Aminoácidos.

Los aminoácidos constituyen el alfabeto de la estructura proteica y determinan muchas de las propiedades importantes delas proteínas. El primer aminoácido aislado de un hidroizado de proteína fue la la glicocola, obtenida en 1820 apartir de las gelatina por Braconnot, el descubrimiento más reciente fue el de la treonina, aislada por primera vez por W.C. Rose , en 1935 de un hidrolizado de la fibrina.

La estructura general de los 20 alfa-aminoácidos hallados corrientemente en las proteínas tienes una estructura o denominadores comunes un grupo carboxilo libre y un grupo amino libre instituido en el carbono alfa. Difieren entre sí en las estructura de sus cadenas laterales distintas, llamadas grupos R. Figura 1. Excepto la prolina ya que se trata del único aminoácido proteinogénico cuya amina es una amina secundaria en lugar de una amina primaria. La prolina en realidad es un aminoácido, pues su cadena lateral es cíclica y está compuesta por 3 unidades de metileno; estos quedan unidos al carbono alfa y al grupo amino, el cual pasa a llamarse imino.

Figura 1

Clasificación según la polaridad del grupo R:

Aminoácidos con grupo R no polares o hidrofóbicas

Alanina, leusina, isoleusina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Como grupos estos aminoácidos son menos solubles en agua que los aminoácidos con grupos R polares.

Aminoácidos con grupo R polares sin carga.

Serina, treonina, tirosina, asparagina, glutamina, cisteína, glicocola. Estos aminoácidos son relativamente solubles en agua que los aminoácidos con grupo R no polares.

Aminoácidos con grupo R cargados positivamente.

Lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos básicos en los que los grupos R poseen carga positiva neta de pH 7 poseen todos seis átomos de carbono.

Aminoácidos con grupo R cargados negativamente.

Ácido Aspártico y glutámico. Lo cuales posee un segundo grupo carboxilo que se halla completamente ionizado y, por tanto, cargado negativamente a pH 6 a 7.

Cromatografía.

El uso de la cromatografía en papel para la separación e identificación de aminoácidos es de gran importancia desde que fue introducida por Martin1 en 1944, la fase móvil empleada generalmente es una mezcla de n‐butanol/ácido acético/agua o dilución acuosa de fenol (polar y ácida), estas combinaciones de fases móviles poseen densidad mayor

que otros sistemas de solventes y requiere de por lo menos de 2 a 3 horas para que el frente del solvente alcance una distancia prudente en una placa relativamente larga.

La cromatografía en papel es un tipo de Cromatografía de Reparto, en donde los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción.

La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno se denomina reparto.

En la cromatografía de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón, celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio, etcétera. Aunque en teoría se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá también, en parte, debido a la interacción entre las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como fuerza de frenado.

La cromatografía se fundamenta en que las sustancias problema, pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos de cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de separación de zonas y sectores. Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas manchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una lámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en cromatografía sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S).𝑅𝑓=𝑋𝑆

En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los componentes que se pretenden separar.

Método colorimétrico

Después de hacer una cromatografía se necesita un revelador para saberla posición final a la que llego el analito, por ello entran los métodos colorimétricos de determinación de aminoácidos que se basan en la reacción específica de éstos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formación de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no está presente. Para cada prueba se utilizará un control

negativo, también denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de determinación de aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina) que reaciona con todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre. Debido a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica, aparentemente debido a una oxidación y reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo.

Conceptos:

Aminoácidos: Los aminoácidos son compuestos orgánicos que se combinan para formar proteínas. Los aminoácidos y las proteínas son los pilares fundamentales de la vida.

Cromatografía: es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

Fases de la cromatografía:

En la fase estática o estacionaria, la mezcla se coloca sobre un soporte fijo, por ejemplo papel. En esta fase tenemos ya la mezcla sobre un soporte, en nuestro ejemplo un papel.

En la fase móvil se hace mover otra sustancia sobre la mezcla que ya está sobre el soporte de la fase estática, por ejemplo un líquido que se mueve por el papel con la mezcla. En la fase móvil empezará el proceso de separación de los componentes de la mezcla al moverse a distintas velocidades por el líquido los distintos componentes de la mezcla sobre el papel.

Polaridad: por su parte, se advierte cuando las cargas eléctricas de una molécula se separan. Cuando la molécula se forma a partir de un enlace covalente, los electrones se movilizan hacia la zona de electronegatividad más importante. A partir de entonces se desarrolla el dipolo eléctrico por las diferencias en la densidad de carga de los núcleos que componen el enlace en cuestión.

Ninhidrina: es un poderoso agente reactivo común para observar (Castro, J. 1990) las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos.

Inmiscible: Dicho de una sustancia, que no se disuelve, que queda en fases separadas o formando una suspensión.

Cuestionario:

¿En qué orden migran los aminoácidos de los diferentes grupos?

Los aminoacidos con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ileu, Fen, Trip, Val, Met, Tir) migran más que que aquellos con cadenas laterales mas cortas no polares (Pro, Ala, Gli) o con cadenas laterales polares (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis). Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las moléculas polares en la fase estacionaria hidrofílica, y de las moléculas no polares en solventes orgánicos.

¿Es la nihidrina un revelador selectivo?

Si, por que reacciona con un grupo anino o amoniaco, ya que da una tonalidad de azul a purpura llamado purpura de Ruhermann.

¿Cómo se calcula en Rf?

El Rf se calcula de la siguiente manera:

Rf= distancia recorrida por el producto/distancia recorrida por la fase movil