FARMACOGNOSIA

Extracción e Identificación de los componentes fitoquímicos de las hojas de ¨¨Morus alba¨

Heden Kurwoll Vega Segura , Katterine Rosario Gonzales Bravo, Angie Inga Balbin, y Gianmarco Lipa Huayta

LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y MEDICINA TRADICIONAL, FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA, UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Resumen: El presente trabajo de investigación tuvo el objetivo de detectar y analizar los tipos de componentes fitoquímicos (metabolitos secundarios) en el extracto macerado etanólico de las hojas de Morus alba sp, mediante la utilización del tamizaje fitoquímico el cuál se realizó por análisis colorimétrico y la presencia de precipitados generados como reacción a reactivos generales y específicos. Usando el análisis cromatográfico en papel y capa fina se detectó la presencia de 3 tipos de flavonoides (flavonoles, flavonas y isoflavonas), los cuales mostraron colores fluorescentes en el Uv por la presencia de sistemas aromáticos conjugados en su estructura; Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de la cátedra de farmacognosia y el análisis cromatógráfico se realizó en el laboratorio de química orgánica de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM). Se determinó que las hojas de Morus alba sp presentan compuestos fenólicos, aminoácidos libres y grupos aminos, flavonoides y alcaloides ,descartando la presencia de taninos, nastoquinonas, antronas y antranonas,saponinas,glicosidos y triterpenoidesMediante el análisis cromatografico se detectó y determinó la presencia de 3 tipos de flavonoides: Flavonas, isoflavonas y flavonoles y se descartó tambien la presencia de taninos. Palabras claves: Morus alba sp, Tamizaje fitoquímico, flavonoides, análisis cromatográfico

SummaryThis research aimed to identify and analyze the types of phytochemicals components (secondary metabolites) in the mash ethanol extract of the leaves of Morus alba sp, using the phytochemical screening which was performed by colorimetric analysis and the presence precipitates generated in reaction to general and specific reagents. Using the Paper-chromatographic analysis and thin layer the presence of 3 types of flavonides (flavonols, flavones and isoflavones), which showed UV fluorescent colors in the presence of aromatic systems in its structure conjugates was detected; This work was conducted in the laboratory of professor of pharmacognosy and chromatographic analysis was conducted in the laboratory of organic chemistry at the Faculty of Pharmacy and Biochemistry, National University of San Marcos (San Marcos). It was determined that Morus alba leaves sp phenolic compounds present, amino groups and free amino acids, flavonoids and alkaloids, ruling out the presence of tannins, nastoquinonas, anthrones and antranonas, saponins and triterpenoid glycosidesBy chromatographic analysis it was detected and identified the presence of three types of flavonoids: flavones, isoflavones and flavonols and also ruled out the presence of tannins.

Keywords: alba Morus sp, phytochemical screening, flavonoids, chromatographic analysis.

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I. INTRODUCCIÓN

El hombre utiliza las plantas con propósitos medicinales desde tiempos prehistóricos y aún hoy tienen un papel clave en el mantenimiento de la salud de la mayor parte de la población mundial, pese a los avances de la medicina moderna. Esto si se tienen en cuenta las diversas formas en que se utilizan, que van desde la preparación de decocciones e infusiones en zonas rurales y países pobres, pasando por los productos fitoterapéuticos, hasta la obtención de principios activos en países desarrollados para la elaboración de medicamentos. Se estima que en el mundo se utilizan cerca de 10000 especies vegetales con fines medicinales, la mayor parte en sistemas de medicina tradicional.

En los países en vías de desarrollo, donde vive el 75% de la población mundial, se consume nos del 15% del mercado total de medicamentos. Las plantas medicinales representan, por tanto, el único recurso terapéutico disponible para los sectores más desfavorecidos de esta población. Por lo anterior, las autoridades de salud a nivel mundial han aumentado considerablemente su atención a dichos medicamentos, ya que por un lado constituyen la única medicina disponible en los países en vías de desarrollo y, por otro, se han convertido en una popular alternativa en los países desarrollados.

Para determinar la composición química de las plantas medicinales y conocer sus constituyentes biológicamente activos pueden seguirse metodologías que van desde un análisis fitoquímico preliminar hasta estudios químicos sistemáticos bioguiados. Puesto que este último tipo de estudio requiere una inversión considerable de tiempo y recursos, lo ideal es iniciar con estudios fitoquímicos preliminares que permitan hacer una discriminación de las plantas a estudiar en

términos de su composición química, con el fin de seleccionar únicamente aquellas más interesantes para posteriores estudios sistemáticos. El objetivo de un estudio fitoquímico y cromatográfico es determinar la presencia o ausencia de los principales grupos de metabolitos en una especie vegetal, a saber: alcaloides, antraquinonas y naftoquinonas, flavonoides, taninos, compuestos fenólicos, carbohidratos, aminoácidos libres y grupos aminos. Dado que cada uno de estos grupos de compuestos está relacionado con actividades biológicas específicas, partiendo de los resultados obtenidos en el estudio fitoquímico preliminar es posible orientar investigaciones posteriores para determinar la actividad biológica de las especies en cuestión y los principios activos involucrados. (Carbajal, 2009)

Objetivo: Determinar los tipos de compuestos fitoquímicos (metabolitos secundarios) en las hojas de Morus alba realizando una tamizaje fitoquímico y mediante el análisis cromatográfico.

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II. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales del laboratorio

Pera de decantacion 250mL Capilares de siembra Cuba cromatografía. Papel Whatman N°1 (11cm × 30cm)

Material biológico:

Hojas de Morus alba sp.

Reactivos:

Molish A + H2SO4

FeCl3 Antrona Gelatina Ninhidrina Dragendorf Mg Metálico + HCl Borntrager Vainillin Lieberman Agua purificada Sistemas solvente fase movil BAW

(n-butanol, ácido acético, agua; 4, 1,5) Hidróxido de Amonio

Equipos Lámpara de luz uv. Secadora de cabello

MÉTODO

Manual de laboratorio de Farmacognosia I (Gorriti 2015)

ANÁLISIS CUALITATIVO

a. Preparación de extracto.

Procesamiento de la muestraSe realizó la reducción del tamaño de partículas de las hojas secas de Mora alba sp. Usando un molino casero, seguidamente se hizo pasar por un tamiz Nº30.

Maceración

En un frasco ámbar con tapa se agregó 40g del material molido y 375mL de alcohol 96º, se agito y se conservó.

b. Tamizaje Fitoquímico:

Reacción con Molish: Agregar 1mL de extracto, luego seguir con V gotas de reactivo Molish y finalizar agregando gotas de ácido sulfúrico concentrado para reconocer carbohidratos.

Reacción con Antrona: Agregar 1mL de extracto en un tubo de ensayo luego seguir con V gotas de reactivo de Antrona más III gotas de ácido sulfúrico concentrado para reconocimiento de carbohidratos.

Reacción con FeCl3: Agregar 1mL de extracto en un tubo de ensayo, luego se procede a agregar III gotas de FeCl3 para la identificación de compuestos fenólicos.

Reacción con Ninhidrina: Agregar 1mL de extracto a un tubo de ensayo y luego III gotas de Ninhidrina para reconocer aminoácidos libres y grupos amino.

Reacción con Gelatina: Agregar 1mL de extracto en un tubo de ensayo, luego se procede a agregar III gotas de Gelatina para la identificación de taninos. Observar la formación de precipitado.

Reacción con Shinoda: Agregar 1mL de extracto en un tubo d ensayo luego agregar virutas de magnesio y continuar con ácido clorhídrico concentrado en zona para identificar flavonoides.

Reacción con Lieberman: Agregar 1mL de extracto a un tubo de ensayo luego 1mL de cloroformo y finalizar agregando el reactivo de Lieberman para reconocer triterpenoides o esteroides.

Reacción con Borntrager: Agregar 1mLde extracto y 1mL de reactivo borntrager para reconocer naftoquinonas, antronas y antranonas.

Reacción con Dragendorff: Agregar 1 mL de extracto en un tubo de ensayo, luego se

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procede a agregar III gotas de Dragendorff para reconocer alcaloides.

Reacción de espuma: Agregar 1mLde extracto en un tubo y luego 10mLde H2O y agitar para identificar saponinas.

Reacción de Vainillina: Agregar 1mLde extracto a un tubo luego III gotas de reactivo vainillina y continuar con la adición de X gotas de ácido sulfúrico para identificar glucósidos.

TÉCNICA CROMATOGRÁFICO

Método: Olga lock 1994 (investigación fitoquímica)-Damián Maestri (técnicas cromatográficas)

CROMATOGRAFÍAS EN PAPEL DESCENDENTE.

Procedimiento:

Siembra: La muestra del extracto alcohólico de Morus alba se coloca unas 45 aplicaciones en unos de los extremos del papel Whatman, con la ayuda de capilares de punta ancha.

Colocación en la cuba cromatográfica: Los disolventes de corrida (BAW) debe estar anhidro, colocar el extremo en el cual se sembró en las canaletes de la cuba.

Desarrollo: El desarrollo se lleva a a cabo por 15 horas, el extremo sembrado es expuesto al disolvente, estos penetran, solubilizan y arrastran la muestra separando según la afinidad entre los disolventes y la muestra. Los componentes más solubles en la fase móvil migran a mayor velocidad que los menos solubles, que quedaran retardados en la fase estacionaria.

Revelado en lámpara Uv: Luego de la separación, la detección de los tipos de flavonoides puede hacerse por el color que desarrollen en la lámpara UV debido a la propiedad de fluorecer en el, los cuales aparecen como una especie de manchas fluorescentes azules, rosadas, naranjas, purpuras y otras, los cuales se intensifican o

cambia de color si se las exponen a vapores de amoniaco.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Fase Móvil: BAW (Butanol, ácido acético y agua)

Fase Estacionario: Silica Gel

Siembra: Se hizo tres puntos de siembra, El primer punto se sembró 8 veces el estándar de quercetina, en el segundo punto se sembró 8 vece estándar de ácido gálico y en el tercer punto se sembró 15 veces el extracto alcohólico de Morus alba.

Desarrollo: Se colocó en una cuba cromatografía y se esperó hasta que el solvente llegue a frente de solvente, se retiró la placa cromatografía y se dejó secar al ambiente para posteriormente revelarlo.

Revelado en Lampara Uv: Unas vez secado al ambiente el cromatograma, se visualiza en la lampara Uv y revelar con FeCl y por ultimo se determinó el Rf.

III. RESULTADOS

Tamizaje fitoquímico:

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Tabla 1: Análisis fitoquímico en extracto alcohólico de hojas de Morus alba sp.

Leyenda: -(Ausencia),+ (Trazas), ++ (Positivo), +++ (Abundante)

Pp.: Precipitado

En la Fig.1 se puede observar las distintas coloraciones que dio el extracto alcohólico de la hoja de Morus alba sp. Cuando se la sometió a reacciones características para identificación de diferentes metabolitos, y según los resultados obtenidos se observa en mayor proporción la presencia de compuestos fenólicos, aminoácidos libres, grupos aminos y alcaloides, además de ausencia de carbohidratos, taninos, saponinas, glicosidos y triterpenoides.

Cromatografía en papel descendente

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Fig.1: Observación de resultados del tamizaje fitoquímico. A) Blanco, B) Reacción de Molish, C) Reacción con Antrona, D) Reacción con FeCl3, E) Reacción con gelatina, F) Reacción con Ninhidrina, G) Reacción con Shinoda, H) Reacción de Lieberman, I) Reacción con Borntrager, J) Reacción con Dragendorff,

Fig.2: En el revelado Uv, se pudo comprobar la presencia de compuestos fenólicos, debido a que estos compuestos presentan intensa absorción en la región ultravioleta debido a la presencia de sistemas aromáticos conjugados, para determinar los tipos de flavonoides se intensificó el color con vapores de amoniaco.

En la figura M se puede observar en el revelado en la lámpara Uv que la muestra corrida de Morus alba desarrolla 3 bandas, donde la banda central tiene fluorescencia de color celeste y tenuemente se puede observar que la banda superior y la banda inferior presente coloración amarilla-verdosa; En la figura N se intensificó los colores con vapores de amoniaco, después de ello si se pudo visualizar claramente que efectivamente eran 3 bandas y la coloración inicial se mantuvo.

Interpretación:

Según Olga lock 1994(análisis fitoquímico) menciona que las coloraciones tienen una relación con la posible estructura del flavonoide.

COLOR DE LA MANCHA A LA LUZ

UV

Posible tipo de flavonoide

sin NH 3 con NH 3

Celeste fluorescent

e

Sin cambio

Flavonas y flavanonas sin 5-

OH libreAmarillo-verdosa

Sin cambio

Flavonol con un 3-OH .

Cromatografía en capa fina

En la Fig3.En esta cromatografía se realizó 3 puntos de siembra:

Siembra 1 estándar: QuercetinaSiembra 2 estándar: Acido gálicoSiembra 3: Extracto alcohólico de Morus alba.Después de terminar el desarrollo se pudo observar que mostró también fosforescencia en el Uv el recorrido del extracto, también se pudo hallar observar M- sin NH 3

Reactivo Metabolitos Respuesta positiva

Rpta. MP

Molish A + H2SO4

Carbohidratos Anillo Violeta

-

Antrona carbohidratos Verde-azul

+

FeCl3 Compuestos Fenólicos

Verde o Azul

+++

Gelatina Taninos Pp. Blanco

-

Ninhidrina Aminoácidos libres y

grupos aminos

Violáceo +++

Shinoda Flavonoides Rojo ++

Borntrager Nastoquinonas, antronas y antranonas

Rojo -

Dragendorff Alcaloides Pp. naranja

+++

Espuma Saponinas Espuma -Vainillin Glicosidos Azul -Lieberman Triterpenoides rojizo -

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FIG.3 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Interpretación:

Rf Quercetina: 1.1

Rf muestra problema: 1.1

Rf:acido gálico:1.3

Con estos resultados podemos decir que nuestros extractos efectivamente presenta flavoides del tipo de flavonoles (quercetina) y se comprueba la ausencia de taninos, por la diferente rf que presenta el ácido gálico y coraborando el resultado negativo para taninos con geltina realizado en el análisis cualitativo.

IV. DISCUSION

La elaboración del extracto hidroalcohólico de hojas de Morus alba sp. comprendió una marcha fitoquímica la cual revelo la presencia de compuestos fenólicos, aminoácidos libres, grupos aminos, alcaloides, flavonoides y carbohidratos en menor proporción. Según (Chae et al., 2004), plantea que esta planta contiene una amplia variedad de moléculas con la capacidad de eliminar las especies reactivas del oxígeno, tales como fenoles, flavonoides, vitaminas y terpenos que presentan una elevada actividad antioxidante

adjudicándole las propiedades farmacológicas que presenta. En el estudio fitoquímico de diferentes variedades de las hojas de morera, recolectadas en la Estación Experimental de Pastos y Forrajes “Indio Hatuey”, encontraron cantidades considerables de triterpenos y esterioides, así como fenoles y taninos en los extractos evaluados, mientras que no fueron detectados quinonas ni alcaloides.(Cazaña et al., 2010), Además estudios de García et al., 2002 han detectados diversos tipos de metabolitos secundarios con elevada actividad biológica, entre los que se destacan los fenoles, flavonoides, cumarinas, esteroides, saponinas y alcaloides, con ausencia de taninos que precipitan proteínas, al menos en las hojas de Morus alba. Por otra parte, la concentración de los fenoles totales, en sentido general, oscila entre 0,85 %MS en las hojas y los flavonoides constituyen el grupo químico de mayor interés biológico; estos representan más de la mitad de los fenoles totales y los niveles se encuentran entre 1,17 y 2,66 %MS (Medina et al., 2009).

Durante el tamizaje fitoquimico al usar el reactivo de antrona en el extracto alholico de las hojas de Morus alba se observó un cambio de coloración verde-azulado debido a que ,La reacción de color para medir la concentración de carbohidratos solubles se basa en la utilización de un compuesto llamado antrona que se disuelve en ácido sulfúrico concentrado. El medio ácido hidroliza el enlace glicosídico de los oligosacáridos y los monosacáridos resultantes reaccionan con la antrona (estructura al margen) produciendo un color verde – azulado ( Mendez 2008),dando asi positivo para esta reacción.

Según estudios reportan la presencia cuantiosa de carbohidratos en las hojas de Morus alba, ya que detectaron en forma cuantiosa, de acuerdo con el contenido energético reportado en la especie y la elevada concentración de sacáridos en sus extractos alcohólicos (Fujun 1995; Jun

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Fig.1: Observación de resultados del tamizaje fitoquímico. A) Blanco, B) Reacción de Molish, C) Reacción con Antrona, D) Reacción con FeCl3, E) Reacción con gelatina, F) Reacción con Ninhidrina, G) Reacción con Shinoda, H) Reacción de Lieberman, I) Reacción con Borntrager, J) Reacción con Dragendorff,

En la figura M se puede observar en el revelado en la lámpara Uv que la muestra corrida de Morus alba desarrolla 3 bandas, donde la banda central tiene fluorescencia de color celeste y tenuemente se puede observar que la banda superior y la banda inferior presente coloración amarilla-verdosa; En la figura N se intensificó los colores con vapores de amoniaco, después de ello si se pudo visualizar claramente que efectivamente eran 3 bandas y la coloración inicial se mantuvo.

Interpretación:

Según Olga lock 1994(análisis fitoquímico) menciona que las coloraciones tienen una relación con la posible estructura del flavonoide.

COLOR DE LA MANCHA A LA LUZ

UV

Posible tipo de flavonoide

sin NH 3 con NH 3

Celeste fluorescent

e

Sin cambio

Flavonas y flavanonas sin 5-

OH libreAmarillo-verdosa

Sin cambio

Flavonol con un 3-OH .

Cromatografía en capa fina

En la Fig3.En esta cromatografía se realizó 3 puntos de siembra:

Siembra 1 estándar: QuercetinaSiembra 2 estándar: Acido gálicoSiembra 3: Extracto alcohólico de Morus alba.Después de terminar el desarrollo se pudo observar que mostró también fosforescencia en el Uv el recorrido del extracto, también se pudo hallar observar

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2000).No encontrando diferencias muy marcadas entre las épocas, las variedades y las frecuencias de defoliación. En cuatro variedades de Morus sp (cubana, indonesia, Tigreada y Acorazonada) el contenido de carbohidratos presento valores que oscilaron entre 10.40 y 16.45%(Garcia 2005); resultados numéricos similares fueron informados por ( Ojeda 2000).

La reacción de cloruro férrico fue positiva lo que significa que existe la presencia de taninos y metabolitos fenolados, esta reacción señala el carácter fenólico, siendo soluble en agua, álcalis diluidos, alcohol, acetona y glicerina. En nuestro caso dio una coloración azul- negruzca lo que significa que son taninos hidrolizables (gálico). Una de sus propiedades farmacológicas es su capacidad para formar complejos con varias sustancias, además de tener actividad antioxidante (Sena 2002 y Ganosa 2000).

La reacción del grupo amino con ninhidrina, es quizás la más empleada en el reconocimiento y determinación de aminoácidos. En esta reacción, cada equivalente de aminoácidos consume dos equivalentes de ninhidrina. El primer equivalente sirve para oxidar el aminoácido. El segundo reacciona con el NH3 y la ninhidrina reducida (hidridaintina) formados en la reacción anterior para dar un compuesto coloreado púrpura característico (Murray 2005 y Mangiaterra 2005).

En la reacción de Shinoda, el magnesio metálico es oxidado por el HCl concentrado, dando como productos al H2, que es eliminado en forma de gas y el MgCl2, que es el que forma complejos con los flavonoides dando coloraciones características. El magnesio divalente intensifica la coloración por estar doblemente coordinado.

La identificación de alcaloides se realizó mediante reacciones de coloración y precipitación con Draggendorff, la reaccion de

precipitación se basan en un intercambio; que normalmente el anión voluminoso del reactivo en acción reemplaza a los aniones pequeños de las sales de alcaloides.

El resto de los compuestos investigados resultaron negativas para taninos, saponinas, nastoquinonas, antronas, antranonas, glucósidos y triterpenoides.La ausencia de taninos que precipitan proteínas, corroborada en este experimento y que apoya lo expresado por García, Ojeda y Pérez (2002) con la utilización de gelatina como proteína para inducir la precipitación, coincide según con los resultados de pruebas realizadas por Doroteo (2013) al emplear BSA como proteína precipitante.

La prueba para saponinas no resultó concluyente para poder aseverar la presencia de estos compuestos, ya que el principio del método consiste solamente en la disminución de la tensión superficial del medio, por lo que otros compuestos con propiedades estructurales similares en la planta, como mucílagos y glicósidos esteroidales, pudieron crear falsos positivos al respecto. El extracto ensayado no mostro alturas relativas de la espuma entre 10-14 mm,equivalente a contenidos moderados de este metabolito.

Detecciones positivas en M. alba han sido realizadas por Domínguez (2001), y negativas por Maldonado (2000).

Las técnicas cromatografícas usadas para la detección o separación de flavonoides de un extracto de planta son muy variadas, La cromatografía en papel es la técnica más antigua y aún usada desde su introducción en 1948 por Bate Smith, se utiizan sistemas de solventes como BAW(N-buOH: HOAc: H 2O: 4:1:5 fase superior), TBA(T-BuOH: HOAc :H 2O, 30: 10: 3 ) , CAW (CHcl3: HOAc: H 2O

:30:15:2);La detección en ambas cromatografías ,de papel y de capa delgada ,puede hacerse por el color que desarrollan en el vis o en el Uv apareciendo

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como manchas fluorescentes azules, rosadas ,naranjas purpuras y otras;las cuales se intensifican o cambian de color luego de su exposición a vapores de amoniaco .Geissman y Markham reportan la relación que existe entre los colores y la posibles estructura del falvonoide. (lock,1994)

Según (Memón, 2010), Las hojas del Morus alba son una fuente rica de sustancias (poli) fenólicos, incluyendo ácidos fenólicos y flavonoides tales como el ácido cafeico, ácidos caffeoylquinic, kaempferol-3- O - (6-malonil) glucósido, quercetina-3- O - (6-malonil) glucósido, y la quercetina-3- O glucósido. Enkhmaa , 2005 también menciona que Algunos glucósidos de flavonol se han identificado en M. alba L. hojas tales como componentes antioxidantes, incluyendo rutina, isoquercitrina, astragalin y quercetina-3- (6-malonil) glucósido informaron de la quercetina-3- (6-malonil) glucósido como el componente más abundante, en el extracto de hoja de morera seca, que atenúa desarrollo de la lesión aterosclerótica en LDL receptor-ratones deficientes ( Enkhmaa et al., 2005 ).

Para la detección de flavonoides se realizó cromatografía en papel descendente y cromatografía en capa fina, utilizando como fase móvil el BAW, y efectivamente al revelado en el Uv presento la fluorescencia característica y según el color los posibles identificados podrían ser 3 tipos de flavonides:Flavonas; flavanonas e isoflavononas.

V. CONCLUSIONES

En el extracto alcohólico de hojas de Morus alba sp se evidencia la presencia de

compuestos fenólicos, aminoácidos libres, grupos aminos, alcaloides y flavonoides, descartando la presencia de taninos, nastoquinonas, antronas y antranonas, saponinas, glicosidos y triterpenoides

En la cromatografía de papel sé detectó y determinó la presencia de 3 tipos de flavonoide: Flavonas, isoflavonas y flavonoles; siendo la quercetina uno de los flavonoles identificados en la cromatografía de capa fina.

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