Análisis Leche Chocolatada

ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA

DEL LITORAL

Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la ProducciónCarrera de Ingeniería en Alimentos

Leche pasteurizada chocolatadaIntegrantes:

Materia: Análisis de AlimentosFecha: 19/Noviembre/2009

LECHE PASTEURIZADA CON SABOR A CHOCOLATE.

Anita ChangGabriela Guevara

Viviana LargoKarla Morejón

Mariela MuentesNazre Murgueitio

Andrea Pérez

OBJETIVO

Establecer las especificaciones fisicoquímicas, microbiológicas y organolépticas que debe reunir la leche pasteurizada con sabor a chocolate para demostrar su cumplimiento, mediante métodos analíticos y el material adecuado que asegure la protección del producto.

Determinar los requisitos que deben cumplir los ingredientes y aditivos empleados en la fabricación de nuestro producto.

DENOMINACIÓN

La leche saborizada de acuerdo a su composición, proceso e ingredientes, de los cuales haremos uso se podrá denominar:

“Leche entera, semidescremada, descremada con sabor a chocolate”.

FUNCIÓN DE LAS ESPECIFICACIONES DE CALIDAD

En la elaboración de la leche saborizada pueden emplearse los siguientes ingredientes:

a. Lecheb. Derivados del cacao

c. Azúcares

En el caso de la leche chocolatada los espesantes y/o estabilizantes autorizados, deberán estar en cantidad no mayor a 5.0 g/kg; además deberá representar un contenido de grasa de leche acorde con el tipo de leche empleado y responder a las exigencias microbiológicas de envasado y de conservación.

No obstante, la leche saborizada debe estar exenta de sustancias tales como grasa de origen vegetal o animal, diferentes a la láctea excepto las que provocan los ingredientes naturales y estar exenta de sustancias tóxicas y residuos de drogas o medicamentos.

- Leche

Para efectos de las clases de leche saborizada se consideran las siguientes:a. Leche Enterab. Leche Semidescremadac. Leche Descremada

Y deben presentar las siguientes características:

a. Fisicoquímicas Características Leche

EstandarizadaLeche

SemidescremadaLeche Descremada

Materia Grasa (%) 3 >0.5 y ≤ 3 ≤ 0.5Sólidos totales

mínimos %11.0 10.0 8.0

Sólidos no grasos mínimos (%)

8.35 8.0 8.0

Acidez como ácido láctico

0.13 – 0.17 0.13 – 0.17 0.13 – 0.17

Máximo (%) 0.17 0.17 0.17Mínimo (%) 0.13 0.13 0.13

Cenizas máximo (%)

0.8 0.8 0.8

Proteínas (N * 6,38) mínimo (%)

3.0 3.0 3.0

Densidad 15 0C 1.032 1.032 1.032Índice Crioscópico

Máximo -0.530 0C (-0.550 0H)

-0.512 0C (-0.531 0H)

-0.512 0C (-0.531 0H)

Mínimo -0.510 0C (-0.530 0H)

-0.539 0C (-0.560 0H)

-0.539 0C (-0.560 0H)

Ensayo de fosfatasa

NEGATIVO

Presencia de conservantesPresencia de adulterantesPresencia de

neutralizantesEnsayo de peroxidasa

Sedimento mg/kg NegativoPrueba de alcohol No se coagulará por la adición de un volumen igual de alcohol

de 68 % en peso o 75 % en volumen

b. Microbiológicas

c. Sensoriales

Olor: Característico, no debe presentar olor a hervido, envejecido u otros olor extrañosColor: Blanco opaco amarillento o marfil.Sabor: Característico, no debe presentar sabor a hervido, rancio u otros sabores extraños.Aspecto: Puede presentar una línea perfectamente definida de crema en la parte superior del envase cuando no sea leche homogeneizada sin sedimento.

- Derivados del Cacao (Cocoa)

El cacao parcialmente desgrasado en polvo (cocoa) en sus dos tipos y contenido de grasa, debe cumplir con las especificaciones que se indican a continuación:

a. Química

El producto objeto de esta Norma debe cumplir las especificaciones de la siguiente tabla:

b. Microbiológica

El cacao parcialmente desgrasado en polvo (cocoa) no debe contener microorganismos patógenos, toxinas microbianas e inhibidores microbianos.

c. Sensorial Aspecto: Polvo finoColor: Propio característico del castaño claro al más oscuro.Olor: Propio característico.Sabor: Propio característico.

- Aditivos

Se permite el empleo de los siguientes aditivos, previa autorización de la Secretaría deSalubridad y Asistencia.

Carbonato ácido de sodio, potasio o amonio. Carbonato de sodio, potasio o amonio. Hidróxido de sodio, potasio o amonio. Carbonato u óxido de magnesio

- Leche pasteurizada con sabor a chocolate

a. Fisicoquímicas

Estabilidad: OH 68% NegativaAcidez: ( expresado como ácido láctico)g/L

1,3 min. y 1,7 máx.

Densidad a 15° (g/mL) 1,029 min.pH 6.5-6.8Sólidos no grasos % 83 min.Lípidos (grasa butírica) g/L 16 0.5 g/LProteínas propias de la leche g/L 29-30 g/LLactosa g/L 43 min. y 50 máx.Caseína g/L 21 minVitamina A 1200 µg ER/LVitamina D 7.5 µg/L

b. Microbiológicas

Mesófilicos aerobios NegativoMesófilicos anaerobios NegativoTermófilicos aerobios NegativoTermófilicos anaerobios NegativoColiformes totales <10Salmonella ssp Ausente en 25 mLStaphylococcus aureus <10 en siembra directaListeria monocytogenes Ausente en 25 mLE. coli NegativoEsporulados Negativo

c. Sensoriales

Apariencia:

Líquido color café claro, no debe presentar separación de grasa ni sedimento.

Color: Característico del producto, café claro.Olor: Característico a chocolate, no rancio, no ácido.Sabor: Dulce característico a chocolate, no rancio, no ácido.Después de su fabricación y para efectos de sus análisis deberá someterse una muestra representativa de cada lote por siete días de incubación a 37°C para la determinación de mesofílicos y 5 días a 55°C para los termofílicos.

Para la determinación microbiológica se tomara como mínimo la Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995. Bienes y Servicios. Alimentos Envasados en Alimentos de cierre hermético y sometido a tratamientos térmicos. Disposiciones sanitarias y en las referidas en el inciso de estas especificaciones.

CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DEL EMPAQUE Y EMBALAJE

Las leches saborizadas se deben envasar en recipientes de tipo sanitario elaborados con material inocuo y resistente a distintas etapas del proceso, de tal manera que no reaccionen con el producto o alteren las características físicas, químicas y sensoriales.

a. Tipo de Envase

Laminación de polietileno de baja densidad, papel, aluminio para llenado aséptico, incluye popote individual envuelto en polipropileno transparente.

Envase hermético que garantice la conservación y evite la contaminación tanto a nivel bacteriológico, fisicoquímico y sensorial. El recipiente deberá ser de elaborado de material inocuo y resistente a las diferentes etapas del proceso de tal forma que no reaccionen

con el producto o alteren sus características fisicoquímicas u organolépticas.

Deberá tener impreso la fecha de envasado y de caducidad, el número de lote así como la información nutrimental en español y todas las características especificadas en la Norma Oficial Mexicana NOM-051-SCFI-1994. Especificaciones Generales de Etiquetado para Alimentos y Bebidas no Alcohólicas Preenvasadas y con la NOM –086-SSA1-1994, Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición.

b. Embalaje

Se deberá utilizar cajas de cartón o algún otro material apropiado, que tenga la debida resistencia y ofrezca la protección adecuada en el sellado para evitar el deterioro externo y tarimas que faciliten el manejo durante su almacenamiento y distribución de los mismos.

Deberá indicarse en la caja: Manéjese con cuidado, la cantidad máxima de estibamiento y especificar el tipo de producto en los laterales externos.

c. Vida útil Mínimo tres meses a la entrega del producto, indicando la fecha de caducidad en la parte superior del envase.

DESCRIPCIÓN BREVE DEL PROCESO

a. Diagrama de Flujo

Leche Cacao en polvo

RECEPCION Verificar que la leche esté libre de objetos extraños

MEZCLADO Controlar la uniformidad de la mezcla

FILTRACION Colar la leche en el cedazo con mucho cuidado Aditivos

CLARIFICADO Remoción de partículas extrañas en la leche

HOMOGENIZADO Impedir formación de nata, mejorar consistencia

PAUSTERIZADO Controlar la temperatura

ENFRIAMIENTO Mantener la temperatura estable

ALMACENADO El lugar de almacenamiento debe tener asepsia

ENVASADO Mantiene inocuidad del producto

REFRIGERADO Conservación de la cadena de frio asegura la x calidad sanitaria

COMERCIALIZADO

b. Descripción de los puntos de control

1.-Recepción.- Es un punto de control en donde deben realizarse verificaciones inmediatas de la calidad acordadas de la leche y el cacao en polvo (cocoa).

2.- Estandarización y preparación de la mezcla.- Se regula el contenido de grasas y sólidos no grasos.

3.-Filtración.- Se realiza la filtración de la mezcla para evitar el ingreso de partículas gruesas al proceso.

4.-Clarificacion.- La mezcla se filtra o bien se centrifuga para sacar la suciedad y otras partículas sólidas. Puede haber células del tejido de las ubres y leucocitos, sobre todo si la vaca ha tenido mamitis (una infección de las ubres).

5.-Homogenizacion.- en la práctica del tratamiento industrial de la leche se homogeniza muchas veces la leche higienizada al objeto de impedir la formación de nata y mejorar el sabor y la consistencia del producto.

6.-Pasteurizacion.- Consiste en calentar la leche durante un rato, de manera que se eliminan todos los microbios patógenos y casi todos los no patógenos. También se para la acidificación de la leche. Actualmente se suele hacer llevando la leche a 70ºC-75ºC durante unos 15 segundos.

Si la leche está destinada a ser esterilizada, en lugar de pasteurizarse se puede termizar: llevarla a 60ºC-65ºC durante un intervalo de tiempo más largo. Así se conserva hasta que llega al siguiente paso del proceso.

En los países del norte de Europa es habitual tomar leche fresca, es decir, sólo pasteurizada. Es típica la imagen del repartidor que deja cada mañana una botella de leche en la puerta de las casas británicas.

7.- Enfriamiento.- Es un punto de control porque asegura la temperatura óptima para conservación de la leche. Se enfría hasta la temperatura óptima de inoculación (42-45ºC) o generalmente hasta unos grados por encima y luego es enviada a los tanques de mezcla.

8.-Almacenamiento.- La leche chocolatada deberá almacenarse en condiciones que impidan el deterioro, eviten la contaminación y reduzcan al mínimo su daño o alteración; además deben someterse, si es necesario, a un proceso adecuado de rotación periódica.

9.- Envasado.- Hoy, la mayoría de la leche se envasa en tetrabrik. Es un envase formado por una capa de plástico, una de aluminio y una

de papel. No se recicla totalmente, porque separar el plástico y el aluminio es muy costoso. Sólo se puede separar el papel, poniendo el tetrabrik a remojo. En España, el destino de la gran mayoría de tetrabriks es el vertedero o la incineradora; en este caso se liberarán a la atmósfera organoclorados y metales como el aluminio.

El tetrabrik se fabrica con aluminio virgen (no reciclado); la extracción de bauxita, el mineral del que proviene el aluminio, es muy costosa medioambientalmente. Según Greenpeace, el coste energético de fabricar un tetrabrik es el triple que el de fabricar un envase de vidrio virgen, y casi cinco veces mayor que el de fabricar un envase de vidrio reciclado.

Algunos fabricantes ofrecen leche en botella de plástico PET porque hay un segmento de consumidores que la prefieren. El plástico PET es reciclable.

Envasar la leche en botella de vidrio tiene sentido si se puede reutilizar, devolviéndola a la tienda y de aquí al fabricante; en España no hay mecanismos que lo faciliten. Sólo usan envase de vidrio algunas leches destinadas a restauración y algunas leches ecológicas. Es conveniente guardar la leche en botella de vidrio en un sitio sin demasiada luz.

El tetrabrik es un envase de un solo uso. Según Greenpeace, en Madrid ciudad el uso de envases tetrabrik genera unas 30 toneladas de residuos cada día. Es una marca registrada de Tetra Pak, una de las empresas más poderosas de Europa.

Los recipientes, contenedores, envases o empaques de la leche debe ser de materiales no susceptibles al deterioro o que desprendan substancias que causen alteraciones o contaminaciones.

10.-Refrigeracion.-Es un punto crítico de control, ya que la refrigeración adecuada y a la vez la conservación de la cadena de frío aseguran la calidad sanitaria desde el fin de la producción hasta las manos del consumidor. De producción se conserva, a temperaturas de almacenamiento ≤ 8ºC, por un tiempo aproximado de una semana.

c. Tabla de métodos analíticos por etapasl

Etapa Método analítico Rango

Min. Max.

Recepción

Leche Método de Gerber(grasa)

1% 8%

Crioscopía -0.550°C -0.530°CDeterminación micro

Kjeldahl(proteinas)

3% 3.5%

Caseína 0,05% 0,08%Potenciometría 6.6 6.8

Sólidos no Grasos 8 8.35Densidad 1.030 1.033

Presencia de Conservantes

Negativo

Presencia de Adulterantes

Negativo

Presencia de Neutralizantes

Negativo

Ensayo de Fosfatasa NegativoEnsayo de

PeroxidasasNegativo

Cocoa Determinación micro Kjeldahl

(proteínas)

21% 22%

Potenciometría 5.0 6.5Gravimetría (humedad)

5% 6%

Almidón Proveniente del Cacao

5.5% 8%

Gravimetría (cenizas)

5.5% 8%

Batido - -Filtrado Densidad 1.029 1.031

Clarificado ó Esclarecido

Potenciometría 6.5 6.8Sólidos no grasos 7.8 8

Pasteurizado - 70°C 75°C

Enfriamiento - 42°C 45°CAlmacenado - 25°C

Envasado Reductasimetría <5 (mala) >5(buena)

Refrigeración - <8 °CComercialización - -

MÉTODOS ANALÍTICOS

a) CASEINA

Fundamento

Se entiende por contenido en caseína de la leche el contenido en proteínas, expresado en porcentaje en peso, obtenidas después de una precipitación a pH 4,6, siguiendo el procedimiento expuesto a continuación, que corresponde a la norma FIL-20: 1964 de la Federación Internacional de Lechería.

Este método es aplicable a las leches no alteradas, natural, certificada, higienizada, esterilizada y a las reconstituidas también, no alteradas posteriormente, de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo. Asimismo puede aplicarse a las muestras de leche conservadas por adición de formaldehído (1:2.500).

Se determina la cantidad total de nitrógeno de la leche. A continuación la caseína se precipita con un tampón acético-acetato y se filtra. Se determina luego la cantidad de nitrógeno del filtrado.

La cantidad de caseína se calcula con estas dos determinaciones de nitrógeno, que se realizan por el método Kjeldahl, según el método

Material y aparatos.

Pipetas de 0,5, 1 y 10 ml. Probeta graduada de 100 ml. Matraz graduado de 100 ml. Papel filtro, lavado en ácido, velocidad media: de 11 a 12,5 cm. Embudos.

Reactivos.

131008 Acido Acético glacial PA-ACS 131074 Agua PA-ACS 171634 Sodio Acetato 1 mol/1 (1M) RE Solución de Acido Acético al 10% p/v.

Procedimiento.

Preparación de la muestra.- Antes del análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclar cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersión homogénea de la materia grasa, calentar la muestra lentamente a 40ºC; mezclar suavemente y enfriar a 20º ± 2ºC.

Determinación.- Determinar el contenido total en nitrógeno (NT) de la leche utilizando el método Kjeldahl, según el método 2.

Precipitar la caseína de la siguiente manera: Llevar con pipeta 10 ml de leche a un matraz aforado de 100 ml. Añadir 75 ml de Agua PA-ACS a 40ºC; después un ml de la solución de Acido Acético. Mezclar suavemente el contenido del matraz y esperar 10 minutos. Añadir con pipeta un ml de la solución de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE. Mezclar de nuevo. Dejar enfriar el contenido del matraz a unos 20ºC, completar hasta 10 ml con Agua PA-ACS y mezclar invirtiendo lentamente el matraz. Cuando el precipitado de caseína y materia grasa se haya depositado, filtrar con filtro seco y recoger el filtrado en un recipiente seco.

Determinar el contenido en nitrógeno de 50 ml del filtrado límpido (nitrógeno no caseínico: NNC), utilizando el método Kjeldahl según el método 2.

Ensayo en blanco.- Además del ensayo en blanco previsto en el método 2, relativo a la determinación del contenido en nitrógeno total de la leche, conviene hacer un ensayo en blanco para comprobar los reactivos que precipitan la caseína, utilizando 50 ml de Agua PA-ACS, 0,5 ml de la solución de Acido Acético y 0,5 ml de la solución de Sodio Acetato 1 mol/l (1M) RE.

Cálculo.

Calcular el porcentaje en peso de NT en la leche y del NNC en el suero límpido con tres cifras significativas. Corregir la cifra obtenida para NNC por el volumen del precipitado, multiplicando el valor obtenido por 0,994. Calcular la cantidad de caseína mediante la fórmula.

Cantidad de caseína % = 6,38 (NT - NNC)

La aplicación de este factor a todas las leches enteras no entraña error sensible; sin embargo, si se aplica el método a leche desnatada, el factor de corrección utilizado deberá ser 0,998.

La diferencia entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,04% de caseína.

b)ÍNDICE CRIOSCÓPICO

Determinación del índice crioscópico

Fundamento El principio en el cual se basa la técnica de la crioscopia es la Ley de Raoult, que señala, que tanto el descenso crioscópico, como el ascenso ebulloscópico, están determinados por la concentración molecular de las sustancias disueltas. Al enfriar una solución diluida se alcanza eventualmente una temperatura en la cual el solvente sólido (soluto) comienza a separarse. La temperatura a la cual comienza tal separación se conoce como punto de congelación de la solución.

Reactivos y materiales Reactivos Solución patrón de sacarosa al 7%, -0,407°C (0,422°H), solución patrón de sacarosa al 10%, -0,598°C (-0,621°H), solución patrón de verificación -0,510°C (-0,530°H) Solución patrón de sacarosa al 10% -0,001 80°C (-0,621°H)Solución patrón de verificación -0,001 89°C (-0,530°H) Líquido congelante para baño del crióscopo Nota.- Las soluciones patrón y el líquido anticongelante pueden adquirirse comercialmente.

Materiales Pipetas volumétricas de 2 mL Termómetro (-10°C) Tubos para crióscopo

Equipo Crióscopo con termisor Tubos para crióscopo Termómetro (-10°C) Preparación y acondicionamiento de la muestra Preparación del líquido congelante para el baño del crióscopo Se prepara a partir de anticongelante comercial siguiendo las indicaciones que vienen en la etiqueta. Por ejemplo: Para obtener un punto de congelación de -9°C se deben mezclar 25% de anticongelante con 75% de agua destilada.

Preparación de las muestras La muestra de leche no requiere de ninguna preparación especial. Se puede utilizar leche entera, aunque la leche descremada proporciona resultados más consistentes. Las pruebas siempre se deben comenzar con las muestras a temperatura ambiente; si es necesario emplear muestras directamente del refrigerador, las soluciones patrón también deben enfriarse hasta alcanzar la misma temperatura. Para evitar el congelamiento prematuro debido a la

presencia de grasa congelada en las muestras, calentar éstas a una temperatura de 30°C a 38°C o permitir que se separe la leche y probar la porción baja en grasa. Nota.- La cantidad de muestra utilizada es crítica, debido a que diferentes volúmenes de muestra requieren de distintas calibraciones; por esta razón las muestras deben ser medidas siempre cuidadosamente para obtener cantidades uniformes, pero no necesariamente exactas.

Preparación de las soluciones patrón Guardar las soluciones patrón en envases de polietileno a temperatura ambiente. Utilizar siempre agua destilada a una temperatura de 20°C. Solución patrón de sacarosa al 7%, determinar la masa de exactamente 7,0 g de sacarosa pura en un matraz volumétrico de 100 mL y diluir al volumen con agua a una temperatura de 20°C, o determinar la masa de 100 g de agua en un matraz volumétrico de 100 mL y agregar exactamente 0,689 2 g de cloruro de sodio grado reactivo previamente secado y enfriado. Solución patrón de sacarosa al 10%, determinar la masa de exactamente 10,0 g de sacarosa pura en un matraz volumétrico de 100 mL y diluir al volumen con agua a una temperatura de 20°C o determinar la masa de 100 g de agua en un matraz volumétrico de 100 mL y agregar exactamente 1,020 6 g de cloruro de sodio grado reactivo previamente secado y enfriado.

Procedimiento Verificar antes de iniciar las determinaciones el nivel del líquido

congelante y la temperatura del mismo a -7°C. Verificar la calibración del instrumento con ambas soluciones

patrón. Nota.- Para las verificaciones antes señaladas y la operación del

equipo, seguir las instrucciones del fabricante. Enjuagar el tubo con la muestra a analizar. Medir 2 mL de muestra dentro del tubo. Colocar el tubo en el contenedor del elevador y presionar el botón

de control principal. Leer y apuntar la lectura que aparece en la pantalla (resultado). Si

hay duda en alguna lectura obtenida, repetir la determinación pudiendo haber una variación de ± 2 entre una lectura y otra.

Retirar el tubo y limpiar perfectamente el sensor, el alambre, el mandril y la parte superior del elevador antes de cada determinación, enjuagando con agua destilada y secando posteriormente.

Al terminar todas las determinaciones, limpiar el sensor, el alambre, el mandril y la parte superior del elevador, colocar un tubo vacío en el contenedor para evitar la evaporación en el baño de congelación, bajar el cabezal presionando el botón control principal y apagar el instrumento.

Cálculos y expresión de resultados Cálculos El resultado obtenido debe cumplir con lo especificado para cada tipo de leche. Cuando el crióscopo ha sido calibrado con soluciones estándares de sacarosa al 7%, -0,407°C (-0,422°H) y sacarosa al 10%, -0,598°C (-0,621°H), para convertir a °C la lectura se debe aplicar la siguiente fórmula:

°C = [0,191 5 X ( (-L) – 0,00047851))] / 0,199 donde:

L es la lectura directa del aparato en °H como valor absoluto.

Nota.- El punto crioscópico de la leche fresca es de -0,510°C (-0,530°H) a -0,536°C (-0,560°H) con valor promedio de -0,526°C (0,545°H) valores menores a -0,510°C (-0,530°H). Si el valor es superior a -0,536°C (-0,560°H) se sospecha la adición de sales. Es importante remarcar que entre una lectura y otra de una misma muestra no debe existir una diferencia mayor de +0,002°H.

c)DETERMINACIÓN DE LA ACIDEZ TITULABLE

Fundamento La acidez normal de la leche se debe principalmente a su contenido de caseína(0,05-0,08%) y de fosfatos .Tambien contribuyen a la acidez el dióxido de carbono(0,01-0,02%),los citratos(0,01%) y la albumina(menos de 0,01%).Esta norma establece el método para determinar la acidez titulable en la leche. Se aplica a leche cruda, leche pasteurizada, esterilizada, crema y productos lácteos fluídos, sean o no fermentados.La acidez titulable corresponde al número de mililitros (ml) de solución 0,1N de NaOH, necesarios para neutralizar 100ml de muestra. El grado de acidez corresponde a la suma de todas las sustancias de reacción ácida contenidas en la leche.Principio: Un volumen conocido de muestra (leche) se titula con una solución alcalina de concentración conocida y con la ayuda de un indicador, el cual indica el punto final de la titulación.

Procedimiento y materiales

Materiales Pipeta

Muestra: leche Matraz Fenolftaleína Solución NaOH

Procedimiento

Se deben pipetear 10ml de muestra (leche) en un matraz, agregar 0,5ml de fenolftaleína y titular con NaOH hasta el primer viraje del indicador (color rosa pálido). Registrar volumen de NaOH.

CálculosDespués se debe calcular la acidez titulable: A = V * 100 VMDonde:A = acidez titulable, expresada como grados de acidez (mililitros de NaOH 0,1N por 100ml de muestra)V = volumen de NaOH 0,1N gastado en la titulación en ml.VM = volumen de muestra en ml.

Resultados Nuestros resultados deben estar entre rangos 1,3 a 1,7 g/L de acidez .

d) DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS NO GRASOS

Método LactométricoFundamento

El peso específico de la leche aumenta proporcionalmente con el porcentaje de sólidos no grasos y disminuye a medida que aumenta el contenido de grasa. El aguado y la adición de crema tiende a disminuir esta propiedad, mientras que la separación de la grasa láctea la aumenta. En base a la relaciones mencionadas, se han establecido formulas especiales que permiten calcular el porcentaje de sólidos totales y sólidos no grasos en las leche a partir de la lectura lactométrica corregida y el porcentaje de grasa. Una vez determinado el contenido de sólidos totales de la leche y el contenido de grasa, se determina el contenido de sólidos no grasos por cálculo, ya que los sólidos no grasos están formados por lactosa proteínas y sales minerales.

A continuación se presentan las formulas simplificadas de Babcock:ST = (0,25*L) + (1,22*G) + 0,55 %SNG = (0,25*L) + (0,22*G) + 0,55

Donde: % ST: porcentaje de sólidos totales% SNG: porcentaje de sólidos no grasosL : lectura lactométrica corregida (15ºC) en grados QuevenneG: porcentaje de grasaCuando el porcentaje de grasa es superior a 4 % es necesario hacer una correcciónde 0,14 para ST.% ST = (0,25*L) + (1,22*G) + 0,55 % SNG = (0,25*L) + (0,22*G) + 0,55

Materiales y AparatosLos mismos utilizados para la determinación de Densidad y GrasaMuestras

Leche cruda y pasteurizada Leche descremada

Procedimiento1. Determinar el peso específico de la muestra en grados Quevenne (L) a latemperatura del laboratorio por el procedimiento indicado en el trabajo prácticonumero uno. Paralelamente determinar el porcentaje de grasa de la muestra (G).2. Calcular el porcentaje de sólidos totales y sólidos no grasos a partir de L Y G,aplicando la formula correspondiente.ResultadosPara considerar que la leche está en optimas condiciones, el porcentaje de sólidos no grasos en nuestra leche debe estar en un 9% .

e) PROTEÍNAS

Principio

Se entiende por contenido en proteínas de la leche el contenido en nitrógeno expresado en porcentaje en peso y multiplicado por el factor de conversión, que se determina por el método expuesto a continuación, el cual corresponde al descrito en la norma FIL-20: 1962 de la Federación Internacional de Lechería.

Este método es aplicable a las leches no alteradas, natural, certificada, higienizada, esterilizada y a las reconstituidas asimismo no alteradas, posteriormente de las leches concentrada, evaporada, condensada y en polvo.

La determinación del nitrógeno total se realiza por aplicación del método Kjeldahl: una determinada cantidad pesada de leche se trata con ácido sulfúrico en presencia de mercurio II óxido como catalizador con objeto de transformar el nitrógeno de los compuestos orgánicos en nitrógeno amoniacal. El amoníaco se libera por adición de sodio hidróxido, se destila y se recoge a una solución de ácido bórico. A continuación se valora el amoníaco.

Material y aparatos

1. Balanza analítica de 1 mg de sensibilidad mínima.

2. Aparato de digestión que permita mantener el matraz Kjeldahl en una posición inclinada y provisto de un sistema de calentamiento que no afecte más que a la parte del matraz ocupada por el líquido.

3. Matraz Kjeldahl de 500 ml de capacidad.

4. Refrigerante Liebig de tubo interior rectilíneo.

5. Un tubo de salida con bulbo de seguridad esférico, conectado a la parte inferior del refrigerante por unión esmerilada.

6. Una alargadera conectada al matraz Kjeldahl y al refrigerante Liebig por medio de goma. Uniones esmeriladas.

7. Un matraz erlenmeyer de 500 ml de capacidad.

8. Probetas graduadas de 25, 50, 100 y 150 ml.

9. Bureta de 50 ml graduados a 0,1 ml.

10. Materiales para facilitar la ebullición. En la digestión, pequeños trozos de porcelana dura o perlas de vidrio, y en la destilación, pequeños trozos de piedra pómez recién calcinados.

Reactivos.

172222 Acido Bórico solución 4% RE

181023 Acido Clorhídrico 0,1 mol/1 (0,1N) SV

131058 Acido Sulfúrico 96% PA-ISO

131074 Agua PA-ACS

251170 Azul de Metileno (C.I. 52015) DC

172430 Indicador Mixto (Rojo de Metilo-Azul de Metileno) RE

141427 Mercurio II Oxido rojo PRS

211835 Piedra Pómez gránulos QP

131532 Potasio Sulfato PA-ACS-ISO

171617 Rojo de Metilo (C.I. 13020) RE-ACS

131644 di-Sodio tetra -Borato 10-hidrato PAACS-ISO

131687 Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO

211682 Sodio Sulfuro 9-hidrato QP

3.1. Potasio Sulfato PA-ACS-ISO

3.2. Mercurio II Oxido rojo PRS

3. Acido Sulfúrico 96% PA-ISO

4. Solución de Sodio Hidróxido: 500 g de Sodio Hidróxido lentejas PA-ACS-ISO y 12 g de Sodio Sulfuro 9-hidrato QP disueltos en 1.000 ml de Agua PA-ACS.

5. Acido Bórico solución 4% RE.

6. Acido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N) SV

7. Indicador Mixto (Rojo de Metilo-Azul de Metileno) RE. En su defecto puede prepararse disolviendo 2 g de Rojo de Metilo (C.I. 13020) REACS y 1 g de Azul de Metileno DC en 1.000 ml de Etanol 96% v/v PA.

3.8. Solución de di-Sodio tetra -Borato 10hidrato PA-ACS-ISO para la valoración del Acido Clorhídrico. Los reactivos y las soluciones utilizadas no deben contener sustancias nitrogenadas.

Procedimiento.

1. Preparación de la muestra.- Antes del análisis poner la muestra a 20º ± 2ºC y mezclarla cuidadosamente. Si no se obtiene una dispersión homogénea de la materia grasa, calentarla lentamente a 40ºC, mezclar suavemente y enfriarla de nuevo a 20º ± 2ºC.

2. Determinación.- Introducir sucesivamente en el matraz Kjeldahl algunas perlas de vidrio o pequeños trozos de porcelana, alrededor de 10 g de Potasio Sulfato PA-ACS-ISO, 0,5 g de Mercurio II Oxido rojo PRS y alrededor de 5 g de leche exactamente pesados, con aproximación de 1 mg.

Añadir 20 ml de Acido Sulfúrico 96% PA-ISO y mezclar el contenido del matraz. Calentar cuidadosamente el matraz Kjeldhal sobre el dispositivo para la reacción hasta que no se forme espuma y el contenido se vuelva líquido. Continuar la reacción por calentamiento más intenso, hasta que el contenido se vuelva líquido. Continuar la reacción por calentamiento más intenso, hasta que el contenido del matraz esté perfectamente límpido e incoloro. Durante el calentamiento, agitar de cuando en cuando el contenido del matraz. Cuando el líquido esté perfectamente límpido, proseguir la ebullición durante una hora y media, evitando todo sobrecalentamiento local.

Dejar enfriar el contenido del matraz a la temperatura ambiente, añadir alrededor de 150 ml de Agua PA-ACS y algunos fragmentos de Piedra Pómez gránulos QP, mezclar cuidadosamente y dejarlo todavía enfriar algo más. Con la ayuda de una probeta graduada, verter 50 ml de Acido Bórico solución 4% RE en el matraz erlenmeyer, añadir cuatro gotas de indicador y mezclar. Situar el matraz erlenmeyer bajo el refrigerante, de manera que el extremo del tubo de salida se introduzca en la solución de Acido Bórico. Con la ayuda de una probeta graduada añadir al contenido del matraz Kjeldahl 80 ml de la solución de Sodio Hidróxido que contiene sulfuro. Durante esta operación, mantener el matraz inclinado, de tal manera que el Sodio Hidróxido se deslice a lo largo de la pared del recipiente y que los líquidos no se mezclen. Conectar inmediatamente el matraz Kjeldahl al refrigerante por medio de la alargadera. Mezclar el contenido del matraz por agitación. Calentar a ebullición evitando la espuma. Proseguir la destilación hasta el momento en que el contenido del matraz presente ebullición a saltos. Regular el calentamiento de manera que la destilación dure por lo menos 20 minutos. Enfriar bien el destilado para evitar que se caliente la solución de Acido Bórico. Poco tiempo antes de terminar la destilación, bajar el matraz erlenmeyer para que el tubo de salida no esté introducido en la solución de Acido Bórico. Detener el calentamiento, elevar el tubo de salida y enjuagar sus paredes exteriores e interiores con un poco de Agua PA-ACS. Valorar el destilado con Acido Clorhídrico 0,1 mol/l (0,1N) SV.

3. Ensayo en blanco.- Efectuar un ensayo en blanco, aplicando el método operatorio descrito, pero utilizando cinco mililitros de Agua PA-ACS en lugar de leche.

Cálculo.

1. Nitrógeno total.- Se calcula el contenido en nitrógeno total mediante la fórmula.

Nitrógeno total % = 1,40N (V 1−V 0)P

N = normalidad del ácido clorhídrico.

V1 = volumen en mililitros de ácido clorhídrico utilizado en la determinación.

V0 = volumen en mililitros de ácido clorhídrico utilizado en el ensayo en blanco.

P = peso en gramos de la leche empleada en el análisis.

La diferencia máxima entre dos determinaciones repetidas no debe sobrepasar el 0,005% de nitrógeno.

2. Proteínas.- Para expresar el contenido en proteínas de la leche analizada es preciso multiplicar la cantidad de nitrógeno total, obtenida según el método descrito, por un factor de conversión que se fija en 6,38. En consecuencia, el contenido en proteínas viene dado por la fórmula

Proteínas % = 1,40N (V 1−V 0)P

x 6,38

Referencia.

1. Norma Internacional FIL-IDF 20: 1962.

(*) En el Real Decreto 1679/1994, capítulo I, artículo 5, apartado 9, publicado en BOE, nº 229, de fecha 24/9/94, se indica que la leche de vaca contiene un mínimo de 28 gramos de materia proteica por litro, obtenida al multiplicar el contenido en nitrógeno total de la leche expresado porcentualmente por 6,38.

Materia grasa (Método de Gerber)

En el caso de leche natural se puede emplear, como alternativo, el método Gerber.

Principio.

Liberación total de la grasa por disolución de las sustancias proteicas, separación de la grasa por centrifugación y posterior medida volumétrica de ésta. Aplicable a leche natural, pasterizada y esterilizada.

Material y aparatos.

1. Pipetas aforadas de 11 ml.

2. Dosificador de émbolo de 10 ml para el ácido sulfúrico.

3. Baño de agua regulable a 65ºC.

4. Centrífuga Gerber.

2.5. Butirómetros original Gerber. Se pueden utilizar de varios tipos.

2.5.1. Graduación de 0-5 por 100 divisiones en 0,1. Cuello ranurado.

2.5.2. Graduación de 0-5 por 100 divisiones en 0,1. Cuello liso.



2.6. Tapones de caucho. 1(e).

2.7. Empujador metálico.

Reactivos.

171010 Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber RE

171865 Alcohol iso-Amílico según Gerber mezcla de isómeros RE

1. Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber RE.

2. Alcohol iso-Amílico según Gerber mezcla de isómeros RE

Procedimiento.

Colocar en el butirómetro 10 ml de Acido Sulfúrico 90-91% según Gerber RE y agregar 11 ml de leche con cuidado y lentamente para que no se mezclen, observándose claramente la separación de ambas capas, ácida y de leche.

Agregar a continuación 1 ml de Alcohol isoAmílico según Gerber mezcla de isómeros RE (con dosificador) y cerrar el butirómetro. Agitar enérgicamente, envuelto en un paño para evitar posibles proyecciones hasta la total disolución de la fase proteica de la leche. Verter y dejar en reposo algún tiempo para observar mejor si la disolución ha sido completa. Llevar a la centrífuga durante 5 minutos. Sacar de la centrífuga con cuidado para no mover la capa superior de grasa ya separada. Colocar en el baño (65ºC) durante 5 minutos. Sacar y leer rápidamente.

Cálculo.

Se lee directamente en la escala del butirómetro.

Observaciones.

1. A veces el volumen de líquidos en el butirómetro no es suficiente para que la columna de grasa quede en la escala graduada; en este caso, antes de centrifugar, añadir unas gotas de ácido sulfúrico o simplemente agua si es después de la centrifugación, para conseguir que dicha columna pueda ser leída.

2. Puede ser conveniente después de la agitación del butirómetro y antes de centrifugar, colocarlo en el baño a 65ºC de 5 a 15 minutos para que el ataque sea lo más completo posible, aunque presenta el inconveniente de hacer el glóbulo graso más pequeño, produciéndose un ligero aumento de volumen de grasa, obteniéndose un valor ligeramente por exceso. A pesar de todo, si dicho tiempo de resistencia en el baño no se prolonga más allá de esos 15 minutos, la variación apenas es apreciable, quedándose dentro del error experimental 0,05% en MG propio del método. Sin embargo, presenta la ventaja de apreciar claramente antes de la centrifugación si la disolución ha sido total, factor fundamental en la determinación.

3. En leches conservadas mediante formol, la disolución de la proteína es imposible o incompleta, por lo que la separación de la capa grasa en la centrifugación no es completa ni nítida. No es aconsejable en dicho caso el empleo de este método.

f) MÉTODO DE SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA LECHE Y DETERMINACIÓN DE LA ADULTERACIÓN

Introducción

El monitoreo de la adulteración de la leche se puede realizar separando las diferentes proteínas presentes en el suero y la grasa. El

método que se puede usar exitosamente para este tipo de prueba es la técnica de Electroforesis Capilar. Esta técnica se aplica para cualquier tipo de adulteración proteica.

Fundamento

El perfil de proteínas obtenido por Electroforesis Capilar es característico del origen de la leche. Generando tal perfil, se puede determinar si existe una adulteración y cuál es el origen y la proporción de ésta. Esta técnica permite la separación simultánea de las proteínas del suero (lactoalbúmina y lactoglobulina) y las de la grasa (caseínas). Comparando los perfiles estándares de leche de vaca con los perfiles de muestras desconocidas y perfiles de productos adulterantes posibles se determina el tipo de adulteración. La adulteración se determina la proporción de adulterante utilizando curvas estándares generadas con muestras artificiales en diferentes proporciones de adulterante.

Reactivos y materiales

1 Reactivos

- Fosfato de potasio, grado analítico, monobásico, KH2PO4 - Fosfato de potasio, grado analítico, dibásico, KH2PO4 - Acido fosfórico H3PO4 - Hidroxipropilmetilcelulosa, viscosidad 15, 000 cps - Urea - Agua desionizada - Acido Clorhídrico, HCl, 0.1 N - Ditiotreitol (DTT) - Soluciones estándares de leches - Soluciones estándares de los productos adulterantes 1.1 Preparación de soluciones

Solución Urea 6 M y Fosfato de potasio 0,005 M. Se mezclan 36 g de urea y 87 mg de fosfato de potasio dibásico con 100 mL de agua desionizada, el pH ajustándose a 8. Guardar la solución en refrigeración (2-8°C).

Solución DDT 0.2 M. Mezclar 309 mg de DTT con 10 mL de agua. Agitar para diluir el DTT y guardar en diferentes alícuotas en refrigeración (2-8°C).

Solución Madre de fosfato con urea. Mezclar 1,36 g de fosfato de potasio monobásico con 36 g de urea en 100 mL de agua desionizada, el PH de esta solución debe ser de 2,5. Guardar la solución, sellada, en refrigeración (2-8°C).

Solución madre de HPMC: Mezclar 0,1 de HPMC: mezclar 0,1 g de HPMC en 100 mL de agua desionizada. Agitar moderadamente la solución para permitir la solubilización del HPMC, a temperatura ambiente. Guardar la solución, sellada, en refrigeración (2-8°C).

Solución de separación. Para obtener la solución de separación, 24 horas aproximadamente antes de su uso, se mezclan 10 mL de la solución de fosfato con 10 mL de la solución de HPMC, el PH final debe ser 2,5. La solución resultante se guarda hasta su uso en un frasco cerrado a temperatura ambiente.

2. Materiales

- Pipetas analíticas en el rango 10-100 μL y 100 μL-1000 μL.

- Puntas para pipetas analíticas.

- Material común de laboratorio.

4 Equipo

- Sistema de electroforesis capilar con las siguientes características:

- Control de temperatura del capilar entre 15°C y 40°C.

- Sistema de inyección por presión.

- Detector Ultra Violeta con luz filtrada a 214 nm o con arreglos de diodos.

- Sistema de control del voltaje hasta 30 kV.

- Software de integración y análisis de resultados.

- Capilar de separación con las siguientes características: capilar neutro con recubrimiento interno de poliacrilamida, diámetro interno de 50 μm, longitud efectiva de 50 cm.

- Centrífuga para tubos tipo "Eppendorf" con las siguientes características: velocidad máxima: 14,000 RPM, presión Máxima: 18,000 g.

- Agitador magnético.

- Potenciómetro.

- Sistema de filtración a 0,2 μm.

Procedimiento

1 Preparación de la muestra

Centrifugar 3 mL de la muestra de leche a 18,000 g durante 15 min. Recuperar 1 mL de sobrenadante y mezclarlo con 4 mL de una solución 6M Urea y 0,005 M de fosfato de potasio. Agregar 10 μL de la solución de DTT 0.2 M a la muestra y agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Filtrar la muestra a través de un filtro de tamaño de poro 0.2 μm.

2 Corrida de separación

La separación se realiza en un capilar neutro (recubrimiento interno o “coating” de poliacrilamida) de 50 cm de longitud efectiva (longitud a la ventana de detección) y 50 μm de diámetro interno. Los pasos de la separación son los siguientes:

a) Lavado del capilar

El capilar se lava con las soluciones siguientes:

- Lavado con agua desionizada 2 minutos.

- Lavado con HCL 0.1 N 2 minutos (5 minutos cuando se usa por primera vez).

- Lavado con agua desionizada 1 minuto.

- Lavado con solución de separación 3 minutos (10 minutos cuando se usa por primera vez).

b) Inyección de la muestra

La inyección se realiza desde un vial tapado y tiene las siguientes características: inyección por presión a 0,04 MPa (0,5 psi) durante 20 s.

c) Separación de la muestra

La inyección se realiza a tensión constante de 350 V/cm durante 30 minutos, a temperatura constante de 35°C. El búfer de separación durante la corrida es la misma solución de separación pH 2,5. Las proteínas se monitorean a 214 nm de longitud de onda de absorbancia. La polaridad es normal (cátodo a la salida del capilar).

Cálculos y expresión de resultados

El resultado obtenido se compara cualitativamente con los perfiles estándares de leches y adulterantes almacenados anteriormente. Se realiza una comparación, en tiempo de migración y área, entre los picos característicos de la muestra desconocida y los picos característicos de los diferentes estándares. Se determina la proveniencia de la leche, así como los probables productos adulterantes.

Para cuantificar la tasa de adulteración, se utilizan estándares artificiales, una curva de calibración (% de leche de vaca vs Area de un pico característico de la leche de vaca/área de un pico característico del adulterante (Area corregida)) para cada tipo de adulterante posible. Una vez determinada la naturaleza del adulterante por el método cualitativo, se informa la relación de áreas en la curva de calibración y se determina la tasa de adulteración.

g) REDUCTASIMETRÍA

Objetivo Determina la conservación del color del producto final, específicamente en el proceso de envasado.

FundamentoTrabajar en condiciones de esterilidad y evitar la exposición a la luz solar. Colocar en un tubo de ensayo ancho (aprox. 3-4 cm de diámetro) 40 ml de leche cuidando de no mojar un costado de la pared interior del tubo. Agregar 1 ml de solución de azul de metileno sin que la punta de la pipeta entre en contacto con la leche. Tapar el tubo con un tapón de algodón y colocarlo en un baño de agua a 37-38°C. El nivel de agua en el baño debe exceder al de la leche en el tubo. Medir el tiempo en que se produce decoloración total o hasta 5 mm de la superficie.

Cálculos y ResultadosLa leche se clasificará según la siguiente tabla:1.- Muy mala: se decolora antes de los 20 min.

2.- Mala: se decolora entre 20 min y 2 h.3.- Mediocre: se decolora entre las 2 h y 5 h.4.- Buena: conserva el color por más de 5 h.

NOTA: La solución de azul de metileno se prepara disolviendo azul de metileno en alcohol de 96° hasta saturación, y diluyendo 5 ml de esta solución con 195 ml de agua destilada estéril. Descartar después de 2 meses. No exponer a la luz.

h) DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD

Objetivo Determinar adulteración en la composición de la leche.

FundamentoSe puede determinar con lactodensímetro, a 15.6°C (AOAC 16021, 1984).El lactodensímetro está calibrado a 15°C. A temperaturas diferentes (15°C ± 5°C) se puede hacer una corrección sumando o restando 0.0002 a la densidad leída, por cada grado de temperatura respectivamente mayor o menor a 15°C.

ResultadosSe espera que la leche cuando se encuentre en el proceso de recepción posea una densidad entre 1.020 y 1.022 ; mientras que en el proceso de filtración 1.020 y 1.021.

Diseño de un laboratorio:

Área de administración: formada por despachos, zona de recepción y preparación de muestras que será el lugar donde vamos a recoger las muestras y las vamos a analizar fisico-química y bioquímicamente y el laboratorio.

Dispositivo de seguridad: que se va a corresponder con las duchas para lavado de ojos, extintor, etc.

Ventilación adecuada y aire acondicionado: van a ser importantes para el mantenimiento de los equipos de trabajo, sobre todo si son sofisticados porque los cambios bruscos le afectarán.

Espacio utilizado: diez metros cuadrados por persona de laboratorio

Suministros: agua potable y destilada, electricidad, etc.

MAQUINARIAS Y EQUIPOS

BPL

1. El Analista

1.1 El análisis de residuos consiste en una cadena de procedimientos, la mayoría de los cuales conocidos o fácilmente comprensibles, realizados por un químico capacitado; sin embargo, dado que las concentraciones de las sustancias analizadas son del orden de µg/kg a mg/kg y que los análisis pueden ser difíciles, es imprescindible prestar atención a los detalles. El analista encargado debe estar convenientemente calificado y poseer experiencia y competencia en análisis de residuos. El personal debe poseer una sólida formación y experiencia en el uso correcto de los equipos y la aplicación de las técnicas de laboratorio apropiadas. Además, cada analista que utilice el método por primera vez debe completar las pruebas especificadas en las secciones 4.4.5 del Cuadro 4 para demostrar que es capaz de utilizar el método dentro de los parámetros de rendimiento previstos, establecidos durante la validación del método antes de su aplicación al análisis de muestras. El personal ha de comprender los principios del análisis de residuos de plaguicidas y las exigencias de los

sistemas de garantía de la calidad analítica. Debe conocer la finalidad de cada etapa del método que se utiliza y entender la importancia de que los métodos se sigan exactamente en la forma prescrita, y señalar todas las desviaciones en que sea forzoso incurrir. Asimismo, el personal debe estar capacitado para evaluar e interpretar los datos obtenidos. Deberá llevarse un registro en el que conste la formación y experiencia de todos los miembros del personal.

1.2 Cuando se crea un laboratorio para análisis de residuos, el personal debe pasar parte de su período de capacitación en un laboratorio de prestigio donde se disponga del asesoramiento de expertos y de medios de capacitación. Si el laboratorio tiene que analizar una amplia de variedad de residuos de plaguicidas, podrá ser necesario que el personal adquiera experiencia en más de uno de estos laboratorios reconocidos.

2. RECURSOS BÁSICOS

2.1 El laboratorio

2.1.1 El laboratorio y sus instalaciones deben estar proyectados de forma que las distintas tareas se efectúen en zonas bien determinadas, con la máxima seguridad y la mínima posibilidad de contaminación de las muestras. Los laboratorios deberán estar construidos y equipos con materiales resistentes a las sustancias químicas que probablemente se utilizarán entre ellos. Lo ideal sería que dispusieran de salas independientes para recibir y almacenar la muestra, para la preparación, extracción y purificación y para los instrumentos utilizados en la etapa de determinación. La zona utilizada para extracción y purificación deberá cumplir las especificaciones impuestas a los laboratorios en materia de disolventes, y todas las instalaciones de extracción de humos deberán ser de alta calidad. La recepción, el almacenamiento y la preparación de las muestras deberán efectuarse en zonas dedicadas exclusivamente a la determinación de niveles de residuos. Los requisitos prioritarios son que se garantice la integridad de la muestra y se cuente con normas adecuadas en materia de seguridad del personal.

2.1.2 La seguridad del laboratorio se debe considerar también desde el punto de vista de lo que es necesario o deseable, ya que hay que reconocer que las rigurosas condiciones de trabajo exigidas en los laboratorios de residuos en algunas partes del mundo no serían en absoluto realistas en otras. No deberá permitirse fumar, comer, beber ni utilizar cosméticos en la zona de trabajo. En ésta sólo deberán almacenarse pequeños volúmenes de disolventes, debiéndose conservar la mayor parte de ellos en locales separados, lejos de la zona de trabajo principal. En la medida de lo posible, el uso de disolventes y reactivos muy tóxicos o de toxicidad crónica deberá reducirse al mínimo. Todos los disolventes sobrantes deberán

almacenarse en lugar seguro y eliminarse de forma inocua y sin causar daños al medio ambiente tomando en cuenta, cuando se disponga de ella, la reglamentación nacional específica.

2.1.3 La zona de trabajo principal deberá estar diseñada y equipada de modo que pueda utilizarse una gama apropiada de disolventes analíticos. Todo el equipo (luces, maceradores, refrigeradores, etc.) deberá ser "antichispa" o "a prueba de explosiones". Las operaciones de extracción, purificación y concentración deberán efectuarse en una zona bien ventilada, preferiblemente en campanas de gases.

2.1.4 Deberán emplearse pantallas de seguridad cuando se utilice material de vidrio en vacío o a presión. Deberá haber un suministro abundante de gafas, guantes y ropa de protección, servicios de lavado de urgencia y equipos para tratar los materiales derramados. Se deberá disponer de un equipo adecuado contra incendios. El personal deberá ser consciente de que muchos plaguicidas presentan una toxicidad aguda o crónica, por lo que hay que tener gran cuidado al manipular los compuestos estándar de referencia.

2.2 Equipo y suministros

2.2.1 El laboratorio necesitará un suministro eficiente y fiable de electricidad y agua. Es imprescindible disponer de un suministro adecuado de reactivos, disolventes, material de vidrio, material para cromatografía, etc., de calidad adecuada.

2.2.2 El equipo de cromatografía, las balanzas, los espectrofotómetros, etc., deberán revisarse con regularidad para comprobar que su funcionamiento es correcto, y se llevará un registro de todas las revisiones o reparaciones que se efectúen a cada uno de los aparatos.

En el caso de los instrumentos de medición, la calibración es fundamental. Puede ser suficiente el empleo de curvas de calibración y la comparación con patrones.

2.2.3 Sólo se deberá proceder a la calibración y recalibración periódica de los instrumentos de medición cuando el posible cambio en el valor nominal pueda contribuir en medida importante a la incertidumbre de la medición. Deben calibrarse regularmente las balanzas y pipetas/dispensadores automáticos o instrumentos similares. A intervalos especificados se controlará la temperatura de funcionamiento de los refrigeradores y congeladores, manteniéndose todos los registros correspondientes.

2.2.4 Aunque puede ser necesario renovar periódicamente el equipo para que no quede obsoleto, bastará con que sea suficientemente moderno para realizar el trabajo requerido.

2.2.5 Todos los laboratorios deberán tener una gama suficiente de plaguicidas estándar de referencia, de pureza conocida y convenientemente elevada. Dicha gama deberá cubrir todos los compuestos de origen cuyas muestras se controlan en el laboratorio, así como los metabolitos incluidos en los LMR.

2.2.6 Todos los patrones analíticos, las soluciones concentradas y los reactivos deberán etiquetarse claramente con la fecha de caducidad y almacenarse en las condiciones adecuadas. Los compuestos "puros" de referencia se mantendrán en las condiciones que reduzcan al mínimo su tasa de degradación: temperatura baja, exclusión de humedad, oscuridad. Asimismo es importante que durante el almacenamiento las soluciones estándar de plaguicidas no se descompongan por efecto de la luz o el calor o se concentren a causa de la evaporación del disolvente.

3. EL ANÁLISIS

Los métodos aplicados para la determinación de los residuos de plaguicidas deberán, en general, satisfacer los criterios indicados en el Cuadro 3.

3.1. Evitar la contaminación

3.1.1 Uno de los aspectos importantes en los que el análisis de residuos de plaguicidas difiere notablemente del macroanálisis es el relacionado con la contaminación y la interferencia. Las trazas de contaminación en las muestras finales utilizadas en la etapa de determinación del método pueden dar lugar a errores tales como falsos resultados positivos o negativos y a una pérdida de sensibilidad, que puede impedir la detección de los residuos. La contaminación puede provenir prácticamente de todos los materiales empleados o relacionados con el muestreo, el transporte y almacenamiento de las muestras, y los análisis. El material de vidrio, los reactivos, los disolventes orgánicos y el agua deberán ser comprobados antes de su utilización para evitar la presencia de posibles contaminantes que puedan interferir, para lo cual se analizarán mediante un reactivo testigo.

3.1.2 Las sustancias limpiadoras, las cremas protectoras, los jabones que contengan germicidas, los rociados contra insectos y los perfumes y cosméticos pueden causar interferencias que resultan especialmente importantes cuando se utiliza un detector de captura de electrones. No hay ninguna solución efectiva al problema fuera de prohibir su uso por el personal dentro del laboratorio.

3.1.3 Los lubricantes, los obturadores, los plásticos, los cauchos naturales y sintéticos, los guantes de protección, el aceite de las conducciones corrientes de aire comprimido y las impurezas de

fabricación en los conos de la extracción, papeles filtrantes y algodón pueden también contaminar la solución analítica final.

3.1.4 Los reactivos, adsorbentes y disolventes químicos generales de laboratorio pueden contener, adsorber o absorber compuestos que interfieren en el análisis. Puede ser necesario purificar los reactivos y adsorbentes y, en general, se deben utilizar disolventes redestilados. El agua desionizada es frecuentemente sospechosa, por lo que es preferible el agua redestilada. En muchos casos bastará agua corriente o de pozo.

3.1.5 La contaminación del material de vidrio, las jeringas y las columnas de la cromatografía de gases puede derivar del contacto con muestras o extractos anteriores. Todos los objetos de vidrio deberán limpiarse con solución detergente y ser enjuagados cuidadosamente con agua destilada (u otra agua limpia) y, a continuación, enjuagados de nuevo con el disolvente que ha de utilizarse. El material de vidrio que se utilice en el análisis de trazas deberá guardarse por separado, y no se utilizará para ningún otro fin.

3.1.6 Los plaguicidas patrón de referencia deberán almacenarse siempre a la temperatura adecuada, en una sala separada del laboratorio principal de residuos. Las soluciones y extractos analíticos concentrados estándar no se guardarán en la misma zona de almacenamiento.

3.1.7 Se deberá desconfiar de los aparatos que contengan cloruro de polivinilo (PVC) y, si se demuestra que son fuente de contaminación, deberá prohibirse su uso en los laboratorios de residuos. También habrá que tener cuidado con otros materiales que contengan plastificadores, si bien el PTFE y los cauchos silicónicos son, por regla general, aceptables y otros pueden serlo en determinadas circunstancias. Los recipientes en que se almacenan las muestras pueden provocar contaminación; quizás se necesitan botellas de vidrio con tapones de vidrio esmerilado Lo ideal es que los instrumentos utilizados en los análisis se almacenen siempre en una sala aparte. La naturaleza y la importancia de la contaminación pueden variar según el tipo de técnica de determinación que se utilice y según el nivel de residuos de plaguicida que deba determinarse. Por ejemplo, algunos problemas de contaminación que son importantes cuando se trata de métodos que utilizan la cromatografía de gases o la cromatografía líquida de alto rendimiento pueden serlo menos cuando se utiliza la espectrofotometría, y viceversa. Cuando los niveles del residuo son relativamente altos, la interferencia de fondo de los disolventes y otros materiales puede ser insignificante en comparación con la cantidad de residuo presente. Muchos problemas pueden resolverse utilizando detectores específicos. Si el contaminante no interfiere con el residuo que debe determinarse, su presencia puede ser admisible.

3.1.8 Se deberán utilizar laboratorios distintos para los análisis de residuos y los de formulación. La preparación y manejo de las muestras deben mantenerse separados de todas las demás actividades del laboratorio de residuos con el fin de impedir una posible contaminación recíproca.

3.2 Recepción y almacenamiento de las muestras

3.2.1 Todas las muestras que se reciban en el laboratorio deberán ir acompañadas de información sobre la muestra, el análisis requerido y los posibles peligros que puede entrañar la manipulación de la muestra en cuestión.

3.2.2 Al recibirse una muestra se le adjudicará inmediatamente un código de identificación único que deberá llevar durante todas las fases del análisis y hasta la comunicación de los resultados. De ser posible deberá contarse con un sistema de control de la eliminación de las muestras, del que se llevará registro.

3.2.3 El tratamiento de las muestras y el submuestreo deberán efectuarse empleando procedimientos para los que previamente se haya demostrado que no repercuten en la concentración de los residuos presentes en las muestras.

3.2.4 Si no es posible analizar las muestras inmediatamente pero su análisis ha de efectuarse con rapidez, éstas deben almacenarse a temperatura de refrigeración (1-5 ºC), sin exponerlas a la luz solar directa, y ser analizadas en el plazo de pocos días. Sin embargo, las muestras que se reciben congeladas deben mantenerse a £ -16 ºC hasta el momento del análisis. En algunos casos puede ser necesario almacenar las muestras por períodos más largos antes de proceder a su análisis. En tales ocasiones, la temperatura de almacenamiento deberá ser de - 20 ºC aproximadamente, dado que a dicha temperatura la degradación de los residuos de plaguicidas por la acción de enzimas es sumamente lenta. Si es inevitable un almacenamiento prolongado se deberán comprobar los efectos del mismo analizando muestras enriquecidas que hayan sido almacenadas en las mismas condiciones durante un período similar. Se encontrará información útil sobre la estabilidad de los residuos de plaguicidas en el almacenamiento en la publicación anual de la FAO titulada: Pesticide Residues - Evaluations que preparada la JMPR de la FAO y la OMS, así como en la documentación presentada por los fabricantes para apoyar el registro de sus plaguicidas.

3.2.5 Cuando haya que congelar las muestras, es recomendable que se tomen las porciones de las mismas que han de analizarse antes de proceder a la congelación, para reducir al mínimo el efecto de separación del agua en forma de cristales de hielo durante el almacenamiento. No obstante, es necesario asegurarse de que en el análisis se emplea toda la porción extraída para tal fin.

3.2.6 Los envases utilizados para el almacenamiento y sus tapas o tapones deberán impedir la entrada de la sustancia o sustancias analizadas en el compartimento de almacenamiento. Los envases no deberán tener pérdidas. Todas las muestras deberán estar claramente etiquetadas de forma permanente, y se llevará un registro de las mismas. Los extractos y la solución analítica final no deberán exponerse a la luz solar directa.

3.3 Procedimientos operativos normalizados

3.3.1 Se aplicarán procedimientos operativos normalizados para todas las operaciones. Dichos procedimientos comprenderán instrucciones de trabajo completas así como información sobre la aplicación, el rendimiento previsto, los requisitos para el control de calidad interno (verificación del rendimiento) y el cálculo de los resultados. Asimismo deberá informar de todos los peligros que puedan derivarse del método, las sustancias patrón o los reactivos.

3.3.2 Todas las desviaciones de un procedimiento deberán ser registradas y autorizadas por el analista encargado.

3.4 Validación de métodos[24]

3.4.1 Un método de análisis es la serie de procedimientos que se aplican desde la recepción de la muestra hasta la producción del resultado final. La validación es el proceso mediante el cual se verifica la idoneidad del método para cumplir la finalidad prevista. El método puede desarrollarse internamente, extraerse de la literatura u obtenerse de terceros de alguna otra manera. Podrá luego adaptarse o modificarse para que se ajuste a los requerimientos y capacidades del laboratorio y/o al propósito para el que ha de utilizarse. Habitualmente la validación se efectúa una vez que se ha terminado de desarrollar el método y se supone que se han establecido de manera satisfactoria requisitos como la calibración, la idoneidad del sistema, la estabilidad del analito, etc. En la validación y utilización de un método de análisis se deberán efectuar mediciones comprendidas en la escala calibrada del sistema de detección que se emplee. Por lo general la validación precederá la aplicación práctica del método de análisis de las muestras, aunque la verificación posterior del rendimiento debe constituir un aspecto constante e importante del proceso. Los requisitos para los datos de verificación del rendimiento constituyen un subconjunto de los exigidos para la validación del método.

Cuando es viable la realización de ensayos de aptitud (u otros procedimientos de verificación entre laboratorios), éstos constituyen un instrumento importante para verificar la precisión general de los resultados generados por el método, y brindan información sobre la variabilidad de los resultados entre los distintos laboratorios. Sin embargo, por lo general los ensayos de aptitud no comprueban la

http://www.fao.org/docrep/meeting/005/Y0508S/y0508s0q.htm#fn24

estabilidad o homogeneidad de los analitos ni su extractabilidad de la misma en la muestra procesada.

Cuando se necesitan datos sobre la incertidumbre, éstos deben incluir información sobre la verificación del rendimiento y no deben basarse únicamente en datos sobre la validación del método.

3.4.2 Siempre que un laboratorio desarrolle un nuevo método o modifique un método ya existente, deberán determinarse los efectos de las variables analíticas, por ejemplo mediante una prueba de rugosidad. Deberán aplicarse estrictos controles que fundamenten todos los aspectos de la metodología que puedan influir en los resultados, como pueden ser: tamaño de la muestra; volúmenes de reparto; variaciones en el rendimiento de los sistemas de purificación empleados; estabilidad de los reactivos o de los derivados preparados; efectos de la luz, la temperatura, los disolventes y el almacenamiento en los analitos de los extractos; efectos de los disolventes, los sistemas de inyección, la columna de separación, las características de la fase móvil (composición y velocidad de flujo), la temperatura, el sistema de detección, las sustancias utilizadas en la extracción, etc., en el sistema de determinación. Es muy importante que se establezcan claramente las relaciones cualitativas y cuantitativas entre la señal medida y la sustancia que se trata de analizar.

3.4.3 Se dará preferencia a métodos que puedan aplicarse a varios tipos de residuos o a varios tipos de matrices. El empleo de analitos o matrices representativos es un instrumento importante para la validación de los métodos. Para este fin los productos deberán diferenciarse suficientemente, pero no más de lo necesario. Por ejemplo, algunos productos están disponibles en una vasta gama de variantes manufacturadas, o variedades cultivadas, o razas, etc., con diferencias menores. Por lo general, aunque no invariablemente, se podrá considerar que una única variante de un producto particular representa a otras variantes del mismo producto, aunque, por ejemplo, no se debe considerar que una sola especie de frutas u hortalizas represente a todas las frutas u hortalizas (Cuadro 5). Cada caso se considerará por sus propios méritos, teniendo en cuenta las situaciones en que se sabe que determinadas variantes de un producto difieren de otras en cuanto a su efecto en el rendimiento del método. Pueden existir diferencias considerables entre las distintas especies en cuanto a la exactitud y precisión de los métodos, especialmente con respecto a la fase de determinación.

3.4.3.1 Si la experiencia indica que en matrices de productos/muestras generalmente similares se obtiene un rendimiento similar en la extracción y la purificación, será posible adoptar un criterio más sencillo de validación del rendimiento. Se podrá seleccionar del Cuadro 5 un producto representativo de cada grupo de productos con propiedades comunes, y utilizarlo para la

validación del procedimiento o el método. En el Cuadro 5, los productos están clasificados con arreglo a la Clasificación del Codex[25].

3.4.3.2 Para evaluar el rendimiento de un método se podrán utilizar analitos de representatividad similar. Se pueden seleccionar compuestos que comprendan propiedades físicas y químicas de los analitos que se intenta determinar con el método. La selección de los analitos representativos debe efectuarse en función de la finalidad y el alcance del análisis, teniendo en cuenta lo siguiente.

a) Los analitos representativos seleccionados deben: i) poseer una gama de propiedades físico-químicas suficientemente amplia como para incluir la de los analitos representados;

ii) ser los que con toda probabilidad se detectarán regularmente o que serán objeto de decisiones críticas sobre la base de los resultados obtenidos.

b) En la medida en que sea viable, todos los analitos incluidos en el proceso de validación inicial deben ser aquéllos que han de someterse a ensayo regularmente y que pueden ser determinados simultáneamente por el sistema de determinación empleado.

c) La concentración de los analitos utilizados para caracterizar un método debe seleccionarse de manera que comprenda o límites aceptados (LA) de todos los analitos que se planea buscar en todos los productos. Por consiguiente los analitos representativos seleccionados deben incluir, entre otros, aquéllos con LA altos y bajos. Esto significa que los niveles de enriquecimiento utilizados en ensayos de rendimiento con analitos representativos/productos representativos no necesariamente corresponderán a los LA efectivos.

3.4.4. Cuando ya se dispone de datos apropiados quizás no sea necesario que el analista efectúe todos los ensayos. Sin embargo, los registros de validación deben incluir, directamente, o mediante referencias, toda la información requerida. El Cuadro 1 ofrece un panorama general de los parámetros que deben evaluarse en la validación de los métodos, según la situación del método que deba validarse. Los parámetros y criterios específicos que se han de evaluar se enumeran en el Cuadro 2. Se evaluarán únicamente aquellos parámetros que resulten apropiados tanto para el método como para la finalidad con la que ha de aplicarse ese método particular. En muchos casos será posible obtener simultáneamente, mediante un único experimento, las características de rendimiento relacionadas con varios parámetros. El empleo de pruebas en las que se modifican varios factores diferentes al mismo tiempo

http://www.fao.org/docrep/meeting/005/Y0508S/y0508s0q.htm#fn25

(experimentos de diseño factorial) puede ayudar a reducir al mínimo los recursos requeridos. El rendimiento del método analítico deberá comprobarse tanto en la fase de elaboración del mismo como durante su uso posterior, tal como se indica en la sección 4.5, con arreglo a los criterios indicados en el Cuadro 3.

3.4.4.1 Los métodos individuales (para un solo residuo) deberá validarse por completo con todos los analitos y materiales de muestras especificados para ese fin, utilizando matrices de muestras representativas de los que ha de analizar el laboratorio.

3.4.4.2 Los métodos específicos para ciertos grupos se deberán validar inicialmente para uno o más productos representativos y para un mínimo de dos analitos representativos seleccionados del grupo.

3.4.4.2 Los métodos para residuos múltiples (MRM) podrán validarse con productos representativos y analitos representativos.

3.5 Verificación del rendimiento

3.5.1 Los objetivos principales de la verificación del rendimiento son:

seguir de cerca el rendimiento del método en las condiciones efectivas en que se emplea;

tomar en cuenta el efecto de las inevitables variaciones provocadas, por ejemplo, por la composición de las muestras, el funcionamiento de los instrumentos, la calidad de las sustancias químicas, la aptitud variable de los analistas y las condiciones ambientales en el laboratorio;

demostrar que las características de rendimiento del método son generalmente similares a las establecidas en el momento de su validación, lo que prueba que el método se halla "estadísticamente bajo control", y que la precisión e incertidumbre de los resultados son comparables a los previstos para el método. Con este fin los datos obtenidos en la validación del método podrán actualizarse con información recabada de la verificación de su rendimiento durante el empleo regular del método.

Los resultados del control interno de calidad proporcionan una información esencial sobre la reproducibilidad a largo plazo y otras características del rendimiento del método, incluidos los analitos y productos que se hayan incorporado durante la extensión del método.

Las características esenciales de rendimiento que han de comprobarse y los procedimientos de ensayo apropiados se describen en el Cuadro 5.

Para que la verificación del rendimiento sea eficaz, el análisis de las muestras se efectuará simultáneamente con los análisis apropiados de control de calidad (determinaciones de material testigo y de la recuperación, materiales de referencia, etc.). Se podrán utilizar gráficos de control para comprobar las tendencias del rendimiento del método y garantizar el mantenimiento del control estadístico.

3.5.2 Construcción y utilización de gráficos de control

Los gráficos de control pueden ser un instrumento útil para demostrar el rendimiento de un método y la reproducibilidad del parámetro seleccionado. Un ejemplo de ello son los gráficos de control utilizados para las recuperaciones. Su aplicación dependerá de las tareas de laboratorio, cuando se analiza un número elevado de muestras del mismo tipo con los mismos ingredientes activos, el gráfico de control se basará en la recuperación media y las desviaciones estándar obtenidas en el uso regular del método. Si, en cambio, el análisis se efectúa en un número pequeño de muestras de cada tipo para una gran variedad de muestras y un número considerable de analitos, aplicando un procedimiento de residuos múltiples, los gráficos de control no podrán utilizarse de la manera habitual. En tales casos inicialmente se construirá un gráfico de control con la recuperación promedio (Q) de los analitos representativos en matrices representativas y el coeficiente tipo de variación de la reproducibilidad dentro del laboratorio (CVAtíp), obtenido por el procedimiento descrito más abajo. Cuando el promedio de los datos de las recuperaciones y su coeficiente de variación obtenidos en la validación del método para los distintos analitos/matrices de la muestra no son estadísticamente diferentes, cada uno de ellos podrá considerarse como una estimación de la recuperación efectiva y de la precisión del método; combinándolas de manera apropiada se podrá establecer la recuperación típica (Qtíp) y el coeficiente de variación (CVAtíp) del método, que se utilizarán para construir el gráfico de control inicial. Los límites de control y de adopción de medidas serán, respectivamente, Qtíp ± 2*CVAtíp*Q y Qtíp ± 3*CVAtíp*Q.

3.5.2.1 Si el método se aplica regularmente para analizar diversas combinaciones de analitos y matrices representadas durante la validación, se trazarán en el gráfico las distintas recuperaciones. La reproducibilidad del método en su uso normal podrá ser algo mayor a la obtenida durante la validación del método. Por consiguiente, si algunas de las recuperaciones quedan fuera de los límites de control o superan ocasionalmente los límites de adopción de medidas, pero están comprendidas dentro de las escalas calculadas a partir de los valores de la CVA especificados en el Cuadro 3, no será necesario adoptar medidas particulares.

3.5.2.2 Sobre la base de los 15-20 ensayos de recuperación adicionales efectuados durante el uso regular del método como parte de la verificación de su rendimiento, se volverán a calcular el valor

medio o recuperación típica y el CVA y se construirá un nuevo gráfico de control que reflejará la reproducibilidad a largo plazo de la aplicación del método. Los nuevos parámetros establecidos deberán formar parte de las gamas de valores aceptables especificadas en el Cuadro 3.

3.5.2.3 Si esto no puede lograrse, por ejemplo en el caso de analitos particularmente problemáticos, se deberá notificar que los resultados recabados de las muestras tienen una exactitud o una precisión inferiores a las que se asocian normalmente a la determinación de residuos de plaguicidas.

3.5.3.4 Durante el uso regular del método, si el promedio de los primeros ³10 ensayos de recuperación para una matriz particular de analito/muestra resulta significativamente diferente (P=0,05) de la recuperación promedio obtenida de las matrices representativas del analito/muestra, no serán aplicables la Qtíp ni el CVtíp. En este caso se calcularán nuevos límites de control y de adopción de medidas para esa matriz particular del analito/muestra, aplicando el nuevo promedio de recuperación y los valores del CV obtenidos.

3.5.3.5 Si los datos de la verificación del rendimiento exceden reiteradamente los límites de control (es aceptable que una de cada 20 mediciones exceda el límite), se deberán verificar las condiciones de aplicación del método, se identificarán las fuentes de los errores, y se adoptarán las medidas correctivas necesarias antes de proseguir con la utilización del método.

3.5.3.6 Si los datos de la verificación del rendimiento exceden los límites de adopción de medidas, afinados según se estipula en 4.2.3, deberá repetirse el ensayo en el lote analítico en cuestión (o por lo menos en las muestras en que se encuentran residuos ³ 0,7 LA o 0,5 LA respectivamente, para los analitos que se detecten en forma regular y ocasional).

4.5.6.7 Un nuevo análisis de la porción analítica de las muestras que den resultados positivos es otro instrumento de gran utilidad para verificar el rendimiento del método. Los resultados de este procedimiento pueden utilizarse para calcular la reproducibilidad global del método dentro del laboratorio (CVLtíp), en general o para una matriz particular de analito/muestra. En este caso, el CVLtíp incluirá también la incertidumbre del procesamiento de la muestra, pero no indicará si hay pérdida del analito durante el proceso.

3.6 Ensayos de confirmación

3.6.1 Cuando se llevan a cabo análisis de efectos de reglamentación, es especialmente importante que se efectúen ensayos de confirmación antes de dar un informe negativo sobre muestras que contienen residuos de plaguicidas normalmente no asociados con el

producto, o cuando parece que se han superado los LMR. Las muestras pueden contener sustancias químicas que interfieren en el análisis, que se han identificado erróneamente como plaguicidas. En la cromatografía de gases son ejemplos de esto las respuestas de los detectores de captura de electrones a los ésteres de ftalatos, y las que se obtienen de los detectores selectivos de fósforo con compuestos que contienen azufre y nitrógeno. Como primera medida, si al principio se había analizado una sola porción analítica, deberá repetirse el análisis utilizando el mismo método. Así se obtendrá una prueba de la repetibilidad del resultado en caso de que se confirme el residuo. Cabe señalar que la única prueba de la ausencia de residuos detectables la proporcionan los datos de verificación del rendimiento.

3.6.2 Los ensayos de confirmación pueden ser cuantitativos o cualitativos, pero en la mayor parte de los casos se necesitarán ambos tipos de información. Se plantean problemas particulares cuando se deben confirmar residuos en el límite de determinación o próximos al mismo, pero aunque en este nivel es difícil cuantificarlos es imprescindible que se confirme su nivel e identidad.

3.6.3 La necesidad de ensayos de confirmación puede depender del tipo de muestra o de su procedencia conocida. En algunos cultivos o productos se encuentran con frecuencia determinados productos. Tratándose de una serie de muestras de origen similar que contenga residuos del mismo plaguicida, quizás baste con confirmar la identidad de los residuos en una pequeña parte de las muestras, tomada al azar. De igual forma, cuando se sabe que se ha aplicado un determinado plaguicida al material de la muestra no hay mucha necesidad de confirmar la identidad, si bien deberá confirmarse una parte de los resultados seleccionada al azar. Cuando se dispone de muestras de control, habrá que utilizarlas para comprobar la presencia de posibles sustancias que interfieren en el análisis.

3.6.4 En la confirmación cualitativa, es conveniente emplear una técnica alternativa que emplee propiedades físico-químicas diferentes, o la utilización de datos del espectro. En la confirmación cualitativa deberá aplicarse por lo menos un procedimiento alternativo (que podrá ser una técnica de detección diferente, el control de otros iones mediante espectometría de masas, etc.). El resultado que ha de notificarse dependerá de los métodos que se apliquen:

si se utilizan métodos de cribado o semicuantitativos y métodos cuantitativos, se notificará el resultado obtenido con el método cuantitativo

cuando la precisión de los dos métodos es comparable y los dos resultados están comprendidos entre los valores extremos previsibles de mediciones duplicadas, se notificará el promedio de los resultados.

Si los dos resultados exceden los valores extremos previstos, se verificará la validez de uno de ellos y se notificará el promedio de los dos resultados conformes.

3.6.5 Las operaciones necesarias para una identificación positiva dependen del criterio del analista, debiendo prestarse atención particular a la elección de un método que reduzca al mínimo los efectos de compuestos que interfieren. Las técnicas que se elijan dependerán de la disponibilidad de aparatos y conocimientos adecuados en el laboratorio de ensayo. En el Cuadro 6 se proporcionan algunos procedimientos alternativos de confirmación.

3.7 Espectrometría de masas

3.7.1 Los datos sobre residuos obtenidos mediante espectrometría de masas pueden ofrecer pruebas definitivas; cuando se dispone del equipo necesario, es la técnica de confirmación preferible. Esta técnica puede utilizarse también para el cribado de residuos. Generalmente el análisis de residuos mediante espectrometría de masas se aplica conjuntamente con una técnica cromatrográfica de separación, con el fin de obtener simultáneamente datos sobre el tiempo de retención, la relación masa/carga en los iones y la abundancia de los mismos. La técnica de separación concreta, el espectrómetro de masas, la interfaz y la variedad de plaguicidas que se han de analizar son interdependientes, por lo que no hay una combinación única que sirva para el análisis de todos los compuestos. La transmisión cuantitativa de analitos lábiles a través del sistema cromatográfico y su interfaz plantea problemas semejantes a los que se presentan con otros detectores. La confirmación más definitiva de la presencia de un residuo se consigue mediante la formación de su espectro "completo" de masas mediante ionización por impacto electrónico (en la práctica, normalmente, desde m/z50 hasta más allá de la región de iones moleculares). Al confirmar la identidad del residuo, se ha de tener especialmente en cuenta la abundancia relativa de los iones en el espectro y la ausencia de iones que interfieran. Este método de análisis es uno de los menos selectivos, por lo que deberá ponerse el máximo cuidado en evitar la interferencia de contaminantes que puedan entrar en el sistema durante la elaboración y el almacenamiento de los extractos. Los sistemas de datos de espectrometría de masas permiten la supresión de las señales de interferencia de fondo (causadas, por ejemplo, por pérdidas en la columna) mediante una "sustracción" de dichas interferencias, pero esta técnica debe emplearse con cautela. Normalmente, se puede lograr una mayor sensibilidad mediante la exploración dentro de una escala de masas delimitada o mediante el control de determinados iones, aunque cuanto menor es el número de iones controlados (sobre todo cuando su masa es pequeña) menos concluyentes son los datos obtenidos. Se puede conseguir una confirmación complementaria i) utilizando además otra columna cromatográfica; ii) utilizando otra técnica de ionización (por ejemplo

ionización química); iii) controlando otros productos de reacción de determinados iones mediante espectrometría doble de masas (EM/EM o EMn); o iv) controlando otros iones con una masa mayor de resolución. En lo que respecta a la cuantificación, los iones que se controlen deberán ser los más específicos del analito, los que sufran menos interferencias y en los que la relación señal/ruido sea buena. Las determinaciones por espectrometría de masas deberán satisfacer unos controles de calidad analítica análogos a los que se aplican a otros sistemas.

3.7.2 La confirmación de los residuos detectados tras la separación por cromatografía líquida de alto rendimiento (CLAR) suele ser más problemática con respecto a la cromatografía de gases. Si la detección se efectúa por absorción de rayos UV, la producción de un espectro completo puede proporcionar una prueba adecuada de la identidad. Sin embargo, los espectros UV de algunos plaguicidas no son muy útiles para el diagnóstico por ser análogos a los producidos por muchos otros compuestos que poseen grupos funcionales o estructuras similares, y la elución simultánea de compuestos que provocan interferencia puede determinar otros problemas. Los datos sobre la absorción UV obtenidos con diversas longitudes de onda pueden apoyar o refutar la identificación, pero en general por sí solos no son suficientemente característicos. Se pueden emplear datos de fluorescencia para apoyar los obtenidos por absorción UV. El empleo de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM) puede proporcionar datos justificativos adecuados, pero considerando que habitualmente los espectros generados son muy simples y presentan una escasa fragmentación característica es improbable que los resultados obtenidos mediante CL-EM sean definitivos. Una técnica más potente es la aplicación de CL-EM/EM, ya que combina selectividad y especificidad y a menudo ofrece pruebas adecuadas de la identidad del compuesto. Las técnicas de CL-EM tienden a estar sujetas a los efectos de las matrices, especialmente la supresión, y por consiguiente para confirmar la cantidad puede hacerse necesaria la adición de compuesto tipo o compuestos tipo marcados por isótopos. Asimismo se podrá recurrir a la derivación para confirmar los residuos detectados por CLAR (párr. 3.6.5.4).

3.7.3 En algunos casos será muy conveniente confirmar mediante cromatografía en capa fina (CCF) los resultados de la cromatografía de gases. La identificación se basa en dos criterios: valor fR y reacción de visualización. Los métodos de detección basados en bioensayos (por ejemplo con enzimas, esporas fúngicas, inhibición del cloroplasto) resultan particularmente idóneos para la confirmación cualitativa puesto que son específicos de cierto tipo de compuestos, sensibles, y normalmente son muy poco afectados por los coextractos. La literatura científica contiene numerosas referencias a esta técnica; en el informe sobre plaguicidas de la UIQPA (13) (Bátora, V., Vitorovic, S.Y., Thier, H.-P. y Klisenko, M.A.; Pure y Appl. Chem., 53, 1039-1049 (1981)) se examina la técnica en cuestión y se ofrece

una introducción adecuada a la misma. Sin embargo, los aspectos cuantitativos de la cromatografía en capa fina son limitados. Una extensión ulterior de esta técnica implica la eliminación de la superficie de la placa correspondiente al fR del compuesto de interés, seguida de elución del material de la capa y de un nuevo análisis químico o físico de confirmación. Habrá que poner siempre en la placa, junto al extracto de la muestra, gotas de una solución del plaguicida estándar para evitar problemas de no repetibilidad del fR. Echando sobre el extracto gotas del plaguicida estándar también se puede obtener información útil. Las ventajas de la cromatografía en capa fina son la rapidez, el bajo costo y la aplicabilidad a materiales sensibles al calor; las desventajas consisten en que normalmente es menos sensible que las técnicas instrumentales de detección cromatográfica y exige una purificación más eficiente cuando la detección se basa en las reacciones cromáticas de las sustancias químicas.

CONCLUSIONES DE LAS BPL

La finalidad de estas Directrices es ayudar a garantizar la fiabilidad de los resultados analíticos cuando se intenta comprobar el cumplimiento de los límites máximos de residuos en alimentos que son objeto de comercio internacional. Unos resultados analíticos fiables son Esenciales para proteger la salud de los consumidores y facilitar el comercio internacional.

Los requisitos relativos a las instalaciones, gestión, personal, garantía de calidad y control de calidad, documentación de los resultados y datos no elaborados, y temas pertinentes, que se consideran requisitos previos para obtener unos resultados fiables e identificables.

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