Producido por Neogen Corp (www.neogen.com). Empresa norteamericana con acreditacin ISO 9001: 2000 .

El mismo fabricante de los kits VERATOX histamina y REVEAL histamina.

AHORA no necesita ser un experto en Laboratorio para detectar en forma muy rpida y segura Histamina en pescado y conservas.

VENTAJAS.

Bajo costo de implementacin . Puede trabajar en el mismo periodo de tiempo 1 o muchas muestras. Bajo costo por muestra eva-luada. 1 pozo le cuesta 3.6 dlares + IGV

Resultado visual: si el pozo da color azul, el nivel de histamina esta por debajo de lo especificado. Si el pozo da color rojizo, el nivel de histamina est por encima de lo especificado.

TOTALMENTE VALIDADO

FDA 2001 . Presentation on October 26,2001, 4th World Fish Inspection & Quality Control Congress, Vancouver, B.C. Perfor-mance of Histamine Test Kits for Applications to Seafood. Walter F. Staruszkiewicz and Patricia L. Rogers, Ph.D. Washington Seafood Laboratory, Office of Seafood, FDA, Laurel, MD. http://seafood.ucdavis.edu/ORGANIZE/wstar2rtf.rtf..

FDA 2003 Performance of Histamine Test Kits for Applications to Seafood. P. L. Rogers, Ph.D., is Chemist and W. F. Staruszkiewicz is Research Chemist, US Food & Drug Administration, 200 C St. S.W., Washington, D.C. 20204

http://seafood.ucdavis.edu/pubs/histamine.htm

El Seafood Network le reconoce la capacidad de detectar cifras tan bajas como 2 ppm de histamina. (Revise y compare ).

http://seafood.ucdavis.edu/haccp/compendium/chapt27.htm

COMPONENTES DEL KIT

288 micropozos desglosables recubiertos con anticuerpos y 288 micropozos desglosa-bles para mezclado con marca roja . (ambos puestos en 6 sobres metlicos de bordes resellables ).

12 frascos con control de Histamina. Etiqueta amarilla. 02 frascos de solucin de Conju-gado. Etiqueta azul. 2 frasco de solucin de Substrato K-Blue. Etiqueta verde. 2 frascos de solucin stop. Etiqueta roja. 6 sobres conteniendo polvo Buffer diluente de muestra (sample diluent ). 2 sobres conteniendo polvo Buffer de lavado concentrado (Wash buffer )

El referente del Kit ALERT HISTAMINA siempre genera un tono de color ligeramente azulado o lila , y por ello solo debe cambiar la

manera como se realiza la dilucin de la muestra para determinar diferentes cifras de histamina. En el kit ALERT BULK de 288

pozos el control y el inserto del kit est escrito para 15 ppm. En el kit ALERT de 24 pozos el control y el inserto del kit est escrito

para 50 ppm. Solo siga las instrucciones dadas en la segunda pagina de este documento para detectar cifras diferentes

de histamina.

METODO DE TRABAJO. PREPARACION DE LA MUESTRA.

Peces histamnicos grandes: La seccin anterior y baja del lomo es la mas representativa ( FDA . Fish and Fishery Products Hazards and

Controls Guidance. Fourth Edition April 2011)

Atn enlatado (Conserva de pescado). AOAC937.07b: Coloque todo el contenido de la lata, tanto la carne como el lquido, en la mezcla-

dora. Mezcle hasta que adquiera una consistencia homognea. Almacene las muestras a una temperatura de 2 a 8 C hasta su rpido

anlisis.

Nota: La norma FDA anterior indicaba tomar 3 pedazos de tejido como representativo de 1 pez.

Peces histaminicos AOAC 937.07: Limpie y eviscere tres pescados. Haga tres cortes transversales de 2,5 cm (1 pulgada) de grosor: uno

detrs de las aletas pectorales, otro a la mitad del orificio de respiracin y el tercero detrs del orificio de respiracin. Retire los huesos

de las rebanadas, mezcle o muela o corte muy finamente las muestras combinadas hasta que sean homogneas. Almacene las mues-

tras a una temperatura de 2 a 8 C hasta su rpido anlisis.

Siempre consulte con el Inspector Sanipez que visite su planta en cuanto a la toma de muestra y el equipamiento necesario para pro-

cesarla

1. PASOS PREVIOS

Diluyente de muestra: En un frasco de 1 litro, limpio y etiquetado, agregue el contenido de 1 sobre Sample Diluent ( diluente de muestra ) y compltelo hacia 1 litro con agua destilada. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente por 6 meses. Si requiere mas prepare otro sobre.

Buffer de lavado. En un frasco de 1 litro, limpio con tapa, agregue el contenido de 1 frasco o 1 sobre Wash Buffer ( Buffer de lava-do ) compltelo hacia 1 litro con agua destilada. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente por 6 meses.

Por seguridad es conveniente que divida su kit en 2 kits completos: En una bolsa plstica etiquetada como A coloque 3 sobres metlicos conteniendo micropozos, 6 frascos control de histamina, 1 frasco conjugado, 3 sobres con buffer Sample Diluent, 1 frasco o 1 sobre wash buffer, 1 frasco substrato y 1 frasco solucin stop. En una bolsa plstica etiquetada como B coloque las mismas canti-dades. Use primero el kit A , lo que le permitir no exponer a accidentes imprevistos a los reactivos del kit B

2. DEFINIR EL NIVEL DE HISTAMINA A DETECTAR

Como pautas puedo indicarle:

Puede elegir cifras como 15 ppm o inferiores si desea conocer si la materia prima es fresca. Si utiliza muestras composito eva-

le a 15 ppm para conocer si la muestra cumple o no con el tope composito FDA de 17 ppm.

Puede elegir 50 ppm si desea determinar si la muestra ya ha producido niveles significativos de histamina y si se ha excedido o

no sobre el tope FDA para anlisis de muestra individual

Use proporciones para determinar cifras mayores

Agua es agua destilada o Agua San Luis sin gas o similar. No usar agua de cao o agua desionizada de pH acido o agua destilada

para batera. Si usa el agua incorrecta tendr resultados anormalmente altos. Despus de cualquier dilucin de lquidos no olvide

mezclar mediante suave agitacin.

Harinas. Debido a que este producto, la histamina esta fuertemente ligada , debe agitar continuamente por un mnimo de 15 minu-

tos. Consulte por el procedimiento alterno con Isopropanol y agitando por 3 minutos

CIFRA HISTAMI-NA

Muestra representativa y homogenizada puesta en bolsa o frasco plstico

Agua a adicionar

Mezclado y filtrado

Dilucin del extracto filtrado

5 ppm 10 gr. 90 ml SI Adicionar 500 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de muestra

10 ppm 10 gr. 77 ml SI Adicionar 100 ul al frasco con 5 ml buffer diluente de muestra

15 ppm 10 gr. 115 ml SI Adicionar 100 ul al frasco con 5 ml de buffer diluente de muestra

20 ppm 10 gr. 154 ml SI Adicionar 100 ul al frasco con 5 ml de buffer diluente de muestra

40 ppm 10 gr. 154 ml SI Adicionar 100 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de muestra

50 ppm 10 gr. 190 ml SI Adicionar 100 ul al frasco con10 ml de buffer diluente de muestra

CIFRA HIS-TAMINA

Muestra representativa y homogenizada puesta en bolsa o frasco plstico

Agua a adicio-nar

Mezclado y filtrado Dilucin del extracto filtrado

100 ppm

10 gr. 190 ml SI. Luego colocar en un vasito 1 ml de filtrado con 1 ml de agua

Adicionar 100 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de muestra

200 ppm 10 gr. 190 ml SI. Luego colocar en un vasito 1 ml de filtrado con 3 ml de agua.

Adicionar 100 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de muestra

300 ppm 10 gr. 190 ml SI. Luego colocar en un vasito 1 ml de filtrado con 5 ml de agua.

Adicionar 100 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de muestra

PREPARACIN DEL EXTRACTO FILTRADO

3. USO DEL KIT ALERT

1) En la placa portapozos, colocar pozos de mezclado (rojos) de acuerdo a este esquema: 1 pozo para el referente hista-mina (frasco de color amarillo ) y 1 pozo por cada muestra a evaluar. Coloque el mismo nmero de pozos con anticuerpos (blancos). 2) Usando 1 sola punta de pipeta, adicione 100 ul de Conjugado (frasco azul) a todos los pozos rojos que ha separado

3) Usando 1 nueva punta de pipeta adicione 100 ul del referente histamina (frasco de color amarillo ) al fondo del primer pozo rojo. Con esa misma punta mezcle el contenido 3 veces (aspirar y botar suavemen-te). 4) Usando una nueva punta por cada muestra, adicione 100 ul de extracto filtrado y diluido puesto al fondo de su correspondiente pozo rojo. (En este caso es el segundo pozo). Con esa misma punta mezcle el contenido 3 veces (aspirar y botar suavemente). Si hay otras muestras contine de la misma forma. 5) Sea con puntas nuevas o usando la punta especfica de cada pozo transfiera 100 ul del pozo rojo a su correspondiente pozo blanco. (No se olvide cada muestra es una punta nueva). 6) Al completar la transferencia del pozo rojo a su correspondiente pozo blanco agitar suavemente por deslizamiento en superficie plana por 20 segundos. Retire y elimine los pozos rojos. 7) Incubar por 10 minutos los pozos blancos. (Guardar los pozos en oscuridad por 10 minutos).

Pese 10 gr de muestra homogenizada y adicione agua destilada conforme el nivel de histamina a detectar.

1. Si est evaluando 1 o pocas muestras agite rpidamente el o los frascos con la mezcla en forma continua durante 2 minutos o

mas. Esperar a que aparezca sobrenadante. Filtrar solo el sobrenadante

2. O s esta evaluando muchas muestras a la vez use este mtodo , el cual le permite trabajar muchos frascos a la vez en forma

manual

Ponga el timer o cronometro a 5 minutos. Agitar vigorosamente por 20 segundos cada uno de los frascos. Si le queda tiempo espere a

que se complete los 5 minutos. Comenzar a agitar nuevamente cada uno de los frascos por 20 segundos. Esperar a que se comple-

ten los 5 minutos. Comenzar a agitar nuevamente cada uno de los frascos por 20 segundos. Esperar hasta que observe que se ha

producido sobrenadante. Filtrar solo el sobrenadante..

Si usa licuadora o un equipo agitador para frascos, el tiempo total de agitacin es 1 minuto. Esperar a que

aparezca sobrenadante. Filtrar solo el sobrenadante

Use las jeringas con filtro. Saque el embolo de la jeringa y agregue solo el sobrenadante. No llene mas de

2/3 partes. Vuelva a colocar el embolo para pasar extracto filtrado hacia un tubo con tapa ( puede usar los

que vienen en el kit de extraccin ) . Tambin puede filtrar usando embudo y papel de filtracin rpida.

Si no conoce como fabricar jeringas con filtro consltenos.

Una vez que obtenga su extracto filtrado, usando la pipeta y 1 punta nueva por cada muestra, retire 100 ul de lquido y colquelos

en un frasco con buffer diluente de muestra (5 o 10 ml de liquido. Agitar por unos segundos para mezclar.

8) LAVADO: Despus de la incubacin, botar todo el contenido de los pozos. Golpee enrgicamente los pozos sobre papel toalla puesto en la palma de la mano para eliminar residuos lquidos. Usando el dispensa-dor que viene con el kit llenar los pozos con el Buffer de lavado. Botar el lquido. Repetir 3 veces ms. Despus de botar la ltima solucin de lavado, golpee rpida y enrgicamente los pozos sobre papel toalla para eliminar residuos lquidos

9) Usando 1 nueva punta de pipeta por cada pozo, adicionar 100 ul de Substrato (frasco verde) a todos los pozos. (Puesto al fondo de cada pozo). Agitar por deslizamiento en superficie plana por 20 segundos

Este reactivo permite la visualizacin de la histamina. A este frasco nunca debe ingresar puntas de pipeta que hayan tenido contacto previo con otros reactivos.

10.)Incubar por 10 minutos pero en oscuridad.

11) Usando 1 nueva punta de pipeta por cada pozo adicionar 100 ul de Solucin stop (frasco rojo) a todos los pozos. Usando la misma punta mezclar 1 vez para uniformizar tono de color. Agitar por deslizamiento en superficie plana por 20 segundos. Hacer Lectura.

Si hace lectura visual, ponga los pozos encima de un papel blanco (para ver mejor los colores) y haga lectura mirando de arriba hacia abajo.

EL POZO CON EL REFERENTE DE HISTAMINA DA UN COLOR LILA

MIENTRAS MS AZUL ES EL POZO MUESTRA - ES HISTAMINA POR DEBAJO.

MIENTRAS MS ROJO ES EL POZO MUESTRA - ES HISTAMINA POR ENCIMA.

Ejemplo: Muestra corrida a 10 ppm. Ejemplo: Muestra corrida a 15 ppm

La muestra es ms azul y por ello tiene menos de 10 ppm. La Muestra es ms roja y por ello tiene ms de 15 ppm.

AL TERMINO DEL TRABAJO REGRESE EL KIT A REFRIGERACION. MIENTRAS MENOS STRESS TERMICO MAYOR TIEMPO DE VIDA UTIL.

Puede consultarnos al Nextel 826*4264. Recuerde saber usar el kit es lo ms importante.

Dr. Juan Carlos Flores N.

MULTIVET SRL