Angioarquitetura de Carcinoma de Células Escamosas
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5/26/2018 Angioarquitetura de Carcinoma de C lulas Escamosas
LAURA BEATRIZ OLIVEIRA DE OLIVEIRA
ANGIOARQUITETURA DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS,
QUIMICAMENTE INDUZIDO EM BOLSA JUGAL DE HAMSTER: ANLISE
EM MICROSCOPIA DE LUZ E MICROSCOPIA ELETRNICA DE
VARREDURA DE RPLICAS VASCULARES
Tese apresentada como requisito parcial
obteno do ttulo de Doutor emBiologia Celular e Molecular, daPontifcia Universidade Catlica do RioGrande do Sul.
Data de aprovao em 20 de janeiro de 2009
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr.Jos Antnio Poli de Figueiredo..................................................................
Prof. Dr. Leo Kraether Neto..............................................................................
Prof. Dr. Manoel SantAna Filho..............................................................................
Prof. Dr. Mnica Ryff M. Roca Vianna
..............................................................................
Porto Alegre2009
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5/26/2018 Angioarquitetura de Carcinoma de C lulas Escamosas
SUMRIO
CAPTULO 1 .......................................................................................................... 18
1 INTRODUO ................................................................................................... 19
1.1 VASCULOGNESE VERSUS ANGIOGNESE ............................................. 20
1.2 REGULAO DA ANGIOGNESE ................................................................ 21
1.3PROMOTORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE ..................................... 21
1.4 INIBIDORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE .......................................... 24
1.5 ANGIOGNESE NO TUMOR ......................................................................... 25
1.6 MODELO ANIMAL .......................................................................................... 27
1.7 AGENTES CARCINOGNICOS ................................................................................................ 29
1.7.1 DMBA, 9,10 dimetil benzatraceno (9, 10 dimethyl-1, 2-benzathracene) .......................... 29
1.7.2 Perxido de Carbamida ............................................................................. 30
1.8 TCNICA DE MODELO DE CORROSO VASCULAR .................................. 32
1.9 HIPTESE ...................................................................................................... 34
2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 34
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 34
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................... 34
CAPTULO 2 - HAMSTER SRIO DOURADO (MESOCRICETUS AURATUS) UM
MODELO PARA ESTUDO DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS ........ 35
1 INTRODUO ................................................................................................... 38
1.1 CNCER BUCAL ............................................................................................ 38
1.2 MODELO ANIMAL .......................................................................................... 38
2 OBJETIVO .................................................................................................................................... 43
3 MATERIAIS E MTODO .................................................................................... 43
3.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 43
3.2 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ................................................................... 44
3.3 PREPARO DOS AGENTES QUMICOS .......................................................... 44
3.4 APLICAO .................................................................................................... 45
3.5 EUTANSIA E ANLISE DOS ESPCIMES ................................................... 45
4 RESULTADOS ................................................................................................... 465 DISCUSSO ...................................................................................................... 47
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REFERNCIAS ...................................................................................................... 53
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CAPTULO 3 - BOLSA JUGAL DE HAMSTER SRIO DOURADO
(MESOCRICETUS AURATUS): ESTUDO COM MODELO DE CORROSO E
MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA ASSOCIADA MICROSCOPIA
DE LUZ .................................................................................................................. 58
1 INTRODUO ................................................................................................... 60
1.1 ANATOMIA E ARRANJO VASCULAR DA BOLSA JUGAL E DO MSCULO
RETRATOR ........................................................................................................... 61
2 OBJETIVOS DO TRABALHO ........................................................................... 65
3 MATERIAIS E MTODO .................................................................................... 65
3.1 PERFUSO COM RESINA ACRLICA ............................................................ 653.2 CORROSO VASCULAR ............................................................................... 66
3.3 ANLISE DAS RPLICAS MICROVASCULARES ......................................... 67
3.4 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................. 68
4 RESULTADOS ................................................................................................... 68
4.1 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................. 68
4.2 TNICA MUCOSA .......................................................................................... 69
4.3 TNICA MUSCULAR ...................................................................................... 704.4 TNICA ADVENTCIA ..................................................................................... 71
4.5 TECIDO CONJUNTIVO / VASOS SANGNEOS .......................................... 71
4.6 MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA .......................................... 72
4.6.1 Vasos arteriais ............................................................................................ 72
4.6.2 Vasos venosos ........................................................................................... 72
4.6.3 Capilares ..................................................................................................... 73
5 DISCUSSO ...................................................................................................... 75REFERNCIAS ...................................................................................................... 79
CAPTULO 4 - ARTIGO (submetido ao peridicoOral Oncology) ................... 83
REFERNCIAS ................................................................................................................................. 98
5 CONSIDERAES FINAIS ............................................................................... 101
5.1 HISTOLOGIA ................................................................................................... 101
5.2 INDUO QUMICA DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS MODELO
ANIMAL .................................................................................................................. 1035.3 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ................................................................... 103
5.4 CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS BEM DIFERENCIADO ................ 103
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5.5 TCNICA DE CORROSO VASCULAR ASSOCIADA MICROSCOPIA
ELETRNICA DE VARREDURA ........................................................................... 104
5.6 MICROSCOPIA DE LUZ E MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA
............................................................................................................................... 105
REFERNCIAS ..................................................................................................... 106
ANEXOS ............................................................................................................... 117
Anexo A - A oncologia de cabea e pescoo da Grcia Antiga ao Sculo XX quando
a avaliao histolgica de tumores se tornou um padro prtico ........................... 118
REFERNCIAS ...................................................................................................... 121Anexo B - O animal experimental - hamster srio dourado com bolsa jugal
evidenciada ............................................................................................................ 123Anexo C - 2ndInternational Workshop on advances in vascular casting ................ 127
Anexo D Ofcio 055/08-CEUA ............................................................................. 134
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RESUMO
O cncer da cavidade bucal e o cncer orofarngeo representam o 6 tipomais comum de cncer no mundo, sendo que 90% desses tumores bucais so dotipo carcinoma de clulas escamosas. Para que ocorra o estabelecimento, aexpanso e a metastatizao de neoplasias fundamental que tumores estimulem aproduo de sua prpria rede vascular, processo conhecido como angiognesetumoral. Assim, o resultado uma nova rede de vasos adequada ao crescimento e aviabilizao de metstases. Os vasos do tumor so considerados como imaturos ediferem dos vasos normais, apresentando formas tortuosas, irregulares, revestidospor clulas endoteliais amplamente fenestradas e muitas vezes com ausncia demembrana basal. Os objetivos deste trabalho foram: definir um protocolo paraestudo da angioarquitetura em rplicas vasculares de tumores quimicamenteinduzidos na bolsa jugal de hamster srio dourado Mesocricetus auratus, descrever ahistologia do rgo normal por microscopia de luz (ML) e a angioarquitetura por
microscopia eletrnica de varredura (MEV), analisar qualitativamente a rede vascularneoformada em bolsas jugais de hamster srios aps induo qumica de tumor emtrs tempos diferentes. 24 hamsters srios machos e com cinco semanas de vida,divididos em trs grupos de oito animais cada, tiveram suas bolsas jugais direitastratadas trs vezes por semana com dimetilbenzantraceno (DMBA) e duas vezes porsemana com perxido de carbamida por 55, 70 e 90 dias, respectivamente cadagrupo. A bolsa esquerda foi isenta de tratamento e considerada como controle.Posteriormente induo do tumor, cinco animais de cada grupo tiveram suas redesvasculares moldadas pela resina Mercoxe analisadas em microscopia eletrnicade varredura (MEV). Os trs animais restantes de cada grupo tiveram suas bolsaspreparadas para anlise em microscopia de luz (ML). Aps 55 dias de induo
tumoral, todos os espcimes analisados por ML j apresentavam carcinoma declulas escamosas na bolsa jugal tratada e este resultado se consolidou aos 70 e 90dias de tratamento. O menor tempo necessrio para a induo tumoral comparado aestudos anteriores e o sucesso na produo do tumor em todos os animaissubmetidos ao tratamento foi correlacionado a ao do perxido de carbamida e aoenriquecimento ambiental empregado durante o experimento. Foi possvel concluirque o protocolo desenvolvido pode ser til anlise da angioarquitetura dos tumoresem bolsas jugais de hamster srio. A tcnica de MEV possibilitou diferenciar vasosarteriais de venosos, como tambm replicar estruturas como esfncteres,bifurcaes, anastomoses e sugestionar a presena de sproutings. No estudo dabolsa jugal normal com ML foram evidenciadas trs tnicas: a tnica mucosa, atnica muscular e a tnica adventcia. Quando analisadas por MEV, as replicasvasculares das bolsas controle apresentavam sua rede vascular composta por vasosparalelos ao seu maior eixo, conforme a fisiologia do rgo. Nas bolsas submetidas induo tumoral observou-se a formao de uma nova rede vascular, com apresena de vasos tortuosos e paralelos. Durante a progresso do tumor houveperda do paralelismo vascular e um aumento do calibre dos vasos. Estururas deangiognese tambm foram observadas.
Palavras-chave:hamster srio, bolsa jugal, DMBA, perxido de carbamida,angioarquitetura, microscopia de luz, microscopia eletrnica de varredura, carcinoma
de clulas escamosas.
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1 INTRODUO
Todas as clulas dependem de oxignio e nutrientes para a sua
sobrevivncia. Essa necessidade implica em que as clulas se encontrem prximas
a capilares sangneos, a uma distncia que permita a difuso de oxignio (DANIEL;
ABRAHAMON, 2000).
A rede vascular basal insuficiente em situaes de aumento de
consumo de oxignio e nutrientes, como por exemplo, no crescimento e na
regenerao tecidual. Para ultrapassar o dficit nestas situaes, a vasodilatao,
muitas vezes, no suficiente, sendo necessria a formao de novos vasos
sangneos. O processo de formao de novos vasos a partir dos pr-existentes
denomina-se, genericamente, angiognese (BECK JR.; DAMORE, 1997; DANIEL;
ABRAHAMON, 2000).
Sob circunstncias fisiolgicas controladas, a angiognese um processo
normal e essencial. Entretanto, durante o processo de estabelecimento e
propagao do cncer, a angiognese permite que o tumor produza sua prpria
fonte de provimento sangneo para obter os nutrientes e o oxignio. Assim, o
resultado uma rede de vasos adequada ao crescimento e a viabilizao demetstases (FOLKMAN, 1998).
Fisiologicamente, este processo est presente no desenvolvimento
embrionrio e no crescimento ao longo dos primeiros anos. Na idade adulta,
observa-se no aparelho reprodutor feminino a cada ciclo menstrual, na gravidez, na
cicatrizao de feridas e na seqncia de processos inflamatrios (POLVERINI,
2002; JAFFE, 2000).
Clulas endoteliais, que normalmente permanecem quiescentes, comturnover entre os 1000 e 5000 dias, em determinadas circunstncias, emergem para
estados de rpida proliferao, viabilizando a formao de novos vasos (DANIEL;
ABRAHAMON, 2000; BECK JR.; DAMORE, 1997).
Portanto, nas situaes em que h aumento das necessidades de
oxignio e nutrientes, existe uma resposta fisiolgica do organismo que aumenta a
densidade da rede capilar. Essa resposta minuciosamente regulada e tem uma
durao limitada (POLVERINI, 2002; ZAKRZEWICZ; SECOMB; PRIES, 2002).H, porm, inmeras situaes patolgicas em que o processo persiste
descontroladamente durante meses ou anos. O exemplo mais conhecido o do
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tumor, em que a angiognese fundamental, para sustentar o crescimento tumoral e
assim permitir a metastatizao (POLVERINI, 2002).
Outros exemplos de desregulao da angiognese so citados, tais como
as doenas inflamatrias intestinais, as doenas de neovascularizao ocular, a
destruio de cartilagens na artrite reumatide, o desenvolvimento de placa
aterosclertica, os hemangiomas infantis, a endometriose, a obesidade, entre outras
(POLVERINI, 2002; GIBALDI, 1998; CARMELIET, 2005).
Ocorrem tambm mltiplas situaes de processos isqumicos, onde
til a formao de novos vasos que possam suprir o dficit de oxignio. Porm,
muitas vezes, a proliferao vascular no suficiente perante as necessidades,
como no caso da doena arterial perifrica, na coronariopatia, em patologiasneurodegenerativas e em fraturas sseas (POLVERINI, 2002; GIBALDI, 1998;
CARMELIET, 2003).
1.1 VASCULOGNESE VERSUS ANGIOGNESE
A vasculognese o processo iniciado precocemente na vida
embrionria, que origina os vasos de grande calibre, a partir de precursores
mesodrmicos, os angioblastos (RISAU; FLAMME, 1995). A vasculognese pode
desempenhar um papel fundamental na organognese (MATSUMOTO et al., 2001).
O termo angiognese muitas vezes empregado no seu sentido mais
lato, como o mecanismo de proliferao de clulas endoteliais e musculares lisas
para formar novos vasos sangneos. Em 1787, Hunter foi o pioneiro a usar o termo
angiognese (crescimento de novos vasos sangneos) para descrever o
crescimento de vasos sangneos semelhantes a galhos de rvore.Aps a formao dos grandes troncos vasculares, os vasos ramificam-se
e distribuem-se numa rede vascular complexa (CARMELIET, 2000). Os vasos
neoformados surgem a partir de vasos preexistentes e este processo mantm-se
durante toda a vida do indivduo, respondendo sempre que necessrio a alteraes
na demanda de oxigenao tecidual (SCOTT, 2000).
Podem ser descritos dois mecanismos distintos de angiognese: a
angiognsese por brotamento (RISAU, 1997) e a angiognse por intussuscepo(CADUFF et al., 1986).
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A angiognese por brotamento consiste na proliferao das clulas
endoteliais e o subseqente aumento do calibre do vaso, a que se segue a migrao
de clulas para o lmen, subdividindo-se o vaso inicial em vrios vasos de menor
calibre (RISAU, 1997).
Outro mecanismo de angiognese a intussuscepo, e refere-se ao
processo pelo qual um nico capilar se divide longitudinalmente em dois pela
formao de um septo. Neste caso, as clulas endoteliais de lados opostos do vaso
se estendem intraluminalmente at entrarem em contato formando um septo,
levando ao surgimento de dois vasos (CADUFF et al., 1986). Ela ocorre quando o
sistema capilar se expande dentro dele mesmo como, por exemplo, no crescimento
do tipo intersticial no tecido cartilaginoso (CADUFF et. al., 1986).
1.2 REGULAO DA ANGIOGNESE
To importante quanto a proliferao vascular quando h aumento das
necessidades de oxignio e nutrientes, a involuo deste processo, que ocorre
aps a resoluo dessa demanda adicional, com a regresso dos vasos
neoformados (SEMENZA, 2002). Desta forma, evitado que haja um aporte
excessivo de oxignio que, alm de desnecessrio, poderia conduzir a estresse
oxidativo e formao de radicais livres de oxignio, nefastos para os tecidos
(SEMENZA, 2002).
Nesse contexto inconstante, o mecanismo angiognico parece atuar como
uma balana, em que, de um lado esto os ativadores, e do outro, os inibidores.
do resultado deste balano que sobrevm um maior ou menor estmulo para a
proliferao vascular. Em muitas patologias h desregulao desse balano, o quejustifica a identificao de uma resposta em cascata visando ao restabelecimento da
homeostasia (BERGERS; BENJAMIN, 2003).
1.3 PROMOTORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE
Citam-se como promotores endgenos da angiognese o fator de
crescimento fibroblstico (Fibroblastic growth factors -FGF); o fator de crescimento
vascular endotelial (Vascular endothelial growth factors -VEGF); o fator de
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crescimento da clula endotelial derivado de plaqueta (Platelet-derived endothelial
cell growth factor- PD-ECGF), os fatores de crescimento derivados de plaquetas,
como as prostraglandinas, angiotensina e a heparina, e o fator de necrose tumoral
alfa (Tumor necrosis factor - TNF ) (BRAT; VAN MEIR, 2001).
Devido ao harmoniosa, complementar e coordenada destas
molculas que se formam vasos funcionais (DANIEL; ABRAHAMON, 2000).
Dentre as inmeras molculas indutoras da angiognese, se destaca o
VEGF (CARMELIET, 2003). Embora tendo ao predominante na estimulao da
angiognese, o VEGF forma apenas vasos imaturos, no funcionais e instveis
(McMAHON, 2000).
O VEGF foi primeiramente descrito como fator de permeabilidade vasculare se constitui em uma famlia de molculas mitognicas endoteliais, indutoras da
angiognese in vivo (FRELIN et.al., 2000).
O VEGF tem participao central na regulao da proliferao vascular,
podendo ter sua expresso induzida ou reprimida conforme a oxigenao tecidual.
Por exemplo, caso exista uma leso na pele, o organismo promove uma resposta
imunitria local e inicia o processo de cicatrizao. Esses fenmenos aumentam as
necessidades de oxignio e induzem a sntese do fator indutor de hipxia (HypoxiaInducible Factor) em resposta hipxia, que aumenta a expresso do VEGF e
estabiliza o seu RNA mensageiro (RNAm). Quando a ferida cicatrizada e existe um
excesso de aporte de oxignio, estimula a sntese do fator indutor de hiperxia
(Hyperoxia Inducible Factor), que inibe a expresso do VEGF e instabiliza seu
respectivo RNAm (SEMENZA, 2002).
Existem quatro isoformas principais do VEGF (VEGF-A), cada uma
codificada por uma poro diferente do gene VEGF. So estas suas isoformas:VEGF121, VEGF165, VEGF189, e VEGF206. Embora estas isoformas se
comportem identicamente em soluo, elas diferem na sua capacidade de ligao
heparina e matriz extracelular (RINI; SMALL, 2005).
As Angiopoietinas (Ang) so uma famlia de duas molculas (Ang1, Ang2)
que se ligam ao mesmo receptor, o TK. A Ang1 induz as clulas endoteliais a
liberarem fatores de crescimento que promovem a associao aos pericitos e s
clulas musculares lisas, incorporando-se aos vasos (JONES et al., 2001).
A Ang2, ao ligar-se ao TK, inibe a ao da Ang1, resultando uma
instabilizao vascular que leva ao afastamento dos pericitos e clulas musculares
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lisas. Por ao da Ang2, obtido um tubo endotelial (estrutura tubular revestida por
clulas endoteliais que ainda no formam um vaso maduro) que, na presena de
VEGF, aumenta a angiognese e, na sua ausncia, conduz apoptose das clulas
endoteliais e regresso vascular (JONES et al., 2001).
A Efirina-B2 e a Ang1 so essenciais na maturao vascular, sabendo-se
hoje que a Efirina- B2 particularmente importante na diferenciao arterial ou
venosa dos vasos imaturos (YANCOPOULOS; KLAGSBRUN; FOLKMAN, 1998). A
Ang1 essencial para a estabilidade vascular. A interrupo desse sinal
estabilizador coincide com o reincio da angiognese, mediada por um antagonista
da Ang1, a Ang2, que uma secreo autcrina do endotlio. Esse processo ocorre
primariamente no desenvolvimento estrutural, sendo reativado na angiognese doadulto (aparelho reprodutor feminino, na cicatrizao de feridas, em tumores, entre
outros) (ELLIS et.al., 2002).
J os fatores de crescimento fibroblstico (Fibroblast Growth Factors- aFGF e
bFGF), potentes moduladores da proliferao celular, motilidade e diferenciao
no so especficos quanto a sua atuao sobre as clulas endoteliais pois atuam
tambm em fibroblastos, clulas musculares lisas e neurnios (GERWINS;
SKOLDENBERG; CLAESSON-WELSH, 2000). Desempenham um papel central nainiciao do processo angiognico (CHEN, J.; FOROUGH, R., 2006).
Os fatores aFGF1 e bFGF2, devido sua potente ao mitognica e atividade
pr-migratria, tm a capacidade de induzir alteraes metablicas e fenotpicas na
clula endotelial que so necessrias para estimular a angiognese (CHEN, J.;
FOROUGH, R., 2006).
So fatores que merecem destaque, j que so protenas angiognicas
mais potentes in vivo. Em conjunto com a Ang2, tornam-se mais especficos: a Ang2,
ao repelir as clulas musculares, potencializa a sua ao nas clulas endoteliais.
Estes fatores tem duas origens principais: a matriz extracelular, onde est
armazenado, sendo mobilizado por proteinases e heparinases e os macrfagos
ativados (GERWINS; SKOLDENBERG; CLAESSON-WELSH, 2000).
Existem nveis anormalmente elevados de bFGF no soro e urina de
indivduos com diversos tipos de tumor, e no lquido cfalo-raquidiano de doentes
com vrios tipos de tumores cerebrais (REYNOLDS; REDMER, 1998).
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H ainda um fator que pela sua sntese muito especfica por parte da
placenta ao longo da gravidez, adquiriu o nome de fator de crescimento da placenta
(placental inducible growth factor- PIGF). Suas aes so semelhantes s do VEGF,
porm mais potentes, sendo importante na gravidez (SMITH et al., 2000).
Os principais receptores que parecem envolvidos nas cascatas de
transduo de sinal em resposta ao VEGF so uma famlia de receptores tirosina-
quinase com trs membros: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Paralelamente, esto
identificados alguns receptores acessrios, as neurofilinas, que modulam a ligao
aos receptores principais. O VEGFR-2 o principal mediador nos efeitos do VEGF
no crescimento e permeabilidade dos vasos. J o VEGFR-1 pode ter um papel
negativo, suprimindo a sinalizao pelo VEGFR-2 (BERNATCHEZ et al, 1999).O VEGFR-3, que est presente essencialmente nos vasos linfticos e
parece levar proliferao destes, tem grande afinidade pelo VEGF-C (SHIBUYA et.
al., 2001).
Receptores Funo
VEGF (VEGF-A) VEGFR-1, VEGFR-2,
neuropilina-1.
Angiognese,
manuteno vascular
VEGFR-1 A estabelecer
VEGF-C VEGFR-2, VEGFR-3 LinfangiognseVEGF-D VEGFR-2, VEGFR-3 LinfangiognseVEGF-E (fator viral) VEGFR-2 Angiognese*PIGF VEGFR-1, neuropilina-1 Angiognese e
inflamaoQuadro 1 - Promotores angiognicos VEGF e seus receptores
*PIGF: fator de crescimento da placentaFonte: GENENTECH, BIONCOLOGY Disponvel em:
1.4 INIBIDORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE
Inibidores endgenos da angiognese so molculas cuja sntese
laboratorial est em franca expanso, estando identificadas inmeras aplicaes
teraputicas (FERRARA; KERBEL, 2005).
A angiostatina, endostatina, fator plaquetrio 4, prolactina,trombospondina, os inibidores teciduais de metaloproteinase 1, 2, 3 (tissue inhibitor
of metalloprotenase 1-TIMP-1, tissue inhibitor of metalloprotenase 2-TIMP-2, tissue
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inhibitor of metalloprotenase 3-TIMP-3) so protenas inibidoras da angiognese
(BRAT; VAN MEIR, 2001).
Entre as molculas mais importantes salientam-se a angiostatina, a
endostatina e a antitrombina III (REYNOLDS; REDMER, 1998).
Vrios ensaios clnicos demonstraram que certos tumores poderiam
produzir inibidores angiognicos (CARMELIET, 2003). Esse fenmeno explicaria
porque, em certas cirurgias, aps a remoo do tumor principal (carcinomas do
clon e da mama e sarcomas osteognicos), havia rpido desenvolvimento de
metstases distncia (FOLKMAN, 2006).
Soff (2000) relatou que os fatores inibidores provinham da ao
enzimtica de metaloproteinases em protenas comuns. Assim, a angiostatinaresulta da degradao do plasminognio e a endostatina, do colgeno XVIII. De
acordo com o autor, ambas as molculas, reconhecidamente importantes na inibio
do processo angiognico, esto sendo usadas em mltiplos ensaios clnicos na rea
da oncologia.
1.5 ANGIOGNESE NO TUMOR
Para se analisar o crescimento tumoral deve-se supor que no tumor
coexistam dois compartimentos celulares que se estimulam mutuamente: o
compartimento das clulas endoteliais e o compartimento das clulas tumorais
(BERGERS; BENJAMIN, 2003).
A existncia de hiperemia tumoral tornou-se conhecida h cerca de dois
sculos, durante as intervenes cirrgicas (FOLKMAN, 2006). Contudo, at 1970 o
fato era explicado pela dilatao dos vasos sanguneos preexistentes, comoresultado do processo inflamatrio que acompanhava o tumor. No incio da dcada
de 70, surgiu a hiptese de que os tumores poderiam recrutar o seu prprio aporte
sanguneo atravs da produo e liberao de molculas estimuladoras da formao
de novos vasos sanguneos. Essa hiptese foi aceita com ressalvas. Somente aps
a introduo da cultura de clulas endoteliais, da purificao de protenas
angiognicas, e do advento da biologia molecular, foi possvel a sua confirmao
(McDONNELL et al., 2000).
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Sabe-se atualmente que a maioria dos tumores humanos surge sem
atividade angiognica, mantendo-se, microscopicamente, como neoplasias in situ
durante meses e anos (CARMELIET, 2005). Ao longo deste tempo, somente uma
pequena porcentagem adquire fentipo angiognico, que lhe permite crescimento e
metastizao (McDONNELL et al., 2000; KIRSCH et al, 2000).
Na maioria dos tumores humanos, o fentipo maligno histologicamente
reconhecvel precede o fentipo angiognico (BERTRAM, 2001). Clinicamente, a
migrao para a condio angiognica reconhecida pela rpida expanso da
massa tumoral para dimenses detectveis, hemorragias locais e metastizao. No
caso da metastizao, a angiognese necessria no incio e ao final (KIRSCH et
al., 2000; ZETTER, 1998).Em animais experimentais, foi observado que antes da neovascularizao
raramente eram encontradas clulas tumorais em circulao, sendo as metstases
virtualmente inexistentes (ZETTER, 1998). Quando ocorre a neovascularizao, a
metastizao surge de imediato e de maneira proporcional vascularizao
(KIRSCH et al., 2000; ZETTER, 1998). Por outro lado, as metstases que subsistem
distncia, tornam-se detectveis aps desenvolverem vascularizao prpria, pois
de outra forma, mantm-se indefinidamente quiescentes (KIRSCH et al., 2000;ZETTER, 1998).
Comprovada a importncia da angiognese no desenvolvimento tumoral,
particularmente no processo de metastizao, os frmacos inibidores da
angiognese apresentam-se como uma arma teraputica no tratamento de vrias
neoplasias, quando combinados com a quimioterapia, resultando em um aumento de
sobrevida nos pacientes com tumores malignos avanados (CARMELIET, 2003)
Mesmo que no seja obtida a cura, estes frmacos podem viabilizar o controle dadoena (ZETTER, 1998; FERRARA; KERBEL, 2005; BALUK et al., 2005).
O uso de frmacos inibidores da angiognese tem inmeras vantagens
em comparao quimioterapia convencional. Os agentes citostticos, sustncias
citotxicas utilizadas especificamente para causar um dano celular, no so
seletivos para as clulas tumorais, sendo inespecficos, acabam por destruir tambm
clulas no neoplsicas, constituindo um entrave ao aumento das doses e so
responsveis pelos seus inmeros efeitos adversos (GOODMAN; GILMAN, 2006).
Acrescenta-se ainda, que as clulas tumorais so geneticamente instveis, com
elevado ndice de mutaes, o que conduz muitas vezes resistncia a drogas
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inicialmente eficazes (CARMELIET, 2005). provvel que mantenham sensibilidade
terapia antiangiognica, sendo as clulas endoteliais geneticamente estveis e
com baixo ndice de mutao, comparadas s clulas tumorais e outras clulas
somticas (FERRARA; KERBEL, 2005).
Os citostticos clssicos podem comear a ser usados de maneira
diferente como na aplicao de doses menores, ao longo de um tempo maior,
embora exera menos efeito no tecido tumoral, consegue inibir a diviso das clulas
endoteliais, reprimindo a angiognese (KERBEL; KAMEN, 2004). Dessa forma,
evita-se o crescimento e a metastizao do tumor. Esse tambm o princpio da
radioterapia fracionada, que utiliza o aumento da freqncia das exposies com
doses menores (PUDUVALLI; SAWAYA, 2000). Tem-se estudado esquemascombinados dos vrios frmacos disponveis, com o objetivo de inibir as vrias
etapas do desenvolvimento tumoral e aproveitar o efeito sinrgico das drogas
(PUDUVALLI; SAWAYA, 2000).
A utilizao da densidade microvascular como indicador prognstico tem
sido alvo de inmeros estudos (BERGERS; BENJAMIN, 2003). Porm, h ainda
relativo desconhecimento quanto integrao das mltiplas cascatas angiognicas
e anti-angiognicas, sendo difcil especular sobre o prognstico da evoluotumoral em funo da maior ou menor vascularizao (MAcDONALD et al., 2002).
1.6 MODELO ANIMAL
O hamster dourado ou srio Mesocricetus arautus, um roedor da famlia
Cricetidae. Os hamsters dourados silvestres ocorrem em uma faixa de rea limitada
do Oriente Mdio, na Sria, onde so chamados pelo equivalente arbico depossuidores de bolsas para carregar, em virtude de suas bolsas faciais
(HARKNESS; WAGNER, 1993).
Estes animais vivem em profundas galerias, onde estocam grandes
quantidades de gros, apresentam cauda curta quando comparada com a de ratos
Wistar e so pequenos (cerca de 100g de peso). So conhecidos pelo curto perodo
de gestao, fcil domesticao, presena de bolsas faciais, tolerncia imunolgica
e pela grande habilidade em escapar do confinamento (HARKNESS; WAGNER,1993). Em laboratrio alimentam-se com rao peletilizada ou dieta para roedores
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com alto teor de protenas e geralmente permanecem saudveis e ativos durante
sua vida. Os hamsters possuem tempo de vida que varia entre 18 e 24 meses,
entretanto, animais mais idosos tambm podem ser observados (HARKNESS;
WAGNER, 1993).
Os hamsters apresentam alto grau de tolerncia imunolgica a
transplantes homlogos e heterlogos de tecidos normais ou neoplsicos
(BILLINGHAM, et al., 1960). So animais com sistema imune ntegro, possuindo um
local de privilgio imunolgico natural nas suas bolsas jugais (LEMON et.al., 1952).
As bolsas servem ao hamster como meio de estocagem de alimentos e ao homem
como um stio de privilgio imunolgico para uso em pesquisa, j que so facilmente
acessveis para induo de tumor.As bolsas jugais ou faciais so divertculos bilaterais das mucosas jugais,
altamente distensveis que se estendem, sob a pele, da extremidade posterior da
comissura labial at aproximadamente ao nvel das escpulas do animal. O epitlio
da parede da bolsa similar pele humana, sendo denominado pele sem folculos
e glndulas (DULING, 1973). A bolsa, ao ser evertida, assume um aspecto sacular.
Apresenta camadas basal, espinhosa, granular e crnea com queratincitos, similar
epiderme e epitlio da gengiva ou palato duro humano (WHITE et. al., 1982).As camadas de clulas epiteliais apiam-se em tecido conjuntivo frouxo,
naturalmente imunodeficiente e aparentemente com ausncia de vasos linfticos,
exceto na regio proximal, onde se inserem as fibras do msculo retrator da bolsa
(GOLDENBERG; STEINBORN, 1970).
A bolsa jugal do hamster um excelente stio para o estudo de carcinoma
da mucosa oral porque susceptvel a modificaes por uma variedade de
influncias locais e sistmicas (GIJARE et al., 1990), sendo um dos modelosusados nas pesquisas de cncer oral (SALLEY, 1954; EVESON, 1980; MOGNETTI
et al., 2005).
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1.7 AGENTES CARCINOGNICOS
1.7.1 9,10 dimetil benzatraceno (DMBA)O composto 9,10 dimetil benzatraceno (DMBA), agente
carcinognico iniciador, induz uma transverso no par de bases adenina-timina
(A-T) na segunda posio do cdon 61 do gen ras, sendo esta mutao
freqentemente identificada em carcinomas de clulas escamosas (SAM;
WATT, 2006).
Em 1954, Salley relatou que aplicaes de um ou vrios
hidrocarbonetos policclicos podem induzir a carcinoma de clulas escamosas
na mucosa de hamster. O autor aplicou DMBA dissolvido em ter e este se
apresentou como um carcinognico efetivo na induo de tumores aps 16
semanas. O autor descreveu 4 estgios histologicamente reconhecveis na
mucosa, que vo desde hiperplasia, papiloma, carcinoma in situ, at carcinoma
de clulas escamosas.
Morris (1961) relatou que o epitlio da bolsa jugal de hamsters
idosos apresentaram maior resistncia ao do DMBA do que animais
jovens. O autor relatou que: cinco semanas, o tempo necessrio para iniciar
as anlises de carcinogsese experimental. A carcinognese na bolsa jugal dehamster provavelmente o sistema animal mais comparvel com o
desenvolvimento de pr-malignidade e malignidade do cncer bucal humano.
Alm disso, o autor definiu que 0,5% de DMBA em soluo de acetona, produz
o efeito mximo de neoplasia, com o mnimo de perodo de latncia e sem
morbidade. Morris (1961) padronizou o procedimento, de tal modo que a leso
experimental pde ser reproduzida posteriormente.
O DMBA 0,5% induz uma resposta hiperplsica no epitlio da bolsaaps poucas aplicaes, constatando-se pela aparncia de variedades de
leses displsicas parecidas com leses pr-malignas humanas, aps seis a
oito semanas de tratamento (SANTIS et al., 1964). Tumores benignos e
malignos, leses papilomatosas e carcinomas, especificamente de clulas
escamosas comeam a ser evidenciados aps algumas semanas de
tratamento (SANTIS et al., 1964). Contudo, estgios de carcinognese
(iniciao, promoo, progresso) no tm sido bem definidos (GIMENEZ-CONTI; SLAGA, 1993).
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Lin et al. (1996) obtiveram 100% de incidncia de tumor na bolsa
jugal de hamster aps aplicao de DMBA trs vezes por semana por oito
semanas consecutivas.
A maior vantagem da aplicao do DMBA neste modelo animal a
similaridade entre a mucosa da bolsa jugal do hamster e a mucosa oral
mastigatria humana. Alm disso a ausncia de induo de carcinomas
espontneos, desenvolvimento de leso displsica comparvel com a
leucoplasia humana oral e a suceptibilidade do sistema de tumor a influncias
sistmicas como vitaminas, hormnios e vrias drogas (SHKLAR et al., 1979).
Outra caracterstica desse modelo est na possibilidade de
acompanhamento macroscpico da evoluo do tumor, em tempos diferentes
aps o tratamento, pela simples everso da bolsa, e o mesmo tambm permite
delimitao dos stios onde est sendo induzida a leso (KREIMANN et al.,
2001).
A maior desvantagem do modelo experimental em bolsa jugal de
hamster o procedimento intensivo laboratorial, em adio ao extensivo
manuseio do animal com o carcingeno. No modelo clssico de Salley (1954) e
no modelo modificado de Lin et al. (1996), o animal manuseado, no mnimo,
48 vezes durante a induo do tumor.
1.7.2 Perxido de CarbamidaO perxido de carbamida, um agente promotor da carcinognese,
pode ser encontrado comercialmente nas concentraes de 10%, 11%, 15%,
16% e 35% em anidro glicerol ou glicerina (CH4N2O-H2O2) (DISHMAN;
BAUGHAN, 1992; FASANARO, 1992; KWONG et al., 1993; McGUCKIN;
MEYER, 1992). tambm conhecido como perxido de uria, perxido dehidrognio-uria, perxido de hidrognio-carbamida ou peridrol-uria; sendo
muito utilizado na tcnica caseira de clareamento de dentes vitais (DARNELLA;
MOORE, 1990; FASANARO, 1992; HAYWOOD; HEYMANN, 1989). O perxido
de carbamida nas concentraes mais usadas uma substncia instvel e
quando em contato com a saliva se dissocia em 3,6% a 5% de perxido de
hidrognio e 6,4% a 7% de uria (FASANARO, 1992; HAYWOOD, 1992;
HUMMERT et al., 1993). O perxido de hidrognio presente no perxido decarbamida, por sua vez, se dissocia em oxignio e gua, quebrando-se
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posteriormente e liberando radicais livres; a uria dissocia-se em amnia e
dixido de carbono (HAYWOOD; HEYMANN, 1989; HAYWOOD et al., 1990;
FASANARO, 1992; HAYS et al., 1995).
O perxido de hidrognio o princpio ativo do perxido de
carbamida (NAIK, et al., 2006). A presena de radicais livres originrios da
quebra do perxido de hidrognio pode ser nociva pelo fato de que, os nions
superxidos e os ons hidroxila liberados so radicais oxidantes altamente
reativos e txicos, um vez que agem diretamente nos componentes vitais das
clulas, onde podem danificar membranas celulares, alterar o DNA e as
protenas, podendo causar mutaes (CHERRY et al., 1993; IMLAY; LINN,
1988; POWELL; BALES, 1991). Sabe-se, porm, que o organismo possui
mecanismos de defesa bioqumicos e mecanismos de reparo intracelulares que
reagem com os radicais livres inativando-os, como o caso de sistemas
enzimticos que controlam o ciclo celular (FRIDOVICH, 1978).
Ito et al. (1981) avaliaram a induo de tumores duodenais em ratos
pela administrao de perxido de hidrognio. A soluo de perxido de
hidrognio foi adicionada na gua destilada para beber, nas concentraes de
0,1% e 0,4%. Os autores verificaram que os grupos de 0,1% e 0,4% de diluio
apresentaram alta incidncia de hiperplasia duodenal com ndices de 40% e
62% respectivamente. Adenoma duodenal foi encontrado em 5% dos ratos, no
grupo em que foi administrada a concentrao de 0,4%, e em 1% dos animais,
no grupo em que foi administrada a concentrao de 0,1%. Eroses gstricas
surgiram aps 40 semanas; hiperplasia duodenal, aps 10 semanas e
carcinomas duodenais em 65 semanas. Os autores concluram que o perxido
de hidrognio pode ter dupla funo na formao de ndulos duodenais,
ampliando a ocorrncia espontnea de hiperplasia duodenal e transformando
ndulos hiperplsicos em neoplsicos.
Weitzman et al. (1984), discutiram a possibilidade dos metablitos
do perxido de hidrognio danificarem o DNA das clulas e causarem
mutaes. Os autores alertaram para os perigos da administrao crnica do
perxido de hidrognio no tratamento de doenas gengivais, pois a exposio
constante pode levar a alteraes indesejveis nos tecidos. As clulas so
danificadas quando expostas a altas concentraes de oxidantes. A
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preocupao que os perxidos possam aumentar a expresso de tumores
por outros carcingenos do meio ambiente (WEITZMAN et al.,1984). O tumor,
para se manifestar, pode demorar anos ou dcadas em humanos (WEITZMAN
et al.,1984).
Weitzman et al. (1986), avaliaram o efeito carcinognico do perxido
de hidrognio no modelo de carcinognese qumica bucal induzida em
hamster. Os animais foram divididos em 4 grupos, sendo que o grupo I recebeu
DMBA; o grupo II recebeu DMBA e perxido de hidrognio 3%; o grupo III
recebeu DMBA e perxido de hidrognio 30%; e o grupo IV recebeu perxido
de hidrognio 30%. A concentrao de DMBA foi de 0,25% em leo mineral. As
bolsas jugais do hamster foram pinceladas duas vezes por semana com os
carcingenos, e o sacrifcio foi realizado aps 19 e aps 22 semanas. Foi
observada a presena de queratose e hiperplasia em mais de 85% dos animais
em todos os grupos aps 19 semanas. Aps 22 semanas, os animais do grupo
I apresentaram carcinomas epidermides em trs de sete animais; no grupo II,
seis de 11 animais desenvolveram carcinomas em 22 semanas e todos os
animais do grupo III desenvolveram carcinomas invasivos. No grupo IV, os
animais no desenvolveram carcinomas, porm, apresentaram mudanas
associadas a leses pr-neoplsicas, incluindo hipercromatismo de clulas e
displasia mdia. Os resultados sugeriram uma ao co-carcinognica do
perxido de hidrognio no modelo analisado e este, isolado ou associado,
provocou mudanas pr-neoplsicas e aumentou a atividade mittica e
hiperplsica.
1.8 TCNICA DE MODELO DE CORROSO VASCULAR
A tcnica de modelo de corroso vascular associada MEV tem
sido aplicada no estudo do padro vascular de rgos e tecidos normais, de
processos patolgicos e de estruturas em desenvolvimento
(LAMETSCHWANDTNER; LAMETSCHWANDTNER; WEIGER, 1990;
DERUITER et al., 1991). Os modelos vasculares desses rgos e tecidos so
obtidos pela modelagem do lmen dos vasos com resina de baixa viscosidade,
seguida pela corroso com soluo alcalina, do tecido circunjacente resina
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polimerizada (WEEKES; SIMS, 1986; HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990;
OHTA et al., 1992; SUGIOKA; IKE, 1993; PIETTE; LAMETSCHWANDTNER,
1994; SELLISETH; SELVIG, 1995b; KRONKA; WATANABE; SILVA, 2001;
VERLI, F.D. et al, 2007).
O modelo de corroso vascular fornece a angioarquitetura da
estrutura anatmica (AHARINEJAD; BCK, 1994), sendo que alguns dos
aspectos morfolgicos observados so: o arranjo tridimensional da
vascularizao, o dimetro vascular, a impresso dos ncleos das clulas
endoteliais na superfcie do modelo vascular, bem como o trajeto das arterolas
e vnulas que compem a estrutura avaliada (HOSSLER; DOUGLAS, 2001).
A moldagem realizada com resina Mercox (MercoxCL 2RB,
Ladd Research Industries, Burlington, VT), material de moldagem vascular
base de metilmetacrilato, bastante utilizado nas pesquisas de modelo de
corroso vascular (KOGUSHI et al., 1988; OHSHIMA; YOSHIMA; KOBAYASHI,
1990; AHARINEJAD; BCK, 1994; NINOMIYA, 2000; VERLI, F.D. et al, 2007) .
Aps a moldagem, realizada a corroso, que a dissoluo dos
tecidos circunjacentes moldagem, utilizando solues de hidrxido de sdio
(NaOH) e hidrxido de potssio (KOH), associadas ou no a detergentes em
diferentes concentraes (HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990;
LAMETSCHWANDTNER; LAMETSCHWANDTNER ; WEIGER, 1990).
Aps corroso dos espcimes, estes sofrem tratamento condutivo,
que consiste no revestimento dos espcimes com uma camada metlica
(metalizao). Com a adio desta camada, h conduo de eltrons sobre as
superfcies dos espcimes e a produo de eltrons capazes de gerar sinal
suficiente para a formao da imagem em MEV (LAMETSCHWANDTNER;
LAMETSCHWANDTNER; WEIGER, 1990; BELZ; AUCHTERLONIE, 1995).
As eletromicrografias de varredura de arterolas, vnulas, artrias,
veias e alas capilares obtidas pela tcnica de corroso vascular fornecem
imagens tridimensionais individualizadas dessas estruturas. Essas imagens
proporcionam informaes especficas dos modelos vasculares como dimetro
vascular e a impresso das clulas na superfcie dos modelos (HODDE;
STEEBER; ALBRECHT, 1990; KONERDING, 1991). A anlise dos modelos de
corroso vascular principalmente descritiva (KONERDING, 1991).
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5.6 CONCLUSO
O entendimento da morfologia da microcirculao tem um papel
importante na compreenso dos fenmenos fisiolgicos e fisiopatolgicos de
todos os sistemas orgnicos.
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