T.3. principios de microscopía
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2°ENFERMERÍA MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA PROFESORA: PATRICIA NARBÓN
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2°ENFERMERÍAMICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍAPROFESORA: PATRICIA NARBÓN
Estudios de microbiología han estado muy ligados al microscopio.
Poder de resolución ojo humano: 100µm Poder de resolución del mejor microscopio
óptico: 0,2µm. 500 veces superior al ojo humano.
Diferenciar entre aumento y resolución
El poder de resolución es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.
Cuanto mayor sea el poder de resolución, mayor será la definición del objeto.
La resolución es inversamente proporcional a la distancia mínima a la cual se pueden distinguir dos puntos muy cercanos.
Los microscopios que utilizamos en la actualidad son los descendientes de los microscopios compuestos que ya se conocían en la época de Leeuwenhoek. Los microscopios compuestos de aquella época utilizaban varias lentes con lo que se conseguían mayores aumentos que con el microscopio simple.
La mejoría de los microscopios actuales básicamente ha consistido en incorporar lentes correctoras que permiten una mejor iluminación de toda la imagen y evitan las aberraciones cromáticas propias de las lentes simples. Los microscopios modernos l levan tres SISTEMAS DE LENTES el Condensador, el Objetivo y el Ocular
La calidad de la imagen depende de tres factores:
AumentoContraste Resolución
Con una lente convexa simple se pueden visualizar estructuras de hasta 1 µm. Los microscopios que utilizamos actualmente tienen más de una lente, son compuestos.
Aunque el aumento es muy importante, no siempre es suficiente para que apreciemos los detalles de un objeto. Los dos factores que afectan a nuestra capacidad para ver una imagen de calidad son el contraste y la resolución.
El contraste Diferencia en la intensidad luminosa que nos
permite diferenciar el objeto del fondo o apreciar distintas partes del mismo.
Depende de la cantidad de luz absorbida por el objeto y la que es transmitida. Si un objeto y el medio inmediato que lo rodea transmitieran la misma cantidad de luz, la imagen del objeto no se distinguiría del fondo.
Algunos tipos de microscopios tienen dispositivos para aumentar el contraste (ej. Microscopio de contraste de fases, microscopio de campo oscuro).
Resolución El límite de resolución de un microscopio LR es
la mínima distancia a la que tienen que estar dos puntos para que en la imagen se perciban separados uno del otro. El poder de resolución es mayor cuanto menor es el límite de resolución (PR=1/LR)
La resolución depende del sistema de lentes del microscopio, no del objeto que se está estudiando; en concreto depende de:
b) Tamaño de la primera lente de aumento llamada Objetivo
c) Longitud de onda de la fuente de iluminación del objeto
d) Índice de refracción (capacidad de desviación de la luz) del material que se encuentre entre la lente del objetivo y el especimen
El límite de resolución disminuye (con lo que el Poder de Resolución aumenta) disminuyendo la longitud de onda (l) de la fuente de iluminación, lo que puede conseguirse iluminando con luz ultravioleta o con haces de electrones.
El poder de resolución es mayor al aumentar el índice de refracción del medio que atraviesa la luz, y puede aumentarse haciendo que la luz atraviese un medio distinto al aire. El objetivo de aceite de inmersión se utiliza sumergido en un aceite especial que se coloca entre el porta y el objetivo. El índice de refracción de la luz es mayor en aceite (1,5) que en aire (1,0).
El poder de resolución de un microscopio aumenta considerablemente al utilizar como una fuente de iluminación de menos longitud de onda.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO El microscopio de campo claro lleva la fuente
de luz incorporada en la base. La luz pasa a través de un filtro azul que elimina longitudes de onda largas y entra en el condensador. El condensador hace incidir la luz en el espécimen que absorbe parte de la luz.
La luz transmitida por el espécimen entra en el Objetivo y forma la primera imagen en el tubo del microscopio. Posteriormente el Ocular aumenta la imagen y la proyecta en la última lente de la serie, la de nuestro ojo.
Casi todos los microscopios actuales poseen varios objetivos con distinto poder de amplificación. Suelen disponer de un objetivo de 10 aumentos (10x) uno de 40 aumentos (40x) y uno de inmersión de 100 aumentos (100x). Casi todos los oculares poseen una capacidad de amplificar 10x la imagen generada en el tubo del microscopio, lo que hace que el número total de aumentos sea de 100x, 400x ó 1000x
El objetivo de inmersión tiene un campo de visión pequeño pero además del aumento proporciona más detalle de la figura por su mejor resolución.
Un microscopio compuesto ordinario proporciona una iluminación de campo claro ya que el condensador dirige la luz a través del espécimen y el fondo queda iluminado de forma brillante. Los microscopios compuestos pueden ser modificados para ver una muestra mediante: Campo oscuro, Contraste de fases, Fluorescencia o por Contraste Diferencial de Interferencia (DIC).
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO El microscopio de campo oscuro es un tipo de
microscopio óptico en el que se ha modificado el sistema de iluminación de manera que la luz incide sobre la muestra sólo desde los lados. La única luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que, al ser dispersada por la muestra, incide en el objetivo.
Los microorganismos se observan brillantes sobre un fondo oscuro.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Las sustancias fluorescentes son capaces de emitir
una luz de mayor longitud de onda que la de la fuente de luz con que son iluminadas. Cuando se iluminan con luz uv (de longitud de onda corta, no visible) son capaces de devolver luz visible, intensamente brillante contra un fondo oscuro. Este microscopio lleva, una fuente de luz uv para iluminar la muestra y un condensador especial, de cuarzo, susceptible de ser atravesado por la luz uv.
La utilización de luz uv para iluminar la muestra hace que el límite de resolución de estos microscopios sea menor (y por tanto su poder de resolución, mayor) que el de los microscopios de campo claro.
Algunos microorganismos son fluorescentes por sí mismos, como algunas bacterias fotosintéticas y algas, pero la mayoría no lo son. Pueden observarse en este microscopio si se tiñen con sustancias fluorescentes como:
2. la naranja de acridina,
3. la auramina
4. la rodamina.
En la foto observamos Staphylococcus aureus teñido con Naranja de Acridina
La tinción de un microorganismo con anticuerpos específicos unidos a compuestos fluorescentes es de gran utilidad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y una de las aplicaciones más importantes de esta microscopía.
En la foto observamos Chlamydia teñida con Anticuerpos fluorescentes
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES En la microscopía de contraste de fases, el
aumento de contraste se consigue aprovechando las pequeñas diferencias en los índices de refracción entre los distintos componentes celulares y el fondo. Diferencias de espesor.
De esta forma se pueden observar células vivas, sin teñir, y por tanto estudiar el movimiento celular. El contraste conseguido permite también observar algunas estructuras celulares internas.
MICROSCOPIO DE NOMARSKY La microscopía de Nomarsky o de contraste de
interferencia diferencial (DIC), se basa en el mismo principio que la microscopía de contraste de fases, pero utiliza un dispositivo distinto a los anillos intercambiadores de fase para aumentar las diferencias de los índices de refracción de las partes del objeto. Este microscopio utiliza unos prismas en los sistemas de lentes condensador y objetivo que producen imágenes con mayor detalle que el microscopio de contraste de fases y con aspecto ligeramente tridimensional.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
El microscopio electrónico ha aumentado el poder de resolución hasta 1000 veces con respecto al microscopio óptico (m.e. alta resolución). Esto ha sido posible cambiando la fuente de iluminación a haces de electrones, en lugar de rayos de luz.
En las mejores condiciones el m.electrónico ha conseguido aumentar el poder de resolución del ojo humano 500.000 veces.
Microscopio electrónico de transmisión: un haz de electrones pasa a través de la muestra y deja su impresión en una pantalla fluorescente. Las áreas de la muestra que son más transparentes aparecen de color brillante, y las que son más opacas aparecen oscuras.
El tubo del microscopio debe estar sometido al vacío.
Muestras a observar deben ser extremadamente finas: < al µm, por lo que se cortan con ultramicrotomos.
No pueden utilizar lentes de vidrio (opacas a los electrones), que son sustituidas por electroimanes.
Los portaobjetos de vidrio son sustituidos por rejillas metálicas de unos 2mm.
Poder de resolución: 0,2nm. 1000 veces más que el m.óptico.
1.000.000x aumentos
Los electrones proceden de la superficie de la muestra. Un sonda la recorre y bombardea con un haz de electrones , y la propia superficie de la muestra que está recubierta por una fina capa de oro, emite unos electrones secundarios que son los que se detectan en la pantalla.
Las depresiones y agujeros en la muestra emiten pocos electrones secundarios, por lo que aparecen oscuros.
Las crestas y las puntas emiten gran número de electrones secundarios y aparecen brillantes.
La imagen que observamos es tridimensional. Poder de resolución: 10nm
Fotos con Microscopio Electronico de Transmisión (M.E.T.).
Espermatozoide de conejo con M.E.T.
Espermatozoides de conejo con M.E.B.
Grano de polen
MICROSCOPIOS CUÁNTICOS Permiten ver estructuras moleculares de la superficie de un objeto. Microscopio de efecto túnel (STM):
puede alcanzar aumentos de hasta 100 mil lones de veces.
Microscopio de fuerza atómica (AFM): puede alcanzar aumentos de hasta 1000 millones de veces.
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA
DOBLE HÉLICE DE ADN
