeras fases tiene conse-cuencias sobre las siguientes. Puede exis-tir, por ejemplo, falta o disponibilidad derecursos inapropiados o faltos de sensibi-lidad o especificidad, que conducen a fa-llos diagnósticos, pero también puedendeberse a fallos en la propia capacidad


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humana o técnico-administrativa, lo quecon frecuencia se observa en países endesarrollo, con estructuras burocráticascomplejas o deficientes. Estos problemas,a la postre, impiden la efectividad de losrecursos económicos, cuando existen, ohacen que los disponibles resulten las másde las veces insuficientes. Pero muchos deestos problemas no solo suceden en lospaíses en desarrollo sino también en elmundo desarrollado, por el cruce de com-petencias entre profesiones, celos corpo-rativos y mala organización, que en elpasado ha dado múltiples pruebas nega-tivas, y todo lo contrario de lo que se haaprendido sustancialmente desde losgraves acontecimientos de la epidemia degripe aviar por el virus influenza H5N1. ElGPAI, al que antes se hizo alusión, pusode manifiesto las ventajas que se derivande una actuación conjunta, coordinada ycolaboradora entre los servicios veterina-rios y los de salud pública, que han sidodefinidas en dos niveles distintos: por unlado, el establecimiento de canales de co-municación, informativos, acerca de laaparición de brotes, entre los organismosde competencia en Salud Pública ySanidad Animal, y por otro lado, una co-ordinación necesaria.

Apostar por “Una Salud” supone inter-venir en numerosos planos profesionales,incluyendo los curricula formativos, en losque se debe incidir más en aspectos quese traducen en ventajas para el objetivofinal de controlar o erradicar las zoonosisemergentes y las enfermedades emer-gentes en general. Énfasis especial debehacerse en el conocimiento epidemioló-gico de estas enfermedades y su repercu-sión en los ecosistemas humano y ani-males, pero también en los estudios

etiológicos y patogénicos, en el desarrollode métodos de diagnóstico rápidos y pre-cisos que permitan el establecimiento deun sistema de vigilancia muy sensible yeficaz, igual que en la aplicación de lasnuevas y modernas tecnologías al desa-rrollo de procedimientos eficaces para sucontrol, incluyendo medidas sanitarias ypreventivas, en particular la disponibilidadde vacunas.

Los compromisos de la SanidadAnimal

L. King (2009) señala como competenciasfundamentales de la Sanidad Animal ySalud Pública, en los que está comprome-tida la profesión Veterinaria, las siguientes:1) inocuidad y seguridad alimentaria; 2)resistencia a los antimicrobianos; 3) de-gradación ambiental y sostenibilidad; 4)aumento de la huella ecológica del car-bono e ingente consumo energético delos sistemas de producción animal; 5) vul-nerabilidad de los animales por la inten-sificación de los sistemas productivos; 6)movimientos de animales exóticos y susderivados; 7) bioterrorismo y agroterro-rismo; 8) intervención de la fauna salvajeen la transmisión de enfermedades; 9) en-fermedades transmitidas por los ali-mentos, el agua o por vectores; 10) apa-rición y reaparición de nuevas zoonosis(emergentes y reemergentes); 11) apari-ción y reaparición de nuevas enferme-dades de los animales (emergentes y ree-mergentes), y 12) comercio mundial dealimentos y animales.

Es verdad que esas tareas recogen mayo-ritariamente los campos en los que la pro-yección sanitaria de la Veterinaria actualestá actuando, o debe estarlo, más omenos. Desde un punto de vista acadé-


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mico, preferimos establecer los objetivosde la Sanidad Animal en dos grandesgrupos, que podríamos denominar obje-tivos generales y objetivos concretos, res-pectivamente.

El objetivo general más simple no puedeser otro que lograr la erradicación de lasenfermedades infecciosas de los animales,en todas sus aptitudes y opciones posibles(domésticos, de compañía, salvajes, etc.),incluyendo las que son transmisibles alhombre. Como puede fácilmente com-prenderse, lograr esto es, simplemente,una utopía y como tal debe entenderse.No obstante, igual que el deber del mé-dico es eliminar la enfermedad humana,el del veterinario debe ser hacer lo propiocon las que afectan a los animales, tareatodavía mucho más ardua, habida cuentade la multitud de especies que sería pre-ciso considerar, sin descartar ninguna. Poresta razón, la Sanidad Animal se planteaotras alternativas de mayor concreción,compatibles con la idea final de lo posible,haciendo uso de los instrumentos que laciencia y la técnica ponen a su alcance.

Enfermedades infecciosas de los animales,Sanidad Animal en suma, supone consi-derar, en la práctica, un alto número devariables para tratar siquiera de definirgroseramente su alcance; distintas espe-cies animales, diferentes agentes pató-genos causales, intereses prioritarios (porejemplo, producción de alimentos, co-mercio, Salud Pública), relaciones con laecología, el medio ambiente, la conserva-ción y la biodiversidad, disponibilidad deinfraestructura y recursos, etc., que encada caso marcan las actuaciones de lasautoridades responsables, pero cuya com-plejidad puede incrementarse hasta el in-finito.

Los desafíos o los retos que supone in-tentar conseguir el objetivo general sonnumerosos y exigen de sus ejecutores pre-paración, conocimiento, medios tecnoló-gicos, capacidad de trabajo e integraciónen equipo, además de una buena dosisde generosidad y entrega y, por encimade todo, una gran vocación. Considera-remos, en primer lugar, los dos elementosimprescindibles en los que se mueve laSanidad Animal, sus causas y sus conse-cuencias (las de la enfermedad infec-ciosa).

No se puede entender la Sanidad Animalsin un conocimiento adecuado de losagentes causales de las enfermedades in-fecciosas de los animales. Es un desafíoactual de la Sanidad Animal, y lo seguirásiendo en el futuro, el estudio de losagentes patógenos, bacterias, hongos,protozoos, helmintos, virus y priones,como de cualquier otra especie que tengatal consideración y que pueda ser descritaen los años venideros. No se puede com-batir al enemigo sin conocerle antes ymucho menos si este hace gala de unagran diversidad, presenta una enorme he-terogeneidad y una gran ventaja evolutivaen relación con otros seres vivos, queviene dada por la velocidad de reproduc-ción y crecimiento y la extrema simpli-cidad estructural de algunos de ellos,como sucede con los virus, que les per-mite adaptarse evolutivamente a las con-diciones del medio, adquiriendo, me-diante procedimientos simples, caracteresque les proporcionan una posición có-moda y les permite sobrevivir. La SanidadAnimal, como parte especializada de laVeterinaria, necesita conocer cómo y enqué condiciones, bacterias, protozoos,hongos o virus utilizan estructuras, pro-


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ductos de secreción, mecanismos o estra-tegias, factores de virulencia en suma,que les permiten superar los mecanismosde defensa orgánica, colonizar el hospe-dador susceptible y consumar el procesoinfeccioso. Conociendo estos hechos sedescubren también puntos débiles delenemigo patógeno que podrán ser utili-zados en su contra, de algún modo.

Tanto como ello, a la Sanidad Animal leinteresa también la identificación y carac-terización, en la mayor profundidad po-sible, de los agentes patógenos impli-cados en una determinada enfermedad,pues de tal conocimiento pueden obte-nerse datos que se aprovechen despuéspara el establecimiento de prácticas en es-trategias o programas de lucha general oparticular. A este respecto, dos conside-raciones son necesarias: por un lado, en-tender que pese a que el nivel taxonó-mico de especie ha venido siendo elcriterio más utilizado para otorgar respon-sabilidad o no a un determinado agenteen una enfermedad concreta, los nuevosmétodos de identificación y clasificaciónantigénica y sobre todo genética o mole-cular ponen de manifiesto, además deciertas inexactitudes fenotípicas, la exis-tencia en muchos casos de una gran va-riabilidad intraespecífica (tipos, subtipos,biotipos, patotipos, serotipos, serovares,genotipos, etc.), con diferencias, en oca-sión, tan importantes en lo que se refierea la patogenicidad y virulencia, que la im-plicación de especie en el suceso morbosocarece de valor, y desde este punto devista es casi obligado referirse a la “cepa”,al tipo, a la serovar, factores predispo-nentes, susceptibilidad y condiciones dela misma, etc. Los recursos finos de carac-terización de los patógenos permiten,

además, cuando se estudia una determi-nada enfermedad en una población de re-ferencia concreta (una explotación animal,una población en un territorio geográficodeterminado, etc.) e incluso en un mismoindividuo, concluir acerca de cuestionesepidemiológicas (fuente de infección, me-canismo de entrada en una explotación,etc.) y adoptar estrategias o disposicionesconcretas con el objetivo de controlar laenfermedad, impedir su difusión, etc. Eneste punto es obligado entender que enel ámbito animal especialmente, pero noexclusivamente, las etiologías singulares,únicas o puras, cada vez están siendo másexcepción que regla. Sea por el sistemade explotación (en el caso de los animalesdomésticos), por la menor resistencia delas razas más productoras, o por otra ra-zones, es más frecuente en la práctica en-contrarse con procesos de etiología mixta,compleja, mezclas de bacterias, de bacte-rias y virus, de virus y protozoos, o detodos ellos, adquiriendo especial rele-vancia en el resultado final agentes pató-genos que por sus propios medios seríanincapaces de producir daño o daño im-portante en hospedadores sanos, mien-tras que de su asociación con otros, apro-vechándose de caídas de inmunidad,especialmente de la resistencia innata a lainfección, los resultados pueden ser de-sastrosos, comprometiendo la vida del in-dividuo y el hundimiento económico dela explotación, llegado el caso.

Debe reconocerse que en este punto,como en el anterior, los estudios sobre pa-tógenos humanos o los de aquellos quetienen el doble interés humano y animal,por ser causa de zoonosis, están mar-cando el camino para todos. Además deello, las nuevas tecnologías y en particular


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la genómica y la proteómica, especial-mente desde la secuenciación del ge-noma humano, están poniendo a dispo-sición de los científicos, investigadores ytecnólogos recursos impensables hace tansolo unos años. La Sanidad Animal, tieneante si un importante desafío referido aldesarrollo y uso de la Biotecnología apli-cada al conocimiento de los agentes queproducen enfermedades infecciosas de losanimales, desde la secuenciación del ge-noma de agentes patógenos de animalespara la identificación de factores de viru-lencia a la utilización de secuencias espe-cíficas para el desarrollo de métodos dediagnóstico y vacunas (ver después).

En cualquier caso, la enfermedad es unaconsecuencia de la compleja interacciónentre un hospedador susceptible y unagente dotado de suficiente capacidadpara establecerse en el primero y produ-cirle daño, incluso la muerte. Por estarazón, tanto como conocer al enemigo,el agente patógeno, es preciso conocertambién el modo en que tiene lugar la en-fermedad misma, para lo cual es nece-sario comprender primero en qué basesasienta la susceptibilidad o resistencia auno determinado, cómo puede mejorarsela segunda o disminuir la primera y dequé manera se desarrolla el proceso pa-togénico que, al final, justifica el cuadroclínico o el desenlace fatal si aquel no sesupera.

En lo primero, uno de los desafíos de laSanidad Animal tiene que ver con resolverel enigma que relaciona los patógenoscon sus hospedadores respectivos: ¿quéhace que los agentes patógenos sean tandiferentes en lo que a disponibilidad dehospedadores susceptibles se refiere?,¿qué diferencias definen un patógeno de

hospedador único, como sucede en elcaso de la peste porcina africana, y otrocapaz de producir enfermedad en unaamplia variedad de animales, como su-cede con el virus de la rabia o las especiesde bacterias del género Brucella? ¿Existenrazones de ventaja evolutiva en alguno delos casos?, ¿solamente puede explicarsela susceptibilidad o resistencia en funciónde la existencia de receptores celulares es-pecíficos, como ocurre en la discrimina-ción o facilitación de los virus de la in-fluenza aviar, por los receptores presentesen las células aviares?, ¿qué otras razonesjustifican la resistencia?, ¿la resistencia esestable?, ¿cómo se producen los saltos dela barrera interespecífica? Son muchas laspreguntas y escasas las respuestas, perola Sanidad Animal debe estar en primeralínea para investigar estos hechos, puesno solo es el interés de su conocimientopara su control, sino como un servicio mása ese interés común al que nos referimosmás atrás, bajo el enunciado “Un Mundo,una Medicina, una Salud”, pues al fin y alcabo muchos de los agentes de enferme-dades animales o de zoonosis (SARS,Nipah, VIH, EEB, etc.) cuando se han des-crito por vez primera en el hombre no hasido otra cosa que el resultado de un salto,no previsto, desde una especie animal,como consecuencia de razones mal com-prendidas, en la mayor parte de los casos,objeto de hipótesis o teorías de difícil jus-tificación y cuyo descubrimiento interesapor igual a la Medicina Humana y a laVeterinaria. Estudiando la resistencia na-tural, heredable, a la infección por deter-minados agentes patógenos, se estándando también pasos de gran interés parala selección animal para caracteres de re-sistencia frente a enfermedades infec-


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ciosas, como la mastitis bovina u ovina, latembladera ovina (scrapie) y otras; un ca-mino que representa una línea de gran in-terés, si se puede desvincular de otros con-dicionantes negativos.

En su defensa ante la infección, el hospe-dador susceptible pone en marcha meca-nismos inespecíficos (inmunidad innata) yespecíficos (inmunidad adaptativa) quetratan de resolver a su favor el desenlacede la agresión patógena. Unos y otros con-tribuyen definitivamente al cuadro clínicoque caracteriza la enfermedad, y en nopocas ocasiones las lesiones y secuelas sedeben tanto a la agresión como a la propiarespuesta. Por esta razón interesa tanto ala Sanidad Animal conocer lo que sucedeen las distintas etapas de la infección-en-fermedad, qué recursos pone en juego elorganismo y cuáles son sus consecuenciasy, desde la óptica médica, si procede o nola intervención para modular la respuestay con ello sus consecuencias negativas. Deeste conocimiento pueden derivarse mé-todos de prevención y/o control nuevos,más eficaces y selectivos pero, como antesseñalábamos, no solo eso, sino que deestos conocimientos también puede bene-ficiarse la Medicina Humana, como una es-pecie de pago por servicios contrarios ocomplementarios. Haemophilus influenzaey Neisseria meningitidis son dos patógenoshumanos específicos, de gran interés mé-dico, causas principales de meningitis enniños. Actinobacillus pleuropneumoniae yHaemophilus parasuis son dos patógenosespecíficos del cerdo, muy semejantes a losanteriores, especialmente el segundo, quees causa también de meningitis en el ga-nado porcino, además de otros problemasde tipo respiratorio o sistémico. Se estánproduciendo avances significativos en el

conocimiento tanto de los mecanismos devirulencia como en la patogénesis deambos grupos, que son utilizados comomodelos aplicables unos a los otros.

Tradicionalmente, el conocimiento de larespuesta inmune se ha venido vinculandode modo principal a la respuesta humoral,estableciendo una relación más o menosdirecta entre título de anticuerpos y efi-cacia de inmunidad activa protectora. Elprofundo impulso de la Inmunología, re-ferido tanto a la respuesta humoral y suontogenia, como sobre todo a la respuestacelular y la suya, conjuntamente con losmecanismos efectores puestos en juegoen cada caso, han de ser utilizados por laSanidad Animal para conocer la dinámicaque se establece en relación con las pobla-ciones y subpoblaciones de linfocitos T im-plicados en la respuesta, la intervención delos distintos linajes de células presenta-doras de antígeno y su eficacia correspon-diente en el procesado de los mismos, lacomplicada diversidad de receptores desuperficie en los distintos tipos de célulasy los mediadores químicos implicadoscomo señales o estimuladores inmunes enla activación de las distintas estirpes de cé-lulas. En este desafío, igualmente, la Sani-dad Animal va de la mano de la MedicinaHumana, a la que sirve de campo de prue-bas, de planta piloto en la que experimen-tar muchos de los avances que despuésse aplican también en el hombre.

Desde el punto de vista de la enfermedad,uno de los compromisos a los que se en-frenta la Sanidad Animal en los próximosaños tiene que ver con el desarrollo de laepidemiología de las enfermedades infec-ciosas, en particular a la que se refiere a lasenfermedades emergentes, con especialatención a las zoonosis. En un mundo glo-


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balizado, con enormes facilidades para eltraslado de los agentes patógenos entre te-rritorios, incluso muy distantes, vehiculadospor hospedadores susceptibles, enfermoso reservorios subclínicos, domésticos o sal-vajes, de forma legal o clandestina, demodo natural o con intervención huma-na, apoyados por medios de transporteque mueven al año cantidades ingentesde todo tipo de especies, productos deorigen animal en los que puede mante-nerse el riesgo, etc., con una sucesión tanlarga y prolija como la que se ha citado defactores que favorecen la emergencia delas enfermedades, su propia dinámica, suepidemiología, es una cuestión absoluta-mente crítica, necesaria e insustituibletanto para la prevención como para laaplicación de medidas y estrategias delucha, control y erradicación, con oportu-nidades de éxito. Por si fuera poco, a todoello se suma en estos momentos el cre-ciente interés e influencia demostrada delaumento de la temperatura del planeta(lo que hemos denominado cambio climá-tico), que facilita cambios que desplazanvectores invertebrados y vertebrados,principalmente roedores, habituales por-tadores de muchos agentes patógenos,que cambian los patrones epidemioló-gicos tradicionales. Sirvan de ejemplo lossucedidos en relación con la lengua azul,la encefalitis del Nilo Occidental o la tula-remia para poder entender el alcance deestos extremos.

La Sanidad Animal debe prepararse a con-ciencia para estos cambios, desde lasaulas de las Facultades de Veterinaria alcampo (en los que muchas veces los pro-fesionales se encuentran con procesosirreconocibles tal como les fueron dadosa conocer académicamente, siendo causa

de sorpresa), desarrollando metodologíascapaces de organizar, calcular o prever ladirección de un determinado proceso. Eldesarrollo de un sistema de VigilanciaEpidemiológica, apoyado en marcadorescentinelas, cualquiera que sea su carácter,tipo o condición, debe anticipar los cam-bios que anuncian la presencia de la en-fermedad, antes incluso que se produzcala aparición de un foco o de que se dis-ponga de un diagnóstico definitivo.

La Sanidad Animal, nuevamente, debe in-corporar los instrumentos y métodos quelas nuevas tecnologías (biología y genéticamoleculares, microbiología, inmunología,biotecnología) ponen a su disposición parallevar a cabo estudios comparativos quepermitan, una vez establecido un foco deinfección, anticiparse a su progreso, paraevitar que se alcancen dimensiones ma-yores, de brote epidémico, pongamos porcaso. Debe tenerse presente, en el caso delos animales domésticos productores dealimentos, la extraordinaria dimensión deefectivos en una explotación y la facilidadde difusión ante un posible caso o foco deenfermedad infecciosa, particularmente sisu modo de transmisión es respiratorio,pero no solo, también cuando es el aguao el alimento contaminado el vehículo dedifusión. Aunque distinto, la explotaciónextensiva, la cría de animales al aire libreen extensiones grandes, tiene tambiénotro tipo de oportunidades de difusiónnada despreciables, que incluyen la posi-bilidad de contacto con fuentes de infec-ción ambientales, en las que los animalessalvajes pueden estar en el núcleo del pro-ceso. Nuevamente, un análisis epidemio-lógico riguroso, de concepto y contenido,no de simple compromiso de encuesta(cuyo valor no se cuestiona, especial-


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mente si está diseñada con criterios cien-tíficos), representa a la vez un reto y unrecurso inestimable en la organización delos planes de lucha.

El diagnóstico es el primer paso firme paradenunciar la presencia de la enfermedady poner en marcha los recursos para lalucha y control, que complementan losque se refieren a la vigilancia. Aunque enmateria de diagnóstico todos los métodosson útiles, cada tipo de población o con-dición exige una consideración diferente,y la Sanidad Animal debe responder atodas con eficacia y prontitud. El diagnós-tico debe ser rápido y certero y, en la me-dida de lo posible, dependiendo de lascondiciones que se den en cada caso, in-tegrar la mayor información disponiblepara asegurar el dictamen. Exceptuandoel caso de animales de aptitudes singu-lares (animales de compañía o de granvalor por razón de una aptitud o capa-cidad especiales), lo cierto es que el valordel “ojo clínico”, más subjetivo, ha venidocediendo progresivamente posiciones afavor de los controles sistemáticos reali-zados al azar sobre muestras remitidas allaboratorio. Es tanto lo que se pone enjuego que cada vez se improvisa menos,y ante la menor sospecha se ponen enpráctica las pertinentes medidas de con-trol que el técnico considera más ade-cuadas o la Administración exige. Un re-traso de días en aclarar la naturaleza deuna enfermedad infecciosa puede suponerun desastre incontrolable, pero tambiénun diagnóstico equivocado, y la adopciónde medidas que no se correspondan conla causa de la misma conduce a idénticoresultado. En cada situación, lo que se re-fiere a la gravedad, tasa de difusión, mor-bilidad y mortalidad, debe de ser ponde-

rado para establecer el límite máximo detiempo disponible para decidir la conclu-sión, aunque, como norma, cuanto másrápido se obtenga esta, mayor facilidadpara su control.

Los métodos tradicionales basados en elestudio del cuadro clínico y anatomopato-lógico, si se quedan en eso, suelen ser in-suficientes. El laboratorio es insustituible,entre otras razones porque su capacidadde acierto se basa en datos objetivos, quedeben ser interpretados correctamente.Ahora bien, el dilema se plantea en rela-ción con el uso de métodos de demostra-ción directa del agente (en el caso de mi-croorganismos o parásitos, su aislamiento,identificación y caracterización), de parteso fragmentos del mismo (detección dematerial genético o de sus antígenos) o in-directa (detección de anticuerpos, estudiode la inmunidad de base celular y sus me-diadores, etc.). Siempre es preferible, si lagravedad del caso lo aconseja y justifica,utilizar métodos rápidos, preferiblementedirectos, pero aunque sean indirectos ysusceptibles de errores (principalmenteproblemas derivados de la sensibilidad yespecificidad de la técnica), confirmandodespués mediante técnicas convencionalesque, además de ello, permiten disponerde un material aprovechable en otras de-terminaciones y estudios.

Pero, como quiera que sea, las enferme-dades infecciosas, particularmente las en-fermedades víricas, de mayor complejidaden el diagnóstico directo, exigen antetodo respuestas rápidas, y este es el com-promiso particular de la Sanidad Animalen este campo: el desarrollo de métodoscapaces de llevar a cabo, con rigor y cer-teza, cientos o miles de estudios en elmenor tiempo posible. Resumiendo pues,


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podríamos señalar que en materia dediagnóstico los desafios implican: sensibi-lidad, especificidad, rapidez y adaptabi-lidad.

Las técnicas moleculares, sin duda alguna,son la respuesta de mayor autoridad en laactualidad, sin despreciar los métodos se-rológicos. Nuevamente la Biotecnología,la Biología Molecular, las nuevas tecnolo-gías en suma, prestan a la Sanidad Animalel auxilio que necesita, y su avance se pro-duce a tanta velocidad en los últimos añosque en ocasiones resulta difícil seguir sudesarrollo. Por esta razón la SanidadAnimal no solo debe formar especialistasen estas tecnologías, sino procurar su ac-tualización periódica y permanente.

Por último, diagnosticado un proceso par-ticular, se impone su control y eliminacióny/o su prevención a partir de aquella. Estees también un campo critico para laSanidad Animal, en el que se producen al-gunos de los compromisos de mayor ac-tualidad. Hemos de diferenciar cuanto serefiere a recursos y métodos que utilizanla inmunidad (activa y pasiva) como he-rramienta de trabajo (principalmente va-cunas y sueros o inmunoglobulinas puri-ficadas) y lo que se refiere al uso deantimicrobianos, cuya situación actual,como es sabido, está sometida al incon-veniente de la generación de resistencias,lo que está propiciando iniciativas de todotipo, tendentes a la búsqueda de susti-tutos y alternativas. En este campo,además, hemos de considerar las nove-dades que representan las nuevas tecno-logías de la mano de la Biotecnología. Porúltimo, hemos de referirnos también alconcepto moderno de Bioseguridad, queintegra todas las actuaciones, métodos yrecursos dirigidos a impedir la entrada de

los agentes patógenos en una explotaciónanimal o su difusión en ella.

La Vacunología, término aceptado en laactualidad para la rama de la Biología quese ocupa del estudio, diseño y desarrollode vacunas, nació directamente de la apli-cación de un agente de enfermedadanimal (virus vaccinia) para proteger deuna enfermedad humana (viruela); ya noshemos referido a ello en otro lugar, y losprimeros progresos estuvieron directa-mente ligados a la Sanidad Animal de lamano de las vacunas contra el carbuncobacteridiano, cólera aviar o mal rojo por-cino, junto a la vacuna frente a la rabia,todas ellas desarrolladas por Louis Pasteur,en lo que se considera la primera etapade la Inmunología. Después vendrían losdescubrimientos de Salmon y Smithacerca de las vacunas inactivadas, y los deGastón Ramón en relación con los adyu-vantes y los toxoides, junto a un sinfín deaportaciones más que han puesto enmanos de la Ciencia Médica, Humana yVeterinaria, un instrumento insustituibleen la lucha contra las enfermedades in-fecciosas. Téngase en cuenta, como se hadicho, que en la extinción de la viruela(oficialmente el 9 de diciembre de 1979)y de la peste bovina (2011), las dos únicasenfermedades en las que se ha logradotal propósito hasta la fecha, el uso de va-cunas ha sido decisivo.

A lo largo de este camino se han identifi-cado dos tipos de productos: las vacunasque utilizan como inmunógeno el mismoagente, pero atenuado, que en su formaprimitiva (salvaje) produce la enfermedad,y las que utilizan este, previamente inac-tivado. La preparación del primero ha su-frido a lo largo de estos años considera-bles modificaciones para mantener su


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capacidad inmunizante asegurando suinocuidad. Hasta tiempos recientes, estosprocedimientos han sido principalmenteempíricos, fortuitos las más de las veces(hallazgo de una cepa particular de unabacteria o virus, menos patógena deforma espontánea o fruto de modifica-ciones inducidas artificialmente, que ino-culada inducía protección, o largamenteperseguida mediante procedimientos delo más variado: pases ciegos por hospe-dadores diferentes al natural, cultivo encondiciones disgenésicas, etc.), en losque, en cualquier caso, no se podía ase-gurar la estabilidad del producto final enlas condiciones de uso y, en ocasiones,una atenuación deficiente producía erro-res capaces de producir enfermedad (va-cunal) en el animal destinado a ser prote-gido, además del riesgo permanente querepresenta incorporar nuevos agentes enel ambiente de las explotaciones animaleso dondequiera que pueda ser utilizado.

El segundo de los caminos (vacunas inac-tivadas) garantiza la seguridad del pro-ducto, puesto que el agente productor dela enfermedad es inactivado con anterio-ridad a su uso, mediante procedimientosfísicos o químicos, pero a cambio de ellocede buena parte de su capacidad inmu-nógena, siendo por ello menos efectivo.En parte se puede mejorar esta capacidadmediante la utilización de adyuvantes deinmunidad, e inoculaciones repetidas(dosis de recuerdo), pero nunca se lograobtener un producto equivalente, en tér-minos de eficacia, al que representan lasvacunas vivas.

La lucha contra las enfermedades infec-ciosas en la que participan estos pode-rosos instrumentos está sometida en laactualidad a un profundo cambio del que

debe participar sin excusas la SanidadAnimal. Además de ello, la Vacunologíaha abierto en la actualidad sus puertas aprocesos de naturaleza esporádica, no in-fecciosa, incluyendo tumores y alergias,que si bien en el mundo de los animalesproductores de alimentos en general ca-rece de consideración, sí la tiene en elcaso de los animales de compañía, o devalor singular por otras aptitudes.

Planteado como antes en relación con ladoble estrategia de uso, en el campo delos productos vivos, la Genómica permiteen la actualidad identificar factores de vi-rulencia, que incluso solo se expresan enel hospedador, in vivo, en el curso de lainfección. Métodos directos o inversos(genética reversa) permiten localizar lassecuencias de mayor interés y, a partir deahí, proceder según mejor convenga. Losmétodos de Ingeniería Genética en usopermiten obtener mutantes atenuados,deficientes en tal o cual gen que codificanpara un factor crítico (factor de virulenciao relacionado con rutas metabólicas im-prescindibles), permitiendo la obtenciónde productos seguros desde el punto devista de su inocuidad, generando, encambio, buenas respuestas protectoras.Además de ello, un campo que está revo-lucionando los programas de controlcontra enfermedades infecciosas de losanimales, se basa en el diseño de vacunasmarcadas, en las que la manipulación ge-nética impide por ejemplo la presencia deun antígeno determinado, para el quepuede desarrollarse un método de diag-nóstico específico, a la carta, permitiendoel desarrollo de un programa de lucha ocontrol en base a la utilización de una va-cuna y su complemento diagnóstico. Estemétodo (DIVA, Differentiating Infected


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from Vaccinated Animals) ha sido utili-zado con éxito en el caso de la enfer-medad de Aujeszky, influenza aviar yotras, y está llamado a ser un recurso prin-cipal en la lucha contra las enfermedadesinfecciosas. En el lado contrario, las mo-dernas versiones de vacunas inactivadasestán representadas por las vacunas desubunidades y las vacunas de ADN. En elprimero de los casos, los avances tecno-lógicos (genómica, transcriptómica y pro-teómica) permiten localizar los genes y susproductos de expresión que tenganmayor interés desde el punto de vista dela respuesta inmune protectora, compa-rarles con bancos de datos referidos aotras bacterias o virus y, utilizando un sis-tema de expresión adecuado (virus, bac-terias, levaduras, células de insecto o cé-lulas de mamífero, por ejemplo), lograr suexpresión recombinante y su purificación,obteniendo de este modo un productofinal en base exclusiva a una proteína ovarias, sin el riesgo que supone la pre-sencia del agente vivo ni la inconvenienciade otros productos que nada influyen enel efecto buscado. Como en el caso de lasbacterinas, este tipo de productos in-ducen una inmunidad de corta duraciónque hace necesario el desarrollo de adyu-vantes, inmunomoduladores, para los queigualmente existen expectativas inmejo-rables en la actualidad. La Sanidad Animalse está incorporando a estas nuevas co-rrientes de desarrollos vacunales y su in-terés es doble: por un lado, el que resultade su objetivo directo de participar conproductos de última generación en lalucha y control de las enfermedades in-fecciosas de los animales, pero, por otrolado, constituye, como se ha dicho enotros lugares, un campo de prueba exce-

lente para productos de iguales caracte-rísticas aplicables al hombre.

Los sueros terapéuticos, que tantos bene-ficios han representado en el pasado re-ciente, para resolver compromisos de ur-gencia en pacientes animales en los quela vacunación no disponía del tiempo ne-cesario para desarrollar una respuestaprotectora, o cuando la etiología de la en-fermedad se correspondía con toxinasproducidas por bacterias, han evolucio-nado también considerablemente. Alavance que supusieron los métodos depurificación de inmunoglobulinas y el des-cubrimiento de los anticuerpos monoclo-nales, mediante la técnica de hibridomas,en las que la fusión de una célula de mie-loma con células B generaba un híbridocapaz de producir de forma indefinida an-ticuerpos contra un epítopo particular, ga-nando extraordinariamente en selecti-vidad y eficacia, se le ha venido a sumaren la actualidad la posibilidad de produciranticuerpos recombinantes a partir de cé-lulas de mamífero adaptadas a su destino(el hombre, principalmente), con lo quese prolonga su duración y eficacia. Bienes verdad que esta frontera de la Bio-tecnología está restringida en la actua-lidad a la Medicina Humana, pero no te-nemos dudas de que su aplicación notardará en llegar a situaciones particularesde la Sanidad Animal, que en cualquiercaso debe permanecer a la expectativa,vigilante de los progresos que en este in-teresantísimo campo se están produ-ciendo y por los que ya están apostandolas principales industrias biotecnológicasa nivel mundial.

En lo que se refiere a la búsqueda de al-ternativas para los antimicrobianos tradi-cionales, los antibióticos, su uso se ha res-


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tringido (de hecho, están prohibidoscomo promotores del crecimiento) en al-gunas especies de ciclo corto y siemprecondicionado a evitar la inducción de re-sistencias que al final exigen un altoprecio en la terapéutica humana. En la ac-tualidad asistimos a la búsqueda de otrasalternativas antimicrobianas, sean estasde origen natural (aceites esenciales,ácidos orgánicos, etc.) o de otra natura-leza, sin olvidar antiguos recursos quefueron desplazados cuando se produjo eldescubrimiento de los antibióticos, comosucede en el caso de la terapia fágica, queya se está planteando como una iniciativamerecedora de toda atención en situa-ciones concretas, como mastitis bovinas yotras.

Recursos

Establecido el contexto de riesgo por lapresencia y difusión de enfermedades in-fecciosas producidas por microorganis-mos, las posibilidades de control y, en sucaso, erradicación están condicionadas ados circunstancias: por un lado, el diag-nóstico, y por otro, la aplicación de me-didas de control. El primero debe cumplirlos requisitos de rapidez, sensibilidad, es-pecificidad y exactitud, y va dirigido tantoa la detección directa como indirecta delagente etiológico. En el primer caso, unavez aislado este por métodos convencio-nales, el propósito es llevar a cabo suidentificación, caracterización y tipifica-ción. Las determinaciones moleculares(detección de genes) o inmunológicas (de-tección de antígenos) no recuperan elagente etiológico, solamente detectan supresencia, pero pueden tener una extra-ordinaria importancia por su rapidez, sen-sibilidad y especificidad.

El diagnóstico indirecto utiliza recursos de-rivados de la respuesta inmune (humoraly celular) y detecta la huella que deja lapresencia del agente en el hospedadorenfermo y está condicionado por losmismos elementos.

En relación con las medidas de control,una vez realizado el diagnóstico en lasmejores condiciones, la Sanidad Animaldebe poner en práctica recursos eficaces,rápidos, carentes de efectos secundarios,que permitan al menos reducir drástica-mente los niveles de prevalencia de la en-fermedad y, siempre que sea posible, lo-grar su erradicación.

En la actualidad, el recurso principal a dis-posición de la Sanidad Animal para hacerfrente con éxito a la difícil tarea a la quese enfrenta reside en la disponibilidad detecnologías derivadas de la Biotecnología.De hecho, ahora mismo es difícil entenderel futuro, no ya de la Sanidad Animal,sino de la Ciencia Veterinaria en general,sin el concurso de la Biotecnología.

El término “Biotecnología” fue utilizadopor primera vez en 1919 por Karl Ereky,un ingeniero agrónomo húngaro para re-ferir un proceso de producción masiva decerdos utilizando remolacha azucareracomo alimento primario transformable,en definitiva, describiendo procesos deobtención de productos a partir de distintotipo de materias primas con el concursode organismos vivos. Bien es verdad quesu desarrollo se produjo (de forma explo-siva) cuando se incorporaron técnicas deIngeniería Genética (tecnología del ADNrecombinante) al trabajo con microorga-nismos (procariotas y eucariotas), que per-mitieron primero la selección y obtenciónde fragmentos del ADN de un microor-


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ganismo introduciéndolo después en otro,que expresaba así moléculas ajenas. LaIngeniería Genética hizo de la Biotecno-logía una ciencia principal desde el puntode vista científico, y las aplicaciones co-merciales han representado después unanueva revolución biológica.

En esencia, la Biotecnología supone el usode organismos vivos o compuestos obte-nidos a partir de aquellos, con valor parael hombre o los animales. Es un enfoquemultidisciplinario compuesto por variedadde técnicas derivadas de la investigación enBiología Molecular y Celular, Microbiología,Inmunología y otras disciplinas afines, quepueden ser utilizadas dondequiera que seutilicen microorganismos (bacterias, virus,hongos, protozoos, etc.) o células (vege-tales o animales). La OCDE define la Biotec-nología como “la aplicación de principioscientíficos de la Química, Biología, Micro-biología e Ingeniería al procesamiento demateriales por agentes biológicos, paraproveer bienes y servicios”.

El espectacular desarrollo de la Biotecno-logía se produjo en el campo de la fabri-cación de nuevos medicamentos y va-cunas y en la obtención de cultivos yanimales modificados genéticamente, conel ánimo de producir alimentos (de origenvegetal y animal) para el consumo hu-mano y animal. Desde la síntesis biotec-nológica de insulina obtenida en 1978por recombinación genética a partir de E.coli, se produjo una carrera desenfrenadapor obtener nuevos productos con el con-curso microbiano y de estas nuevas tec-nologías. La lista de productos hoy dispo-nibles por estos procedimientos es cadadía más numerosa e incluye hormonas,proteínas de utilidad en distintos ámbitos,antibióticos, antitumorales, antiparasita-

rios, anticuerpos monoclonales, etc. Se hagenerado, de este modo, una pujante in-dustria biotecnológica que con carácterglobal representa ya un sector estratégicopara muchos países y ello no solo de losque forman parte del mundo desarro-llado, sino que por su bajo coste repre-senta también una oportunidad para lospaíses en desarrollo.

Genómica y Proteómica. El términoGenómica surgió a finales de 1986 con elnombre de una nueva revista dedicada a lapublicación de resultados de los trabajos,entonces en curso, relativos a la secuencia-ción del genoma humano. Un año antes,en 1985, se había publicado, por primeravez, una técnica denominada “reacción encadena de la polimerasa”, abreviada-mente PCR (polymerase chain reaction),que abrió grandes posibilidades para de-tectar y analizar diferencias entre el ADN(las secuencias) del genoma de los ani-males. Cuando se combinó con marca-dores genéticos, se dispuso de una herra-mienta extraordinaria que permitió elestudio detallado de los genes que cons-tituían el genoma de la vaca, y años des-pués, nuevas técnicas y variantes de laPCR permitieron realizar estudios de ex-presión génica a gran escala para visua-lizar cambios en el nivel de expresión decientos de miles de genes en tejidos par-ticulares. Se secuenció el genoma de lagallina y después el de la vaca, al que si-guieron el de los primeros microorga-nismos, cuya lista hoy supera el centenar.

La Organización Mundial de la SanidadAnimal (OIE) (20) ha establecido cuatroprioridades de la Genómica en su relacióncon la Sanidad Animal, incluyendo el de-sarrollo de estudios cuantitativos de ge-nética de poblaciones para la búsqueda


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de marcadores de rasgos sanitarios, estu-dios de genómica funcional para el aná-lisis de las interacciones patógeno-hospe-dador, la búsqueda de herramientas parael diagnóstico y control de las enferme-dades animales y el apoyo integral. LaSanidad Animal, como la Salud Pública(Salud Humana), es un campo de unenorme atractivo para el desarrollo y apli-cación de los recursos generados por laBiotecnología, aunque es preciso reco-nocer que, al menos en el campo indus-trial, las distancias que se mantienen enla actualidad entre ambas son enormes.Comoquiera que sea, en este contexto, eldesarrollo de la Genómica, Proteómica,Bioinformática y otras técnicas molecu-lares han supuesto un impulso tecnoló-gico determinante en la investigación.

En el último informe de la Sociedad ASE-BIO (Asociación Española de Bioempresas)(21), correspondiente a 2010 (figura 6) yaprobado en mayo de este año, se hacereferencia a que este sector alcanzó en2009 un total de 1.095 empresas con acti-vidades en Biotecnología, de las que 399(el 36,4%) afirman que esta es su acti-vidad principal y/o exclusiva. El personal

empleado ascendió a 148.648 y la cifrade negocios a 53.152 millones de euros.La facturación de las empresas biotec (lasque tienen como actividad principal labiotecnología) alcanzó los 7.711 millonesde euros, lo que supone el 15% del totaldel sector. Conviene recordar el caráctertransversal de la Biotecnología, que haceque las empresas de distintos sectores in-corporen cada vez más actividades biotecen sus productos y servicios, por lo que eslógico que se produzca este tipo de incre-mentos cuando las nuevas tecnologíasemergentes se consolidan en el tejido pro-ductivo.

Entre el resto de indicadores, destacan losincrementos de casi un 7% en el personalempleado en I+D biotec y de más del 5%en el gasto en I+D privado. Conviene des-tacar igualmente que las empresas quehan hecho I+D en Biotecnología han cre-cido un 12% y que otros indicadores deoutput, como el número de patentes so-licitadas, casi se han duplicado (+ 85% enel último año), datos que confirman lasbuenas perspectivas de este sector en elcontexto nacional.


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Figura 6. Evolución de los principales indicadores del sector biotecnológico español (ASEBIO, 2011).

600.000

500.000

400.000

300.000

200.000

100.000

02005 2006 2007 2008 2009

Facturación (M €) Gastos en I+D (k€)Empleo (n.º de trabajadores)

485.466

148.648

53.152

460.653

108.648

31.101

376.146

103.911

26.149

294.845

88.124

22.549

200.114

79.39619.058


El gráfico siguiente (figura 7) pone de ma-nifiesto que las empresas del sector alimen-tario (42%) por primera vez son las quepredominan entre las empresas con activi-dades en el ámbito de la Biotecnología ylas aplicaciones en salud humana (38%)ocupan el segundo puesto, mientras queen un segundo grupo se sitúan las em-presas con actividades relacionadas conaplicaciones medioambientales (18%),Sanidad Animal y acuicultura (17%) y agri-cultura y producción forestal (18%).

En la actualidad, la Biotecnología, comola Informática, se ha diversificado tantoque se ha convertido en una herramientaimprescindible en cantidad innumerablede campos científicos e industriales, loque ha supuesto la necesidad de un sis-tema de clasificación de usos relacionadocon sus características comunes o su uti-lidad final que confluyen en cinco agru-paciones fundamentales de los usos bio-tecnológicos, que se identifican por unsistema de colores (22). La BiotecnologíaRoja agrupa los usos relacionados con lamedicina e incluye la obtención de anti-bióticos, vacunas, nuevos fármacos, téc-

nicas y métodos moleculares relacionadoscon el diagnóstico, terapias regenerativasy desarrollo de la Ingeniería Genética parael tratamiento de enfermedades mediantemanipulación genética; a esta nos referi-remos en particular en el caso de laSanidad Animal. La Biotecnología Blan-ca se ocupa de los usos relacionados conlos procesos industriales y presta especialatención al diseño y desarrollo de pro-ductos energéticamente más eficientesy/o menos contaminantes, como es elcaso de la utilización de microorganismos(principalmente bacterias y hongos) parala producción de productos químicos,nuevos materiales de uso doméstico ybiocombustibles. La Biotecnología Grisengloba las aplicaciones relacionadas conel medio ambiente, tanto en lo que se re-fiere al mantenimiento de la biodiversidadcomo a la eliminación de contaminantes(biodegradación para la eliminación demetales pesados o hidrocarburos, princi-palmente); la primera se ocupa, porejemplo, de estudios moleculares para elanálisis genético de poblaciones y espe-cies o los estudios de clonación en el casode especies en peligro de extinción, o la


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Figura 7. Distribución de empresas del sector biotecnológico, según área de aplicación (ASEBIO, 2011).

10

12

17

18

18

38

42

Industria

Salud animal y acuicultura

Medio ambiente

Agricultura y producción forestal

Salud humana

Alimentación

50 15 20 25 30 35 40 45


utilización de tecnologías de almacena-miento de genomas. La BiotecnologíaVerde se ocupa de la agricultura, desdela creación de nuevas especies de plantasde interés a la producción de fertilizantesy biopesticidas, o el cultivo in vitro y la clo-nación de vegetales. La creación de nue-vas variedades de plantas (plantas trans-génicas) ha suscitado el mayor interés ycontroversia social; persigue la obtenciónde variedades resistentes a enfermedadesy plagas, variedades con mejores propie-dades nutricionales y variedades que ac-túen como biofactorías para la produc-ción de sustancias de interés médico,biosanitarios o industrial, de fácil aisla-miento y purificación. Finalmente, la Bio-tecnología Azul se ocupa de la explota-ción de los recursos marinos para lageneración de productos y aplicacionesde interés industrial, como ocurre en elcaso de productos químicos utilizables enalimentación, medicina, cosmética, agri-cultura, etc. Ha sido definida como la demayor proyección a medio plazo.

En España, la Biotecnología, como la salud,son consideradas prioridades estratégicasen el actual Plan Nacional de InvestigaciónCientífica, Desarrollo e Innovación Tecno-lógica en el que se define como “uno delos factores clave de la revolución de laeconomía basada en el conocimiento…cuyo avance potencia nuevas disciplinascientíficas, aporta respuestas y generaaplicaciones socioeconómicas múltiples…la investigación en este campo es una ac-tividad muy importante para el éxito decualquier estrategia que se proponga me-jorar la salud de los ciudadanos, la mejorade la producción agraria, la alimentación,las tecnologías de la producción, la gene-ración de energía, el desarrollo sostenible

y la conservación y mejora del medio am-biente… podemos afirmar que laBiotecnología no es una ciencia per se,sino que aglutina varias disciplinas, comoagricultura, biología, bioquímica, gené-tica, ingeniería, medicina, microbiología,veterinaria, etc.” (23).

Aplicaciones de laBiotecnología en eldiagnóstico de enfermedadesinfecciosas en Sanidad Animal

Introducción

Numerosos y recientes avances tecnoló-gicos de la Biología Molecular y la Biotec-nología han permitido el desarrollo denuevas pruebas de diagnóstico, más efi-caces, o utilizables en él. Se incluyen, porejemplo, diversos tipos de reacción en ca-dena de la polimerasa (PCR), métodos deamplificación isotérmica, micromatrices(microarrays), detección de proteínas poramplificación de ácidos nucleicos, proteí-nas recombinantes, proteínas sintéticas,biosensores y otros muchos métodos parala detección de patógenos o de la res-puesta inmune frente a la infección.

Aunque el aislamiento de una moléculade ADN se llevó a cabo por primera vezen 1869 a partir de núcleos aislados delinfocitos humanos, siendo entonces de-nominada “nucleína”, su composiciónfue determinada 10 años después, esta-bleciendo la presencia de cuatro bases ni-trogenadas: adenina, guanina, citosina ytimina. Sin embargo, no fue hasta 1944cuando Avery, MacLeod y McCarty pa-saron a la historia de la Ciencia al demos-trar que el ADN era el material genéticoresponsable de la herencia (24). A este


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descubrimiento siguieron otros no menostrascendentes, como la estructura dedoble cadena (o doble hebra) realizadapor Watson y Crick en 1953 (25), en laque las bases nitrogenadas permanecenunidas externamente por grupos fosfato,formando una cadena en cuyo interior in-teractúan con bases complementarias dela otra cadena (adenina con timina y cito-sina con guanina) a través de enlaces dehidrógeno. Cada cadena sirve de molde,en la herencia, para su propia replicación(replicación semiconservativa). En 1960 sedescubrió la enzima polimerasa (26), loque permitió definir el sitio de inicio de lasíntesis del ADNbc, considerado este elorigen de todos los métodos de síntesisde ADN in vitro. A partir de aquí, la suce-sión de acontecimientos ha sido real-mente vertiginosa. En el cuadro que sigue(cuadro 1) se resumen los principales des-cubrimientos sucedidos a partir de 1960:

El descubrimiento de la renaturalizacióno hibridación del ADN realizado por Doty

et al. (1961), después de su desnaturaliza-ción por calentamiento, constituyó elpunto de partida de todas las técnicas de-sarrolladas posteriormente bajo la deno-minación de hibridación, con la única di-ferencia que en los métodos actuales seintroduce un fragmento de una cadenadenominado “sonda” que, al estar enmayor concentración que el ADNbc y pro-ducirse la renaturalización, forma un hí-brido. La utilización de enzimas capacesde cortar el ADN en secuencias palindró-micas específicas, que en condiciones nor-males tiene como fin proteger a las bacte-rias de infecciones por fagos, degradandosu ácido nucleico, permitió obtener y es-tudiar fragmentos discretos y específicosdel ADN, lo que, unido al siguiente des-cubrimiento de enzimas con capacidad deunir fragmentos separados (ADN ligasa),permitió llevar a cabo estudios de recom-binación in vitro, dando origen a la tec-nología del ADN recombinante, es decir,


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Cuadro 1. Cronología de los descubrimientos más importantes en el campo de latecnología del ADN.

Año Descubrimiento Referencia1961 Desnaturalización y renaturalización del ADN. Doty y Marmur1962 Aislamiento y purificación de las enzimas de Arber

restricción.1966 Descubrimiento del código genético. Niremberg, Ochoa y Khorana1967 Aislamiento y purificación de la enzima ADN Geller

ligasa.1972 Desarrollo de las técnicas de clonación del ADN. Boyer, Cohen y Berg1975 Hibridación del ADN con sondas de secuencia Southern

específica.1977 Métodos de secuenciación de ADN. Sanger y Barrel; Maxam y Gilbert1981 Primeros animales transgénicos. Palmiter y Brinster1985 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mullis1997 Secuenciación de genomas bacterianos Tomb, Cole y Parkill

completos.2001 Secuenciación del genoma humano. Venter y Collins


a la Ingeniería Genética o, lo que es lomismo, a la Biotecnología moderna.

Diagnóstico molecular

Con carácter general es preciso señalarque la detección de material genético(ADN o ARN) de un microorganismo enmuestras clínicas posee la consideraciónde indicar su presencia en el hospedadorde donde proceden las muestras en elmomento de obtenerlas, aunque nopuede asegurar que el microorganismoen cuestión estuviese activo (es decir,vivo). La detección de ARNm sí que indica,por el contrario, que el microorganismode procedencia está metabólicamente ac-tivo, es decir, vivo (27). En cualquier caso,este tipo de detección molecular tiene laventaja de que permite la identificaciónde una infección de forma directa, sin lanecesidad del cultivo del microorganismoresponsable, actividad que en algunoscasos reviste peligrosidad para el especia-lista. El diagnóstico basado en la detec-ción directa del gen o fragmento delácido nucleico mediante hibridación consondas específicas puede completarse conotras determinaciones que amplifican se-cuencias específicas incrementando lasensibilidad del procedimiento.

La hibridación se basa en la capacidad dedos cadenas sencillas de ácido nucleico(ADN o ARN) complementarias en su se-cuencia de bases, para formar enlaces es-pecíficos y organizar una doble hélice encualquier combinación posible (ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN). Para que seproduzca la formación de híbridos esta-bles debe haber un alto grado de comple-mentariedad.

Una sonda es un fragmento determinadode ADN o ARN marcado química o radiac-tivamente, utilizado para localizar deter-minadas secuencias de ácidos nucleicosmediante hibridación. La hibridación sepuede llevar a cabo en diversos formatos,por ejemplo, en solución, con la cadenadiana unida a un soporte sólido o in situ,sobre un corte tisular o un microorga-nismo fijado a un soporte. La sondapuede producirse por síntesis química omediante técnicas recombinantes, y en elproceso de su producción se marca (conenzimas, fluorocromos o isotopos radiac-tivos) para su detección. En la práctica, lahibridación es útil para detectar o con-firmar los resultados de otras pruebas(28), como sucede en el caso de los mi-croarrays y otras (ver después).

La electroforesis en gel es una herra-mienta muy útil para separar macromolé-culas de diferentes tamaños y cargas eléc-tricas. Las moléculas de ADN tienen, porlo general, una carga constante porunidad de masa, por lo que se pueden se-parar casi completamente en geles deagarosa o acrilamida, sobre la base de sutamaño o conformación. Los geles deagarosa o acrilamida actúan como ta-mices moleculares, retardando el paso delas moléculas más grandes en relacióncon las más pequeñas. Para las moléculasmás grandes son mejores los geles deagarosa, mientras que los de acrilamidalo son para las moléculas más pequeñas.Aunque los procedimientos para separarácidos nucleicos y proteínas tienen elmismo principio, presentan algunas dife-rencias técnicas debido a las caracterís-ticas particulares de cada clase de molé-cula.


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En 1975, Southern (29) desarrolló un mé-todo para fijar ADN digerido por enzimasde restricción a un soporte sólido y llevara cabo después la hibridación con sondasespecíficas. La técnica permitió ubicar losgenes y otras secuencias de ADN sobrefragmentos resultantes de la restricciónenzimática separados por electroforesisen gel. La principal característica de la téc-nica es la transferencia de las moléculasde ADN, que han sido separadas por elec-troforesis en gel, a una membrana denailon o nitrocelulosa. Esta técnica fue de-nominada Southern-blot en honor a sudescubridor. En la práctica, el ADN se des-naturaliza (se abren sus dos cadenas)antes o durante la transferencia, dispo-niendo el gel en una solución alcalina.Una vez finalizada la transferencia, el ADNse inmoviliza sobre la membrana por ex-posición a temperatura elevada o a radia-ción ultravioleta y se incuba con él unasonda de ADN que contiene la secuenciade interés y que solamente hibridará conmoléculas que contengan la secuencia denucleótidos complementaria a la suya. Lassondas pueden marcarse por métodos di-ferentes (radiactividad, colorantes, qui-mioluminiscencia, etc.), de tal modo quedespués de la hibridación pueda revelarsede acuerdo con el método que corres-ponda al procedimiento de marcaje.

Igual que sucede con el ADN, las molé-culas de ARN también pueden separarsepor electroforesis en geles de agarosa,transferirse a membranas de nailon o ni-trocelulosa y analizarse. La transferenciade ARN se denomina Northern-blot comoreconocimiento de que el método es, enrealidad, la imagen de espejo de la téc-nica de Southern-blot. Aunque ambosprocedimientos son idénticos, las molé-

culas de ARN son muy sensibles a la de-gradación por ARNasas, lo que exigemucha precaución para evitar la contami-nación con ellas. Además, la mayoría delas moléculas de ARN contienen estruc-turas secundarias (debidas a empareja-mientos intracatenarios), por lo quedeben mantenerse desnaturalizadas du-rante la electroforesis para poder sepa-rarlas sobre la base de su tamaño.

La electroforesis en gel de poliacrilamidarepresenta una herramienta muy impor-tante para la separación y caracterizaciónde proteínas, cuyos polipéptidos inte-grantes se separan en presencia del de-tergente dodecil sulfato sódico (SDS),capaz de desnaturalizar las primeras.Como en el caso de los ácidos nucleicos,los polipéptidos una vez separados porelectroforesis, también pueden transfe-rirse desde el gel a una membrana de ni-trocelulosa y ser detectados mediante lautilización de anticuerpos específicos. Estatransferencia se denomina Western-bloty se lleva a cabo mediante el uso de co-rriente eléctrica. El anticuerpo se suelemarcar, bien con isotopos radiactivos, quepermiten la detección por autorradio-grafía, o con enzimas que producen unproducto visible cuando se adiciona elsustrato correspondiente. Más adelantese desarrollarían otras variaciones que noutilizan la separación electroforética,como el dot-blot o slot-blot, que es unatécnica simplificada de las anteriores en laque las moléculas (ADN o ARN) se de-tectan en una mancha (un blot) transfi-riéndola primero a una membrana y utili-zando después una sonda (en el caso deNorthern y Southern-blot) o anticuerpos(en el caso de Western-blot).


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Los métodos de secuenciación del ADNfueron desarrollados entre 1975 y 1977,a partir de dos aproximaciones diferentes(30); mientras que la primera permite leerel código genético rompiendo la moléculade ADN en nucleótidos específicos, la se-gunda va incorporando nucleótidos quebloquean la extensión de la síntesis delADN, lo que se presta mejor para la se-cuenciación automática (31).

Reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

En 1985, Mullis aplicó algunas de las me-todologías descritas antes para llevar acabo la síntesis de ADN in vitro de formaexponencial, en un procedimiento quefue denominado reacción en cadena dela polimerasa (PCR, de Polymerase ChainReaction) (32), metodología que ha sidoconsiderada una auténtica revolución enel contexto de la Biología Molecular, y quepermite el análisis tanto de ADN como deARN a partir de cantidades minúsculas demuestras de cualquier origen y para la quese han desarrollado multitud de aplica-ciones diagnósticas. En 1993, K. B. Mullisrecibió el Premio Nobel de Química.

La PCR es una tecnología poderosa queimplica la síntesis enzimática, in vitro, demillones de copias de un fragmento es-pecífico de ADN sobre la base de ciclossucesivos de amplificación exponencial, ytodo ello a partir de una mezcla complejade ADN. La reacción se basa en la hibri-dación y extensión de un par de oligonu-cleótidos, sintetizados artificialmente, quese utilizan como iniciadores o cebadores(primers) que delimitan la secuencia deADN de doble cadena que se desea am-plificar y que son secuencias cortas de al-rededor de 20 nucleótidos, orientados en

direcciones contrarias (forward -5’→3’ yreverse 3’→5’), cuyo diseño constituyeparte principal de la técnica. A partir delos primers, en presencia de una enzimaADN polimerasa termorresistente (Taq-po-limerasa) y de oligonucleótidos, se lleva acabo la síntesis exponencial.

Cada ciclo de amplificación, de los que enla reacción se producen entre 25 y 40,tiene lugar en tres fases o etapas: enprimer lugar, la desnaturalización del ADNproblema, seguido del alineamiento y fi-nalmente la extensión. La desnaturaliza-ción se lleva a cabo, de ordinario, a 95 °Cy la separación permite que cada hebra delADN sirva de molde o plantilla para la sín-tesis de una nueva molécula. El tiempo dedesnaturalización depende de la longitudde la plantilla y de ordinario oscila entre30 segundos y 1 minuto. Debido a que alcomienzo de la amplificación es necesarioseparar todo el ADN de la muestra en es-tudio, inicialmente se lleva a cabo, por unasola vez, una incubación a 95 °C durante5 minutos. Después se produce la alinea-ción entre los primers y el ADN molde, quese lleva a cabo entre 45 y 60 °C. Sigueluego la intervención de la ADN-polime-rasa, que se une complementariamente alos nucleótidos libres y a la secuencia delmolde. La extensión se lleva a cabo a latemperatura de máxima eficiencia de laenzima (72 °C) y el tiempo necesario paraello dependerá de la distancia entre losprimers. Se ha calculado que la polime-rasa es capaz de incorporar 60 nucleó-tidos por segundo a 70 °C por lo que en1 minuto pueden incorporarse más de1.000 pares de bases (pb). En cada ciclode amplificación se produce de forma lo-garítmica un número de copias equiva-


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lente al exponente del número de ca-denas del molde de ADN disponibles (33).

El alineamiento (emparejamiento) es, se-guramente, la fase más crítica de la ampli-ficación, puesto que se basa en la comple-mentariedad entre las bases nitrogenadasdel molde (el ADN problema) y los pri-mers. Factores como la temperatura,entre otros, influyen decisivamente, en re-lación con la cantidad de ADN disponible,en la especificidad de la reacción. En eldiagnóstico de enfermedades infecciosas,con esta magnitud de amplificación esposible el análisis de moléculas de ADN oARN a partir de cantidades mínimas demuestra; por ejemplo, si consideramosque una bacteria contiene 10-9 g de ADN,la amplificación por PCR permitirá generaralrededor de 0,1 µg (esto es, 10-6 g) deuna región específica de ADN de origenbacteriano, lo que supone, en la práctica,poder identificar secuencias presentes entan solo 10 o 50 copias de ADN presentesen una muestra de origen clínico, y todoello sin condiciones especiales de mante-nimiento (en teoría podría llevarse a caboel diagnóstico a partir de tan solo unacopia).

El método más utilizado para la visualiza-ción del producto amplificado es la elec-troforesis en agarosa (Southern), en la quese produce la migración eléctrica del ADNamplificado, proporcionalmente al ta-maño.

Las técnicas de PCR también presentanproblemas de ejecución, por lo generaldebidos a la inhibición por factores queanulan la actividad polimerasa. La gransensibilidad es su inconveniente principal,pues facilita errores debidos, por ejemplo,a la falta de esterilidad, que puede llevar

a la amplificación de ADN que no se co-rresponde con el de la muestra que se in-vestiga. Se aconseja, por ello, la separa-ción de fases y la limpieza exhaustiva dela superficie de trabajo entre pruebas (eluso de lejía, otros desinfectantes, lám-paras ultravioleta y psoraleno son habi-tuales). En los laboratorios donde se llevana cabo este tipo de determinaciones, lamuestra se prepara en un lugar distintode aquel en el que está alojado el termo-ciclador, con cabinas de seguridad bioló-gica para reducir ambientes cargados deamplicones correspondientes a microor-ganismos, además de la inclusión de todotipo de controles-testigos. En el diseño deprimers debe tenerse en cuenta que cadauno debe integrar entre 18 y 24 bases; sison demasiado cortos, se pierde especifi-cidad, y si son demasiado largos, se pierderendimiento. Por otra parte, la proporciónóptima entre bases púricas y pirimídicasdebe ser de 1:1 (con una oscilación admi-tida del 40-60%) y que comiencen y ter-minen con una o dos bases púricas.Finalmente, los primers no deben incluiren su secuencia regiones que sean com-plementarias entre sí, para evitar la for-mación de dímeros.

Variaciones

Se pueden considerar los siguientes tiposde variaciones en la denominada PCR bá-sica (34):

• PCR específica de alelo. Se utiliza paraidentificar los polimorfismos de una solabase (SNPs) en el diagnóstico y clonación.

• PCR “ensamblado”. Lleva a cabo la sín-tesis artificial de largas secuencias deADN en una PCR con oligonucleótidoslargos, con secuencias solapantes cortas.


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• PCR asimétrica. Para amplificar prefe-rentemente una cadena de ADN ori-ginal con respecto a la otra.

• PCR de colonia. Para el estudio de co-lonias de bacterias.

• Amplificación dependiente de heli-casa. Utiliza la enzima helicasa y unatemperatura constante, en lugar de lapolimerasa de ADN y los ciclos repetidosde desnaturalización-extensión.

• PCR “hot-start” (de arranque en ca-liente). Reduce la amplificación inespe-cífica durante las etapas iniciales.

• PCR específica de intersecuencia(ISSR). Se utiliza en la determinación dela huella genética, que amplifica re-giones entre repeticiones de secuenciasimple, para producir una huella gené-tica única, de longitudes de fragmentoamplificadas.

• PCR inversa. Solo cuando se conoceuna secuencia interna. Es muy útil en laidentificación de secuencias flanque-antes a secuencias de inserción (IS).

• PCR mediada por ligación. Utiliza pe-queños empalmadores o enlazadores deADN ligados al ADN de prueba y múlti-ples primers hibridando a estos.

• PCR específica de metilación (MSP).Para detectar metilaciones en islas CpG(alta concentración de pares C-G quehabitualmente conforman promotores)de ADN genómico.

• Amplificación múltiple dependientede sonda (MLPA. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification).Permite amplificar varias secuencias ob-jetivo con un único par de primers, evi-tando las limitaciones de resolución dela PCR multiplex.

• PCR cuantitativa. Para medir la can-tidad de un producto de PCR (preferen-temente en tiempo real).

• PCR-TAIL (PCR termal de entrelazadoasimétrico). Para aislar una secuenciadesconocida que flanquea otra cono-cida.

• PCR “touchdown”. Una variante que seutiliza cuando se desconoce la secuenciaexacta de los extremos de la secuencia aamplificar, asumiendo que puede existiralguna base desaparecida en el alinea-miento primer-secuencia. Reduce elfondo de inespecificidad bajando gra-dualmente la temperatura de hibridacióna lo largo del progreso de la PCR.

• PAN-AC. Utiliza condiciones isotermaspara la amplificación y puede ser utili-zado en células vivas.

Tipos de PCR

Se consideran los siguientes, principales:

• PCR anidada. El producto de amplifi-cación es utilizado como molde parauna segunda amplificación con primersque se ubican dentro de la primera se-cuencia amplificada. Es un tipo de PCRmuy específica y muy sensible.

• PCR in situ. Especialmente adaptadapara llevar a cabo determinaciones ensecciones de tejidos o en células, dondelos productos generados pueden visua-lizarse en el sitio de amplificación, ordi-nariamente sobre preparaciones fijadasen un portaobjetos. Se lleva a cabo unaprimera amplificación de ADN en blancoy luego se detecta mediante hibridaciónin situ convencional con sondas de ADN/ARN, lo que permite una gran sensibi-lidad.


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• PCR multiplex. Se amplifica más deuna secuencia en la misma reacción.Utiliza dos o más parejas de primers enun único tubo con el fin de amplificarsimultáneamente múltiples segmentosde ADN. Combina en una única reac-ción todos los pares de primers corres-pondientes a los sistemas que se deseanamplificar simultáneamente y obtiene lainformación correspondiente a variosloci en una reacción única, con lo queprecisa menor cantidad de ADN moldepara el análisis, además de menor can-tidad de reactivos y de que permite unarápida construcción de los datos.

• PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). Utiliza ARN como molde inicial enlugar de ADN y una transcriptasa inversapara llevar a cabo la síntesis de ADNcomplementario al ARN (ADNc). Puedeutilizarse para el estudio de ARNm casia nivel de una célula individual, para de-terminar la presencia o ausencia de untranscripto, para estimar el nivel de suexpresión y para el clonado de ADNc, sinnecesidad de construir una genoteca.

La reacción consiste en la síntesis de unacadena de ADN a partir de ARNm pormedio de la enzima transcriptasa inversa(reversa), por lo general, extraída devirus tumorales de ARN, que utiliza ARNcomo molde o plantilla para sintetizaruna cadena de ADN. La cadena comple-mentaria se sintetiza por PCR. Ciclos su-cesivos de PCR estándar permiten dis-poner de cantidades apropiadas deADNc para diversas utilidades.

• PCR en tiempo real (Real Time-PCR)o PCR cuantitativa (qPCR, Q-PCR). Esuna variante utilizada para amplificar ycuantificar de forma absoluta, simultá-

neamente, el producto de la amplifica-ción del ADN o ARN presentes en lamuestra original o para identificar conuna muy alta probabilidad de certezamuestras de ADN específicas a partir desu temperatura de fusión.

Como en la PCR convencional, utiliza unmolde o plantilla de ADN, al menos unpar de primers específicos, dNTP (deso-xirribonucleósidos trifosfato), un tampónde reacción adecuado y una ADN poli-merasa termoestable, mezcla a la que sele adiciona una sustancia marcada conun fluorocromo que, al ser excitado a lalongitud de onda adecuada, permitemedir la tasa de producción de uno omás productos específicos. La medida serealiza después de cada ciclo de amplifi-cación.

En muchos casos, el molde o plantillano es desde el principio ADN, sino quepuede ser ADNc (complementario), deuna cadena, obtenido por retrotrans-cripción del ARN, en cuyo caso se deno-mina RT-PCR cuantitativa o RT-PCR entiempo real, o también RT-Q-PCR (35).

La PCR en tiempo real es la metodologíamás moderna para el estudio de la ex-presión génica (junto a los microarrayso micromatrices), aunque otros mé-todos tradicionales, como el Northern-blot, también permiten su abordaje. Adiferencia de la PCR estándar, en la quela cantidad de producto final no siemprerefleja la cantidad de ADN molde pre-sente antes de la amplificación, la PCRen tiempo real (RT-PCR) sí permite ave-riguar cuánto ADN o ARN molde (esteúltimo convertido en ADNc medianteuna transcriptasa inversa) existe en unamuestra problema. A tal efecto, en la


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mezcla de reacción se incorpora unasonda marcada con un colorante fluo-rescente, un fluorocromo (o fluoróforo),cuantificando la señal durante la faseexponencial de la reacción. En los ciclosiniciales la fluorescencia va aumentandoa medida que se van acumulando loga-rítmicamente los productos de PCR,pero como a medida que avanzan los ci-clos de PCR también se van gastandolos sustratos y disminuye la eficacia dela polimerasa, al final, aunque la tasa deproducto aumenta, la progresión ya noes exponencial.

La PCR en tiempo real se lleva a cabo enun termociclador capaz de hacer incidirsobre cada muestra un haz de luz deuna longitud de onda determinada y de-tectar la fluorescencia emitida por unfluorocromo excitado, permitiendo a lavez calentar y enfriar rápidamente lasmuestras para aprovechar las capaci-dades fisicoquímicas de los ácidos nu-cleicos y las enzimáticas de las ADN po-limerasas. Este tipo de termocicladoresregistran de forma continua la cantidadde producto generado, de ahí el nombre(real time, en tiempo real).

La PCR en tiempo real incluye variantesbasadas en el uso de fluorocromos ines-pecíficos y otras basadas en sondas mo-leculares específicas, dependientes de la

secuencia. En las primeras, el ADN, quemultiplica su cantidad con cada ciclo, seune de forma inespecífica al fluoro-cromo produciendo fluorescencia, quees medida por el termociclador, que de-tecta así la generación exponencial delADN de doble cadena. En definitiva, losflurocromos inespecíficos, del que esejemplo el “SYBR-Green Dye”, detectanla generación exponencial de ADNbcmediante su unión inespecífica con él.Permite cuantificar una sola secuenciapor reacción pero tiene la ventaja deque utiliza solo un par de primers nor-males, lo que abarata su coste, perosolo es capaz de amplificar un productoen cada reacción.

Las técnicas basadas en sondas específicasutilizan una sonda unida (al menos un oli-gonucleótido) a dos fluorocromos, que hi-brida en la zona intermedia entre el primerdirecto (forward) y el inverso (reverse), esdecir, en el amplicón. Incluyen, por ejem-plo, sondas tipo Taqman, que están mar-cadas con un fluorocromo en el extremo3’ y un bloqueante (quencher) en el ex-tremo 5’. Cuando la sonda está intacta,presenta una transferencia energética defluorescencia por resonancia (FRET), queno se produce cuando la sonda está da-ñada y los dos fluorocromos están dis-tantes, debido a la degradación de la


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Figura 8. Sondas inespecíficas en q-PCR. SYBR “ Green Dye (http://www.nfstc.org) y específicas, tipo Taqman(www.en.wikipedia.org).


sonda mediante la actividad 5’-3’ exonu-cleasa de la ADN polimerasa, o bien a laseparación física de los fluorocromos porun cambio en la conformación de lasonda, lo que permite monitorizar elcambio del patrón de fluorescencia y de-ducir el nivel de amplificación del gen. Endefinitiva, en la PCR, cuando la polimerasaencuentra la sonda, la hidroliza y separa elbloqueante, permitiendo la fluorescencia,que se relaciona con la cantidad de am-plicón. Otras sondas utilizables incluyen lostipos “Molecular Beacons” y “Scorpion”.

La técnica de PCR a tiempo real (Q-PCR)elimina cualquier proceso post-PCR,puesto que monitoriza la progresión de laamplificación en el momento en que seproduce. A diferencia de la PCR conven-cional (también denominada de puntofinal), que mide la acumulación del ADNal final de un número determinado de ci-clos, con la Q-PCR la medición se lleva acabo durante el proceso de amplificaciónmediante fluorescencia, de tal forma quesu aumento es proporcional a la cantidadde ADN formada. El proceso se puede au-tomatizar fácilmente utilizando un sistemaque lleve a cabo la amplificación y que ala vez sea capaz de leer la fluorescencia.

En la PCR en tiempo real, debido a su ele-vada sensibilidad, uno de los puntos crí-ticos está representado por la calidad delmaterial de partida, lo que supone que laextracción de los ácidos nucleicos revistauna importancia fundamental, en lo que,pese a los avances realizados, aún se ca-rece de un sistema automático y universalque se pueda utilizar con cualquier tipode muestra.

La variabilidad que se introduce en lacuantificación y que conlleva un error en

la estima deriva de la integridad del ADNy de la eficiencia enzimática, entre otrosfactores, razón por la que se han desarro-llado numerosos sistemas de estandariza-ción, desde los que cuantifican de formaabsoluta la expresión génica a los que lohacen de forma relativa para el gen deprueba respecto de otro, al que se sueledenominar “normalizador”, seleccionadoen base a su expresión casi constante.Estos genes normalizadores suelen deno-minarse “house-keeping genes” por suimplicación habitual en funciones básicasde supervivencia celular, lo que implica ex-presión constitutiva. De este modo, efec-tuando en cada experimento la medidade los genes de interés y dividiéndolos porla expresión del gen normalizador selec-cionado, se pueden comparar los pri-meros aun sin conocer en términos abso-lutos su nivel de expresión. Son genesnormalizadotes comunes los que codi-fican para la tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclo-filina, ARN ribosomales, etc.

La PCR permite identificar y genotipar laespecie y cepa implicada en un procesoinfeccioso determinado, para lo cual seamplifica una zona del genoma bacte-riano cuyo producto de PCR posea unascaracterísticas de tamaño o temperaturade fusión que permitan identificarlo deforma inequívoca. En el caso de infec-ciones víricas que impliquen la integracióndel genoma del patógeno en el ADN delhospedador, la PCR cuantitativa posibilitala determinación de la carga viral exis-tente y, por tanto el estadio de la enfer-medad (36).

En estudios de expresión génica se utilizauna PCR en tiempo real, pues los trans-critos de ARNm pueden copiarse y ampli-


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ficarse mediante la transcriptasa inversa(a la que también se la designa como RT,de reverse transcriptase, lo que introducealguna confusión con la RT de real time).En este caso, el procedimiento propor-ciona una medida del nivel de transcrip-ción del gen correspondiente a la se-cuencia de los primers utilizados. A veceseste método se denomina RT-RT-PCR (RealTime-Reverse Transcriptase-PCR) (37).

Amplificación isotérmica

La amplificación isotérmica resulta de con-vertir, en forma cíclica, una molécula deARN a otra de ADNbc y, a partir de ella,llevar a cabo la transcripción a ARN, elcual sirve de molde para un nuevo ciclode amplificación (38). Se requieren dosprimers que definen el ARNm a amplificary uno de ellos contiene, además, una se-cuencia “promotora” para la enzima querealiza la transcripción, la ARN polimerasa.Además de esta última, participan tam-bién una transcriptasa reversa y unaARNasa H.

La amplificación isotérmica solo amplificaARN y su principal aplicación reside en eldiagnóstico y cuantificación de procesosinfecciosos originados por virus ARN. Lacuantificación se realiza coamplificando elARN de la muestra conjuntamente concalibradores internos o ARN de concen-tración conocida, y se mide medianteelectroquimioluminiscencia (39) .

Hibridación de ADN ramificado (Bran-ched DNA)

Se basa en hibridaciones sucesivas consondas que reconocen, por una parte, lasecuencia de ADN o ARN problema y, porotra, secuencias introducidas en la reac-ción para amplificar la señal de hibrida-

ción (40). Esta metodología, que es alta-mente reproducible, se utiliza en enfer-medades infecciosas humanas para lacuantificación de ácidos nucleicos en pa-cientes de VIH o hepatitis B y C.

Micromatrices (microarrays) de ADN

Aunque la terminología utilizada paraeste tipo de técnicas es muy variada y seutilicen términos como biochip, DNAChip, gene array o gene chip, el términomicroarray (micromatrices) es el que pa-rece que cuenta con mayor aceptación in-ternacional.

Los microarrays son series de matrices es-pacialmente ordenadas, con ligandos(sondas de ADN) químicamente inmovi-lizados en puntos concretos o en unamatriz sólida, como un fragmento de vi-drio (portaobjetos) o de propileno (41).En la práctica de la reacción diagnóstica,las sondas del microarray se incuban conlas muestras sospechosas, de prueba, quecontienen el material genético en es-tudio, previamente marcado, de tal modoque, al producirse la hibridación, se pro-duce una señal en la celda reconocida,que es anotada. Un microarray es, pues,un dispositivo basado en la hibridaciónmolecular.

Como matrices pueden utilizarse distintostipos de materiales, como vidrio, siliconao nailon. En ellos se fijan o “imprimen”sondas (spots) de oligonucleótidos (frag-mentos de ADN) conocidos, y en una ubi-cación precisa, para lo que se dispone derobots que realizan el trabajo de formaautomática. Sobre ellos se sitúan o “hi-bridan” fragmentos de ADN desconocido,procedentes de tejidos o muestras de pa-cientes. En caso positivo, las bases com-plementarias se reconocen y se visualiza


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su hibridación mediante el uso de sustan-cias fluorescentes, aunque también sepuede utilizar quimioluminiscencia o ra-diactividad.

La miniaturización permite el anclaje, enunos pocos centímetros, de cientos o va-rios miles de “spots” de oligonucleótidos,alineados en filas y columnas, cada uno delos cuales se corresponde a una secuenciaespecífica del ADN. De ordinario se utilizanentre 5.000 y 8.000 sondas, que repre-sentan la totalidad de genes expresadospor un microorganismo (42), pudiéndosealcanzar 20.000, 60.000 sondas en unúnico soporte y aún muchas más (43).

De esta reacción se obtiene un puzle enel que la lectura de los puntos marcadospermite identificar la presencia o ausenciade los diferentes fragmentos y componerun cuadro genómico o huella genéticapara la muestra problema. La identifica-ción puede ser, en ocasiones, laboriosa ypuede precisar de la ayuda de algoritmosy programas informáticos que ayuden ala interpretación de los resultados.

Cada mancha de muestra es de tan solo10 µm de diámetro. Para preparar las ma-trices se pueden utilizar ADN complemen-tarios de partes de genes seleccionadosde los patógenos; sin embargo, si se va ainvestigar un gran número de patógenos,entonces sería más fácil desde un puntode vista logístico utilizar oligonucleótidosgrandes, por ejemplo, de alrededor de 70 nucleótidos, como ocurrió durante laidentificación y los estudios epidemioló-gicos en la epidemia de SARS.

Los microarrays son un sistema de detec-ción de alto rendimiento que permite laidentificación simultánea de un gran nú-mero de moléculas diana (analitos o deter-

minantes genéticos o antigénicos) que seunen específicamente al ligando inmovili-zado del array, siendo después leídos enun escáner, originando un patrón de luzcaracterístico. Los datos obtenidos se inter-pretan informáticamente, procesándosesobre datos previamente almacenados, porlo que la ausencia de estandarización hacedifícil la aplicación de programas informá-ticos universales. Su importancia en el diag-nóstico se prevé tan importante como loes en el presente la PCR.

Esta técnica, aunque habitualmente seasocie al estudio del ADN, también sepuede aplicar al estudio de las proteínase hidratos de carbono, y constituye unaauténtica revolución en el campo de laBioinformática; debe recordarse que hastahace pocos años este tipo de estudios es-taba limitado al de un pequeño númerode genes simultáneamente.

Los microarrays permiten:

• Medir la expresión de genes (microarrayexpression analysis).

• Estudiar la mutación de un gen (micro-array for mutation analysis).

• Estudiar la presencia de genes o su ex-presión relacionados con factores de vi-rulencia, como elemento decisivo en re-lación con los estudios de patogénesisde las enfermedades infecciosas.

• Llevar a cabo el genotipado, análisis deexpresión y secuenciación de genes deinterés, en relación con agentes pató-genos.

Los microarrays de ADN que se comercia-lizan en la actualidad incluyen:

• Microarrays de alta densidad: estetipo de microarrays permite una grandensidad de integración y la realización


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de un importante número de ensayosde manera simultánea. Hasta el mo-mento, la empresa líder en microarraysde alta densidad es Affimetrix.

• Microarrays de media y baja den-sidad: suelen utilizarse para trasladar auna escala más práctica los resultadosobtenidos con microarrays de alta den-sidad. Son importantes cuando lo quese busca es fiabilidad y flexibilidad.

En la práctica, el ácido nucleico se extraea partir de una muestra y se realiza unaRT-PCR empleando oligonucleótidos ce-badores al azar. De esta manera, parte detodos los ácidos nucleicos de la muestra,tanto de origen hospedador como pató-geno, se amplifican. Estos productos dePCR, representativos de cada ácido nu-cleico de la muestra, se marcan con uncolorante fluorescente y se aplican a lamicromatriz. En condiciones óptimas soloel ADN procedente del patógeno se uniráal ADN del portaobjetos.

Se pueden diseñar micromatrices para de-tectar patógenos a distintos niveles de di-ferenciación; por ejemplo, se pueden pre-parar oligonucleótidos capaces de detectary diferenciar patógenos a nivel de género.Se elegiría un número, diez, por ejemplo,de oligonucleótidos con un grado elevadode conservación de secuencia (oligonucleó-tidos consenso) dentro de un génerodado, de modo que una sonda fabricadaa partir de una muestra de campo quecontenga un miembro de este géneroprobablemente hibridaría con al menosalguno de los nucleótidos, mientras queno hibridaría (o lo haría en menor grado)con aquellos correspondientes a los gé-neros relacionados (por ejemplo, para di-ferenciar aislados de Apthovirus, cau-

santes de la fiebre aftosa, FMDV) a partirde cepas de Enterovirus de la familiaPicornaviridae. Después se podrían selec-cionar otros juegos de oligonucleótidos,colocarlos en el mismo porta de la matriz,capaces de caracterizar un patógeno deforma más específica, (p.ej. para diferen-ciar los siete tipos de FMDV e incluso po-tencialmente afinar después a nivel desubtipo).

En los últimos años, la tecnología de mi-croarrays ha emergido como el métodode elección para estudios de genómicafuncional, de expresión génica a gran es-cala, proporcionando un procedimientoeficiente y rápido para investigar el trans-criptoma completo de una célula o un mi-croorganismo, es decir, el conjunto degenes que en un momento dado se estánexpresando en ella (que han sido trans-critos a ARNm), por lo que su análisis per-mite estudiar la expresión diferencial endiferentes estados. En este caso particular,el análisis mediante micromatrices per-mite conocer cuánto ADN o ARN (ADNbc)está presente en una muestra, permiteidentificar y genotipar especie y cepa; esuna metodología adecuada en el caso deagentes de difícil cultivo, cultivo lento oincultivables, con una gran sensibilidad,además de corto tiempo de obtención dedatos, aun en el caso de infecciones ví-ricas con integración del genoma vírico enel de la célula hospedadora, como sucedeen retrovirus, permite determinar la cargaviral y el estadio de la enfermedad y, endefinitiva, en estudios de expresión génicaproporciona una medida del nivel detranscripción del gen.

Aunque ningún campo se ha beneficiadomás de este tipo de tecnología que los es-tudios de patogénesis (ver después), los


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microarrays poseen también numerosasaplicaciones en la clínica humana y vete-rinaria, tanto en lo que se refiere al diag-nóstico como en la identificación denuevas dianas terapéuticas. En la actua-lidad, las potencialidades en SanidadAnimal son enormes (44) en función deque la gran cantidad de información dis-ponible procedente, sobre todo de expe-rimentos científicos está generando unnuevo tipo de software analítico (45).Claramente, el análisis de micromatricespresenta un enorme potencial cuando seinvestigan enfermedades de etiología des-conocida, enfermedades en las quepuede estar presente más de un pató-geno (se pueden buscar cientos de pató-genos de manera simultánea sobre unaúnica micromatriz) y cuando se precisa lasubtipificación. Para mejorar la sensibi-lidad en la detección de los patógenos sepueden complementar las micromatricescon amplificaciones por PCR que se di-señan para amplificar uno o más genesconservados o secuencias múltiples, ytambién mediante el uso de biosensores.

En el caso de Salmonella, por ejemplo, unpatógeno de importancia en Salud Públi-ca y en Sanidad Animal, por su condiciónde patógeno o al ser algunas especiesanimales reservorios de ellas, se han de-sarrollado microarrays (Ahn y Walt, 2005)(46) con oligonucleótidos de los genesinvA y spvB, con una sensibilidad de 103

a 104 ufc/ml después de 1 hora de hibri-dación a partir de una mezcla que con-tenía otros patógenos comunes. Tambiénse han desarrollado para otros patógenosde interés en este campo, como sucedecon E. coli 0157:H7 (47), un patógeno detriste actualidad (por aproximación en elcurso del presente año) en el que los au-

tores incorporaron cuatro genes de viru-lencia, los correspondientes a la intimina,las toxinas stx-I y II y la hemolisina A, de-mostrándose hasta 32 veces más sensibleque las PCR convencionales para la detec-ción, y el caso que corresponde a otrospatógenos de origen animal transmitidospor alimentos, como Staphylococcus au-reus y Clostridium perfringens (48), queincorpora los genes de las toxinas produ-cidas por ambos, o un método de detec-ción de Mycobacterium spp. basado enuna proteína de shock térmico que per-mite su detección a partir de mezclascomplejas (49). También, en el caso deBacillus anthracis, Burton et al. (2005) (50)desarrollaron un microarray para la detec-ción y diferenciación de este patógeno.En el caso de los virus, Liu et al. (2006)(51) desarrollaron un microarray para ladetección de los virus del PRRS y fiebre af-tosa a partir de dos secuencias del pri-mero y una secuencia del virus aftoso. Porúltimo, señalaremos la realización de mi-croarrays para la detección de multipató-genos, como el sistema desarrollado porWilson et al. (2002) (52) para la detecciónde un total de 18 patógenos, incluyendoprocariotas, eucariotas y virus.

Es seguro que el futuro de esta tecnologíaes muy halagüeño desde el punto de vistadiagnóstico, aunque es de esperar que losreactivos y el equipamiento de las micro-matrices sean menos costosas a medidaque se popularice su uso, lo que condu-cirá a una mayor aplicación en el diagnós-tico de las enfermedades animales, per-mitiendo la investigación de los virus o lacaracterización de las cepas bacterianasen términos de virulencia, sensibilidad an-timicrobiana u otros marcadores impor-tantes.


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Proteómica

El estudio de las proteínas es un recursocrucial en el diagnóstico en Sanidad Ani-mal. Su aproximación puede llevarse acabo mediante dos estrategias principalesdisponibles en la actualidad, que permitenidentificar moléculas orgánicas e inorgá-nicas en modo rápido, fiable y con altorendimiento. El estudio e identificación deproteínas (proteómica) puede conside-rarse paralelo a la genómica, permitiendoconocer las proteínas codificadas por ungenoma en particular y llevar a cabo unapredicción de los iones que se generandurante la fragmentación en los dife-rentes sistemas de análisis, obteniendo así“huellas digitales” que permiten identi-ficar una molécula exacta por compara-ción con las generadas teóricamente apartir de las bases de datos genómicas.También puede utilizarse para identificarsecuencias de ADN, lo que permite llevara cabo un análisis rápido y automatizadode productos de PCR (puede utilizarse,por ejemplo, en ensayos de PCR multiplexy se ha probado en la práctica con nume-rosos patógenos respiratorios, incluyendovirus y agentes patógenos de otro tipo, deprocedencia humana) (53).

Por un lado, la electroforesis bidimen-sional (EBM) separa mezclas complejas deproteínas e informa del estado de la in-fección o los efectos de una terapia de-terminada o la influencia del ambiente,igual que permite el estudio del momentodel ciclo celular o el efecto de mutaciones.En la primera fase, las proteínas son sepa-radas según su punto isoeléctrico (isoelec-troenfoque), y en la segunda, lo son aten-diendo a su tamaño molecular, quecondiciona su movilidada electroforéticaen una técnica de SDS-PAGE (tratamiento

detergente seguido de electroforesis engel de poliacrilamida). En la actualidad, laelectroforesis bidimensional diferencial engel (DIGE) es la tecnología más fiable.Marca las proteínas con FC espectral-mente diferenciables y permite procesar ala vez varias muestras. Reduce la variabi-lidad entre geles al analizar muestras en elmismo gel, a la vez que garantiza la fiabi-lidad estadística como consecuencia deutilizar réplicas biológicas y fluorocromosde gran sensibilidad y rango lineal, ademásde un software único (DeCyder).

En lo que se refiere a la espectrometría demasas (EMS), puede definirse como unatécnica analítica que mide iones derivadosde moléculas, después de su tratamiento.Utiliza espectrómetros de masas que ana-lizan con precisión la composición de di-ferentes elementos químicos e isótoposatómicos, separando los núcleos en fun-ción de su relación masa-carga, pudiendoutilizarse tanto para identificar los dife-rentes elementos que forman un com-puesto como para determinar el conte-nido isotópico de diferentes elementos enun mismo compuesto. En la práctica, elEMS calienta hasta vaporizarlo, e ionizarlos diferentes átomos, un haz del mate-rial procedente del compuesto de prueba.El haz de iones produce un patrón espe-cífico en el detector, que permite analizarel compuesto.

El espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF utiliza una técnica de ionización suave(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ioniza-tion) acoplada con un detector de iones(Time-Of-Fligh), en definitiva, un métodode deserción/ionización láser asistida pormatriz y un detector de iones (MALDI-TOF-TOF). La técnica es rápida, fiable y dealto rendimiento y permite el análisis de


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biomoléculas (proteínas, péptidos, azú-cares, secuencias de ácidos nucleicos, am-plicones…), incluso de grandes moléculasorgánicas, frágiles cuando son ionizadaspor métodos convencionales. MALDI-TOFobtiene “huellas peptídicas digitales” otándem MS, con las que identifica las mo-léculas por comparación con bases dedatos.

Biosensores. Aplicación al diagnósticomolecular

Un biosensor es un dispositivo de análisisque convierte una señal biológica en unaseñal eléctrica (figura 9). Según la IUPAC(International Union of Pure and AppliedChemistry), un biosensor es “un sistema re-ceptor-transductor, integrado en un dispo-sitivo capaz de proporcionar informaciónanalítica selectiva, cualitativa y cuantitativautilizando un elemento de reconocimientobiológico” (54). Se trata pues de un dis-positivo o sistema compacto, integradopor dos elementos, un receptor biológico(biorreceptor), que es el biosensor propia-mente dicho, preparado para detectar es-pecíficamente una sustancia o señal bio-

lógica (el biomarcador o marcador bioló-gico) aprovechando la especificidad de lasinteracciones biomoleculares, reaccio-nando con ella, y un transductor o sensorcapaz de interpretar la reacción de reco-nocimiento biológico que produce el re-ceptor y “traducirla” en una señal eléc-trica cuantificable a través de un sistema“de salida”.

Los dos constituyentes del biosensor estánintegrados formando una unidad y es pre-cisamente esta unión íntima la que con-fiere al dispositivo sus especiales caracte-rísticas de sensibilidad y selectividad (55).

El biorreceptor es, sin duda, el compo-nente más crucial del sistema biosensor;es la clave de su especificidad y puede cla-sificarse en diferentes grupos, de acuerdocon su composición o carácter. En gene-ral, incluyen anticuerpos, enzimas, ácidosnucleicos (ADN), receptores o compo-nentes celulares (células completas, mem-branas, otros componentes subcelulares,como mitocondrias, proteínas no enzimá-ticas, sistemas celulares, secciones de te-jidos, etc.), que responden básicamente a


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Figura 9. Esquema de componentes principales de un biosensor (56).


procesos biocatalíticos (el caso de las en-zimas), inmunológicos (el caso de los an-ticuerpos) y genómicos (el ADN). Su fun-ción consiste en proporcionar especificidady selectividad, respondiendo únicamentea un analito en particular o una moléculade interés, evitando de este modo reac-ciones cruzadas o interferencias con otrassustancias.

El transductor desempeña un importantepapel en el proceso de detección. Comotransductores pueden utilizarse, principal-mente, dispositivos electroquímicos, óp-ticos y mecano-acústicos. También se des-criben transductores piezoeléctricos ycalorimétricos o térmicos. Cada uno deestos grupos puede dividirse en tipos mar-cados y no marcados según que el efectose mida directamente o mediante la de-tección de una señal particular depen-diente del marcador utilizado, siendoestos últimos, generalmente, los más uti-lizados.

Además de la sensibilidad y la selecti-vidad, una de las características funda-mentales de los biosensores es la posibi-lidad de realizar el análisis de la sustanciaa determinar en tiempo real y de formadirecta (sin necesidad de marcador) a di-ferencia de cualquier análisis biológico oclínico que requiere siempre un marcador(ya sea colorimétrico, fluorescente o ra-dioactivo). Estas características permitenla posibilidad de realizar análisis cualita-tivos y cuantitativos, además de evaluarla cinética de la interacción (constante deafinidad, asociación, disociación…) y, portanto, dilucidar los mecanismos funda-mentales de dicha interacción.

En el diagnóstico de las enfermedades in-fecciosas, los receptores comunes son las

secuencias de ácidos nucleicos y los anti-cuerpos. Los primeros se utilizan como re-ceptores tipo sonda, del mismo modo quelo hacen en una hibridación, mientras quelos segundos captan los antígenos espe-cíficos correspondientes.

En la clasificación pueden utilizarse dis-tintos criterios. Si se considera el tipo deinteracción, esta puede ser biocatalítica(se basa en el uso de sistemas que con-tienen enzimas o multienzimáticos) o deafinidad. Si es el tipo de interacción elconsiderado, puede hablarse de interac-ción directa o indirecta

En relación con el marcaje de las molé-culas, existen biosensores marcados y nomarcados: los primeros detectan una señalo marcaje específico, como puede ser lafluorescencia o la actividad enzimática;son los más utilizados. Los no marcadosmiden directamente la reacción bioquí-mica en la superficie del transductor.

Respecto del tipo de transductor, se in-cluyen: biosensores ópticos o fotomé-tricos, que se basan en la recepción de luzque, o bien pasa a través de la muestra ose refleja; biosensores electroquímicos, enlos que el elemento de reconocimientobiológico (el receptor bioquímico) es rete-nido en contacto directo con un elementode transducción electroquímica, y, final-mente, biosensores piezoeléctricos y acús-ticos, que se Zbasan en el uso de cristalescapaces de sufrir una deformación cuandose les aplica un potencial eléctrico a travésdel cual es posible obtener característicasde frecuencia de resonancia.

El reconocimiento molecular que tienelugar en el receptor biológico requiere laintervención de la señal biológica o bio-marcador, que con la molécula de recono-


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cimiento (biorreceptor) y bajo el desarrollode algún tipo de reacción, genera unaseñal específica (señal biológica). Las mo-léculas de reconocimiento se generan enbase al conocimiento del biomarcador re-levante, que puede proceder del patógenoque produce una enfermedad o del propiohospedador que la padece (57, 58).

Los biomarcadores que proceden delagente patógeno necesitan ser altamenteespecíficos, mientras que los derivados delhospedador enfermo o sospechoso puedenser específicos o inespecíficos. Habitual-mente, los biomarcadores derivados delhospedador ofrecen la ventaja añadida deque muchos pueden generarse para cadapartícula infecciosa.

Los biomarcadores pueden ser ácidos nu-cleicos, proteínas o metabolitos de bajopeso molecular. Además de las moléculasde carácter antigénico, como biomarca-dores, la detección de la actividad enzi-mática en particular derivada de losagentes infecciosos también tiene valordiagnóstico, como ocurre con la actividadureasa en Helicobacter pylori o la beta-D-glucuronidasa de Escherichia coli. Por suparte, los cambios en la actividad de de-terminadas enzimas y derivados del hos-pedador también han sido utilizados comoindicadores generales de infección bacte-riana, como ocurre con la lisozima delsuero y la mieloperoxidasa, así como pro-teínas de estrés, como la IL-6 y la proteínaC-reactiva. Como hemos señalado, losbiomarcadores derivados del hospedador,aunque son útiles como indicadores de in-fección, son menos convenientes paraidentificar un agente infeccioso particular,incluso aunque sean capaces de diferen-ciar entre etiologías bacterianas y virales,pero no necesariamente son específicos.

Los biomarcadores basados en los ácidosnucleicos, derivados del agente patógeno,son muy importantes, tanto en términosde la exactitud de su identificación comodel límite de detección (sensibilidad) quepuede lograrse utilizando la amplificaciónpor PCR. Los sistemas de PCR rápida hanhecho grandes progresos en los últimosaños y se está estudiando su integraciónen los sistemas µTAS (sistema de análisismicro total, Micro Total Analysis Systems)(59). Estos sistemas de biosensores ba-sados en los ácidos nucleicos pueden serplataformas genéricas eficaces, aunqueno pueda diferenciarse entre células vivasy muertas y el ácido nucleico, en este úl-timo caso, pueda degradarse rápida-mente.

Como se ha señalado antes, los biorre-ceptores son las moléculas de reconoci-miento. Se incluyen los siguientes tipos:

• Biorreceptores basados en enzimas.Las enzimas pueden ser utilizadas comobiorreceptores en base a su capacidadde unión específica al sustrato o debidoa la transformación catalítica de unamolécula en una forma detectable. Enla mayoría de los estudios, la utilidadmás buscada ha sido la capacidad cata-lítica, y las tres enzimas más utilizadasson la peroxidasa (de rábano picante),la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa(60), siendo su principal limitación la es-tabilidad de la enzima, que depende dela temperatura, el pH y otras condi-ciones, a pesar de lo cual, estas enzimasson los biorreceptores más utilizados (enla diabetes, para detectar los niveles deglucosa en sangre, y también se hanpropuesto para detectar bajos niveles depesticidas) (61).


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• Biorreceptores basados en anticuer-pos. También se les conoce como inmu-nosensores porque utilizan anticuerposcomo elemento receptor del biomar-cador, en base a la reacción antígeno-anticuerpo, como es sabido, altamenteselectiva. Aunque las determinacionesbasadas en la reacción antígeno-anti-cuerpo (inmunoensayos) son de usocomún en el diagnóstico de las enfer-medades infecciosas, ninguna de ellasha sido suficientemente sofisticada parapermitir su automatización, facilitandola realización de gran número de mues-tras en un corto espacio de tiempo. Eldesarrollo de los inmunosensores parael diagnóstico de enfermedades, princi-palmente humanas, ha merecido últi-mamente mucha atención, principal-mente como consecuencia de esanecesidad reiteradamente citada de dis-poner de sistemas rápidos y sensibles(adaptables y automatizables, si ello esposible).

Aunque habitualmente los inmunosen-sores incorporan anticuerpos al sensor(biorreceptor), también pueden incor-porar el antígeno para detectar al anti-cuerpo, y, en un caso y otro, utilizanfundamentalmente transductores óp-ticos y electroquímicos.

• Biorreceptores basados en ácidosnucleicos (ADN). La detección de se-cuencias específicas de ADN utilizandosondas marcadas, no radiactivas, cons-tituyen la base de este tipo de biorecep-tores, utilizable para la detección de unaamplia variedad de patógenos, princi-palmente bacterias o virus. El métodoconsiste en la inmovilización de unasonda, un oligonucleótido sintético,corto, de 20-40 mer (bases repetidas),

cuya secuencia es complementaria a lade la molécula diana de interés, de talmodo que la exposición del biorreceptora una muestra que contiene la diana dalugar a la formación de un híbrido. Paradetectar la formación de la doble ca-dena se han adaptado diversos tipos detransductores, incluyendo dispositivosópticos, piezoeléctricos o electroquí-micos, siendo estos últimos los procedi-mientos más comunes.

Los transductores transforman la señalbiológica en una señal eléctrica, como seha señalado. Los transductores electroquí-micos incluyen distintas opciones, comolos sensores amperométricos, muy utili-zados en el caso de la glucosa, o los po-tenciométricos [que se han utilizado conéxito en inmunoensayos de varios tiposde agentes patógenos, como el virus dela enfermedad de Newcastle (62), ence-falitis equina venezolana (63) o en la de-tección de E. coli (63) en varios tipos dealimentos].

Los transductores ópticos son los que másinterés han recibido para el diagnóstico/detección de enfermedades, como se co-mentó anteriormente. Este sistema puedeimplicar la detección directa del analito deinterés o indirectamente a partir desondas marcadas óptimamente, y puedenagruparse en cuatro tipos de biosensores:de absorción y reflexión, de quimiolumi-niscencia, de fluorescencia y de fosfores-cencia, todos los cuales requieren del usode espectrofotómetro.

La espectroscopía de infrarrojos es, en laactualidad, un instrumento muy popularpara la detección de distintos tipos de mi-croorganismos como E. coli, Mycobacte-rium spp., Staphylococcus spp., hongos


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como Candida albicans, etc. (65). El es-pectrómetro de infrarrojos puede propor-cionar una “huella” del microorganismorevelando cambios en las vibraciones delos puentes moleculares que informan dela composición química de la muestra sos-pechosa, aunque no es lo suficientementesensible como para detectar directamenteel agente patógeno a partir de una ma-triz compleja, como puede ser la sangre,por ejemplo, por lo que la muestra en es-tudio necesita ser sometida al cultivoprevio. Puede también utilizarse espec-troscopía de luz reflejada, un procedi-miento atractivo para la detección de pa-tógenos directamente, sin marcar, comoocurre en el caso de Salmonella entericaEnteritidis o Listeria monocytogenes.

La quimioluminiscencia puede ser utili-zada para detectar reacciones bioquímicasespecíficas. Implica la producción de luzcomo resultado de una reacción químicaentre un analito y una sustancia fluores-cente, por ejemplo, rodamina B. Para al-gunos investigadores, el transductor qui-mioluminiscente es el sistema óptico másconveniente para detectar reacciones an-tígeno-anticuerpo y otros lo han utilizadopara la detección de ADN. En cualquiercaso es un sistema muy sensible.

Los transductores fluorescentes, que uti-lizan una fuente externa de luz para ini-ciar la transición electrónica en un átomoo molécula, son, probablemente, los mé-todos de detección más sensibles y se hanutilizado para la detección de varios mi-croorganismos y toxinas microbianas,como B. anthracis, Francisella tularensis,toxina colérica, enterotoxina estafilocó-cica, toxina botulínica, etc., comparándolacon el ELISA estándar.

Aunque las primeras descripciones de bio-sensores se produjeron hace ya casi 40años, no hace más de 15 que comenzarona difundirse y comercializarse, especial-mente en el campo de la salud, aunque elcampo de aplicación ha sido limitado. Sinembargo, las nuevas tecnologías en loscampos de ingeniería de proteínas, nano-tecnología, Biología Molecular e Inmunolo-gía, han reavivado el interés por estecampo, a la vez que los avances en genó-mica y proteómica identificando nuevosbiomarcadores de enfermedades, inclu-yendo enfermedades infecciosas, han per-mitido desarrollos de gran interés práctico(66).

En la actualidad, los biosensores repre-sentan un campo con una tasa de expan-sión impresionante, estimada en más del60% anual en los últimos años, en su ma-yoría dependiente de la industria referidaa la salud humana (por ejemplo, en rela-ción con la diabetes, los biosensores deglucosa han acaparado la atención de losespecialistas), aunque pueden ser perfec-tamente aplicables a la evaluación de ali-mentos, la vigilancia del medio ambienteo la Sanidad Animal (especialmente en elcaso de animales de compañía). Se ha cal-culado que más del 30% del mercado deanálisis de todo tipo, a nivel mundial, es-timado en más de 12.000 millones deanálisis al año, lo acapara cuanto se re-fiere a la salud humana, permaneciendopor ello abiertas grandes posibilidades deexpansión a otras áreas, incluyendo, evi-dentemente, a la Sanidad Animal y lasciencias veterinarias en general (porejemplo, para el control de la fertilidad enespecies de renta y seguridad alimentaria,tanto en lo que se refiere a la contamina-ción con agentes patógenos como en re-


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lación con la composición y fraudes, etc.)(67). Algunas compañías pretenden co-mercializar esta tecnología actualmenteen el campo veterinario (68, 69), inclu-yendo biosensores para la detección de E.coli 0157:H7 y otros. El inconveniente re-side, sin embargo, y por el momento, ensu coste y en el impacto social.

Tecnología de genes bioindicadores–bioreporters– bioluminiscentes e in-tegrados en circuitos (CIBB)

En los últimos años, las aplicaciones bio-lógicas que tienen que ver con la utiliza-ción de genes indicadores han comenzadoa suscitar un inusitado interés por parte delos científicos y tecnólogos. Una de ellasse refiere a los CIBB (circuitos integradosbioindicadores bioluminiscentes), un tipode dispositivo que utiliza chips diseñadospara recoger señales emitidas por bacte-rias especialmente alteradas, creadas me-diante manipulación genética, que emitenluz verdosa (o azul verdosa) en presenciade contaminantes químicos o biológicos.

La enzima que cataliza la reacción lumi-niscente es una luciferasa, un tipo de en-zima que se detecta, entre otros, en bac-terias y en hongos. Los genes aislados,responsables de la reacción luminiscente,constituyen bioinformadores o bioindica-dores (bioreporters), de tal modo que,ante un producto químico determinado oun agente físico dispuesto en su am-biente, responden emitiendo luz.

Un bioreporter contiene dos elementosgenéticos esenciales, un promotor y ungen reporter (un gen indicador, es decir,que, cuando se expresa, existe o se pro-duce alguna característica que es aprove-chable como indicio de su presencia).

El promotor (controla el inicio de la trans-cripción a ARNm, es decir, es el puntodonde se fija la ARN polimerasa) es trans-crito cuando está presente un determi-nado agente en el ambiente del microor-ganismo. En una bacteria normal el genpromotor está unido a otros genes que setranscriben igualmente, traduciéndose enproteínas que ayudan a la bacteria a com-


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Figura. 10. Anatomía de un organismo bioreporter (70).

Signal

Promoter Transcription Translation

ReporterProtein

ReporterGene mRNA

Analyte


batir o a adaptarse al agente al que hansido expuestas. En el caso de un biore-porter, estos genes, o parte de ellos, hansido eliminados y reemplazados por elgen reporter. De este modo, al activarseel promotor, se activa el gen reporter, loque conduce a la producción de proteínasreporter que generan algún tipo de señaldetectable. Por tanto, la presencia de unaseñal indica que el bioreporter ha detec-tado la presencia de un determinadoagente en su ambiente.

Aunque originalmente esta tecnología sedesarrolló para el análisis de factores queafectan a la expresión de los genes,pronto se descubrió su aplicación para ladetección de contaminantes ambientales(71) y desde entonces se ha introducidoen otros campos, como el diagnósticomédico (medicina humana), la seguridadalimentaria y otros. La versatilidad del sis-tema depende de la disponibilidad de sis-temas de genes reporter que sean capa-ces de generar distintos tipos de señales.Además, los genes reporter pueden inser-tarse genéticamente en bacterias, leva-duras, plantas o células de mamíferos,proporcionando entonces una funciona-lidad considerable en un amplio rango devectores.

Sistemas de genes indicadores (repor-ter). Para la construcción de microorga-nismos bioindicadores (bioreporter) se dis-pone de varios tipos de genes reporter ylas señales que generan pueden detec-tarse mediante la utilización de distintosprocedimientos, incluyendo métodos co-lorimétricos, fluorescentes, luminiscentes,quimioluminiscentes o electroquímicos.En algunos casos, la señal solamente seproduce en presencia de un sustrato se-cundario, que tiene que ser incorporado

al bioensayo, mientras que otras veces laseñal debe activarse por una fuente de luzexterna, y en unos pocos casos la señal seautoinduce. Se consideran los siguientes:

• Sistema de la luciferasa bacteriana (lux).La luciferasa es el nombre genérico deuna enzima que cataliza una reacciónque produce y emite luz. Las luciferasaspueden encontrarse en bacterias y enhongos, además de en otros organis-mos, y los genes responsables de la re-acción bioluminiscente (genes lux) hansido aislados y utilizados extensamenteen la construcción de bioreporters queemiten una luz azul-verdosa con inten-sidad máxima a 490 nm. Se producenvariantes en función de la temperatura(< 30 ºC, < 37 ºC y < 45 ºC) y de lacombinación de genes lux implicados(existen cinco tipos de genes lux: luxA,luxB, luxC, luxD y luxE), lo que propor-ciona bioreporters luxAB, luxCDABE einespecíficos.

Los bioreporters luxAB solo completanla reacción bioluminiscente en presenciade un determinado sustrato. A partir debacterias, levaduras y otros sistemas ce-lulares (células de insectos, de mamí-feros, de nematodos o de plantas) sehan desarrollado diferentes opciones.Por ejemplo, se han utilizado en estu-dios de detección de antimicrobianos(incluidos antibióticos), biofilms, conta-minantes ambientales, patógenos enalimentos, inmunoensayos, tecnologíasIVET (de expresión in vivo), patógenosde plantas o infecciones por virus, entreotros. En el caso de los bioreportersluxCDABE, que incorpora todos losgenes lux, no requieren la adición deningún sustrato, ni excitación alguna ex-terna para generar luz, de tal manera


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que este bioindicador siempre que se ex-ponga a un analito diana produce bio-luminiscencia en menos de 1 hora, loque le hace especialmente interesantedesde el punto de vista práctico, por loque se ha incorporado en diversos arraysde metodologías diseñadas para la de-tección de contaminantes ambientalesy, experimentalmente, en sistemas deseguimiento de infecciones experimen-tales por agentes patógenos en ratones,por ejemplo, en el caso de S. entericaTyphimurium (72). Los bioindicadoresinespecíficos solo se utilizan para la de-tección de toxinas químicas.

• Sistema de la luciferasa de la luciérnaga(luc). Esta luciferasa cataliza una reac-ción que produce luz visible en el rangode 550-575 nm de longitud de onda.Igual que sucede con otra luciferasa,producida por un escarabajo, que esbioluminiscente en un pico más estre-cho (595 nm) y requiere de la incorpo-ración externa de luciferina. Sobre ellosse han desarrollado numerosos bioindi-cadores para la detección de contami-nantes ambientales y puede resultarmuy prometedor en el campo del diag-nóstico médico (ya se ha utilizado en elcaso de tumores) (73), veterinario, y enel de la fisiología de la reproducción (74).

Sistema Aequorin. Aequorin es una fo-toproteína aislada de la medusa Aequoreavictoria que en presencia de calcio (Ca) ycoelenterazina produce una reacción enla que se genera luz azul en el rango de460 a 470 nm de longitud de onda. Estaproteína se ha incorporado en células Bhumanas para la detección de bacterias yvirus patógenos en un sistema que se de-nomina CANARY (Cellular Analysis andNotification of Antigen Risks and Yields)

(75) en el que la exposición de las célulasB recombinantes a antígenos procedentesde distinto tipo de patógenos da lugar ala producción de luz como resultado de laactivación de una cascada de señales in-tracelulares que liberan Ca dentro de lacélula.

Los linfocitos B como bioindicadores sonmuy rápidos, sensibles y específicos. Enun estudio diseñado para la identificaciónde Yersinia pestis, por ejemplo, se pu-dieron detectar menos de 50 ufc en untiempo inferior a 3 minutos, incluido eltiempo de concentración, y la probabi-lidad de detección estuvo en el intervalode entre el 62% (para 20 ufc) y el 99%(para 200 ufc), siendo la tasa de falsos po-sitivos de tan solo el 0,4%. En el caso deE. coli en alimentos, se han detectado va-lores de 500 ufc/g en menos de 5 mi-nutos, incluyendo el tiempo de prepara-ción de la muestra, muy por debajo de lorequerido, por ejemplo, en el caso de unaPCR, en el que los tiempos necesarios vande 30 a 60 minutos y el límite de detec-ción es mucho mayor. También se han lle-vado a cabo ensayos similares para la de-tección de F. tularensis, el virus de laencefalitis equina venezolana, B. anthra-cis, Salmonella Typhimurium o S. aureus,etc. (76), señalándose que la posibilidadde crear bioindicadores específicos esprácticamente infinita. Además de ello,los linfocitos B como bioinformadores sonun material muy adecuado en casos querequieren un rápido tratamiento (77).

Sistema de la proteína verde fluores-cente (GFP). Se trata de otra fotoproteínaaislada y clonada, procedente de la mismamedusa, que produce una señal fluores-cente azul al ser excitada con una fuentede luz UV, sin necesidad de sustrato exó-


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geno, por lo que tiene mucho interés enel caso de estudios con células vivas. Seha utilizado extensamente en construc-ciones de bioindicadores en bacterias y le-vaduras o en células de mamífero, permi-tiendo detectar infecciones por virus (porejemplo, el virus VIH).

CIBB. Como en el caso de los biosensores,el uso de la luz como indicador terminaltiene la ventaja de que puede medirse fá-cilmente mediante transductores ópticos.Los BBIC (bioindicadores bioluminiscentesintegrados en circuitos) están formados pordos componentes principales: por un lado,un fotodetector, y por otro, un bioindicadorbioluminiscente que produce una señal quees capturada por el primero (el fotode-tector) en un chip, procesándola. Despuéspuede manejarla y almacenarla (78).

La tecnología de los bioreporters representaun método cuantitativo, de bajo coste, se-lectivo y rápido para la detección y vigilanciade sustancias químicas o agentes biológicosen aplicaciones que incluyen la contamina-ción ambiental, el diagnóstico médico o laseguridad alimentaria, entre otros. Su in-terés se relaciona, además, con la posibi-lidad de implementarse con sistemas detiempo real, ensayos in vivo, etc., que pro-porcionan una perspectiva nueva sobre lafisiología de las bacterias o las interaccionesintercelulares. El estudio de las enferme-dades infecciosas o el uso de modelos ani-males con distintos fines, entre otros, la res-puesta a tratamientos médicos, son camposde utilidad muy claros.

Diagnóstico basado en el estudio dela respuesta inmune

El estudio de la respuesta inmune para eldiagnóstico de animales enfermos ha sido

una línea de trabajo que tiene su origen enlos primeros estudios de fijación del com-plemento (desviación del complemento) oreacción de Bordet-Wasserman, utilizadadesde su descripción en 1906 en el diag-nóstico de la sífilis humana, más tarde apli-cada al diagnóstico del muermo y de la pe-rineumonía contagiosa bovina (reacción deCampbell y Turner). De igual modo, tam-bién se sitúa en sus comienzos los estudiosde Widal (Prueba de Widal) en 1898 parael diagnóstico por aglutinación de infec-ciones entéricas (fiebre tifoidea) o los deKraus sobre la precipitación. En 1945,Coombs describió la prueba de la antiglo-bulina (prueba de Coombs) para la detec-ción de anticuerpos incompletos en elcaso de la brucelosis, aplicable después aldiagnóstico humano; y en 1969, Morgandescribió la prueba del Rosa de Bengala(una modificación del Card Test) para eldiagnóstico rápido de la brucelosis animal,más tarde aplicada también a la enfer-medad humana. En el momento actual, laInmunología presta a la Sanidad Animalapoyo muy importante en materia dediagnóstico.

Como ya hemos referido en otros lugares,una condición que caracteriza las inter-venciones en Sanidad Animal referidas alos animales domésticos productores dealimentos (no así en otras opciones) es lanecesidad de disponer de formatos quepermitan realizar en las mejores condi-ciones números elevados de determina-ciones y, si fuera posible, su automatiza-ción. La aparición en los años 70 de lossoportes en microplaca de poliestireno de96 pocillos estimuló el desarrollo de unaindustria auxiliar que pasó de los labo-riosos microdiluidores utilizados entoncesen las pruebas de fijación del comple-


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mento a los dispositivos de micropipetasautomáticas con puntas desechables quesupusieron en este sentido un avanceconsiderable. Al tiempo, se puso de ma-nifiesto la necesidad de disponer depruebas versátiles, sensibles, eficaces y rá-pidas. Por el camino han quedado nume-rosas determinaciones de la respuesta in-mune (detección de anticuerpos o deantígenos) de desarrollo laborioso o com-plicado, por lo general restringido a unospocos laboratorios capaces de disponerde infraestructura o instalaciones ade-cuadas para su aplicación, como es elcaso de los distintos sistemas de inmuno-fluorescencia, radioinmunoanálisis (RIA),hemaglutinación y hemadsorción, inmu-nodifusión, etc.

ELISA

En 1971, Engvall y Perlman describieron laprueba ELISA (enzyme-linked immuno-sorben assay) (79) y demostraron su valorcuantitativo utilizando fosfatasa alcalina.Más tarde, Perlman publicó estudios sobrecitotoxicidad de linfocitos humanos (80) yuna selección de inmunógenos y epítoposen el curso de una investigación sobre eldesarrollo de la malaria (81). Ello supuso,sin duda, un hito muy importante en eldiagnóstico inmunológico de las enferme-dades infecciosas. ELISA puede definirsecomo una técnica de tipo bioquímico enla que una cantidad de un antígeno des-conocido se fija a una superficie y despuésse aplica un anticuerpo conocido que, sicoincide con el antígeno, se fija a él. El an-ticuerpo va unido a una enzima y en lafase final del proceso se añade un sustratoque cambia de color cuando sobre élactúa la enzima disponible, fijada al con-junto.

El ELISA puede evaluar la presencia de an-ticuerpos o de antígeno en una muestraproblema, por lo que puede modificarsepara determinar concentraciones de anti-cuerpos en el suero o la presencia de an-tígeno desconocido en una muestra clínicasospechosa. Igualmente posee innumera-bles aplicaciones en muchos campos, porejemplo, para la determinación de antí-genos en alimentos (alérgenos, por ejem-plo) o en toxicología. En la determinaciónde anticuerpos, puede aumentarse demodo importante su sensibilidad medianteel uso de anticuerpos secundarios.

Los tipos más conocidos de ELISA incluyenrespectivamente, ELISA directo, ELISA in-directo (ELISAi), ELISA sándwich y ELISAcompetición. En el ELISA directo, que esel formato más simple de la prueba, el an-tígeno de prueba (la solución sospechosade contener el antígeno) se utiliza parafijar en las microplacas. Posteriormente seañade el anticuerpo conocido, marcadocon la enzima (habitualmente fosfatasaalcalina o peroxidasa). Al añadir el sus-trato específico de la enzima, en caso deque exista antígeno y se corresponda conél, se producirá color, que se mide, o vi-sualmente o mediante un espectrofotó-metro. En todos los casos se incluyen con-troles positivos y negativos que sirvenpara establecer el umbral que marca elvalor a partir del cual la reacción se con-sidera positiva.

En el ELISA indirecto (ELISAi), probable-mente el más utilizado, el antígeno pro-blema se fija a la microplaca utilizandocomo bloqueo seroalbúmina bovina o ca-seína. A continuación se añade el anti-cuerpo primario, conocido, que se uniráal antígeno si se corresponde con él y mástarde se añade y se une el anticuerpo se-


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cundario, antiespecie, con la particula-ridad de que este último está marcadocon una enzima que no modifica las pro-piedades del anticuerpo. Por último, seañade el sustrato de la enzima (para pe-roxidasa, habitualmente TMB –tetrametil-bencidina–), que cambia de color si la en-zima está presente y este se mide con unespectrofotómetro. En un tiempo deter-minado, la reacción se detiene con NaOH.Entre cada fase se incluyen lavados paraeliminar el reactivo sobrante. Existe unarelación entre la producción de color y lacantidad de antígeno de prueba presenteen la reacción. La detección tiene mayorsensibilidad por presentar una amplifica-ción de señal debida a la unión de dos omás anticuerpos secundarios por cada pri-mario. El ELISAi es el método de elecciónpara detectar la presencia de anticuerposséricos contra gran cantidad de antígenosmicrobianos.

La enzima actúa como un amplificador,incluso aunque solo permanezcan unidosunos pocos anticuerpos marcados, de talmodo que las moléculas de la enzimapueden producir muchas moléculas señal.La desventaja principal del ELISAi resideen que la inmovilización del antígeno esinespecífica y cuando se utiliza suerocomo fuente de antígeno todas las prote-ínas presentes en la muestra se puedenunir a la placa compitiendo con el antí-geno de prueba (este problema se re-suelve en la modalidad de “captura ocompetición”, ver después).

El ELISAi se puede ejecutar en un formatocualitativo o cuantitativo; en el primercaso se obtiene un resultado simple, po-sitivo o negativo, y el punto de corte entreambos se determina mediante un cálculoestadístico teniendo en cuenta la informa-

ción obtenida de los controles, conside-rando 2 o 3 veces la desviación estándar.Para la determinación del punto de cortese elige un control negativo, de absor-bancia conocida y baja, por duplicado, yse procesa como una muestra cualquiera,calculando la media de ambas absorban-cias y la desviación estándar, que se mul-tiplica por 3 y se suma al valor promedioobtenido antes. En las pruebas cuantita-tivas se hace necesario construir una curvapatrón de densidades ópticas, elaboradacon una serie de diluciones de una solu-ción conocida de la molécula diana.

En el ELISA sándwich (ELISAs), tambiéndenominado “de captura antigénica” serecubre el pocillo de la microplaca con unprimer anticuerpo conocido y, después deeliminar el exceso por lavado, se añade lamuestra problema en la que se investigala presencia del antígeno que, en caso deexistir, quedará retenido por el primer an-ticuerpo, pegado a la placa. Después deun nuevo lavado, se añade un segundoanticuerpo, en este caso marcado con laenzima. Este ensayo gana en especificidady sensibilidad debido a la amplificación dela señal que permite el segundo anti-cuerpo.

Del ELISAs se han descrito dos variantes, elELISAs DAS (Double Antibody Sandwich) yel ELISAs HADAS (Heterologous Antiglo-bulin Double Antibody Sandwich). En elprimero se utilizan dos anticuerpos espe-cíficos del mismo tipo, uno de ellos mar-cado, que se unen a dos sitios diferentesdel antígeno (el primero se fija a la micro-placa y el segundo se añade después deañadir el antígeno sospechoso) (82),mientras que el segundo anticuerpo, quese dirige también frente a un epítopo di-ferente, es un anticuerpo heterólogo, ob-


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tenido en una especie distinta de la deprocedencia del primero (83).

El ELISA “de captura” permite la detec-ción de antígenos procedentes de bacte-rias o virus (de agentes patógenos, en ge-neral) a partir de muestras clínicas. Es unprocedimiento muy utilizado en SanidadAnimal, por ejemplo, en el diagnóstico deanaplasmosis, diarrea vírica bovina, pestebovina o peste de los pequeños rumian-tes, virus respiratorio sincitial, enferme-dades por priones (EEB, tembladera, etc.),listeriosis, salmonelosis, brucelosis, infec-ciones por E. coli, etc. (84).

Un tipo de ELISA denominado “de com-petición” incluye el uso de un primer an-ticuerpo, no marcado, que se incuba enpresencia de su antígeno correspondiente,cuya presencia se investiga en la muestrasospechosa (antígeno de prueba). Empleaplacas tapizadas con Ac (o el antígeno es-pecífico marcado, si lo que se investiga esla presencia de anticuerpos, aunque lo ha-bitual es lo primero) específico, marcado,que compite por la unión del antígeno deprueba con los complejos previamente in-cubados. Cuanto más antígeno (o anti-

cuerpo, según el caso) exista en la mues-tra, menor anticuerpo (o antígeno, segúnel caso) será capaz de unirse al antígeno(o anticuerpo, según el caso) en el pocillo,pues uno y otro competirán por el com-plementario. En la práctica, la concentra-ción más alta del antígeno supondrá laexistencia de la señal más débil, en rea-lidad, la ausencia de color, que en estecaso será indicio de resultado positivo. Suventaja principal reside en la capacidad deutilizar muestras crudas o complejas, quetodavía en este caso son capaces deunirse selectivamente a cualquier antí-geno que esté presente en la muestra.

En el diagnóstico serológico, en SanidadAnimal, el ELISA de competición para lainvestigación de anticuerpos ha despla-zado en los últimos años, prácticamente,al ELISAi, tanto en la vigilancia serológicacomo en determinaciones a gran escala(OIE, 2009), pues permite analizar mues-tras procedentes de muchas especies sinnecesidad de utilizar conjugados especí-ficos de especie marcados con una en-zima distinta para cada especie de prue-ba. En el diagnóstico de la lengua azul,


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Figura 11. ELISA, ELISAi y ELISAs (http://www.piercenet.com).


por ejemplo, el uso de un anticuerpo mo-noclonal muy conservado (frente a la pro-teína P7 del virus) permitió la detecciónde anticuerpos frente a todos los tipos delvirus y no reaccionaba contra otros orbi-virus (85). También se ha utilizado esteformato en el diagnóstico de la PPC, lababesiosis, la brucelosis o la fiebre aftosa,entre otros (OIE, 2009).

El ELISA MP (múltiple y portátil), tambiéndenominado ELISA reverso, utiliza varillasde poliestireno como fase sólida con 8-10ojivas. Todo el dispositivo está incluido enun tubo de ensayo que contiene lamuestra problema, y las fases siguientes(lavado, incubación con el conjugado yposteriormente con el sustrato) se llevana cabo por inmersión de las ojivas en mi-cropocillos de microplacas estándar, pre-viamente rellenas con los reactivos. Lasventajas residen en que cada una de lasojivas puede ser sensible a un reactivo di-ferente (antígeno o anticuerpo) con loque puede establecerse una multipruebaque puede resolver simultáneamente va-rias sospechas; además, puede aumen-tarse el volumen de la muestra, con loque la sensibilidad aumenta de formaproporcional (no sirve solo en el caso demuestras clínicas, sino también de ali-mentos o de muestras ambientales). Seha utilizado, por ejemplo, para la detec-ción simultánea de dos tipos distintos deinmunoglobulinas (IgM e IgG) en el casode la fiebre de Lassa (86) con resultadosde alta sensibilidad, por ejemplo cuandose comparó con inmunofluorescencia.También se ha recomendado en el casode flavivirus (87), en la detección de Acdel virus de la encefalitis del Nilo Occiden-tal y en la detección de IgM, IgA e IgGfrente a T. gondii. Igualmente que en la

detección de IgE en casos de alergias. Encualquier caso, este tipo de ELISA se hadefinido como altamente sensible y espe-cífico (mejor que IFD).

Con carácter general, en todas las va-riantes ELISA que utilizan como elementoconocido un anticuerpo específico, de sucalidad depende la sensibilidad y especi-ficidad de la prueba. A este respecto, laalternativa es la disponibilidad de anti-sueros (anticuerpos) policlonales o mono-clonales (ver después). Los segundos, di-rigidos frente a epítopos muy conservadosdel antígeno, ofrecerán determinacionesde una reactividad amplia, mientras quesi están dirigidos frente a epítopos muyespecíficos (poco conservados) ganaránen especificidad.

Citometría de flujo

Es una metodología de análisis individualde células que mide las características dedispersión de la luz y la fluorescencia, des-pués de hacer pasar una fuente de luzsobre una suspensión celular. El estudiocelular individualizado se refiere siemprea un alto número de células, ordinaria-mente entre cinco y diez mil, que su-ponen una muestra suficientemente re-presentativa del conjunto de la población.En el citómetro, la suspensión de célulasen una solución isotónica se hace pasar através de un pequeño orificio de tal modoque necesariamente tienen que hacerlode forma individual (en fila), formandoparte de una corriente continua o flujo ci-líndrico.

La citometría de flujo permite la mediciónrápida de ciertas características físicas yquímicas de las células, que son útilespara el diagnóstico hematológico e inmu-nológico, incluyendo lo que se refiere al


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número y clasificación de las poblacionescelulares, entre otras.

Al interaccionar las células con la luz, ladispersan. La medida de la reflexión la-teral de la dispersión permite evaluar eltamaño, la granularidad y/o la comple-jidad celular. Si antes de la utilización dela luz se dispone la presencia de anticuer-pos monoclonales marcados con fluo-rocromos, se puede evaluar la presenciade un antígeno particular, correspon-diente al anticuerpo, en la superficie ce-lular. Las señales luminosas obtenidaspueden transformarse en impulsos eléc-tricos, que se pueden amplificar y con-vertir en señales digitales, las cualespueden procesarse después con ayuda dela bioinformática.

Distintos fluorocromos permiten estudiarla presencia de diferentes marcadores demodo simultáneo (en la actualidad pue-den detectarse simultáneamente hasta 13fluorocromos de diferentes longitudes deonda). La citometría de flujo utiliza citó-metros de flujo o FACS (fluorescent acti-

vated cell sorter) que evalúan las célulasen una suspensión en función de los doscaracteres citados (tamaño y fluores-cencia), permitiendo un análisis multipa-ramétrico, combinando y relacionando dis-tintos parámetros de la misma célula (88).

El objetivo del análisis por inmunofluores-cencia en citometría de flujo es asignarcada célula a un grupo específico de ellasque comparten propiedades comunesdespués de identificar, como primera fase,las células de interés en cada caso con-creto; por ejemplo, para el análisis de sub-poblaciones linfocitarias se requiere selec-cionar un área de trabajo diferenciandolos linfocitos por sus propiedades de dis-persión particulares (en general, se utilizael tamaño contra la complejidad celular)y una vez que las células de interés se hanseparado del resto, se puede utilizar la in-munofluorescencia para determinar laproporción o el número de células queposeen un determinado marcador, pon-gamos por caso el CD4, con el fin deidentificar la respuesta y su progresiónfrente a un determinado agente pató-geno, virus o bacteria.

La citometría de flujo permite evaluar di-ferentes parámetros celulares, incluyendovalores intracelulares y extracelulares.Entre los primeros pueden diferenciarselos que corresponden al núcleo (porejemplo, ADN, pares de bases, ADN/ARN,ADN/proteínas totales, ADN/antígenosnucleares, ADN/antígenos celulares, re-ceptores nucleares, expresión de genes re-porter, morfología nuclear, otros compo-nentes nucleares, etc.) o al citoplasma(por ejemplo, proteínas totales, estructu-rales, funcionales, glicoproteínas, lípidos,funciones intracelulares, etc.), mientrasque entre los segundos pueden mencio-


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Figura 12. Fundamentos de la citometría de flujo.http://www.cnb.csic.es.


narse los parámetros de superficie (recep-tores, pared celular, sitios de unión a lec-tinas, densidad, unión de ligandos, etc.)o los parámetros extracelulares, general-mente proteínas secretadas. En general,la evaluación de parámetros evaluablespor citometría de flujo están condicio-nados a la disponibilidad de anticuerposmarcados con fluorocromos, específicosfrente a ellos. El conjunto de esta infor-mación permite caracterizar el fenotipode superficie, su estado intracelular, su pa-trón de secreción o su ciclo celular.

En el campo diagnóstico, la citometría deflujo permite determinar la presencia oausencia de determinado tipo de antí-genos en los compartimentos celulares(superficie, citoplasma, mitocondrias onúcleo) y fuera de ellas (antígenos circu-lantes), lo que permite consecuentementeaumentar tanto la especificidad como lasensibilidad de la prueba. En relación conel análisis de anticuerpos, pueden estu-diarse tanto los anticuerpos circulantescomo los que están unidos a células.

La citometría de flujo está considerada enla actualidad uno de los métodos de aná-lisis celular más relevantes y constituye,además, un complemento muy valioso deotro tipo de metodologías para el estudiode las células. La posibilidad de utilizar,conjugándolos, anticuerpos monoclonaleso policlonales con marcadores fluores-centes ha permitido llevar a cabo estudiossobre distribución de determinantes y re-ceptores de la superficie de los microorga-nismos y las células y, en este último caso,ha permitido identificar subpoblacionescelulares (89), incluso diferentes en lamisma muestra, aun cuando estas esténescasamente representadas, una opcióncuantitativa de gran utilidad práctica.

Aunque la introducción de la citometría deflujo en el campo del estudio y diagnósticocelular tiene tras de sí una larga historia,pues comenzó a aplicarse al análisis de lascélulas a comienzos de los años 60, los mi-crobiólogos no comenzaron a utilizar estatécnica hasta finales de los años 70 (90) ylas primeras aplicaciones estuvieron limi-tadas por la inespecificidad de la unión delos colorantes fluorescentes y la capacidad,también limitada, de la informática. Cuan-do emergieron las técnicas moleculares,como la PCR, la secuenciación del ADN ola hibridación, se volvió a retomar la posi-bilidad de uso de pruebas que no depen-dieran del cultivo para el análisis micro-biano, tanto de un modo cualitativo comocuantitativo. Estos nuevos desarrollos faci-litaron hasta cierto grado el uso de la cito-metría de flujo, como de otras técnicas,que permiten la detección y análisis de mi-croorganismos no cultivados, con alta pre-cisión, especialmente en combinación conotros métodos.

En el campo de las enfermedades infec-ciosas, la citometría de flujo permite la me-dida de las características físicas y químicasde bacterias en suspensión en microse-gundos, pudiéndose obtener informaciónsobre la pureza o heterogeneidad de unapoblación en minutos (91). En la actua-lidad, la citometría de flujo se aplica deforma generalizada para los análisis de mi-crobiología ambiental y, en el campo delas enfermedades producidas por bacte-rias y otros microorganismos, fundamen-talmente en estudios sobre la patogénesis,estudiando la evolución de parámetrosque se influyen en el curso de la infeccióno la respuesta, particularmente en pobla-ciones y subpoblaciones de linfocitos yotras células. En el diagnóstico microbio-


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lógico de infecciones, las primeras aplica-ciones son relativamente recientes y datande los años 80, fundamentalmente parala detección de microorganismos en pro-cesos sistémicos, a partir de la sangre depacientes humanos; por ejemplo, E. coliera detectado en muestras de sangre, porcitometría de flujo, utilizando bromuro deetidio, con un umbral mínimo de detec-ción tan bajo como solo 10 células por mi-lilitro (92). Poco después se introdujeronlos anticuerpos fluorescentes, que mejo-raron sensiblemente las técnicas de detec-ción que se aplicaron a otras especies,como Salmonella, Legionella, Pseudomo-nas (Álvarez-Barrientos A., et al., 2000), ydespués a otras, incluyendo S. aureus,Chlamydia, Leptospira, Listeria, F. tularensisy hongos de varias especies (93), aunqueeste desarrollo inicial estuvo también limi-tado por la disponibilidad y coste de losaparatos de medida.

En la actualidad la citometría de flujo esun método imprescindible para detectar ycuantificar el tamaño de la infección, sinla limitación que supone el que algunosmicroorganismos sean de difícil cultivo ono cultivables. Combinada con técnicas deBiología Molecular, permite detectar direc-tamente y enumerar microorganismos es-pecíficos en poblaciones mixtas y para elestudio de funciones biológicas (94).

En el caso de los virus, el obstáculo prin-cipal es su pequeño tamaño, aunque sehan diseñado modificaciones de los citó-metros que permiten optimizar la detec-ción y cuantificación (95); se ha descrito,por ejemplo, su aplicación en la deteccióne identificación de herpesvirus, picorna-virus y retrovirus (Laguado, 2007), y en elcampo veterinario las descripciones sontodavía poco numerosas; por ejemplo, se

ha aplicado directamente a la detecciónde micoplasmas (Mycoplasma agalactiae,M. putrefaciens, M. capricolum subsp. ca-pricolum y M. mycoides subsp. mycoidesLC) en leche (96), medio en el que tam-bién se han estudiado otros patógenos,como Pseudomonas spp o SalmonellaTyphimurium (97, 98). Los micoplasmastambién han sido objeto de estudio en elcaso de M. agassizii, un agente que pro-duce desórdenes respiratorios en la tor-tuga y que se han cuantificado por cito-metría de flujo (99).

No obstante, en este campo, los estudiosindirectos sobre microorganismos o pro-cesos producidos por ellos, en lo que serefiere a la patogénesis de las enferme-dades o la respuesta celular del hospe-dador natural o experimental (incluyendorespuesta a vacunaciones), son más fre-cuentes; en este sentido, por ejemplo, seha descrito el seguimiento de la respuestainmune frente a Mycoplasma gallisep-ticum en aves (100), o de la inmunidad ce-lular en el caso de Brucella melitensis y B.ovis (101), estudios de infecciones latentesen terneros por Chlamydophila pecorumy Ch. abortus (102), o la respuesta frentea una vacuna experimental y controles deinfección en el caso de H. paraseis (103).

También se ha utilizado la citometría deflujo en el estudio experimental de la pa-togénesis de la tularemia, utilizando elmodelo ratón y la cepa LVS (104). En elcaso de los virus y enfermedades produ-cidas por ellos de interés en SanidadAnimal, se ha descrito su uso en el sín-drome debilitante posdestete del ganadoporcino, producido por circovirus (105) yen el virus del PRRS (106), o en el estudiode la patogénesis de las infecciones porretrovirus felinos, modelo tradicional de


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las infecciones por estos mismos agentes(107), entre otros. También existen publi-cados estudios similares en el caso de laleishmaniasis canina (108).

En definitiva, la citometría de flujo, sola oen combinación con las nuevas tecnolo-gías, es un instrumento de gran valor enel estudio de enfermedades infecciosas delos animales, tanto por lo que se refiere ala detección, identificación y cuantificacióndirecta de sus etiologías, con ventajas re-feridas al estudio de un microorganismoen particular, como en lo que se refiere alos estudios derivados del hospedador enel curso de la infección natural, experi-mental o en la valoración de productos va-cunales. De forma especial, su utilidad esaun mayor en el caso de infecciones pro-ducidas por microorganismos no cultiva-bles o de difícil cultivo en el laboratorio.

Reactivos para las pruebasinmunológicas

La principal limitación para el diseño y de-sarrollo de pruebas diagnósticas que re-únan las características deseables (rapidez,sensibilidad, especificidad y coste redu-cido) reside en la producción de antígenosy anticuerpos de calidad, que, en base ala especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, conocido uno de ellos, per-mita la búsqueda del contrario. En la ac-tualidad, la Biotecnología hace posible laobtención y producción de proteínas y se-cuencias nucleotídicas de alta pureza y encantidades suficientes, permitiendo in-cluso modificar su estructura química, ga-nando en reactividad (109).

Obtención de anticuerpos

Con carácter general, la producción de an-ticuerpos específicos requiere disponer con

anterioridad de antígenos de calidad, encantidad y pureza suficientes. Pueden plan-tearse dos alternativas generales en lo quea la obtención de anticuerpos se refiere:por un lado, pueden obtenerse anticuer-pos policlonales, cuya reactividad puedeser discreta, pues representa una mezclade inmunoglobulinas, específicas enmayor o menor medida de un antígenocompleto, pero resultado de la respuestainmune frente a sus epítopos, cada unode los cuales induciría un clon de célulasB (células plasmáticas) que producirían in-munoglobulinas con una secuencia carac-terística; además, el resultado dependetambién del sistema elegido para la pro-ducción (la especie animal, vía de inocula-ción), la propia inmunogenicidad del antí-geno y el protocolo utilizados.

Por otro lado, la alternativa a las inmuno-globulinas policlonales está representadapor los anticuerpos monoclonales (AcMo).El término se refiere a una población demoléculas de inmunoglobulina idénticas,con actividad anticuerpo, y todas ellas conla misma especificidad. Su obtención pro-cede del trabajo pionero de Kohler yMilstein, que en 1975 demostraron la po-sibilidad de producir anticuerpos (mono-clonales) mediante la obtención de un“hibridoma”, fruto de la fusión de linfo-citos B con células de mieloma, trabajoque les valió el premio Nobel de Medicinade 1984 (110). La técnica original deKohler y Milstein (figura 13) se inicia conla inmunización de ratones (Balb/c) conun antígeno para el que se desea la ob-tención de los anticuerpos. Cuando el tí-tulo de anticuerpos séricos es adecuado,se sacrifican los animales y se obtiene elbazo, que se tritura para obtener una po-blación de células B que se fusionan con


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células de mieloma. La fusión se facilitamediante la adición lenta de polietilen-glicol (alternativamente pueden utilizarsevirus, como el virus Sendai, o pulsos eléc-tricos), y al final se obtienen diversidad dehibridomas que heredan las característicasfenotípicas de las células B y mieloma, estoes, crecen indefinidamente y producen an-ticuerpos que corresponden a los distintosepítopos con el que fueron inmunizadoslos animales. Se procede a la selección delos híbridos que producen el anticuerpo deinterés y se clonan, controlando la produc-ción del anticuerpo deseado. En definitiva,la metodología para la preparación de an-ticuerpos monoclonales revolucionó el sis-tema de producción al hacer posible laproducción de anticuerpos dirigidos frentea un solo epítopo, además de otras ven-tajas no menos importantes, como la po-sibilidad de almacenar las células híbridasproductoras (hibridomas) para volver aproducirlos cuando fuera necesario y la ca-pacidad de producción en función de lasnecesidades de cada caso (111). La técnicade Köhler y Milstein produce anticuerposmonoclonales “de primera generación”,que han desplazado a los policlonales demuchas aplicaciones, permitiendo el de-sarrollo y mejora de numerosas pruebasdiagnósticas basadas en la disponibilidadde anticuerpos de calidad como reactivoconocido para la búsqueda del antígenocorrespondiente, sospechoso de estar pre-sente en una muestra clínica en estudio.En general, muchas determinaciones se-rológicas de investigación del antígenodependen en su valoración de la calidad(especificidad, avidez y afinidad) del anti-cuerpo utilizado y, por lo general, los mo-noclonales son mucho más valiosos quelos anticuerpos policlonales.

Las nuevas tecnologías de Ingeniería Ge-nética han permitido, en la actualidad, laproducción de anticuerpos en ausencia deinmunización animal, generándolos porseparado como recombinantes las ca-denas pesadas y ligeras que forman su es-tructura, que una vez reunidas paraformar la molécula completa (no siemprede forma necesaria) constituyen los deno-minados anticuerpos recombinantes (AcR)o de segunda generación que, a dife-rencia de los primeros, se caracterizan porser (si así se desea) multivalentes y mul-tiespecíficos.

Debe recordarse que los genes estructu-rales que codifican las inmunoglobulinasse organizan en forma de exones dis-cretos, que corresponden a dominioscompletos en la proteína, separados porintrones cuyas secuencias pueden mani-pularse para añadir secuencias nuevas enlugares específicos, seleccionados previa-mente, sin que ello suponga riesgo de al-terar la secuencia codificante presente enlos exones. A nivel proteico, la organiza-


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Figura 13. Producción de anticuerpos monoclonalesde primera generación (Köhler y Milstein, 1975).


ción estructural-funcional de las inmuno-globulinas en la forma de estos módulosdiscretos o dominios, en donde se en-cuentra almacenada la información nece-saria para realizar una función específica,facilita también estos objetivos. De estemodo, es posible clonar regiones génicasresponsables de una especificidad de in-terés y ensamblarla con otras, para darforma a un anticuerpo funcional, prácti-camente de cualquier clase de inmuno-globulina, aunque hasta la fecha este tipode estudios se han referido al hombre.

Se pueden producir, así, moléculas com-pletas, similares a las que se obtienen deforma natural en las que están presenteslas dos porciones estructurales, fragmentosFab y Fc, como ocurre con los denomi-nados anticuerpos quiméricos y humani-zados, o bien un conjunto de proteínasbasadas en la estructura de la inmunoglo-bulina, pero no estructuradas, como enti-dades recombinantes autónomas, inclu-yendo fragmentos Fab, Fv de cadenasencilla (scFv), “diabodies”, “triabodies”,

etc. Estas últimas pueden presentarse tam-bién como proteínas de fusión, en las quese combina una porción Fab o Fc con unaenzima, una toxina, un receptor celular,una citoquina, etc., dependiendo del usoo el destino que se prevea para ella (terapiade tumores, enfermedades crónicas, au-toinmunidad, etc.).

Los anticuerpos quiméricos son moléculasartificiales en las que las porciones cons-tantes de las cadenas pesadas y ligerasproceden de una inmunoglobulina hu-mana, mientras que las regiones variablesde ambas cadenas se obtienen a partir deun anticuerpo monoclonal obtenido enratón. Con ello se reduce la inmunogeni-cidad para el hombre de los anticuerposde ratón, al suprimir las regiones cons-tantes, sin afectar a su especificidad. Latécnica fue desarrollada por Morrison ySchlom (1990) (112) y Boulianne (113) eimplica el aislamiento y clonación de losgenes VH y VL del ratón mediante RT-PCR,utilizando ARN total como molde oARNm de un hibridoma secretor de in-


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Figura 14. La molécula de inmunoglobulina con actividad anticuerpo y los genes que la codifican.http://caibco.ucv.ve/.


terés, y como primers oligonucleótidoscomplementarios a los extremos 3’ y 5’ decada gen. Posteriormente se insertan envectores de expresión (ordinariamente cé-lulas de mamífero –CHO–, pero tambiénde plantas, pues se busca que las prote-ínas se secreten glicosiladas) a los que pre-viamente se han incorporado los genesque codifican para las cadenas H y L hu-manas, siendo después transfectados enforma estable a una línea celular seleccio-nada.

Los fragmentos de anticuerpos se ob-tienen, por lo general, en sistemas de pro-cariotas, principalmente en E. coli, y debenestar formados por las regiones hiperva-riables de unión al antígeno, bien comoparte de la región variable de las cadenasligeras y pesadas (Fv) o como parte delframento Fab, que además de las ante-

riores incluye los dominios constantes delas cadenas ligeras y parte de los dominiosde las cadenas pesadas. Para evitar la ex-presión intracitoplasmática, que generacuerpos de inclusión con los inconve-nientes que ello supone (proteínas no fun-cionales, recuperación ineficiente, no gli-cosilación), en 1988 (114) se demostró laexpresión en el periplasma de la bacteria,que se comporta como si se tratase deuna célula eucariota (producción en el re-tículo endoplásmico) con todas sus ven-tajas.

En el mismo año se describió también laproducción en E. coli (posteriormente seha expresado en levaduras –Pychia pas-toris–, en hongos filamentosos, células deinsecto y células de mamífero) de una ver-sión recombinante del fragmento Fv en laque los dominios VH y VL se encontraban


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Figura 15. Obtención de anticuerpos quiméricos para su uso en el hombre a partir de monoclonales obtenidosen ratón. http://caibco.ucv.ve/.


unidos físicamente a través de un ligandopeptídico, pequeño y flexible, formadopor aproximadamente 15 aminoácidos,que permitía el arreglo espacial adecuadode los dominios VH y VL, generándose unFv funcional. Estas construcciones fuerondenominadas Fv de cadena sencilla (delinglés single chain Fv, scFv) y resultan másestables que el Fv convencional, conser-vando toda la capacidad de reconocer yligar antígenos. Es uno de los formatospreferidos para producir fragmentos re-combinantes de Ac con capacidad paraunir antígenos, para preparar proteínas defusión con especificidad antigénica y paraconstruir genotecas de Ac.

También se utilizan en la expresión descFvs sistemas basados en el uso de fagosfilamentosos tipo f (fagos tipos f1, fd yM13) que resultan muy convenientes paraexpresar dominios de anticuerpos, puessu estabilidad en forma cristalizada o lio-filizada facilita el almacenaje y el trans-porte, reduciendo los costes de produc-ción.

Se han aplicado diversas estrategias paraproducir dímeros o polímeros de AcR y enmuchas de ellas se utiliza el entrecruza-miento por medios químicos de dos frag-mentos individuales, obtenidos y purifi-cados de forma independiente, lo quegenera algunos problemas. Una estrategiamás efectiva se basa en la construcciónscFv, pero la longitud del ligando se re-duce a tan solo cinco aminoácidos, lo queimposibilita la formación de un Fv fun-cional entre dos dominios VH y VL en unamisma molécula, pero conduce a la inte-racción de dos moléculas de scFv queforman un dímero que posee dos sitios decombinación con el antígeno. Si la espe-cificidad de los dominios VH y VL es la

misma, el producto obtenido es un homo-dímero bivalente (“diabody” o “frag-mento bivalente”).

Utilizando el mismo formato, también esposible producir moléculas recombinantescon dos especificidades diferentes (porejemplo, A y B). Los polipéptidos produ-cidos a partir de estas construcciones sonincapaces de formar scFv funcionales demanera individual, pero sí son capaces deaparearse apropiadamente para generarheterodímeros (se les ha denominado an-ticuerpos biespecíficos), en donde ambasespecificidades se encuentran físicamenteasociadas. Si se elimina el péptido quesirve de ligando entre los dominios VH yVL y ambas regiones se expresan como unpolipéptido continuo, se forma un trímerofuncional con capacidad para ligar tresdeterminantes antigénicos al que se de-signa como “triabodies” (“fragmento tri-valente”).

Finalmente, las nuevas tecnologías hanpermitido también el diseño y producciónde moléculas artificiales denominadasproteínas de fusión, en las que se com-binan estructuras y funciones procedentesde dos o más proteínas naturales. Puedencombinarse porciones, dependiendo deluso previsto, moléculas de Ac diferentes,o con toxinas, interleucinas, moléculas deadhesión, componentes de la matriz ex-tracelular, hormonas, factores de creci-miento, etc.

En la actualidad, existen programas infor-máticos para diseñar moléculas formadaspor un único dominio variable (VHs), com-plementarias a la estructura de su epítopodiana (115). También pueden producirselos fragmentos correspondientes a las re-giones variables de los anticuerpos con-


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formados con dos cadenas peptídicas en-sambladas en una cadena peptídica única(dsFv).

El uso de los AR de especificidad dirigidao como vehículo de fármacos está dirigidoal tratamiento de enfermedades autoin-munes humanas y otro tipo de enferme-dades crónicas humanas, aunque tambiénse han producido anticuerpos capaces deidentificar proteínas de B. anthracis útilesen el diagnóstico, especialmente en elcontexto de su consideración como armabiológica es lo que representa, sin duda,uno de los aspectos de mayor interés yperspectivas futuras.

En el campo de la Sanidad Animal, la in-formación disponible hasta la fecha acer-ca de la producción de anticuerpos re-combinantes es más bien escasa; Foordet al. (2007) describieron la producciónde anticuerpos recombinantes frente a laproteína no estructural 3ABC del virus dela fiebre aftosa en forma de scFV utili-zando una librería de fagos en un sistemade expresión en E. coli e inmunizando enpollos para comprobar su aplicación enuna vacuna DIVA (ver después), en la queel sistema de diagnóstico utilizado fue unELISA competición que diferenciaba ani-

males vacunados de animales infectados(116).

Pero no solo las inmunoglobulinas sonsusceptibles de la aplicación de este tipode metodología para su producción bio-tecnológica, in vitro, sino que otras mo-léculas, incluyendo otras proteínas, sonigualmente susceptibles de ello, como su-cede con proteínas ricas en leucina yotras. Además, mediante síntesis químicade oligonucleótidos, pueden generarsemoléculas de ARN o ADN sintéticas(genes sintéticos) con capacidad parareconocer específicamente otras molé-culas, incluso con mayor especificidad dela de los anticuerpos, como sucede conlos aptámeros, que se han descrito parael diagnóstico de algunos tipos de cáncery que pueden competir con los anti-cuerpos en investigación y diagnóstico(117-119).

Tecnología de aptámeros

Los aptámeros son cadenas sencillas de70 a 100 oligonucleótidos sintéticos (deADN o ARN), que reconocen de forma es-pecífica y con alta afinidad varios tipos demoléculas diana mediante plegamientostridimensionales de su cadena. Se ob-


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Figura 16. Fragmentos de anticuerpos recombinantes. http://caibco.ucv.ve/.


tienen mediante selección de genotecasde oligonucleótidos combinatoriales (desecuencias al azar) mediante el métodoSELEX (Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment) (120), una téc-nica de química combinatoria que selec-ciona el oligonucleótido que se une conmás afinidad a la diana de prueba. Poseeuna región central de entre 30 y 60 nucle-ótidos, que incluye una secuencia aleatoriay, además, dos regiones flanqueantes desecuencia conocida. Estas moléculas adop-tan estructuras globulares complejas queles permiten propiedades de reconoci-miento molécular, uniéndose de forma es-pecífica y estable a sus dianas, entre lasque se cuentan proteínas, ácidos nucleicos,estructuras multiméricas, pequeños com-ponentes orgánicos e incluso organismosenteros. Existen aptámeros formados porcadenas peptídicas que interaccionan den-tro de la célula con otras proteínas for-mando bucles, cuya afinidad es compa-rable a la de los anticuerpos, con los quese han comparado.

Los aptámeros están considerados comouna alternativa o un complemento a losanticuerpos monoclonales en el diagnós-tico y en la terapia de enfermedades (se lesha señalado como anticuerpos de tercerageneración). Tienen la condición de sen-sores moleculares y son capaces de inter-ferir con las moléculas diana, igual que lohacen los anticuerpos con los antígenos,sobre los que se han señalado varias ven-tajas, incluyendo la posibilidad de su ob-tención frente a proteínas no inmunogé-nicas, la capacidad de regeneración, suestabilidad a temperatura ambiente, subaja inmunogenicidad, la posibilidad demodificar su estructura por plegamiento,su bajo coste, la posibilidad de obtención

por síntesis química, su alta reproducibi-lidad y la capacidad de marcaje (121).También se ha señalado su actividad frentea receptores de la superficie celular y re-ceptores relacionados con la unión con an-fígenos (122). Entre sus inconvenientes secitan su vida corta, especialmente en san-gre, debido a la degradación rápida pornucleasas, y la rápida eliminación a nivelrenal, lo que limita su uso a situacionesparticulares. En cualquier caso se ha seña-lado su utilidad diagnóstica (sensores mo-leculares) y terapéutica (interfieren con laactividad biológica de moléculas diana),por ejemplo, frente a enfermedades pro-ducidas por priones (123).

Polímeros impresos molecularmente(MIP)

Los ligandos naturales de las proteínasson moléculas proteináceas, como ocurrecon los receptores celulares o bacteria-nos, los anticuerpos o los ácidos nuclei-cos, que también se implican con deter-minadas funciones, como la catálisis o latransducción de señales. Con el objetode reproducir estas propiedades deunión se han producido redes de políme-ros con capacidad de reconocimiento es-pecífico y sitios de unión que son com-plementarios a un molde, que puede seruna biomolécula o un compuesto sinté-tico, técnica que se denomina impresiónmolecular.

El concepto de impresión molecular es si-milar al de hacer un molde de goma oplastilina para encajar perfectamente unaplantilla. El producto de la impresión mo-lecular se denomina un polímero impresomolecularmente (molecularly imprintedpolymer, MIP). Los MIP tambien se deno-mina receptores poliméricos sintéticos o


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anticuerpos artificiales o “plastibodies” yse caracterizan por su simplicidad, estruc-tura de red y bajo coste, y en los últimosaños se han diseñado estructuras de estetipo con propósitos de reconocimientomacromolecular (124). Comparándoloscon anticuerpos monoclonales o policlo-nales, son más estables, más baratos yconsumen menos tiempo en las técnicasde uso. Hasta la fecha se han descritopara el diagnóstico de enfermedades bac-terianas, víricas y fúngicas de las plantasy en la detección de compuestos orgáni-cos de interés médico en el hombre (porejemplo, hemoglobina) o en los animales(seroalbúmina bovina).

Obtención de antígenos

Los antígenos proteicos pueden obtenersedirectamente del microorganismo cuyadetección se persigue mediante la pruebadiagnóstica en la que van a ser utilizados,bien como parte del microorganismocompleto o separado del mismo, o me-diante la aplicación de los nuevos mé-todos biotecnológicos, en forma de pro-teínas recombinantes, si se conoce lasecuencia del gen y su producto corres-pondiente. Incluso la ingeniería genéticapuede introducir modificaciones en las se-cuencias que hagan más fácil la purifica-ción, o más eficaz su intervención en elproceso de inmunización, produciendo tí-tulos más altos del anticuerpo deseado,en suma más eficientes, acelerando elproceso y disminuyendo los costes. En elcaso de microorganismos extremada-mente virulentos, la tecnología recombi-nante puede facilitar la producción de an-tígenos de interés a partir de organismosinocuos, reduciendo el riesgo de infecciónen el proceso productivo.

Otros métodos de diagnóstico, de basecompleja, en Sanidad Animal

Pruebas rápidas

Con carácter general, la Biología Molecu-lar se revela como una alternativa de in-terés para el estudio de la respuesta in-mune frente a los métodos clásicos dedetección de antígeno o anticuerpo.

En su conjunto las pruebas rápidas (RDT,rapid diagnostic tests) buscan disponer deprocedimientos rápidos, incluso inme-diatos, que permitan establecer cuantoantes tratamientos terapéuticos al paciente(en Medicina Humana se han definidocomo “pruebas de punto de atención”,que en Sanidad Animal serían equivalentesa “pruebas de establo”) y adoptar cuantoantes decisiones para el control delagente sobre individuos conocidos sus-ceptibles al mismo. El formato más habi-tual de este tipo de determinaciones con-siste en una tira de membrana en la quese fija el material de prueba, sospechoso(el antígeno sospechoso), sumergiendodespués la misma en un recipiente quecontiene los anticuerpos conocidos (anti-cuerpos de detección) y los reactivos derevelado, produciéndose resultados evi-denciables, incluso en pocos minutos.Además permiten procesar un númeroimportante de muestras, con sensibilidady especificidad aceptables, por lo queestán siendo motivo de interés tanto enel caso de la Medicina Humana como enla Sanidad Animal.

Las RDT son tiras basadas en el principiode inmunocromatografía para identificarantígenos o anticuerpos, con interés diag-nóstico; un reactivo (antígeno o anti-cuerpo) es reconocido por el otro (anti-cuerpo o antígeno) mantenido en un


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líquido que migra a través del papel,como consecuencia del paso de la co-rriente eléctrica.

La Biotecnología interviene en varios ni-veles para hacer posible esta disponibi-lidad: por un lado, mediante la identifica-ción de biomarcadores (una determinadaproteína rica en histidinas o una enzima,por ejemplo, una lactato deshidrogenasao una lactasa), su clonación y producciónrecombinante, en el caso de los anfí-genos, y en el de los anticuerpos, me-diante la disponibilidad de anticuerposmonoclonales o recombinantes.

Las tiras pueden contener en su extremodistal el anticuerpo monoclonal (o poli-clonal, según proceda) que reconoce elbiomarcador específico del microorga-nismo sospechoso. Para el diagnóstico,por ejemplo, se coloca en el extremo pro-ximal de la tira diagnóstica la muestrasospechosa (por ejemplo, sangre, orina,heces, etc.) junto a un amortiguador delisis celular que contiene un anticuerpo di-rigido frente a un antígeno blanco del mi-croorganismo de prueba, marcado conuna enzima. La migración del líquido de lamuestra pone en contacto a los tres reac-tivos (biomarcador –antígeno–, anticuerpomarcado y anticuerpo monoclonal), pro-duciendo, en caso de correspondencia,una línea de color al añadir el sustrato co-loreado de la enzima.

Entre los ejemplos mejor conocidos deeste tipo de determinaciones figuran RTDpara el diagnóstico de malaria en en-fermos sospechosos, sobre la base deidentificar un biomarcador representadopor una proteína rica en histidinas 2(PRH2), en la lactato deshidrogenasa(p.D.) o en una aldolasa (125). En su ex-

tremo, las tiras contienen Acm que reco-nocen el biomarcador.

En la práctica, se impregna el extremoproximal de la tira con una gota de sangredel paciente sospechoso, junto con untampón de lisis y un Acm marcado con uncolorante. Al migrar el líquido se ponenen contacto los tres reactivos. La presenciadel biomarcador es reconocida (en casopositivo) por el Acm marcado y produceuna banda visible. En este caso, la sensi-bilidad supera el 95% comparada con elanálisis por microscopía, aunque, depen-diendo de variaciones en el marcador,pueden existir diferencias de sensibilidad.

Inmuno-PCR (iPCR)

Los inmunoensayos representan en ge-neral un procedimiento de diagnósticomuy versátil, capaz de llevar a cabo la de-tección directa de proteínas pertenecientesa los agentes patógenos, o indirectamen-te, detectar anticuerpos frente a ellos.

De modo particular, el ELISA combina laespecificidad de los anticuerpos con la


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Figura 17. Desarrollo de RTD (126).


sensibilidad de una prueba enzimática,pero es incapaz de detectar algunos antí-genos cuando están presentes en concen-traciones muy bajas, por lo que pareceque el nivel de transcripción de los geneses bajo, probablemente debido a los me-canismos de persistencia en el hospe-dador. La PCR, por su parte, es un mé-todo muy sensible, capaz de detectar unasimple molécula de ADN, lo que la con-vierte en una elección excelente para ladetección directa de ácido nucleico pro-cedente de un agente infeccioso y, enconsecuencia, para el diagnóstico micro-biológico, aunque en algunos casos laproteína diana se expresa en un númeromayor de copias que el que correspondeal ácido nucleico.

Uniendo las ventajas de la PCR y la téc-nica ELISA se obtiene una combinación ala que se ha denominado “inmuno-PCR”(iPCR), descrita inicialmente por Sano etal. en 1992 (127), que une al poder deamplificación de la PCR la versatilidad delELISA, permitiendo mejorar la capacidadde detección del antígeno de interés envalores de entre 100 y 10.000 veces(128). Los recientes avances, en particularlos derivados de la nanotecnología, estánhaciendo de la inmuno-PCR un métodode elección para el diagnóstico de las en-fermedades infecciosas (129), en parti-cular allí donde se precisa análisis ultra-sensibles de proteínas, anticuerpos,citoquinas y otros.

La inmuno-PCR permite tanto la detec-ción de antígenos como de anticuerpos,y ha sido utilizada ya para detectar antí-genos proteicos de origen bacteriano o ví-rico (en rotavirus, VIH, norovirus, S. au-reus, etc.) (130-133). También se haadaptado para la detección de anticuer-

pos, como sucede en el caso del saram-pión, a partir de sueros de procedenciahumana (134).

El concepto básico de la iPCR es un ELISAcon una modificación particular. La capa-cidad de reconocimiento del antígeno porparte de un anticuerpo específico perma-nece, pero puede amplificarse y cuantifi-carse un fragmento de un ADNbc utili-zando la tecnología de la PCR cuantitativa(qPCR), reemplazando la parte enzimáticadel ensayo. En términos generales, el mé-todo puede dividirse en dos fases, la pri-mera de las cuales es idéntica al ELISAconvencional, esto es, la inmovilización dela molécula sospechosa (diana) y la sepa-ración de un anticuerpo detector. Launión del anticuerpo conocido a la molé-cula de prueba, en lugar de ser detectadamediante un enzima, como ocurre en elELISA convencional, es identificada poruna secuencia de ADN conjugada al anti-cuerpo detector, y la molécula que con-tiene el ADN funciona como en el ELISA,reconociendo específicamente la primeraunión y al mismo tiempo proporcionandouna molécula reporter, en este caso elADN. El fragmento de ADN se integradespués en la segunda fase del ensayo, alser amplificado por PCR hasta un nivel de-tectable. Como consecuencia de ello, laseñal amplificada correlaciona con el nú-mero de uniones y, por lo tanto, de lacantidad del antígeno de prueba (135).

La iPCR requiere utilizar una molécula queactúa como ligando entre el ADN mar-cado y los anticuerpos. Normalmente seutiliza estreptavidina. El antígeno diana,sospechoso, que recubre la placa de mi-crotiter, es detectado por un anticuerpoespecífico. Las moléculas del ligando seunen al complejo antígeno-anticuerpo y


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a la secuencia de ADN, que después seamplifica por PCR. La cantidad de pro-ducto PCR es proporcional a la cantidadde antígeno que es detectado por los an-ticuerpos. Además, para mejorar el límitede detección del ELISA clásico, la sensibi-lidad del iPCR permite el análisis de pe-queñas cantidades de muestra, lo que re-sulta de especial interés en el caso deestudios en los que la disponibilidad dematerial sospechoso es escaso. La iPCR escompatible con una amplia variedad demateriales objeto de estudio, como puedeser sangre, suero, orina, saliva, heces, cul-tivos celulares, alimentos, extractos deplantas, etc., lo que facilita su uso.

Como se señaló al principio, como conse-cuencia de distintos tipos de avances se haconseguido una reducción del tiempo deejecución de las pruebas y una estandari-zación de los protocolos, además de unaumento de la especificidad, todo ello de-

bido a la introducción de nanopartículasen un formato líquido de la reacción, envez de en microplaca (137), como semuestra en la figura 17 (Malou y Raoult,2011), tanto para el caso de la detecciónde antígeno como para la detección deanticuerpos.

Además de las mejoras en el límite de de-tección, las ventajas del sistema que in-corpora nanoparticulas incluye tambiénuna reducción de las fases de lavado y pe-riodo de incubación, así como la reduc-ción de las interacciones inespecíficas y elaumento de la especificidad, etc.

Aplicaciones de la iPCR al desarrollode pruebas diagnósticas

La iPCR se ha propuesto como un métodoconveniente para la detección de bacte-rias y virus incultivables, en el caso de in-fecciones latentes indetectables. Además,en algunos casos en que la PCR clásica re-


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Figura 18. Comparación de ELISA e iPCR (136).


quiere fases adicionales para la purifica-ción o concentración de las muestras deADN o ARN vírico o bacteriano, lo que su-pone la pérdida de potencial de lasmismas, todo ello además de otras utili-dades en biomedicina de tumores, segu-ridad alimentaria o contaminación am-biental. También se ha utilizado en elseguimiento de enfermedades autoin-munes y después de programas de vacu-nación, en el hombre.

La iPCR se ha adaptado, por ejemplo, paradetectar Streptococcus pyogenes utili-zando como antígeno carbohidratos de la

pared celular de este microorganismo (138)con un límite de detección de 10-5 célu-las/µl, equivalente a 100 antígenos, lo quesupone sensibilidades superiores a las ob-tenidas con ELISA y muy específico. Tam-bién se ha adaptado a la detección de S. aureus, utilizando como antígeno la pro-teína A (139), también con gran sensibi-lidad, pero no tan específico. En el caso devirus, se ha adaptado para la detección deARN del VIH-1 en el plasma sanguíneo,con límites de detección de 50 partículasvíricas/ml (140), o en el caso de norovirusen muestras de alimentos (Tian y Man-


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Figura 19. Avances en la iPCR asociados a la incorporación de nuevas tecnologias. En (a) iPCR con nanopartí-culas de oro: el anticuerpo captura (conocido y fijado por Fc a una placa magnética de captura) adsorbe al an-tígeno diana; a continuación se añaden nanopartículas de oro con ADN marcado y anticuerpos de deteccióntambién marcados, formándose un inmunocomplejo que libera el ADN después del calentamiento y se am-plifica por qPCR, lo que permite la detección del antígeno de prueba. En (d), detección de anticuerpos me-diante el sistema Tus-Ter. El anticuerpo de prueba se une a la proteína LG que recubre una placa microtiter. Elanticuerpo de prueba, unido a la proteína Tus se añade al anterior. Se une después el ADN a la proteína Tus yfinalmente se amplifica por qPCR (Malou y Raoult, 2011).


drell, 2006) con una sensibilidad superiora la de ELISA y diez veces más sensibleque la RT-PCR. Se ha destinado tambiéna la detección de rotavirus (Adler et al.,2005), hantavirus (141) y el virus influenzaH5N1 (142), en el que ha mejorado sus-tancialmente la sensibilidad del ELISA (milveces más sensible) y la RT-PCR (cien vecesmás sensible). También se ha adaptado ala detección de anticuerpos, por ejemploen la vigilancia de campañas de vacuna-ción humanas, cuando se precisa gransensibilidad, como ocurre en el sarampión(Mckie et al., 2002). También se ha utili-zado para la detección de priones en elcaso de la encefalopatía espongiformebovina (143) y en el scrapie o tembladeraovina en cricetos infectados experimen-talmente (144).

En definitiva, se trata de una técnica degrandes perspectivas, extraordinariamentesensible, tanto en la detección de antí-genos como de anticuerpos, en la que senecesitan todavía más estudios para pro-fundizar en su conocimiento. Los estudiosrelacionados con el diagnóstico en ma-teria de Sanidad Animal son, hasta lafecha, muy escasos. Sería de interés suutilidad en casos de difícil identificación,por razón de microorganismos de difícilcultivo o incultivables, así por la repercu-sión de reservorios, de agentes de enfer-medades animales y de zoonosis.

Estudios de expresión génicay patogénesis deenfermedades infecciosas

Introducción

En el curso de la infección, los agentes pa-tógenos deben lograr acceder, persistir y

reproducirse en lugares, habitualmenteprivilegiados, dentro del hospedador. Paralograr este propósito es necesario dis-poner de, o producir, determinados fac-tores (ordinariamente factores de viru-lencia) que rompen el equilibrio fisiológicodel hospedador y le producen daño,cuando no resultan letales, en casos ex-tremos, además de otros que les permitenevadir el sistema inmune y/o adquirir losnutrientes necesarios.

Debido a que el ambiente con el que seencuentran los agentes patógenos en elhospedador vivo es muy diferente delmedio ambiente externo, los patógenosdeben regular los genes necesarios, en co-ordinación, a medida que ellos se des-plazan en el ambiente del hospedador ydesde un nicho a otro.

El principal propósito de la investigaciónde la patogénesis bacteriana es com-prender de qué forma los agentes pató-genos interactúan con los hospedadorespara causar enfermedad. El núcleo cen-tral de estas investigaciones reside en co-nocer qué productos de genes se re-quieren y se expresan en el curso de lainfección natural y cómo cambia esta ex-presión en el tiempo (desde la coloniza-ción inicial hasta que tiene lugar la enfer-medad y difusión del patógeno desde lafuente de infección a nuevos hospeda-dores) y el espacio (en diferentes célulaso tejidos dentro del hospedador). Nece-sitamos conocer cómo se adaptan los pa-tógenos al microambiente del hospe-dador, qué tipo de presiones selectivasactúan sobre el agente patógeno en cadamicroambiente, qué factores son respon-sables del daño y cómo se sortea o se de-fiende (o evade) el patógeno frente al sis-tema inmune.


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Aunque los análisis que proporcionan in-formación sobre la expresión de unospocos genes relacionados con la adhesióne invasión celular por parte de los micro-organismos (virus y bacterias invasivas) hansido el núcleo central de la mayor parte dela información disponible hasta la fechasobre la patogénesis, uno de los aspectosmás importantes se refiere a comprendercómo tienen lugar los cambios de expre-sión a nivel completo del genoma micro-biano. La información adicional generadapor los estudios de genomas completos vamás allá de la derivada del aislamiento ycaracterización de los genes y productosgénicos, porque el análisis del genomacompleto permite identificar y caracterizarlas redes reguladoras.

En general, la Genómica se ocupa del es-tudio del genoma de un organismo, queincluye la identificación de sus genes yelementos reguladores, en definitiva, detodos los elementos que componen elmaterial genético. El primer genoma bac-teriano completamente secuenciado fueel de Haemophilus influenzae, publicadoen 1995. En la actualidad son más de 200los genomas de procariotas (incluyendoarqueas y bacterias) que se han secuen-ciado y más de 500 están en proceso desecuenciación (145). Algunos autores ha-blan ya de más de 1.000 microorga-nismos de genoma secuenciado.

El conocimiento de la secuencia genómicacompleta de los microorganismos es elpaso necesario para poder comprender subiología y evolución, lo que implica, en elcaso de los patógenos, identificar genesde virulencia, dianas de los antibióticos,conocer nuevos candidatos para el diseñoy elaboración de vacunas, nuevas estrate-gias diagnósticas e investigar las interac-

ciones que tienen lugar con el hospe-dador y los mecanismos que conducen ala enfermedad, esto es, comprender lasclaves en las que asienta la patogénesis.El diluvio de datos generados por los tra-bajos de secuenciación genómica ha for-zado un salto cualitativo en la aplicaciónde la Bioinformática, necesario para poderanalizar la información producida. La evo-lución de la Biología “in silico” no es laúnica alianza interdisciplinaria surgida dela era posgenómica. La tecnología de losmicroarrays, proteómica, inmunoinformá-tica, biología estructural y química com-binatoria, en todas las cuales se ha ba-sado el conocimiento de la genómica, hanabierto la puerta a otras tecnologías dealto rendimiento que han incrementadola eficiencia con la que han podido iden-tificarse nuevos genes de virulencia,dianas potenciales para fármacos y anti-bióticos y estrategias para el diseño de va-cunas, como antes señalamos.

El genoma de una bacteria esta com-puesto por genes conservados y genes ac-cesorios, variables. Elementos genéticosmóviles, como plásmidos, transposones,secuencias de inserción, integrones, pro-fagos, islas genómicas e islas de patoge-nicidad, son parte de los genes accesoriosy poseen una influencia significativa en elfenotipo y en la biología de los microor-ganismos, facilitando, además, el inter-cambio genético ínter e intraespecie, loque contribuye a su diversidad, desempe-ñando un papel muy importante en la pa-togenicidad de los microorganismos. Unanálisis genómico más detallado permitedescubrir otros pequeños elementos ge-néticos, como sucede con genes ARN (nocodificantes), que pueden desempeñar unpapel significativo en la regulación génica.


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Los genomas bacterianos están altamentediversificados en lo que se refiere a ta-maño, número de copias, topología ocontenido G+C. La mayoría de los cromo-somas bacterianos están continuamenteexperimentando una reorganización muyactiva, con deleciones, duplicaciones y ad-quisiciones de ADN mediante transfe-rencia horizontal, todo lo cual produceuna gran diversidad, encargándose des-pués la selección natural de escoger a losmás adaptados. La mayoría de los ge-nomas contienen genes accesorios queincluyen determinantes para la adapta-ción al hospedador, virulencia y resistenciaa los antibióticos.

El incremento progresivo del número degenomas secuenciados está permitiendoconocer cada vez con mayor profundidadlos procesos moleculares que tienen lugaren la evolución de los microorganismos,especialmente en las bacterias. El análisisgenómico comparativo entre cepas viru-lentas y no virulentas de la misma especieproporciona una información muy valiosasobre los mecanismos de adquisición yevolución de la virulencia. Los factores devirulencia se definen como genes o pro-ductos de genes que facilitan la interac-ción bacteriana, la subversión, la destruc-ción de las células del hospedador o laneutralización de sus mecanismos de de-fensa.

Las especies virulentas han evolucionadodesde grupos numerosos y divergentes debacterias. Los estudios de prevalencia debacterias patógenas han puesto de mani-fiesto que su representación sobre el totalde especies microbianas es muy pequeñay que siempre derivan de especies no pa-tógenas o de cepas o especies estrecha-mente emparentadas. Las propiedades de

una bacteria que determinan si será o nopatógena son numerosas, y los genes co-rrespondientes se adquieren a partir deotras especies, mediante la participaciónde plásmidos (conjugación) o fagos (trans-ducción) o directamente del ambiente ex-terior (transformación). En el caso de lasbacterias intracelulares no patógenas, evo-lucionan a virulentas a partir de mutacionesendógenas, que incluyen deleciones, inser-ciones, duplicaciones de genes, fusiones yreordenaciones (figura 20).

Dentro de una misma especie, las varia-ciones en la virulencia entre cepas sonuna circunstancia habitual. La disponibi-lidad de genomas secuenciados permiteel uso de microarrays de ADN para inves-tigar la base genética de esa variación.

Genómica funcional. Estudios demicroarrays de ADN

La tecnología de microarrays de ADN hafacilitado la identificación de determi-nantes relacionados con la virulencia,genes responsables de la susceptibilidado de la especificidad de hospedador ygenes bacterianos y del hospedador quese activan o se reprimen durante la infec-ción. En el estudio de la identificación yverificación del papel de los genes sospe-chosos de estar relacionados con la viru-lencia, son críticas la disponibilidad demutantes isogénicos y las pruebas de vi-rulencia. Desgraciadamente, para la ma-yoría de los genomas de patógenos se-cuenciados, el 25% o más de los ORFidentificados no coinciden con ningúngen conocido y, por ello, sus funcionesson desconocidas (se les denomina genesFUN, de “functions unknow”). Con fre-cuencia, estos genes FUN son específicosde especie o de cepa.


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Para poder comprender los mecanismosde patogénesis necesitamos de estrate-gias multidisciplinares con el fin de definiry probar la estructura de este tipo degenes. A tal efecto, los microarrays deADN y la modalidad de PCR de análisis degenoma completo (WGPScanning) per-miten analizar y comparar el contenido degenes de las cepas bacterianas secuen-ciadas con los de otros aislados de lamisma especie o de cepas estrechamenterelacionadas.

Los microarrays de ADN, elaborados apartir del ADN o bien del ADNc desnatu-ralizado o de los productos genómicosamplificados por PCR para preparar lasmatrices de ADN (spotted DNA arrays), sehan utilizado para medir la expresión detodo el genoma (bien de modo natural ocomo respuesta a cualquier variable de

tiempo ambiental) o de grandes regionesdel mismo de muchas bacterias, y tam-bién para comparar el contenido genéticocompleto de las cepas bacterianas se-cuenciadas con las de las cepas estrecha-mente relacionadas o con otros aisladosde la misma especie. De este modo, porejemplo, los microarrays han facilitado laidentificación de determinantes sospe-chosos de virulencia y de los genes quedeterminan la especificidad de hospe-dador en algunas bacterias, como ocurreen el caso del género Porucella, en el que,cuando se dispuso del genoma completode B. melitensis 16M, se preparó un mi-croarray con oligonucleótidos de alta den-sidad con el fin de compararlo con el ge-noma de otras especies del género (146),y los resultados pusieron de manifiestoque la mayoría de ORF de B. melitensis es-taban presentes en el resto de especies


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Figura 20. Evolución de una especie avirulenta a virulenta. Mecanismos de transferencia de genes de factoresde virulencia.

MN

L

MN

Pl

L

m

L

MN

PAI

L

Virulent strainsNon virulent strain

Mutations

Plasmaid

DNA


(B. abortus, B. ovis, B. suis, B. neotomaey B. canis), lo que evidenciaba que estegénero presentaba una diversidad gené-tica muy limitada y que muchos de losgenes potencialmente relacionados con lavirulencia se agrupaban en nueve GEI(islas genómicas). Al comparar B. meli-tensis con B. ovis y B. neotomae, que noson patógenas para el hombre, mediantemicroarrays seguido de clonaje por PCR ysecuenciación, pudo comprobarse quehabía 84 ORF que estaban presentes enB. melitensis y ausentes en B. ovis, 80 delos cuales se agrupaban en cinco regionescorrespondientes a otras tantas islas ge-nómicas del genoma de B. melitensis. B.neotomae, sin embargo, pese a no ser pa-tógena para el hombre, también presen-taba tales islas. La posible explicaciónpuede tener que ver con que en esta es-pecie el nivel de expresión es mucho másbajo que en B. melitensis o simplementeque los genes de referencia están inacti-vados (este tipo de cambios no los de-tecta el microarray).

Los microarrays también se han utilizadopara detectar e identificar genes especí-ficos de cepa o la diversidad intraespecí-fica, como sucede en el caso de muchospatógenos bacterianos, como Streptoco-ccus pneumoniae, Salmonella entericaTyphimurium, Campylobacter jejuni,E. coli y otros (147, 148). También se hanutilizado para analizar la expresión degenes en el genoma completo (transcrip-toma) de E. coli uropatógeno en el cursode la infección experimental en el ratón(149), en el que se han propuesto hasta25 genes previamente implicados con lavirulencia bacteriana, incluyendo los rela-cionados con la adquisición de Fe, síntesisde cápsula, de proteínas secretadas, etc.

Utilizando tecnología de micromatricesse han estudiado los efectos transcripcio-nales globales (la expresión génica) sobrelas células del hospedador susceptible, envarios patógenos bacterianos, principal-mente de interés en Medicina Humana,como Pseudomonas aeruginosa, Borde-tella pertussis, Mycobacterium tubercu-losis, Helicobacter pylori o Chlamydia tra-chomatis, además de otros agentes dezoonosis, como Listeria monocytogeneso Salmonella Typhimurium (150, 151).Muchos de los genes sobrerregulados co-difican para citoquinas proinflamatorias(como IL-8, IL-6 y otras) y muchos de lossubregulados lo hacen para factorestranscripcionales y moléculas de adhesióncelular (152).

Esta capacidad de producir informaciónde interés para la comprensión de los me-canismos de patogénesis de las bacteriaspatógenas, sin embargo, no ha rendidotoda su capacidad plena, principalmentecomo consecuencia de los problemas aso-ciados con la expresión de los genes du-rante las infecciones reales en las quesurgen cuestiones como el bajo númerode bacterias en los tejidos vivos, dificul-tades en la purificación de las bacterias (ydel ARN bacteriano) a partir de los tejidos,la inestabilidad potencial del ARNm(aunque esto puede resolverse en buenamedida mediante el uso de reactivos deestabilización actualmente disponibles,como el ARN tardío –Qiagen, Hilden,Alemania–) y su degradación durante lapurificación, además de la necesidad deun modelo animal y otros problemas.

Además de los problema anteriores hayque tener en cuenta también que, a causade la especificidad de la hibridación delADN, pequeñas cantidades de ARN euca-


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riota copurifican y afectan desfavorable-mente a los resultados de los microarrays.Así pues, existen problemas de diversotipo para medir la expresión génica a lolargo del proceso infeccioso, desde la faseinicial de invasión/colonización a la demultiplicación y difusión tisular hasta lafase final de la enfermedad, con daño enel hospedador. Algunos estudios actualespueden proporcionar, a medio plazo, in-formación del modo en que las bacteriasregulan la expresión génica en diferentesfases de la infección.

La primera generación de estudios deaplicación de micromatrices de ADN parael conocimiento de las claves de la pato-génesis bacteriana se centraron en el aná-lisis de la expresión de los genes duranteel crecimiento, en condiciones determi-nadas (in vitro) que reproducían algún as-pecto de la infección. Estos estudios per-

mitieron una descripción detallada de larespuesta bacteriana a las limitaciones deFe (153, 154), limitación de nutrientes(155, 156), ambiente ácido (157), caídade la tensión de oxígeno (158), densidadbacteriana (159) y formación de biofilms.También se han llevado a cabo varios es-tudios para analizar los efectos de los re-guladores transcripcionales, con el objetode definir completamente las redes regu-ladoras (160).

La segunda generación de estudios lle-vados a cabo con microarrays se ha ocu-pado en medir directamente la expresióngénica en la interacción con las células eu-cariotas durante el crecimiento bacterianodentro del hospedador (tabla 1).

En un total de cuatro experimentos publi-cados se comparó el crecimiento in vivocon el crecimiento in vitro en medios delaboratorio. Tres de los estudios analizaron


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Tabla 1. Medición a gran escala de la expresión de genes o proteínas en infeccionesreales o interacciones con células del hospedador.

Especie Tipo de experimento Descripción del estudioCrecimiento in vivo Microarray ADN Crecimiento en membranas deB. burgdorferi Perfil antigénico diálisis implantadas en ratas.

Alteración de la expresión delipoproteínas y del perfilantigénico durante la adaptacióna hospedador, en el ratón.

Id. P. multocida Microarray ADN Expresión de genes durante elcrecimiento en sangre y enhígado de pollos infectados.

Id. V. cholerae Expresión de genes durante elcrecimiento en asa de íleon deconejo y en heces “en agua dearroz”.

Interacción con células Electroforesis en dos Expresión de proteínas duranteen cultivos de tejidos dimensiones el crecimiento en células Hep-2 Chlamydia pneumoniae en respuesta a IFN-γ.Id. N. meningitidis Microarray ADN Interacción con células epiteliales

y endoteliales.


directamente la expresión del genomabacteriano completo durante el creci-miento en los tejidos de un hospedadoreucariota vivo (161-163), mientras que elcuarto analizó la expresión génica en bac-terias recién liberadas de los tejidos delhospedador, en el lumen del intestino.Tres de los estudios llevaron a cabo hibri-daciones competitivas de ARN in vivo e invitro, para comparar directamente la ex-presión génica en dos lugares distintos,mientras que el cuarto estudio comparóla expresión génica de muestras de ambosin vivo e in vitro respecto de una muestrade referencia común (ADN genómico).

A pesar de que los análisis se llevaron acabo sobre diferentes especies de bacte-rias (Vibrio cholerae y Pasteurella multo-cida), se pudieron observar similaridadesen los cuatro experimentos. Todos ellosmostraron sobrerregulación sustancial delos genes implicados en el metabolismode los aminoácidos, biosíntesis de purinasy transporte del Fe. Los genes de los ope-rones ily y pur estaban sobrerregulados ymuchos de los cambios revelaron tambiénsobrerregulación de los genes implicadosen el transporte de aminoácidos y carbohi-dratos. Incluso se observó un gran númerode transportadores ABC también sobrerre-gulados. En cualquier caso, en el ambientein vivo, bien en asa de íleon de conejo, hí-gado o en heces diarreicas (cólera), los nu-trientes disponibles estaban marcada-mente reducidos cuando se comparabancon los del medio in vitro. Aunque los es-tudios corrientes han comparado la expre-sión génica con el crecimiento en mediosricos in vitro, la razón principal para estaaproximación ha sido el deseo de identi-ficar potenciales genes de virulencia, másque los sobrerregulados in vivo, simple-

mente en respuesta al ambiente nutri-cional in vivo. Sin embargo, muchos deestos genes han sido identificados pormutagénesis marcada (STM) como nece-sarios para la supervivencia in vivo (164,165).

Estos estudios demostraron también queun número de genes implicados en el me-tabolismo energético estaban sobrerregu-lados durante el crecimiento in vivo.Específicamente, en cada experimento, al-guno de los genes más sobrerreguladosincluian los que codificaban alternativasparticulares a los complejos aceptores deelectrones. Tanto en el caso de V. cho-lerae, purificado a partir de heces dia-rreicas, como en P. multocida, purificadaa partir de sangre de aves, el operón nap(periplasmic nitrate reductase) estaba al-tamente sobrerregulado. En el caso de V. cholerae cultivado en asa de íleon deconejo, el operón frd (fumarate reduc-tase) estaba sobrerregulado, y en P. mul-tocida, aislado y purificado a partir de hí-gado de pollo, el operón dms (dimetilsulfoxide reductase) estaba, igualmente,sobrerregulado. El complejo aceptor deelectrones terminal más apropiado estágeneralmente determinado por la tensiónde oxígeno y esta difiere entre los distintostejidos in vivo. Incluso el crecimiento de V. cholerae en asa intestinal de conejo y P. multocida en hígado, indican la sobre-rregulación de un número de genes poranaerobiosis. Como antes, estas medidasfueron comparadas con el crecimiento invitro en medios de laboratorio, definiendola anaerobiosis por comparación con elambiente in vitro altamente aeróbico.

Estos experimentos in vivo han demos-trado la variable expresión de factores devirulencia conocidos. En V. cholerae, en el


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que están definidos muchos factores devirulencia, solo se expresan un pequeñonúmero de estos en los microorganismospurificados a partir de la diarrea, inclu-yendo los genes implicados en el metabo-lismo de aminoácidos, metabolismo de laspurinas y respuesta de tolerancia a losácidos. Ninguno de estos genes incluidosen el regulón ToxR/TcpP/ToxT fue identifi-cado como expresado de forma diferen-cial en su nicho hospedador, lo que indicaque estos genes se expresan transitoria-mente y no son necesarios para que labacteria se elimine del hospedador. Sinembargo, un número de genes de viru-lencia se expresaban en las bacteriascuando se cultivaban en el asa ligada deintestino de conejo. Un total de 12 genesde los 300 que se expresaban in vivo for-maban parte del grupo funcional en lapatogénesis, e incluían reguladores de lavirulencia como tcpP, tcpH y toxR, losgenes de la hemolisina y transportadoresde la hemolisina hlyA y hlyB y el gen de laproteasa con actividad hemaglutininahapR. En el caso de P. multocida, una ter-cera parte de los genes identificadoscomo factores de virulencia por STM tam-bién se identificaron como regulados di-ferencialmente durante el crecimiento ensangre de pollo.

En el caso de Borrelia burgdorferi (enfer-medad de Lyme), se han publicado tam-bién varios estudios sobre expresión gé-nica, dos de ellos estudiaron los cambiosen la expresión del genoma completo du-rante el crecimiento en membranas dediálisis implantadas en la cavidad perito-neal de rata (166) y uno más se centró es-pecíficamente en la expresión de lipopro-teínas durante el crecimiento en ratones(167). Los perfiles de expresión génica ob-

servados diferían sustancialmente de losobservados en el caso de P. multocida yV. cholerae cuando crecía en tejidos. Se ob-servaron pocos cambios en los genes im-plicados en el metabolismo energético oen el de los aminoácidos, carbohidratos oen el transporte del hierro, lo que se inter-preta debido a la baja tasa de crecimientoen el ambiente de los mamíferos. Elcambio más notable observado en B. burg-dorferi implicó la expresión de compo-nentes de membrana externa, particular-mente lipoproteínas, por lo que pareceque B. burgdorferi responde primaria-mente a la respuesta innata o adaptativadel sistema inmune o a ambas, resultandoen la subregulación de un gran número decomponentes de superficie, incluyendo al-rededor de 100 lipoproteínas.

En el caso de muchos patógenos hu-manos específicos, no existen modelosanimales bien definidos, por lo que los es-tudios de expresión génica durante las in-fecciones reales son muy complicados oimposibles de realizar. En algunos casosse han llevado a cabo estudios de interac-ción con células, como sucede en el casode N. meningitidis, comparando los resul-tados de expresión sobre células epite-liales o endoteliales respecto de los quese observan en cultivos in vitro, en mediosde cultivo (168).

En definitiva, la comparación de estudiosin vivo con estudios definidos in vitro, per-mite la deconstrucción de los estímulosque actúan en el microambiente repre-sentado por el nicho hospedador. Esta po-sibilidad representa un aspecto prome-tedor de los estudios de expresión génicaque todavía no ha sido completamenteexplorada. En el caso de P. multocida,cuando crece en pollos, el perfil de expre-


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sión de la bacteria en dos de cada tresanimales es similar a los genes que se ob-servan sobrerregulados en condiciones deescasez de hierro in vitro. Tal análisis com-parativo puede ampliar el conocimientode cómo la presión selectiva actúa sobrelos patógenos durante la infección. Dehecho, este primer análisis de P. multocidaindica que al menos en una de las infec-ciones el perfil de expresión de los genesbacterianos difiere del que se observa encondiciones limitantes de hierro, lo quesugiere que una respuesta bacteriana abajas concentraciones de Fe solo se pro-duce en algunos hospedadores o enciertos estadios de la infección (169).

PCR de análisis de genoma completo(WGPScanning)

La PCR de genoma completo (WGPSca-nning –Whole Genome PCR Scanning–)representa otra estrategia para el análisisgenómico desarrollada por Ogura et al.(2006) (170), cuyo principio se basa en di-señar un set de parejas de primers queamplifican segmentos superpuestos consegmentos adyacentes en ambos ex-tremos y que cubren el genoma completode una cepa de referencia secuenciada.Comparando los fragmentos amplificadoscon los del genoma de referencia, puededeterminarse si las regiones diana estánorganizadas en el mismo orden y si lossegmentos entre las regiones diana estánsometidos a cualquier cambio estructuralprincipal, incluyendo deleciones o inser-ciones. Los autores señalados desarro-llaron un set de pares de primers basadosen la secuencia genómica de E. coli 0157,con el fin de determinar la diversidad ge-nómica de este linaje, demostrando suexistencia en grado significativo, a lo que

contribuía la variación de los profagos lo-calizados en las islas genómicas.

Construcción de mutantes isogénicosde genes candidatos de virulencia

Como se ha señalado al principio, paradefinir y verificar el papel de los genes enestudio como potenciales genes de viru-lencia y en consecuencia implicados en elproceso de patogénesis de las enferme-dades con las que se relacionan, se hacenecesaria la construcción de mutantes iso-génicos. Tales mutantes deben ser estu-diados posteriormente, bien en ensayosde virulencia en cultivos celulares o enmodelos animales de la enfermedad o enla enfermedad natural misma, confir-mando de este modo su papel o papelesen la patogénesis.

Genómica comparada para laidentificación de genes de virulencia

Depende de la disponibilidad de genomassecuenciados. Sobre las disponibilidadesde los existentes, se han publicado ya al-gunos estudios que han puesto de mani-fiesto, por ejemplo, interrelaciones posi-tivas entre el contenido de genes y eltamaño del genoma cuando se refieren abacterias, arqueas y eucariotas. Los ge-nomas más pequeños se caracterizaronpor los genes esenciales.

En un estudio en el que se compararonlas secuencias genómicas completas decinco proteobacterias y una cepa no pa-tógena, se concluyó que las cinco bacte-rias patógenas compartían aproximada-mente la mitad de sus genes y que lasvariaciones que se relacionaban con la vi-rulencia incluían genes que codificaban,por ejemplo, para el LPS, flagelos o lipo-proteínas.


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En un futuro es previsible que la informa-ción procedente de la genómica se com-bine con un detallado análisis proteómico(ver después), pues los genes sospechososde virulencia, identificados a partir de lasecuenciación de los genomas, deben serverificados experimentalmente mediantela construcción de mutantes isogénicos,probando las construcciones en modelosanimales apropiados, trabajo en el que seimpone el uso de animales transgénicos yratones knockout, deficientes en la res-puesta inmune innata o en rutas de trans-ducción de señales.

Transcriptómica

La transcriptómica (171) se ocupa del es-tudio y comparación de los transcrip-tomas. Bajo esta denominación se refierenlos conjuntos de ARNm (o transcritos) pre-sentes en una célula, tejido, microorga-nismo u organismo y sus niveles relativos

de expresión en condiciones definidas. Enotras palabras, los transcriptomas refierenel conjunto de genes que se están expre-sando en un momento dado y que cons-tituyen el fenotipo molecular de la célulau organismo de prueba.

Si se toma como referencia cuanto se co-noce acerca de la transcriptómica hu-mana, se ha descrito que solamente el3% de los genes están expresándose enun momento dado, lo que, a primeravista, pudiera hacer pensar que el trans-criptoma es mucho más simple que el ge-noma y, sin embargo, nada más lejos dela realidad, porque el transcriptoma esmucho más amplio que la parte que setranscribe del genoma. La complejidadobedece a la existencia de empalmes al-ternativos del ARN (splicing) y otros cam-bios, de tal modo que cada gen puededar lugar, potencialmente, a muchostranscritos, cada uno de los cuales puede


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Figura 21. Splicing del ARN (http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_splicing).

1st Reaction

2nd Reaction

pre-mRNA

Spliced mRNA

Translation

1st Exon 2nd Exon

Discard

Intron Lariat

Intron


tener un único perfil de expresión. Encasos extremos, donde un gen tiene mu-chos intrones y se somete a un procesa-miento diferencial amplio, potencialmentepuede producir miles o millones de trans-critos distintos.

Pese a su complejidad, nunca se consideraun sistema in vivo completo porque todoslos genes no se expresan simultánea-mente, ni al mismo nivel. Las células o losmicroorganismos (bacterias, hongos, etc.)transcriben un set básico de genes cons-titutivos (housekeeping genes) cuya acti-vidad se requiere siempre para funcioneselementales, pero hay que tener encuenta que otros genes, probablementela mayoría, se expresan solo de forma re-gulada, como parte de un programa dedesarrollo o en respuesta a estímulos ex-ternos, por ejemplo. De igual modo, loseventos postranscripcionales (los em-palmes, por ejemplo) también son pro-cesos regulados.

En una célula en particular, algunosARNm son muy abundantes, otros lo sonde forma moderada y el resto lo son soloraramente. Con el fin de obtener unaperspectiva global de la expresión del ARNen un microorganismo o en una célula,deben cuantificarse todos estos trans-critos al mismo tiempo, lo que requiere eluso de un formato de ensayo que sea ala vez selectivo y sensible. A tal efectoexisten dos alternativas comunes para elanálisis de la expresión del ARN global:por un lado, el muestreo directo de se-cuencias a partir de una fuente de pobla-ciones de ARN o de librerías de ADNc, oa partir de bases de datos de secuenciasderivadas de los mismos o un análisis dehibridación con colecciones de secuenciasde ADN no redundantes inmovilizadas en

un soporte sólido, esto es, microarrays deADN. Aunque este tipo de análisis habi-tualmente se denomina “perfil transcrip-cional”, no supone en realidad la bús-queda del nivel de transcripción sino elnivel de ARNm en estado estacionario,que también tiene en cuenta la tasa derotación del ARN. Además, la mayoría delas técnicas de perfil transcripcional nomiden el nivel de ARN absoluto, sino másbien los niveles comparativos relativosdentro y/o entre muestras.

Los niveles de ARNm en estado estacio-nario pueden cuantificarse directamentemediante el muestreo de secuencias. Losprimeros estudios de expresión génica agran escala implicaron el muestreo de se-cuencias marcadas (EST, ExpressedSequence Tags) a partir de librerías deADNc. Históricamente, el primer estudiode expresión global de genes se basó enla secuenciación a gran escala de clonesde librerías de ADNc (172). Con caráctergeneral, se considera que una librería deADNc que no ha sido “normalizada” esrepresentativa de los ARNm en la pobla-ción fuente utilizada para prepararlo.Algunos ARNm (y los correspondientesADNc) son muy abundantes, en tanto queotros son extremadamente raros. Porejemplo, si se pican 5.000 clones al azara partir de la librería y se obtienen las se-cuencias parciales, los transcritos másabundantes podrían ser más representa-tivos entre las secuencias obtenidas quelos transcritos raros. El análisis estadísticode estos resultados permitiría determinarlos niveles de expresión relativa. Esta es-trategia no es particularmente sensible ydepende de la disponibilidad de datos ESTa partir de fuentes apropiadas. El pro-


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blema principal reside, además, en la grancantidad de secuencias que requiere.

Veculescu et al. (1995) (173) propusieronuna técnica de análisis seriado de la expre-sión génica (SAGE, serial analysis of geneexpression), que implica esencialmente lageneración de EST muy cortos (de 9 a 14nucleótidos) denominados “SAGE tags”(etiquetas de análisis seriado de expresiónde genes), que se unen en largos conca-támeros (en tándem) que son clonados y,después, secuenciados. El tamaño de las“SAGE tags” se acerca al límite menor re-querido para una identificación de genesespecíficos sin ambigüedades. Las “eti-quetas” concatamerizadas son secuen-ciadas y las secuencias se analizan para re-solver la secuencia individual, lo que dauna idea de la abundancia de ARNm.

En comparación con la secuenciación ale-atoria de las librerías de ADNc, SAGE eshasta 50 veces más eficiente, porque cadaconcatámero representa la presencia demuchos ADNc. La ventaja principal, sinembargo, es que los datos obtenidos sonrepresentaciones digitales de los nivelesde expresión absoluta que permiten lacomparación directa entre nuevos experi-mentos y las bases de datos existentes. Elmétodo SAGE descrito originalmente porVeculescu et al. (1997) se muestra en lafigura 22. ARN PolyA+ es transcrito deforma reversa utilizando un primer oligo-dT biotinilado y el ADNc es digerido conuna enzima de restricción (NlaIII) que ledivide intensamente y que reconoce la se-cuencia de 4 pb CATG y de la que es es-perable que le corte cada 250 pb. El ex-tremo 3’ de cada ADNc se captura porafinidad a estreptavidina, lo que da lugara un grupo representativo de extremos deADNc que se pueden utilizar para generar

etiquetas de análisis seriado de expresiónde genes. El grupo se divide después endos subgrupos, cada uno de los cuales sefusiona a un enlazador (linker) diferente.Estos enlazadores o conectores contienensitios de reconocimiento para enzimas derestricción de tipo III, tales como la enzimaFokI, la cual tiene la propiedad inusual decortar fuera del sitio de reconocimiento,en un número específico de bases co-rriente abajo. La división con una enzimade este tipo, por lo tanto, genera la“SAGE tags” unida a parte del enlazador.Las etiquetas (tags) están ligadas “colacon cola” para generar dímeros denomi-nados “ditags” (bi-etiquetas) y entonceses cuando se amplifican por PCR utili-zando los enlazadores como primers. Losproductos de la amplificación se tratancon la enzima de restricción NlaIII, paraeliminar los enlazadores, y los dímeros deetiquetas se concatamerizan. Los conca-támeros se clonan por un procedimientoestándar y los plásmidos resultantes se se-cuencian para revelar la composición delconcatámero (Primrose y Twyman, 2006)(174).

El método SAGE de perfiles de expresión,modificado para reducir la probabilidadde genes indeterminados (ambiguos), seha aplicado a muchos sistemas diferentes.En el contexto de las enfermedades hu-manas se ha utilizado ampliamente, sobretodo en procesos cancerígenos humanos(175, 176). En Microbiología, SAGE se haaplicado para estudiar el transcriptoma delevaduras y dividir el genoma en dominiosfuncionales de expresión. También en elcaso de Plasmodium falciparum, el agentede la malaria, para estudiar el transcrip-toma en diferentes estadios del ciclo bio-lógico (177). En los últimos años, las apli-


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caciones en Sanidad Animal han prolife-rado con rapidez; Miller et al. (2008) (178)estudiaron el efecto del virus del PRRSsobre los macrófagos alveolares porcinos;Nelly et al. (2008) estudiaron los efectosde la infección por el virus de la diarrea ví-rica sobre células endoteliales (179) y Huet al. (2008) (180) llevaron a cabo un es-tudio sobre la adaptación metabólica deCryptococcus neoformans en el curso dela infección pulmonar. En estas fechastambién se propusieron diversas mejorasdel método, como es el caso del RL-SAGE(Robust-Long SAGE) (181), que incre-menta significativamente la eficiencia enel clonaje de concatámeros y el tamañodel inserto.

La tecnología de microarrays de ADN haemergido como un método de elecciónpara el análisis de la expresión de ARN dealto rendimiento, permitiendo el análisisparalelo de miles de genes en un disposi-tivo miniaturizado. En este caso, las ma-trices diana de ADN se prueban por hibri-dación con una sonda compleja, porejemplo, una sonda que comprende mu-chas secuencias diferentes que se pre-paran a partir de una población de ARNprocedente de una célula, una bacteria oun tejido. La composición de la sonda re-fleja la abundancia de transcritos indivi-duales en la población de ARN fuente. Eluso de los microarrays permite la medidasimultánea de los niveles relativos de mu-chos transcritos, aunque una limitaciónimportante reside en que estos disposi-tivos son cerrados y solamente puedenmedirse las secuencias representadas enlos arrays, al contrario de lo que ocurrecon las técnicas de muestreo de secuen-cias, que son sistemas abiertos.

En los análisis de expresión están disponi-bles dos tipos principales de microarraysde ADN, los arrays de “spots” (manchas)de ADN y los “chips” de oligonucleótidosimpresos. En los primeros puede utilizarseun formato sobre nailon o sobre vidrio.

La disponibilidad de set de clones para lafabricación de los arrays de spots no esgrande, pero es suficiente. Tres compañías(Research Genetics, Incyte Genomics yGenosys Biotech) disponen de coleccioneshumanas, de ratón o de rata, y entre losprocariotas se incluyen E. coli y Bacillussubtilis (en ambos casos, colección com-pleta de ORF), además de algunas otrasbacterias (aunque colecciones parciales) ytambién se incluyen Saccharomyces cere-visiae, Candida albicans, Arabidopsis tha-


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Figura 22. Principio del análisis seriado de expresiónde genes (SAGE) (Veculescu et al., 1997, modificadopor Primrose and Twyman, 2006) [Anchoringenzyme (Nla III); Tagging enzyme (Fok I); B Biotin].


liana, Caenorhabditis elegans y Drosophila(Primrose y Twyman, 2006) (tabla 2).

Aunque con alguna discusión, se admiteque los microarrays de spots y los chips,funcionan aproximadamente igual en tér-minos de sensibilidad; en cualquier caso,una importante diferencia entre ambos esque para la fabricación de los chips se re-quiere información previa de secuenciascompletas, mientras que en el caso de losspots pueden generarse utilizando clonesno anotados (anónimos) a partir de libre-rías de ADNc sin caracterizar, pudiendoutilizarse, entonces, para el descubri-miento de genes de novo. La ventaja delos chips es que están diseñados in silico,por ejemplo, utilizando bases de datoscomo fuente de información, lo que su-pone que no es necesario mantener setsde clones físicos de ADN.

En los últimos años se ha producido unincremento exponencial del número deexperimentos publicados basados en losarrays y han surgido aplicaciones extre-madamente diversas que cubren, entreotros, el campo de la clínica y la farmaco-logía.

Como hemos señalado ya en otras oca-siones, la Sanidad Animal cumple, desdeel punto de vista humano dos principiosy aplicaciones fundamentales: por unlado, el estudio e interés que se deriva delconocimiento y control de las enferme-dades compartidas (las zoonosis) en lasque la fuente animal condiciona la enfer-medad humana, bien como consecuenciade que el animal padezca la enfermedado cuando se comporta como un reser-vorio subclínico del agente que la producey, en segundo lugar, cuando conside-ramos las distintas especies animales,

desde los roedores a los primates, pero sinexcluir ninguna otra especie, como mo-delos de estudio, para la obtención de co-nocimientos que después se aplican alhombre. En este último sentido, porejemplo, la tecnología de manipulacióngenética que acabamos de señalar escapaz ahora de diseñar estrategias alter-nativas para crear modelos de enferme-dades específicas, como ciertas formas decáncer producidas en ratón o de enferme-dades producidas por priones, en el casodel hámster o el ratón, por poner simple-mente unos pocos ejemplos. En el casode las enfermedades infecciosas, la tec-nología de las vacunas de ADN (ver des-pués) es otro ejemplo de la utilización deestas técnicas, particularmente intere-sante donde no existen tratamientos con-vencionales o fallan las vacunas tradicio-nales, como sucede con la tuberculosis yotras (en el caso del hombre, sarampión,VIH, Ébola o enfermedades por priones,entre otras).

Las aplicaciones de los perfiles de expre-sión en el campo de la salud han estadohasta ahora dirigidas de forma casi exclu-siva al hospedador humano, tanto paraidentificar perfiles transcripcionales quepermitan la identificación de nuevos mar-cadores de enfermedad (sobre todocáncer, en los que se utilizan, por ejemplo,para la clasificación de tumores) como dela investigación de posibles nuevas drogaspara uso terapéutico. No obstante, lasaplicaciones, tanto en el campo humanocomo veterinario, son muy amplias.

En el campo de la biomedicina veterinaria,se han aplicado estudios de perfiles de ex-presión génica principalmente en el casode los perros, en situaciones de cardio-miopatías, degeneración de la válvula mi-


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tral, dermatitis atópica, atrofia pancreá-tica o enfermedades del sistema nerviosocentral (SNC) (182). Además de las ante-riores, otros procesos como fibrilaciónatrial, fallo cardiaco, enfermedad crónicarenal y miositis, también estudiados me-diante perfiles de expresión, han servidode modelo para las correspondientes en-fermedades humanas (Kort et al., 2009).

En otras especies animales se han utili-zado, por ejemplo, en la mastitis bovinaproducida por S. aureus (183) o en la ar-tritis ósea de los caballos (184). Tambiénse han utilizado en la identificación demarcadores diagnósticos, dianas terapéu-ticas o factores relacionados con la resis-tencia natural en paratuberculosis (185),tripanosomiasis en el ganado bovino(186), salmonelosis (187) y cocidiosis enaves (188), en la anemia infecciosa delsalmón del Atlántico, producido por unisavirus, de la familia Orthomyxoviridae(189), parasitosis de los ovinos por nema-todos gastrointestinales (190), así comoen la respuesta a la vacunación frente adiversos procesos en peces de consumo,como el lenguado o la trucha (septicemiahemorrágica vírica, necrosis hematopoyé-tica infecciosa), o en el ganado bovino. Entodos los casos, los estudios de perfiles deexpresión mejoraron el conocimiento dela biología de las enfermedades y aña-dieron nuevas estrategias de diagnóstico,terapéutica y manejo, que se tradujeronen una mejora de la calidad de vida y su-pervivencia o mayor eficiencia en la pro-ducción, según el caso.

Estudios de proteómica

Si la genómica se ocupa del estudio delgenoma, su expresión conduce a la for-mación del transcriptoma que es el com-

plemento de los ARNm que reflejan losgenes estructurales de un organismo; sinembargo, esto es mucho más complejode lo que parece a simple vista, dado quela transcripción del genoma es sensible auna amplia variedad de factores relacio-nados con el contexto de la célula y su en-torno. En un momento dado, incluso,solo se expresan un subset del total degenes, tanto se trate de una célula indivi-dual (una procariota o una eucariota) oasociada formando tejidos en un hospe-dador. Cuando las condiciones cambientambién cambiará la expresión del trans-criptoma, por lo que el principal factor deconfusión es el tiempo, una dimensiónausente en los estudios genómicos. En laseucariotas puede introducirse otro ele-mento de diversidad representado por los“empalmes”, que pueden producir variosARNm a partir de un gen único. La trans-criptómica (la descripción del transcrip-toma y su expresión), por tanto, es poten-cialmente más compleja que la genómica.

La conversión del transcriptoma en su pro-ducto, esto es en la proteína, produce elcorrespondiente proteoma. El proteomaes el conjunto de proteínas expresadas porun genoma a partir de una célula (proca-riota o eucariota). La proteómica es la des-cripción del proteoma.

Puesto que en las células y organismoscompletos el transcriptoma es depen-diente del tiempo, el proteoma tambiénlo es igualmente, aunque este último sediferencia tanto del genoma como deltranscriptoma porque en los dos primerosla información es esencialmente lineal (se-cuencial), mientras que en el proteomaestá definida tanto por estructuras se-cuenciales como tridimensionales (191).Por otra parte, mientras que la comple-


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jidad del genoma es finita, es decir, quepuede alcanzarse aun cuando se trate delgenoma de eucariotas superiores, la delproteoma es prácticamente infinita (192).

El análisis global de proteínas pone demanifiesto las modificaciones postraduc-cionales, los productos del empalme al-ternativo del ARNm y la degradación se-lectiva de las proteínas, todos los cualesno pueden ser conocidos cuando semiden directamente los niveles de trans-critos del ARNm.

Existen dos estrategias principales, y dife-rentes, de la proteómica para analizar lasmezclas complejas de proteínas. Uno delos métodos lleva a cabo la separación delas proteínas completas por electroforesisbidimensional en gel de policrilamida (2D-PAGE o 2DE) y la subsiguiente identifica-ción de las proteínas individuales me-diante espectrometría de masas (MS),incluyendo MALDI-TOF.

El otro método se suele denominar tec-nología multidimensional de identificaciónde proteínas (MUDPIT) y lleva a cabo la se-paración de los péptidos proteolíticos porcromatografía líquida, y su identificaciónpor espectrometría de masas acoplada entándem a una técnica de ionización suaveasociada a la espectrometría (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization –de-sorción/ionización láser asistida por ma-triz– y TOF por Time-Of-Flight –detectorde iones–) (193, 194), (coupled electros-pray ionization-tandem mass spectro-metry). También pueden utilizarse arrays.

Existen algunos problemas técnicos que li-mitan el alcance de los análisis proteómicos.El análisis del proteoma con electroforesisbidimensional (2-DGE) habitualmente ex-cluye las proteínas de gran tamaño, hidro-

fóbicas, o aquellas que poseen un puntoisoeléctrico extremadamente alcalino. Lasproteínas hidrofóbicas a menudo estánenmascaradas a consecuencia de su inso-lubilidad durante el isoelectroenfoque, losproblemas derivados de la extracción delos péptidos hidrofóbicos a partir de ma-trices en gel y las dificultades de ioniza-ción de este tipo de péptidos (hidrofó-bicos) para el análisis por espectrometríade masas. Las proteínas de gran tamañoo básicas habitualmente no se resuelven,porque no entran en el gradiente del iso-electroenfoque o no permanecen solublesdurante él.

El MUDPIT resuelve muchas de las limita-ciones impuestas por la solubilidad de lasproteínas durante el isoelectroenfoque dela 2-DGE. Sin embargo, los geles en dosdimensiones proporcionan una referenciavisual de la expresión de las proteínas porcomparación, y también permiten ob-servar las modificaciones postraduccio-nales y la escisión de las proteínas, que noresultan evidentes utilizando MUDPIT.Además, MUDPIT no proporciona infor-mación cuantitativa (195). En cualquiercaso, 2-DGE y MUDPIT son tecnologíascomplementarias y para obtener resul-tados óptimos deben usarse ambos sis-temas (196). Sin embargo, al contrario delas estrategias basadas en el ARNm, estastecnologías son incapaces de dilucidar elproteoma completo.

Los arrays representan un conjunto demoléculas que se pueden construir conayuda de robots. Son, en realidad, una ex-tensión de los microarrays de ácidos nu-cleicos o chips, que utilizan ADNc (o losoligonucleótidos correspondientes) deri-vados de una librería que pueden ensa-


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yados con ARNm obtenido a partir de cé-lulas.

Algunos autores consideran que los arraysforman parte de la proteómica (197). Encualquier caso, se utilizan en proteómicapara comparar niveles de transcritos yproteínas y para identificar las interac-ciones proteína-proteína, entre otras uti-lidades. Su valor principal reside en quepermiten conocer los patrones que pue-den estar relacionados con el estímulocausal o la patología de base, lo que tienealgún valor diagnóstico potencial.

Los arrays de proteínas son, sin embargo,mucho más complejos que los microarraysde ácidos nucleicos. Pueden construirseinmovilizando las moléculas de prueba(algunas veces denominadas reactivosanalitos específicos, ASR) o las proteínasde prueba. El procedimiento de unióntambién es muy variable y refleja la grandificultad que existe para unir proteínasnativas y mantener su estructura tridi-mensional a lo largo de los análisis. ASRpuede incluir anticuerpos, péptidos o ap-támeros (198). También se han preparadoarrays de proteínas que reflejen, o casi, elproteoma completo, y pueden utilizarsepara identificar la función, las interac-ciones proteína-proteína, etc. (199).

Es de esperar que los datos obtenidos delos estudios con microarrays correlacionencon los resultados de estudios proteó-micos obtenidos de los mismos sistemas.Sin embargo, en un estudio llevado acabo con levaduras en los que se compa-raron los resultados de la expresión deproteínas (niveles de ARNm) con los ob-tenidos utilizando un análisis seriado dela técnica de expresión génica, se obtuvoun coeficiente de correlación de 0,4, lo

que indicaba que los niveles de expresiónde proteínas correlacionaban escasa-mente con los datos cuantitativos delARNm (200). Cuando se llevó a cabo unestudio más global, en el que se compa-raron los niveles de ARNm obtenidos poranálisis con microarrays con los obtenidoscon niveles de expresión de proteínas uti-lizando una estrategia de MUDPIT/isó-topo-etiqueta de afinidad codificada, seencontró que la expresión de ARNm y elset de proteínas implicadas en algunasrutas biológicas sí que estaban fuerte-mente correlacionadas, al contrario queotras. Este hallazgo sugiere que los meca-nismos de regulación postranscripcionalestán operativos en algunos casos cuandoes escasa la correlación entre los nivelesde expresión proteica y los datos cuanti-tativos de ARNm (201), lo que puede serel resultado de problemas técnicos aso-ciados con la precisión de la medida, biendel ARNm o bien de los niveles de la ex-presión proteica en una escala general(202). No obstante, si los instrumentosutilizados para la medida de los genes yde la expresión de proteínas son exactos,los datos de expresión deberían correla-cionar para los transcritos y las proteínasque conforman las vías biológicas que noestán sujetas a regulación postranscrip-cional o postraduccional.

Aunque el uso de la proteómica para ana-lizar las bacterias patógenas prometeavances importantes, todavía no existeningún ejemplo de un análisis global dela expresión de la proteína de un pató-geno bacteriano en crecimiento dentro desu hospedador natural o en un modeloanimal. Esta situación es consecuencia delos problemas técnicos relacionados conla separación de las bacterias de los te-


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jidos del hospedador y con la obtenciónde suficiente material para llevar a caboun análisis en serie para que tenga signi-ficado estadístico.

Aunque no se han publicado estudios deexpresión de proteínas bacterianas en elinterior del hospedador, varios investiga-dores han analizado la expresión de pro-teínas durante el crecimiento in vitro encondiciones que reproducen algún as-pecto de la infección, incluyendo la res-puesta a los cambios de la temperatura,limitación del Fe disponible y presencia deproteínas del suero (203), falta de nu-trientes, estrés del pH (204), limitación deMg (205) o formación de biofilms (206).Otros estudios han utilizado sistemas decultivo celular para reproducir más estre-chamente el ambiente del hospedador.

Un análisis de la expresión de proteínasde células enteras de Chlamydia pneumo-niae durante el crecimiento en la líneaHEp-2 y en respuesta al tratamiento coninterferón, después del marcado radiac-tivo de las bacterias, puso de manifiestola regulación de un pequeño número deproteínas implicadas en la replicación, me-tabolismo energético y síntesis de pepti-doglicano.

De igual modo, un estudio del perfil anti-génico de B. burgdorferi dio como resul-tado cambios en las proteínas antigénicasexpresadas durante el crecimiento enratón cuando se compararon con los cam-bios acaecidos durante el crecimiento enmedios de laboratorio in vitro. Este aná-lisis permitió la medición semicuantitativade la expresión del antígeno de B. bur-dorgferi en diferentes tejidos del ratón ymostró la expresión diferencial de algunasproteínas de superficie. Sin embargo, el

estudio se queda corto comparado con elestudio de un genoma completo. Cuandose superen los obstáculos técnicos, el aná-lisis de la expresión de las bacterias pató-genas completas creciendo dentro loshospedadores proporcionará claves im-portantes para profundizar en el conoci-miento de los mecanismos de la patogé-nesis bacteriana.

Estudios de la respuesta delhospedador a los agentes patógenos

De igual modo, el conocimiento de labase molecular de la respuesta inmune ala infección es un dato necesario paracomprender los mecanismos implicadosen la génesis de la enfermedad, es decir,en la patogénesis de la misma.

En los últimos años se ha producido grancantidad de información en relación conel uso de microarrays para estudiar las in-teracciones entre el hospedador y unagente patógeno particular, la mayoría delos cuales se refieren al hombre o al ratón,y entre ellos se incluyen estudios sobreBordetella pertussis, Brucella abortus,Coxiella burnetii, E. coli, Salmonella typhy,S. aureus, Y. pestis, M. tuberculosis, L.monocytogenes, Leishmania major,Toxoplasma gondii, o el virus Ébola, entreotros (207, 208).

Es conocido que la inmunidad innata de-sempeña un papel crítico en la respuestadel hospedador a las enfermedades pro-ducidas por microorganismos. Por otraparte, existe el convencimiento, cada vezcon más argumentos, de que la inmu-nidad innata influencia y dirige la inmu-nidad adaptativa. Además de ello, es unhecho comprobado que la activación demuchos de los elementos que intervienenen la respuesta innata están regulados por


337


receptores de reconocimiento de patroneso perfiles (PRR) que reconocen específica-mente puntos estructurales específicos delas moléculas asociadas a los patógenos.Destaca, especialmente, la familia de re-ceptores toll-like (TLR), que reconocenuna amplia variedad de moléculas de bac-terias, hongos y virus (209).

El conocimiento del papel de los TLR en laregulación de la inmunidad innata es crí-tico para la comprensión de la respuesta alos agentes patógenos. En las células delos mamíferos se han descrito hasta 12tipos distintos de TLR (1-13), la mayoríadispuestos en la superficie de las célulaspresentadoras de antígenos (macrófagosy dendríticas, especialmente) y algunos encompartimentos internos. En algunos deellos se desconoce su ligando, mientrasque en el caso de la mayoría son compo-nentes de la superficie de bacterias uhongos. El análisis, mediante microarrays,de la expresión diferencial de genes, des-pués de la exposición de células dendrí-ticas a diferentes patógenos y moléculasasociadas a ellos ha sido una estrategiapráctica eficaz para comprender cómo seproduce la inducción tanto de la res-puesta innata como adaptativa (210).

Tanto los LPS como los dinucleótidos decitosina-guanina (CpG) no metilados enel ADN de las bacterias, se consideranmoléculas asociadas a patógenos que ac-tivan la respuesta innata mediante inte-racciones con TLR4 y TLR9. El LPS activalos monocitos uniéndose a una proteínaespecífica denominada LBP (LPS-bindingprotein) y este complejo se asocia a su vezcon el receptor CD14 que se une en-tonces al TLR4, que inicia una cascada deseñales intracelulares que conducen a larespuesta inflamatoria (211). Los CpG-

ODN (CpG oligodeoxinucleótidos) sinté-ticos pueden utilizarse como ligandos deTLR9 para activar distintos tipos de célulasinmunes, incluyendo células NK, mono-citos, macrófagos, células dendríticas y cé-lulas B. Para identificar las rutas por lasque actúan los TLR, que dan lugar a la ac-tivación de funciones celulares únicas, sehan utilizado microarrays con el fin de de-terminar el perfil de expresión de genesdespués de la estimulación de/con LPS yCpG-ODN, comprobando que la mayoríade los genes que se expresaban de formadiferencial eran únicos para cada estímuloaunque aproximadamente unos 30 genescomunes se sobrerregulaban. En defini-tiva, estos estudios y otros no descritosaquí ponen de manifiesto la utilidad delos microarrays para estudiar las señalescelulares de respuesta a ligandos especí-ficos y para determinar cómo moléculasrelacionadas pueden inducir respuestascelulares diferentes.

Perspectivas futuras en los estudiosde patogénesis de las enfermedades

Es un hecho constatado que la incorpo-ración de la tecnología de los microarraysha revolucionado el análisis de la expre-sión de genes de la totalidad del genomade las células y microorganismos y ha per-mitido la apertura de una puerta del má-ximo interés al conocimiento de la pato-génesis de las enfermedades (212, 213).

Las técnicas tradicionales de hibridaciónen microarrays se basan en la fluores-cencia, pero estos métodos presentan li-mitaciones debido a su baja sensibilidad,una señal de fondo elevada, extinción yfotoblanqueo (214, 215). Actualmenteexisten, sin embargo, técnicas emer-gentes, como la RLS (Resonance Light


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Scattering, resonancia de dispersión deluz), que están ganando en popularidadtanto en aplicaciones clínicas como en in-vestigación de detección con microarraysdebido a su mayor sensibilidad. La RLS esmás sensible que la fluorescencia, pro-duce mejor señal, no fotoblanquea (conlo que los arrays pueden ser escaneadosrepetidamente) y no necesita intercambiode colorantes, por lo que desde todos losaspectos, y en particular cuando la can-tidad de ARN es limitada o escasa, resultauna opción muy interesante (Wilson et al.,2005).

Aunque está fuera de duda que los micro-arrays representan una tecnología impor-tantísima para el estudio de la expresiónde genes en el curso de la patogénesis delas enfermedades, la calidad de estos aná-lisis depende en gran medida de la ano-tación precisa, interpretación correcta ycalidad de las sondas utilizadas. La ano-tación debe incluir tanto la valoración dela especificidad de una determinada se-cuencia de la sonda para un transcriptodado (para detectar casos de hibridacióncruzada) como de la alta calidad de la in-

formación referida a los transcriptosmismos. Esta anotación es crítica parapoder extraer datos biológicos significa-tivos a partir de la medida de la intensidadde la señal en los microarrays. Es previsibleque el desarrollo progresivo y continuadode la bioinformática mejore las anota-ciones de los microarrays combinados,con nuevos datos de instrumentos deanálisis que sean capaces de llevar a cabocomparaciones cruzadas.

Epidemiología. Aplicacionesde las nuevas tecnologías enla identificación microbiana yen Epidemiología Molecular

Introducción

El progreso de la Epidemiología dependeen buena parte, de los avances en los mé-todos epidemiológicos y la búsqueda deinformación y conocimientos a través dela investigación. Tanto en un caso comoen otro, las nuevas tecnologías poseenuna importancia extraordinaria.


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Figura 23. Respuesta innata y adaptativa. Intervención de TLR y NOD frente a distintos ligandos (LPS y GpG).http://epidemiologiamolecular.com/25/09/2010/defensa-innata-frente-a-patogenos-infecciosos/; http://ge-nemol.org/genemol/pictures/TRL-04.html; http://www.invivogen.com/review-tlr9.


¿Cómo podríamos entender en la actua-lidad la emergencia de un brote de unaenfermedad infecciosa sin la ayuda del or-denador, sin la colaboración de Internet osin los avances de la Epidemiología gené-tica o molecular, en suma, sin la Biotec-nología? (216). A primera vista, al menos,parece difícil, si no imposible.

Internet, por ejemplo, ha demostrado susposibilidades como medio de comunica-ción en tiempo real, sin precedentes, sinbarreras de espacio ni de tiempo. En la ac-tualidad, el tono del dial de radio se hasustituido por el “tono web” (217). Hoylos datos sobre la presencia o difusión delas enfermedades infecciosas pueden sertransmitidos y, en mayor medida, lo seránen un próximo futuro a una velocidad su-perior, a través de líneas telefónicas, porcable o fibra óptica, por satélite, a travésdel espectro de radio (inalámbrico) y, po-siblemente, la red eléctrica. Los datos y elsoftware serán almacenados en granjasde servidores y gestionados de forma pro-fesional por los proveedores de serviciosde aplicación. Con la creciente capacidadpara captar, transmitir, almacenar y recu-perar datos, surgirá la necesidad de ana-lizarlos y transformarlos en informaciónútil. La combinación de información pro-cedente de varias fuentes crea la base deconocimiento necesaria para la toma dedecisiones (Bernardo, 2000).

Al principio nos hemos referido al compli-cado entramado de factores que condi-cionan la emergencia y reemergencia delas enfermedades infecciosas, entre losque se incluyen factores humanos, ani-males, del medio ambiente y factores de-pendientes de la propia evolución de lapatogenicidad de los microorganismos,agentes etiológicos de aquellas. La inte-

rrelación, por ejemplo, entre los animalessalvajes y los domésticos y el hombre fa-cilita constantemente el tránsito de micro-organismos de unas especies a otras, conla particularidad de que un hospedadorvirgen, si es susceptible, puede ser elorigen de un brote explosivo, difícil decontrolar.

Otros factores, como el comercio nacionaly sobre todo internacional de animales,productos de origen animal, etc., repre-sentan siempre un elemento de riesgo. Engeneral, el movimiento de los animalesdomésticos y salvajes es un factor muy im-portante de difusión de enfermedades.Los ejemplos de difusión de enferme-dades que han estado relacionados conmovimientos internacionales de ganadodoméstico o fauna salvaje son numerosos.El conocimiento del volumen de estosmovimientos y los riesgos asociados aellos constituyen elementos fundamen-tales en el estudio de la epidemiología delas enfermedades infecciosas de los ani-males, algunas de las cuales son impor-tantes zoonosis. El comercio mundial deanimales, tanto legal como, sobre todo,clandestino, igual que el de productos deorigen animal, es un factor epidemioló-gico de primer orden y la vigilancia epide-miológica tiene en estos asuntos un retode control permanente, difícil de cumplir,para el que necesita de herramientas cadavez más precisas y sofisticadas y la cola-boración de diferentes tipos de profesio-nales.

La transmisión de los agentes de las en-fermedades entre animales y su control esun concepto clave en la epidemiología delas enfermedades infecciosas, igual que loes definir y prevenir los tipos de contactoque conducen a la primera transmisión.


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En el ganado doméstico y en otros tiposde animales, los movimientos puedenestar sometidos a legislaciones que man-tienen controles estrictos, existiendo porello la oportunidad (que no se da de igualmodo en el caso del hombre) de reducirla transmisión de las enfermedades. LaOIE (www.oie.int) se justifica en sí mismapor esta razón, y todo su trabajo, desdesu nacimiento hasta la fecha, ha estadomuy relacionado con el conocimiento y ladifusión de las enfermedades infecciosasde los animales, y en todo ello, el movi-miento es centro neurálgico. Desde su na-cimiento, la OIE ha adquirido en estecampo una solvencia extraordiaria y susrecomendaciones son aplicadas, casi sinexcepción, por todos los países adheridos,en la confianza de reducir los riesgos. Pordesgracia y pese a todo, los brotes de en-fermedades siguen produciendose deforma regular como resultado de los mo-vimientos de los animales, tanto legalescomo ilegales (218).

El comercio internacional de animales do-mésticos y salvajes, como el de los pro-ductos de origen animal es de una grancomplejidad, además de que se presentaen escalas diferentes (219). Por otra parte,con excepciones, no existen normas im-perativas para el control de estos movi-mientos y todavía la mayor parte de lostratados se basan en acuerdos bilateralesentre países; sin embargo, los países queson miembros de la Organización Mun-dial del Comercio (OMC) están obligadosa cumplir los acuerdos sanitarios y fitosa-nitarios que incluyen disposiciones rela-tivas a la seguridad alimentaria, sanidadanimal y sanidad vegetal (220). Ya noshemos referido a la OIE, indicando quesus recomendaciones internacionales en

materia de sanidad animal y zoonosis,igual que sus declaraciones relativas a loscódigos de salud de los animales terres-tres y acuáticos, son referencia interna-cional, promoviendo la seguridad sanitariadel comercio internacional de los animalesterrestres y sus productos en normas ymedidas de salud que son utilizadas encada país por las autoridades veterinariascompetentes. De ahí, precisamente, la im-portancia de una buena infraestructuraveterinaria para minimizar los riesgos dedifusión de los agentes patógenos y suscorrespondientes enfermedades (221).

El volumen del comercio internacional deanimales es de una magnitud impresio-nante. Tomando simplemente nuestro paíscomo referencia, en 2008, en el capítulode animales vivos y productos de origenanimal se importaron 3,3 milones de Tm,por un valor estimado de 5.407 millonesde euros, siendo las exportaciones muy si-milares (3,2 millones de Tm, por un valorde 5.949 millones de euros) (222). A nivelmundial, la FAO (www.fao.org) reconocela imposibilidad de disponer de una cifrasiquiera aproximada de este comercio,pues numerosos países carecen de datos.En relación con enfermedades como lafiebre aftosa, la tuberculosis bovina o latripanosomiasis, los mercados desem-peñan un importante papel en la disemi-nación de los microorganismos, sirven decontacto entre enfermos y sanos y faci-litan el transporte, permitiendo la disemi-nación de la enfermedad a través de losanimales cuando regresan a los establos.

En relación con los animales salvajes, la si-tuación es aún más complicada e igual-mente de valores económicos extraordina-rios, aunque en este caso las transaccionesilegales o clandestinas tienen un peso


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mayor; por ejemplo, se ha estimado quecada año son objeto de comercio alre-dedor de 40.000 primates, 4 millones deaves, 640.000 reptiles y 350 millones depeces tropicales (223). En estas condi-ciones, a pesar del reconocimiento de losriesgos de transmisión de enfermedadesasociadas a ellos y las regulaciones decada país, lo cierto es que continuamentesiguen apareciendo enfermedades nuevascomo resultado directo o indirecto de estecomercio. Buenos ejemplos de estas hansido el SARS (síndrome respiratorio agudograve) y la influenza aviar por el virusH5N1, que, como otras muchas, man-tienen sus hospedadores reservorios enfauna salvaje.

Como en el caso de los animales domés-ticos, el papel de los mercados se ha re-velado en estos casos de gran importanciaal poner en contacto enfermos y sanos, yestos últimos, en periodo de incubación ysin síntomas ni evidencia de su coloniza-ción por los agentes patógenos, los dise-minan a su vuelta, especialmente en elcaso de los no vendidos.

En la actualidad, además, ha surgido otrofactor al que se está imputando impor-tante responsabilidad en la emergencia ydifusión de enfermedades infecciosas. Elcambio climático está modificando con-diciones ambientales que hacen posiblela persistencia de vectores de agentes pa-tógenos que años atrás estaban limitadospor la temperatura, la humedad y otroscondicionantes. Uno de los mejores ejem-plos a nuestro alcance está representadopor la lengua azul, cuyo vector ha alcan-zado, como consecuencia del aumento detemperatura, latitudes nunca antes cono-cidas, difundiendo la enfermedad en lospaíses europeos. Otro tanto sucede tam-

bién en el caso de la encefalitis del NiloOccidental, ya comentado. Desde la des-cripción, por primera vez en Holanda en2006, del serotipo 8 del virus de la lenguaazul, se produjo su difusión en el norte deEuropa, afectando a más de 57.000 ex-plotaciones en 2007 (con decenas demiles de animales muertos) y más de33.000 en 2008. En los años siguientesmás serotipos llegaron al norte de Europa(serotipos 1, 11 y 16).

Se impone pues, como elemento críticopara el control de las enfermedades, es-pecialmente las que hemos denominadoemergentes o reemergentes, la concu-rrencia del método epidemiológico, asen-tado en bases científicas, para evitar suuso indebido como barreras artificiales alcomercio. De este modo, pues, las me-didas sanitarias se apoyan en dos ele-mentos clave: la vigilancia y el análisis deriesgo. En uno y otro la aportación de lasnuevas tecnologías, principalmente mo-leculares, sobre todos los elementos queconcurren en la emergencia (agentes,hospedadores y ambiente) es inexcusable.

En el caso de la Epidemiología humana,D. Raoult (2009) (224) apuesta, para lospróximos años, por el desarrollo de tresdirecciones principales en la investigaciónepidemiológica, en las que no está ajenala Medicina Veterinaria en general y laSanidad Animal en particular. Por un lado,señala la necesidad de identificar lascausas de los dos motivos principales demortalidad humana en la actualidad, lasenfermedades digestivas y respiratorias, alas que define como las grandes descono-cidas, especulando con un posible origenmicrobiano, por el momento no estable-cido, para lo que reclama el desarrollo ymejora de nuevos métodos que permitan


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la identificación y caracterización rápida yextensa de los mismos. A este respecto re-fiere la utilidad de los métodos múltiples(multiplexing) de detección e identifica-ción.

En relación con las enfermedades respira-torias, en los últimos años se están iden-tificando un número creciente de agentespatógenos como responsables etiológicosde las mismas (Metapneumovirus, Coro-navirus, etc.), aunque en la mayoría de loscasos su implicación es incierta, igual quesucede en el caso de las enfermedadesgastroentéricas (Norovirus, etc.), entreotros motivos porque todavía no seacierta a comprender el significado epide-miológico de etiologías tan complejas,tanto en los casos de neumonía, como degastroenteritis. En unas y otras, por ejem-plo, el conocimiento actual de las rutas detransmisión es todavía muy incompleto, yde ello deriva la falta de estrategias pre-ventivas y otros métodos de control,como sucede en los casos de gripe. En lospróximos años, un objetivo a lograr serádeterminar las condiciones que permitandetener la transmisión interhumana oanimal-humano de estos procesos.

En segundo lugar, se refiere a la posibleimplicación de los agentes infecciosos enlas enfermedades crónicas y cáncer, comoya ocurriera en el caso de H. pylori y su re-lación con la úlcera gastroduodenal y pos-terior evolución a cáncer de estómago,descubrimiento que valió a Marshall yWarren el Premio Nobel de Medicina de2006 y que se puede hacer extensivo alcaso del virus del papiloma humano, re-lacionado también con el cáncer de cuellouterino, para el que ya se está utilizandoen la actualidad una vacuna.

Por último, en lo que se refiere a la epide-miología de las enfermedades infecciosas,el próximo desafío será, en opinión deeste autor, relacionar la obesidad y la mi-crobiota intestinal, un hecho para el quese están produciendo interesantes apor-taciones, en las que se implican las varia-ciones de la microbiota intestinal de losanimales productores de alimentos comoconsecuencia del uso indiscriminado deantibióticos, tanto con carácter preventivoo terapéutico como en razón de su uti-lidad como promotores de crecimiento,circunstancia, como es sabido, ya prohi-bida.

Extrapolando estos objetivos al campo dela Sanidad Animal, la conclusión nopuede ser otra que la de que quedamucho trabajo por recorrer, en el quenuevamente la Microbiología Moleculardebe venir en auxilio de las necesidadesde conocimiento señaladas antes y que,al menos en principio, en los animales yen el hombre, se debe trabajar en desen-trañar las complejas etiologías de estoscuadros clínicos múltiples en los que seentremezclan signos y etiologías.

Identificación y caracterizaciónmicrobianas. Epidemiología Molecular

En la vigilancia epidemiológica, tanto lacapacidad de detección como la disponi-bilidad de métodos capaces de diferenciarcon rapidez y rigor entre aislados es esen-cial. En los últimos 30 años, los avancesde la Biología Molecular han permitido re-definir y, en algún caso, reorientar laforma de investigar las interrelacionesentre patógenos y hospedadores suscep-tibles. De hecho, las innovaciones deri-vadas del conocimiento, cada vez mayor,del material genético de los microorga-


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nismos (ADN y ARN) están proporcio-nando la base para el desarrollo de mu-chos instrumentos utilizados en la mo-derna Epidemiología, lo que ha permitidodesde 1982, la introducción del conceptode Epidemiología Molecular (225).

La Epidemiología Molecular permite ex-plorar los mecanismos que gobiernan lasinterrelaciones entre patógenos y hospe-dadores. Desde la culminación del pro-yecto del Genoma Humano y el comienzodel Proyecto del Epigenoma, los instru-mentos disponibles para el estudio de lasenfermedades todavía se han ampliadomás, proporcionando a los modernos epi-demiólogos moleculares técnicas basadasen nuevos datos de laboratorio que in-cluyen técnicas epigenéticas y ómicas (ge-nómica, proteómica, metabolómica, etc.),que ofrecen nuevas oportunidades paraprofundizar en los componentes querigen la dinámica de las enfermedades, asícomo para hacer frente al desafío que su-pone obtener el máximo rendimiento de-rivado de su utilización en las investiga-ciones epidemiológicas actuales. Enmuchos aspectos, el aprendizaje necesariopara incorporar las tecnologías emer-gentes disponibles hoy es muy similar a laforma en que lo hicieron los epidemió-logos cuando incorporaron los biomarca-dores moleculares a la investigación epi-demiológica tradicional (226).

En lo que se refiere a los agentes pató-genos, productores de enfermedades in-fecciosas, el análisis filogenético de las se-cuencias genómicas amplificadas brindainformación inédita sobre ellos y su evo-lución, y resulta muy útil para llevar acabo estudios de caracterización genotí-pica y epidemiología molecular.

La evidencia de que a lo largo de la escalaevolutiva se han producido intercambiosde ADN entre microorganismos muy di-versos, principalmente por transferenciahorizontal de genes, fragmentos genó-micos e islas genómicas y de patogeni-cidad, está permitiendo redefinir el con-cepto actual del mundo microbiano, asícomo su clasificación y sistemática, almenos en el sentido de cómo se venía re-alizando hasta ahora.

Desde un punto de vista exclusivamentepráctico, en términos epidemiológicos, elproceso de tipificación es importante.Permite reconocer los brotes de infección,la detección de transmisión cruzada de pa-tógenos, la detección de fuentes de infec-ción o el reconocimiento de cepas viru-lentas de una especie particular. Endefinitiva, es la base de la vigilancia epide-miológica; sobre sus resultados se adop-tan decisiones, se modifican criterios o sesuspenden medidas adoptadas sobredatos poco sólidos.

Los métodos de tipificación tienen interésen el estudio de la difusión y dinámica delas poblaciones microbianas, tanto debacterias como de otros tipos de microor-ganismos, tanto en la clínica como en va-lores ambientales, a niveles que van desdeun simple hospedador a un ecosistemaglobal. Hasta la fecha, los métodos quese describen a continuación han sido apli-cados a los organismos y microorga-nismos haploides, pero se está manifes-tando un interés creciente para latipificación de organismos (y microorga-nismos) diploides, incluyendo levaduras,hongos y parásitos.

Definitivamente, la Biología Molecular yla Biotecnología han desplazado en los úl-


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timos años las técnicas tradicionales de ti-pificación microbiana mediante el estudiode rasgos fenotípicos (227) y, como se haseñalado antes, esto no debe ser otracosa que el comienzo de una larga carrerapor perfilar cada vez con más precisión lascausas que se sitúan en el origen de lasinfecciones, con todas sus variantes.

Métodos fenotípicos de identificacióny tipificación microbianas

Los métodos de identificación y tipifica-ción de microorganismos han rendido enel pasado reciente servicios del máximointerés en Microbiología, Parasitología yEpidemiología. Un breve recorrido por losmismos se resume a continuación:

Fenotípicamente pueden valorarse datoscomo la morfología de las colonias, elcolor, el olor y numerosos detalles micros-cópicos, pero la mayoría de los métodosfenotípicos se basan en datos que re-quieren una observación especializadaque pueda documentarse; por ejemplo,la capacidad de crecimiento en presenciade determinadas sustancias (metabolitos,sensibilidad o resistencia a drogas, a to-xinas o a bacteriófagos) o la expresión demoléculas específicas (antígenos, enzimas,etc.).

Comoquiera que sea, todos los métodosrequieren una estandarización estricta,dada la posibilidad de cambio de losrasgos de interés, en función de modifi-caciones en las condiciones ambientalesen las que se lleva a cabo la prueba. Se in-cluye, por ejemplo, el biotipado, que sebasa en las características bioquímicasque ofrecen excelentes resultados de ti-pabilidad, pero su poder discriminatorioes variable, siendo necesario para optimi-zarlas seleccionar un gran número de ca-

racterísticas. Existen arrays de reaccionesfenotípicas útiles de modo complemen-tario a tecnologías de ADN y proteómica.La tipificación basada en la susceptibilidada los antibióticos (antibiotipia), bien me-diante un sencillo antibiograma o bienmediante procedimientos de más profun-didad (cálculo de la concentración mínimainhibitoria 90 o 50%, CMI90-50%), seaplica más o menos habitualmente, enfunción de la necesidad clínica, a muchasespecies; en este caso, la discriminacióndepende de la diversidad, de la estabilidady de la prevalencia relativa de los meca-nismos de resistencia adquiridos por losaislados en estudio. En cualquier caso, pa-trones de sensibilidad semejantes puedenser debidos a un proceso de evoluciónconvergente.

El serotipado ha sido, tradicionalmente, elmétodo fenotípico más importante de ti-pificación microbiana, con la particula-ridad de que, prácticamente, fue el pri-mero o uno de los primeros en aplicarse;por ejemplo, en el caso de las enterobac-terias, como las salmonelas o E. coli, elmétodo o esquema de Kauffmann-Whiteha sido una referencia internacional queha servido para identificar y agrupar estasespecies en función de los antígenos so-mático, flagelar y capsular, mediante el usode anticuerpos (policlonales, y ahora tam-bién monoclonales). La calidad de los an-ticuerpos y el tipo de antígeno proporcionaproblemas en la tipificación en función dela presencia de reacciones cruzadas y,además, algunas cepas no son tipificables,por lo que resulta de gran importancia laestandarización del método de prueba.Puede mejorarse la discriminación combi-nando el serotipado con electroforesis engel (SDS-PAGE) en el western-blotting (in-


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munoblotting) (228). Algunos esquemasde serotipado tradicionales se están reem-plazando progresivamente por equiva-lentes genotípicos, como sucede en elcaso de Clostridium botulinum (229) yotros.

La tipificación mediante el uso de fagos(fagotipia), igual que en el caso de lasbacteriocinas (bacteriocinotipia), permitela obtención de un patrón lítico del micro-organismo de prueba cuando se exponea la acción de virus bacterianos específicoso la actividad bactericida de las bacterio-cinas. Ambos métodos, sin embargo, sereducen a la aplicación a unas pocas es-pecies, además de que los tipos puedencambiar a lo largo del tiempo, con lo quela capacidad de discriminación es variable,la tipabilidad es parcial y la reproducibi-lidad escasa. Además, se requieren con-troles de calidad continuos de los fagos,experiencia y tiempo.

La electroforesis en geles de poliacrila-mida (SDS-PAGE) de componentes celu-lares y extracelulares puede proporcionaralta capacidad discriminatoria, con bue-nas aplicaciones en la tipificación bacte-riana (230), aunque desde la introducciónde los métodos basados en el ADN en ladécada de los años 90, su uso se ha redu-cido de forma sustancial. En el caso de laelectroforesis de enzimas multilocus(MLEE), se identifican variantes electrofo-réticas de un set de enzimas constitutivas(housekeeping) codificadas por diferentesalelos del mismo gen, lo que da lugar apequeñas variaciones, pero detectables,en el tamaño y la carga eléctrica de la pro-teína (231). MLEE ha sido utilizada comométodo de referencia para definir la es-tructura filogenética de linajes clonales enpoblaciones bacterianas y, aunque no es

un sistema ni rápido, ni utilizado amplia-mente, ha sido muy importante en la con-figuración de la biología de las poblacionesbacterianas ambientales. Su continuaciónmolecular (MLST, ver después) es muchomás práctico y, consecuentemente, muchomás utilizada en la actualidad.

La espectrometría de masas (MS) es unatécnica desarrollada originalmente para laidentificación de moléculas, principalmenteorgánicas, de bajo peso molecular en mez-clas complejas (232). En la actualidad seutiliza para caracterizar mezclas de macro-moléculas biológicas complejas mediantela caracterización de sus productos de de-gradación específicos. La técnica de desor-ción/ionización láser asistida por matriz,con ionización suave (Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization-Time-Of-Flight), co-nocida por sus siglas en inglés MALDI-TOF,permite el análisis de biomoléculas (biopo-límeros como las proteínas, los péptidos ylos azúcares) y moléculas orgánicas gran-des (como los polímeros, los dendrímerosy otras macromoléculas) que tienden a ha-cerse frágiles y fragmentarse cuando sonionizadas por métodos más convencio-nales, con lo que permite el análisis dehuellas moleculares de microorganismoscompletos (233). El procedimiento utilizaun láser que evapora el material biológicoque después es sometido a un campoeléctrico intenso. Los pequeños iones semueven a alta velocidad y alcanzan un de-tector antes que los más grandes y las se-ñales que se generan se registran y danlugar a espectros complejos, característicosdel contenido molecular de una bacteria.Cuando se comparan informáticamente,pueden diferenciarse tipos bacterianos(234). También se puede utilizar para el


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análisis de moléculas menos complejas,como sucede con el ADN.

También se han comercializado con éxitootros métodos espectroscópicos y croma-tográficos y pueden proporcionar plata-formas útiles para determinados formatosde identificación bacteriana, como es elcaso de la cromatografía líquido-gas (GLC,que es utilizada en el sistema MIDI deidentificación bacteriana) y otras. Otrosmétodos de fundamento físico para laidentificación bacteriana incluyen, porejemplo, el mapeo óptico de moléculasde ADN, que permite visualizar frag-mentos reales de ADN de gran tamaño,que puede ser utilizado para compararbacterias utilizando una sola molécula deADN genómico (235).

Finalmente, algunas estrategias “ómicas”completan el moderno espectro del feno-tipado. La proteómica describe, de formacolectiva, los métodos utilizados para des-cifrar el contenido proteico de una bac-teria. Este rango de tecnologías de elec-troforesis inteligentes, de alto rendimiento,automatizadas, facilita la secuenciación delas proteínas basadas en la espectrometríade masas.

Métodos de detección, identificacióny tipificación genotípica

Se basan en la variación de los genomasde los aislados bacterianos respecto de sucomposición, estructura (por ejemplo,perfiles de endonucleasas de restricción,número y posiciones de elementos repe-titivos, etc.) o secuencia de nucleótidos(de uno o más genes, o de regiones inter-génicas). El análisis de la base genética deeventos moleculares tales como la adqui-sición, multiplicación, mutación, delecióno inserción de nucleótidos o genes, aso-

ciada con los patrones de variación, es laestrategia preferida para evaluar las inte-rrelaciones entre cepas, pero, en general,no es siempre necesaria ni tampoco fac-tible (236).

En la actualidad se dispone de una ampliavariedad de métodos genotípicos para ladetección, identificación y caracterizaciónde los microorganismos, todos los cualesse basan en la detección y estudio demarcadores genéticos.

Marcadores genéticos de interés enla identificación y caracterizaciónmicrobiana

Los sistemas de identificación y tipifica-ción moleculares representan una de lasaportaciones de la Microbiología que másdifusión ha alcanzado en los últimos años.Comprenden una amplia variedad de téc-nicas y métodos que comparan la compo-sición de los ácidos nucleicos de dos omás microorganismos de prueba, lo quepermite reconocer la posible relaciónentre aislados, hecho que posee gran in-terés desde el punto de vista epidemioló-gico. Igualmente, estas tecnologías debenser capaces de diferenciar entre aisla-mientos no relacionados, independiente-mente de su pertenencia a la misma es-pecie, género o familia.

En el genoma de los microorganismos,como en el de las células eucariotas queforman parte de los tejidos de los seressuperiores, existen determinadas regioneso secuencias hipervariables (también de-nominadas secuencias anónimas, locianónimos, loci polimórficos, marcadoresanónimos o polimórficos, polimorfismos,etc.), de gran interés desde el punto devista que nos ocupa, pues permiten uti-


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lizar la información genética con fines deidentificación y discriminación. Tales se-cuencias se concentran principalmente enregiones no codificantes (intrones) y sedistribuyen en el genoma de forma máso menos aleatoria, y su característica sin-gular es que son polimórficas, razón porla que también reciben el nombre de po-limorfismos o secuencias polimórficas.

Las técnicas que estudian los polimor-fismos genéticos de los microorganismoshan permitido un avance extraordinarioen el campo de la tipificación microbiana.La mayor ventaja de estos métodos radicaen la estabilidad de los marcadores gené-ticos utilizados y en la posibilidad de apli-carlos universalmente a especies o gé-neros de bacterias, no solamente para laidentificación, caracterización y tipifica-ción, sino también en otros campos deutilidad, algunos de los cuales ya hemosestudiado (patogénesis) y, en cualquiercaso, permiten su aplicación a estudiosepidemiológicos (detección de focos,brotes y epidemias, identificación de re-servorios, mecanismos de transmisión,evolución genética microbiana, diseño demedidas de control, etc.).

En todos los casos, el objetivo es definirla relación existente, clonal o no, entre elgrupo de aislamientos de prueba. Un clono grupo clonal, en este caso, hace refe-rencia a la relación existente entre variosaislados o un grupo de los mismos quedescienden de un ancestro común, estoes, forman parte de la misma cadena dereplicación y transmisión y poseen unnivel de similitud entre sus genotipos y fe-notipos, significativamente superior al deaislados de la misma especie, no relacio-nados.

Los métodos moleculares aplicados al es-tudio epidemiológico pueden incluir dife-rentes opciones, como el análisis de plás-midos, el estudio de los fragmentos derestricción y detección de secuencias es-pecíficas, la macrorrestricción, la amplifi-cación de secuencias por PCR, el análisisdel ADN por secuenciación, el perfil de hi-bridación de múltiples secuencias, etc. Lamacrorrestricción del ADN incluye la téc-nica PFGE (ver después), muy versátil,entre las más utilizadas, que permite co-nocer la clonalidad de diferentes aisladosen situaciones de brotes epidémicos contiempo y espacio definido. Las técnicas dePCR son más rápidas, con idénticas ven-tajas, mientras que los estudios de se-cuenciación permiten el análisis degrandes grupos clonales y se reservanpara la comparación de aislados de dife-rentes áreas geográficas y su evolución enel tiempo (237).

La eficacia de un determinado marcadormolecular está en relación con factorescomo la tipabilidad (la proporción, sobreel total, de cepas tipables), la reproduci-bilidad (repetición con el mismo resultadoen varios ensayos diferentes; debe ser> 0,95), la estabilidad (capacidad para re-conocer la relación clonal entre cepas queproceden de un precursor común, pese ala variación esperable debido a la disemi-nación, almacenamiento o reproducciónen el laboratorio) y el poder discriminativo[probabilidad promedio de que un mar-cador clasifique en dos tipos distintos ados aislados no relacionados, obtenidosaleatoriamente; se cuantifica con el índicede diversidad de Simpson: ID=1-1/N (N-1)Σs

j = 1nj (nj - 1), donde N es el número de

cepas, S son el número de tipos distintos


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y nj son el número de cepas pertene-cientes al tipo J].

El análisis de ADN extracromosómico in-cluye el perfil plasmídico, muy utilizadoen epidemiología humana hace algunosaños, pero ahora en desuso a favor deotros procedimientos de mayor sensibi-lidad y eficacia, y el de otros elementos detransmisión horizontal (ETH) o elementostransponibles, que incluyen secuencias deinserción (IS) y transposones, además delos fagos transponibles. En la actualidad,el interés de los ETH se reserva para estu-dios de epidemiología molecular relacio-nados con la resistencia a antibióticos, unaspecto de gran interés común de laSanidad Animal y la Salud Pública.

El análisis del ácido nucleico (ADN) me-diante la restricción e hibridación se apro-vecha de la particularidad de los microor-ganismos que, para proteger su genomade la contaminación con ADN exógeno,han desarrollado un sistema de protec-ción basado en la disponibilidad de en-zimas que reconocen una secuencia espe-cífica de nucleótidos de tan solo 4 a 8pares de bases (secuencia de restricción),cortando la molécula en ese punto. Al di-gerir una molécula de ADN con una en-zima de restricción se obtiene un númerode fragmentos equivalente al número deveces que se encuentra repetido el lugarde restricción, del número de pares debases del mismo y de la proporción rela-tiva de los nucleótidos ATGC del lugar derestricción en relación con la del ADN di-gerido. Por otra parte, el tamaño traducela separación entre dos lugares de restric-ción contiguos; cualquier cambio (muta-ción o recombinación, por ejemplo) enuno de estos lugares hace que la enzimano lo reconozca y se traduce en una va-

riación del perfil de fragmentos de restric-ción, circunstancia que es la responsabledel polimorfismo existente entre las dis-tintas cepas de prueba en un hipotéticoestudio de un foco o un brote epidémico.

Métodos basados en la hibridación

Para la hibridación con sondas se han uti-lizado sondas clonadas al azar o comple-mentarias de un gen o de una secuenciade inserción. En cualquier caso, este tipode sondas para la detección de genes devirulencia o regiones flanqueantes sonpoco discriminativas, aunque la presenciade elementos repetitivos (como las IS) dalugar a diversidad y, por ejemplo, en elcaso de M. tuberculosis es una de laspocas técnicas capaces de diferenciarentre cepas. En todos los métodos, elADN inmovilizado para ser investigado esprobado con moléculas de ADN que sonselectivas y reconocen algunos patronesy otros no. Las tecnologías disponiblesvarían ampliamente, pero la original fuedesarrollada por Southern (1975) (238).Se han desarrollado sistemas de este tipoadaptados a la identificación y tipifica-ción de muchas especies, como S. au-reus, Clostridium difficile y otras. Estametodología puede utilizarse tambiénpara la tipificación del ADN ampliado porPCR, como sucede en el caso del “spoli-gotyping” en M. tuberculosis (239), queincluye la amplificación de un locus queincluye repeticiones en tandem con al-guna variación en las secuencias internas.Estas variantes se identifican por hibrida-ción utilizando sondas de ADN de frag-mentos específicos repetidos. La técnicase ha utilizado para otras especies deMycobacterium, incluyendo M. bovis yotras (240).


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El ribotipado es una variante clásica de lahibridación de Southern que estima el nú-mero de loci génicos y su posición en elcromosoma. Es reproducible y aplicable amicroorganismos de crecimiento rápido,aunque su capacidad de discriminación esmoderada, más bajo que el de la PFGE(ver después), sin embargo, puede tenermuchas aplicaciones, tanto taxonómicascomo epidemiológicas. Los genes que co-difican para el ARNr y su disposición des-pués del promotor (5’-16S-23S-5S-3’),aunque están muy conservados, man-tienen una región espaciadora que codi-fica para ARNt y secuencias repetidas, porlo que el operón permite ser reconocidopor una sonda universal y, a la vez, que segeneren polimorfismos de restricción, al-gunos de los cuales son específicos de es-pecie y otros permiten discriminar a nivelinfraespecífico. La técnica se ha automa-tizado (Riboprinter) lo que a la vez quepermite la estandarización, facilita la cre-ación de bases de datos.

El análisis genómico por hibridación me-diante microarray se basa en las posibili-dades tecnológicas de inmovilizar hastavarios cientos de miles de sondas de ADNpor centímetro cuadrado en una matrizsólida, como ya hemos señalado en otrasocasiones. En la actualidad se han desa-rrollado microarrays para la mayoría de losmicroorganismos de interés clínico enMedicina Humana, aunque la situación enSanidad Animal no es ciertamente lamisma, que se basan en la disponibilidadde secuencias genómicas y que cubrentodos los genes identificados. Las sondaspueden ser productos de PCR de tamañodefinido, aunque se utilizan más frecuen-temente oligonucleótidos sintéticos. Estasplataformas facilitan la identificación y ti-

pificación bacteriana con un detalle sinprecedentes hasta ahora. Una compara-ción reciente sobre los genomas de cepasde la misma especie ha mostrado la exis-tencia de una considerable variacióndentro de la especie, razón por la que seha acuñado el término pangenoma paradefinir el genoma acumulativo deducidode las secuencias individuales (241).

Métodos de análisis basados en elanálisis de fragmentos del genoma

Debe considerarse, en primer lugar, la si-tuación que hace referencia al estudio defragmentos genómicos independientesdel cromosoma bacteriano (microbiano),como es el caso de los plásmidos.

La tipificación por plásmidos (plasmi-dotipia) evalúa el número, tamaño y per-files de digestión después de la electrofo-resis en geles de agarosa de los plásmidosde las bacterias de prueba. La capacidadde tipabilidad y discriminación de este re-curso es variable, dependiendo de la es-pecie de que se trate (242), siendo alta laespecificidad y moderada la reproducibi-lidad. Por otra parte, se han descrito difi-cultades añadidas, relacionadas con pa-trones múltiples. En resumen, la falta deestabilidad de los plásmidos no pareceque haga de esta opción la mejor para se-leccionarla como marcador clonal, almenos tal como se desprende de algunosestudios, como los referidos en el caso deS. enterica o en S. aureus (243), aunquepuede combinarse con otros métodos detipificación genómica y, como habitual-mente se hace, con estudios de suscepti-bilidad antimicrobiana.

Polimorfismos. Cuando se utilizan en-zimas de restricción de baja frecuencia decorte (es decir, que poseen lugares de res-


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tricción raros o escasos a lo largo de lamolécula de ADN) se produce la divisióno fragmentación del genoma en unospocos fragmentos (entre 10 y 30), lo quesupone un tipo de macrorrestricción.Entre los métodos de estudio de los poli-morfismos de longitud de los fragmentosde restricción (RFLP), el análisis por endo-nucleasas de restricción (REA) fue el pri-mero en utilizarse ampliamente.

Habitualmente el cromosoma bacterianoes digerido por las enzimas de restricciónproduciendo cortes que dan lugar a va-rios cientos de pequeños fragmentos quedespués se separan por electroforesis ho-rizontal en gel (SDS-PAGE) (244), en pa-trones complejos que producen compli-cadas interrelaciones y enmascaran yconfunden el intercambio de datos entrelaboratorios. Para simplificar los datos ob-tenidos por este procedimiento se aña-dieron sucesivas fases de Southern blot ehibridación. En este sentido, el ribotipado,al que nos hemos referido antes, es unmétodo que acopla la digestión del ge-noma mediante una endonucleasa de res-tricción que proporciona una “frecuenciade corte” con una secuencia de recono-cimiento de 4 pb y una hibridación conuna sonda complementaria de ADNr.Algunas de las sondas de restricción utili-zadas con este fin están restringidas a unaespecie simple, como sucede con laIS6110 de M. tuberculosis (245).

El PFGE (Pulsed-field gel-electropho-resis) es una nueva técnica de electrofo-resis que hace posible separar grandesfragmentos de macrorrestricción del ADNgenómico en geles de agarosa mediantela alternancia periódica del ángulo de di-rección de un campo eléctrico. Estos frag-mentos de macrorrestricción del ADN se

generan con endonucleasas de restriccióncon seis o más sitios de reconocimientode pb (“cortes raros”). Ordinariamente seobtienen menos de 30 fragmentos deentre 20 y 800 kb.

En la actualidad, esta técnica es conside-rada el “gold standard” de los métodos detipificación molecular (246). La PFGE poseeuna importante capacidad discriminatoriay reproducibilidad y ha sido un procedi-miento muy aplicado para la tipificacióncomparada de casi todas las especies bac-terianas, aunque en la última década otrosmétodos han ganado también terreno. LaPFGE, por ejemplo, se ha aplicado en losúltimos años a la tipificación de numerososagentes de interés en Salud Pública ySanidad Animal (M. tuberculosis, C. jejuni,C. coli, Yersinia pseudotuberculosis,Streptococcus suis, F. tularensis, Salmonellaenterica Enteritidis y Typhimurium, E. coli,Leptospira monocytogenes, Listeria spp,Enterococcus faecium, S. aureus, Dichelo-bacter nodosus, Treponema phagenedis,Klebsiella pneumoniae, Shigella dysente-riae, Streptococcus pneumoniae, Clostri-dium perfringens, Shigella dysenteriae,Neisseria meningitidis, Mannheimia hae-molytica, Bartonella henselae, M. tubercu-losis, M. avium, etc. (247-255). Se puedenconseguir niveles aceptables de reproduci-bilidad interlaboratorios, lo que ha permi-tido en algunos casos la creación y mante-nimiento de bases de datos internacionales.El sistema, sin embargo, resulta caro, tieneun consumo de tiempo de alrededor de 4días y se necesitan equipos costosos.

La PFGE se ha aplicado con frecuencia enestudios epidemiológicos en Bacteriología.Se obtienen patrones de restricción senci-llos, que representa el ADN cromosómicobacteriano distribuido en unas pocas


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bandas, con movilidades electroforéticasdiferentes. Se puede digitalizar para el aná-lisis de las bandas, que se ejecuta con unsoftware disponible comercialmente. LaPFGE es altamente discriminatoria en la ti-pificación y caracterización de muchas es-pecies bacterianas y excelente reproducibi-lidad, aunque en el caso de Salmonellaenterica, Pseudomonas aeruginosa, E. coli,Clostridium difficile y otros existen incon-venientes derivados, entre otras razones,de la degradación del ADN cromosómico,y resultan no tipables o carecen de sufi-ciente capacidad de discriminación.Tampoco detectan cambios puntuales engenes ni permiten la observación detalladade ciertos elementos como plásmidos,transposones, IS, etc.

La PCR y métodos derivados. La PCR es,en general, una alternativa menos costosaque las técnicas anteriores, pero tambiénmenos resolutiva que aquellas. La PCRpermite que determinados loci genéticossean amplificados e investigados a la bús-queda de variaciones características deuna cepa en particular o entre cepas uti-lizables tanto en la tipificación como conpropósitos epidemiológicos.

Por lo general se reconocen tres tipos ogrupos de variantes de la PCR utilizablescon estos fines. En primer lugar, las queutilizan primers arbitrarios o con cierta es-pecificidad, con los que amplifican re-giones situadas entre dos primers adya-centes separados por una distanciainferior a la máxima que puede amplificarla Taq polimerasa. Así se obtienen pa-trones de amplificación que están consti-tuidos por un número variable de bandas.En segundo lugar, las variantes en las queantes o después de la amplificación porPCR se somete el genoma o el amplicón

a la acción de enzimas de restricción y, fi-nalmente, en tercer lugar, las variantesque amplifican por PCR regiones internasde ciertos genes y después secuencian.

En el primer grupo, sin digestión con en-zimas de restricción, se lleva a cabo la am-plificación de los fragmentos genómicosflanqueados por una o dos secuencias deoligonucleótidos utilizadas como primers.Se diferencian los métodos de amplifica-ción múltiple arbitraria (utilizan primersarbitrarios, que no van dirigidos a ningunaregión específica), como la AP-PCR(Arbitrary Primed-PCR) o RAPD-PCR(Random Amplified Polymorphic DNA)(que permiten amplificar regiones que selocalizan entre dos primers consecutivos)y los de amplificación múltiple definida,que utilizan primers de secuencias repe-tidas, cortas (< 200 pb), situadas a lolargo del genoma, como REP-PCR(Repetitive Extragenic Palindromic), ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive IntragenicConsensus), ARNt-PCR, Box-PCR, IS-PCR… En todas ellas, la reproducibilidades baja y la interpretación de las diferen-cias entre bandas en ocasiones es compli-cada. Por otra parte, son procedimientosflexibles, técnicamente simples, no soncomplicados en lo que a disponibilidad deequipos y reactivos se refiere y son rá-pidos. En conjunto, estos métodos cons-tituyen la denominada “huella genéticade PCR” (PCR fingerprinting) y no sonmuy aceptados para intercambio de datosentre laboratorios (256).

Los RAPD-PCR se basan en la utilizaciónde pequeños primers, de apenas 10 pb,cuya secuencia es inespecífica, no diri-giéndose hacia un locus genético deter-minado sino que, a bajas temperaturas dealineamiento, híbrida al azar (arbitraria-


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mente) en ciertos sitios cromosómicos consuficiente afinidad para permitir la inicia-ción de la polimerización, con lo que lapresencia de tales lugares en dos puntosconcretos de las cadenas complementa-rias de ADN, en direcciones opuestas unaa la otra, permite la amplificación delfragmento entre estos dos puntos. El nú-mero de tales localizaciones de dospuntos varía según la cepa, por lo quesirve para la tipificación de cualquier mi-croorganismo y presenta un alto poder dediscriminación, aunque posee baja repro-ducibilidad y es de difícil interpretación.

La REP-PCR se basa en la presencia de se-cuencias repetitivas, que están presentesen casi todas las bacterias y que puedenser utilizadas como secuencias consensopara la hibridación de primers que inicianla amplificación en estos sitios. Estas se-cuencias se localizan habitualmente envarios sitios del genoma bacteriano, ycuando dos secuencias se localizan pró-ximas una de otra, puede amplificarse laregión flanqueada. Para este efecto sehan utilizado principalmente secuenciasrepetitivas extragénicas palindrómicas,que se han identificado en muchos miem-bros de la familia Enterobacteriaceae(ERIC-PCR).

La misma estrategia se ha utilizado tam-bién con otras secuencias repetitivas,como es el caso de las secuencias de in-serción (IS), secuencias ribosomales y se-cuencias Shine Dalgarno (el sitio de fija-ción del ribosoma). El método, que hamostrado buena reproducibilidad y bajocoste y complejidad, tiene un poder dis-criminatorio que depende de la secuenciarepetitiva analizada.

En general, las técnicas de tipificación ba-sadas en la secuenciación del ADN se hanvisto favorecidas por la aparición de tec-nologías de secuenciación automática.

En el segundo grupo se incluyen variantesde PCR con digestión posterior con en-zimas de restricción y comparación de losfragmentos por RFLP (RestrictionFragment Length Polimorphisms; polimor-fismos de restricción de los fragmentos delongitud). En una primera fase se ampli-fican los loci con primers específicos y seanalizan por RFLP, visualizando por elec-troforesis. El inconveniente de estos aná-lisis reside en la limitada región del ge-noma que puede ser examinada, lo queproporciona un poder de discriminaciónmenor que en el PFGE.

Si la digestión con enzimas de restricciónse lleva a cabo antes de la amplificación,pueden utilizarse métodos que amplificanlas secuencias flanqueantes a los lugaresde restricción (IRS, baja frecuencia decorte) o el estudio de los polimorfismosde longitud de los fragmentos de restric-ción amplificados (AFLP, alta frecuencia decorte).

La AFLP (Amplification FragmentLength Polymorphism) es un marcadormolecular basado en la PCR, en el que secombinan dos estrategias diferentes: porun lado, la digestión del ADN con en-zimas de restricción y, por otro, la ampli-ficación selectiva por PCR. Utiliza adapta-dores que reparan los fragmentos de ADNprocedentes de la digestión, con una am-plificación posterior mediante primerscomplementarios de la secuencia deaquellos. En el caso de las bacterias(porque el sistema se describió y se utilizaen sistemas eucariotas, más complejos) se


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han desarrollado variantes que solo uti-lizan una digestión inicial y una resoluciónfinal en geles de agarosa. En el caso de al-gunas especies bacterianas se han orga-nizado bases de datos y evaluado la re-producibilidad ínter-laboratorios, en M.tuberculosis, Legionella pneumophila, E.coli, F. tularensis, B. anthracis, Y. pestis,Burkholderia mallei, B. abortus y mico-plasmas aviares (258-262).

El análisis Multilocus Variable (MLVA)se ha aplicado a repeticiones en tándem(Multilocus Variable Number TandemRepeat) (VNTR). Es también un método detipificación basado en la PCR que apro-vecha la variabilidad inherente encontradaen muchas regiones de ADN repetitivo. ElADN repetitivo se copia incorrectamentecon frecuencia, en muchas especies bac-terianas, como consecuencia de un malemparejamiento de la cadena, por desli-zamiento, lo que da lugar a un acorta-miento o alargamiento de la región de re-peticiones debido a la deleción o inserciónde unidades repetidas. Este tipo de varia-ciones del ADN puede evaluarse simple-mente llevando a cabo una PCR queabarca repeticiones y determinando lalongitud del producto. En el caso de re-peticiones de grandes unidades, el sis-tema de análisis puede ser simple me-diante electroforesis en gel, pero enrepeticiones cortas o más cortas se re-quieren tipos de electroforesis más com-plejos.

En el diagnóstico genético se utilizan dostipos de VNTR, los denominados VNTR-minisatélites y los VNTR-microsatélites(también denominados STR –ShortTandem Repeats–). Cada uno de estos locio segmentos de ADN polimórfico consti-tuye un marcador genético, y la principal

diferencia entre ambos reside en la lon-gitud (o tamaño) total del segmento deADN, que a su vez viene determinada porel número de nucleótidos de la unidad derepetición que lo componen. Un VNTR-minisatélite puede oscilar entre 500 y10.000 nucleótidos, mientras que unVNTR-microsatélite oscila entre 2 y 500nucleótidos. Los diferentes alelos de unVNTR se diferencian por su tamaño, queen realidad viene determinado por el nú-mero total de repeticiones en tándem. LosVNTR-microsatélites son por excelencia lospolimorfismos utilizados en el diagnósticogenético y corresponden a la repeticiónen tándem de secuencias entre 2 y 5 nu-cleótidos.

La combinación de varios loci VNTR en unensayo (Multiple-locus Variant-repeatAssay, MLVA) ha demostrado en varias es-pecies bacterianas que genera perfiles es-pecíficos de cepa que pueden ser compa-rados, intercambiados y reproducidos endiferentes laboratorios. La técnica ha sidoutilizada con éxito para la tipificación deun número creciente de especies bacte-rianas (263).

Los VNTR se utilizaron, por primera vez,para identificar en M. tuberculosis las de-nominadas Mycobacterial InterspersedRepeat Units (MIRU), unidades repetidasintercaladas. En la actualidad, los VNTR sehan aplicado a la identificación y tipifica-ción de otros muchos microorganismos,como Bacillus anthracis, Legionella pneu-mophila, Pseudomonas aeruginosa,Salmonella enterica o Escherichia coli0157 (264) y, recientemente, también, enFrancisella tularensis (265).

Finalmente, entre las técnicas basadas enla amplificación de locus específicos se in-


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cluyen, por ejemplo, la región espaciadora16S-23S del locus rRNA (RS-PCR,Ribosoma Spacer PCR), que presenta múl-tiples polimorfismos en secuencia y lon-gitud, los cuales, una vez amplificadoscon primers específicos, generan patronesde bandas propios de cada clon de cepasidénticas.

En tercer término, se situan métodos quellevan a cabo la secuenciación de los am-plicones obtenidos por PCR. En este casopuede llevarse a cabo la amplificación devarios loci genéticos (Multilocus).

La MLST (Multilocus Sequence Typing)es una técnica desarrollada y diseñada paraidentificar clones a partir de poblacionesbacterianas. Es un marcador molecular deaplicación en epidemiología que ha sido uti-lizado en Medicina Humana para la carac-terización de brotes, estudio de reinfec-ciones, fallos terapéuticos, etc. El métodose basa, inicialmente, en el MLEE(Multilocus Enzyme Electrophoresis), al queya nos hemos referido antes, análisis de iso-enzimas, en el que se estudia la movilidadelectroforética de un grupo de enzimas me-tabólicas (entre 15 y 20) en geles de polia-crilamida, relacionando las movilidades conlas variaciones en el gen que codifica paracada enzima, confirmando un perfil que de-fine el tipo electroforético (266). MLEE midede forma indirecta el polimorfismo gené-tico, mientras que MLST lo hace directa-mente, pues el análisis se basa en la se-cuencia de ADN de fragmentos internos degenes constitutivos (housekeeping) que co-difican para enzimas metabólicas. El sistemapermite detectar variaciones neutras, quedefinen líneas clonales relativamente esta-bles.

MLST se basa en la amplificación y se-cuenciación del material genético, y en elcaso de algunos microorganismos se hapodido adaptar al estudio directo demuestras biológicas, sin necesidad de cul-tivo.

Una variante de la MLST que no requieresecuenciación y que consiste en la ampli-ficación inicial de los mismos fragmentosque se utilizan en esta, utilizando losmismos primers, es la MLRT (MultilocusRestriction Type), en la que los fragmentosson digeridos después con enzimas derestricción y resueltos por electroforesis engeles de agarosa. Se ha considerado deutilidad en Medicina Humana, en el casode ondas epidémicas.

La MLST también se ha acoplado al usode micromatrices (microarrays) (267) me-diante el diseño de sondas a partir de losalelos conocidos de los fragmentos selec-cionados en los siete genes housekee-ping, las cuales después se inmovilizan enla matriz.

MLST está indicada para el seguimientoepidemiológico de clones bacterianos (ode líneas clonales), permitiendo establecerel proceso de dispersión del microorga-nismo, identificando con precisión gruposde hospedadores específicos, con inde-pendencia de variaciones que afecten alespacio o al tiempo (epidemiologíaglobal). Permite identificar líneas clonaleshipervirulentas de un patógeno concreto,prediciendo la llegada de ondas epidé-micas. También se ha utilizado para el se-guimiento de resistencias antibióticas.

El polimorfismo de un solo nucleótido, SNP(Single Nucleotide Polymorphism) es unavariacion en la secuencia del genoma deADN que afecta solo a una base nitroge-


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nada (A, T, C o G). Algunos autores se re-fieren también con igual denominación a“polimorfismo de nucléotido simple” yaceptan en ello cambios en unos pocos nu-cleótidos, incluyendo inserciones y dele-ciones que deben afectar al menos a un1% de la población (por debajo se consi-dera mutación puntual). En esencia, MLSTes también un metodo de genotipado SNP,aunque solo se aplica a especies heterogé-neas genéticamente en las que muchosSNP están localizados dentro del gen.

La SLST (Single-Locus Sequence Typing)es una denominación muy general queacoge una amplia variedad de métodos enlos que la secuenciacion de un locus gené-tico simple ha mostrado que proporcionaresultados válidos para la tipificación. Elanálisis de un locus simple hace que la can-tidad de ADN a secuenciar sea limitada,por lo que es imperativo seleccionar se-cuencias génicas que sean altamente va-riables. Un ejemplo de un esquema SLSTes el que corresponde a la tipificación deStr. pyogenes (268).

Los microarrays, solos o combinados conMLST, como hemos visto, también repre-sentan una opción alternativa, aunque li-mitada (269), en el campo de laEpidemiología Molecular (solamente se hadescrito su uso en el caso del estudio de laevolución de M. tuberculosis con micro-arrays que contienen la totalidad del ge-noma del microorganismo). No obstante,algunos autores justifican su uso en el casodel seguimiento de cepas microbianas anivel internacional.

Secuenciación de genomas

La secuenciación de genomas, en sus di-ferentes opciones, permite “leer” el có-

digo genético de un microorganismo,cualquiera que sea su carácter. La secuen-ciación permite identificar nuevos pató-genos, caracterizarles, establecer su rela-ción con la aparición de casos, brotes yepidemias y la identificación de patronesque determinan la resistencia frente a an-timicrobianos (particularmente antibió-ticos), incluyendo también antivirales. Lasecuenciación ha permitido conocer el ge-noma completo de numerosos microor-ganismos, representando después unaventana abierta para el estudio de la pre-sencia de genes relacionados con factoresde virulencia, el estudio de sus interac-ciones con los hospedadores susceptiblesy el desarrollo de métodos diagnósticos yde fármacos y vacunas.

Aplicaciones de laBiotecnología al desarrollode vacunas. Vacunología

Introducción

La vacunación ha sido durante siglos,desde su descubrimiento aplicando losprincipios de la variolización de Jenner(270), un poderoso instrumento (en al-gunos casos el único) en la lucha contra lasenfermedades infecciosas, de los animalesy el hombre. En Medicina Veterinaria, lasvacunas han representado un valiosísimopapel en el desarrollo de la ganadería mo-derna, permitiendo el control frente a en-fermedades producidas por bacterias y,sobre todo, por virus, en los que, como esconocido, los antibióticos carecen deefecto. En el mundo de los animales sal-vajes los éxitos logrados, por ejemplo, me-diante la vacunación de zorros frente a larabia en Europa, han permitido práctica-


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mente lograr su erradicación entre la faunasilvestre y con ello salvado de la enfer-medad a otros animales domésticos y alhombre.

Desde hace apenas 20-30 años, losnuevos descubrimientos ligados a laMicrobiología, Biología Molecular y laInmunología han impulsado nuevasformas de entender esta ciencia, cam-biando progresivamente los métodos ori-ginales de los primeros especialistas, par-ticularmente Pasteur y otros, hace ya másde 100 años. A ello han contribuido tam-bién conocimientos nuevos acerca de lapatogénesis de las infecciones, datos pro-cedentes del conocimiento del genoma,tanto de los agentes patógenos como delos hospedadores animales, nuevos sis-temas de preparación de antígenos y undesarrollo importante de los adyuvantesde inmunidad, que exaltan y modulan lainmunogenicidad de los primeros.

En su conjunto se puede afirmar, comosucede en el campo del diagnóstico, quela Biotecnología está propiciando contri-buciones muy trascendentes, abriendonuevas vías para la fabricación de va-cunas, incluyendo nuevos métodos deatenuación, sistemas de marcaje genético,definición y uso particular de fraccionesmicrobianas o moléculas purificadas comodianas vacunales, uso directo del ADNcomo inmunógeno, nuevas estrategiaspara la mejor presentación del antígenoal sistema inmune, etc., además de otrasherramientas de distinto tipo, todo ellocon el propósito de lograr una inmuniza-ción más segura y eficaz contra las enfer-medades infecciosas, tanto en el caso delos animales como del hombre. En la ac-tualidad, en la práctica, se dispone deproductos que son utilizables de forma

compatible en programas de erradicación,en las políticas de comercio internacional,así como en los balances coste-beneficioen los esquemas de producción animal, ytodo ello respetando los principios de se-guridad más rigurosos y exigentes.

La Biotecnología proporciona los mediospara desarrollar instrumentos nuevos y máseficaces destinados al control y la erradica-ción de las enfermedades, naturales o pro-vocadas. Los últimos avances del desarrollode vacunas mediante la IngenieríaGenética, particularmente en lo que se re-fiere a las vacunas recombinantes, son muyprometedores. Las autorizaciones oficiales,sin embargo, tropiezan en algunos paísescon el temor a los riesgos, debido, por logeneral, a la ignorancia o a una comunica-ción insuficiente sobre las bases científicasde su desarrollo. Las primeras vacunas re-combinantes fueron introducidas en lapráctica a finales de los años 80 para elcontrol de la enfermedad de Aujeszky (va-cuna marcada) y la rabia, en este caso, enanimales salvajes (271).

En cualquier caso, debe precisarse que loscriterios que condicionan el éxito de lasvacunas veterinarias (en Sanidad Animal,principalmente) pueden ser muy distintosa los que rigen la vacunología humana,dependiendo del grupo o tipo de ani-males que se considere, pues mientrasque en el caso de los animales de com-pañía los criterios son aproximadamentelos mismos que los de las vacunas hu-manas, primando el concepto de indi-viduo enfermo, en el caso de los animalesde renta, la línea de intervención funda-mental seguida por la industria en todassus fases es el balance coste/beneficio, ysu destino poblaciones muy numerosasde animales de forma simultánea, en pro-


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gramas de vacunación sistemáticos y muyajustados. En el caso de las zoonosis e in-fecciones transmitidas por alimentos, elobjetivo principal es la eliminación delriesgo para el consumidor (y en algunoscasos mejorar la productividad). Por úl-timo, la vacunación de los animales sal-vajes solamente mantiene una considera-ción secundaria, ligada a la posibletransmisión de enfermedades al hombre(por ejemplo, el caso de la rabia), aunqueen los últimos años está siendo objeto deinterés creciente, en relación con otrosmotivos, incluyendo razones ecológicas,de diversidad o epidemiológicas, o en laconcienciación, cada vez más importante,del papel que estos animales representanen el origen de infecciones (y zoonosis)emergentes. En esta última poblaciónanimal resulta de especial importanciacuanto se refiere a la forma de adminis-tración, principalmente mediante el usode cebos vacunales (vacunas orales).

Los dos factores clave del éxito de la in-dustria de la Sanidad Animal incluyen eltiempo necesario para la comercializacióny el coste derivado del desarrollo. Tantoen el que se refiere a vacunas como a fár-macos terapéuticos, se han puesto de ma-nifiesto inconvenientes derivados de loselevados costes de desarrollo y el de sudistribución y comercialización. La OIE haprestado su apoyo a la estrategia de“Cooperación Internacional para laArmonización de los Requisitos Técnicosrelativos al Registro de MedicamentosVeterinarios”, un programa trilateral fir-mado por los EE.UU., Japón y la UE. Estaúltima, por su parte, ha reconocido la ne-cesidad de revisar y mejorar los procedi-mientos de control en todos sus países

miembros, en lo que se está trabajando(272).

Situación actual

Las vacunas veterinarias suponen aproxi-madamente el 23% del mercado globalde la industria de Sanidad Animal, conuna tendencia creciente debido sobretodo a los nuevos avanc es tecnológicosen el desarrollo de vacunas, la crecientedescripción de resistencias frente a los an-tibióticos y otros antimicrobianos y a laconstante emergencia de enfermedadesnuevas, unido a la reemergencia de otrasque se consideraban controladas. Apartede la mejora en salud y productividad, enel caso de los animales a los que van diri-gidas, las vacunas veterinarias poseen unimpacto significativo en términos de SaludPública, toda vez que su uso reduce el defármacos y hormonas, así como el de loscorrespondientes residuos en la cadenaalimentaria, aspecto este, de gran interésactual, como es conocido. Las vacunastambién contribuyen al bienestar animaly su uso está favorecido por todas las or-ganizaciones internacionales de defensade los animales.

El valor de las vacunas en la lucha contralas enfermedades infecciosas del hombre ylos animales es una cuestión de reconoci-miento unánime. En el diseño de una va-cuna eficaz, la elección del antígeno cons-tituye el elemento central. El antígenoelegido, que puede ser un microorganismocompleto inactivado o atenuado o unamezcla de varias cepas bacterianas, porejemplo, o de proteínas aisladas y purifi-cadas, o glicoproteínas y carbohidratos, oproteínas recombinantes y glicoproteínas,que de todas estas posibilidades y aún másse dispone para la preparación del producto


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vacunal, debe estimular una respuesta in-mune específica y de memoria, aunque enla actualidad se sabe también de la impor-tancia que posee el estímulo de la inmu-nidad innata, pues juega un importatísimopapel en relación con la adaptativa, con laque está intimamente relacionada (figura24) (273). Para la selección del antígeno,particularmente cuando es posible elegirentre varias opciones, por ejemplo, en elcaso de las bacterias patógenas, y para supresentación a las células competentes delsistema inmune, deben considerarse nume-rosas cuestiones desde su estructura ter-ciaria, a su tamaño, complejidad molecular,composición química, etc.

En la actualidad, la mayor parte de las va-cunas autorizadas destinadas a los ani-males, tanto en el caso de enfermedadesproducidas por bacterias como por virus,son vacunas vivas, atenuadas, o vacunasmuertas o inactivadas. Las primeras sonmuy eficientes en el propósito de estimularuna inmunidad de larga duración basadatanto en la respuesta inmune humoralcomo celular; sin embargo, este tipo de

productos presenta un riesgo potencialpara los animales gestantes e inmunode-primidos en general, además de su poten-cial capacidad de revertir a la forma viru-lenta. Las vacunas inactivadas carecen deinfectividad y, desde ese punto de vista, ca-recen del riesgo de las primeras, aunque sucapacidad de inducir una respuesta in-mune eficaz es mucho menor, especial-mente en lo que se refiere a la respuestade base celular y, en conjunto, son menosinmunógenas que las vacunas vivas.

La inmunidad adquirida como conse-cuencia del padecimiento de la enfer-medad natural puede adoptar diferentesformas, dependiendo del tipo de pató-geno (bacterias, virus, hongos, parásitos,etc.), y las vacunas pueden ser utilizadaspara prevenir los signos clínicos de la en-fermedad, después de la infección, o paraayudar al control, eliminar o incluso erra-dicar una infección a nivel de poblacionesanimales. Tanto la eficacia como el meca-nismo de acción de las vacunas puede va-riar, dependiendo del resultado requerido.


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Figura 24. La respuesta innata y adaptativa. http://people.eku.edu/ritchisong/301notes4b.html.


Las autoridades competentes, tanto en elcaso humano como veterinario, vienen re-quiriendo de forma sistemática a las in-dustrias dedicadas a la producción de va-cunas, a definir de forma específica losantígenos protectores y a producir va-cunas libres de toxinas asociadas a la pre-sencia de patógenos y de componentesinmunosupresores (274) representandotodo ello un reto muy importante para laCiencia Veterinaria de la Sanidad Animaly las industrias que la desarrollan.

Vacunas convencionales

A lo largo del siglo pasado y aún en elpresente se han venido utilizando en laprevención de enfermedades bacterianasy víricas en Sanidad Animal, diferentestipos de vacunas vivas atenuadas e inac-tivadas (bacterinas), como hemos seña-lado. En el caso de las primeras, la ate-nuación se obtuvo de forma espontánea,como un hallazgo científico, las más delas veces, en el que se desconocía la na-turaleza de la atenuación y aún así per-manece en la mayor parte de los casos,con escasos esfuerzos por lograr su carac-terización desde el punto de vista gené-tico. Se obtuvieron cepas atenuadas que,en ocasiones, inducían niveles de protec-ción buenos y en otras no tanto, razónque sigue estimulando por parte de loscientíficos su mejora. Las bacterinas re-sultan de la inactivación de una o más es-pecies o serotipos de bacterias o virus, porlo general mediante el empleo de mé-todos físicos (calor) o químicos (formol,por ejemplo) o la acción combinada deambos, unidas a adyuvantes de inmu-nidad, por ejemplo, hidróxido de alu-minio.

Muchas de estas vacunas resultaron en lapráctica muy eficaces y a ellas se debengrandes éxitos en el control de enferme-dades infecciosas animales.

Vacunas bacterianas

Pese a los avances tecnológicos queserán descritos en los apartados si-guientes, todavía siguen llegando al mer-cado vacunas vivas atenuadas, de bacte-rias, de las que se desconocen muchosaspectos relacionados con la caracteriza-ción genética de la atenuación, el meca-nismo de patogénesis y de respuesta in-mune de la enfermedad en cuestión.Una vacuna frente a la ileítis porcina pro-ducida por Lawsonia intracellularis es unbuen ejemplo, pues refiere el uso va-cunal de una cepa atenuada, procedentede un aislamiento clínico, sin caracteresfenotípicos o genotípicos que la separende la cepa considerada “salvaje”.Después de la administración oral de lavacuna no existe eliminación fecal delmicroorganismo, aunque la inmunidadhumoral o celular inducida sea baja oesté ausente, pero a la vez que no existeeliminación fecal después del desafío, loscerdos vacunados comparados con losno vacunados ganan más peso (275). Lavacuna fue autorizada en EE.UU. paramejorar la ganancia de peso y reducir lavariabilidad de crecimiento asociada conla ileítis porcina y administrada en elagua de bebida (276).

En el campo de las vacunas inactivadasse han producido en los últimos años al-gunas aportaciones interesantes, comouna bacterina inactivada mixta, que in-corpora tres especies de Porphyromonas (P. gulae, P. denticanis y P. salivosa) rela-cionadas con la enfermedad periodontal


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en los perros, que ha sido autorizada enlos EE.UU. y Nueva Zelanda (277), o unavacuna oral frente a Yersinia ruckeri, queproduce la boca roja de la trucha arcoiris, caracterizada por zonas hemorrá-gicas y congestivas en varios tejidos y ór-ganos del animal, sobre todo alrededorde la boca y en los intestinos, y que cursacon alta mortalidad. Esta y otras vacunassimilares con destino a la forunculosis dela trucha producida por Aeromonas sal-monicida y la vibriosis producida porVibrio anguilarum, o la autorizada enChile frente a la necrosis pancreática in-fecciosa, han sido algunas de las últimasvacunas inactivadas frente a enferme-dades bacterianas que, aunque a menorritmo que hace algunos años, aún se si-guen autorizando.

Vacunas víricas

Debe señalarse, de entrada, que los virusunen a sus peculiaridades biológicas (pa-rásitos absolutos, un solo tipo de ácidonucleico, etc.) su gran variabilidad, espe-cialmente en el caso de los virus ARN, quese traduce en múltiples serotipos en unasola especie, hecho que implica fracasosen situaciones de campo que obligan aproducir constantemente productosnuevos a partir de aislados obtenidos delos brotes de la enfermedad, cada vez queestos se producen. Como en el caso delas bacterias, probablemente aún enmayor cantidad, en la actualidad se si-guen produciendo tanto vacunas ate-nuadas como inactivadas.

A lo largo de todo el siglo pasado, inclusodesde el último tercio del siglo XIX, todavíasin conocer la naturaleza de los virus, seiniciaron las primeras preparaciones vacu-nales frente a estos; de hecho, viruela y

rabia, figuran entre las primeras enferme-dades asociadas al desarrollo de vacunas,por E. Jenner y L. Pasteur, respectiva-mente. Después de ellas, un sinfín de va-cunas vivas atenuadas e inactivadas frentea enfermedades víricas de los animales yel hombre se han producido y utilizadocomo instrumentos poderosos en la luchacontra estos agentes. Las vacunas vivasatenuadas se obtuvieron utilizando deforma empírica distintas estrategias, in-cluyendo el uso de agentes aislados deforma natural o inducido experimental-mente a partir de hospedadores dife-rentes al de prueba o sometiendo al virusen cuestión a pases ciegos por animalesdiferentes del hospedador natural o porlíneas celulares o embrión de pollo; deeste modo, las cepas víricas implicadas seatenuaban como consecuencia de muta-ciones al azar y se seleccionaban para lavirulencia reducida.

Debe tenerse en cuenta que al manteneractividad infectante, aunque aquella estédisminuida, las cepas vacunales puedenreplicarse en el organismo hospedador einducir en él inmunidad humoral y ce-lular, no siendo necesaria la incorpora-ción de adyuvantes para ser eficaces; porotra parte, los productos vivos atenuadosofrecen la ventaja adicional de su fáciladministración, que puede producirsebien en el agua de bebida, intranasal, in-traocular, intramuscularmente, etc. Ladesventaja de que adolecen este tipo deproductos es el riesgo de virulencia resi-dual o la posible reversión a la forma pa-tógena virulenta, además de que consti-tuyen una fuente importante decontaminación ambiental, y de hecho, lahistoria reciente y menos reciente haacreditado episodios de esta naturaleza,


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ejemplo de los cuales pueden ser lascepas avianizadas del virus rábico (FluryLEP y Flury HEP) con destino a los gatos(más susceptibles que los perros) o elcaso del virus vacunal americano frenteal PRRS, que revertió a la forma virulentay se difundió en Dinamarca, en 1996,como parte de las vacunaciones llevadasa cabo en los programas de control de laenfermedad; desde entonces, ambostipos de virus (norteamericano y eu-ropeo) han sido descritos entre la pobla-ción porcina danesa (278).

En cualquier caso, y pese a estos incon-venientes, son más los datos a favor queen contra y este tipo de vacunas ha ju-gado un papel extraordinario en el con-trol y erradicación de alguna de las prin-cipales enfermedades infecciosas de losanimales, como es el caso de la pestebovina, dependiente de la vacuna“Plowright”, una vacuna atenuada, pro-ducida a partir de la cepa Kabete O, ate-nuada después de 90 pases en cultivo detejidos, o las vacunas avianizadas delvirus rábico, aludidas antes, atenuadaspor pases en embrión de pollo o pato,LEP (Low Egg Passage) entre los pases 40y 50 por cerebros de pollitos de un día,o HEP (High Egg Passage), a partir delpase 180, que representan probable-mente el hito más importante en la luchacontra la rabia en los animales domés-ticos, particularmente el perro, y puntode partida para adaptaciones posterioresa cultivo celular y otras modificaciones.El riesgo de reversión, no obstante, estásiempre presente y ello es particular-mente una situación de riesgo en el casode los virus ARN, aunque tambiénexisten mutaciones estables.

En relación con las vacunas víricas inac-tivadas de virus completos, carecen delriesgo de la reversión a la forma virulentao de la presencia de virulencia residualdescrita en las vacunas atenuadas,aunque su capacidad inmunizante essustancialmente menor, sobre todoporque al carecer de la capacidad de in-fectar las células y activar las células T ci-totóxicas, la capacidad protectora indu-cida es mucho menor, por lo querequieren de la incorporación de adyu-vantes e inoculaciones de recuerdo paraconseguir un nivel de protección acep-table, utilizándose por lo general más enel control del cuadro clínico que en elcontrol de la infección. Además de ello,las vacunas inactivadas incorporan otrotipo de riesgos, incluidos la sensibiliza-ción del hospedador receptor del pro-ducto y la consiguiente producción dealergias, la capacidad de causar enfer-medades autoinmunes o la producciónde sarcomas en el punto de inoculación.La inactivación de los virus, como en elcaso de las bacterias, se consigue porprocedimientos físicos (por lo generalcalor) o químicos (habitualmente formol,tiomersal, óxido de etileno o β-propio-lactona), siendo, por razones obvias, máscostosas de producir que las vacunasvivas atenuadas. Entre las vacunas inac-tivadas más recientemente autorizadasfigura una vacuna frente a la circovirosisporcina por PCV2 o las vacunas autori-zadas en la UE frente a la lengua azulovina, entre otras.

La oferta actual de vacunas víricas inac-tivadas para distintas especies animales,se recoge en la tabla siguiente (279):


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Vacunología moderna

La primera innovación importante en la va-cunología moderna se inició con las va-cunas recombinantes, a partir de la aplica-ción de los métodos moleculares. Con elcomienzo de la era genómica, tuvo lugaruna segunda revolución en el campo de lasvacunas a partir del conocimiento en 1995del primer genoma completo de un micro-organismo, H. Influenzae (280), en el quese utilizó una estrategia de secuenciacióndenominada pistola de secuenciación(shotgun sequencing) (281), que en la ac-tualidad ha sido sustituida por otras nuevas(282), como la tecnología denominada“454“ que se aplica para la resecuencia-ción de varias especies y que permite se-cuenciar muchos genomas adicionales abajo coste y rápidamente, siempre que estédisponible un genoma de referencia (283).Merced a estos avances técnicos ya se dis-pone del genoma completo de más de1.000 microorganismos y más del dobleestán siendo secuenciados en la actualidaden numerosos laboratorios del mundo(http://genomesonline.org), que cubren la

mayoría de los patógenos importantespara la salud humana y la Sanidad Animal.

Desde el punto de vista de la Vacuno-logía, el genoma completo de una bac-teria representa un gran reservorio degenes que codifican para antígenos po-tenciales, que pueden ser seleccionadosy ensayados como candidatos vacunales.Descubrir esos genes que se relacionancon los factores de virulencia (aunque noexclusivamente, por ejemplo, antígenosexpuestos en la superficie bacteriana) esuna tarea larga y compleja a la que hancontribuido metodologías aportadas porla Genómica Funcional, que se ocupaparticularmente del estudio del genoma,incluyendo la tecnología IVET (In VivoExpression Technology), STM (SignatureTagged Mutagenesis), secuenciación ge-nómica y análisis in silico, microarrays deADN y proteómica (electroforesis en gelde dos dimensiones y espectrometría demasas).

STM e IVET representan metodologías di-rigidas a descubrir genes que se inducenespecíficamente durante la infección.

Tabla 3. Oferta española de vacunas víricas inactivadas para animales.

Aves Équidos Bovino Perros Gatos ConejoNewcastle +Influenza equina (H3N8) +Rabia (cepa Pasteur, cepa SAD, Flury) + + +Herpesvirus equino tipo 1 +Herpesvirus equino tipo 4 +IBR/IPV + parainfluenza3 + Diarrea vírica +Herpesvirus felino +Herpesvirus canino +Calicivirus felino +Leucemia felina +Parainfluenza canina +Calicivirus del conejo (enf. vírica hemorrágica) +

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STM (literalmente mutagénesis marcada,etiquetada) fue descrita en 1999 (284) yse basa en un sistema de mutagénesis alazar para identificar genes que se re-quieren para la supervivencia en el hos-pedador (in vivo), potenciales factores devirulencia. Utiliza una técnica de selec-ción negativa con transposones modifi-cados por la incorporación de una se-cuencia-etiqueta de aproximadamente40 pb, lo que permite que cada mutantepueda identificarse a través del trans-posón integrado en él y marcado. Lascepas mutantes marcadas (etiquetadas)se mezclan y se inoculan en un animalde experimentación, y después de quese haya establecido la infección, las bac-terias se recuperan a partir del bazo delos animales infectados y se cultivan enmedios sólidos. Los mutantes atenuadosno podrán recuperarse. La comparaciónde los marcadores (transposones mar-cados o etiquetados) que están pre-sentes en el inóculo, pero ausentes enlas bacterias que se recuperan de los ani-males infectados, identifica los mutantesatenuados. La técnica tiene la ventaja deque permite identificar, potencialmente,mutantes atenuados que son incapacesde producir la infección y que puedenser utilizados como vacunas vivas. Porotra parte, las proteínas identificadascomo esenciales para la infección o laenfermedad pueden ser buenas candi-datas a formar parte de vacunas de su-bunidades. STM se ha utilizado en labúsqueda de genes de virulencia en dis-tintos patógenos como M. tuberculosis,S. aureus, Salmonella Typhimurium,Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica,Streptococcus agalactiae y N. meningi-tidis, entre otros.

IVET es un sistema de selección positivade genes que se inducen específicamenteen el curso de la infección, descrito porMahan et al. (1993) (285). Requiere de ladisponibilidad de una cepa portadora deuna mutación en un gen biosintético (au-totrófico) que impide el crecimiento invivo en ausencia del producto de su ex-


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Figura 25. STM (mutagénesis marcada y etiquetada).Inicialmente se sintetizan diferentes dianas de ADNmarcado con etiquetas (signature tags). Se ligan lasdianas de ADN al transposón y se obtiene unamezcla (pool) de estos, utilizándose para mutage-nizar las bacterias patógenas de prueba. Se alma-cena cada mutante separadamente en un disposi-tivo adecuado y se obtienen réplicas en filtro. Semezclan los mutantes y, por un lado, se inocula elpool en ratones recuperando las viables del bazo, secoamplifican las dianas, se marca el ADN y se hi-bridan con las dianas del inóculo (pool de salida).Por otro lado, se coamplifican las dianas etiquetadas,se marca el ADN y se hibrida con las anteriores apartir del inóculo (pool de entrada). La comparaciónde ambos pools identifica los mutantes avirulentos,secuenciando el ADN flanquente a los lugares de in-serción del transposón (Chiang et al., 1999).


presión, como sucede por ejemplo con elgen purA, que convierte su ausencia enlos microorganismos a auxótrofos parapurinas o efg, que codifica para un factorde crecimiento esencial. La función bio-sintética, esencial para el crecimiento enel hospedador, es proporcionada por elpromotor purA, cuyos fragmentos obte-nidos a partir de una librería de ADN cro-mosómico del patógeno suministra loselementos de transcripción desconocidos;lacZ, alternativamente, que codifica paraβ-galactosidasa, actúa como indicador.

Las fusiones seleccionadas positivamentese secuencian para identificar los genesque se inducen in vivo. Se han propuestosistemas alternativos sobre genes indica-dores (reporter) que portan resistenciasantibióticas (286) o codifican para unaproteína verde fluorescente (gfp) en unametodología conocida como “inducciónfluorescente diferencial“ (287). La tecno-logía IVET ha sido utilizada para identificargenes de virulencia en P. aeruginosa, S.typhimurium, Y. enterocolitica, V. choleraeo S. aureus, entre otros.


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Figura 26. IVET. A la izquierda, método IVET de selección positiva. Se utilizan dos genes marcadores en unplásmido IVET (un marcador de selección efg –un factor de crecimiento esencial y limitante– y un gen indi-cador o reporter –lacZ–, que codifica para la β-galactosidasa) situados en tándem, fusionándolos aleatoria-mente con fragmentos del genoma del microorganismo de prueba obtenidos por restricción enzimática, ge-nerando una genoteca. Se clonan al azar los fragmentos del ADN situados delante del gen efg/lacZ y setransforman las cepas de estudio con la genoteca. Se infecta el ratón con las bacterias recombinantes y seaíslan las patógenas del bazo de ratón, seleccionando colonias blancas (no poseen actividad β-galactosidasay, por tanto, tampoco efg, es decir, ambos genes no se expresan in vitro, pero sí in vivo, indicativo de su pa-togenicidad). Las colonias azules indican bacterias que solo se expresan in vitro (carecen de genes de viru-lencia). A la derecha, un metodo IVET de selección negativa en la que el gen auxotrófico que condicionaba lasupervivencia está sustituido por un gen de R a la tetraciclina (Te). Permite la detección de actividad de pro-motores durante un periodo muy corto de la infección. Si el promotor está activo, la resolvasa eliminará el gende R y, por tanto, el microorganismo pasará de R a S. El ratón se sustituye aquí por la incorporación de Te invitro, buscando células S a la tetraciclina, que serán blancas (Mahan et al., 1993, 1995).


Es importante señalar, en cualquier caso,que tanto IVET como STM fueron apli-cadas antes del comienzo de la era genó-mica; de hecho, no es estrictamente ne-cesario el conocimiento previo delgenoma (de la secuencia genómica) parasu aplicación, aunque ambas tecnologíasse benefician de la disponibilidad de lassecuencias, ya que la identificación degenes inactivados puede llevarse a caborápidamente secuenciando solamenteunos pocos nucleótidos upstream (co-rriente arriba) y downstream (abajo) delos insertos.

La secuenciación del genoma y el aná-lisis in silico es fundamental para la se-lección de los genes candidatos. En la ac-tualidad se dispone de metodología parala secuenciación de ADN completamenteautomatizada. Básicamente, las libreríasgenómicas solapantes obtenidas al azar,representantes del genoma completo enpequeños fragmentos, se preparan enplásmidos vectores y se secuencia el in-serto de cada plásmido. Las secuenciasaleatorias se determinan hasta cubrir,aproximadamente, de 8 a 10 veces el ge-noma. Herramientas bioinformáticas muysofisticadas comparan entonces las se-cuencias y generan solapamientos delargas secuencias conocidas como contigs(de secuencias contiguas) (288). Un contiges un set de segmentos de ADN super-puestos procedentes de una fuente gené-tica única. En este sentido puede utilizarsepara deducir la secuencia de ADN de lafuente original.

Después de esta fase, el genoma habitual-mente se encuentra en un número pe-queño de grandes contigs. El cierre signi-fica llenar los vacíos e implica genotecasde los fragmentos más grandes en los

vectores fágicos λ y la clonación de pro-ductos específicos de PCR utilizando se-cuencias de los primers en los extremosde los contigs. El resultado es el genomacompleto en una secuencia continua.

Una vez que se ha completado la secuen-ciación y se ha montado la secuencia, seidentifican los potenciales ORF y se uti-lizan para buscar en las bases de datoshomologías de genes que tengan unafunción conocida en otros microorga-nismos. De este modo se adscriben a losORF las funciones que correspondan y lasecuencia se anota. La anotación tambiénpuede basarse sobre el plegamiento delas supuestas proteínas. El análisis bioin-formático permite asignar una función acada gen.

En la investigación de genes de virulenciala estrategia más habitual es comparar lassecuencias codificadoras estimadas conlas secuencias presentes en las bases dedatos utilizando programas como elBLAST (289) que identifica coincidenciascon genes conocidos. En la actualidadexiste una amplia variedad de paquetesde software para asignar funciones a losgenes y predecir datos clave, como la lo-calización celular, la topología, el pesomolecular, el punto isoeléctrico y la solu-bilidad.

La condición principal para que una pro-teína sea considerada un antígeno es sulocalización celular. De hecho, las prote-ínas que están únicamente presentes enel citoplasma bacteriano no son buenasdianas, mientras que las proteínas secre-tadas o asociadas a la superficie son másaccesibles a la unión con los anticuerpos,siendo por ello consideradas como dianasposibles para el sistema inmune.


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Tabla 4. Bases de datos y programas para el análisis de secuencias de ADN proteínas (290).

Objetivo Programa Página webBases de datosde secuenciasGenomas completos FASTA http://www.ebi.ac.uk/fasta

TIGR http://www.tigr.org Sanger Institute http://www.sanger.ac.uk GOLD database http://www.integratedgenomics.com/GOLD GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html EMBL http://www.embl.org EBI http://www.ebi.ac.uk COGs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG

Por homología BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Búsqueda de ORFEn bacterias SMS http://bioinformatics.org/sms2/orf_find.html En eucariotas GENSCAN http://genes.mit.edu/GENSCAN.html Por homología blastx http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Herramientas depredicción decaracterísticas de proteínasHélices transmembranasen proteínas TMHMM2.0 http://www.cbs.dtu.dk/service/TMHMM

TMpred http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.htmlBarriles beta TBBpred http://www.imtech.res.in/raghava/tbbpred

PredictionProtein http://www.predictprotein.org Alineamientosecuencias múltiples ClustalW http://www.ch.embnet.org/sofware/ClustalW.html Traducción de secuenciasnucleotídicas en aa TRANSLATE tool http://www.expasy.ch/tools/dna.hml Base de datosde motivosde proteínas CDD http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/edd.html

MOTIFS http://motif.genome.jp ProDom http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php Prosite http://au.expasy.org/prosite Pfam http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml BLOCKS http://blocks.fhere.org InterPro Scan http://expasy.org/tools PRINTS http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS SMARTS http://smarts.embl-heidelberg.de

Péptido señal SignalP 3.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP Lipoproteínas LipoP 1.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP Epítopos en B y T IMTECH http://www.imtech.res.in/bic Epítopos en T EpiMatrix http://epivax.com/epimatrix.html Unión a MHC I y II RANKPEP http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html



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En la actualidad se dispone de varios mé-todos bioinformaticos (métodos in silico)para investigar las proteínas secretadas oasociadas a la superficie. La mayor partede los programas aparecen recogidos enel cuadro; otros, por ejemplo: PSORT seutiliza para la predicción de señales de cla-sificación de la proteína y la localizaciónde sitios en la secuencia de aminoácidos(http://psort.nibb.ac.jp/); SignalP predicela presencia y localización de la señal quecorresponde a sitios de escisión de pép-tidos en secuencias de aminoácidos apartir de diferentes tipos de microorga-nismos Gram positivos y negativos, asícomo en eucariotas; TMpred predice lasregiones de barriles β que abarca y suorientación. Otras circunstancias útilespara las proteínas asociadas a la mem-brana incluyen la presencia de residuosaromáticos en el extremo C-terminal dela proteína, así como los dominiosLeu(Ala/Val)-Leu-Ala(Ser)-Gly(Ala)-Cys enel extremo N-terminal de las lipoproteínas,etc.

Como los resultados de la metodología insilico permiten la selección de genes quecubren como mucho el 25% del númerototal de ORF en el genoma, resulta nece-sario utilizar procedimientos simples quepermitan clonar y expresar un gran nú-mero, lo que es posible mediante el usocombinado de la robótica y la PCR (291).Los primers para la PCR se diseñan a partirde las secuencias genómicas; cada parejacontiene también las secuencias que co-rresponden al sitio de restricción apropiadopara el clonaje en vectores de expresiónprocariotas o sitios de reconocimiento pararecombinasas cuando se emplea la recom-binación in vitro para clonar los genes.Entonces se clona el producto de cada PCR

y se selecciona para la expresión en un sis-tema heterólogo. El éxito de la expresióndepende de la predicción realizada sobrela localización de la proteína. Las proteínasintegrales de membrana han demostradoser particularmente difíciles de producir portécnicas de recombinación en E. coli.

El método más común utilizado para ex-presar genes se basa en la fusión a unadiana de histidina y/o glutatión-S-transfe-rasa, para facilitar la purificación rápidade las proteínas recombinantes por afi-nidad en una columna de cromatografía.En el caso de antígenos insolubles, la pu-rificación con agentes desnaturalizantes,como la urea, va seguida de la renatura-lización basada en una diálisis en dosfases, en presencia de arginina, glicerol, yen el caso de proteínas con puentes disul-furo, la adición de glutatión reducido yoxidado.

Una vez purificadas, las proteínas recom-binantes se utilizan para inmunizar ra-tones, analizando después el suero paraverificar la localización superficial predic-tiva por bioinformática, así como su capa-cidad para conseguir una respuesta in-mune cuanti-cualitativa. A tal efecto seutiliza un análisis por Western-blot de lasproteínas recombinantes, las vesículas dela membrana externa y los extractos to-tales de la bacteria, para determinar si losanticuerpos son capaces de reconocertanto la proteína recombinante como labacteriana y confirmar su localización enla bacteria.

La tecnología de microarrays de ADNes particularmente atractiva para el aná-lisis de microorganismos con genomas re-lativamente simples, como sucede con lasbacterias. Pueden prepararse con relativa


facilidad chips de ADN portadores del ge-noma bacteriano completo, siguiendodespués con el análisis de la expresión delgenoma, siendo de gran utilidad en la lo-calización de los genes de virulencia.

La expresión de los genes de virulenciapuede monitorizarse mediante el creci-miento de los patógenos en modelos invivo apropiados (cultivos celulares y/o ani-males de experimentación), recuperandodespués las bacterias para la preparación ymarcaje del ARN, lo que permite el análisisde la actividad génica y la comparación degenes en condiciones in vitro. Siguiendolos patrones de expresión de genes a dife-rentes tiempos es posible dilucidar todoslos genes del hospedador y de la bacteriacuya expresión se modifica (sobrerregula osubregula) durante la interacción pató-geno-hospedador. Grifantini et al. (2002)(292) utilizaron microarrays de ADN paraestudiar la regulación génica durante la in-teracción entre bacterias y células epite-liales, haciendo uso de esta tecnología enel diseño de vacunas.

El genoma completo, visto desde los mi-croarrays, resulta un sistema prometedorpara identificar genes candidatos comodianas para el desarrollo de vacunas,aunque los resultados de la expresión gé-nica en patógenos y las interacciones pa-tógeno-hospedador están influenciadaspor el sistema modelo que se utilice, porlo que los resultados deben interpretarsecon precaución. Además de ello, los datosde expresión presentan limitacionesporque los niveles de ARNm puede queno reflejen los niveles de proteínas, y laexpresión de una proteína no siempreposee consecuencias patológicas.

Otro uso de los microarrays de ADN (ge-noma completo) es el de comparar los ge-nomas de bacterias relacionadas (hibrida-ción completa del genoma, CGH). A esterespecto, microarrays de ADN que con-tienen el genoma de una cepa pueden hi-bridarse con el ADN genómico total decepas diferentes o relacionadas para lasque no existen datos de secuencia genó-mica, permitiendo así la identificación degenes presentes en una cepa y ausentes enotra (293). Mediante este procedimiento,comparando cepas de S. agalactiae se handescrito regiones genómicas hipervariablesy genes comunes a todas las cepas (294),dato sin duda importante en la búsquedade genes candidatos para vacunas poten-ciales capaces de inducir protección cru-zada frente a todos los serotipos.

Por lo que se refiere a la Proteómica, esdecir, el conjunto total de proteínas codifi-cadas por el genoma bacteriano, tambiénproporciona datos importantes en el di-seño de vacunas. En el análisis del pro-teoma, una mezcla de proteínas y otrasmoléculas, pongamos por caso una prepa-ración cruda de la membrana externa o unlisado completo de una suspensión bacte-riana, debe resolverse en sus componentesindividuales, utilizando, por ejemplo, unametodología de electroforesis bidimen-sional o espectrometría de masas. Una vezlograda la separación, cada proteína se di-giere con una proteasa específica para ge-nerar fragmentos de péptidos discretoscuya masa molecular pueda ser evaluadaconvenientemente por espectrometría demasas. Los resultados del experimento secomparan con los esperados para la mismadegradación específica de todas las prote-ínas predichas a partir de la secuencia ge-nómica. De esta manera, la proteína puede


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ser identificada inequívocamente como elproducto de un gen específico (295). Elanálisis físico del proteoma permite la iden-tificación de proteínas expresadas en uncompartimento particular o bajo diferentescondiciones de crecimiento. Esta estrategiaha sido utilizada para identificar nuevoscandidatos vacunales frente a varios pató-genos humanos, como sucede en el casode H. pylori o Chlamydia pneumoniae.

En definitiva, en la práctica, las opcionesdisponibles en la actualidad para el diseñode vacunas, utilizando las metodologíasdescritas, incluyen vacunas de genética re-versa, vacunas recombinantes, vacunas desubunidades, vacunas de ADN y vacunasvivas atenuadas por ingeniería genética(vacunas delecionadas). En el caso parti-cular de los virus se incluyen también lasvacunas quiméricas.

Genética reversa. Vacunología reversa

Esta nueva tecnología, denominada así(296) por primera vez con ocasión del de-sarrollo de la vacuna contra el serogrupoB de N. meningitidis (MenB), parte de labase de que proteínas potencialmente ex-puestas en la superficie de los microorga-nismos pueden ser identificadas de formainversa (reversa), comenzando a partir delgenoma, más que a partir del microorga-nismo (297). De este modo, se procede aexplorar los genomas en busca de genesque puedan codificar proteínas de interés,potenciales candidatos vacunales.

Como hemos señalado, gracias al desa-rrollo y optimización de las nuevas tecno-logías derivadas del Proyecto GenomaHumano se dispuso de técnicas automá-ticas de secuenciación del ADN, que hanpermitido el conocimiento del genoma de

numerosos microorganismos, generandoa la vez una cantidad ingente de informa-ción y datos sobre los que la Bioinformáticaha facilitado el desarrollo de programasque analizan los genomas en cortos espa-cios de tiempo (298), permitiendo descu-brir nuevos antígenos que nunca habríanpodido ser obtenidos por métodos tradi-cionales. En definitiva, la disponibilidad degenomas completos de microorganismosy las nuevas herramientas informáticas hanpermitido el nacimiento de una auténticadisciplina científica nueva (GenómicaComparada) que puede aplicarse a dife-rentes cepas, especies y géneros, y que re-presenta un instrumento poderoso para es-tudiar diferencias en el fenotipo, rango dehospedadores y evolución molecular de lavirulencia (299).

La vacunología inversa hace innecesarioel cultivo de los microorganismos. A partirde la información derivada del genomadel microorganismo de prueba, se lleva acabo la selección de los genes candidatosvacunales, mediante un análisis predictivoque informa acerca de si la proteína ex-presada es una proteína de membrana ouna proteína secretada. Incluso, algunosprogramas informáticos pueden pronos-ticar acerca de propiedades antigénicas alidentificar las regiones de unión al CPH(complejo mayor de histocompatibilidad).A tal efecto, la utilización de algoritmosbioinformáticos permite seleccionar ORFque codifican para potenciales proteínassecretadas expuestas en la superficie dela bacteria.

Finalizada la selección de los genes can-didatos (en el caso de N. meningitidisfueron más de 600), se procede a la am-plificación mediante PCR, clonando, ex-presando y purificando el producto como


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proteínas recombinantes, por lo generalutilizando alguno de los vectores al uso,habitualmente E. coli, que serán utilizadasen la inmunización en modelos animaleso en animales de experimentación (fre-cuentemente en ratón), siendo evaluadosfinalmente en cuanto a su capacidad de

inducir una respuesta inmune protectora.A tal efecto, los antisueros obtenidos seprueban en su capacidad bactericida. Enel caso de N. meningitidis, se identificaronde este modo un total de 91 antígenos desuperficie, 28 de los cuales inducían anti-cuerpos bactericidas protectores.


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Fig. 27. Estrategia de vacunología reversa (Serruto et al., 2009). Extracción de una secuencia del genoma de unabacteria. La vacunología reversa pan-genómica representa un avance, ya que pone de relieve el potencial de bús-queda de más de un genoma para la misma especie bacteriana (por ejemplo, secuenciación de más de un ais-lado) para superar los problemas representados por la presencia y variabilidad de genes. La vacunología reversacomparativa consiste en comparar secuencias genómicas patógenas (bacterias rosas) y no patógenas (bacteriasamarillas) con el fin de seleccionar aquellos antígenos que son específicos de los patógenos y que pueden estarimplicados en la patogénesis. Un candidato vacunal potencial se identifica in silico, se amplifican los ORF, se clonay se expresa en vectores, se purifica y se utiliza para inmunizar ratones. El suero inmune obtenido es utilizado enpruebas de laboratorio para medir la capacidad de los anticuerpos específicos para destruir el patógeno (porejemplo, actividad bactericida); los animales inmunizados también pueden ser utilizados en experimentos de de-safío con una dosis letal del patógeno para medir la capacidad (tasa) de protección. Los mejores candidatos sonseleccionados por este proceso, con los que al final se procederá al desarrollo de la vacuna.


Este sistema tiene la ventaja adicional deque, cuando se trata de patógenos peli-grosos, el cultivo es innecesario y sepuede comenzar a trabajar a partir detodos los posibles antígenos proteicos co-dificados en el genoma, sin tener encuenta tan siquiera, si estos se expresano no, in vivo o in vitro.

Pese a sus limitaciones (conocimiento limi-tado de los candidatos vacunales obtenidode los análisis in silico en lo que se refierea su relación con el hospedador, no iden-tificación de polisacáridos y dificultadespara identificar glicolípidos y otros antí-genos CD1), la vacunación reversa es unaherramienta poderosa para el desarrollode vacunas, en especial en el caso de losmicroorganismos no cultivables.

Existen programas basados en algoritmosque permiten la identificación de prote-ínas de membrana, proteínas extracelu-lares o proteínas secretadas, habitual-mente consideradas candidatos vacunalesideales, al ser más accesibles a los anti-cuerpos que las proteínas intracelulares.Sin embargo, tales algoritmos no siemprepredicen correctamente la ubicación ce-lular de las proteínas (300), por lo que lasestrategias de vacunología reversa, ba-sadas en la genómica, dependen delacierto y el criterio utilizado en la selec-ción de los antígenos potenciales. En laactualidad se dispone de diferentes basesde datos utilizables para obtener informa-ción de las secuencias genómicas de nu-merosos microorganismos de interés ve-terinario (Sanidad Animal), dato queresulta esencial para la selección de losantígenos vacunales potenciales, unido ala tecnología informática correspondiente(301) en la que se incluyen programas debúsqueda de secuencias o proteínas. Los

algoritmos más empleados en el análisisde las secuencias incluyen métodos debúsqueda de secuencias similares (deADN o de proteínas) y de la predicción desu localización en el microorganismo, enel caso de las proteínas, a partir de unasecuencia determinada de aminoácidos.Existen también bases de datos que in-cluyen dominios de familias de proteínasgeneradas de la comparación de todas lassecuencias de proteínas. Incluso dentro deuna misma especie se puede analizar silos genes seleccionados como candidatosestán o no conservados, para lo quepuede utilizarse un programa como elClustalW, que permite el alineamiento demúltiples secuencias de ADN o proteínas,hasta observar la identidad, la similitud ylas diferencias.

Vacunología reversa pan-genómica

Mientras que la secuencia genómica deuna cepa en particular revela muchos as-pectos de la biología, falla en el mismo pro-pósito cuando se refiere al conocimientode la patogénesis, igual que en lo que serefiere a la búsqueda de candidatos vacu-nales o de dianas antimicrobianas.

La disponibilidad de secuencias genómicasde diferentes aislados de una especie per-mite el análisis de su diversidad genómicamediante el análisis comparativo del ge-noma. Cuanto mayor sea el número de ais-lados y más estrecha la selección de cepas,mejor será la estimación de la heteroge-neidad global de la especie (302).

La ventaja del análisis múltiple del genomaen el diseño de vacunas se puso de mani-fiesto con ocasión del descubrimiento decandidatos vacunales universales frente aStreptococcus agalactiae, un estreptococodel grupo B que produce enfermedad


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mortal en niños recién nacidos y es causade mastitis bovina. En esta especie se handescrito nueve serotipos capsulares dis-tintos, aunque los más frecuentes enEuropa y EE.UU. pertenecen a cinco deellos (Ia, Ib, II, III y V). Un análisis de hibri-dación genómica comparativa reveló queexistía una variación significativa en el con-tenido de genes entre los diferentes ais-lados de casos clínicos, lo que hizo pensaren la idea de que una secuencia del ge-noma no era suficiente para captar porcompleto la diversidad de la especie y per-mitir la identificación correcta de los can-didatos vacunales protectores frente a laenfermedad, razón por la que se secuen-ciaron nuevas cepas pertenecientes a loscinco serotipos principales y se compa-raron. Así surgió el concepto de pan-ge-noma (303).

El pan-genoma puede definirse como el re-pertorio global de genes perteneciente auna especie y puede dividirse en trespartes: a) el núcleo genómico, que incluyeel set de genes que están presentessiempre, de forma invariable, y que perma-necen conservados en todos los aislados;b) el genoma dispensable, que comprendelos genes presentes solo en algunas de lascepas, y c) los genes específicos de cepa,que son los que solamente están presentesen un aislado en particular.

El concepto de pan-genoma fue aplicadopor Maione et al. (2005) (304) para el de-sarrollo de la vacuna frente a S. agalactiae.Se utilizaron algoritmos bioinformáticospara seleccionar de los genes del pan-ge-noma los que codificaban proteínas secre-tadas, asociadas a la superficie bacteriana,y después de probar un número significa-tivo de los mismos en un modelo de infec-ción en ratón; se identificaron cuatro antí-

genos que eran capaces de incrementarsignificativamente la tasa de supervivenciafrente al desafío. Desafortunadamente solouno de estos antígenos formaba parte delnúcleo-genoma, perteneciendo los otrostres al genoma dispensable. La formulaciónfinal de la vacuna comprendió una combi-nación de los cuatro anfígenos, que pro-porcionaban, prácticamente, una protec-ción universal.

La caracterización de los antígenos vacu-nales, recientemente identificados, ha re-velado que dos de ellos forman parte deestructuras semejantes a pili que se ex-tienden desde la superficie bacteriana, loque ha orientado a la comunidad cientí-fica a investigar estructuras semejantes enotras bacterias grampositivas, como haocurrido en el caso de S. pyogenes y otras(305). Es lo que sucede también en elcaso de S. pneumoniae (306), uno de lospatógenos humanos más importantes,productor de neumonía, meningitis, otitisy sepsis, causante de morbilidad y morta-lidad en todo el mundo.

Análisis genómico comparativo

Mientras que en el caso de la vacuna frentea estreptococos el análisis genómico com-parativo se aplicó en aislados clínicos, cau-santes de enfermedad, una estrategia al-ternativa está representada por lacomparación entre cepas patógenas (viru-lentas) y no patógenas (avirulentas) de lamisma especie, análisis que puede propor-cionar la información necesaria para laidentificación de antígenos que definan ladiferencia en la que puede fundamentarsela patogénesis de la enfermedad. Se hanllevado a cabo estudios de este tipo, porejemplo, en el caso de cepas de E. coli uro-patógenas, de procedencia clínica humana


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y otros en el caso de L. monocytogenes(307), Yersinia enterocolitica (308) yN. meningitidis (309), que han puesto demanifiesto la presencia de una extensa re-ducción genómica en el caso de las cepasapatógenas, con pérdida de genes, parti-cularmente de grupos implicados en la vi-rulencia, interacción con el hospedador yrutas metabólicas.

Desde el punto de vista vacunal, los genesque codifican para antígenos conser-vados, tanto en cepas patógenas comoen las no patógenas, deben descartarseen la selección, reduciendo el número decandidatos, puesto que la selección deantígenos que solamente están presentesde modo selectivo en las cepas patógenaspuede, además, reducir el impacto sobrela microbiota comensal, especialmente enel caso de microorganismos que poseenambos fenotipos.

En los últimos años se han conseguidoimportantes éxitos que han demostradoque la vacunología reversa puede ser lasolución frente a numerosos patógenoshumanos en los que las estrategias tradi-cionales para el desarrollo de vacunas, poruna u otra razón, habían fallado antes, osolo habían permitido conseguir resul-tados parciales. Los métodos tradicionalesde diseño de vacunas consumen muchotiempo, solamente identifican los antí-genos más abundantes, que no tiene porqué coincidir con los mejores inductoresde inmunidad protectora y fallan drásti-camente en el caso de patógenos inculti-vables en el laboratorio.

Utilizando la vacunología reversa, cadaproteína sintetizada por el patógeno encualquier momento de su ciclo biológicopuede considerarse probada como uncandidato vacunal, sin ninguna selección


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Tabla 5. Comparación entre la vacunología convencional y reversa (Rappuoli, 2001;Adu-Bobie et al., 2003).

Vacunología clásica. Elementos esenciales Vacunología reversa. Elementos esencialesLos antígenos más abundantes en la enfermedad. Todos los antígenos inmunogénicos en la enfermedad.Antígenos que se expresan in vitro. Antígenos que se expresan in vivo e in vitro.Microorganismos cultivables. Antígenos, incluso, de microorganismos no cultivables.Los modelos animales son esenciales. Son esenciales los modelos animales.Es útil la correlación con la protección. Es esencial la correlación con la protección.Componentes estructurales del microorganismo. Componentes no estructurales, incluyendo

las proteínas tempranas de los virus. Es importanteel plegamiento correcto en la expresión recombinante.Importante expresión de alto rendimiento/análisis.

Pueden utilizarse los polisacáridos como antígenos. No pueden utilizarse los antígenos no proteicos(polisacáridos, glicolípidos y otros antígenosCD1-restringidos).

Vacunología clásica. Elementos esenciales Vacunología reversa. Elementos esencialesLas vacunas a base de lipopolisacáridos son posibles.Pueden utilizarse los glicolípidos y otrosantígenos CD1-restringidos.

Pueden identificarse antígenos que no soninmunogénicos durante la infección.


a priori basada en el conocimiento limi-tado de la patogénesis del microorga-nismo y de la respuesta inmune inducidadespués de la infección. En la tabla 5 semuestran de forma comparativa las estra-tegias clásica y reversa para el desarrollode vacunas, siendo esperable que en lospróximos años se incremente el númerode antígenos candidatos para el desarrollode nuevas vacunas.

Vacunología reversa enenfermedades víricas

Fundamentalmente se aplica en el caso delos virus ARN, aunque también ha sido des-crita en los virus ADN. La genética reversaha permitido la introducción de muta-ciones marcadas, inserciones y delecionesen el genoma de virus vivos utilizadoscomo virus vacunales. La ingeniería gené-tica ha permitido atenuar virus, modificarla especificidad de hospedador y obtenervirus vacunales deficientes, incapaces dereplicarse en los hospedadores vacunados.

Estas estrategias se aplican también al de-sarrollo de nuevas estrategias vacunales yse utilizan ampliamente en la caracteriza-ción de la estructura y función de losgenes individuales o secuencias codifi-cantes de virus.

La tecnología de genética reversa implica,en el caso de los virus ARN, la generaciónde una copia de ADN complementario(ADNc) a partir del ARN, por transcripciónreversa llevada a cabo in vitro, seguido dela generación de virus vivo modificado portransfección de células permisivas con losADN clonados en plásmidos para generarun organismo vacunal vivo, pero modifi-cado, similar antigénicamente, pero seguro,como ha sucedido, por ejemplo, en el caso

de la vacuna frente a la gripe aviar por elvirus H5N1 a partir del H5N3 (figura 28).

Utilizando el bacteriófago Q-Beta y unvirus ARN de sentido positivo, Taniguchi(1978) puso a punto por primera vez estatecnología (310) con la que se desarrolló,en el caso del virus influenza aviar, una va-cuna en la que el virus manipulado con-tiene un gen de la hemaglutinina proce-dente de un virus H5N1 y un gen de laneuraminidasa procedente de un virusH2N3, utilizando un virus H1N1 como es-tructura vertebral (311). El virus vacunalresultante, H5N3, inactivado, induce pro-

tección completa en las aves frente al de-safío con el virus H5N1 altamente pató-geno.

Después ha sido aplicada con éxito parala generación de virus ARN que contienengenomas no segmentados o fragmentosgenómicos de sentido negativo. Tambiénhan sido objeto de estudios similares un


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Figura 28. Obtención de un virus quimera influenzaH5N3 por vacunología reversa.


gran número de virus ARNmc de sentidopositivo, incluyendo el coronavirus queproduce el SARS (síndrome respiratorioagudo severo) con genoma de gran ta-maño, lo que ha ayudado en el estudiode la biología de estos virus y el desarrollode nuevas vacunas vivas atenuadas.

La genética reversa se ha utilizado tam-bién para desarrollar un clon infecciosodel virus de la gastroenteritis transmisibleporcina (TGEV), que induce inmunidadlactogénica en cerdos inmunizados (312)y para desarrollar un virus modificado delsíndrome respiratorio y reproductivo por-cino (PRRS), que puede ser utilizado comouna vacuna DIVA (Differentiating Infectedand Vaccinated Animals) para ayudar a di-ferenciar entre los animales vacunados ylos infectados (313).

También se ha utilizado una estrategia degenética reversa en el desarrollo de va-cunas frente a la fiebre aftosa, peste por-cina clásica y enfermedad de Newcastle.Más recientemente, se han utilizado sis-temas de genética reversa para el desa-rrollo de virus ARNbc segmentados, inclu-yendo el virus de la lengua azul,introduciendo la posibilidad de disponerde un nuevo tipo de vacuna para este tipode virus (314) (ver después).

Las vacunas desarrolladas recientementea partir de flavivirus defectivos en la en-capsidación, en un ciclo simple (DisabledInfectious Single-Cycle, DISC) (315), im-plican la deleción de un ORF para unaproteína crítica implicada en la replicacióndel virus o en la formación de la cápsida.El virus puede aislarse en células que ex-presan esa proteína limitante, proporcio-nando así la proteína necesaria en trans.Cuando esos virus se inoculan en ani-

males, solamente son capaces de com-pletar un ciclo de replicación sin producirprogenie. Las vacunas basadas en esta es-trategia son más inmunógenas que las va-cunas de virus inactivado y carecen de losproblemas asociados a las vacunas vivas(OIE, 2010).

Vacunas de subunidades. Vacunasrecombinantes

Una vacuna de subunidades puede defi-nirse como la formulada a base de un pre-parado de subunidades antigénicas, en laque pueden estar incluidas moléculas dedistinta naturaleza, como lipopolisacá-ridos, proteínas, polisacáridos, mezclas depolisacáridos y proteínas, fracciones mi-crobianas, toxoides, extractos ribosó-micos, etc., procedentes de la síntesis quí-mica, o a partir de preparados naturaleso modificados mediante la intervenciónbiotecnológica y purificados o semipurifi-cados.

Las vacunas de subunidades representanla primera innovación importante en elcampo de la vacunología. La BiologíaMolecular y la Ingeniería Genética hanproporcionado las técnicas necesariaspara producir una molécula simple, pon-gamos por caso una proteína, a partir deun sistema procariota o eucariota, con laparticularidad adicional de que en sis-temas procariotas el sistema de produc-ción de la molécula puede permitir su lo-calización en la superficie de la bacteria oen su periplasma, como cuerpos de inclu-sión insolubles o secretados en el medio.

En Medicina Humana, los primeros ejem-plos de vacunas de subunidades fueron losdesarrollos de la vacuna de la hepatitis B apartir de proteínas de la cápsula altamente


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purificadas (316) y una vacuna acelularfrente a Bordetella pertussis, el agente dela tos ferina, a base de tres proteínas tam-bién altamente purificadas, incluyendo unatoxina detoxificada genéticamente (317,318). En el campo veterinario, un buenejemplo de vacuna de subunidades fue lavacuna frente a E. coli K99, contra la dia-rrea de los terneros, que procede ya de1979 (319) y que representa un antígenoinmunógeno que mantiene su estructuratridimensional, basado en las fimbrias K99,que fueron extraídas mediante tratamientotérmico a partir de las bacterias, mante-niendo su estructura nativa. Un ejemplomás reciente está representado por la va-cuna frente al circovirus porcino tipo 2(PCV2) (320), que incluye una proteína ví-rica expresada en un sistema de baculo-virus.

Las subunidades vacunales pueden pre-sentar algunas ventajas sobre las vacunasvivas atenuadas o las vacunas inactivadas,incluyendo la capacidad para inducir unafuerte respuesta inmune, tanto humoralcomo celular. Además son seguras ypueden utilizarse en combinación conotras vacunas de subunidades, aunque sueficacia depende de la inmunidad protec-tora que sean capaces de inducir por ino-culación de una proteína o un grupo deproteínas recombinantes. Por otra parte,las vacunas de subunidades pueden sercaras de producir (al menos en el caso dealgunas glicoproteínas) y pueden requerirel uso de adyuvantes para exaltar la res-puesta inmune.

Una de las principales ventajas de estetipo de productos es que son compatiblescon métodos DIVA, siempre que el antí-geno no sea utilizado como marcador. Porejemplo, en el caso del herpesvirus bo-

vino, la glicoproteína gD ha sido utilizadacon éxito en formulaciones de subuni-dades. Aunque la inmunización con gD esprotectora a nivel individual, no reduce laprevalencia del virus en el campo, circuns-tancia que limita su uso (321). En el casode la peste porcina clásica, aunque las va-cunas convencionales producen una in-munidad rápida y efectiva en la preven-ción de la transmisión de la infección, sudesventaja radica en la imposibilidad dediferenciar animales infectados de vacu-nados, por lo que una vacuna a base dela subunidad E2, comercializada en la ac-tualidad, aunque induce una inmunidadmás lenta y reduce, pero no previene ladiseminación (eliminación) del virus, per-mite una estrategia DIVA, lo que facilitasu uso en campañas de erradicación de laenfermedad (OIE, 2010).

En la actualidad se dispone de vacunas desubunidades en una amplia variedad deenfermedades infecciosas animales porvirus, como BVDV (diarrea vírica bovina),BRSV (virus respiratorio sincitial), PI3 (virusparainfluenza 3), rotavirus y coronavirus, yal menos a nivel experimental, todas ellashan superado con éxito las pruebas de de-safío pertinentes, aunque por el momentono se comercializan. En el caso de las bac-terias, las vacunas de subunidades tienenmás éxito que sus homólogas virales, pro-bablemente en razón de su bajo coste y laefectividad del tipo de respuesta inmuneque inducen (tipo Th2); están disponibles,por ejemplo, frente a patógenos respirato-rios como Mannheimia haemolytica yActinobacillus pleuropneumoniae, incor-porando toxinas RTX (leucotoxinas y to-xinas Apx) producidas por estos microor-ganismos, que se añaden a cuerposbacterianos con buenos resultados, igual


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que sucede en el caso de las proteínas delreceptor de la transferrina (principalmenteTbpB). También se comercializa una vacunafrente a la rinitis atrófica que contiene underivado no tóxico de la toxina dermone-crotóxica producida por Pasteurella multo-cida, expresada en E. coli, junto con unabacterina de Bordetella bronchiseptica(OIE, 2010).

La producción de las subunidades antigé-nicas puede llevarse a cabo, bien por pro-cedimientos bioquímicos convencionales,o bien mediante tecnologías de ADN re-combinante. Estas últimas implican unamplio rango de sistemas de expresión enprocariotas o en eucariotas, incluyendocélulas de levaduras, de insectos o plantas(322), mediante varias estrategias de ex-presión integradas o transitorias. Los mé-todos convencionales son útiles en al-gunos casos en los que no es apropiadala expresión recombinante, como sucedeen el caso de antígenos que requieren unensamblaje complejo, por ejemplo en lasfimbrias, o cuando es necesaria una mo-dificación postraduccional.

Campylobacter jejuni es una especie bac-teriana que glicosila muchas proteínas dela superficie bacteriana y, como tal, paraexpresar sus proteínas se le prefiere a unsistema de expresión heterólogo, aunqueE. coli ha sido modificada genéticamentepara poder llevar a cabo la misma función(glicosilación de las proteínas) (323).

La estrategia recombinante para la pro-ducción de vacunas de subunidades con-siste en clonar el gen que codifica para elantígeno protector de interés en un orga-nismo secundario, preferiblemente no pa-tógeno, capaz de expresar el inmunógenoen su forma nativa o con una alteración

mínima. A partir de este momento puedeser expresada y recogida utilizando la me-todología tradicional de producción deantígenos bacterianos o transferida a unvector vivo no patógeno. Las vacunas desubunidades recombinantes carecen delos riesgos que se asocian con la manipu-lación de los microorganismos patógenosy de los que se asocian con productosvivos o inactivados revertientes a unaforma virulenta debido a una inactivaciónincompleta o una deficiente atenuaciónde los productos originales. En cualquiercaso, la ventaja más importante derivadade la tecnología del ADN recombinantetiene que ver con la caracterización com-pleta del inmunógeno y de los productosresultantes, lo que representa ventajas evi-dentes para su comercialización (324).

En todos los tipos de vacunas recombi-nantes, cualquiera que sea la estrategiautilizada en su producción, la identifica-ción de las proteínas o de los epítopos im-plicados en la inducción de una respuestainmune protectora, es crítica. A este res-pecto, la genómica, la proteómica y labioinformática han permitido en los úl-timos años el desarrollo de metodologíascapaces de llevar a cabo la identificaciónde epítopos protectores, incluyendo laidentificación de moléculas inductoras deprotección cruzada o funcionalmente si-milares. Incluso, la combinación de estastres herramientas científicas ha permitidoel desarrollo de candidatos vacunalesantes de que el patógeno hubiera siquierasido cultivado en el laboratorio (325),como ha ocurrido en el caso de la hepa-titis B en el hombre. La tecnología recom-binante también puede generar epítoposde fusión, más inmunógenos que las mo-léculas independientes, como se ha de-


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mostrado en el caso de los paramyxovirus,a partir de las glicoproteínas F y HN (326).La tecnología recombinante y las estrate-gias de subunidades, conjuntamente,están comenzando a revolucionar, y loharán mucho más en un futuro inme-diato, la Vacunología Veterinaria.

En la práctica, la producción de una subu-nidad vacunal mediante la tecnología re-combinante requiere, primero, la selecciónde un sistema de expresión adecuado, quedepende de la naturaleza de la molécula(proteína) a expresar. Constituyen factorescríticos, al respecto, la producción de unepítopo inmunológicamente protector, unsistema de producción asequible, al igualque la purificación y extracción e interfe-rencia mínima con las proteínas del hospe-dador.

Sistemas de expresión

Expresión en bacterias. En la produc-ción de proteínas no glicosiladas, la expre-sión en procariotas (por ejemplo, E. coli oS. Typhimurium) es un recurso excelente.En la actualidad se están produciendo ungran número de moléculas de interés ve-terinario en procariotas, incluyendo, porejemplo, la proteína G del virus respira-torio sincitial expresada en E. Coli (327,328), antígenos del virus de la leucemiafelina, igualmente expresada en E. coli(329), y LPS de Shigella sonnei expresadoen V. cholerae y Bacillus brevis (330).También se ha utilizado la cepa BCG deM. tuberculosis como vector para la ex-presión de antígenos vacunales para otrasenfermedades infecciosas animales.Además hay que añadir un importantenúmero de especies de procariotas co-mensales que están siendo evaluadascomo vectores bacterianos, incluyendo

Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillusy Staphylococcus, además de otras debacterias patógenas previamente ate-nuadas, como Shigella, Bacillus, Yersinia,Vibrio, Corynebacterium y Bordetella.

Habitualmente, los vectores bacterianospara la expresión de proteínas han sidoatenuados con anterioridad mediante ladeleción de genes que se requieren paraprocesos metabólicos clave de su biología,o de genes asociados a la virulencia delmicroorganismo.

Mientras que la expresión en procariotases eficiente y adecuada para la produc-ción de un amplio rango de inmunó-genos, incluyendo unas pocas proteínasnativas glicosiladas, la producción de mu-chas proteínas víricas en sistemas de pro-cariotas no resulta conveniente, porque lafalta de glicosilación no proporciona in-munogenicidad protectora, pese a que síproduzcan respuesta inmune (331).Además, la presencia de LPS y otros com-ponentes pirogénicos introduce compli-caciones a modo de interferencia y reac-ciones en el punto de inoculación, por loque para la expresión de glicoproteínas yotras proteínas modificadas los sistemaseucariotas son más convenientes, inclu-yendo levaduras, células de insectos,plantas o células de mamíferos.

La expresión en levaduras, principal-mente Saccharomyces cerevisae, fue uti-lizada por primera vez para producir unavacuna de subunidades frente al virus dela hepatitis B (332) autorizada ya en 1986.Tanto S. cerevisiae como Pichia pastorisson dos levaduras utilizadas comúnmenteen investigación, comparables a los sis-temas de procariotas (procesado, coste,escalado, etc.), incluso en lo que se refiere


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a la modificación genética, aunque a sufavor incluyen la capacidad de expresarproteínas glicosiladas, ausencia de piró-genos y la circunstancia de que los com-ponentes procedentes de las levaduras noson excesivamente inmunogénicos, lo queles hace ser preferidos en la producciónde antígenos vacunales en Veterinaria,como sucede, por ejemplo, en el caso dela proteína de la nucleocápsida de loshantavirus (333), la proteína E del virus dela encefalitis japonesa o la glicoproteínaD del herpesvirus equino tipo 1 (334).

Los sistemas de expresión basados encélulas de insecto utilizan células de le-pidópteros con un baculovirus recombi-nante diseñado para expresar los pro-ductos génicos bajo el control de unfuerte promotor (polyhedron), dandocomo resultado una abundante produc-ción de proteína inmunológicamente ac-tiva. Estos sistemas también producenproteínas glicosiladas, solo que los pa-trones de glicosilación de las células de in-secto son más precisos y se piensa quetienen un mayor potencial como inmunó-genos protectores. En 1999 se describió(335) la expresión de varias proteínas es-tructurales del virus de la enfermedad deGumboro en un sistema de este tipo (cé-lulas de insecto/baculovirus). La limitaciónprincipal del sistema tiene que ver con laincapacidad para producir densidadesaltas por parte de las células, aunque de-sarrollos recientes en medios sintéticos, li-bres de suero, que incorporan surfac-tantes de lípidos, consiguen densidadesmás altas de células en fermentaciones degran escala, lo que reduce los costes deproducción (336).

Los sistemas de expresión viral son elmétodo preferido para la producción co-

mercial de glicoproteínas nativas con des-tino a vacunas frente a enfermedades ví-ricas, como sucede, por ejemplo, en elcaso de la proteína gp50 del virus de laenfermedad de Aujeszky o la gp63 delvirus de la viruela porcina, o la expresiónde proteínas del virus de la enfermedadhemorrágica del conejo en el poxvirus delcanario (337). Esta tecnología se inició,originalmente, con el virus vaccinia comovector y, por lo general, se utilizan virusno asociados con enfermedad (baculo-virus) o con procesos benignos, o bienvirus patógenos previamente atenuadospor deleción de genes de virulencia.

La replicación competente de los vectoresvíricos puede producir progenie vírica, locontrario de lo que ocurre con vectoresdefectivos, lo que permite su uso comovehículos vacunales. En la actualidadexiste un número importante de vacunasbasadas en vectores de virus ADN, inclu-yendo principalmente poxvirus y herpes-virus, que han sido autorizados para sucomercialización (338); algunos han sidocitados ya, como el virus vaccinia, el pox-virus de la viruela del canario, a los que sesuman el virus de la viruela aviar y el her-pesvirus del pavo. Por otra parte, existenotros vectores víricos ya evaluados o enproceso de evaluación o de mejora, queincluyen virus ARN, como el de la encefa-litis equina venezolana, el virus de la en-fermedad de Newcastle o el virus espu-mante felino, así como otros virus ADN,incluidos adenovirus, herpesvirus y pox-virus. Especialmente los virus de la viruelaaviar y la viruela del canario han sido uti-lizados como vectores en la expresión deproteínas vacunales frente al virus de lainfluenza equina y el de la leucemia felina(339, 340), mientras que los herpesvirus


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del pavo lo han sido en el caso de la en-fermedad de Gumboro y adenovirus hu-manos, y los virus de replicación defi-ciente lo han sido en el caso de vacunascontra la fiebre aftosa (341).

Aunque la expresión de proteínas en cé-lulas de mamífero es cara, en el caso dealgunas glicoproteínas virales es crítica,como ocurre cuando la glicosilación pos-traduccional es importante en el plega-miento adecuado, así como para la gene-ración de epítopos específicos.

En general, puede emplearse casi cual-quier línea celular, a condición de que estélibre de agentes extraños, que no sea tu-morogénica y que crezca bien, preferible-mente en suspensión. Otra consideracióncrítica tiene que ver con que el sistema deexpresión secrete las glicoproteínas en elmedio y no se retengan en el interior dela célula, pues, por un lado, la sobreex-presión de muchas proteínas puede con-ducir a la muerte de la célula debido a lanaturaleza tóxica de muchas proteínas,sobre todo en el caso de proteínas víricas,y, por otro lado, si las células tienen queser lisadas para extraer el producto, estepaso añadiría costes excesivos a la pro-ducción, ligados además a la necesidadde crecimientos con mayores densidadesde células. Por el contrario, si el productose secreta al medio de cultivo, la masa ce-lular puede mantenerse a lo largo de unperiodo de duración mayor y pueden lle-varse a cabo varias recogidas del pro-ducto. Puesto que la mayoría de las glico-proteínas se asocian con las membranas,se requiere que la separación del anclajepermita la secreción de la glicoproteína almedio.

Recientemente se han desarrollado bio-factorías para proteínas recombinantes yproductos biológicos, como sucede conlas plantas modificadas genéticamente,capaces de producir proteínas glicosiladassemejantes a las que producen los euca-riotas, y en consecuencia utilizables en va-cunas orales con mínimo coste de proce-sado.

Partículas semejantes a virus

Las partículas semejantes a virus son es-tructuras supramoleculares compuestasde una o más proteínas recombinantesformadas por autoensamblaje, con un ta-maño que va de 20 a 100 nm. Pueden serde tipo icosahédrico o forma bacilar, de-pendiendo de su origen (Jennings yBachmann, 2008), y tienen la ventaja deque presentan el antígeno en una deter-minada estructura, lo que incrementa suinmunogenicidad.

Se pueden utilizar bien como vacunas obien como vehículos portadores para fu-siones genéticas (vacunas quiméricas, verdespués), incorporadas o unidas covalen-tamente a otros antígenos.

En Medicina Humana, este tipo de pro-ductos han sido estudiados en profun-didad en los últimos años, especialmenteen el caso de las vacunas frente al virus dela hepatitis B [antígeno de superficie delvirus de la hepatitis B (HBsAg-VLP)] y elvirus del papiloma, y ambas están dispo-nibles comercialmente (342), mientrasque en el caso de las enfermedades infec-ciosas de los animales existen en la actua-lidad varios proyectos en desarrollo, inclu-yendo una vacuna contra la lengua azul yotras frente a rotavirus y parvovirus (OIE,2009). En el caso de la VP6 del rotavirus


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bovino, forman partículas de este tipoque son muy inmunógenas y confierenprotección frente al desafío. Otros ejem-plos incluyen el virus de la inmunodefi-ciencia humana tipo 1, las partículas se-mejantes a virus del virus dengue, de losnorovirus y de la influenza A.

En el caso de partículas semejantes a viruscomo portadores, se incluyen el antígenodel núcleo del virus de la hepatitis B(HBcAg VLPs) (343), de la proteína M2 delvirus influenza o de la malaria (344, 345).Algunas de las vacunas a base de partí-culas semejantes a virus han sido ensa-yadas para su administración en mucosas(OIE, 2009).

Las partículas semejantes a virus ofrecenla ventaja de su alta seguridad, su simila-ridad a las estructuras bacterianas o ví-ricas, la posibilidad de ser producidas agran escala y la de combinarlas con otrasmoléculas, como los adyuvantes. La inmu-nización induce una respuesta de anti-cuerpos rápida y fuerte y, a semejanza delo que ocurre con los virus o las bacterias,están dispuestas copias múltiples de losantígenos en una estructura ordenada, re-petitiva, casi cristalina, que puede unirseal receptor de la célula B, activándola e in-duciendo una respuesta de IgM indepen-diente de células T (346), que se une auna interacción con el sistema del com-plemento, lo que produce un incrementode la fagocitosis. Además, la estructurade las partículas semejantes a virus tam-bién activan las células dendríticas y sub-siguientemente la presentación cruzadadel antígeno. En algunos casos, como su-cede en el caso de la proteína L1-VLP delvirus del papiloma, activa directamente lascélulas dendríticas.

El inconveniente de la no estimulación delas células T se ha intentado resolver com-binando este tipo de partículas con adyu-vantes moleculares, como CpG-ODN(347) (CpG-oligodeoxinucleótidos, unamolécula corta, sintética, de una sola ca-dena de ADN, que contiene una citosinaseguida de una guanina, con un puentefosfodiéster) y ARN monocatenario.

Virus quiméricos (vacunas dequimeras)

Una quimera es una proteína artificial for-mada por la unión de dos proteínas dife-rentes. Los virus quiméricos son virus re-combinantes que pueden contener partesde dos genomas víricos estrechamente re-lacionados; por ejemplo, un virus quimé-rico podría ser uno que contiene genes yproteínas estructurales de un serotipo ví-rico y genes no estructurales de otro se-rotipo diferente del mismo virus (de lamisma especie de virus). También podríaser un virus que contiene partes del ge-noma de diferentes miembros pertene-cientes a la misma familia de virus.

La ventaja de este tipo de recombina-ciones es que una dosis simple de un virusquimérico puede contener el repertoriocompleto de antígenos relacionados es-trechamente de un patógeno, con sus po-sibles variaciones, lo que permite quepueda inducir respuesta inmune frente avarios (múltiples) patógenos víricos perte-necientes a diferentes serotipos de lamisma especie vírica.

La disponibilidad de clones de ADN com-plementario (ADNc) infeccioso de dife-rentes virus ARN utilizando la tecnologíagenética reversa ha permitido el desarrollode estrategias vacunales nuevas. Se han


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construido pestivirus quiméricos utili-zando clones infecciosos de ADNc quecontienen el genoma estructural del virusde la peste porcina clásica o del virus dela diarrea vírica bovina.

Algunos ejemplos de virus quiméricos conaplicación práctica en la vacunación estánrepresentados, por ejemplo, por los cons-truidos por recombinación entre el virusde la diarrea vírica bovina y el de la pesteporcina clásica. En un caso, en el virus dela diarrea vírica bovina, se reemplazó lasecuencia que codifica para la proteína E2de la cepa CP7, por la correspondiente ala cepa del virus de la peste porcina clá-sica Alfort 187; también se construyó unvirus quimérico reemplazando la se-cuencia de la proteína E2 de la cepa C delvirus de la peste porcina clásica por la E2del virus de la diarrea vírica. Ambas cepasse atenúan para el cerdo e inducen inmu-nidad completa frente a la peste porcina,además de que permiten diferenciar entrecerdos enfermos y vacunados (348).También se han construido virus quimé-ricos con circovirus utilizando clones in-fecciosos ADNc del circovirus porcino tipo1 (PCV1), en el que se utilizó la proteínade la cápsida del PCV2 para reemplazar lacorrespondiente al primero (PCV1-2) o alcontrario (PCV2-1); como en el caso an-terior, esta modificación está atenuadapara los cerdos e inducen inmunidad pro-tectora frente a PCV-2 (349). En el casode los flavivirus se han generado quimerasreemplazando la secuencia de proteínasestructurales del virus de la fiebre amarilla(YF-17D) con la del virus de la encefalitisdel Nilo Occidental, con el resultado deque el recombinante induce buena res-puesta inmune protectora en los caballosfrente al virus de la encefalitis (350), o

también quimeras entre el virus de la en-cefalitis japonesa y el del dengue, aunquepor la peligrosidad de esta familia de virusse recomienda mucha precaución anteposibles riesgos de cambios de virulenciaen ellas.

Vacunas de ADN

La introducción de la metodología gené-tica en la ciencia de las vacunas (vacunasde ADN) es todavía reciente, pues no fuehasta comienzos de los años 90 cuando secomprobó por primera vez que la inyecciónde secuencias de ADN en animales desen-cadenaba una respuesta inmune frente ala proteína codificada en la secuencia in-corporada (351). Indudablemente, el des-cubrimiento incorporaba importantes ven-tajas respecto del uso de vacunas vivasconvencionales, pues son más seguras,ofrecen la posibilidad de vacunar frente adiferentes antígenos en una sola inocula-ción, son asequibles y no están condicio-nadas por la cadena de frío, aunque su efi-cacia variaba sustancialmente en funciónde la técnica utilizada.

Este tipo de vacunas se basan en el usode plásmidos bacterianos codificantes deantígenos que son capaces de inducir unarespuesta inmune específica después desu inoculación en hospedadores conve-nientes. El plásmido ha de incluir el genque codifique para el antígeno diana,bajo el control transcripcional de un pro-motor (uno de los más utilizados corres-ponde a citomegalovirus) y una secuenciaseñal de poliadenilación (poly-A) con el finde proporcionar la estabilidad necesaria yaumentar la eficacia de la traducción. Elplásmido suele contener, además, unorigen de replicación bacteriano y un gende resistencia a un antibiótico para faci-


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litar su selección y producción en bacte-rias (352).

La inmunización se lleva a cabo por lacaptación del plásmido purificado por lascélulas musculares (miocitos) del hospe-dador, cuando se inocula intramuscular-mente, u otro tipo de células somáticas(353), en las que persiste extracromosó-micamente en el núcleo. Aunque en elmúsculo se localizan, además de mio-citos, células dendríticas y macrófagos,el tipo celular que se transfecta habitual-mente son los primeros (miocitos) (354).Una vez en el interior de estos, los com-ponentes del plásmido inician la trans-cripción y expresión de proteínas en el ci-toplasma, proporcionando la célula lasmodificaciones postraduccionales nece-sarias al antígeno para que este man-tenga su estructura terciaria (355), resul-tando al final en la presentación de unaforma de la proteína procesada normal-mente o bien modificada al sistema in-mune.

Los miocitos transfectados pueden ge-nerar respuestas citotóxicas mediante lapresentación del antígeno en unión de lasmoléculas del sistema mayor de histocom-patibilidad de clase I (356), aunque comoestas células no expresan moléculas coes-timuladoras, hace que este tipo de pre-sentación antigénica, con toda probabi-lidad, tenga poco éxito. Además, se hadescrito que los miocitos pueden secretarantígeno sin procesar, pudiendo ser cap-tado en este caso por las células B, inician-dose así una respuesta humoral, y pormacrófagos o células dendríticas (357),que le procesarían y presentarían unido amoléculas de clase I, lo que iniciaría unarespuesta T citotóxica, o de clase II, esti-mulando células T cooperadoras, que a su

vez podrían secretar citoquinas que po-tenciarían la respuesta T y B y proporcio-narían una respuesta equilibrada (OIE,2010).

Las células presentadoras de antígenotambién podrían captar el antígeno através de cuerpos apoptóticos o necró-ticos de las células que han sido transfec-tadas con el plásmido (358).

El uso de plásmidos purificados ofrece mu-chas ventajas sobre otros vehículos de li-beración de antígenos. Una de las ventajasprincipales es que las vacunas de ADN in-ducen tanto una respuesta humoral comode base celular frente a muchos agentespatógenos. También existen evidencias deque las vacunas de ADN pueden induciruna inmunidad de larga duración, que serelaciona con una mayor eficacia. Comono existe vector propiamente dicho, no seinduce respuesta inmune frente a él, loque supone la posibilidad de que este tipode vacunas puedan administrarse repeti-damente, cuantas veces sea preciso, sin in-terferencia de los anticuerpos, lo que enel caso de los anticuerpos maternales, porejemplo, que retrasa la edad de vacuna-ción en algunas especies animales, repre-senta una ventaja, aunque, pese a losavances producidos en los últimos años,aún se precisa mayor número de investi-gaciones y conocimiento, en particular enlo que se refiere al diseño de vectores másconvenientes y el estudio de respuestas decélulas T citotóxicas (Tc). En el mismo sen-tido, la falta de conocimiento respecto dela concentración de la proteína expresadain vivo, hace que no se pueda concluir conprecisión acerca de la respuesta inmune.Otro tanto se puede afirmar en relacióncon los sistemas de administración, quedeben mejorarse desde el punto de vista


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de una mayor eficiencia en la transfección,incluyendo el uso de electroporación(359), o el de citoquinas como inmuno-moduladores (360). También se ha seña-lado la necesidad de optimizar otros ex-tremos, tales como los que se refieren amodificaciones precisas (ingeniería gené-tica) para cambiar la localización subce-lular, estudios de adyuvantes, bien comoun gen adicional o bien como una sus-tancia o molécula coadministrada, estu-dios sobre presentación antigénica, etc.

Desde un punto de vista técnico, las va-cunas de ADN son fáciles de manipular,producir y purificar, lo que permite queen un tiempo reducido (meses) puedanconstruirse y evaluarse en modelos ani-males. También se consideran muy esta-bles, manteniendo su actividad largotiempo, sin precisar de la dependenciade la cadena de frío y de bajo coste deproducción, además de otras ventajas re-feridas, por ejemplo, a la opción de graninterés que representan en el caso de mi-croorganismos de difícil cultivo o peli-groso, en condiciones de laboratorio(361). Su seguridad se ha demostrado envarios ensayos llevados a cabo en dis-tintas especies animales, incluyendo hu-manos (362), aunque han sido los roe-dores los animales de experimentaciónmás utilizados. Recientemente, sin em-bargo, se han llevado a cabo distintosdesarrollos en otras especies diana queincluyen desde mascotas a animales do-mésticos productores de alimentos ypeces de cultivo, además de programaspara animales salvajes, en todas lascuales representan, cuanto menos, unaalternativa de interés.

En los últimos años se están llevando acabo también iniciativas muy interesantes

relacionadas con la modulación y prolon-gación de la vida activa de las células den-dríticas, con el fin de mejorar la presenta-ción antigénica (ver después) como otrocamino de interés en la mejora de la efi-cacia de este tipo de vacunas. Se están lle-vando a cabo, por ejemplo, ensayos clí-nicos en vacunas de ADN paraenfermedades humanas, como el sín-drome de inmunodeficiencia adquirida, lagripe, la malaria o la tuberculosis, y en elcaso de los animales frente a la fiebre af-tosa, enfermedad de Aujeszky, peste por-cina clásica, rabia, moquillo canino o bru-celosis, entre otras. Otras propuestasincluyen vacunas de ADN frente a la hor-mona del crecimiento en cerdos enAustralia, frente al virus de la necrosis he-matopoyética infecciosa en el salmón enCanadá, la encefalitis del Nilo occidentalde los caballos y el melanoma de los pe-rros en los Estados Unidos (363), etc.

También se puede inducir una buena res-puesta inmune con las vacunas de ADNutilizando la vía intradérmica, propuestarealizada por varios investigadores (366,367) que, a la luz de los últimos descubri-mientos realizados en el hombre, ratón yganado porcino, se justificaría por la exis-tencia de varios tipos de células dendrí-ticas en la dermis (368, 369).

Uno de los inconvenientes actuales de lasvacunas de ADN es la baja inmunogeni-cidad obtenida tanto en el caso delhombre como en los grandes animales, loque hace que generen respuestas más dé-biles que con otras vacunas de nueva ge-neración que utilizan vectores virales o pro-teínas recombinantes. Por otra parte, unadesventaja actual reside en que no puedepreverse la respuesta inmune que se ge-nera debido a que no se conoce cuál será


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Figura 29. El plásmido inoculado intramuscularmente transfectaría miocitos o CPA e incluso, una vez liberadopor los miocitos, podría también ser captado por las CPA o a partir de células transfectadas apoptóticas o ne-cróticas. Después de captar el Ag, las CPA migrarían hacia los ganglios linfáticos regionales a través del vasoaferente, donde presentarían el péptido a los linfocitos T, activándolos. Además, las células T secretarían cito-quinas y cooperarían en la activación de las células B que hubieran captado el antígeno sin procesar. Los lin-focitos B y T activados abandonarían el ganglio a través de los vasos linfáticos eferentes. Kutzler y Weiner,2008 (364). Modificado por Poderoso García T., 2011 (365).


la concentración de la proteína expresadain vivo y a que los niveles de transfecciónsuelen ser bajos por lo general (370), razónpor la que en la actualidad se están eva-luando diferentes estrategias para tratar demejorar la efectividad, tanto en lo que serefiere a optimizar el plásmido para incre-mentar la expresión génica, a través delempleo de promotores más potentes,como mediante la incorporación de ele-mentos reguladores o potenciadores de latranscripción (371).

También se puede optimizar la secuenciagénica que codifica el antígeno de interésmediante la inclusión de secuencias Kozak(372), de secuencias que aumenten la es-tabilidad del ARNm (373) o de secuenciasque favorezcan la captación y/o presenta-ción del anfígeno (374), sin olvidar la po-sibilidad de coadministrar citoquinas, qui-mioquinas o moléculas con actividadinmunomoduladora, o diferentes mé-todos de inoculación, que tambiénpueden incrementar la respuesta.

Algunos ejemplos, en Sanidad Animal, devacunas ADN incluyen, en el caso delcerdo, una vacuna de ADN con la que seha inducido protección frente a la pesteporcina clásica inmunizando con un plás-mido que expresa la proteína E2 (375),igual que frente al virus de la fiebre aftosainoculando un plásmido que codifica todala secuencia del virus con una mutaciónque impide su replicación, o en otro caso,con un plásmido que contiene los genesde la VP1 (serotipos O y Asia 1) y el gen3C del serotipo O (376), y en otro casocon un plásmido que contiene las secuen-cias del precursor de la proteína estruc-tural P1-2A y de las no estructurales 2C y2D (377). También se ha autorizado el usode una vacuna de ADN frente al virus de

la encefalitis del Nilo Occidental para suuso en caballos (378) y en otro caso frenteal virus de la necrosis pancreática infec-ciosa de los peces (379).

Otras estrategias de atenuación

Vacunas delecionadas en genesde virulencia

El conocimiento actual acerca de los fac-tores de virulencia de los microorganismospatógenos, unido a la disponibilidad dediferentes metodologías de la tecnologíadel ADN recombinante, ha facilitado in-ducir modificaciones en genes específicosde virulencia para su utilización en formade vacunas vivas atenuadas genética-mente. Debe mantenerse, a este respecto,un exquisito equilibrio, de tal forma quela modificación afecte exclusivamente ala virulencia del patógeno y no a su inmu-nogenicidad, lo que supone además quela estabilidad sea un requisito intocable,igual que la capacidad de crecimiento invitro o la facilidad para su administración.En general, en el caso de las bacterias, seprefieren modificaciones que atañen agenes que afectan directamente a fac-tores de virulencia o los que lo hacensobre rutas metabólicas críticas del micro-organismo.

Algunos ejemplos incluyen vacunas frentea salmonelas en el caso de las aves, comoS. enterica Enteritidis o Typhimurium, quereducen su excreción en heces, reducenla colonización e invasión y proporcionanprotección pasiva a través de la presenciade anticuerpos en los huevos. La primeravacuna autorizada en los EE.UU. fue ladenominada Megan Vac-1, obtenida apartir de S. enterica Typhimurium, modi-ficada genéticamente por la supresión de


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dos genes que son importantes para elcrecimiento y metabolismo microbiano,los genes cya (adenilato ciclasa) y crp (co-difica para CAP, una proteína activadoradel crecimiento) (380, 381), que en lapráctica da lugar a un microorganismocompletamente diferente, más próximo aHafnia alvei que a Salmonella, lo que pro-porciona ventajas desde el punto de vistade la posibilidad de contaminación. Elmismo sistema ha sido propuesto tam-bién, para su destino a la protección de lasalmonelosis por S. choleraesuis, en elcaso del cerdo (382). También se ha des-crito una vacuna delecionada en el genaroA de Streptococcus equi, para su uti-lización en el caso de los caballos (383).En el caso de virus, esta misma tecnologíase ha utilizado para el desarrollo de va-cunas marcadas (DIVA), que diferenciananimales vacunados de infectados, porejemplo, en el caso de la enfermedad deAujeszky por deleción de los genes gE yTK (384), y en el herpesvirus bovino tipo1 por deleción del gen gE (385), entreotros.

Vacunas marcadas. Vacunas DIVA

Con algunas de las vacunas convencio-nales, tanto de células completas inacti-vadas, como con vacunas vivas atenuadas,resulta difícil, en ocasiones, diferenciar si larespuesta inmune (ordinariamente res-puesta humoral, en suero) se correspondecon los resultados de la vacunación o si,por el contrario, los anticuerpos detectadosse deben a la presencia de infección o en-fermedad. Son ejemplos clásicos los de lavacunación de brucelosis en el ganado bo-vino con vacuna B-19 o los de la vacuna-ción frente a la fiebre aftosa con vacunasinactivadas. Especialmente en este último

caso, dada la gran trascendencia de la en-fermedad, el uso de vacunas está prohi-bido en países libres de la enfermedad.

La capacidad para identificar y seleccionardeterminados genes a partir de un micro-organismo patógeno cuando no se pro-pone la atenuación del mismo ha permi-tido el desarrollo de vacunas “marcadas“,porque combinadas con métodos dediagnóstico convenientes permiten dife-renciar los animales vacunados de los in-fectados (DIVA). Nos hemos referido aellas en varias ocasiones en este estudio.Tales vacunas DIVA y los métodos de diag-nóstico complementarios han sido desa-rrollados en un buen número de enferme-dades animales, incluyendo rinotraqueítisinfecciosa bovina (IBR), enfermedad deAujeszky, peste porcina clásica, fiebre af-tosa o gripe aviar, entre otras.

Frente a la enfermedad de Aujeszky, seprodujo hace años una de las primeras va-cunas modificadas genéticamente, autori-zadas por la UE. El producto consiste en unvirus atenuado (deleción del gen de la ti-midinquinasa) que, además, ha sido dele-cionado en el gen de la glicoproteína E(gE), que no resulta esencial para la repli-cación del virus, pero que juega un papelimportante en la difusión intercelular. Estamodificación en la estructura proteica delvirus, que no compromete su ciclo bioló-gico, como se ha dicho, se ha aprovechadopara desarrollar una metodología DIVA(386) que permite diferenciar animales va-cunados de infectados, mediante unaprueba ELISA de bloqueo de la gE. En elcaso de la rinotraqueítis bovina infecciosa,causada por el herpesvirus bovino tipo 1,también se delecionó, suprimiéndolo, elgen de la gE, con el mismo resultado prác-tico, incluyendo tanto el desarrollo de una


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prueba ELISA (387) como una PCR especí-fica (388). Finalmente, en el caso de la PPC,para la que existe una vacuna viva, ate-nuada, muy eficaz, que se utiliza donde laenfermedad es enzoótica, se han desarro-llado dos vacunas de subunidades basadasen la glicoproteína de la envoltura E2 quese produce en un sistema de baculovirus/células de insecto, acompañada porpruebas ELISA discriminatorias, como partedel sistema DIVA correspondiente. En elcurso de un brote de gripe aviar por virusinfluenza altamente patógeno que tuvolugar en Italia por el virus influenza H7N3(389), Capua et al. (2003 y 2004) (390,391) desarrollaron igualmente un sistemaDIVA para la diferenciación de aves vacu-nadas de infectadas, mediante una pruebaELISA sobre una vacuna en la que la neu-raminidasa correspondía a una proteína di-ferente (H7N1). Otras enfermedades paralas que la estrategia DIVA sería muy apro-vechable, pero que por el momento noestá disponible, incluyen la lengua azul, laenfermedad de Newcastle, la diarrea víricabovina y la arteritis vírica equina. Más re-cientemente, con ocasión del brote degripe aviar en el sudeste asiático, se desa-rrolló también un procedimiento de estetipo utilizando genética reversa para cons-truir una vacuna de virus quimera, a lo queya nos hemos referido antes, con el fin deproteger a las aves frente al virus H5N1 (elgen de la hemaglutinina fue obtenido deun virus H5N1 aislado de un brote en Asia,se inactivó y se combinó con el gen de laneuraminidasa procedente de un virusH2N3 sobre un virus “básico“ H1N1 –queproporcionaba los genes correspondientesa las proteínas PA, PB1, PB2, NP, M y NS–,desarrollando después un ELISA para de-tectar específicamente los anticuerpos

frente a N3 y N1: N3+ N1- indicarían vacu-nado; N3- N1+ indicarían infectado(Meeusen et al., 2007).

Vacunas de mucosas

La primera razón que justifica el uso delas mucosas como vía de inmunización esque la mayor parte de las enfermedadesinfecciosas afectan o inician el proceso in-feccioso en alguna superficie mucosa cor-poral, y en tales infecciones la aplicaciónde una vacuna directamente en la mucosainduciría una respuesta protectora (392),tal y como ocurre en infecciones deltracto gastrointestinal producidas por bac-terias (por ejemplo, por patotipos de E.coli), rotavirus y calicivirus, o infeccionesrespiratorias por micoplasmas, P. multo-cida, virus influenza o virus respiratoriosincitial.

Tanto en un caso como en otro (infec-ciones respiratorias o digestivas), la induc-ción de inmunidad local es crítica para lo-grar una protección eficaz, representandola IgA secretora (S-IgA o IgAs) el meca-nismo efector principal de la inmunidadadquirida local, siendo por ello el objetivoprincipal de la mayoría de las vacunas demucosas. También, otras inmunoglobu-linas, como la IgG, acceden a la superficiede las membranas mucosas y adquierenimportancia especial, fundamentalmenteen el caso de las infecciones respiratoriasy genitales, en las que ese mecanismo re-sulta más fácil.

Además de la inmunidad humoral, en lasmucosas se induce también una buena res-puesta de células Tc que, por ello, es un ob-jetivo perseguido habitualmente por partede las vacunas, aunque este aspecto está,respecto del primero, mucho más retra-sado, toda vez que solo algunas vacunas


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experimentales han demostrado que lo in-ducen y hasta la fecha la mayoría de estasvacunas son vivas atenuadas. En el ratónse ha demostrado hace unos años que lainmunización transcutánea, en la piel, conun péptido derivado del virus VIH, inducíauna respuesta de células Tc e inmunidad

protectora en el bazo y la mucosa gastroin-testinal, por migración de células dendrí-ticas (393), aunque la respuesta estabacondicionada a la administración de un ad-yuvante. En su conjunto, Gerdts et al.(2006) (394) han resumido las ventajas dela inmunización de mucosas:

La inmunidad en las superficies mucosasdel organismo está mediada por el tejidolinfoide asociado a las mucosas (Mucosa-Associated Lymphoid Tissues, MALT), querepresenta el mayor compartimento in-mune del organismo de los animales y elhombre, cuyas principales funciones hansido resumidas (Holmgren y Czerkinsky,2005): 1) proteger a las membranas mu-cosas de la infección y colonización poragentes patógenos; 2) tolerar los antí-genos derivados de los alimentos inge-ridos, partículas en suspensión en el airey microorganismos comensales queforman parte de la microbiota, y 3) pre-venir el desarrollo de cualquier respuestapotencialmente peligrosa frente a estosantígenos en el caso de rotura o deteriorode la cubierta mucosa.

Para poder llevar a cabo estas funciones,el MALT está equipado con mecanismosaltamente específicos, algunos de loscuales son especialmente relevantes parael desarrollo de vacunas de mucosas,como sucede con los sistemas de recono-cimiento de agentes patógenos a través

de los receptores TLR (Toll Like Receptors),CR (receptores del complemento), lectinasde tipo C, receptores NOD (Nucleotide-binding Oligomerization Domain) de tipo1 o tipo 2, que determinarán en conjuntoel resultado de la respuesta inmune. Envarios tipos de células inmunes se handescrito patrones de moléculas de reco-nocimiento (PRM, Pattern RecognitionMolecules) altamente conservados; se in-cluyen células presentadoras de antí-genos, linfocitos y células epiteliales si-tuadas en la capa mucosa y, especialmente,células dendríticas que expresan una am-plia variedad de tales moléculas de recono-cimiento.

A través de sistemas de señales químicas,los receptores inducen el reclutamientode las células dendríticas, las cualespueden entonces muestrear directamenteel antígeno desde la superficie externa orecibirle desde las células M, un tipo ce-lular altamente especializado. Dentro delfolículo linfoide, las células dendríticasmaduras presentan el antígeno a los lin-focitos para inducir una respuesta inmune


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Cuadro 2. Ventajas de la inmunización en mucosas.

Induce inmunidad protectora en el sitio de la infección.Induce tanto inmunidad sistémica como inmunidad en mucosas.Es eficaz y efectiva en presencia de anticuerpos maternales.No se produce reacción en el punto de inoculación de la vacuna y no necesita agujas.Se administra rápidamente (por ejemplo, vacunas orales, administradas con el alimento).


de mucosas. Dependiendo del estímuloinnato inicial, las células dendríticaspueden activar a las células efectoras pararegresar selectivamente a ciertos lugaresde la mucosa y cambiar el tipo de res-puesta inmune a Th1 o Th2. A este res-pecto, es importante que la capacidad delas células dendríticas para polarizar la res-puesta inmune está condicionada por lasecreción de IL-10 y de IL-6 a partir de lascélulas epiteliales, circunstancia que, en elcaso del intestino, da lugar a la inducciónde un tipo de respuesta inmune Th2.

En definitiva, las células dendríticas sonesenciales en los procesos iniciales quetienen lugar como consecuencia de la in-fección. Aunque todavía no se ha demos-trado en el caso de los animales domés-ticos, parece que la estimulación de lascélulas dendríticas por determinados com-ponentes vacunales, en particular por losadyuvantes que acompañan a los antí-genos, representa un importante puntoque será objeto de atención preferente enel próximo futuro de las vacunas (Gerdtset al., 2006).

Despues de dejar su huella en los tejidoslinfoides, las células efectoras abandonanel sitio de inducción y migran al sitioefector, que generalmente está situado enla lámina propia de las membranas mu-cosas. El tráfico de células efectoras escrucial para la comunicación entre los dis-tintos compartimentos del sistema in-mune de mucosas, lo que conduce al con-cepto de sistema inmune de mucosas“común“ aunque, pese a todo, el sistemaestá fuertemente compartimentalizado;de hecho, algunos de tales comparti-

mentos favorecen el tráfico de las célulasefectoras desde algunos sitios inductoresa otros sitios efectores.

El tráfico celular entre los compartimentosestá facilitado por una compleja red de in-teracciones mediadas por moléculas deadhesión (adhesinas) a mucosas, inte-grinas y quimioquinas que siguen la mi-gración específica de las células inmunesdesde los sitios inductores a los efectores(Gerdts et al., 2006). De este modo, lasquimioquinas y sus receptores son molé-culas importantes en la relación que existe


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Figura 30. Las células dendríticas captan y procesan el antígeno procedente de los agentes patógenos y lo pre-sentan a las células B y las células T CD4+ y CD8+, y las activan (395).


entre los sitios inductores con los sitiosefectores particulares y, como resultado,determinadas rutas son más favorablesque otras para inducir inmunidad en elsitio efector deseado; por ejemplo, la víaoral es más efectiva para inducir una res-puesta efectiva en la porción proximal delintestino delgado, colon ascendente,mamas y glándulas salivares, mientras quela vía intrarrectal lo es en el recto, la nasalo tonsilar lo es en el sistema respiratoriosuperior o en la mucosa genital, la vía va-ginal también en la mucosa genital, y lapiel en el intestino, datos, todos ellos, quedeben ser tenidos en cuenta para el di-seño de nuevos tipos de vacunas desti-nadas a la inmunización de mucosas.

Casi todos los tipos de vacunas disponi-bles comercialmente en la actualidad, in-cluyendo vivas atenuadas, inactivadas, desubunidades y de ADN, han sido pro-badas para su uso como vacunas de mu-cosas en una amplia variedad de especiesanimales, aunque no son más de unaveintena las que están autorizadas para

su administración por esa ruta (396) yotras muchas se encuentran todavía enfase experimental, esperándose que mu-chas de ellas se autoricen y se incorporenal mercado en un próximo futuro.

En términos generales, las vacunas quecontienen microorganismos vivos (ate-nuados o vectores) son más eficaces parasu administración en mucosas que lasinactivadas, dado que dependen de me-canismos de invasión tanto en el caso devacunas bacterianas como de vacunas ví-ricas, aunque con el fin de evitar losriesgos derivados de la posible reversióna formas virulentas, se está trabajandopara esta vía con vacunas de ADN o re-combinantes, que carecen de esosriesgos. Tales desarrollos, sin embargo,van de la mano del de los adyuvantes,dado que la efectividad de su respuestaes mucho menor que la de las vacunasvivas, como ya se ha indicado. Una va-cuna ideal de mucosas debe reunir unaserie de características que han sido refe-ridas (Gerdts et al., 2006):

En cuanto a las vías de inmunización,aunque en teoría todas son factibles, in-cluyendo la inmunización oral, intranasal,

intraocular, vaginal o rectal, razones prác-ticas hacen que en el caso de algunas es-pecies, como las aves, solamente se uti-


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Cuadro 3. Requisitos de una vacuna ideal de mucosas (Gerdts et al., 2006).

Segura, sin efectos colaterales ni en adultos ni en recién nacidos.Estable, en particular en el microambiente gastrointestinal.Que se disuelva y administre rápidamente (mediante spray, inyector u oralmente) y en pequeño volumen.Que atraviese la barrera mucosa.Que retenga el antígeno en la superficie mucosa uniéndose a las células epiteliales de la mucosa.Que estimule tanto la inmunidad innata como adaptativa en la mucosa.Que disponga (puedan utilizarse) de sistemas de administración que permitan mejorar la absorciónde la vacuna.Que asegure la búsqueda y localización de células efectoras en el sitio de infección.Que induzca una inmunidad de larga duración.


licen la vía oral y la intranasal, mientrasque en otras especies, tanto de animalesde compañía como productores de ali-mentos, en teoría al menos, pueden uti-lizarse todas, seleccionando aquella quepor razón de proximidad produce elefecto mayor; por ejemplo, si lo que sedesea es un efecto principal en el tractorespiratorio, se utilizará la vía intranasal,mientras que si se desea que el efectotenga lugar en el tracto digestivo, la víaelegida será la oral.

Presentación del antígeno en lasvacunas de mucosas

Por lo que se refiere a las posibilidadesque se ofrecen acerca del modo de pre-sentación del antígeno vacunal, la diver-sidad es la norma. Pueden utilizarse vec-tores vivos, micropartículas o liposomas.En relación con los vectores vivos, puedenutilizarse tanto vectores bacterianos comovíricos, aunque estos últimos son particu-larmente comunes. En cualquier caso, elvector permite que se ponga a disposiciónla proteína recombinante expresada en elpropio vector o la información genética,bien integrada en el genoma o en unplásmido. Un resumen de vectores vacu-nales autorizados para su uso en inmuni-zación de mucosas incluyen (Gerdts et al.,2006), el virus vaccinia (para vacunacontra la rabia), el de la viruela aviar (envacunas contra Newcastle y gripe aviar),el virus de la viruela del canario (en va-cunas contra el moquillo canino, rabia,leucemia felina, influenza equina, tétanos,encefalitis del Nilo Occidental o enfer-medad de Gumboro) y el herpesvirus delpavo (en vacunas frente a la enfermedadde Marek, Newcastle y Gumboro).

En el genoma de un microorganismopueden introducirse múltiples delecionespara producir mutantes que virtualmentepierdan toda su capacidad de producir en-fermedad y cualquier posibilidad de rever-sión a la virulencia, igual que insertargenes múltiples, capaces de codificar múl-tiples antígenos vacunales. En el primercaso, una vez que el microorganismo estáatenuado, puede utilizarse para trans-portar genes o plásmidos de ADN paraotros patógenos e inmunomoduladores(por ejemplo citoquinas) que permitan lainmunización de animales para producirinmunidad protectora frente a variosagentes de enfermedad al mismo tiempo(vacunas múltiples). Un vector ideal debecumplir una serie de condiciones que in-cluyen (Gerdts et al., 2006):

1) Que no sea patógeno para los animaleso el hombre;

2) que sea fácil de manipular;

3) que su producción sea fácil y de bajocoste;

4) que contenga un genoma estable;

5) que contenga sitios bien definidos parala inserción de genes extraños;

6) que sea fácil de administrar;

7) que no se integre en el genoma delhospedador, y

8) que induzca tanto inmunidad de mu-cosas como sistémica cuando se admi-nistre oral o nasalmente.

Vectores bacterianos. Los vectores bac-terianos vivos poseen un gran potencialcomo nuevas vacunas de mucosas, conventajas evidentes sobre las vacunas inyec-tables, utilizadas en la actualidad. Entreestas se incluyen, por ejemplo, su bajo


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coste y facilidad de producción, quepueden administrarse tanto oral como in-tranasalmente, que pueden incorporarsesin dificultades importantes genes ex-traños, que pueden inducir respuesta hu-moral y celular y que, si es necesario, posi-bles efectos adversos pueden controlarsecon antibióticos; en contra está la posibi-lidad de reversión a forma virulenta.

En el caso de Salmonella, E. coli o Shigellaatenuadas, pueden administrarse en mu-cosas y suministrar el antígeno específica-mente a las células presentadoras vía sis-temas de secreción bacterianos (397).También se han descrito vectores bacte-rianos que vehiculan plásmidos de ADN através de las mucosas y más reciente-mente también se han descrito como me-dios eficaces de administración de va-cunas de ADN en mucosas, envolturasbacterianas (bacterial ghosts) vacías decontenido, procedentes de bacteriasgramnegativas, patógenas o apatógenas(398).

Un resumen de la situación respecto devectores bacterianos vivos para inmuniza-ción frente a diferentes patógenos de in-terés veterinario fue revisado en 2003(399) destacando el uso de vectores deSalmonella spp para antígenos como latoxina Hly (fragmento B) de E. coli, L. mo-nocytogenes, Corynebacterium diphte-riae, virus de Aujeszky y diversos coccidiosy Theileria parva. Se incluyen tambiénotros vectores, como C. pseudotubercu-losis (antígenos de Dichelobacter no-dosus, Babesia bovis, Anaplasma margi-nale y Taenia ovis), Shigella flexneri, L.monocytogenes, B. anthracis (para toxinaiota de C. perfringens), Lactococcus lactis(para antígenos del virus de la enfer-medad de Gumboro –VP2– y rotavirus bo-

vino), Erysipelothrix rhusiopathiae (para laproteína P97 de Mycoplasma hyopneu-moniae), M. tuberculosis BCG (para laGP5 y la proteína M del virus del PRRSV)o E. coli (para antígenos de Toxoplasmagondii o el virus de la enfermedad deAujeszky).

En general, las bacterias vivas recombi-nantes son vehículos interesantes para laadministración de vacunas de mucosas,porque son procedimientos de bajo coste ypueden producirse fácilmente, pueden seradministradas oral o intranasalmente,pueden vehicular muchos genes extrañosdiferentes, protegiendo simultáneamentefrente a ellos, pueden inducir tanto res-puesta humoral como celular y, si es nece-sario, los efectos adversos pueden contro-larse mediante la administración deantibióticos. En el lado contrario, su incon-veniente principal reside en la inestabilidaddel fenotipo recombinante y en la poten-cial reversión a la forma virulenta, ademásde que aún no se sabe si la respuesta in-mune correspondiente al vector bacterianopuede afectar en la repetición de la dosis(efecto booster). En la actualidad se estu-dian varios vectores bacterianos con el pro-pósito de conocer estos y otros extremos,incluyendo comensales como Lactobacillus,Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcusy patógenos atenuados de Salmonella,Shigella, BCG, Corynebacterium, Bacillus,Yersinia, Vibrio, Erysipelothrix o Bordetella,entre otros (Gerdts et al., 2006), promo-viéndose la necesidad de más estudios, es-pecialmente en lo que se refiere a su apli-cación en Sanidad Animal.

Vectores virales. Los vectores víricos sontambién una alternativa de mucho interéspara vehicular los antígenos vacunalespara mucosas, incluyéndose una amplia


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lista de poxvirus, herpesvirus y adenovirusque ya han sido propuestos con este des-tino. Entre los poxvirus, ya nos hemos re-ferido anteriormente al caso del virus vac-cinia y los poxvirus de la viruela aviar y dela viruela del canario. La lista de herpes-virus incluye el herpesvirus bovino tipo 1(para la glicoproteína C del virus de la en-fermedad de Aujeszky, la VP1 del virus dela fiebre aftosa, la proteína E2 del virus dela diarrea vírica bovina o la proteína G delvirus respiratorio sincitial bovino), el her-pesvirus de los pavos (para las proteínasHN y F del virus de la enfermedad deNewcastle, virus de la enfermedad deMarek y la VP2 del virus de la enfermedadde Gumboro), el virus de la enfermedadde Aujeszky (para la proteína E1 del virusde la peste porcina clásica) o el herpes-virus felino de los pavos (para la proteína

de la cápsida del calicivirus felino y la pro-teína ROP2 de Toxoplasma gondii).

La eficacia de los vectores víricos está de-terminada por su rango de hospedador ytropismo, por su capacidad para replicarseen la especie diana y la expresión del antí-geno extraño de prueba. En la actualidadse están evaluando, para conocer su com-portamiento en la administración de va-cunas de mucosas, varios tipos de virusADN, incluyendo adenovirus (adenovirusbovino, adenovirus porcino, adenovirus ca-nino, virus CELO, adenovirus aviar o ade-novirus humanos), poxvirus (virus de la vi-ruela caprina y de la viruela porcina) yherpesvirus (ya comentados), y por lo quese refiere a virus ARN, se hace lo propio conel virus de la enfermedad de Newcastle, dela encefalitis equina venezolana, de la selvaSemliki y algunos retrovirus.


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Tabla 6. Vectores autorizados para vacunas de mucosas con destino a distintosprocesos infecciosos de los animales.

Denominación Vector Objetivo Indicación CompañíacomercialRaboral V. vaccinia Vector Rabia MerialTrovac/NDC V. viruela aviar Vector Newcastle idTrova/AIV H5 V. viruela aviar Vector Influenza H5 idRecombitek V viruela canario Vector Moquillo canino idPurevak id Vector Rabia idEurifel FeLV id Vector Leucemia felina idEurifel RCCP FeLV id Vector Combinada

(moquillo felino+leucemia) idProteqFlu id Vector Influenza equina idProteqFlu-Te id Vector Influenza equina + tetanos idRecombitek WNV id Vector West Nile idPurevax FeLV NF id Vector FeLV (transdérmica) idGallivac IBDV id Vector Gumboro idHVT-MDV HVT Vector Marek IntervetHVT-MDV-NDV HVT Vector Marek/ Newcastle IntervetHVT-IBDV HVT Vector Gumboro BiomuneMegan Vac-1 Salmonella Mutante Salmonella Avant

delecionado


En resumen pues, los vectores víricos sonbuenas herramientas para la administra-ción de vacunas en mucosas aunque secondiciona su uso a su seguridad, estabi-lidad y aplicabilidad, así como a la efecti-vidad, sobre todo en presencia de inmu-nidad preexistente como consecuencia dela infección natural o posvacunal, activao pasiva.

En la tabla 6 se recoge un resumen devectores vivos, bacterias y virus, autori-zados para la presentación de antígenosen vacunas de mucosas con destino a losanimales.

En el hombre se han propuesto vacunasfrente a procesos originados por microor-ganismos de tropismo digestivo (E. coli,Salmonella, Shigella, V. cholerae y, especial-mente, frente a rotavirus) o respiratorio (in-fluenza y virus respiratorio sincitial) o sexual(sida, herpesvirus y papilomavirus) (400).

Micropartículas. Por último, en lo que serefiere a las micropartículas, su uso se re-laciona con la protección que ejercensobre el antígeno evitando su degrada-ción, incrementando su consumo porparte de las células especializadas de lamucosa, asociadas al tejido linfoide (MALTy GALT). Además de ello, las micropartí-culas facilitan la presentación por las cé-lulas presentadoras de antígeno tanto porla restricción del MHC-I como MHC-II y lasdiferentes rutas de presentación habi-tuales (401).

Los estudios llevados a cabo en animales delaboratorio sobre los sistemas de adminis-tración particulados han puesto de mani-fiesto que pueden mejorar significativa-mente la inmunogenicidad de los antígenosadministrados directamente en las mu-cosas, especialmente en el caso de antí-

genos no replicantes, como proteínas, y va-cunas inactivadas, por lo general, los menosinmunogénicos de todos, aunque la mayorparte de información disponible procede deMedicina Humana, pues los estudios reali-zados sobre enfermedades infecciosas delos animales domésticos son muy escasos,sobre todo en lo que se refiere a las vacunasinactivadas. Tres de estos sistemas princi-pales serán estudiados con detalle en el ca-pítulo de adyuvantes, dada su doble condi-ción de vehículo y adyuvante de inmunidad;nos referimos principalmente a las micro-partículas, los complejos estimulantes in-munes (ISCOM) y los liposomas (ver des-pués).

En el ganado bovino se han utilizado ex-perimentalmente micropartículas de algi-nato administradas oral o intranasalmente,comprobando que se generaba buena res-puesta, tanto sistémica como mucosa,frente a la albúmina (402). El alginato esun carbohidrato natural que se polimerizaen partículas al contactar con cationes di-valentes. Se ha ensayado en el ganado bo-vino para inmunización intranasal, indu-ciendo niveles altos de anticuerpos ensuero, secreciones nasales y saliva, mien-tras que no se produjeron cambios signifi-cativos por vía oral (403), lo que sugiereuna mayor eficiencia por la vía respiratoria;sin embargo, en estudios llevados a caboen conejos inmunizados oralmente con an-tígenos encapsulados en micropartículasde alginato, sí desarrollaron niveles signifi-cativamente altos de IgA en la mucosanasal, prueba de su eficacia, dependiendode la especie, tanto en animales grandescomo en pequeños (404).

También se han utilizado con el mismo finmicropartículas de otros polímeros, comoPLG (Poly-Lactide-co-Glycolide), polifosfa-


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cenos y almidón. El PLG es un poliéster bio-degradable, alifático, que se ha utilizadoextensamente para la preparación de mi-crocápsulas para vacunas, incluyendo an-tígenos bacterianos como fimbrias de B.pertussis o ADN, en ensayos experimen-tales en ratón, entre otros. Hasta la fechase ha utilizado PLG para microencapsularovoalbúmina, que fueron utilizadas parainmunizar ratones por vía oral, con buenasrespuestas a nivel de IgG sérica e IgA en lamucosa intestinal, en un nivel equivalenteal obtenido con toxina colérica como ad-yuvante (hasta la fecha el adyuvante máspotente utilizado en vacunas de mucosas)(405). En general, se admite que la inmu-nización de mucosas con antígenos encap-sulados en micropartículas de PLG es capazde proteger a los animales frente al desafíocon patógenos que utilizan esta vía de en-trada en la infección, como se ha demos-trado en el ratón en el caso de S. typhimu-rium o Bordetella pertussis, induciendobuena protección frente al desafío homó-logo (406), igual que sucedía en el caso deChlamydia trachomatis (407) o Salmonellaenterica Typhimurium (408), con la parti-cularidad de que el procedimiento estimulael sistema común de mucosas, protegiendode la infección en lugares alejados delpunto de entrada (la inmunización por víaoral protege de infecciones respiratorias yal revés). Se han utilizado vacunas de DNAencapsuladas en PLG, en el caso de rota-virus (en ratón) y en humanos inmunizadoscon antígeno CFA/II de E. coli enterotoxi-génico mediante inmunización intestinaldirecta, con buenos resultados, mientrasque la administración al cerdo del mismoantígeno, vía oral, produjo resultados va-riables (409). Una alternativa al PLG es lapoli-Â-caprolactona (PEC), un polímero

biodegradable que mejoró los resultadosde la inmunización del ratón con un antí-geno de Brucella ovis, aunque no sucediólo mismo en el caso de antígenos deSchistosoma mansonii. Probablemente unade las limitaciones de los polímeros de PLGreside en que solo es soluble en solventesorgánicos que, por otra parte, pueden des-naturalizar epítopos críticos para la induc-ción de inmunidad protectora.

Los polifosfacenos son polímeros sintéticosbiodegradables y solubles en agua que sehan utilizado en ensayos de inmunizacióndel ratón con toxoide tetánico o antígenodel virus influenza en micropartículas dePCPP (poli-di-carboxilato fenoxi fosfacene),con incrementos significativos de IgG en elsuero, lo que, unido a la facilidad de pre-paración de las micropartículas del polí-mero, justifica más estudios (410).

En el caso de M. hyopneumoniae y Actino-bacillus pleuropneumoniae (411) se hanutilizado resinas acrílicas (acetato de celu-losa, ftalatos y ácido metacrílico) para pro-teger los antígenos del bajo pH gástrico,permitiendo su liberación intestinal, conbuenos resultados en la administración oralal cerdo, igual que en el caso de E. coliETEC, utilizando también derivados celuló-sicos como vectores de fimbrias, en vacu-naciones experimentales en el cerdo (412).

Capítulo aparte, dentro de los sistemasparticulados, merecen los ISCOM y los li-posomas. Los primeros son pequeñas na-nopartículas de 40 nm de diámetro com-puestas de saponina (como adyuvante),lípidos y el antígeno. No solo se comportancomo un adyuvante, sino que también sonactivas con las células presentadoras de an-tígeno. Su mecanismo de actuación se re-laciona con la capacidad para estimular la


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inmunidad innata produciendo citoquinas(IL-12) y modulando la utilización del antí-geno a través del reclutamiento de célulaspresentadoras de antígeno. Se han publi-cado numerosos estudios que señalan quelos ISCOM incrementan la respuesta in-mune frente a una amplia variedad de an-tígenos vacunales tanto en animales de la-boratorio como en animales domésticos,por lo que en la actualidad se incluyen envacunas comercializadas (413) con aplica-ciones potenciales para las vacunas de mu-cosas, según resulta de diversos estudiosllevados a cabo con ovoalbúmina incorpo-rada a ISCOM y administrada por vía orala ratones, que fue capaz de inducir la apa-rición de anticuerpos séricos, IgA en mu-cosas y respuesta de células T (Th1 yTh2CD4), así como actividad de restriccióndel MHC I en linfocitos Tc (414). Despuésde esto se han llevado a cabo numerososestudios en los que se incorporan dife-rentes antígenos en ISCOM con el resul-tado de la inducción de inmunidad protec-tora; tal ha ocurrido, por ejemplo, con elvirus influenza, administrado intranasal-mente a ratones, igual que el virus respira-torio sincitial. También se han estudiado va-cunas frente a la perineumonía contagiosabovina (Mycoplasma mycoides subsp. my-coides), incorporando antígenos a ISCOMe induciendo inmunidad mucosa y sisté-mica, también experimentalmente en ra-tones, etc. (Gerdts et al., 2006). Se hacenecesario continuar estos estudios en ani-males de renta utilizando antígenos de in-terés, relevantes en Sanidad Animal, parasancionar definitivamente la utilidad deeste sistema de administración de antí-genos en la vacunación de mucosas.

Los liposomas son vesículas de fosfolí-pidos que incrementan la respuesta in-

mune primaria como consecuencia deuna mayor utilización del antígeno y desu presentación por parte de las célulaspresentadoras. Han sido utilizados expe-rimentalmente en el ratón, tanto por víaoral como intranasal, parece que conbuenos resultados, por ejemplo en en-sayos en los que se incorporó la subu-nidad B de la toxina colérica recombi-nante, con un incremento significativo delos niveles de IgA e IgG sérica, igual queen estudios llevados a cabo con una va-cuna inactivada de Yersinia pestis, en losque su incorporación a liposomas se tra-dujo en un aumento de los títulos de IgGe IgA en pulmones y en lavados nasalesde ratones inmunizados por vía nasal.También se han descrito resultados de in-terés en el caso de aves vacunadas por víaintraocular, intranasal y oral con extractoscelulares de Salmonella entericaEnteritidis, incorporados a liposomas, conrespuesta significativa de IgG e IgA(Gerdts et al., 2006).

Vacunas de mucosas. Administración

Aunque la mayoría de las vacunas hansido administradas, tradicionalmente, através de las vías intramuscular o subcu-tánea, en Sanidad Animal, especialmenteen avicultura industrial, se han utilizadodesde hace tiempo otras rutas (adminis-tración en agua de bebida y/o en spray)que han demostrado su eficiencia y opor-tunidad, habida cuenta de que la super-ficie mucosa de los organismos verte-brados supone la principal exposición alexterior y en consecuencia la principial víade ingreso de agentes patógenos.

La administración de antígenos vacunalesdirectamente en mucosas (principalmentenasal y digestiva, pero también en mu-


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cosa conjuntiva) ofrece un considerablenúmero de ventajas, incluyendo una ad-ministración más fácil, la reducción deefectos adversos y, en el caso de los ani-males domésticos, una mejor posibilidadde practicar dosis de recuerdo, en casonecesario. Además de todo ello, la admi-nistración directa en mucosas induce in-munidad específica de mucosas en los lu-gares en los que los agentes patógenosinician la colonización e infección, y, enconsecuencia, el bloqueo de las primerasfases puede resolver con prontitud y efi-cacia el ulterior desarrollo de la potencialinfección y enfermedad, lo que, cuandose administra el producto mediante otrasvías, se resuelve peor, dado que la induc-ción de inmunidad protectora en base ala producción de IgA secretora es baja omuy baja. La inmunización oral, porejemplo, puede ser particularmente con-veniente en el caso de explotaciones ani-males donde el acceso del veterinario escomplicado y, en todo caso, este tipo deadministración evita siempre otros pro-blemas potenciales derivados del uso deobjetos punzantes debido a la reutiliza-ción de agujas y jeringuillas.

Casi todos los tipos de vacunas disponibles(atenuadas, inactivadas, de subunidades ode ADN) han sido estudiadas para su ad-ministración como vacunas de mucosas endistintas especies animales, aunque solounas pocas se han autorizado para su ad-ministración por esta vía con carácterglobal (ver tabla), y muchas otras se en-cuentran en la actualidad en fase experi-mental, confiando en que lleguen al mer-cado en los próximos años. De modogeneral, las vacunas vivas o que utilizanvectores vivos son más eficaces que las va-cunas inactivadas, igual que ocurre cuandose utilizan otras vías de administración,pues se relacionan con la disponibilidad demecanismos de invasión bacterianos o ví-ricos, aunque, como ocurre con el resto devacunas, en este caso debe considerarsetambién lo que se refiere al riesgo de su in-seguridad debido a la posible reversión aformas virulentas, si se trata de métodosde atenuación convencionales, no deri-vados de la manipulación genética, muchomás segura. En el caso de las vacunas inac-tivadas o de subunidades, precisan de laincorporación de adyuvantes, para lo quese incluyen buenas perspectivas de uso (verdespués).


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Tabla 7. Vacunas autorizadas para su administración en mucosas en los EE.UU.(Gerdst et al., 2006) (415).

Especie Patógenos y enfermedadesBovinos BHV-1 (in), rotavirus (oral), coronavirus (oral).Porcinos Gastroenteritis transmisible (in), rotavirus (oral), Bordetella bronchiseptica (in).Equinos Influenza (in), Streptococcus equi (in).Caninos Adenovirus-2 (io), parainfluenza (in), B. bronchiseptica (in).Felinos Calicivirus (io), rinotraqueítis (io).Aves Adenovirus del pavo (oral), bronquitis infecciosa (oral, in, io, spray), Newcastle

(oral, io, in, spray), Gumboro (oral, in, io, spray), herpesvirus del pollo (oral, in,io, spray), herpesvirus del pavo (oral, in, io, spray), reovirus (oral, in, io, spray),Bordetella avium (oral, spray), Pasteurella multocida (oral).


Sin duda alguna la ruta más atractiva parala inmunización directa en mucosas es laoral, debido a la facilidad que supone la ad-ministración del antígeno, aunque la acidezestomacal y la abundancia de enzimas enlos primeros tramos del intestino delgado,así como la cubierta de moco protector queprotege la mucosa, puede limitar el accesoal epitelio y en consecuencia hacer menosefectiva la inmunización, siendo esto espe-cialmente importante en el caso de la ad-ministración de antígenos inactivados. Pararesolver estos inconvenientes pueden utili-zarse nuevos sistemas de administración yadyuvantes convenientes, capaces de re-solver en buena medida estos aspectos des-favorables.

Vacunas antialérgicas

En los animales, como en el ser humano,especialmente en algunas especies comoel perro, gatos o caballos, existe una ciertapredisposición genética al desarrollo deenfermedades alérgicas de la piel o der-matitis atópica, como respuesta a dife-rentes antígenos del medio que tienen laconsideración de alérgenos (granos depolen, semillas, esporas fúngicas, ácarosdel polvo, etc.).

El tratamiento más común en estos casos,igual que sucede en el hombre, es la va-cunación con un extracto del alérgenopara el que el animal ha mostrado sensi-bilidad y reacción (inoculación intradér-mica o determinación de IgE específica ensuero). Este tipo de inmunoterapia espe-cífica de alérgeno (ASIT) consiste en ad-ministrar gradualmente cantidades cre-cientes del alérgeno, en suspensiónacuosa o precipitada con alumbre, a lolargo de un periodo de varios meses (de-

sensibilización), seguido por dosis de re-cuerdo anuales.

La efectividad de la medida es muy va-riable; por ejemplo, en el caso del perropuede ir desde el 20 al 100%, depen-diendo de muchas variables. En paraleloa los estudios que se realizan en MedicinaHumana, el conocimiento de los meca-nismos de producción del fenómeno alér-gico es un dato clave que implica la induc-ción de células T reguladoras específicasy/o IgG que compiten con los alérgenos ylos enmascaran. Se precisan más estudiosque puedan identificar los mecanismosexactos de producción del fenómeno alér-gico, igual que de los mediadores, que seasocian con el éxito o el fracaso de la in-munoterapia a base de vacunas. Sin dudaalguna, este es un campo en el que tantoen el caso del hombre como en el de losanimales de valor singular, deberá ser de-sarrollado en profundidad a corto plazo.

Perspectivas

La Vacunología es reconocida actual-mente como una ciencia que combinadisciplinas como la Inmunología, laMicrobiología, la Química de proteínas yla Biología Molecular, con consideracionesprácticas relativas a los costes de produc-ción, asuntos regulatorios y beneficios co-merciales (Meeusen et al., 2007) con elpropósito de diseñar productos o combi-naciones de productos destinados a pro-ducir una respuesta inmune protectorafrente a los agentes patógenos, produc-tores de enfermedades infecciosas delhombre o los animales.

El objetivo final de cualquier vacunanueva es proporcionar un producto quepueda ser utilizado para proteger a los


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animales o al hombre frente a las enfer-medades, principalmente infecciosas. Lasvacunas en el campo veterinario han te-nido en el pasado un gran impacto nosolo sobre la Sanidad Animal, sobre el quelo han ejercido directamente, sino tam-bién indirectamente sobre el bienestaranimal, la producción animal y, con unatrascendencia extraordinaria, sobre laSalud Pública, tanto en lo que se refiere alas enfermedades zoonósicas, cuya erra-dicación depende del control y erradica-ción en las poblaciones animales, comopor lo que se refiere a beneficios o perjui-cios relacionados con la capacidad de pro-ducir alimentos de primera necesidadpara el hombre o la de originar, en el casode desastres sanitarios, quebrantos eco-nómicos en las explotaciones animalesque conducen a la ruina y desesperaciónde los ganaderos propietarios.

En el caso particular de las denominadasenfermedades emergentes, que identifi-camos en la actualidad con el presentemás crítico y sobre todo con el futuro máspreocupante, se produce un continuo in-tercambio de información entre las insti-tuciones dedicadas al control de las enfer-medades humanas y animales, y lospropios científicos, con el propósito esen-cial de estar preparados ante el riesgo deaparición de una enfermedad nueva oemergente de esta categoría (416), comoha ocurrido recientemente (está ocu-rriendo, en realidad) en el caso de la epi-demia de gripe aviar por H5N1. La pesteo influenza o gripe aviar, que afecta a lasaves domésticas, tiene en las aves salvajesy/o migratorias los reservorios primor-diales del agente, aunque informacionesrecientes han señalado que los gatos,tanto domésticos como salvajes, también

pueden estar infectados y pueden actuarcomo fuente posible de infección para elhombre (417). Por su parte, los cerdos sonsusceptibles tanto al virus de la influenzaaviar como al de la influenza humana, es-peculándose con que la coinfección convirus de la influenza aviar altamente pa-tógenos y simultáneamente con virus dela gripe humana pudiera hacer surgir porreordenamiento genético un nuevo viruscon capacidad para infectar al hombre ytransmitirse después horizontalmente(hombre-hombre) (418). Todo ello ponede manifiesto la complejidad epidemioló-gica de este tipo de procesos en los quela evolución natural de su agente pro-ductor, en ocasiones influenciada por lapresión de origen humano, constituyeuno de los elementos facilitadores de laemergencia.

En los procesos emergentes, sobre todode origen vírico, la alternativa a la vacu-nación, que no siempre es posible (porausencia de una vacuna eficaz o por ra-zones de otro tipo, incluyendo motivoseconómicos), es el sacrificio en masa delos animales afectados y sus posibles con-tactos (diagnóstico y sacrificio, stampingout, y destrucción de cadáveres), una me-dida efectiva pero impopular y en oca-siones inasumible por razones econó-micas. Existen ejemplos, tanto en el casode enfermedades exclusivas de los ani-males como de zoonosis, en los que lafalta de una vacuna disponible no dejaotro recurso que la aplicación de estasmedidas extremas. Los brotes periódicosde peste porcina africana, para la que noha sido posible hasta la fecha desarrollaruna vacuna efectiva, son un buen ejemplode lo primero. La descripción del virus deNipah, para el que solo recientemente se


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ha descrito la disponiblidad de una va-cuna (419), hizo que en los primerosbrotes de la enfermedad en Asia, en elque todavía ni siquiera se había caracte-rizado perfectamente la causa, la situa-ción fuera idéntica. En otros casos, comosucede con la fiebre aftosa, que reemergeperiódicamente, las circunstancias propiasde contagiosidad de la enfermedad y sutrascendencia económica hacen que, auncontando con vacunas eficaces disponi-bles, sea posible elegir la opción más ade-cuada a seguir en cada caso particular (sa-crificio o vacunación), para la que ladecisión depende de numerosas circuns-tancias. Todavía se podrían considerarotros muchos ejemplos en los que las cir-cunstancias de cada momento son cam-biantes en función de la coincidencia decircunstancias que afectan al conoci-miento o desconocimiento de reservorios,vectores, capacidad de control y solvenciade las administraciones, etc.

Todavía más, cuestiones como el incre-mento de las interacciones comercialescon animales vivos o sus productos y elcontacto directo o indirecto, legal o clan-destino, con animales salvajes, unido alcambio climático, se están postulandocomo situaciones de riesgo creciente queexigen una vigilancia permanente sobrela aparición y difusión de las enferme-dades en cualquier parte del mundo y entodo tipo de animales (domésticos, deproducción o salvajes), pues todos ellospueden actuar como potenciales reservo-rios de muchas enfermedades transmisi-bles al hombre, incluyendo aquellas en lasque se implican vectores invertebrados,como ocurre por ejemplo con el caso dela encefalitis del Nilo Occidental, quetanto en los Estados Unidos como en

Europa exige ya una vigilancia continua yel establecimiento de programas de con-trol para detectar la presencia del virus enaves, en caballos o en humanos (420).

Las razones anteriores ponen de mani-fiesto lo complicado de la situacióncuando se trata de enfermedades que sedescriben por primera vez y para las quela falta de conocimiento en aspectosclaves es la situación normal. Ante ello,especialmente en el caso de los virus enlos que no existen alternativas antimicro-bianas capaces de resolver una eventua-lidad como la que señalamos, la disponi-bilidad de métodos rápidos que permitanidentificar, caracterizar, conocer los mapasantigénicos de una eventual causa son crí-ticos para el desarrollo pronto de pro-ductos capaces de frenar su entrada enlugares nuevos o su difusión en lugaresendémicos. Las vacunas siguen siendo, enel caso de los virus y de los microorga-nismos responsables de enfermedades in-fecciosas en general, el recurso principalde lucha y control de enfermedades deesta naturaleza, incluyendo zoonosis.

Una incorporación reciente a las vacunasveterinarias para el control indirecto deuna enfermedad humana de gran reper-cusión en el campo de la Salud Pública esla reciente autorización en Canadá de unavacuna para el ganado bovino frente aEscherichia coli 0157:H7, como es sabido,causa principal de enfermedad humanatransmitida por alimentos en todo elmundo, en la que el ganado bovino es elreservorio más importante. Hace tan solounos pocos meses que un pariente pró-ximo de este agente el E. coli 0104:H4,ha surgido de la recombinación medianteintervención fágica, de un E. coli 0157:H7con genes procedentes de otro E. coli en-


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teroagregativo, originando un agentenuevo con capacidad de agregación demúltipes células en la mucosa intestinal yproducción de toxinas Stx-2, que dio lugaren Alemania y otros países a un brote quese saldó con más de 3.200 enfermos, másde 500 pacientes hospitalizados por sín-drome urémico hemolítico y por encimade 30 fallecimientos, en el que se impli-caron brotes de soja.

En la historia reciente de la Vacunología,es preciso anotar numerosos éxitos en elcampo humano y veterinario, y ello, tantoen lo que se refiere a su eficacia en la pre-vención de las enfermedades como en lareducción de los efectos colaterales inde-seables, aunque todavía permanecen sinresolver importantes problemas, con unamplio margen para incorporar losnuevos conocimientos y tecnologías en eldiseño y desarrollo de vacunas.

Como se ha señalado en este estudio, enel campo veterinario todavía la mayorparte de las vacunas que se producen enla actualidad están basadas en microor-ganismos vivos atenuados. Aparte delriesgo que implica este tipo de inmuniza-ción, esta estrategia no es en absolutoconveniente para los laboratorios dedi-cados a su producción y comercialización,ya que, además de los inconvenientes deaccidentes posvacunales (por deficienteatenuación, etc.), se exige una cadena demantenimiento de frío, y los productos decorta vida y que por lo general son espe-cíficos de una región en particular, o deuna cepa concreta relacionada con brotescircunscritos a ella, reducen la rentabilidaddel producto.

Mientras tanto, por otra parte, la mayoríade las vacunas de subunidades disponi-

bles en el mercado veterinario, más se-guras que las anteriores, manifiestanmucha menor capacidad inmunógenaque aquellas, particularmente en lo quese refiere a la inducción de anticuerposneutralizantes. Se requiere un mejor co-nocimiento de los procesos moleculares einmunológicos que tienen lugar durantela patogénesis de la enfermedad para me-jorar la eficacia de este tipo de vacunas,igual que el de las vacunas inactivadas demicroorganismos completos. Aunque estábien establecido que el sistema inmuneposee varios mecanismos efectores parahacer frente a los diferentes tipos de pa-tógenos, dependiendo de sus ciclos devida y al microambiente, la mayoría de lasvacunas de subunidades e inactivadas to-davía fallan en su propósito de inducir in-munidad protectora (421).

Resulta necesario, por tanto, abrir vías deconocimiento que sirvan para incrementarla capacidad de las vacunas inactivadas yde subunidades para inducir una res-puesta eficaz que actúe directamentesobre los agentes patógenos en los dife-rentes estadios de su ciclo biológico. Unaforma de acometer con éxito estos desa-fíos puede estar en conseguir, porejemplo, nuevos y más eficaces sistemasde presentación de los antígenos, me-diante plásmidos, liposomas, nano o mi-cropartículas o vectores vivos, que intro-ducen directamente los antígenos en loscompartimentos intracelulares (Gerdst etal., 2006). Otro avance principal en rela-ción con la Vacunología moderna tieneque ver con el desarrollo de adyuvantes(ver después).

Con independencia de los esfuerzos cien-tíficos necesarios para el desarrollo de me-jores vacunas, su comercialización nece-


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sita además de facilidades reguladoras quepermitan su llegada al mercado, lo que nosiempre resulta sencillo. En la UE, porejemplo, el sistema regulador en materiade vacunas se basa en la legislación de laAgencia Europea del Medicamento(European Medicines Evaluation Agency,EMEA) que contempla tres procedimientosen el registro de vacunas: por un lado, eldenominado procedimiento centrali-zado, en el que las vacunas nuevas e in-novadoras son evaluadas y legalizadas entodos los Estados Miembros (EM) en unúnico procedimiento; en el denominadoprocedimiento de reconocimientomutuo, el fabricante selecciona un únicopaís de referencia para evaluar el dosiercorrespondiente a la vacuna, el cual va se-guido de una solicitud en los países impli-cados para que puedan disponer despuésde la vacuna registrada. La tercera y últimaopción consiste en solicitar el procedi-miento descentralizado, que puede serelegido cuando se desea un expediente deregistro más conveniente; en este caso, eldosier de la vacuna es revisado por todoslos países seleccionados al mismo tiempo,lo que evita la primera fase en el recono-cimiento mutuo. En los EE.UU., la FDA(Food and Drug Administration), que man-tiene la responsabilidad de este tipo de re-gistros, posee una jurisdicción mucho másrestringida y considera las vacunas comomedicamentos, con mayor cantidad deobstáculos para el registro, aunque las va-cunas con destino a los animales estánbajo la jurisdicción del Departamento deAgricultura y los requerimientos son dife-rentes.

A nivel internacional, existe un ComitéVeterinario para la Armonización de losrequisitos de vacunas, medicamentos,

análisis, etc., con grupos especializados,que pretende reunir a las autoridades re-guladoras de la UE, Japón y los EE.UU., asícomo a representantes de las industriasde la Sanidad Animal de las tres regiones,con el fin de armonizar los requerimientostécnicos para el registro de productos ve-terinarios (422).

La investigación y el desarrollo constituyenla base de la generación de nuevas y me-jores vacunas para las enfermedades delos animales, fundamentalmente produ-cidas por microorganismos y parásitos,competencia de la Sanidad Animal. Losdescubrimientos relacionados con estecampo en las enfermedades humanas sonmuy aprovechables, y en algunos sec-tores, como sucede con los animales decompañía, trasciende el campo de las en-fermedades infecciosas, abordando terri-torios no infecciosos, a los que tambiénse llega para prevenir y tratar algunas en-fermedades crónicas, esporádicas o defondo inmune, contribuyendo al bienestaranimal y generando, además, un impor-tante mercado. Las nuevas vacunas frentea enfermedades de los animales no solopueden tener el carácter profiláctico tra-dicional, sino que, como sucede en elcaso de la Medicina Humana, poseenefectos terapéuticos en las enfermedadescrónicas, principalmente para perros ygatos. También se han incorporado estetipo de tecnologías innovadoras en elcaso del caballo y de los peces, principal-mente en lo que se refiere a vacunas deácidos nucleicos.

Por otra parte, ya nos hemos referido aello, muchas especies animales, en razónde su estructura anatómica y fisiología,son excelentes modelos (423) para el es-tudio de enfermedades humanas y, en


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este caso, útiles como campo de pruebaspara diferentes sistemas de presentaciónde los antígenos vacunales (424), que per-miten optimizar, por ejemplo, la adminis-tración de vacunas de ADN mediante eluso de plásmidos (425).

Adyuvantes, complementosde vacunas

Introducción

Como se señaló en su momento, el estí-mulo de la inmunidad innata no solo seaplica en las barreras físicas, químicas ycelulares que la constituyen, sino que estáíntimamente relacionada con la inmu-nidad adaptativa, de tal manera que losinconvenientes a los que hemos hecho re-ferencia en el caso de las vacunas inacti-vadas o de subunidades, de baja inmuno-genicidad, pueden resolverse o, al menos,potenciarse mediante la incorporación alas formulaciones vacunales de inmuno-potenciadores que reciben el nombre deadyuvantes.

Como es sobradamente conocido, el sis-tema inmune presenta ante los agentespatógenos dos tipos de respuesta en laque implican directa o indirectamente cé-lulas del organismo hospedador: la pri-mera, más o menos inmediata y general(inespecífica), tiene lugar frente a los pa-trones moleculares situados en la super-ficie de los microorganismos, mientrasque la segunda, más lenta (se producedespués de varios días y hasta semanas),implica anticuerpos y células.

La respuesta inmune innata conduce,entre sus principales efectos, a una rápidaexplosión de citoquinas inflamatorias y ala activación de las células presentadoras

de antígeno (CPA), principalmente macró-fagos y las células dendríticas. Esta res-puesta, que no es de carácter clonal, llevaa un condicionamiento del sistema in-mune para el desarrollo posterior de larespuesta inmune adaptativa.

Para diferenciar los agentes patógenos dela microbiota comensal y de los compo-nentes que forman parte de las células y te-jidos del propio hospedador, la inmunidadinnata utiliza una amplia variedad de recep-tores relativamente invariables, que de-tectan moléculas identificativas propias delos patógenos, que incluyen las denomi-nadas “patrones moleculares asociados alpatógeno“ (Pathogen-Associated MolecularPatterns, PAMP) (426), a las que se unen lasdenominadas DAMP (Damage AssociatedMolecular Patterns), señales de peligro,también denominadas alarminas, reciente-mente descubiertas, que desempeñan unimportante papel en la respuesta inmune(realmente la inician), que incluyen algunasproteínas, como la denominada HMGB1(High Mobility Group Box protein-1), etc.

La incorporación de PAMP a las vacunasexperimentales induce el desarrollo de unarespuesta inmune adaptativa fuerte y du-radera. El mecanismo implicado se ha co-nocido recientemente, cuando se identifi-caron algunos de los “receptores dereconocimiento de los patrones“ (Pattern-Recognition Receptors, PRR) implicados enla respuesta inmune innata frente a losPAMP. Los PRR están expresados de formadiferencial en una amplia variedad de cé-lulas inmunes que incluyen neutrófilos, ma-crófagos, células dendríticas, NK (NaturalKillers), células B y algunas células que nopertenecen al sistema inmune, como lascélulas epiteliales o las células endoteliales.El compromiso de los PRR conduce a la ac-


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tivación de algunas de estas células y la co-rrespondiente secreción de citoquinas yquimioquinas, así como a la maduración ymigración de otras. Esta cadena de fenó-menos crea un ambiente inflamatorio quepermite el establecimiento de la respuestainmune adaptativa (427).

Los PRR son receptores no fagocíticos,como las proteínas que forman los recep-tores Toll-like (TLR) y los NOD (Nucleotide-Binding Oligomerization Domain, dominiosde oligomerización unidos a nucleótidos),y los receptores que inducen fagocitosis,como los receptores de residuos, los recep-tores de manosa y de β-glucano. Estos úl-timos reconocen directamente ligandos dela superficie de los microorganismos pató-genos y ello produce su engolfamiento porparte de las células fagocíticas, como su-cede en el caso de los macrófagos. Los re-ceptores no fagocíticos que reconocenPAMP extracelularmente (determinadosTLR) o intracelularemente (familia de pro-teínas NOD) llevan a una cascada de trans-ducción y señales. Aunque los datos dispo-nibles hasta la fecha sugieren que algunosTLR unen directamente PAMP, todavía nose sabe si esto es lo que sucede habitual-mente o si están implicadas algunas prote-ínas intermediarias (428).

Los TLR (TLR-1 a 11) pueden formar hete-rodímeros que les permiten cambios en suespecificidad, como sucede por ejemplo enel caso de TLR-2 y TLR-6, en los que los he-terodímeros les permiten reconocer una li-poproteína de los micoplasmas, o en elcaso de TLR-1 y TLR-2 para reconocer unalipoproteína de las micobacterias.

Por otra parte, los TLR son glicoproteínasintegrales de membrana de tipo 1, conuna homología considerable con el do-

minio citoplasmático del receptor de la IL-1. Poseen un gran dominio citoplasmáticoconservado de alrededor de 200 aminoá-cidos, al que se denomina TIR (Toll-IL-1Receptor Domain), que es importante porsu asociación con proteínas adaptadoras,vinculando así estos receptores trans-membrana a sus vías de señalizaciónhacia el interior.

Todos los TLR, excepto el TLR-3, com-parten una ruta de señalización comúnque utiliza una proteína adaptadora de-nominada MyD88 (mieloid differentiationfactor 88). En algunos casos se ha vistoque MyD88 se une directamente me-diante el dominio TIR, como sucede en losTLR-5, 7 y 9, mientras que otras veces(como sucede en los TLR-2 y 4) está im-plicada otra molécula intermediaria adap-tadora denominada TIRAP (TIR domain-containing adapter proteín). A través desu dominio amino-terminal, MyD88 seune a otra familia de transductores de se-ñales, conocida como IRAK (IL-1 receptor-associated kinases), que a su vez se unena TRAF6 (TNF receptor associated factors).La activación subsiguiente de los factoresde transcripción NF-κB (nuclear factorkappa B) y AP-1 (activator protein) porTRAF6, implica todavía otras proteínasadaptadoras denominadas TAK1 (TGFβ-activated kinase 1) y TAB2 (TAK1-bindingprotein 2) (429) (figura 25).

Las proteínas NOD están implicadas en elreconocimiento intracelular de los pató-genos y productos derivados de losmismos, tal como el peptidoglicano de lasbacterias (muramil dipéptido peptidogli-cano, MDP) y estructuralmente contienentres regiones distintas: un dominio de re-conocimiento de patrones, rico en leu-cina, similar a los TLR; un dominio de


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unión a los nucleótidos, que es esencialpara la oligomerización y subsiguiente se-ñalización, y motivos efectores, inclu-yendo un dominio de reclutamiento decaspasas.

Como consecuencia de la activación deNF-κB y MAPK-pathway (mitogen acti-vated proteína kinase) por mediación deuna cadena de proteínas que comunicanuna señal desde un receptor de la super-ficie celular al ADN del núcleo, se producela expresión de numerosas citoquinas yquimioquinas inflamatorias.

Inmunidad innata y adaptativa

En definitiva, las señales iniciadas en losPRR dan lugar a la actuación de factoresde transcripción como NF-κB y IRF3 (inter-feron regulatory factor 3) que propor-cionan el contexto inflamatorio necesariopara la activación rápida de las defensas

del hospedador. La vía NF-κB controla laexpresión de citoquinas proinflamatorias,como IL-1β y el TNFα, mientras que IRF3lleva a la producción de interferones detipo I (antivirales, IFN-α e IFN-β). Junto aestas citoquinas se liberan varios tipos dequimioquinas (IL-8, una proteína quimio-atractante de los monocitos, proteínas in-flamatorias de los macrófagos y RANTES–Regulated upon Activation, Normal T-cellExpressed, and Secreted–) y sus recep-tores se expresan en la superficie de lascélulas activadas.

Como resultado de todo ello, las célulasdel endotelio vascular pueden alterar laexpresión superficial de selectinas y demoléculas de adhesión intercelular, lo queal final produce la extravasación y la re-tención selectiva de algunos leucocitos enel sitio de la inflamación. Este infiltradocelular está formado por monocitos acti-vados, neutrófilos, basófilos, eosinófilos ycélulas NK, muchas de las cuales expresantambién TLR y pueden asimismo activarsepor la presencia de sus respectivos li-gandos. Como consecuencia de este mi-croambiente inflamatorio, los monocitosque infiltran el sitio pueden diferenciarseen macrófagos y/o células dendríticas. Asípues, la activación del sistema de inmu-nidad innata puede condicionar el sitio in-flamado para el comienzo de la respuestainmune adaptativa (Iwaski y Mezhitov,2004), y todo el sistema de señalizaciónsupone la implicación de un complejo deproteínas transmembrana que puedenconsiderarse potenciales dianas para serutilizadas como adyuvantes.

Las células dendríticas se reconocen comouno de los más importantes tipos celu-lares para la iniciación del proceso de in-ducción de las células T CD4+ helper (TH)


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Figura 31. Sistemas de señalización, a través de re-ceptores, de la inmunidad innata (Pashine et al.,2005).


y para inducir la diferenciación de las cé-lulas TCD8+ en células NK. Las célulasdendríticas inmaduras se encuentran enlugares anatómicos estratégicos de todoel organismo, lo que les permite res-ponder con rapidez a la invasión bacte-riana. Estas células reciben señales micro-bianas de riesgo potencial a traves de susPRR y entonces maduran y migran a losórganos linfoides secundarios para “ac-tivar“ los linfocitos T.

Existen, al menos, tres subpoblacionesde células dendríticas: las que derivan deprecursores mieloides, linfoides y célulasde Langerhans, descritas sobre la base

de sus orígenes y características fenotí-picas (incluyendo la expresión de dis-tintos repertorios de TLR). Por lo tanto,la activación de las diferentes célulasdendríticas tiene el potencial necesariopara inducir cualitativamente distintasrespuestas inmunes.

La activación de las células dendríticas lin-foides, debido a su preponderancia parasecretar IL-12, puede ser importante parainducir respuestas Th1-like, mientras quela activación temprana de las células den-dríticas mieloides pueden llevar a res-puestas Th2 o Th0 (431). La señalizaciónTLR también tiene un papel importante

en determinar la calidad de estas res-puestas de células Th.

Las células dendríticas también puedenejercer efectos indirectos, por ejemplo,bloqueando los reguladores negativos de

la activación inmune. Se ha sugerido quela producción de IL-6 por células dendrí-ticas puede ser responsable para inhibir laactividad supresora de las células T regu-ladoras CD4+CD25+ (Treg) (432).


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Figura 32. Representación esquemática simplificada del mecanismo general de iniciación de la respuesta in-mune (Pashine et al., 2005) (430).


Adyuvantes

El término “adyuvante“ (del latín, adju-vare = ayudar) fue utilizado por primeravez por Gastón Ramón en 1926 para re-ferirse a una sustancia utilizada en com-binación con un antígeno específico queinducía más respuesta inmune quecuando se utilizaba sola (433).

En sus trabajos de inmunización experi-mental en caballos contra la toxina difté-rica, Ramón observó que cuando se origi-naban (o provocaba) abscesos en el puntode inoculación, con distintas sustancias in-cluidas en el preparado vacunal (toxoidediftérico), se obtenían títulos de anti-cuerpos mayores (434, 435). Poco des-pués, Glenny demostró la actividad adyu-vante de los preparados de aluminioutilizando toxoide diftérico precipitadocon alúmina (436), y en 1936, Freund de-sarrolló un preparado que lleva su nombre(adyuvante completo de Freund, ACF),basado en micobacterias muertas en unaemulsión de agua en aceite mineral (437),uno de los adyuvantes más enérgicos des-critos hasta la fecha, aunque excesiva-mente reactogénico para ser utilizado enla práctica. A partir de él, se desarrolló eladyuvante incompleto (AIF) que no incor-pora micobacterias (solamente una emul-sión agua-aceite) y que ha sido muy utili-zado en la práctica, tanto en humanoscomo en animales.

A partir de los años 50 se incorporaron ala lista nuevos productos, como el LPSprocedente de S. typhi (438), que, muymejorado, se utiliza en la actualidad en al-gunas formulaciones, o el muramildipép-tido (MDP), componente de la pared ce-lular de las micobacterias, que formaparte del ACF (439), a partir del cual se

han generado también otros compo-nentes de igual uso.

En los últimos años se han incorporadocon este fin numerosas sustancias, com-puestos o moléculas, tanto de origen na-tural como sintético, cuya deriva trata deresponder a las necesidades impuestaspor las nuevas corrientes de diseño de va-cunas generadas por la biología y gené-tica moleculares. Los adyuvantes hoy re-presentan también un importante puntode desarrollo de la Sanidad Animal y laSalud Pública en el hombre y en los ani-males, en la lucha contra las enferme-dades infecciosas mediante el uso de va-cunas cada vez más eficaces y seguras.

Además, en estos últimos años, el interéspor los adyuvantes de vacunas con destinoal hombre o los animales ha crecido rápi-damente impulsado por razones que in-cluyen la disponibilidad de vacunasnuevas, tanto destinadas a la prevenciónde las enfermedades infecciosas comotambién frente a enfermedades crónicascomo el cáncer, para el control de la repro-ducción (fertilidad en el hombre) y enfer-medades alérgicas y autoinmunes, muchasde las cuales requieren la incorporación deadyuvantes. Además de ello, los avancesen el conocimiento del sistema inmune yde la respuesta innata y adaptativa, igualque los que ha aportado la biología y ge-nética moleculares, igual que la microbio-logía y biotecnología, han impulsadonuevas ideas y combinaciones posiblessobre el uso dirigido de estas sustanciascomo inmunomoduladores o sustanciascapaces de dirigir la respuesta humoral ocelular, o ambas, frente a los productos va-cunales.


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Debe diferenciarse, previamente, por úl-timo y para evitar confusión, entre sustan-cias inmunomoduladoras y adyuvantes.Las primeras tienen capacidad de modularla respuesta inmune, bien estimulándolao bien suprimiéndola, mientras que losadyuvantes son siempre inmunopotencia-dores de la respuesta inmune.

Clasificación y tipos de adyuvantes

En la actualidad, la gran diversidad decompuestos que incrementan la respuestainmune (innata y adaptativa) para un an-tígeno particular hace que cualquier pre-tensión de clasificar los adyuvantes no dejede ser relativamente arbitraria. Puede uti-lizarse con este propósito el origen o elmecanismo de acción, aunque este últimoes desconocido en muchas ocasiones. Coxy Coulter (1997) (440) clasificaron los ad-yuvantes en dos grandes grupos en rela-ción con su estructura, particulados y noparticulados, y dentro de cada uno deellos señalan que un adyuvante en parti-cular puede actuar por uno o más decinco posibles mecanismos: inmunomodu-lación, presentación, inducción de res-puesta de linfocitos Tc CD8+, según el ob-jetivo u orientación y generación dedepósitos (efecto depot). La inmunomo-dulación se refiere a la capacidad de mu-chos adyuvantes para modificar la red decitoquinas. La presentación se refiere a lacapacidad de un adyuvante para preservarla integridad conformacional de un antí-geno y presentarle a las células efectorasinmunes apropiadas. La inducción de res-puesta de linfocitos Tc CD8+ requiere, porlo general, que el antígeno sea procesadodentro del citosol celular donde se incor-poran los péptidos resultantes dentro delsurco de la moléculas de MHC-1 y luego

se expresan en la superficie. En relacióncon el objetivo u orientación, viene defi-nido por la capacidad de un adyuvantepara presentar un inmunógeno a las cé-lulas efectoras del sistema inmune, por logeneral mediante la vía de las células pre-sentadoras de antígeno (APC). Finalmente,el efecto depósito consiste en la liberaciónlenta (más corta o más larga) del antígeno,de forma intermitente o continua, con elfin de estimular durante más tiempo el sis-tema inmune.

Según la clasificación aludida antes (Coxy Coulter, 1997), entre los adyuvantesparticulados se incluyen las sales de alu-minio, las emulsiones de agua en aceite,las emulsiones de aceite en agua, loscomplejos inmunoestimulantes (ISCOMs),los liposomas, nano (< 10 µm) y micropar-tículas (> 10 µm) y otros adyuvantes par-ticulados, entre los que se encontraríanlas sales de calcio, proteosomas, viro-somas, estearil tirosina, γ-inulina y alga-mulina. Entre los adyuvantes no particu-lados, los citados autores incluyen elmuramil dipéptido (MDP) y derivados, co-polímeros en bloque no iónicos, sapo-ninas, lípido A, citoquinas, polímeros decarbohidratos, derivados de polisacáridos,toxinas bacterianas y otros, entre los quese incluyen avridina DDA. En la tabla 7 seresumen sus características principales.

Otros autores (441) dividen los adyu-vantes desde un punto de vista mecánicoen sistemas presentadores del antígeno einmunopotenciadores. Entre los primerosincluyen las sales de aluminio insolubles,el fosfato cálcico, los liposomas, viro-somas, ISCOM, micropartículas, emul-siones y partículas semejantes a virus yvectores virales. Entre los inmunopoten-ciadores, por su parte, incluyen los MPL


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(lípido A) y derivados sintéticos, los MDPy derivados, los oligonucleótidos (CpG,etc.), los ARNbc, los PAMP (entre ellos latoxina colérica CT, LT y flagelina de E.coli),saponinas (como Quil-A o Quil-S-21), pe-queñas moléculas inmunopotenciadoras(SMIP, como el resiquimod) y citoquinas yquimioquinas.

De igual modo, más recientemente se haoptado por una clasificación simple y con-vencional, dividiendo los adyuvantes enclásicos y modernos (442). Entre los pri-meros, se refiere a las sales de aluminio,emulsiones, liposomas y virosomas, mien-tras que entre los modernos, incluye ago-nistas de TLR, saponinas y complejos in-munoestimulantes. Muy interesante es laincorporación de lo que denomina “sis-temas adyuvantes“, un tipo de combina-ción de inmunopotenciadores clásicos ymodernos. Veamos, brevemente, las ca-racterísticas que señala para cada uno deestos grupos.

Sales de aluminio. Utilizadas amplia-mente como adyuvantes para vacunas,tanto humanas con en Sanidad Animal,desde hace casi 100 años, son de laspocas autorizadas en el caso de las va-cunas con destino al hombre, aunque sumodo de acción ha permanecido igno-rado hasta hace pocos años (443). Antesse pensaba que las sales de aluminio ac-tuaban mediante la formación de depó-sitos del antígeno en el punto de inyec-ción (persistencia del antígeno) ymejoraban la atracción de y el consumopor las células presentadoras de antígeno,pero más recientemente se ha sugeridoque el antígeno absorbido sobre las salesde aluminio se presenta de una formamultivalente particular haciendo que seinternalicen más eficientemente por las

APC (444). Además de ello, se ha demos-trado recientemente también que las salesde aluminio activan componentes delcomplejo “inflamasoma“ (445) (unmiembro de la familia NOD-like de PRR),llevando al procesado y liberación de ci-toquinas proinflamatorias, como IL-1β eIL-18 (446).

Un inconveniente de las sales de aluminioes que incrementan, primariamente, larespuesta Th2 y poseen un pequeñoefecto sobre la respuesta Th1 que, comoes sabido, es fundamental en la protec-ción frente a muchos patógenos, sobretodo los patógenos intracelulares, comolos virus y algunas bacterias.

Estudios recientes han incrementado el co-nocimiento acerca de los fenómenos bio-lógicos que se inducen después de la ad-ministración de adyuvantes de sales dealuminio, aunque los mecanismos necesa-rios para la inducción de la respuesta in-mune adaptativa todavía no se com-prenden totalmente y son objeto dediscusión (447). Existen algunas cuestionesque todavía no tienen respuesta y otrastienen que aclararse; por ejemplo, cuantose refiere a si existe o no un receptor ce-lular específico que reconoce las sales dealuminio. ¿Cómo se produce la inflama-ción inducida por las sales de aluminio invivo?, ¿se produce indirectamente cau-sando citotoxicidad y liberación de DAMPcomo ácido urico, que forma cristalesMSU, o bien directamente mediante la ro-tura de los lisosomas y facilitando el es-cape de la fagocitosis? El LPS se requierepara sobrerregular la expresión de ARNmde IL-1β y para activar la caspasa-1 in vitro,pero, ¿qué induce estos efectos in vivo?,¿existe un papel biológico para la induc-ción de IL-1β y para la acumulación de


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Tabla 8. Propiedades de los dos grupos de adyuvantes, según Cox y Coulter (1997).

Adyuvante Inmunomodulación Presentación Inducción Tc Objetivo Depot Observaciones

Particulados

Sales de Al Fuerte Th2, IgE - - + +ST*

Emulsiones w/o Débil Th1 y Th2 - - ó +++** - +++ST

Emulsiones o/w Débil Th1 y Th2 +++ - + -

ISCOM Fuerte Th1 y Th2 ++++ ++++ +++ -

Liposomas - +++ ++ ++ -

Nanopartículas - - - ++++ -

Micropartículas - - - - +++LT*

Sales de Ca - - - + +ST

Proteosomas/virosomas - +++ - ++ -

Estearil-tirosina Mod Th1 y Th2 - - - +ST

γ-inulina Mod Th1 - - - -

Algamulina Mod Th1 y Th2 - - + +ST

PNo particulados

MDP-hidrofílico Fuerte Th2 - - - En emulsiones w/o

MDP-lipofílico Fuerte Th1 - - - En emulsiones o/w

Copolímeros no iónicos ¿ +++ - - ó +++ En w/o u o/w

Saponinas Fuerte Th1 y Th2 - + - En ISCOM.Con liposomas, MPL

Lípido A (MPL) Fuerte Th1 - - - Con liposomas, o/w, saponinas

Citoquinas varios - - - Con adyuvantesparticulados

Polímeros Mod. Th1. Induce IL-1 - - +++ ¿Conjugados?de carbohidratos

Derivados ¿ - - +++de polisacáridos

Avridina DDA Th1 En liposomas, o/w,tóxicos

CWS (cell wall skeleton) Th1? En o/w, con MPL

Dehidroepi-androsterona Th1 Difícil de administrar

Vitamina D3 Th2, induce IgAs Difícil de administrar

TDM (trehalosa dimicolato) Th1 Difícil de administrar,tóxico

P3CSS +++ Tóxico potencial

Poli I:C Poli ICLC Th1 (Á-IFN) y Th2 (IL-4) Tóxico

Poli A:U Th2 (IL-6)

*ST: < 2 semanas; LT: semanas o meses.**: buena respuesta solo para péptidos aplicados externamente.



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neutrófilos?, ¿es crucial la activación delinflamasoma y de la caspasa 1 para la ac-tividad adyuvante de las sales de aluminio,o no lo es? Tampoco existe todavía nin-guna prueba definitiva de la hipótesis ori-ginal de que el efecto depot de las salesde aluminio contribuya a la acción adyu-vante (Marrack et al., 2009).

Las sales de aluminio han sido utilizadascon éxito en millones de vacunaciones enel hombre (especialmente) y en los ani-males (en menor proporción, pues se pre-fieren adyuvantes orgánicos) a lo largo decasi 100 años, contribuyendo a la luchacontra las enfermedades infecciosas conmínima toxicidad, aunque en el caso dela vacunación frente a patógenos queexigen la concurrencia de una buena res-puesta celular (Th1), como hemos seña-lado antes, la respuesta no ha sido sufi-cientemente eficaz.

La incorporación de sales de aluminio (ge-neralmente hidróxido de aluminio) escomún en vacunas de uso humano y enSanidad Animal, como ocurre con una va-cuna frente al virus de la diarrea vírica bo-vina-enfermedad de las mucosas, frenteal herpesvirus de la rinotraqueítis infec-ciosa bovina (IBR), en una vacuna mixtafrente a coronavirus, rotavirus y E. coli,Manheimia haemolytica, virus de la pa-rainfluenza, Clostridium chauvoei, etc.

Emulsiones. Aunque el conocimiento delas emulsiones procede de comienzos delsiglo pasado (Le Moinic, 1916) (448), nofue hasta 1937 cuando Freund se ocupóde profundizar en el concepto (449). Unaemulsión se define como una dispersiónde un líquido denominado fase dispersaen un segundo líquido denominado fasecontinua con la que la primera no es mis-

cible. En las formulaciones vacunales estasfases son agua (el medio antigénico) yaceite.

Aunque al principio las emulsiones eranmuy inestables y viscosas y producíanfuertes reacciones locales en el sitio de in-yección, en la actualidad, las nuevas ge-neraciones de aceites han permitido el de-sarrollo de emulsiones estables y seguras.Con el fin de estabilizar las emulsiones seañaden surfactantes, compuestos quecontienen un grupo polar, hidrofílico, y ungrupo no polar, hidrofóbico, que frecuen-temente está compuesto por una cadenade ácidos grasos. Los surfactantes se de-finen por su balance hidrofílico/lipofílico(HLB).

La caracterización físico-química de lasemulsiones se lleva a cabo a partir devarios parámetros, como la prueba de lagota, la conductividad, la viscosidad, eltamaño de la partícula y la estabilidad avarias temperaturas. En la tabla si-guiente (450) se recogen las caracterís-ticas físico-químicas de emulsionesagua/aceite (w/o), agua/aceite/agua(w/o/w) y aceite/agua (o/w) comparadascon el adyuvante incompleto de Freund(IFA).

El modo de acción de las emulsiones noestá muy claro y se basa en diferentes me-canismos, el primero de los cuales es elefecto depot y la consiguiente liberaciónlenta del antígeno desde el sitio de inocu-lación, pero, según el tipo de emulsiónque se considere, la cinética de liberacióncambia. En cualquier caso, una proteínasin adyuvante se elimina inmediatamente.

En las emulsiones o/w puede permitirseun ligero retraso en la eliminación del an-tígeno que, en cualquier caso, se consi-


dera rápida. En las emulsiones w/o la li-beración del antígeno no se induce o estaes muy baja, hecho que correlaciona conla estabilidad de la emulsión y en cuantoesta se rompe se liberan grandes canti-dades de antígeno, pero siempre deforma más lenta que en las emulsioneso/w. Las emulsiones w/o/w tienen uncomportamiento intermedio.

El efecto depot no es el único mecanismode actuación. Freund demostró (1956)(451) que la escisión del material en elpunto de inyección no suprimía el efectoadyuvante; es decir, que la microdifusiónde pequeñísimas gotitas de aceite a losganglios linfáticos que drenan en el puntode inyección puede explicar, al menos enparte, esta observación. Las emulsionesprotegen también al antígeno de la rápidadegradación por enzimas y pueden mo-dificar la carga eléctrica del antígeno, ha-ciéndole más inmunogénico. Tambiéncrean un proceso inflamatorio y estimulanel reclutamiento de macrófagos y otrascélulas presentadoras de antígeno,además de linfocitos, siendo capaces defavorecer la captación por las interac-ciones que se suceden entre el surfactante

y la membrana celular. La captura de lin-focitos es otro mecanismo de acción delos adyuvantes oleosos, pues estimulan suacumulación en los nódulos linfáticos y al-teran la recirculación facilitando entoncesla asociación celular. Finalmente, según eltipo de emulsión seleccionada, puede in-ducirse la liberación de distintas cito-quinas (452).

Los adyuvantes en forma de emulsiónw/o, como el adyuvante incompleto deFreund, eran aún demasiado reactogénicospara su uso en la vacunación humana, porlo que la tecnología ha refinado los proce-dimientos y en la actualidad se han conse-guido nuevas versiones de las emulsionesagua-aceite que se aceptan en el hombre,principalmente con destino a las denomi-nadas “vacunas terapéuticas“. Entre estasúltimas se incluyen las emulsiones deMontanide, una familia de adyuvantes quese utilizan en los estudios de vacunaciónfrente a procesos cancerígenos humanosde próstata, ovario y pulmón (453) (Leroux-Roels, 2010).

Las emulsiones w/o se recomiendan, en elcampo de la Sanidad Animal, para los


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Tabla 9. Características de las emulsiones comparadas con el adyuvante incompletode Freund (ISA) (Aucourier et al., 2001).

Caracteres IFA (w/o) Montanide Montanide Montanide MontanideISA 50 (w/o) ISA 70 (w/o) ISA 206 (w/o/w) ISA 25 (o/w)

Ratio aceite/agua 50/50 50/50 70/30 50/50 25/75

Conductividad < 1 µs < 1 µs < 1 µs > 1 ms > 1 ms

Viscosidad 2.000 mPa s 200 mPa s 50 mPa s 50 mPa s 20 mPa s

Microscopía 1-5 µm 1 µm 1 µm 1 µm 0,5-1 µm

Estabilidad a 4 ºC Pocas semanas > 2 años > 2 años > 2 años > 2 años

Estabilidad a 20 ºC Pocas semanas > 2 años > 2 años > 6 meses > 2 años

Estabilidad a 37 ºC Pocas semanas > 3 meses > 3 meses > 1 semana > 2 meses


grandes y pequeños rumiantes, las aves ylos peces, siempre que se requiera el de-sarrollo de una inmunidad de larga dura-ción. Por ejemplo, en el caso de la fiebreaftosa, las emulsiones oleosas de este tipopueden inducir una protección de hasta1 año de duración, mientras que formu-laciones basadas en el uso de hidróxidode aluminio requieren, para lo mismo, dosinoculaciones o más. Pueden sustituirselos aceites minerales por otro tipo de sus-tancias oleosas en el caso de antígenosmuy reactivos, pero ello va en detrimentode la eficacia de la vacuna, por lo que unabuena opción es utilizar una mezcla deaceites minerales y no minerales. En al-gunos casos se pueden producir algunasreacciones locales, inconveniente que seasume a favor de la buena protección quegeneran, especialmente en algunos casos,como sucede en la protección frente a lavacunación de truchas contra la foruncu-losis, limitándose las inoculaciones a unasola en el periodo de máximo riesgo, du-rante el crecimiento (454). En avicultura,este tipo de productos son muy comunesen vacunas frente a enfermedadesaviares, como la enfermedad de Gumboroy pneumovirus aviar (mixta) o enfermedadde Newcastle.

Las emulsiones w/o permiten la reducciónde la dosis o de la concentración de antí-geno necesario para inmunizar, lo cual su-pone un asunto del máximo interés desdeel punto de vista económico. Por ejemplo,en el caso de la vacunación contra la en-fermedad de Newcastle, utilizando un ad-yuvante oleoso a base de un aceite mi-neral, se protegen frente al desafío conuna dosis 100 veces menor de la habitualde antígeno. Los aceites orgánicos, no mi-nerales, son menos eficientes, pero tam-

bién pueden inducir un 100% de protec-ción con la mitad de la dosis habitual.

Las emulsiones w/o también puedenexaltar la respuesta inmune celular, puesde hecho, en algunos estudios se ha de-mostrado que la protección no correla-ciona con la inmunidad humoral (455);además, estudios de citometría de flujohan demostrado un importante aumentodel número de células CD8+ después dela inmunización. También se ha demos-trado la presencia de inmunidad asociadaa la presencia de células Tc (456). En va-rios estudios llevados a cabo en un mo-delo ratón con antígenos de distinta na-turaleza, virales, bacterianos oprocedentes de parásitos, indujeron ni-veles más altos de IgG2a que cuando seutilizaban otro tipo de emulsiones.

En el caso de las emulsiones o/w, sumodo de acción no se comprende deltodo, aunque se piensa que se debe auna respuesta inflamatoria innata. El re-clutamiento de células presentadoras deantígeno y su activación exalta la persis-tencia del antígeno en el sitio de infeccióny la presentación a las células inmuno-competentes, además de la liberación dediferentes patrones de citoquinas (457).

Las emulsiones o/w son muy fluidas, bientoleradas e inducen una fuerte respuestainmune, pero de corta duración. La ratiode participación de la fase oleosa es muybaja, entre el 15 y el 25%, una circuns-tancia, por otra parte, que explica su se-guridad.

Las emulsiones o/w han mejorado los per-files de reactogenicidad en comparacióncon las emulsiones w/o y han sido utili-zadas con éxito en vacunas autorizadas,tanto en el caso del hombre como en


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Sanidad Animal. En el caso de una vacunacontra la gripe humana, por ejemplo, for-mulada con este tipo de emulsiones, seha descrito que estimula la respuesta hu-moral (vía Th2). En el caso de enferme-dades infecciosas de los animales, estetipo de emulsiones se utilizan con segu-ridad en el caso de los cerdos, en vacunasfrente a enfermedades bacterianas o ví-ricas, como en la enfermedad de Aujeszky(458-460); pero en el caso de animales decompañía, como los perros, y también enlos caballos, no son aconsejables a causade que producen reacciones locales, queno se admiten.

Las emulsiones multifásicas w/o/wfueron desarrolladas, inicialmente, porHerbert en 1965, en un proceso en dosfases, lo que supone mayor dificultadpara la preparación y su estabilidad noes muy buena, aunque en los últimosaños se ha conseguido mejorar esta tec-nología en una sola fase (doble emul-sión), ganando en estabilidad y fluidez,lo que supone mejoras importantes parasu aplicación. El interés de este tipo deemulsiones reside en su baja viscosidady en su capacidad para inducir una res-puesta inmune de corta o larga dura-ción. El antígeno se encuentra en la faseexterna, acuosa y está disponible para elsistema inmune, mientras que el que sealoja en la parte interna (tambiénacuosa), se libera lentamente a través dela emulsión oleosa. En el caso de lafiebre aftosa, por ejemplo, una emulsiónde este tipo fue capaz de proteger alcerdo y al ganado bovino tan solo 4 díasdespués de la vacunación (461), lo querepresenta una ventaja muy importanteen el caso de explosión de brotes. Noobstante, las emulsiones multifásicas

también pueden inducir inmunidad delarga duración, como sucede en el casode la septicemia hemorrágica bovina,que con solo una inoculación consi-guieron protección de más de 1 año deduración (462). En el cerdo se reco-mienda las que incorporan aceite mi-neral, aunque una buena alternativa esuna mezcla de aceite mineral y orgánico.Este tipo de emulsiones incrementa tam-bién la respuesta humoral y también seha descrito la inducción de IL-6.

Nanopartículas. Es un concepto definidocomo muy interesante por parte de nu-merosos autores. Las nanopartículas lí-quidas (de un tamaño de entre 10 y 500nm), dispersadas en agua y combinadascon un inmunoestimulante han sido utili-zadas en vacunas frente a la rinitis atró-fica y pleuroneumonía porcinas, indu-ciendo una buena respuesta inmune, sinreacciones locales, igual que en el caso dela anaplasmosis bovina y en peces y caba-llos (Aucouturier et al., 2001).

En resumen pues, en el caso de las emul-siones no existe un producto universal,por lo que la decisión de uso depende delas circunstancias de cada situación, puesunas especies son más sensibles queotras. Por ejemplo, si se trata de bovinoso de aves, funcionan muy bien las emul-siones w/o, mientras que en el caso de loscerdos se prefiere las de o/w. En lo que serefiere al antígeno, puede adoptar las másdiversas presentaciones, desde una pre-paración cruda, por ejemplo un extractode cultivo, a una proteína purificada o unpéptido sintético, procedentes de bacte-rias, virus o parásitos. Los aceites mine-rales pueden utilizarse cuando no existenantígenos reactivos, como es el caso delas proteínas purificadas o los péptidos


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sintéticos, por ejemplo. Los aceites no mi-nerales se recomiendan en el caso de an-tígenos más reactivos. Las emulsionesmultifásicas (w/o/w) o las emulsiones o/wpueden utilizarse con vacunas vivas o deADN.

Los adyuvantes en forma de emulsionesdeben ser capaces de incrementar la res-puesta humoral o celular como parte delos mecanismos de protección frente a lasenfermedades infecciosas. Las emulsionesw/o inducen, por lo general, respuesta debase celular (Th1). Las emulsiones w/o/wu o/w exaltan principalmente la respuestahumoral, pero pueden asociarse tambiéncon adyuvantes que exaltan la respuestacelular. La duración de la inmunidad tam-bién debe de ser una cuestión a consi-derar cuando se trata de seleccionar el ad-yuvante más conveniente en un casoparticular, igual que la vía de inoculación,pues esta puede influenciar posibles reac-ciones locales y el tipo de respuesta in-mune inducida. La misma formulación,administrada por vía subcutánea o intra-muscular, puede dar lugar a diferentesrespuestas (463). Cuando, de acuerdocon estos criterios, las emulsiones clásicasno satisfacen los objetivos de la vacuna-ción, una buena alternativa puede estarrepresentada por las nanopartículas.

Liposomas y virosomas. Los liposomasson nanosferas sintéticas estructuradaspor capas lipídicas que pueden encapsularantígenos y que pueden actuar como ve-hículos de presentación o distribución. Enesencia están compuestos, principal-mente, por fosfolípidos con una faseacuosa en el interior de la partícula for-mada por una bicapa lipídica. El antígenopuede estar, indistintamente, encerradodentro de la partícula en el interior de la

fase acuosa, o intercalado en la capa lipí-dica y, por lo tanto, accesible desde el ex-terior (464).

Aunque propiamente dicho no son ac-tivos, su modo de acción principal tieneque ver con la presentación del antí-geno. Se ha demostrado que inducentanto respuesta humoral como celular(465). Se han llevado a cabo estudioscon proteínas víricas incorporadas en li-posomas que han demostrado ser inmu-nogénicas (466). Una utilidad impor-tante de los liposomas es su uso para laadministración oral de antígenos, en losque estos se sitúan atrapados en los li-posomas. De este modo se han prepa-rado vacunas experimentales frente a in-fecciones por Aeromonas salmonicida(467) en la carpa. Se ha formulado tam-bién un péptido de listeriolisina, proce-dente de L. monocytogenes en lipo-somas de Quil-A (ver después),obteniéndose una respuesta de linfo-citos Tc que se tradujo en la supervi-vencia de los ratones desafiados conhasta 10 DL50 (468).

Los liposomas han sido utilizados tambiénen las vacunas de ADN, bien para vehi-cular plásmidos, como en el caso del virusde la diarrea vírica bovina, que expre-saban la proteína E2, bien en una vacunapara el ganado bovino (469) que no fun-cionó satisfactoriamente o en el manteni-miento de extractos alergénicos en unavacuna frente a la dermatitis atópica ca-nina (470).

Los archeosomas son liposomas formadospor lípidos polares de Archaeobacteria yhan demostrado ser adyuvantes muy efi-caces en la inducción, tanto de respuestasTh1 como Th2. Se ha señalado que estos


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lípidos, únicos, están presentes solo en lasarchaeobacterias y su actividad adyuvantese dirige principalmente a la activación delas células dendríticas (471).

Los virosomas son envolturas vacías devirus, como el de influenza, en la práctica,semejantes a los liposomas, pero con laventaja adicional de que incluyen glico-proteínas funcionales de la envoltura ví-rica, que facilitan su utilización por partede las células y la membrana de fusión fa-cilita también la entrega de los antígenosa las células diana (figura 33) (472).Existen vacunas autorizadas que utilizanvirosomas en el caso del virus de la gripehumana, tanto para adultos como parauso pediátrico y también en el caso de lahepatitis A, por ejemplo; experimental-mente, en ratón, también se ha descritoel uso de liposomas frente frente aLeishmania donovani. En el caso de laSanidad Animal, la utilización más cono-cida de los virosomas es la de vacunasfrente a la enfermedad de Newcastle, enla que algunos autores utilizan DHPC (1,2-dihexonoilfofatidilcolina) como solubili-zador de la membrana vírica para pre-parar los virosomas, manteniendo de estemodo los antígenos correspondientes a lahemaglutinina, neuraminidasa y proteínade fusión (473), o frente a los metapneu-movirus del pavo (474) (en este caso, parala extracción de los virosomas utilizaronTriton X-100).

Entre los adyuvantes que hemos dado enconsiderar “nuevos o modernos“ se in-cluyen los compuestos que incrementanla actividad de los TLR, esto es, los ago-nistas de los receptores Toll-like.

Hemos señalado anteriormente, que losTLR son un buen ejemplo de receptores

de reconocimiento de patógenos y el sis-tema inmune los utiliza para el reconoci-miento de “patrones moleculares aso-ciados a patógenos“ (PAMP). Los TLRforman parte de los denominados PRR(receptores de reconocimiento de pató-genos).

El descubrimiento de los TLR y el reco-nocimiento de su relación con la inmu-nidad innata y adaptativa ha llevado aldesarrollo de una serie de nuevos adyu-vantes/inmunopotenciadores que ejercensu función adyuvante a través de la es-timulación directa de células de la res-puesta innata, como macrófagos, mo-nocitos y células dendríticas mediadopor los PRR (los TLR).

Muchos ligandos naturales o sintéticos dela mayoría de los TLR (agonistas de TLR)identificados hasta la fecha son poten-ciales compuestos utilizables en inmuno-terapia y como adyuvantes vacunales(tabla 6).

El MPL (3-0-desacil-4’-monofosforil lípidoA) es un agonista del TLR-4 y es uno de losinmunoestimulantes utilizados en vacunashumanas. El MPL es una forma detoxificadadel LPS de Salmonella Minnesota y man-tiene su capacidad para unirse al TLR-4 yactuar sobre las células de la inmunidadinnata con el mismo mecanismo que lohace el LPS. Se ha demostrado que esti-mula la expresión de moléculas coestimu-latorias y la liberación de citoquinas, me-jorando cualitativa y cuantitativamente lasrespuestas humoral y celular, dependiendodel antígeno que se considere. Está auto-rizado para su uso como adyuvante en elcaso de una vacuna contra el virus de lahepatitis B y otra frente al virus del papi-loma (Garcon et al., 2007).


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Figura 33. Procesado del Ag mediado por virosomas: En primer lugar, se une el virosoma a la CPA, mediadapor la interacción entre la HA y el ácido siálico, seguido de la endocitosis del virosomas. Se produce la fusióndel virosoma con la membrana endolisosómica hasta producir la acidificación y el cambio conformacional dela HA. Sigue después el procesado del Ag y la liberación del contenido del virosoma en el citoplasma y el pro-cesado endógeno vía MHC-I. En la figura de abajo se presenta la activación de las células Tc por los antígenosdel virosoma (Felnerova et al., 2004) (475).


Entre los agonistas de otros TLR se in-cluyen las secuencias inmunoestimula-doras (ISS) del ADN microbiano (477), lascuales, cuando son reconocidas por losTLR, pueden llevar a la amplificación de larespuesta inmune adaptativa después deamplificar la respuesta innata. Se han ca-racterizado varias ISS con distintas activi-dades biológicas, y los datos preliminaresobtenidos ponen de manifiesto que su

uso en las vacunas incrementa la res-puesta humoral y celular frente a los an-tígenos vacunales, como se ha compro-bado en el caso de varios virus de interéshumano (VIH, hepatitis B, el agente de lamalaria, alergias y otras enfermedadescrónicas).

El ácido poliinosínico: ácido policitidí-lico (poli I:C) es un ligando agonista delTLR-3 y ha sido utilizado con éxito en va-


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Tabla 10. Receptores de reconocimiento de patrones moleculares (PRR) y ligandos(Akira y Takeda, 2004) (476).

Receptores Ligandos (PAMP Y DAMP)de reconocimientode patrones (PRR)TLR-1/TLR-2 Lipoproteínas (triacil lipopéptidos) bacterianas de Mycobacterium

o Neisseria; α-defensinas (endógenos).TLR-2 Zymosan de levaduras, peptidoglicano, lipoproteínas,

lipoarabinomanano, porinas, GPI-mucina, fosfolipomanano, α-glicano(grampositivos y gramnegativos, micobacterias, neiserias, virus,protozoos, hongos), glicoproteínas de envoltura, glicolípidos, LPS;α-defensinas y proteína A surfactante (endógenos).

TLR-3 ARNbc, Poly:IC; ARNm (endógenos).TLR-4 LPS de bacterias, glicoproteínas de envoltura, glicoinositol

fosfolípidos, manano (gramnegativos, virus, protozoos, algas),productos de plantas; fibronectina, fibrinógeno, elastasa de neutrófilos,lactoferrina, LDO oxidado, ácidos grasos saturados, heparán sulfato,fragmentos de ácido hialurónico (endógenos).

TLR-2/TLR-4 Glucuronosilomanano (Cryptococcus neoformans); HSP60, 70, Gp96,HMGB1, proteína D del suero surfactante, amiloide A y biglicano(endógenos).

TLR-5 Flagelina de las bacterias.TLR-6 Zymosan de levaduras, ácido lipoteicoico, lipopéptidos de micoplasmas.TLR-2/TLR-6 Diacil-lipopéptidos, ácido lipoteicoico (grampositivos y micoplasmas);

versicano (endógenos).TLR-7 ARNmc, componentes sintéticos como loxoribine y bromopirimine.TLR-8 ARNmc.TLR-7/TLR-8 ARNmc de virus; ARNmc (endógenos).TLR-9 Oligonucleótidos CpG, hemozoína de virus, bacterias o protozoos;

complejos de IgG-cromatina (endógenos).TLR-10 Desconocido.TLR-11 Componentes de bacterias uropatógenas.NOD-1 y NOD-2 Peptidoglicano, ácido diaminopimélico (gramnegativos), muramil

dipéptido (gramnegativos y grampositivos).Receptores de residuosProteínas acetiladas, lipoproteínas de baja densidad y otros ligandos

polianiónicos.Receptores Macrófagos (MMR): manosa y mucosa. Otros: β-glucano.de lectinas tipo C


cunas experimentales frente al virus de lagripe (478).

El CpG (Citosina-fosfato-Guanina) delADN es un oligonucleótido no metilado,un agonista del TLR-9 e inductor de cito-quinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1,6,IFN-α,γ−), un ejemplo de ISS que se estáutilizando en Medicina Humana para laterapia del cáncer y en estudios preclí-nicos. Se ha utilizado también en vacunasexperimentales frente a SalmonellaTyphimurium (479), Toxoplasma gondii(480) y Leishmania major (481). CpG soloo en combinación con alérgenos estásiendo utilizado para el tratamiento delasma y alergias (482). Se ha comprobadoque posee capacidad para inducir res-puesta Th1 y de linfocitos Tc.

Las imidazoquinolinas se unen a losTLR-7 y TLR-8, y también se consideranbuenos candidatos para ser utilizadoscomo adyuvantes (483). Son compuestosorgánicos sintéticos, por ejemplo el imi-quimod y el resiquimod, que manifiestanuna fuerte actividad antiviral a través dela inducción del mismo tipo de respuestainmune, uniéndose al ARN, mimetizandoel ligando natural del receptor TLR. Se hademostrado que aumentan la respuestade células T frente a infecciones víricascon un incremento de la actividad protec-tora antivírica en ensayos llevados a caboen modelo ratón (484).

No hemos encontrado referencias del usode agonistas de los TLR en vacunas desti-nadas a los animales, ni frente a enferme-dades infecciosas ni frente a ningún otrotipo de desorden. En cualquier caso, esjusto señalar que la mayor parte de los es-tudios que se están realizando para vacu-

naciones en el hombre se están llevandoa cabo en modelos animales.

Las saponinas son otro tipo de inmuno-potenciadores, en este caso derivados deplantas (corteza, hojas, tallo, raíces e in-cluso flores) (485), en las que su funciónes desconocida, sometidas a evaluacióncomo adyuvantes para vacunas humanasy de las que existe experiencia acreditadaen vacunas frente a enfermedades infec-ciosas de los animales, actividad en la quefueron introducidas primero por Espinet(1951) (486). Se sabe que inhiben el cre-cimiento de mohos y que protegen a lasplantas de los insectos. Además, poseenactividad antibacteriana y son fuente demonosacáridos (487). Todavía se utilizanpor sus propiedades detergentes como unagente espumante barato (488).

Químicamente son un grupo heterogéneode esteroles glicósidos y terpenoides gli-cósidos, complejos, que contienen una es-tructura en anillo y carbohidratos que seunen específicamente al colesterol y ori-ginan poros en las membranas biológicas.Aunque los mecanismos de la actividadadyuvante comparados con los efectostóxicos no han sido bien estudiados, losmateriales a base de saponina podríantener, presumiblemente, un balance entreuna potencial toxicidad (por ejemplo, ac-tividad hemolítica) y efectos beneficiososcomo adyuvante.

Se incluyen la Quil A, una saponina na-tural extraída de la corteza de la Quillajasaponaria, una de cuyas fracciones, deno-minada QS-21, ha demostrado ser un po-tente adyuvante con capacidad paraexaltar la presentación del antígeno a lascélulas presentadoras de antígeno e in-ducir, predominantemente, la producción


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de linfocitos T citotóxicos, provocando se-creción de citoquinas Th1 y Th2 en mo-delos animales (489, 490). Se ha afirmadoque el mecanismo adyuvante de la Quil Arepresenta una interacción entre un antí-geno amfipático con el complejo coles-terol/Quil A que resulta efectivo para es-timular la inducción de linfocitos Tcitotóxicos (491, 492). La Quil A es la basede los ISCOM (ver después).

QS-21 se ha propuesto como adecuadapara incluir en vacunas humanas, particu-larmente en combinación con monofos-foril lípido A (MPL) y una emulsión de tipoo/w denominada AS02A (493), aunquelos primeros estudios llevados a cabo handescrito alguna actividad lítica residual enel punto de inyección. Estudios recientesdirigidos a disociar los efectos tóxicos delos efectos adyuvantes de la saponina handado lugar a una nueva saponina semi-sintética que tiene una toxicidad reduciday una mayor actividad adyuvante compa-rada con la QS-21 para su inclusión en va-cunas humanas (494).

Los ISCOM (Immune StimulatingComplexes) son adyuvantes utilizandosinicialmente como vehículos de antígenos.Son complejos tipo “jaula“ compuestosde lípidos, colesterol, el antígeno y Quil-A. La función de estos compuestos seproduce a través de interacciones hidro-fóbicas para atrapar al antígeno proteicoy son incorporados mediante endocitosispor las células presentadoras de antígeno.Un segundo tipo de ISCOM se denominaISCOMATRIX (ISCOM matrix o ISCOM va-cíos porque no incluyen el antígeno en suinterior, que se añade a posteriori).

Los ISCOM han permitido la obtención detítulos altos de respuesta de anticuerpos,

así como de células Th y Tc en modelosanimales. La respuesta inmune obedecetanto a la presentación del antígeno enunión de los antígenos de histocompati-bilidad de clase I como de clase II, combi-nado con el efecto inmunomodulador dela saponina.

Se han preparado ISCOM con moléculasanfipáticas de una amplia variedad devirus, como el herpes simples tipo 1, cito-megalovirus, Epstein-Barr, hepatitis B,rabia e influenza, y también con proteínasde la pared celular de bacterias, como B.abortus, o parásitos, como Plasmodiumfalciparum o Toxoplasma gondii.

Finalmente hemos de referirnos a lascombinaciones de inmunopotenciadoresclásicos y nuevos. Se refiere a combina-ciones de antígenos con más de un adyu-vante a las que también se denominaASA (Adjuvant System Approach). Elsistema introduce la idea de que la inte-racción con la respuesta inmune innata yel efecto subsiguiente sobre la respuestaadaptativa puede modularse mejor con lacombinación de más de un adyuvante, enun sistema de este tipo. Así pues, utili-zando múltiples adyuvantes en combina-ción puede influenciarse la activación delas células presentadoras de antígeno amás de un nivel y de este modo conducirmejor el tipo de respuesta adaptativa,consiguiendo mayor umbral de la misma.

El desarrollo de vacunas recombinantesadyuvantadas se inició hace ya 20 años eimplica el diseño cuidadoso de la combi-nación de adyuvantes para producir unefecto sinérgico o aditivo mejorando larespuesta inmune. A este respecto, MPL yQS-21 se piensa que son inmunopotencia-dores en combinación con adyuvantes clá-


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sicos (sales de aluminio, emulsiones o/w oliposomas) y en la actualidad son compo-nentes clave de diferentes sistemas ASA(AS04, AD02, AS01, AS15…). AS04 con-siste en MPL adsorbido sobre AlOH o fos-fato alumínico, en el que MPL desempeñaaquí un papel crucial en la activación de lainmunidad innata. Después de la unión deMPL a TLR-4, se produce una exaltaciónde la inmunidad humoral y celular predo-minando respuesta Th1. AS02 combinauna emulsión o/w con MPL y QS21 y pro-duce una fuerte respuesta de células T quegenera una buena protección.

Adyuvantes para vacunas de mucosas

Aunque las distintas formas de presenta-ción del antígeno, incluyendo micropartí-culas, poseen un potencial significativopara ser utilizadas en las vacunas de mu-cosas, todavía puede mejorarse si se uti-lizan en combinación con adyuvantes(495). Casi todos los datos disponiblessobre adyuvantes para vacunas de mu-cosas con destino a la vacunación de espe-cies animales proceden de estudios expe-rimentales llevados a cabo principalmenteen cerdos, conejos y ovejas, aunque pun-tualmente se dispone de alguna informa-ción (escasa) de vacunas para otras espe-cies, como caballos, perros, ganadobovino, gatos y otras.

En cualquier caso, la experiencia acumu-lada en esos últimos años pone de mani-fiesto, por ejemplo, que una simple encap-sulación de las vacunas en micropartículasno resulta suficiente para lograr el éxito enlas vacunas orales, siendo por ello necesa-rias mejoras en la tecnología de prepara-ción (496).

Los adyuvantes más potentes de que sedispone en la actualidad para potenciar la

respuesta inmune de las vacunas de mu-cosas son las toxinas bacterianas de Vibriocholerae y Escherichia coli, toxina coléricay LT, respectivamente, que causan el có-lera y la diarrea de los viajeros. Ambas seunen a receptores de tipo gangliósido enlas células diana del intestino.

La toxina colérica (CT) y la toxina ter-molábil de E. coli (LT) son potentes in-munógenos e inducen respuestas de IgAsecretora (IgA-s) e IgG en el suero, peroademás, ambas toxinas pueden actuarcomo adyuvantes exaltando la respuestade anticuerpos a nivel de mucosa y en elsuero frente a otros antígenos coadminis-trados y dispuestos en la mucosa, lo quegenera una respuesta de memoria delarga duración. Después de la administra-ción intestinal de LT y CT, ambas se unena las células de la mucosa intestinal, quesecretan, como consecuencia de ello, IL-1, IL-6, IL-10 e IL-1Ra. Además, CT y LT in-crementan la permeabilidad intestinal,aunque no está claro si ello permite el au-mento de permeabilidad a las macromo-léculas que forman el antígeno vacunal.Una vez que atraviesan la mucosa soncapturadas principalmente por las célulasdendríticas, induciendo su maduración ymigración a los ganglios linfáticos, dondese produce la interacción con los linfocitosT naïve, iniciando una respuesta Th2,igual que sucede en el caso de los macró-fagos. La tabla 11 presenta un resumendel uso de CT como adyuvante en va-cunas destinadas a los animales, utilizadaprincipalmente por vía intranasal, conbuenas respuestas de IgA en el caso decaballos, cerdos y conejos.

En el caso del hombre y en algunas espe-cies animales, CT y LT resultan demasiadotóxicas para ser utilizadas, por lo que han


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sido manipuladas genéticamente para re-ducir su toxicidad (497), sustituyendo unaminoácido en la subunidad A, lo quepermite el desarrollo de una toxina mu-tante que retiene su potencial actividadadyuvante pero que muestra una reduc-ción espectacular de la toxicidad (498).También se ha producido mutantes afec-tados en una delección de tres aminoá-cidos (LT triple-aa), que igualmente man-tiene su capacidad adyuvante. De estemodo se disocia la enterotoxicidad de suefecto adyuvante y los mutantes son ac-tivos cuando se aplican por vía intranasal,por vía oral o por vía rectal.

Así pues, este tipo de enterotoxina proce-dente de mutantes ha sido utilizada parainducir inmunidad protectora en el ratónfrente a Helicobacter pylori (499), yademás también se han utilizado comoadyuvantes potentes en el caso de va-cunas orales frente a la gripe (500).

En el caso de los animales, se han utili-zado principalmente mutantes LT, bien tri-ples o únicos, en los términos señalados,con destino al cerdo, ganado bovino,

gatos y conejos, prácticamente en todoslos casos por vía intranasal y con antí-genos de E. rhusiopathiae, B. bronchisep-tica, E. coli (intimina), proteínas de rota-virus, fimbrias de E. coli, proteínas delvirus de la inmunodeficiencia felina o he-maglutinina del virus influenza. Mutantesde CT se han utilizado intranasalmente enel cerdo con antígenos fimbriales (F18) deE. coli (Gerdst et al., 2006).

En el hombre se han evaluado varias rutasalternativas de inmunización con mu-tantes de LT, incluyendo la vía nasal, intra-vaginal e intrarrectal, y de todas ellas lavía intranasal es la que ha resultado másprometedora, debido tanto a la potenterespuesta inducida como a la facilidad deacceso y a los dispositivos de administra-ción existentes en la actualidad. En mu-chas ocasiones se ha demostrado la capa-cidad de los mutantes LT para inducir unarespuesta inmune con títulos altos de an-ticuerpos cuando se administra intrana-salmente (501). Estudios recientes coneste tipo de mutantes han demostradoprotección frente al desafío con B. per-


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Tabla 11. CT como adyuvante en vacunas de mucosas para animales.

Especie Vía Antígenos Respuesta

Cerdos In, oral Proteína de Ascaris, Incremento IgG en suero, IgA nasal,proteína virus PRRS, IL-4, IL-10, protección, IgA intestinal.fimbrias, adhesinas.

Ovejas In, rectal T. gondii (taquizoitos), No hay efectos claros. Respuesta L3 Haemonchus contortus. de Ac en suero muy baja.

Caballos In HA del virus influenza. IgA nasal y suero, IgG.

Conejos In, oral OMP P. multocida. IgA nasal e IgG suero.

Gatos In, rectal Virus inmunodeficiencia IgA e IgG suero.felina (péptidos).

Pollos Oral, i-cecal, rectal Coccidios, virus Gumboro Efectos irregulares.inactivado, aflatoxina B1.


tussis (502), Streptococcus pneumoniae(503) después de la administración intra-nasal, así como la inducción de respuestasde Tc (CTL) potentes (504). De igual modotambién Sing et al. (2001) (505) demos-traron que los mutantes LT todavía podíanexaltar más la respuesta si se adminis-traban en un sistema de microsferas bio-adhesivas.

Aunque todavía faltan datos por conoceren relación con el mecanismo de actua-ción de las toxinas del cólera y LT comoadyuvantes de inmunidad, parece que sonimportantes en lo que se refiere al efectoadyuvante, el dominio correspondiente ala subunidad B, la presencia de una subu-nidad A intacta, que interactúa con lasproteínas reguladoras del interior de lascélulas, y también la actividad enzimáticade la subunidad A1 (Rappuoli et al., 1999).

Otros estudios recientes han puesto demanifiesto que este tipo de adyuvantespara vacunas de mucosas permiten tam-bién la vacunación después de la aplica-ción tópica en la piel y que esta estrategiapuede aplicarse tanto a los animalescomo al hombre. Además, la inmuniza-ción epidérmica puede llevarse a cabomediante dispositivos sin agujas, como losque utilizan gas helio para depositar la va-cuna deshidratada en la epidermis (506).La inmunización oral tanmbién puedepracticarse mediante la ingestión deplantas transgénicas que expresan antí-genos y adyuvantes (507).

Otros adyuvantes para vacunas de mu-cosas incluyen componentes de la paredcelular de las bacterias, oligonucléotidosCpG (CpG ODN), péptidos antimicro-bianos, etc. El muramil dipéptido (MDP),el componente activo del adyuvante com-

pleto de Freund, actúa sobre el TLR-2 (tolllike receptor-2) y ha sido utilizado experi-mentalmente en el ratón, por distintasvías, incrementando la respuesta inmuneen las mucosas y los dinucleótidos no me-tilados CpG (citidina-fosfato-guanosina)estimulan macrófagos, células dendríticas,células NK y células B.

Citoquinas o quimioquinas. Varias cito-quinas y quimioquinas, como la IL-1, IL-5,IL-6, IL-12, IL-15, RANTES, linfotoxina(factor de necrosis tumoral beta, FNT-β ofactor citotóxico), MCP-1, MIP-1 y otras,han sido estudiadas experimentalmente enel ratón como adyuvantes para vacunas demucosas, bien en forma de proteínas solu-bles o como genes para vacunas de ADN.En el caso de vacunas veterinarias, el nú-mero de citoquinas/quimioquinas estu-diadas como adyuvantes de vacunas demucosas ha sido todavía muy limitado. IL-1 se ha utilizado en conejos y exalta la ac-tiviad de las células presentadoras de antí-geno y la producción de IgA e IgG por lascélulas B, incrementando la respuesta in-mune frente a Streptococcus.

Mecanismo de acción de losadyuvantes en las vacunas demucosas

Ante la diversidad de productos expuesta,puede suponerse igualmente una nomenos diferente forma de actuar. En ge-neral puede utilizarse alguna de las si-guientes vías para ejercer la inmunopoten-ciación de la respuesta inmune adaptativae innata: 1) Pueden actuar como sistemasde administración o entrega de antígenos,incrementando su utilización a cargo delas células presentadoras de antígeno, conla consiguiente alteración de la conforma-ción estructural dentro de la vacuna, lo


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que permite su liberación progresiva, unretraso en su eliminación y una mejor ex-posición del sistema inmune; 2) Los adyu-vantes también pueden colaborar positi-vamente con los antígenos en activar víassignificativas en la inducción de la res-puesta innata, predominantemente diri-gidas a las células presentadoras de antí-geno, influenciando consecuentemente larespuesta inmune adaptativa.

Estrategias de inmunopotenciaciónde las vacunas que tienen como dianalas células presentadoras de antígeno

Su necesidad surge de la observación deque la mayoría de los productos nuevospara la inmunización frente a las enfer-medades infecciosas, que principalmentese están evaluando en modelos animales(generalmente roedores), son menos in-munogénicas en el hombre y animales degran tamaño, tanto los domésticos pro-ductores de alimentos como otros ani-males útiles por otras aptitudes (com-pañía, ocio, etc.), lo que supone un graveimpedimento para su uso en clínica hu-mana o veterinaria, además de otrohecho destacable, que reside en que enmuchos casos las vacunas experimentalesvan dirigidas frente a patógenos que noinfectan esta especie de forma natural(son resistentes), lo que en el mejor de loscasos no garantiza el éxito en el hospe-dador susceptible natural, de interés.Algunas de las estrategias que se han pro-puesto para mejorar estos inconvenientes,potenciando principalmente la inmuno-genicidad de los antígenos, tienen en lascélulas presentadoras de antígeno (APC)su objeto de estudio principal. Se incluyenlas que pretenden aumentar el recluta-miento celular en la zona de inoculación,

las que promueven la maduración de lasAPC o la mejora de la captación y/o pro-cesamiento del antígeno.

Aumento del reclutamiento celular.Diversos investigadores han comprobado,en el ratón, que la administración del an-tígeno con algunas citoquinas o quimio-quinas puede ser causa del aumento delnúmero de células dendríticas en el puntode inoculación o en el lugar donde se iniciala respuesta inmune (bazo, ganglios linfá-ticos, médula ósea o hígado), y, además,son capaces de actuar como células pre-sentadoras eficaces en un cultivo mixto lin-focitario, como se pudo comprobar en elcaso del Fl3L (ligando del factor de creci-miento hematopoyético) (508). Igual su-cede en el caso de algunas quimioquinascomo MIP-1α y RANTES, que son capacesde actuar como adyuvantes mejorando larespuesta inmune frente a diferentes antí-genos incrementando la respuesta humoraly celular (509) o, en el caso del segundo,la respuesta T CD4+ y CD8+, mejorandola supervivencia de ratones infectados conuna dosis letal del virus del herpes simpletipo 2 (Sin et al., 2000). En el cerdo, la ino-culación intradérmica de un plásmido conla secuencia del factor estimulante de co-lonias-granulocito-macrófagos (GM-CSF)incrementó de forma significativa el nú-mero de células de Langerhans y de otrascélulas dendríticas de la piel en el punto deinoculación (510), y la utilización de GM-CSF como adyuvante en una vacuna frenteal virus de la enfermedad de Aujeszky pro-dujo un aumento significativo de los títulosde IgG1 e IgG2 frente a las proteínas gB ygD y mejoró sus protección frente al mismo(511), pero no se observaron los mismosresultados en el caso de la vacuna frente alvirus de la fiebre aftosa (512).


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Aumento del estímulo de las APC. Lacapacidad de presentación antigénica delas APC aumenta cuando maduran y seactivan, debido a la expresión de recep-tores de quimioquinas y moléculas coes-timuladoras que, además, dirigen la mi-gración de estas células a los órganoslinfoides secundarios. En relación con ello,algunos anticuerpos monoclonales espe-cíficos de los receptores tipo TLR y CD40y ligandos se consideran también adyu-vantes vacunales, dado que las señalesmediadas por estos receptores inducen lamaduración de las células presentadorasde antígeno (513). El ligando del receptorCD40 es la molécula CD154 y ha sido uti-lizado desde hace años para promover laexpresión de CD80/86 en las células den-dríticas, como sucede en el caso del virusde la peste porcina clásica, en la que laadministración de este ligando (CD154)junto con un plásmido portador de la se-cuencia codificante de la proteína E2, me-joró claramente la producción de anti-cuerpos neutralizantes y la protecciónfrente al virus (514), igual que sucedió enel caso del herpesvirus bovino tipo 1, que,fusionado el ligando con la proteína gDdel virus, también produjo una respuestahumoral de mayor intensidad y más rá-pida (515).

Algunas citoquinas, como IL-3 o GM-GSF,también promueven la maduración de al-gunos tipos de células presentadoras deantígeno, mejorando su presentación,como sucede en el caso del virus de lapeste porcina clásica, que favorecen unarespuesta protectora al administrarlas jun-tamente con el plásmido que codificapara la gp55 (516).

Redirección del antígeno a la super-ficie de las APC. Se ha visto, en el ratón,

que utilizando ligandos, anticuerpos mo-noclonales específicos de receptores ex-presados en la superficie de las APC fu-sionados al antígeno, se mejora supresentación a los linfocitos por parte delas APC al facilitar su captura y/o proce-samiento. A este respecto se ha estudiadoel efecto de dirigir el antígeno a distintostipos de moléculas (moléculas de adhe-sión, coestimuladoras, receptores tipo Toll,lectinas, receptores Fc, entre otros) y, porejemplo, fusionando ovoalbúmina al an-ticuerpo monoclonal anti-DEC-205, con-siguieron mejorar la respuesta (necesi-taron 1.000 veces menos de antígenopara obtener la misma respuesta linfopro-liferativa).

Consideraciones y perspectivasen relación con las vacunas enSanidad Animal

La Vacunología es reconocida como unaciencia que combina conocimientos deri-vados de la Microbiología, la Inmunología,la Química de proteínas y la BiologíaMolecular con el fin último de conocer lasbases de la respuesta inmune y su aplica-ción a la prevención de enfermedades, me-diante el desarrollo de vacunas, tanto en elcaso del hombre como el de los animales.

La Vacunología Veterinaria ha tenido,desde sus comienzos hasta el momentopresente, un impacto espectacular no solosobre la salud (Sanidad Animal), el bie-nestar y la producción animal, sino tam-bién sobre la salud humana (SaludPública), en particular sobre ese territoriocomún en el que se asientan enferme-dades compartidas que conocemos bajola denominación de zoonosis. Hacia ellas,pero no solo, se dirige en la actualidad el


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interés de muchos médicos y veterinariosque apuestan por lo que se ha dado endenominar “una sola medicina“. Sobreellas, pero no solo, se justifica la nece-sidad de un intercambio permanenteentre las organizaciones y los científicosde uno y otro signo con el fin de prepararel siempre presente riesgo de las enferme-dades nuevas y emergentes (517). El re-ciente y aún presente brote de gripe aviaren el sudeste asiático por el subtipo H5N1del virus influenza ha puesto nuevamentede manifiesto esta coordinación necesariaentre la Sanidad Animal y la Salud Pública,en el que los animales salvajes (aves sal-vajes, migratorias) son portadores cró-nicos permanentes, reservorio de los virus,además de que otros animales, en estecaso domésticos (el cerdo, principal-mente) o de compañía (los gatos), puedenjugar papeles cruciales en la modificaciónde las cepas circulantes cuando por coin-fección se producen cambios que afectana la virulencia, a la capacidad de transmi-sión, a la susceptibilidad o a la difusiónhorizontal de los virus. Todavía, más re-cientemente, hemos tenido otro ejemploal surgir en Alemania un brote producidopor una nueva estirpe patógena de E. colisurgida de cambios evolutivos en este mi-croorganismo, que habitualmente resideen el ganado bovino, que se considera sureservorio principal, derivados de la inter-vención de fagos u otros sistemas detransmisión de ADN que permiten el trá-fico de genes de virulencia, en ocasionesincluidos en grandes fragmentos genó-micos (islas de patogenicidad) capaces deimprimir caracteres nuevos, para los quecada vez con mayor urgencia necesitamosestar preparados.

En un caso y otro, la salud humana es in-terdependiente de la Sanidad Animal, loque exige compartir conocimientos y pre-venir los riesgos con los mejores recursosdisponibles.

En la actualidad, con los grandes avancesproducidos sobre las bases en las que seasienta la respuesta inmune, de la manode la Biología Molecular, la Microbiología,la Parasitología y la Inmunología, que estánpermitiendo no solo profundizar en el co-nocimiento de los mejores antígenos (an-tígenos críticos), sino de resolver las me-jores estrategias para lograr resultadosóptimos en términos de inducir inmunidadprotectora frente a las enfermedades in-fecciosas, a lo que la Biotecnología aportaherramientas poderosas que permitenidentificar y producir grandes cantidadesde antígenos potencialmente protectorespara casi cualquier tipo de patógeno, es-tamos, sin duda, en el camino de lograrproductos cada vez más adecuados para laprevención de las enfermedades produ-cidas por microorganismos, en particular,las enfermedades emergentes y reemer-gentes.

En los últimos años se han producidoavances significativos en el conocimientode la inmunidad de mucosas (no debe ol-vidarse que el 90% de los patógenos ini-cian la infección a través de esta vía, porlo que parece coherente pensar que lamejor forma de administración de una va-cuna eficaz lo sea por esta vía, con lo quese reduciría la capacidad de un patógenopara establecerse), igual que lo que se re-fiere a los esperanzadores resultados devacunación por esta vía, a nivel experi-mental, principalmente en el ratón, de-mostrando que la inmunización prácticapor esta vía es un hecho posible con las


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particularidades a que haya lugar en rela-ción con el mejor sistema y vía de admi-nistración, según la especie animal que seconsidere, aunque parece que las vías oraly nasal son las más prácticas, conve-nientes y asequibles, especialmentecuando se trata de animales de produc-ción, explotados en grandes cantidades.

Falta por resolver cuestiones que tienenque ver con el conocimiento de la inmu-nidad inducida y otras referidas a la pre-paración de antígenos de interés para lavacunación de los animales domésticos,que puedan ser utilizables por este proce-dimiento. Considerando, además, queuno de los desarrollos más trascendentesde los últimos años ha sido el conocer quelas células presentadoras de antígenosmás eficaces (las células dendríticas) po-seen marcadores celulares específicos, elloposibilitará unir antígenos a anticuerposespecíficos o lectinas que se unan, a suvez, específicamente, a las células dendrí-ticas, asegurando de este modo que sesatisface la cantidad (particularmente pe-queña) de antígeno requerida para inducirinmunidad, lo que a su vez permite re-ducir los costes de producción de vacunaspara los animales, un aspecto de gran im-portancia práctica.

El desarrollo de los adyuvantes va íntima-mente unido a los nuevos desarrollos devacunas de subunidades e inactivadas,uno de los campos de la Vacunología mo-derna más prometedores, que pone espe-cial énfasis en el papel que juega la inmu-nidad innata en el control de lasinfecciones, a la que cada vez se prestamás atención por su capacidad de neutra-lización de los agentes patógenos ac-tuando sola o en relación con la inmu-nidad adquirida (518). Los recientes

descubrimientos que se acaban de ex-poner, en relación con los receptores in-munes Toll y NOD, entre otros, estánsiendo investigados en profundidad porlos científicos, igual que sus correspon-dientes ligandos (patrones molecularesasociados a los patógenos), para el desa-rrollo de compuestos adyuvantes denueva generación, con el fin de incre-mentar o modular el desarrollo de la res-puesta inmune, tanto en el caso de mi-croorganismos (519, 520) como en el deparásitos (521).

Una cuestión importante que marca dife-rencias entre el uso de adyuvantes en va-cunas destinadas al hombre respecto delas que lo son para los animales tiene quever con que en estos últimos el uso de ad-yuvantes es mucho menos restringido queen el caso de las vacunas humanas yestán disponibles un gran número de for-mulaciones (en el caso humano solo estánautorizados tres tipos de adyuvantes: salesde aluminio, emulsiones aceite en agua yvirosomas).

En su conjunto, se están consolidadograndes avances en el propósito de au-mentar el número de vacunas disponiblesfrente a las enfermedades infecciosas delos animales, a la vez que incrementar sueficacia y disminuir los efectos indesea-bles de los productos disponibles.Quedan, sin embargo, aún muchos pro-blemas por resolver, siendo preciso paraello incorporar los nuevos conocimientosy las tecnologías actualmente disponiblespara el diseño y elaboración de nuevas va-cunas más eficaces y seguras.

Debe tenerse presente que en la actua-lidad todavía la gran mayoría de las va-cunas disponibles se basan en preparados


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inactivados o en productos vivos ate-nuados en los que se superponen, apartede los riesgos inherentes a la utilizaciónde productos vivos, no suficientementecaracterizados desde el punto de vista ge-nético, otros inconvenientes derivados dela falta de especificidad, muchas vecescausada por la variabilidad de las cepasde campo de los agentes patógenos,además de otros que, desde el punto devista económico, no les hacen intere-santes para las industrias del sector. En loque se refiere a las vacunas de subuni-dades disponibles en la actualidad es pre-ciso reconocer que, hoy por hoy, la ma-yoría son menos protectoras que lasvacunas vivas atenuadas. Así pues, se im-pone la necesidad de un mejor conoci-miento de las enfermedades desde elpunto de vista molecular e inmunológico,igual que de los agentes que constituyensu etiología y de los mecanismos impli-cados en la patogénesis, pues solo asípodrá lograrse que tanto las vacunas desubunidades como las vacunas inacti-vadas, menos inmunógenas pero más se-guras que las vacunas vivas, ganen en efi-cacia práctica induciendo anticuerposneutralizantes protectores.

La alternativa o una de las alternativas dis-ponibles para resolver estos inconvenientespasa por la puesta en práctica de losnuevos sistemas de administración de losantígenos inmunizantes, bien en forma devacunas de DNA, incorporando el materialgenético en plásmidos, liposomas, nano-partículas o micropartículas, o en vectoresvivos de expresión (bacterias, levaduras, cé-lulas…) que sean capaces de introducir losantígenos vacunales en los comparti-mentos intracelulares.

De igual modo debe aprovecharse el cono-cimiento que se deriva del papel de la in-munidad innata en la respuesta inmunefrente a los agentes patógenos, aplicandolos mismos al desarrollo de nuevos adyu-vantes de inmunidad a las vacunas, para loque en la actualidad se están llevando acabo estudios en profundidad sobre los re-ceptores de la inmunidad innata y sus co-rrespondientes ligandos con el fin de incre-mentar o modular la respuesta vacunal. Eluso de adyuvantes en la VacunologíaVeterinaria está, por el momento, muchomenos restringido que lo que correspondea la vacunología humana (solo tres tipos deadyuvantes disponibles), estando a dispo-sición de la formulación de vacunas dife-rentes tipos de productos autorizados quepueden ser utilizados en las vacunas desti-nadas a los animales.

Desde el punto de vista comercial, las au-toridades sanitarias competentes, sin me-noscabar el rigor necesario, también debenabrirse a los nuevos procedimientos.

La investigación y el desarrollo constituyela base de la generación de nuevas y me-jores vacunas destinadas a los animales.Los científicos que se ocupan de investigaren los distintos campos de la SanidadAnimal pueden prestar grandes serviciosa la investigación médica, particularmenteen áreas de bienestar y medicina geriá-trica de los animales de compañía, queestán comenzando a representar unsector de gran interés para las industriasde la Sanidad Animal. Los mismos espe-cialistas en Sanidad Animal y los cientí-ficos del ramo también pueden contribuirde forma significativa al desarrollo de va-cunas con destino al hombre, extrapo-lando los resultados obtenidos en mo-delos animales desde pequeños roedores


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a grandes animales, estos últimos por di-versas razones mucho más convenientes,como ha ocurrido en el caso de la optimi-zación de las vacunas de DNA y los en-sayos realizados con anterioridad sobre laespecie equina o en relación con enfer-medades de los peces.

Las nuevas vacunas del campo de laSanidad Animal también pueden tenerutilidad terapéutica, no solo preventiva,como ocurre en el caso de muchos pro-cesos esporádicos de los animales y lasalergias.

Biotecnología basada en elARN

El ARN se asocia a la transcripción de losgenes, el primer proceso de la expresióngénica mediante el que se transfiere la in-formación contenida en la secuencia delADN hacia la secuencia de proteína.Durante la transcripción génica las secuen-cias de ADN son copiadas en ARN mensa-jero (ARNm) mediante una ARN polime-rasa, que le sintetiza manteniendo lainformación de la secuencia del ADN. Enla actualidad se conoce de la existencia demoléculas de ARN no codificantes, mu-chas de las cuales están relacionadas confunciones esenciales para la supervivenciay el crecimiento de los organismos. Variasde estas moléculas son susceptibles deaplicación en Biología y, en particular, enSanidad Animal, en relación con la preven-ción de las enfermedades infecciosas o enla atenuación de sus efectos. Todas las téc-nicas descritas hasta la fecha parece quese orientan a reducir la síntesis de la pro-teína resultante de la expresión de un gendeterminado mediante la reducción de la

actividad génica. En resumen, puedenconsiderarse las siguientes alternativas:

– ARN antisentido. Los ARN antisentidoson hebras de ARN complementariasdel ARNm diana que bloquean su tra-ducción. Físicamente bloquean los pro-cesos celulares. Su empleo en la prác-tica ha resultado complicado y muchosde los efectos que se atribuyeron enprincipio al ARN antisentido lo son enrealidad al ARN de interferencia (verdespués).

– Ribozimas. Son moléculas de ARN conactividad enzimática propia, que seunen específicamente a otras moléculasde ARN y después catalizan su lisis.Hasta la fecha no ha sido posible su usopráctico. Representan una alternativa deinterés al ARNi, aunque por el momentosu conocimiento es escaso, en particularen lo que se refiere a su estructura.

– ARN de interferencia (ARNi). Se hadefinido como “el producto de inter-vención sanitaria del siglo XXI“, y por sudescubrimiento, tan solo 8 años des-pués de producirse, A. Fire y C. Mellowrecibieron el Premio Nobel de Medicinaen 2006. ARNi se refiere al uso de mo-léculas de ARN para modular la acti-vidad de un gen diana. Debe tenerse encuenta, a este respecto, que los genesde una célula animal se transcribencuando se producen determinadas se-ñales de activación; es entonces cuandola transcripción da como resultado lasíntesis de una molécula de ARNmcuyas cadenas encierran el código de lasproteínas. Contra las moléculas deARNm es frente a las que actúa el ARNi.

Las moléculas de ARNi pueden ser pe-queñas moléculas bicatenarias indepen-


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dientes (ARN de interferencia corto,short interferente RNA: ARNsi) cuya su-pervivencia en la célula es reducida. Unade las cadenas presenta homología per-fecta con la del ARN diana, de tal modoque donde en este exista un nucleótidode uracilo, el ARNsi presentará uno deadenina. Estas moléculas poseen unalongitud de 20 a 25 nucleótidos y se de-gradan con rapidez, lo que limita suaplicación en el laboratorio.

Para permanecer activa de forma pro-longada en el tiempo, el ARNsi debe in-corporarse a un vector de expresión quefuncione como un gen. Los primeros deestos vectores se basaban en los promo-tores del gen de la polimerasa III y reci-bieron el nombre de ARN horquilladocorto (short-hairpin RNA: ARNsh) enatención a su estructura física. Los vec-tores de segunda generación utilizan lospromotores de la polimerasa II y ofrecenuna regulación tanto espacial comotemporal de la actividad de “derribo gé-nico“; estructuralmente se basan enmoléculas denominadas microARN(ARNmi), que suelen estar presentes deforma natural en los animales y difierendel ARNsi en que su secuencia presentauna homología solo parcial con la se-cuencia del ARN diana. Al ARNmi se lesupone una función básica en el creci-miento y supervivencia celular.

El ARNmi puede sintetizarse e introdu-cirse en un animal. Todas la formas deARNi tienen en común que su especifi-cidad respecto del procesamiento delARNm diana es dependiente del gradode homología. Desde el punto de vistafuncional, el componente importantedel ARNi es una pequeña molécula mo-nocatenaria de unas 20 bases de lon-

gitud que puede unirse directamente aun ARNm diana. Cuando esta unión seproduce en el núcleo, se suele inducir ladestrucción del ARNm, pero si tienelugar en el citoplasma, el resultado esuna reducción de la traducción delARNm en la proteína correspondiente.Como quiera que sea, en ambos casos,se reduce la cantidad de proteína sinte-tizada a partir del gen (derribo génico).En el caso de los virus, por ejemplo, siexistiese una molécula de ARNi dirigidaespecíficamente frente a un gen delvirus, su actividad bloquearía el procesonormal de síntesis de la proteína y con-secuentemente de replicación del virus.

Los ARNsi son moléculas de ARN doblehebra de 20-21 nucleótidos perfecta-mente complementarias, que se ori-ginan a partir de un ARN largo de doblehebra (ARNbc). Los ARNbc pueden serde origen endógeno (por ejemplo, lostránscritos generados a partir de se-cuencias de ADN repetidas en tándem),o de origen exógeno (como virus otransgenes). La enzima responsable delprocesamiento del ARNbc en moléculasde ARNsi es la denominada Dicer (522),una enzima citoplásmica, ribonucleasa,de la familia ARNasa III, que procesa elARNbc en fragmentos con extremos 5'fosfato y dos nucleótidos libres con ex-tremo hidroxilo (-OH) en 3'.

Los ARNsi suprimen la expresión de losgenes diana mediante el corte delARNm complementario en dos mitades,a través de la interacción de la hebraantisentido del ARNsi con el complejoRISC (RNA-induced silencing complex).Las dos mitades del ARNm son poste-riormente degradadas por la maqui-


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naria celular, lo que conlleva la supre-sión de la expresión del gen.

– Otros tipos de ARN. Existen otros tiposde moléculas de ARN que también po-drían utilizarse en los animales, comolos denominados "señuelos de ARN",con los que se podría bloquear la acti-vidad de una enzima, pongamos porcaso una polimerasa vírica, lo que impe-diría también la replicación del virus. Los“señuelos de ARN“ imitan las moléculasnormales de ARN y compiten con susíntesis. Suelen incluir componentes quí-micos modificados que constriñen físi-camente la estructura de la molécula deARN y/o alteran la cinética de sus reac-ciones de enlace.

Los análogos de ácidos nucleicosestán siendo investigados en profun-didad en los últimos años. Son molé-culas modificadas que permiten dis-poner de un ARN más estable, lo quemejora sustancialmente sus posibilidadesde uso. Es el caso, por ejemplo, del de-nominado morfolino, un derivado de unácido nucleico natural que utiliza unanillo de morfolina (una amina secun-daria alcalina, de fórmula C4H9NO) envez del azúcar (desoxirribosa o ribosa),conservando el enlace fosfodiéster y labase nitrogenada de los ácidos nucleicosnaturales. Se utilizan con fines de inves-tigación, generalmente en forma de oli-gómeros de 25 nucleótidos, para llevara cabo procesos de genética inversa, yaque son capaces de unirse complemen-tariamente a pre-ARNm, con lo que seevita su posterior recorte y procesa-miento. También tienen un uso farma-céutico, y pueden actuar contra bacte-rias y virus o para tratar enfermedades

genéticas, al impedir la traducción de undeterminado ARNm.

Los ácidos nucleicos bloqueados(locked nucleic acids: LNA) o los ácidosnucleicos peptídicos (peptide nucleicacids: PNA) ofrecen una mejora especta-cular de la bioestabilidad, pero hasta lafecha no se han propuesto usos prácticos.

Una molécula de reciente descripción,denominada “antagomir“, es capaz dedestruir el ARNmi, pero no se sabe cómo,aunque se piensa que le inhibe irreversi-blemente uniéndose a él. Antagomir esuna pequeña molécula sintética de ARNperfectamente complementaria delARNmi diana. Habitualmente posee al-gunas modificaciones que la hacen resis-tente a la degradación. Ha sido utilizadacon éxito para inhibir en MedicinaHumana procesos de fibrosis pulmonary de corazón.

Administración de las moléculasde ARN

Las moléculas de ARN pueden utilizarsecomo parte de un procedimiento análogoa la terapia génica o la vacunación, o biencomo técnica de base para sintetizar untransgén e introducirlo en la línea ger-minal, generando así un animal transgé-nico o genéticamente modificado.

Utilizando procedimientos análogos a laterapia génica o la vacunación, depen-diendo del tipo de molécula de ARN quese administre, pueden inocularse animalescon el propósito de regular la expresióngénica en microorganismos productoresde enfermedades infecciosas. El efecto lo-grado puede ser, bien un cambio transi-torio o permanente en la actividad de ungen. Si se utilizase, por ejemplo, ARNsi


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podría lograrse una alteración temporalde la actividad génica en cierto modoanáloga a la de la vacunación, aunque demenor duración. Con una estrategia deterapia génica, el objetivo sería lograr quela alteración de la actividad génica semantuviera mientras las células porta-doras de la molécula de ARN en cuestiónse mantuvieran vivas.

Como se ha señalado antes, otra alterna-tiva podría ser administrar ARNsh oARNmi en forma de transgén, para darlugar a animales genéticamente modifi-cados. En este caso, la progenie heredaríade forma estable el transgén de ARNi. Enambos casos, pueden crearse moléculasde ARNi más elaboradas, que incorporenuna actividad "gene knockdown" indu-cible, con lo que el ARNi solo se sinteti-zaría en presencia del correspondientefactor de inducción (por ejemplo, en res-puesta a un patógeno o a una agresióntóxica).

Por lo que respecta a las vías de adminis-tración, muchos de los interrogantes quese plantean en la actualidad en relacióncon el bienestar de los animales coincidencon los que en su día se suscitaron a pro-pósito de la vacunación.

Aplicaciones de la biotecnología delARN en Sanidad Animal

Aunque en la actualidad este tipo de es-tudios son, principalmente, de tipo expe-rimental, en el caso del ser humanoexisten varios estudios preclínicos de apli-caciones. En algunos laboratorios se vieneaplicando ya desde hace tiempo una seriede procedimientos en los que se utilizaARN para regular la actividad génica.

Quizás la aplicación más factible de estetipo de técnicas del ARN tenga su sitio enel tratamiento de las infecciones víricas;de hecho, varios de los proyectos en de-sarrollo se centran en impedir la replica-ción de un virus en el proceso de la enfer-medad producida por este, como ocurreen particular en el caso del virus de lafiebre aftosa, de la anemia infecciosaequina o la gripe, en todos los cuales ladiana suele ser la polimerasa vírica. Deigual modo, los métodos basados en eluso de moléculas antisentido también vandirigidos frente a los virus, y en uno de losproyectos a que se hace mención se uti-liza el ARN como señuelo, destinadoigualmente a bloquear la actividad enzi-mática de la polimerasa del virus influenzainterfiriendo con el proceso de replica-ción.

Otros posibles usos de esta tecnologíapueden referirse, por ejemplo, a la modu-lación de determinados aspectos del sis-tema inmune, imitando la variación de laactividad génica que se observa en pobla-ciones naturales, utilizando ARNi para in-ducir el knockdown, lo que sería aplicableno solo al caso de las infecciones víricas,sino también las producidas por otro tipode patógenos. También sería posible mo-dular algún otro aspecto de las funcionesanimales, como el propio crecimiento.

Fiebre aftosa y gripe (influenza) comoejemplos modelo del uso de ARN enSanidad Animal

El virus de la fiebre aftosa es un picorna-virus con ARNmc que causa una de lasenfermedades de los animales de pezuñahendida (fisípedos) de mayor trascen-dencia económica. En el proceso de infec-ción, una vez que el virus entra en con-


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tacto con el receptor presente en la su-perficie de la célula hospedadora, inicia lasíntesis de nuevas partículas por una po-limerasa codificada en su genoma. El ciclode replicación vírica presenta variospuntos vulnerables al uso de la tecnologíaARN. Por un lado, si simplemente se re-dujeran los receptores celulares, aunquesolo fuera de forma temporal, deberíaservir para disminuir la vulnerabilidad a lainfección vírica. Otro punto de posible in-tervención podría tener a la polimerasa ví-rica como diana y ello afectaría tanto a laexpresión de los genes como a la replica-ción del genoma del virus, conteniendode este modo la progresión de la infec-ción en un animal afectado.

El virus de la fiebre aftosa ha evolucio-nado, principalmente por deriva gené-tica, para dar lugar a varios tipos (A, O,C, SAT-1, 2 y 3, ASIA-1), además de nu-merosos subtipos. Tal variación y la au-sencia de protección cruzada entre se-rotipos hacen difícil el diseño de unavacuna universal, y las disponibles po-seen uno o varios de los serotipos cono-cidos, lo que exige el aislamiento, iden-tificación y caracterización del agenteetiológico en las epidemias, como pri-mera medida para el posible control yprevención, en su caso, frente a la en-fermedad. Sin embargo, el gen que co-difica para la polimerasa vírica poseeuna secuencia bien conservada, lo querepresentaría un blanco para llevar acabo alguna de las acciones comentadasanteriormente. Si extendemos la posibi-lidad al grupo de virus ARN que afectana los animales, podremos comprobarque nos encontramos con el grupo se-guramente más temido por la dificultadde su control, habida cuenta de la ra-

pidez de evolución que presentan sus in-tegrantes (téngase en cuenta, porejemplo, que la replicación intracitoplas-mática de este tipo de virus facilita elaumento de la tasa de mutación naturalal no disponer de los mecanismos de au-tocorrección existentes en el núcleo dela célula hospedadora). Además, en estegrupo de virus se encuentra el mayor lis-tado de virus zoonósicos emergentes, loque añade un plus de interés a losmismos.

Con el virus de la fiebre aftosa y otros detropismo humano (poliomielitis, hepatitis,VIH) se ha comprobado lo correcto delplanteamiento de uso de la tecnología delARN. En lista de espera podrían estarahora retrovirus animales, como el virusde Jaagsiekte, el de maedi-visna o el de laanemia infecciosa equina.

Otro de los virus ARN a los que hacíamosmención antes: el virus influenza, que pro-duce la gripe o peste aviar, un virus ARNmcde sentido negativo y fragmentado, perte-neciente a la familia Orthomyxoviridae(virus influenza). La variación y evolución delvirus se facilita como consecuencia de lamezcla de los fragmentos genómicos delARN en el proceso de replicación, lo que in-fluye negativamente en la viabilidad y efi-cacia temporal de las vacunas. Las técnicasde ARN dirigidas contra el genoma víricopueden destruirle. Recientemente se handescrito cadenas de ARN que se incorporana una secuencia líder común y los señueloscontra esta secuencia son potentes inhibi-dores de la expresión génica del virus in-fluenza. Se prevé que tales señuelos seanútiles en los tratamientos contra el virus dela gripe y en la actualidad están siendo con-siderados con gran interés.


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Limitaciones

Por el momento se han descrito algunas li-mitaciones al uso de la tecnología del ARN,incluyendo la posibilidad de provocar lamuerte celular, aunque este inconveniente,en el caso de infecciones víricas, no deja deser una ventaja. Eventualmente se ha se-ñalado la posibilidad de inducir efectossobre genes no dirigidos debido a una in-teracción débil entre el ARN y ARNm trans-critos a partir de dichos genes, hecho que,de ocurrir en un animal vivo, podría repre-sentar una cuestión de cierta gravedad.

Perspectivas

La evaluación de los métodos basados enel uso del ARN y su aplicación en SanidadAnimal es un desafío actual de gran interésy a corto plazo se esperan los resultados demuchos experimentos actualmente encurso. Se trabaja en la síntesis de moléculasde ARN capaces de producir la muerte debacterias e incluso de células infectadas ovectores invertebrados de bacterias o virus.Alternativamente se contempla la posibi-lidad de elaborar moléculas de ARN diri-gidas contra genes endógenos del animalhospedador con el fin de modular nivelesde citoquinas o alguna otra propiedad querefuerce o aumente la inmunidad innatapara resolver prematuramente la infección,reduciendo, por ejemplo, la abundancia dereceptores celulares para el patógeno encuestión, dificultando con ello la coloniza-ción o invasión celular.

En definitiva, con total seguridad, la téc-nica del ARN se abrirá camino en el con-trol de las enfermedades infecciosas me-diante la reducción o anulación de lasíntesis de la proteína resultante de la ex-presión de un determinado gen, en par-ticular en el campo de las infecciones ví-

ricas para las que no existe alternativa detratamiento o prevención, incluso pen-sando en la posibilidad de utilizar técnicascon animales genéticamente modificadoso métodos similares a los convencionalesde vacunación, con diferencias particu-lares. El deseo de aportar esta importantetecnología a la lucha contra las enferme-dades humanas será la fuerza que impul-sará la iniciativa y el progreso que permi-tirá su entrada como un recurso adicionalen el ámbito de la Sanidad Animal.

Nanotecnología. El futurohecho presenteLa Nanotecnología se define como unaaplicación de la ciencia de los sistemas aescala nanométrica, en la cual se producenfenómenos que hace posible aplicacionesnovedosas. Un nanómetro (nm) es la mi-llonésima parte de un milímetro y las di-mensiones de los sistemas de escala nano-métrica oscilan entre 1 y 100 nm. Elrégimen nanométrico se sitúa entre el ré-gimen subnanométrico de los átomos in-dividuales y el de los circuitos electrónicosde última tecnología (que miden varioscentenares de nanómetros). A “nanoes-cala“, las propiedades físicas, químicas ybiológicas de los materiales difieren en as-pectos fundamentales de las que mani-fiestan tanto a escala atómica o moleculary, evidentemente, a macroescala. En “na-noescala“, la Física, la Química y la Biologíaconvergen para crear la “Nanociencia“, apartir de la cual podrá (algún día) fluir laNanotecnología.

La Nanotecnología presenta tres objetivosprincipales: por un lado, colocar cadaátomo en lugar adecuado; además, con-seguir que cualquier estructura sea con-


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sistente con las leyes de la física y la quí-mica a nivel atómico y, finalmente, lograrque los costes de fabricación no excedandel coste de las materias primeras y laenergía utilizadas en el proceso. El ga-nador del Premio Nobel de Física (1965),Richard Feynman, fue el primero en hacerreferencia a las posibilidades de la nano-ciencia y la nanotecnología en un célebrediscurso pronunciado en el Caltech(Instituto Tecnológico de California) el 29de diciembre de 1959 titulado En elfondo hay espacio de sobra (There'sPlenty of Room at the Bottom). K. EricDrexler desarrolló y popularizó el con-cepto de nanotecnología y fundó elcampo denominado “NanotecnologíaMolecular“. El término “nanotecnología“fue acuñado originalmente por NorioTaniguchi en 1974 y, sin saberlo, fue uti-lizado por Drexler en 1986 en su libroEngines of Creation: The Coming Era ofNanotechnology, en el que propuso laidea de una “nanoescala“ o escala nano-métrica “ensambladora“, que sería capazde construir una copia de sí mismo y deotros elementos de complejidad arbitraria.Las aplicaciones de la Nanotecnología co-menzaron a principios de los 2000,aunque en su mayor parte estuvieron li-mitadas a los nanomateriales.

La Nanotecnología está captando cadavez mayor atención por parte de los cien-tíficos de todo el mundo, lo que está per-mitiendo conocer el camino del controlsistemático de la materia a escala nano-métrica. A ello contribuye un volumen deinversiones económicas creciente que, porejemplo, en 2005 alcanzó un valor esti-mado de 4.610 millones de dólares, a lacabeza de las cuales se situó EE.UU., conuna inversión del 34%, equivalente a

1.606 millones de dólares, seguido deJapón con más de 1.100 millones.

En los últimos años, las aplicaciones bio-lógicas han comenzado a suscitar un inu-sitado interés por parte de los científicosy tecnólogos. En “nanomedicina“ las mi-núsculas esferas de las nanopartículas po-drían ser utilizadas para localizar dolen-cias ocultas en el organismo humano ydeterminar, al tiempo, su extensión, ta-maño y forma, permitiendo un diagnós-tico preciso. Más tarde, las nanopartículaspodrían ser utilizadas para transportaragentes terapéuticos permitiendo la libe-ración de la cantidad precisa de la sus-tancia, justo en el lugar que constituyerala diana orgánica, e incluso, si fuera pre-ciso, podrían sustituir numerosas pruebasmédicas, el diagnóstico por imagen e in-tervenciones quirúrgicas, que serían re-emplazadas por una simple inyección delas mismas.

Experimentalmente, en animales, ya se hacomprobado el resultado favorable de suutilización en dolencias graves, como tu-mores o enfermedades cardiovasculares,y la idea de incorporar un sensor químico,físico o biológico y adaptarlo a un sistemainteligente de administración, igualmenteincorporado, ha sido denominada “prin-cipio de inyección“, a semejanza de loque ocurre en los motores, para regularla entrada de combustible. Se prevé quelas primeras aplicaciones médicas esténrepresentadas por dispositivos implanta-bles de liberación de insulina o “chips me-dicamentosos“, que estarán ligados asensores de glucosa permitiendo la regu-lación automática de los niveles de azúcaren la sangre de los enfermos diabéticos.Es previsible que en el próximo futuro, enel hombre y en los animales, este sistema


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constituya un modelo para todo tipo desistemas de administración de fármacos.

En el campo de la Sanidad Animal se hanpropuesto varios tipos de aplicaciones(Scott, 2005) (523). Por un lado, la admi-nistración inteligente de medicamentosmediante la utilización de dispositivos na-nométricos, capaces de detectar y trataruna enfermedad infecciosa, una patologíanutricional o cualquier otro tipo de pro-ceso, mucho antes de que se manifiestenlos primeros síntomas. Además, podríautilizarse para llevar a cabo el diagnósticoy tratamiento de enfermedades, inclu-yendo procesos infecciosos, mediante lainoculación de los denominados “puntoscuánticos“ en la circulación sanguínea deun animal, los cuales detectarían las cé-lulas defectuosas; dado que estos puntosresponden a la luz, podría iluminarse elcuerpo y ello calentaría el punto cuánticorevelando su posición y eliminando las cé-lulas enfermas. La nanotecnología podríaser utilizada igualmente en SanidadAnimal para el denominado “registro deidentidad“, es decir, la trazabilidad o se-guimiento permanente de la historia delanimal y de los productos derivados (porejemplo, leche o carne, o cualquier otroproducto de origen animal para consumohumano), permitiendo en tiempo realllevar a cabo un informe que acumulaseel histórico del animal desde su naci-miento, al igual que cumplir óptimamenteel objetivo de seguridad enmarcado en elobjetivo de “de la granja a la mesa“, enel que se ha comprometido, desde la pro-mulgación del Libro blanco de SeguridadAlimentaria, la UE. Finalmente, la nano-tecnología podría ser utilizada tambiénpara llevar a cabo una eficaz gestión dela reproducción de los animales mediante

el uso de “nanotubos“ implantados sub-cutáneamente para detectar el estro delanimal y llevar a cabo así, en las mejorescondiciones, la fecundación. Los “puntoscuánticos“ son nanocristales que puedenunirse a proteínas presentes en la super-ficie de las bacterias patógenas y ,cuandoson excitados con luz ultravioleta, emitencolores característicos que revelan su pre-sencia, pudiendo ser utilizados de estemodo en el diagnóstico de enfermedadesproducidas por estos microorganismos. Seha diseñado una nanopartícula capaz deunirse a especies de Campylobacter en elintestino de pollos, permitiendo su agre-gación y facilitando su eliminación deltracto intestinal.

Consideraciones finales

La Sanidad Animal tiene, en la actualidad,grandes compromisos con la ganaderíaindustrial, con las poblaciones de ani-males de compañía y salvajes y, por exten-sión con el ser humano. Proporcionandosalud a los primeros, hace lo propio conel hombre, en particular cuando se refierea las enfermedades compartidas, las zoo-nosis, pero no solamente, dado que mu-chos agentes de tropismo exclusivo porlos animales repercuten directamente enSalud Pública, al ser una de las causas depobreza más reconocidas, especialmenteen los países en desarrollo o subdesarro-llados, además de quebrantos sociales detodo tipo.

En los últimos 50 años, profundizar en elconocimiento de los agentes etiológicos delas enfermedades infecciosas, microorga-nismos y parásitos, en sentido extenso, hasido un objetivo de una atención prefe-rente de la Sanidad Animal y la SaludPública. Después de conocer e identificar


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las causas de las enfermedades, se profun-dizó en su conocimiento. Los últimos 30años han sido de un intenso trabajo porconocer los factores de virulencia y su basegenética, lo que ha permitido grandesavances que no solo han permitido desen-trañar muchas de las claves de la patogé-nesis de las enfermedades infecciosas, sinoque, especialmente desde la culminacióndel proyecto Genoma Humano, la accesi-bilidad y conocimiento de muchos agentesde enfermedades animales ha permitidotambién obtener información utilizablepara el diagnóstico de las enfermedades ypara su vigilancia y control.

A la vez que se profundizaba en el cono-cimiento de los agentes, la SanidadAnimal, a través de la Inmunología, laEpidemiología y la Patología, ha conocidoel comportamiento del hospedador afec-tado por un patógeno para el desarrollode la respuesta innnata y adquirida y lasinteracciones que condicionan la génesisde la enfermedad. Son tantos los conoci-mientos acumulados en estos últimosaños que resulta muy difícil seleccionar al-gunos de los más destacados.

Atención especial han recibido y están re-cibiendo las enfermedades de nuevocorte que periódicamente se han trans-formado en causas de muerte o, en elmejor de los casos, de inquietud y zo-zobra, de lo que derivan muchos otros in-convenientes difíciles de cuantificar, y conellas, los denominados agentes nuevos,principalmente virus, pero también bac-terias, hongos, protozoos y priones.Cuestiones como las que tienen que vercon la susceptibilidad y resistencia, desa-rrollo de medicamentos antimicrobianos,desarrollo de resistencias a estos últimos,estudio de inmunidad humoral y celular

en la respuesta inmune, etc., han sido ob-jeto de gran interés científico y práctico.

Los avances producidos en Microbiología,Epidemiología, Parasitología, Inmunología,pero principalmente en las técnicas y mé-todos derivados de la Biología Molecular yBiotecnología, han irradiado a todos loscampos necesarios para profundizar en elconocimiento de los agentes y de las en-fermedades derivadas. Diagnóstico, epide-miología, vacunas y vacunación, vigilancia,han sido y están siendo en la actualidadáreas preferentes de atención para laSanidad Animal y la Salud Pública. Una yotra se aprovechan de los conocimientosque se obtienen en ambas.

Mucho ha sido el camino recorrido ymucho más es todavía el camino quequeda por recorrer. Los desafios planteadosa la Sanidad Animal, que no solo afectana los animales, sino también a la proyec-ción humana, se están respondiendo condignidad y la Sanidad Animal es hoy unaciencia reconocida con personalidad propiaen la que participan profesiones múltiples,pero en las que el veterinario ejerce unpapel principal. Es deseable no solo conti-nuar en la línea marcada en los años re-cientes, sino profundizar cada vez más enlograr esclarecer las claves que encierra laenfermedad, desde todos los puntos devista, con el fin de controlar la presentacióny difusión de las enfermedades, y, sobretodo, anticiparse a las mismas mediante ladisponibilidad de procedimientos capacesde asentar una vigilancia permanente.

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e Inmunología). Universidad de León (Facultadde Veterinaria). Director de INBIOTEC(Instituto de Biotecnología de León).


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7. El descubrimiento de que la peste bovinaestaba producida por un virus (M. Nicolley M. Adil Bey, en 1902), después de queLoeffler y Frosch fueran los primeros endemostrar en 1899 que una enfermedadanimal, la fiebre aftosa, estaba producidapor un virus, representó una verdaderasorpresa, toda vez que a las “pestes hu-manas“ se les reconocía ya su naturalezabacteriana. En el estudio de la peste bo-vina se implicaron también algunos delos impulsores de la Microbiología, comoR. Koch y Pasteur, quienes con ocasiónde una grave epidemia que afectó aSudáfrica a finales del siglo XIX, se despla-zaron allí directamente (en el caso de R.Koch) o enviaron a miembros de susequipos (L. Pasteur envió a J. Bordet y J.Danysz, que trabajaron con el veterinariosuizo A. Theiler en el mejor conocimientode la enfermedad y en la búsqueda desoluciones). La peste bovina está, igual-mente, en el origen de la creación de la

OIE (Office International des Epizooties,actualmente Organización Mundial de laSanidad Animal), con ocasión de la rein-troducción de la enfermedad en Bélgicaa partir de un rebaño de cebúes infec-tados procedentes de las Indias Inglesas,en tránsito a Brasil, que permanecieronen el puerto de Amberes, donde conta-giaron un rebaño americano de bovinosde carne, después liberado a Bruselas yGante, diseminando la enfermedad porEuropa Central. Este hecho puso de ma-nifiesto la necesidad de una colaboracióninternacional en la lucha contra las en-fermedades infecciosas de los animalesdomésticos y salvajes, que hizo queFrancia convocase con este fin una reu-nión internacional en 1924, de la quesurgió la OIE.

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las más numerosas: adenovirus del pavo ycólera aviar (P. multocida) (oral), Bordetellaavium (oral, spray), y las siguientes: bron-quitis infecciosa, Newcastle, bursitis infec-ciosa, herpesvirus de los pollos, herpes-virus de los pavos y reovirus, en todos loscasos, oral, in, io y en spray.

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