-;kPrincipios y tcnicas de microscopaI-os biloeos celulares menudo necesitan a examinar Ia estructura de'las clulasy de sus componentes.El microscopio es una herramienta indispensablepara ello ya que la mayora de las estructurascelularesson demasiadopequeas para ser observadasa simple vista. De hecho, los comienzos de la biologa celular se pueden seguir hastaIa invencin del microscopio ptico, que posibilit por primera vez a Ios cientficosla observacinde imgenesaumentadas de las clulas.El primer microscopio ptico fue desarrollado en 1590por Z. |ansseny su sobrino H. jansenn.Durante el siguiente siglo se describieron muchas observaciones microscpicasimportantes, entre las que destacanlas realizadaspor Robert Hooke, que observlas primeras clulas y por Antonie van Leeuwenhoek,cuyos microscopios mejorados nos hicieron vislumbrar por primera vez la estructura interna de las clulas.Desde entonces,el microscopio ptico ha experimentado numerosasmejoras y modificaciones hastala actualidad. De igual forma que la invencin del microscopio ptico permiti una oleada de logros cientficos al posibilitar por primera vez la observacinlas clulas,el desarrollo del microscopio electrnico en la dcadade 1930revolucion nuestracapacidadde explorar la estructuray Ia funcin celular. En microscopio electrniconos hizo pasara una nueva era en biologa celular debido a que es al menos 100 veces ms eficaz que el microscopio ptico para visualizar objetos,abriendo nuestros ojos a la exquisita arquitectura subcelular,nunca observadaanteriormente, y cambiando para siempre nuestra forma de pensar sobre las clulas. Sin embargo,a pesarde su poder de resolucin inferior, el microscopio ptico no ha cado en desuso.Por el contrario la microscopa ptica ha experimentado un renacimiento en los ltimos aos por el desarrollo de nuevastc-

T

que nicas especializadas han permitido a los investigadores explorar aspectos la estructuray del comportamiento cede lular que no pueden ser estudiadosmediante la microscopa electrnica.Estosavances han sido posiblespor la combinacin de tecnologasprocedentesde Ia fsica,ingeniera, qumica y biologa molecular,y han ampliado en gran medida nuestra capacidadpara estudiar clulasempleando la microscopa ptica. En este apndice,exploraremos los principios fundamentalestanto de microscopaptica como de microscopa electrnica,haciendo nfasisen las diversastcnicasespecializadasque se emplean para adaptar estos dos tipos de microscopapara una gran diversidadde objetivos especializados.

Principios pticos de la microscopaAunque los microscopiospticos y electrnicosdifieren en muchos aspectos, ambos hacenuso de principios pticos semejantes parala formacin de imgenes.Por lo tanto, comenzamos nuestra discusin sobre microscopa examiprincipios comunes,y haciendoespecial nando estos nfasis en los factoresque determinan el tamao mnimo de los objetos que pueden observarse. .: Le loNcrruD DE oNDA DE LA rLUMrNAcrN ESTABLECE LMITE EN EL TAMAO OB LOS OBIETOS UN QUE PUEDENSEROBSERVADOS Independientementedel tipo de microscopio que se emplee, se necesitansiempre tres elementospara formar una imagen: wa fuente de iluminacin, una muestra para ser examinada y un sistemadelentesqlueenfocan la iluminacin sobrela muestra y que forma la imagen.La Figura A.1 ilusPrincipios pticos la mlcroscopa 873 de

Fuente luz de Luzvisible

+ kvl 5o-1ooY

Haz de electrones Anodo

Lentes condensadoras

MuestrasLentesobjetivo

Lentes vidrio de

electromagnticas Lentes

Lentes intermedias

Lenteocular Lentede proyeccin

FiguraA.1 Sistemaspticos de los ptico y electrnico. El microscopios microscopio ptico utiliza luz visible y lentes de vidrio paraformar a partir de la muestra una imagen que puede ser observadaa simple vista, enfocadaen una pelcula fotogrfica o recibida por un detector electrnico como una cmara de vdeo. (b) El microscopio electrnico utiliza un haz de electronesemitido por un filamento de tungsteno y enfocado por lentes para formar una electromagnticas imagen de la muestra en una pantalla fluorescente,un detector digital o una pelcula fotogrfica. (Estosdiagramas han dibujado se para enfatrzarlas semejanzas el en diseogeneralentre los dos tipos de el microscopio. realidad, En microscopioptico estdiseado con la fuentede luz en la parte inferior y el ocular en la parte superio como semuestraen la Figura 5b.)

pelcula Ojo humano,l+ar4fia ^ dt^t^r

Pantalla fluorescenten nolinr rl taar Afio

(cmara vdeo) de electrnico (a) Microscopio ptico (b) Microscopio electrnico

Si dos personassujetan los dos extremos opuestos de en tra estascaractersticas un microscopio ptico y en un mila fuente _ una cuerda y la hacen ondular mediante un movimiento rtcroscopio electrnico. En un microscopio ptico, mico hacia arriba y hacia abajo,generarnun largo patrn de iluminacin es luz visible,y el sistema de lentes consiste regular de movimiento en la cuerda denominado movipuede ser vista o en una serie de lentes de vidrio. La imagen miento ondulatorio (Figura A.2a).La distancia desde la puede enbien directamentea travsde un ocular o bien se crestade una onda a la crestade la siguientese denomina focar sobreun detectorcomo una pelculafotogrficao una longitud de onda. Si alguien localizado en un lado de Ia cmaraelectrnica. En un microscopio electrnico, la fuencuerda arroja hacia la cuerda un objeto grande como una emitido por un fite de iluminacin es un haz de electrones pelota de playa,stapuede interferir con el movimiento de y lamento de tungsteno calentado, el sistemade lentesconla cuerda y perturbarlo (Figura A.2b). Sin embargo, si se sisteen seriesde electroimanes.El haz de electronesseenfoca arroja hacia la cuerda un pequeo objeto como una pelota en una pantalla fluorescente,en una pelcula fotogrfica o es de bisbol, el movimiento de la cuerda probablemente no visualizada digitalmente empleando un detector. se ver afectado (Figura A.2c). Si las personasque sujetan A pesar de estasdiferenciasen la fuente de iluminacin la cuerda la mueven ms rpidamente, su movimiento toy en el diseo de los instrumentos)los dos tipos de microsdava serondulatorio, pero la longitud de onda serprocopios dependen de los mismos principios pticos, y forsi bablementems corta (FiguraA.2d). En bstecaso, searroman imgenes de una manera similar. Cuando se coloca ja contra Ia cuerda una pelota de bisbol, es bastante una muestra en el recorrido de un baz de luz o de electroprobable que el movimiento de la cuerda se perturbe (Fines, las caractersticasfsicasdel haz cambian de forma que gura A.2e). se crea una imagen que puede ser interpretada por el ojo Esta analoga sencilla ilustra un principio importante: la humano o puede ser registradapor un detector fotogrficapacidad de un objeto de perturbar un movimiento onco. Paracomprender estainteraccin entre la fuente de iludulatorio depende crticamente del tamao del objeto con minacin yla muestra, necesitamosentender el concepto de relacin a la longitud de onda del movimiento. Esteprincilongitud de onda que se ilustra en la Figura A.2 empleanpio es de gran importancia en microscopa, ya que significa do la siguiente analoga sencilla.

874

y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

(a)

(b)

(c)

que la longitud de onda de la fuente de iluminacin estableceel lmite del tamaomnimo de un objetoparapoder Paracomprenderestarelacin,necesitamos serobservado. que el movimiento de la cuerdade la FiguraA.2 reconocer que se es anlogoal rayo de luz (fotones)o de electrones empleacomo fuentede iluminacin en el microscopiop-en tanrespectivamente otraspalabras, tico o electrnico comoondas-. se to la luz comolos electrones comportan incide sobreuna Cuandoun haz de luz o de electrones fsicasdelhaz muestra,la muestraalteralas caractersticas de iluminacin de igual forma que la pelota de playao de Debido a que un bisbolalterael movimiento de la cuerda. por sobre onda,la la objetoslosepuededetectar su efecto al de onda debetenerun tamaocomparable del longitud que debeserdetectado. objeto esta Unavezque entendemos relacinentrela longitud podemos comprender ahode onday el tamaodel objeto, pequeos sepuedenobra por qu los objetosmuy slo la electrnico: longitud de onda con el microscopio servar es de los electrones muchomscortaquela de los fotones. son comovirus y ribosomas demasiaobjetos As,algunos peropueparaperturbaruna ondadefotones do pequeos Al den interaccionarcon una onda de electrones. tiempo y los quedescribimos distintostiposdemicroscopios detcpuedesertil que seprede nicasde preparacin muestras la gunte cmo interaccionan fuentede iluminacin y la de muestra,y cmo semodifican las caractersticas ambas paraproduciruna imagen. Le nrsoluclN INDtcA LA cAPActDAD ADYACENTES OBJETOS PARADISTINGUIR SEPARADOS COMO OBJETOS pasaa travsde una Cuandoun haz de luz o de electrones lente y se enfocaen un punto, la imagenque se forma es de de consecuencia una propiedad lasondasdenominada interferencia-proceso por el cual dos o ms ondasse produciendouna o combinan para reforzarse cancelarse, onda igual a la suma de las dos ondasiniciales-. As, la una muestraa travs imagenque ustedve cuandoobserva un de una seriede lentesesrealmente patrn de interacde cionesaditivasy destructivas las ondasque atravesaron laslentes,un fenmenoconocidocomo difraccin. lentesde vidrio ptico seemplean En un microscopio para dirigir la direccin de los fotones,mientras que un comolentes emplea electroimanes microscopioelectrnico Aun de paradirigir la direccin los electrones. as,los dos fundatipos de lentestienen en comr'dos propiedades La focaly aperturaangular. distanciafodistancia mentales: entreel punto medio de la lentey el puncal esla distancia la queconvergen rayosqueatraviesan lente los to focalen el (FiguraA.3). La apertura angular esla mitad del nguloa del cono de luz que entra en el objetivo del microscopioa partir dela muestra(FiguraA.4).La aperturaangularespor lo tanto una medidade la cantidadde iluminacin que sale de la muestray pasatravsde la lente.Esto determinalade Principios pticos la microscopa 875

(d)

(e)FiguraA,2 Movimientoondulatolio,longitudde onday pertuaciones. El movimiento ondulatorio de una cuerda sujeta por dos personasesanilogoal movimiento ondulatorio de los y fotonesy electrones, sepuede utilizar para ilustrar el efectodel tamao de un objeto en su capacidadde perturbar el movimiento ondulatorio. (a) EI movimiento rtmico del extremo de una cuerda hacia arriba y hacia abajo generarun movimiento ondulatorio con (b) una longitud de onda caracterstica. Cuando searroja contra la cuerdauna pelota de playau otro objeto con un dimetro comparablea la longitud de onda de la cuerda,seperturba el movimiento de la cuerda.(c) Una bola de bisbol u otro objeto con menor que la longitud de onda de la un dimetro significativamente cuerda producir perturbacionesmuy pequeaso no Perturbar el movimiento de la cuerda.(d) Si la cuerdasemuevems rpidamente, (e) Ia longitud de onda sereducesustancialmente. Ahora, una pelota de bisbol puede perturbar el movimiento de la cuerdaporque su metro escomparablea la longitud de onda de la cuerda.

Lneamedia de la lente

medio que rodea a la muestra. (El ndice de refraccin es una medida de la variacin de la velocidad de la luz al atravesar de un medio a otro.) El efecto de estastres variables sobre la resolucin se describe cuantitativamente mediande te la siguienteecuacinconocida como la ecuacin Abb:

Rayos parareros

r:

- 0,6u" nsena

(A.l)

Distancia focal, focalesla Figula A.3 Distancia focalde unalente. La distancia distancia desde lneamediade unalenteal punto en el que la paralelos pasan travs Ia que a de convergen un focolosrayos en 1ente.

agtdeza del patrn de interferenciay,por 1o tanto, la capacidad de la lente para trasladarinformacin de la muestra. En los mejores microscopios pticos la apertura angular es alrededor de 70o. La apertura angular de una lente es uno de los factores que determina la resolucin de un microscopio, que sedefine como la distancia mnima que existe entre dos puntos que todava se pueden identificar como puntos separados cuando se observancon un microscopio. La resolucin estdeterminada por tres factores:la longitud de onda de la luz que se emplea para iluminar la muestra, la apertura angular y el ndice de refraccin del

en la que res la resolucin ,t esla longitud de onda de la luz empleada como iluminacin, n esel ndice de refraccin del medio entre la muestra y la lente objetivo del microscopio, y d esaapertura angular ya descrita.La constante0,61 relos presentael grado en el que pueden solaparse puntos de la imagen y todava ser reconocidos como puntos separados por un observador. En la ecuacin anterior, la cantidad r seno de a se denomina apertura numrica de la lente objetivo y se abrevia como NA. Por lo tanto, una expresin alternativa para la resolucin sera:

(4.2)

EN le pRcrICA, EL LMrrE DERESoLUcTN EL PTICO ESDE2OONM PARA MICROSCOPIO ELECTRNICO Y 2 NM PARAEL MICROSCOPIO es Maximizarla resolucin una tareaimportantetanto en microscopa pticacomo electrnica. que r esuna meYa puedenestar puntosy sertodados dida de cmode cerca va distinguidos, resolucin la mejora al tiempo que r se hacemspequeo. parauna mejor resolucin, nuAs, el poA.2 ser meradordela Ecuacin debera lo mspequeo posible. lo sibley el denominador msgrande preguntndonos cmo maximizarla Comenzaremos Lenteobletvo resolucinde una lente de vidrio usandoluz como fuente En hacerel nude iluminacin. primer lugar,necesitamos pequeo posible. longitudde ondapara La meradorlo ms nm, por lo que la luz visibleoscilaen el rangode 400-700 por vendr determinado la longitud el valormnimo para,2, de onda ms corta, dentro de esterango,que seaprctica como fuentede iluminacin lo que resultaserluz azulde alrededor 450nm. Paramaximizarel denominadordela de lmagen rmagen Ecuacin que numrica el proA.2,recuerde la apertura es y ducto del ndicede refraccin el senode la aperturaangular.Estos valores debenpor lo tanto sermaximizados dos para alcanzar una resolucinptima. Ya que la apertura objetivos alrededor 60o, vaes de angularparalos mejores el (b) Lentede aperturaalta (a) Lentede aperturabaja parasenode a esalrededor 0,94.El ndice lor mximo de parael aireesde aproximadamente por de refraccin 1,0, Figun 4.4 Apertutaangulatde una lente. La aperturaangulares la mitad del ngulo a del cono de luz que entra en la lente objetivo parausarse seco, aperen la lo queparauna lentediseada del microscopio a partir de la muestra. (a) Lente de poca apertura de tura numricamximaesde alrededor 0.94. (a espequeo).(b) Lentede aperturagrande (a esgrande).A As,parauna lentecon apertura angular 70",la resode mayor apertura numrica ms informacin puede transmitir la lucin parauna muestrailuminada en secocon luz azulde lente. Las mejores lentes de vidrio pueden tener una apertura de 450nm sepuedecalcular la manerasiguiente: angular de alrededor de 70'.876 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

0.61I -

NA - (o'61)J450) :292nm 0.94

(A.3)

Por tanto, como regla bsica,el lmite de resolucin para una lente de vidrio en seco es aproximadamente 300 nm. Con objeto de incrementar la apertura numrica, algunas lentes de microscopio estn diseadasparaufrlizar aceite de inmersin entrela lente en la muestra.El aceitede inmersin tiene un ndice de refraccin mayor que eI aire por tanto, permite que la lente reciba mayor cantidad de luz transmitida a travs de la muestra. Debido a que el ndice de refraccin del aceitede inmersin es alrededor de 1,5,la apertura numrica mxima para una lente de aceitede inmersin esalrededorde 1,5 X 0,94 : 1,4.Por lo tanto, Ia resolucin de una lente para aceitede inmersin es de alrededor de 200 nm.

0,614 NA

(0 ,6 r)(4 so ):

1,4

Iyb nm

(A.4)

posible) As,el lmite deresolucin(la mejor resolucin que paraun microscopio emplea visibleesaproximadaluz paraaceite de y mente300nm en seco de 200nm conlentes valopuedeseroptimizada hasta La inmersin. resolucin como fuentede luz resde 100nm empleando ultravioleta debidoa la longitudde ondamscorta(200iluminacin, imagen debeser 300nm) deese tipo deluz.Sinembargo,la o registrada una pelculafotogrftca mediante en entonces ya algnotro medio de deteccin que la luz ultravioletano es parael ojo humano. Adems, vidrio corriente el esvisible por emplear lenopaco la luz ultravioleta, lo quesedeben a Ios En tesde cuarzomuy caras. cualquiercaso, valoresque En de hemoscalculado los lmitestericos resolucin. son estoslmites debido a las abelaprctca,esraro alcanzar (defectos tcnicos) laslentes. de rraciones determinalacapaDebidoa queel lmite de resolucin que deuna lenteparadistinguirentredosobjetos escidad prximos,tambin establece lmite superiorde el tn muy En con lente. la prclosaumentos tilesposibles cualquier tilesquesepuedenconseguir tica,Iosmayores aumentos de veces conun microscopio pticosonde alrededor 1.000 Ya la apertura numricade la lenteempleada. quela aperque los tura numricavaraentre 1,0y 1,4,estosignifica limitados tilesde un microscopio pticoestn aumentos y aproximadamente 1.000Xen seco a 1.400x con aceite a por lmitesse Los de inmersin. aumentos encimade estos queno proporcionan ya indenominan del formacin adicional acerca objeto que seestudia. La forma ms efectivade alcanzarms aumentoses cambiarla fuentede iluminacin deluz visiblea electrones.

es Debidoa quela longitudde ondade un electrn alredeque veces pequea la deun fotn deluz ms dor de 100.000 visible,el lmite terico de resolucinde un microscopio (0,002nm) es algunosrdenes magnitud de electrnico ptico (200 nm). Sin emmenor que el del microscopio problemas prcticos el diseode laslenen algunos bargo, para empleadas enfocarlos electrones teselectromagnticas alcance estevalor evitan que el microscopioelectrnico es proEI terico. principalproblema queloselectroimanes considerables cuandola aperturanuducendistorsiones dcimas grado.Estengulo de mricaesmayor de algunas que de diminuto esvariosrdenes magnitudmspequeo el de una lente de vidrio de buenacalidad(alrededor de que confiere microscopio al electrnico aperuna 70'), lo ms que tura numricaconsiderablemente pequea la del para el mejor microscopio ptico.El lmite de resolucin electrnico por lo tanto nicamente ales de microscopio rededorde 0,2 nm, lejos del lmite terico de 0,002nm. muestras biolgicas, existen Adems, cuandose observan y de problemas la preparacin la muestra con el concon que el lmite prcticode resolucin a que hacen sea traste, la de menudoentorno a2 nm.Enla prctica, resolucin un 100 electrnico generalmente veces es mejor microscopio que la de un microscopio ptico.Como resultado, aulos electrnico alrededor son mentostilesde un microscopio ios ptico,esdecir,alredede 100veces de un microscopio dor de 100.000x.

El microscopiopticoEl microscopio ptico abri inicialmente nuestrosojos a la existenciade las clulas.Un nombre pionero en la historia de Ia microscopa ptica esel de Antonie van Leeuwenhoek, el comercianteholandsreconocido generalmentecomo el padre de la microscopaptica. Laslentesde Leeuwenhoek, que l mismo fabric durante los ltimos aos del siglo xvtt, tenan una calidad sorprendentementealta para lo de aquellapocay eran capaces aumentar 300 veces, que supone una mejora de 10 vecescon respectoa los instrumentos previos. Este incremento en la capacidadde aumentar hizo visible por primera vez el interior de las clulasy las observaciones Leeuwenhoekdurante ms de 25 aos conde dujeron al descubrimiento de las clulasen varios tipos de para la forel muestrasbiolgicasy establecieron escenario mulacin de la teora celular.

EMpLEAN Los utcRoscoproscoMpuEsTosCOMBINACIONES DE VARIAS LENTES Se han hecho avances considerables en la construccin y la

pticosen los 300aospostede aplicacin microscopios En rioresal trabajopionerode Leeuwenhoek. la actualidad, en ptica utiliza el instrumentode eleccin microscopa y por lentes sedenomina Io tande combinaciones diversas (FiguraA.5). la FiguraA.5 En compuesto se to microscopio compuesto ilustrael recorridode la luz en un microscopioElmicroscopio ptico 877

Ocular (pieza ocular) Aumenta imagen laformada por el objetivo Lenteocular

Tubodel cuerpo Transmite imagen la al delobjetivo ocular Brazo Principales Lentes objetvo que lentes aumentan la muestraPlatina Mantiene la posicinde la

Lneade visin de la luz

4s4

AfTM Tubo del cuerpohiotirrnev v l v L ' Y

v v

preparacron mrcroscoprca Entoca Condensador la luza travs la de muestraDiafragma ControlaIa cantidad de luz oue entraen el condensador

lvluestra Lentes conoensaooras

Tornillode enfoquerpido Iluminador Fuente luz de Base fino Tornillo enfoque de .. r".*,r$rti Basecon la fuente de iluminacin(b) Recorrido la luz (de abajo a arriba) de

ts,prlncipales (a) Partes funciones y

FiguraA.5 Microscopioptico compuesto. (a) Un microscopio ptico compuesto. (b) Recorrido de la luz a ttavs del microscopio comPuesto.

que comienzacon la fuentede iluminacin, normalmente en una fuentedeluz localizada la basedel instrumento.Los de rayosde luz procedentes estafuente pasana travsde que dirigen la luz haciala muestra lentescondensadoras en montadaen un portaobjetosde vidrio dispuesto la platina del microscopio.La lente objetivo, localizadainmees de sobre muestra, responsable la formacin la diatamente primaria.La mayorade microscopios comdela imagen puestostienen diversos objetivosde distintosaumentos montadossobreun revlverrotatorio. por aumentada La imagenprimaria esposteriormente la lente ocular, o pieza ocular. En algunosmicroscopios entre el objetivo y el ocular se posicionauna lente interLos toan mediaparaconseguir msaumentos. aumentos talesde la imagense puedencalcularmultiplicandolos aumentos objetivo,del oculary dela lenteintermedia(si del presente). un microscopio un objetivo l0 x, con de As, est de2,5X,y un ocularde 10X,aumenuna lenteintermedia la ta250 veces muestra. hastaahora Los elementos microscopiodescritos del constituyenla forma bsicade microscopaptica denominada microscopade campo claro. En microscopiode es con campoclaro,comparado otrosmicroscopios, baraIas Sin to y fcilde usary alinear. embargo, nicasmuestras878 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

directamente mediante microscoque sepuedenobservar que pa de campoclaroson aquellas tienencolor o tienen a algunaotra propiedadque afecta la luz que la atraviesa. caractersticas carecen esas de muestras biolgicas Muchas con colorantes examinao y por lo tanto deben teidas ser Estos microscode microscopios. dascon tipos especiales quelosadecuan para piosespecficos ventajas tienenvarias Entre ellosseincluvisualizardistintostipos de muestras. de yen Ia microscopa contrastede fase,la microscopa de la diferencial, microscopa de contrastede interferencia y En confocal. las siguientes fluorescencia la microscopa y stas otrastcnicas importantes. estudiaremos secciones DETEcTA Le urcRoscopA DE coNTRAsrE DEFASESEN DIFERENCIAS EL NOIC DE REFRACCIN Y EN EL GROSOR Como describiremos ms adelante con mayor detalle, antes de poder examinar las clulas mediante microscopa de campo claro, stas habitualmente se matan, se cortan en seccionesfinas y setien. Aunque estosprocedimientos son tiles para visualizar los detalles de la arquitectura celular interna, el estudio de clulas que se han fijado, seccionado y teido proporciona poca informacin acercade los aspectos dinmicos del comportamiento celular. Por lo tan-

para de una to, sehan desarrollado ampliavariedad tcnicas de el uso de microscopaptica en la observacin clulas todavavivas.Una de que estnintactasy en muchoscasos increla estas tcnicas, microscopade contrastede fases, de sin menta contraste necesidad cortar ni teir, haciendo de uso de lasdiferencias grosory de ndicede refraccintle que seexaminan.Paraentende variasregiones las clulas de debemos de de der lasbases la microscopa contraste fase por mulprimero saberque un haz de luz estcompuesto titud de rayosindividualesde luz. A medida que los rayos la pasandesde fuente delaz a travsde la muestra,suveloftsicas la de por cidadpuedeverseafectada laspropiedades la Habitualmente, velocidadde los rayosseve dismuestra. minuida de maneravariable por distintas regionesde la muestra,lo que produceun cambio de fasecon relacina el lasondasdeluz queno han atravesado objeto(sediceque en lasondasde luz viajan enfaseunndo coincidenlascresde tasy los valles lasondas). Aunque el ojo humano no puededetectardirectamende de Ia de te estos cambios fase, microscopa contraste fase de solucionaesteproblematransformandolas diferencias se del faseen alteraciones brillo. Estaconversin consigue usandovna placadefase(FiguraA.6) que es un compo- Planode la imagen

en nenteptico dispuesto el recorrido de la luzpor encima del objetivoparaponer en faselos rayosdirectosno difracpor que tadoscon aquellos han sido difractados la muestra. de longitudesde onda intensificala El patrn resultante entre imagen,produciendouna imagencon alto contraste fondo iluminado homogy sobreun zonasclaras oscuras (Figura las inA.7).Comoresultado, estructuras neamente se ternasen lasclulas visualizana menudomejor medianque de de te microscopa contraste fase con pticadecampo claro. ptica es particularEstamodalidaden microscopa vivasy sin teir ya que mentetil para examinarmuestras biolgicosproducendifraccin de la luz de los materiales La de de maneracasiinevitable. microscopa contraste fase en seempleageneralmente microbiologay en Ia investigapara detectar bacterias, orgnucin con cultivoscelulares presentes las partculas y en los celulares otras pequeas vivas. muestras DE Le urcnoscopA DE coNTRASTE TNTERFERENcIA (OTC) DELIj.AZ UTU-ZA UN DISOCIADOR DIFERENCIAL DE DIFERENCIAS FASE DELUZ PARADETECTAR La microscopla de contrastede interferencia diferencial (DIC) en principioseasemeja Ia microscopa contrasde a ya un peroesmssensible queemplea prismaeste defase, (Fiseparados paraseparar hazdeluz en dosrayos el pecial cualquier se guraA.8). Cuandolos doshaces recombinan, a en cambiode fase algunode ellosproducidoal pasar tragenerauna interferencia con el segundo vsde la muestra normalcambios fase de haz.Debidoa quelos principales (el ndicede en de menteseproducen losbordes lasclulas la dentrode la clula), perifees refraccin msconstante intensa. produce generalmente seal una La ria de la clula tridimensionalcomo resultadode imagentiene apariencia que ya una ilusindefusinde sombras seproduce quelas

Placa de fase

Luz difractada (fasealterada por la muestra) Lenteobjetivo Luz directa (fase inalterada por la muestra)

i

Lentecondensadora

G?lxl'#'"Fuente luz de

FiguraA.6 0ptica del mictoscopiode conttaste de fase. Configuracin de los elementospticos y de los recorridos de los rayos de luz a travs del microscopio de contrastede fase.Las lneas rosasrepresentanla luz difractada por la muestra y las lneasnegras representanla luz directa.

so;m-

de de de Figura A.7 Mictoscopia conttaste fase. Micrografa Las fueronobservadas epiteliales. clulas de de contraste fase clulas principalde la y sin procesar sin teir,lo queesunaventaja de de microscopa contraste fase.

Elmicroscopio ptico

879

-------Plano

de laimaoen

Analizador (rotado90" con respectoal polarizadr) Prismade Wollaston

I

\iLenteobjetivo

2 hacesde luz polarizada separadospor el prisma inferior Lentescondensadoras

Torrm' Figura Microscopa Micrografa deun grupo 4.9 DlC. DIC deneuronas hipocampalesde rata creciendo en cultivo. Obsrvese el efecto de grabado de sombra que haceque estasclulasaparezcan oscurasen la parte superior y clarasen la parte inferior.

Prismade Wollaston Polarizador

-E-

Q-ruente

oetuz

Figura Optica microscopiocontlaste inteilerencia A.8 del de de (DlG). Configuracinloselementos diferencial de pticos delos y recorridos losrayos luzatravs microscopio de de del DIC. diferencias fasesonpositivas un lado dela cebray nede en (Figura gativas el ladoopuesto en A.9). Los componentes pticosnecesarios parala microscopa DIC incluyenan polarizador,unanalizadorywpar de prismas Wollaston (FiguraA.8).El polarizador el primer de y prisma de Wollanstonseparan rayo de luz, creandodos el hacesseparados una pequeadistanciaen una direcpor cin. Despus atravesar muestra,los haces recomde la se binan por el segundoprisma de Wollanston.Si no existe muestra, haces recombinan los se paraformar un rayoidntico al que entr inicialmenteen el polarizadory en el primer prismadeWollanston. presencia una muestra,los En de doshaces serecombinandela mismaforma (interfieren no entreellos),ylapolarizacin de los haces rota ligeramente en compracin con el original. El efectoneto esun marcadoincrementode la resolucin, que haceque estatcnica seaespecialmente para estudiarmuestras til vivasy sin teir. Como veremosen breve,la combinacinesatcnica con la videomicroscopa una aproximacinespeciales menteefectiva para estudiarlos procesos dinmicosde las clulas tiempo real. en880 y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

Losbilogos celulares emplean otrosmtodos mejode ra de contraste.Lamodulacin contraste Hoffman,dede de sarrollada por Robert Hoffman, incrementael contraste detectandogradientes pticos a travsde una muestra transparente, utilizando filtros especiales un polarizador y que rota. La modulacin de contrastede Hoffrnan produceun efecto fusinde sombras de parecido de la microsal copaDIC. pERMrrE Le urcRoscopA DEFLUoREScENcIA DETECTAR PRESENCIA MOLCULAS IONES LA DE OESPECFICOS DENTRO DE LAS CLULAS

Aunque las tcnicas microscpicas descritas hastaahora sonbastante efectivas paravisualizarlasestructuras celulares,proveen relativamente pocainformacinacerca la lode calizacin molculas de especficas. forma de obtener Una estainformacin esmedianteel uso de la microscopade fluorescencia,que permite la Tocalizacin molculas de fluorescentes dentrodelasclulas. Paraentender cmo funcionala microscopa fluorescencia necesario primero de es comprenderel fenmenode la fluorescencia. Naturaleza la fluorescencia. trmino fluorescencia de El hacereferencia proceso comienza la absorcin al que con de luz por una molculay termina con su emisin.La aproximacin a esteproceso optimizaconsiderando comse el portamiento de un cuanto de luz en contraposicina su comportamiento ondulatorio. FiguraA.l0 esun diagraLa ma de los diversos nivelesde energa un tomo simple. de Cuandoun tomo absorbeun fotn (o cuanto)de luz de una determinada energa, uno de suselectrones saltade su

c .o

b c) c) -o! ,g

de una molcula fluorescentetpica. Cada molcula fluorescente tiene su propio espectrode absorciny de emisin caracterstico. El microscopio fluorescencia. La microscopa de fluoresde cencia es un tipo especializado microscopa ptica que de emplea luz para excitar fluorescencia en la muestra. Un microscopio de fluorescencia tiene un filtro de excitacin entre la fuente deluzy el condensador, que transmite nicamente luz de una longitud de onda particular (FiguraA.l l). El condensadorenfoca la luz sobre la muestra, produciendo que los compuestosfluorescentes la muestra emitan de luz de una longitud de onda ms larga. Thnto la luz de excitacin del iluminador como Ia luz emitida, generadapor los compuestosfluorescentes la muestra, pasan a travs de del objetivo. A medida que la luz pasaa travsdel tubo delPlanode la imagen

9)c) c

LIl

Estadobasal (a) Diagrama energa de

N f,

-c)

'11

p E (O

Luz 400 500 600 700VlSlDlei

I i

Longitud onda (nm) de y (b) Espectros absorcin de emisin de Figura A.10 Principios la fluorescencia. (a) Diagramade de energa la fluorescencia un tomo simple.La luz de una de de determinadaenerga absorbida(lneaazul).El electrnsaltade es Vuelveal estadobasal su estado basala un estadoexcitado. emitiendo un fotn de menor energa por lo tanto de mayor y longitud de onda (por ejemplo,Iuz roja). (b) Espectros de absorcin y de emisin de una molcula fluorescentetpica. La curva azul representaIa cantidad de energaabsorbida en funcin de la longitud de onda, y la curva arroja muestra la cantidad de luz emitida como funcin de la loneitud de onda.

4

Filtrn herrare

/hlnn,roa

la transmisin toda de la luz ultravioleta,normitiondn al nrcn

nicamente luz visible) de Lenteob.letivo

lvluestra

Luzultravioleta Lentecondensadora (fillra Filtro excitacin de la luz y transmite nicamente rayosultravioleta)

estado basal un estado excitado o de mayor energa. Este electrn a menudo pierde parte de su energa y desciende a su estado basal original, emitiendo un fotn al hacerlo. El fotn emitido tiene siempre menor energa (mayor longi-

tud de onda) que el fotn original que fue absorbido.As, por ejemplo, la iluminacin con luz azrtlde un tomo puede producir Ia emisin de luz roja (la energade un fotn esinversamenteproporcional a su longitud de onda; por lo tanto, la luz roja, al tener una longitud de onda mayor que lahlz az,il' tiene menor energa). Las molculas fluorescentes en realidad tienen diagramas de energams complicados que los que se muestran en la Figura A.10a. El nmero de nivelesposiblesde energa en las molculas reales es mucho mayor y por lo tanto, los diferentes tipos de energa que se puedan absorber y emitir son consecuentemente ms numerosos.En Ia Figura A.10b se muestran los espectros absorcin y emisin de

\ -ruenre oe ruzEI +

Figura A,11 pticadel microscopio fluorescencia. de Configuracinde los elementos pticosy de Ios recorridosde la luz a travs del microscopio de fluorescencia.Laluz procedentede la fuente de iluminacin pasaa travs de un filtro de excitacin que transmite nicamente luz de excitacin (lneasnegrascontinuas). La iluminacin de Ia muestra con estaluz produce que sus molculasfluorescentes emitan luz de una longitud de onda mayor (lneasazules).Posteriormente,el filtro barrera elimina la luz de excitacin y permite el paso de Ia luz emitida. Por lo tanto, Ia imagen se forma exclusivamentea partir de luz emitida por las molculasfluorescentes Ia muestra. de

Elmicroscopio ptico

881

un microscopio por encima del objetivo, atraviesa filtro barrera que elimina especficamentela longitud de onda de la luz de excitacin. Esto deja nicamente las longitudes de onda de la luz emitida por la muestra parala formacin de la imagen fluorescentefinal que, por lo tanto, parecebrillante frente a un fondo oscuro. fluotescentes, Para emplear la microscopa de Anticuetpos fluorescencia la localizacinde molculaso iones especen ficos dentro de las clulas,los investigadoresdeben emplear de indicadores especiales las molculas denominados sondas Una sonda fluorescente esuna molcula capaz lluorescentes. para indiy de emitir luz fluorescente que puede emplearse presenciade una molcula o un ion especfico. car la Una de las aplicacionesms frecuentes de las sondas es fluorescentes la inmunotincin, una tcnicabasadaen la capacidadde los anticuerposde reconocery unirse a mol(las molculas a las que se unen los anticulas especficas Los cuerpossedenominan antgenos). anticuerposson protenasproducidas de manera natural por e1sistemainmune invasores, de a en respuesta la presencia microorganismos pero se pueden generartambin en el laboratorio inyectando una protena extraau otra macromolculaa un animal como un conejo o un ratn. De estaforma, es posible a producir anticuerposque se unirn selectivamente virtualmente cualquier protena que un cientfico quisieseesusanno tudiar. Los anticuerpos son visiblesdirectamente do microscopa ptica, sin embargo, se suelen unir a colorantes fluorescentescomo Ia fluorescena,que emite verde,o \a rodamina,que emite fluorescencia fluorescencia roja. Ms recientemente los anticuerpos se han unido a > son cristalesdiminutos que emiten luz que y que son ms establesqumicamente que los colorantes n tradicio nales.Para identifi car la lo calzaci subcelularde las una protena especfica clulassetien simplementecon un anticuerpo fluorescentedirigido contra Ia protena y la localizacin de la fluorescenciase detectamediante el examen de Ia clula con luz de la longitud de onda apropiada. Se pueden aplicar tcnicasmicroscpicasde inmunofluorescenciausando anticuerpos marcados directamente (FiguraA.l2a). Sin embargo, con marcadoresfluorescentes la microscopa de inmunofluorescenciase emplea ms comnmente utilizando tcnicasde inmunofluorescencia indirecta (Figura A.12b). En la inmunofluorescenciaindirecta se trata un tejido o una clula con un anticuerpo sin marcar. Este anticuerpo, llamado anticuerpoprimario, se dentro del tejido o de une a los sitios antignicosespecficos Entoncesse aadeun segundotipo de anticuerpo la clula. El llamado anticuerpo secundario. anticuerpo secundario partcula fluorescente se une al any estmarcado con una que se pueden unir ms de ticuerpo primario. Debido a una molcula de anticuerpo primario al antgeno,y ms de una molcula de anticuerpo secundario al anticuerpo primario, seconcentrauna mayor cantidad de molculasfluocercade la molcula que queremos detectar.Como rescentes

marcados Anticuerpos con un colorante fluorescente

A n t i c u . e r p o s , , ,Y V .,otflgtooscl / especrlrcos

;;;;;;;;,r1s"r;-4 1 \A v

h

que los Se permite anticuerpos unan se

r1'

(a) Inmunofluorescencia icos Anticuerpos especf frenteal antgeno primario) (anticuerpo

a Sepermite losanticuerpos unirse antgeno al

\/\-

I-t

v -

f'(

Se aadenanticuerpos que se unen marcados primarios a los anticuerpos ("anticuerpo secundario') (b) Inmunofluorescencia indirecta fluotescentes. empleando anticuerpos FigwaA.t2 Inmunotincin se La microscopa inmunofluorescencia basaen el uso de de paradetectarcomponentes marcadoscon fluorescencta anticuerpos (antgenos) dentro de una muestrade especficos moleculares directaun anticuerpoque se tejido. (a) En la inmunofluorescencia une a un componentemolecularen la muestrade tejido semarca El se con un colorantefluorescente. anticuerpomarcadoentonces localizaciones aadea la muestrade tejido unindosea algunas que El especficas. patrn de fluorescencia seorigina sevisualiza o de empleandomicroscopa fluorescencia confocal.(b) En ia indirecta,seaadeun anticuerpoprimario al inmunofluorescencia que lleva tejido.A continuacinseaadeun anticuerposecundario se El el marcajefluorescente. anticuerposecundario une al anticuerpoprimario. Debido a que sepuedeunir ms de un fluorescente cadamolculade anticuerpo a anticuerposecundario indirectaamplificade manera primario, la inmunofluorescencia que la haciendoque seams sensible 1a fluorescente, efectiva sea1 directa. inmunofl uorescencia

resultado, la inmunofluorescencia

indirecta produce una

amplificacin de la sealy esmucho ms sensibleque la utilizacn de un nico anticuerpo primario. El mtodo es ya que no detectadirectamentednde se unen los anticuerpos a los antgenos;tcnicamente,la fluorescencia refleja el sitio al que se ha unido el anticuerpo secundario. Por supuesto,esto refleja el lugar donde se localizala molcula originaria de inters.

882

y tcnicas microscopa de Apndice Principios

de fluotescentes,En microscopa fluorescenOttassondas que son unidas naturales tambinprotenas cia seemplean especficos. Por celulares a selectivamente componentes de unaimagen fluorescenejemplo, FiguraA.l3muestra la teidas confaloidina, una toxina cia de clulasepiteliales que procedente una seta, marcada con fluorescena, se de de Otra a los une especficamente microfilamentos actina. utiliza la protenaverde tcnicapotentede fluorescencia (GFP),una protenafluorescente origen de fluorescente Aequoria victoria.Usannaturalproducidapor la medusa pueden los do tcnicas DNA recombinante, cientficos de unir el DNA que codificapara GFP a un gen que codifica

--

1orm-----]

de Clulas epiteliales A.13 Micloscopa fluotescencia. de Figura phalloidina, fluorescente con rin de perroteidas el colorante queseunea losmicrofilamentos actina. de

Et una protenacelularen particular. DNA recombinante en resultantesepuedeintroducir dentro de las clulas, las fluorescente queseexpresarparaproducir versin una de la la protenacelularnormal.En muchoscasos, fusin de GFP al final de una protenano interfierecon su funcin, de lo que permite el uso de la microscopa fluorescencia protenas fusionadas GFPmientrasstas a paravisualizar sus desempean funcionesen una clulaviva (Figuhan Losbilogosmoleculares producidoformas ra A.14). que absorbeny emiten luz de diversas mutantesde GFP se otrasprolongitudes onda.Adems, han identificado de roja tenasde origennatural,la protenafluorescente del han herramientas expandidoel repertoriode coral.Estas que a de molculas fluorescentes estn disposicin losbiIogoscelulares. de se La microscopa fluorescencia puedeutilizar para subcelular variosionesadede monitorizarla distribucin comoprotenas. macromolculas Para msde paradetectar cuyas los conseguirlo, qumicoshan sintetizadomolculas son a propiedades fluorescencia sensibleslasconcentrade H+, Na*, Zn'* y Mg2+,as de ionescomo Ca2+, ciones a elctricos travsdela membranaplascomoa potenciales sondas fluorescentes inyectan cse en mtica. Cuandoestas al lulasde forma que sequedanrestringidas citosolo a un producen informacin intracelular especfico, componente inicasdentro de la de importanteacerca las condiciones llamadafura-2 clula.Por ejemplo,una sondafluorescente paraestudiar concentraciones las habitualmente seemplea vivas,ya que fura-2 emite fluode Ca2* dentro de clulas de bajas rescencia amarillaen presencia concentraciones verdeo azul en presencia conde de Ca2+y fluorescencia progresivamente altasde esteion. Por lo ms centraciones del en tanto,la monitorizacin colordela fluorescencia ccon estasondapermite a los cientficos lulas vivasteidas intracelulares de observarcambiosen las concentraciones se Ca2*amedidaque stas producen.

(a)00:00

(b) 03:a0

(c) 05:08

-iotm-

ptoteinas. Serie imgenes unaclulade un embrinde patavisualizal de de fluorescente vetde de Figura A.14 Utilizacin la protena El fluorescente verde(GFP). tiemporespecto queest unidaa la protena mitosis. embrinexpresa El experimentando nematodo B-tubulina en a Ia primerasemuestra minutos:segundos.

Elmicroscopio ptico

883

Le utcnoscope coNrocAl MINMTzAEL ASpEcro BoRRoSoMEDIANTE EXcLUSIN LALUz zuERA LA oT DE FOCO LA IMAGEN DE Cuando se visualizanclulasintactas,la resolucinde la microscopa fluorescencia limitada por el hechode de est que aunqueseemite fluorescencia travsde toda la proa fundidad de la muestra,el observadornicamentepuede enfocarel objetivoen un determinadomomento a un nico plano.Como resultado, luz emitida desde la regiones de la muestra encimay por debajodel planofocalhaceque por la imagensea borrosa(Figura A.15a). Parasolucionar este problema,los bilogoscelulares menudo empleanel mia croscopioconfocal-un tipo especializado microscopio de ptico que empleaun haz dehtz lserpara producir una imagende un nico plano de la muestraen un momento determinado(FiguraA. I 5b)-. Estaaproximacinmejora la resolucina lo largo del ejeptico del microscopio-as se pueden distinguir las estructuraslocalizadas el que en centro de la clulade las que estnen la superficieo de la parteinferior-. De igualforma,sepuededistinguiruna clula en el centro de una piezade tejido de las clulasque estnpor encimao por debajode ella. Paraentender este tipo de microscopa necesario es primero considerar recorridosde la luz que atraviesa los una lente simple.La FiguraA.16 ilustra cmo una lente forma una imagende una fuentepuntual de luz. Paraentender lo que verasu ojo imagineque colocaun trozo de una pelcula fotogrficaen el plano de foco (plano de la imagen).

Ahora pregntese cmo contribuyena la imagenoriginal lasimgenes procedentes otrospuntosdeluz localizados de mscerca mslejosde la lente(FiguraA.16b).Como se o puedededucir,existe una relacinprecisa entrela distancia entre el objeto y la lente (o), la distanciaentrela lente y la imagenenfocada objeto (i) yladistanciafocalde la lendel te (fl.La siguiente ecuacin expresa relacin: esta 111

j:;-

i

(A.s)

Como muestra FiguraA.l6b, la luz que seoriginaa la partir de los puntos que no estnen foco cubreuna superficie mayor de la pelculaya que los rayosconvergen dio vergen.As, la imagen en la pelcula estformada por la fuentepuntual original, que esten foco,y un halo de luz procedente los objetosfuera de foco. superpuesto de Si nicamenteestuvisemos interesados ver la fuenen te puntual original, podramos eliminar la ltz ajenaa estepunto disponiendo una apertura u orificio puntual (pinhole), el mismo plano de la pelcula.El microscopio en confocalempleaesteprincipio para discriminar los rayos fueradefoco.Porsupuesto, una muestrarealno tenemos en nicamente una fuentepuntual de luz extraaa cadalado del objeto que deseamos observar,sino un continuo de puntos.Paraentendercmo afectaestoa nuestraimagen, imagineque en lugar de tres puntos de luz nuestramuesa estuviese formadapor un tubo deluz fino ylargo, como muestrala FiguraA.16c.Considere se ahoracmo seob-

(a) Microscopa fluorescencia de tradicional

(b) Microscopa fluorescencia de confocal

E

FigutaA.15 Comparacin la microscopa fluorescencia de de confucalcon la microscopiade fluorescencia tladicional. Estasmicrograflas de fluorescenciamuestran clulasde gla marcadascon fluorescencia(rojo) y clulasnerviosas(verde) marcadascon dos marcadorei fluorescentes diferentes.(a) En la microscopa de fluorescenciatradicional se ilumina la muestra completa de forma que el material fluorescentepor encima y por debajo del plano de foco tiende a hacer borrosa la imagen. (b) En la microscopa confoial de fluorescencia,la luz incidente se enfocaen un nico plano, y se excluyela fluorescenciafuera de foco de la muestra. La imagen resultanteespor lo tanto mucho ms ntida. (Imagen cortesade Karl Garsha,especialista microscopla ptica digital, grupo de tecnologa de imagin, Instituto en Beckman de Ciencia y Tecnologa,Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana,IL wwi.tig.uiux.edu.l

884

y tcnicas microscopa ApndicePrincipios de

Visin plano del de Ia imagen Lente Planode la imagen

(a) Formacin una imagenpor una lentea partirde un nico de puntode luz

FiguraA.16 Reconidosde la luz a travs de una lente. (a) Imagen de un punto nico de luz formada por una lente. (b) Recorridos de laluz a partir de tres puntos de luz situados a diferentesdistancias de Ia lente. En el plano de la imagen, la imagen enfocadadel punto central sesuperpone con los rayos desenfocados procedentesde los otros puntos. Sepuede usar una apertura alrededor del punto central para discriminar los rayos desenfocados maximizar la y contribucin del punto central. (c) Recorridos de la luz originada a partir de un continuo de puntos, representadocomo un tubo de luz. Esto es semejantea una muestra iluminada uniformemente. En el plano de la imagen, las contribuciones procedentesde una pequea seccinenfocadaarbitraria, dx, estncompletamente enmascaradas los otros rayos fuera de foco; en estecasoun por pinhole o pequeo orificio no ayuda. (d) Mediante la iluminacin intensa de una nica seccindel tubo y la iluminacin dbil del resto,podemos recuperar Ia informacin en el plano de imagen de la seccin dx. Ahora un orificio localizado alrededor del punto rcchazalos rayos fuera de foco. Debido a que los rayos del centro proceden casitodos de dx, tenemos una forma de discriminar frente a los puntos ms dbilesfuera de foco.

Visin plano delda la imnan

Lente

Planode la imagen magen

(b) Formacin la magende un puntode |uz en presencia enaia ^trc 2 nr rninc

Visin plano dello l imnonI

Lente

Planode la imagen

(c) Formacin una imagende una seccinde un tubo de de luz uniforme

t. 1 .l

I I

Visin plano del de la imagen

Lente

Planode la imagen

(d) Formacin una imagende una secciniluminada en d e u n t u b od e | u z

tieneuna imagena partir de una pequea seccin arbitraria, dx. Si el tubo envala misma cantidadde luz por unidad de longitud,entonces inclusocon un pinhole,la imagendeinters estar por enmascarada loshalos procedentes de otras partesdel tubo. Estosucede porquela pequea contribucinde cadauna de lassecciones fuerade foco,y todaslaspequeas producenconjuntamente secciones un fondo intensosobrela seccin inters. de Estasituacin muy semejante la que encontramos es a en muestras biolgicas reales que se han teido con una sondafluorescente. general, distribucinde la sonda En la y estridimensional cuandodeseamos mirar en detalle un nico objeto(comoun microtbulo)usando microscopa defluorescencia convencional, imagen la est menudoesa por tropeada el halo de luz de fondo queseoriginaprincipalmente por los microtbuloslocalizados encimay por por debajodel plano de inters. Paraevitaresto, podemos iluminar preferentemente plano de intersdesequiliel brando as las distintascontribuciones el plano de Ia en imagen, formaqueprocedan de principalmente un nide co plano (FiguraA.16d).As,la esencia Ia microscopa de confocal consiste enfocar un nico planoel hazdeiluen en minacin queexcitala fluorescencia, usarun orificio para y asegurar la luz que llegaal plano de la imagenseorigique na principalmente partir del planoenfocado. a La FiguraA.17ilustracmofuncionanestos principios enun microscopio lserconfocal, iluminalasmuestras que empleando whazde luz lserenfocdo travs una lena de te objetivohaciaun punto limitado de difraccin.La posicin del punto se controlamedianteespejos barrido, de que permiten que el haz deluz recorrala superficiede la muestra formaprecisa. medidaqueel hazhaceun bade A rrido sobrela muestraseforma una imagena partir de la mismade la siguiente forma.En primer lugar,la luz fluorescente emitidapor la muestra captada la lenteobpor es jetivo y conducidapor el mismo recorrido de la luz inciElmicroscopio ptico

88s

Lser Espejos de barrido

Haciael oroenaoor Espejo dicroico Detector | t ^hiii\/^ (tubofotomultiplicador)L v , , r v v v J v ! , v v

Muestra(b) de FiguraA.1? Microscopio banidolserconfocal. (a) Fotografiay (b) esquemade un microscopio de barrido lserconfocal.Seemplea un lserpara iluminar un punto de la muestra en un determinado de momento (lneasazules).Los espejos barrido mueven el punto en un determinado plano de foco siguiendoun patrn preciso.La luz fluorescenteemitida por la muestra (lneasrojas) esreflejadapor los de mismos espejos barrido y retorna por el mismo recorrido original del haz incidente.La luz emitida no urelve al lser por el contrario, estransmitida a travsde un espejodicrico (que en esteejemplo refleja la luz azul y transmite lafuzroja). Un orificio o pinhole en el plano de la imagen bloquea los rayosextraosque estnfuera de foco. La luz esdetectadapor un tubo fotomultiplicador, cuya seales digitalizaday almacenadaen un ordenador.

dente. El recorrido de la luz fluorescente se separa entonces

de la luz lserutilizando un espejodicroico,que reflejaluz de un color y transmitela de otro. Debido a quela luz fluorescente tieneuna longitud de onda mslargaquela luz de hacia es el excitacin, color dela luz fluorescente desplazado en atraviesa orificio localizado el el roio. La luz fluorescente886 y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

un plano de la imagen,frentea un tubo fotomultiplicador, La que actacomo detector. sealdel tubo fotomultiplicay digitalizada mostradaen un ordenador. dor esentonces Paraver el incrementode resolucinque seobtienecon la microscopaconfocal,vuelva a mirar la Figura A.15, que mediande muestraimgenes la misma clulavisualizada y convencional mediante te microscopade fluorescencia de microscopa lserconfocal. lserconfocal, miel a Como alternativa la microscopa que giran giratorioempleadiscos de confocal disco croscopio leny rpidamente que contieneun conjunto de pequeas Aunque no de tes y una seriecorrespondiente pinholes. pticastan finas como los mipuedeproducir secciones puedegenerar imgenes confolserconfocal, croscopios usandocmaras que sepuedenadquirir rpidamente cales rEstavelocidadestil paravisualizarprocesos digitales. en pidosqueseproducen lasclulas. un confocal, emplea pinholeparaelise En microscopa es luz fuerade foco.El resultado una imagenntiminar la por molculas encimay por debajodel plada, aunquelas por siendoexcitadas Ia luz no focaldela lenteobjetivoestn rpidode Estopuedeproducir el blanqueamiento incidente. especialen de las molculas fluorescencia; algunoscasos, vivasque contienenmoclulas mentecuandoseobservan libera radicales este lculasfl uorescentes, blanqueamiento txicosque puedencausarla muerte de la clula.Parareque nicamente serladeseable ducir esta muy prximas fluorescentes las fuesenexcitadas molculas Estoesposibleutilial plano focalque seestexaminando. zandolamicroscoplade excitacinmultifotn. En la mimultifotn, seempleaun lserque de croscopa excitacin y emitepulsosde luz de muy altaenerga muy rpidamente fluorescencia, Paraqueseproduzca parairradiar Ia muestra. una rpidasucesin debeabsorber la molculafluorescente (FiguraA.l8). casos o ms)fotones tres dedos(o enalgunos es de Laprobabilidad queestoseproduzca muy baja,excepto nicerca plano focaldel objetivo.Como consecuencia, del que camentelas molculasfluorescentes estnenfocadas El es emitenfluorescencia. resultado muy similar en nitidez el perono esnecesario pinholeya confocal, a la microscopa se queno hayqueeliminarluz fueradefoco.Thmbin reduce Como ejemplo,seemla considerablemente fototoxicidad. ple microscopa excitacinmultifotn para generarla de imagende la FiguraA.14 de un embrin vivo. la una tercera tcnica, microscopladiSepuedeemplear muy ntigital de deconvolucin,para producir imgenes digital sebasae un principio comdas.La deconvolucin pletamentediferente.En estecaso,seempleamicroscopa para adquirir series imde convencional de fluorescencia de a genes fluorescentes lo largo del espesor la muestra. digitalEntonces empleaun ordenadorpafa procesar se cada o deconvolucionar, plano focal para eliminar mente, la matemticamente contribucin debida alalaz fuera de digital puedeprocasos, deconvolucin la foco.En muchos mediantemicomparables las obtenidas a ducir imgenes

Figura A.18 Microscopa de excitacin multifotn. (a) En un microscopio confocal estndarse produce fluorescenciaen un recorrido con forma de reloj de arena a travs de la muestra. Debido a que una zona amplia emite fluorescenciaesmucho ms probableque seproduzca fototoxicidad que en la microscopa de excitacin multifotn. (b) En un microscopio de excitacin multifotn la fluorescenciaest limitada al punto de foco de los pulsosdel lserinfrarrojo, lo que producemucho menosdao.La iluminacin infrarroja tambin penetrams profundamenteen la muestraaue la luz visible.

(a) Microscopa confocal

(a) Microscopa multifotn

croscopaconfocal (Figura A.l9). Una ventaja de la deconvolucin es que microscopano estrestringida a las longitudes de onda especficas que se emplean comnmente en los lseres los microscopios confocales. de LR vtool,ncRoscopA DIcITAL pUEDE REGIsTRAR IMGENESCONSECUTIVAS OPTIMIZADAS El advenimiento de detectoresde luz de estadoslido ha hecho posible en muchos casosreemplazar la pelcula foto-

grflcacon un equivalenteelectrnico-por ejemplo, con una cmarade vdeo o una cmarade imagen digital-. Estas mejoras han dado lugar a la tcnica de videomicroscopa digital, en la que se registrany se almacenanelectrnicamenteimgenesmicroscpicasponiendo una cmarade vdeo en el plano de la imagen producido por la lente ocular. Esta aproximacin se aprovechadel hecho de que las cmaras de vdeo pueden detectar pequeas diferencias de contraste con mayor sensibilidad que el ojo humano.

(a)

(b)

a

4"n---:,

Figura A'19 Microscopia deconvolucin de digital. Fisin de una clulade levaduras teida con un coloranteespecfico para el DNA (rojo) y un colorante especficode membrana (verde). La imagen de la izquierda esuna seccinptica sin procesara travs del centro de la clula. La imagen de la derechaesuna proyeccin de todas las secciones despusdel procesamientotridimensional de la imagen. El anillo del tabique central en desarrollo (rojo) se estformando entre los dos ncleos (rojo) que surgieron por divisin nuclear durante Ia mitosis previa.

Elmicroscopio ptico

887

1.1

imgenes un foren de las Adems, cmaras vdeogeneran medianteel promato digital que pueden seroptimizadas digital. En el procesode optimizacin,primecesamiento como un conjunto de la ro sealmacena sealdela cmara a cuyos valorescorresponden nmerosen dosdimensiones particular en la la claridadu oscuridadde una localizacin paraincrementar el entonces Los imagen. datosseprocesan del y contraste paraeliminar las caractersticas fondo que A.20). la enmascaran imagende inters(Figura de permitenla visualizacin esLasmejorasproducidas de tructurasque son un orden de magnitud mspequeas las que se pueden observarmediantemicroscopaptica ptica Como hemosvisto, Ia microscopa convencional. incapazde resolverobjetos es convencional generalmente de mspequeos 200 nm de dimetro.Por el contrario,la permite la visualizacin computerizada videomicroscopla de microtrlbulos individuales que miden nicamente25 digitalesde vdeo sepueden nm de dimetro.Lastcnicas de convencional campo claro,as aplicar a la microscopa creandoasun conDIC y confocal, como a la microscopa junto poderoso aproximaciones paraincrementarla efide ptica. caciade la microscopa digital es Una ventajaadicionalde la videomicroscopla fijada,comoesel casoen estar el quela muestrano necesita de electrnica, forma que sepuedenmonila microscopa se a dinmicos medidaquestos producen. torizarprocesos cmaras vdeo especialde Adems, han desarrollado se que imgenes extremadamentesensibles puedendetectar de mentedbilesfacilitandoaslla capacidad registraruna celude consecutivas los procesos serierpidade imgenes laresa medidasque stosseproducen.Por ejemplo,utilipodra llevar zandouna pelculafotogrficaconvencional, ms de minuto registraruna imagendel marcajefluoresconseculo cente, quesignificaqueuna seriede fotografias tivaspodrla slomostraruna foto de una clulapor minusi to. Sin embargo, una cmarade vdeooptimizadapuede

registraruna imagen de la misma clula30 vecespor segundo,estopermite monitorizar cambiosrpidosen el assubcelulares. pectoy el comportamientode componentes Estoha permitido a los cientficosobtenerinformacin de y los cambiosen la concentfacin en la distribucin subcemensajecomo segundos citoslicos lular de componentes y celular, estudiarel papelde las ros durantela sealizacin en de estructuras citoesqueleto los movimientosintraceludigital ha ampliado enorlares.As, la videomicroscopa para monitorizar procesos al mementenuestracapacidad vivas. tiempo que seproducenen las clulas til digital no essolamente paraexamiLa microscopa en nar procesos un plano focal.En una variantede estatcnica seempleaun ordenadorpara controlar el foco motoimgenes De forma,secaptan rizadodeun microscopio. esta de series de a lo largo del espesor la muestra.Cuandoestas este se imgenes captana intervalosde tiempo especlficos, en se tipo de microscopa denominamicroscopa cuatrodi(expresin a acuada partir de la ftsica;las cuamensiones msla del son tro dimensiones lastresdimensiones espacio de en deltiempo).El anlisis los datos adicional dimensin informticasesrequiereaplicaciones cuatro dimensiones a entrelos planosfocales que pecializadas puedennavegar especficas. lo largo del tiempo para mostrar imgenes MToDosprtcos S pusoN EMPLEAR Y LOSMOVIMIENTOS LASPROPIEDADES PARAMEDIR Y MACROMOLCUTS DELASPROTENAS OTRAS a La microscopapticapuedeayudarnos visualizardnde y dentro de lasclulas para estulocalizanlas molculas se de delos momientosy laspropiedades las diar la dinmica brevemente estas Consideraremos biolgicas. molculas en estaseccin. modernas tcnicas y fotoactlvacln,Cuandolasmolculas Fotoblanqueamiento son fluorescentes irradiadascon luz de la longitud de onda

(a)

(b)

(c)

(d)

ffi

digital computeilzada. Esta serie de micrografas muestra cmo sepueden emplear los ordenadorespara FiguraA.20 Videomicroscopa mejorar las imgenesobtenidas mediante microscopa ptica. En esteejemplo, la imagen de numerosos microtbulos, que son demasiado pequeospara ser observadosmediante microscopa ptica convencional,seprocesanpara hacerlosvisibles en detalle. (a) Imagen resultante del incremento electrnico del contrastede la imagen original (que pareceestarvaca). (b) Fondo de Ia imagen procesadaen (a) que es sustrado (c) de la imagen (a) dejando como resultado nicamente los microtbulos. (d) Imagen final detalladaque resulta del promedio que semuestran en a-c. electrnico de las imgenesindiduales procesadas

y tcnicas microscopa de ApndicePrincipios

de excitacin apropiada durante largos periodos de tiempo, sufren un fotoblanqueamiento (la irradiacin induce que las molculas dejen de emitir fluorescencia).Si solamente una pequea regin de Ia clula es expuesta a la luz intensa, el blanqueamiento produce una disminucin caractersticade la fluorescencia estazona (FiguraA.2la).A meen dida que las molculas no blanqueadas se mueven hacia la zona blanqueada, se recobra gradualmente los niveles de fluorescencia.La recuperacinde la fluorescenciadespus del (FRAP) es una medida til de la velofotoblanqueamiento

:F*QF--QF(a) Fotoblanqueamiento (b) Fotoactivacin Monmero de G actina

cidad a la que las molculas difunden o son transportadas (vasela directamente Figura7.ll paraun ejemploclsico de la utilizacin de FRAP). En otroscasos, molculas las fluorescentes modificason das qumicamente para no emitir fluorescencia hastaque son irradiadascon luz de una longitud de onda especfica, normalmente ultravioleta. luz ultravioleta luz La inducela liberacindel modificadorqumico,permitiendoque la molculade intersemitafluorescencia. han producidotanSe to colorantes modificadosqumicamente como formas de GFPque secomportande estaforma. Estoscompuestos se denominan frecuencia con compuestos enjaulados,ya son que la escisin nicamente por inducidapor la luz. La liberacin, fotoactivacin, o producela situacin contraria al fotoblanqueamiento: liberacinlocal de una molla produceun punto luminosodefluorescenculafluorescente quesepuedeseguira medidaquelasmolculas cia siguen su caminoa Io largode la clula(Figura A.2lb). La liberacin por fotoactivacin puedeemplear se tambinparatransformar otro tipo de molculas inertesa su estadoactivo.Por ejemplo, ncalcio el enjaulado> consiste un quelante calen de cio que estunido a los ionescalcio.Cuandoel compuesto enjaulado irradiado,liberael calcioque llevaunido, proes duciendouna elevacin local de calciodentro de la clula. Microscopa fluorescenciareflexin intema. La mide de total croscopa florescencia reflexin de de total interna(TRIF) suponeun mtodoinclusoms precisopara observar las molculas fluorescentes. sebasa unapropiedad TRIF en til dela luz: cuandola luz semuevedesde mediocon un alto un (comoel vidrio) a un medioconun nndicederefraccin dicede refraccin menor (comoel aguao una clula), el si ngulodeincidencia la luz supera ciertovalor (denode un minadongulo crtico),Laluz reflejada. es puede Usted estar familiarizadocon los cables fibra ptica,que sebasanen de el mismo principiofsico. curvatura Ia fibra produce La de que casitoda la luz que entra en el cableseareflejada internamente, permitiendoa estas fibrasservircomo.Losmicroscopistas pueden tambinusarlentes especialespara haceruso de la reflexintotal interna.Cuando una clulaemiteluz brillantefluorescente forma quetoda de la luz supera ngulocrtico,seproducirla reflexintotal el interna.Por qu estil la TRIF si sereflejatoda la luz?Una capade luz muy pequea, llamadael