AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS...
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Programa de Estudios de Posgrado AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS ASOCIADOS A ONCOIDES DE MANANTIALES HIDROTERMALES DE SANTISPAC, BAHÍA CONCEPCIÓN, B.C.S., MÉXICO. TESIS Que para obtener el grado de Maestra en Ciencias Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales P r e s e n t a La Paz, Baja California Sur, diciembre de 2016. ( Orientación en Biotecnología ) Priscila Gallut Rubio
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Programa de Estudios de Posgrado
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS ASOCIADOS A ONCOIDES
DE MANANTIALES HIDROTERMALES DESANTISPAC, BAHÍA CONCEPCIÓN, B.C.S.,
MÉXICO.
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestra en Ciencias
Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales
P r e s e n t a
La Paz, Baja California Sur, diciembre de 2016.
( Orientación en Biotecnología )
Priscila Gallut Rubio
COMITÉ TUTORIAL
Dr. Alejandro López CortésCentro de Investigaciones Biológicas del Noreste, S.C.
Director
Dr. Ricardo Vázquez JuárezCentro de Investigaciones Biológicas del Noreste, S.C.
Tutor
Dr. José Quinatzin García MaldonadoCentro de Investigación y de Estudios Avanzados, Mérida.
Tutor
COMITÉ REVISOR DE TESIS
Dr. Alejandro López Cortés
Dr. Ricardo Vázquez Juárez
Dr. José Quinatzin García Maldonado
JURADO DE EXAMEN DE GRADO
Dr. Alejandro López Cortés
Dr. Ricardo Vázquez Juárez
Dr. José Quinatzin García Maldonado
SUPLENTE
Dra. Yolanda Maya Delgado
i
Resumen
La diversidad filogenética y funcional de microorganismos de ventilas hidrotermales intermareales de Bahía Concepción, B.C.S., México ha sido poco estudiada. Sin embargio, estos sistemas han atraído la atención de científicos por ser modelos del origen de la vida en la Tierra, en otros planetas y por presentar microorganismos con capacidades metabólicas de interés en biotecnología. En este estudio se determinó la composición elemental de macroestructuras denominadas oncoides, que se desarrollan en manantiales hidrotermales intermareales de Playa Santispac, B.C.S., encontrando por análisissemicuantitativo a los siguientes elementos: Ag, Au, As, Co, Cu, Cl, Ca, Cd, Fe, Na, Mg, Mn, O, Si y S; mientras que por medio del análisis cuantitativo se detectaron: Ag, Al, As, Ba, Be, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Na, Mn, Ni, P, Pb, Sb, Se, Sn, Sr, V, Zn. Con estos resultados se reporta por primera vez la presencia de Ag, Au, Be, Cr, Cl, K, Na, P, Pb, Sb, Se, Sn y Sr en el sistema hidrotermal de playa Santispac, B.C.S. En base a las concentraciones obtenidas del análisis cuantitativo, los elementos más abundantes en el oncoide correspondieron al Mn (138312 mg kg-1), Mg (28531 mg kg-1) y Ca (56606 mg kg-
1). Metales y metaloides tóxicos fueron encontrados: As (550 mg kg-1), Ba (950 mg kg-1) y V (770 mg kg-1). Con la finalidad de incrementar el conocimiento de la diversidad de bacterias aerobias mesófilas de los oncoides, en este trabajo se aislaron 22 cepas, de las cuales se identificaron a los géneros Nitratireductor,Ornithinibacillus, Bacillus; y a las especies Bacillus licheniformis y Synechococcus elongatus a partir de las secuencias parciales del 16S ARNr. Los cultivos obtenidos en este trabajo pueden ser empleados como modelos de estudio para la identificación y análisis de los mecanismos genéticos y bioquímicos responsables de la resistencia bacteriana a metales y metaloides con fines de biorremediación.
Palabras clave: Manantiales hidrotermales intermareales, oncoides, composición elemental, bacterias heterótrofas mesófilas, 16S ARNr.
Vo. Bo. Dr. Alejandro López Cortés
ii
Summary
The phylogenetic and functional diversity of microorganisms from intertidal hydrothermal springs in Bahía Concepción, B.C.S., México have scarcely been studied. However, these systems have attracted the attention of scientists as models for the origin of life on Earth, on other planets and for harboring microorganisms with metabolic capacities of biotechnological interest. In this study it was determined the elemental composition of macrostructures termed oncoids,which are developed in intertidal hydrothermal springs of Santispac beach, B.C.S., finding by a semi-quantitative analysis the follow list of elements: Ag, Au, As, Co, Cu, Cl, Ca, Cd, Fe, Na, Mg, Mn, O, Si, and S. Through quantitative analysis, we detected: Ag, Al, As, Ba, Be, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Na, Mn, Ni, P, Pb, Sb, Se, Sn, Sr, V, and Zn. With these results its reported for the first time the presence of Ag, Au, Be, Cr, Cl, K, Na, P, Pb, Sb, Se, Sn and Sr in the hydrothermal system of Santispac beach, B.C.S. Based on the concentrations obtained from quantitative determinations, the most abundant elements found in the oncoid were Mn (138312 mg kg-1), Mg (28531 mg kg-1) and Ca (56606 mg kg-1). Toxic metals and metalloids were found: As (550 mg kg-1), Ba (950 mg kg-1) and V (770 mg kg-
1). With the goal of increasing the knowledge of the diversity of mesophilic aerobic bacteria of oncoids, we isolated 22 strains of aerobic mesophilic heterotrophic bacteria, of wich were identified the genera Nitratireductor, Ornithinibacillus, and Bacillus; and the species Bacillus licheniformis and Synechococcus elongatus from the partial sequences of 16S rRNA. The cultures obtained in this study could be used as study models for identification and analysis of the genetic and biochemical mechanisms responsible for bacterial resistance to metals and metalloids whit bioremediation purposes.
Key words: Intertidal hydrothermal springs, oncoids, elemental composition, heterotrophic mesophilic bacteria, 16S rRNA.
Vo. Bo. Dr. Alejandro López Cortés
iii
Dedicatoria
Dedico esta tesis a mi madre Liliana Gema quien fue mi primera y por siempre maestra. Te AMO INFINITAMENTE ojitos verdes… A mi querido hermano Alexis;
A todas las enseñanzas que me han brindado mi familia, mis amigos y profesores;
y a todos aquellos que han sembrado y cultivado la ciencia en México.
Educar es lo mismo que poner un motor a una barca, hay que medir, pensar, equilibrar, y poner todo en marcha.
Pero para eso, uno tiene que llevar en el alma
un poco de marino, un poco de pirata, un poco de poeta, y un kilo y medio de paciencia concentrada.
Pero es consolador soñar, mientras uno trabaja,
que esa barca, ese niño irá muy lejos por el agua.
Soñar que ese navío llevará nuestra carga de palabras hacia puertos distantes, hacia islas lejanas.
Soñar que cuando un día esté durmiendo nuestro propio barco,
en barcos nuevos seguirá nuestra bandera enarbolada. G.C
iv
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada durante dos años para mi manutención con número de registro 276805 y servicios médicos proporcionados.
Agradezco enormemente al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. por admitirme como estudiante de maestría y así poder formarme como futuro científico. En particular al Programa de Planeación y Conservación Ambiental por el apoyo económico otorgado para el desarrollo de experimentos,ya que la realización de esta tesis fue posible con el apoyo del proyecto de recursos fiscales del PPAC otorgado al Dr. Alejandro López Cortés.
Al programa de Posgrado y Formación de Recursos Humanos, por la beca otorgada para mi manutención por tres meses y patrocinio de las impresiones de tesis permitiéndome finalizar la maestría. Especialmente quiero agradecer alpersonal que allí labora, por todas las amables atenciones, facilidades y servicios brindados.
A mi director de tesis el Dr. Alejandro López Cortés por permitirme estudiar este tema, por transmitirnos la importancia del conocimiento científico. Reconozco sugran dedicación a mi aprendizaje y atesoraré por siempre todos sus consejos a lo largo de este camino.
También deseo agradecer a mi comité tutorial, el Dr. Ricardo Vázquez Juárez por el apoyo y las facilidades brindadas para la realización de esta tesis; al Dr. José Quinatzin García Maldonado por sus aportaciones y sugerencias para mejorar mi proyecto de investigación.
Al técnico Biól. Mar. Hever Lastinere Barragán por su admirable asesoramiento en las técnicas de biología molecular. Al M.C Baudilio Acosta Vargas y al I.B.Q Ariel Arturo Cruz Villacorta por su apoyo con la composición elemental de oncoides.
A la Academia de Biotecnología en especial al Dr. García Carreño por su buen ejemplo.
Con cariño a mis compañeros de laboratorio por su solidaridad, colaboración yamistad, Biól. Mar. Carolina Alejandra Martínez, Biól. Juan Pablo Molina.
A los estudiantes y buenos amigos, Isaac Camargo, Esteban Velázquez, Daniel Romo, Leticia Cab, Jhonathan Jiménez, Carmen Pasos. A Olivia Gonzales, Luis Beltrán y toda la pandilla. A Olaff Osuna. A Winny y Butch por estar siempre conmigo y darme todo su amor. A todos ellos gracias por ayudarme a finalizar esta etapa de mi vida.
A la ciudad de la Paz B.C.S., donde viví en paz durante tres años, maravillada de su espectacular biodiversidad.
v
Contenido
Resumen ................................................................................................................. iSummary................................................................................................................ iiDedicatoria............................................................................................................ iiiAgradecimientos .................................................................................................. viContenido .............................................................................................................. vLista de figuras.................................................................................................... viiLista de tablas .....................................................................................................viiiAbreviaturas ......................................................................................................... ix
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................11.1. Estrategias para el estudio de los microorganismos ........................................1
1.2. Métodos independientes de cultivo..........................................................31.2.1. PCR-DGGE ..........................................................................................31.2.2. Clonación..............................................................................................41.2.3. Metagenómica ......................................................................................51.3. Métodos dependientes de cultivo ............................................................61.4. Ventilas hidrotermales someras.............................................................101.5. Las ventilas hidrotermales como modelos del origen de la vida en la Tierra y en otros planetas ............................................................................111.6. Geología ................................................................................................131.6.1. Geoquímica ........................................................................................131.6.2. Registro fósil .......................................................................................131.7. Oncoides modernos...............................................................................131.8. Microbiología de aberturas hidrotermales someras y oncoides.............151.9. Biotecnología .........................................................................................17
2. ANTECEDENTES .............................................................................................18
3. JUSTIFICACIÓN...............................................................................................19
4. HIPÓTESIS .......................................................................................................20
5. OBJETIVOS......................................................................................................20
6. MATERIAL Y METODOS .................................................................................216.1. Área de estudio......................................................................................216.2. Parámetros fisicoquímicos y toma de muestras ....................................23
6.3 Composición elemental de los oncoides ................................................24 6.3.1 Microanálisis elemental por espectroscopía de energía
dispersiva de rayos X ...................................................................................246.3.2 Microanálisis elemental por espectrometría con plasmaacoplado inductivamente ..............................................................................246.4.1. Aislamiento de cianobacterias ............................................................256.4.2. Aislamiento de bacterias.....................................................................26
vi
6.4.3 Crecimiento y cultivo de microorganismos...........................................266.4.4. Preservación de cultivos de microorganismos....................................276.4.5. Caracterización morfológica ...............................................................276.5. Secuenciación parcial del gen 16S ARNr ..............................................286.6. Reconstrucción filogenética...................................................................30
7. RESULTADOS .................................................................................................317.1. Parámetros fisicoquímicos del área de estudio .....................................317.2. Determinación de la composición química de los oncoides...................317.3. Descripción del oncoide.........................................................................367.4. Aislamiento, crecimiento y cultivo de microorganismos de
oncoides.................................................................................................367.4.1. Características diagnósticas de las cepas..........................................377.4.2. Morfología colonial de cultivos de cianobacterias...............................377.4.4. Morfología colonial de bacterias heterótrofas .....................................387.4.5. Morfología celular de bacterias heterótrofas......................................397.5. Asignación taxonómica por la secuenciación parcial del gen
16S ARNr de cepas................................................................................407.6. Reconstrucción basada en secuencias de cepas cultivadas .................41
8. DISCUCIÓN ......................................................................................................438.1. Área de estudio......................................................................................438.2. Determinación de la composición química de los oncoides...................438.3. Aislamiento, crecimiento y cultivo de microorganismos de
oncoides.................................................................................................498.4. Secuencias del gen 16S ARNr ..............................................................508.5. Diversidad filogenética de bacterias aisladas de oncoides....................54
9. CONCLUSIONES .............................................................................................55
10. RECOMENDACIONES ...................................................................................56
11. LITERATURA CITADA...................................................................................57
vii
Lista de figuras
Figura 1. Mapa de localización de playa Santispac, Bahía Concepción, Baja California sur, México. ..................................................................................22
Figura 2. Mapa de la localización del manantial hidrotermal 2 en playa Santispac.....................................................................................................23
Figura 3. Línea de barrido tomada con SEM-EDS, que muestra la composición elemental de submuestras de oncoide incluye a los elementos oxígeno y silicio ...................................................................................32
Figura 4. Línea de barrido tomada con SEM-EDS, que muestra la composición elemental de submuestras de oncoide excluye a los elementos oxígeno y silicio ...................................................................................33
Figura 5. Proporción de elementos químicos de submuestras de Oncoides, detectados por espectrometría con plasma acoplado inductivamente......................................................................................................35
Figura 6. Oncoides del manantial 2 de Santispac, Bahía Concepción, Baja California Sur ................................................................................................36
Figura 7. Micrografías de contraste de fases de cepas cianobacterianas............37
Figura 8. Micrografías de contraste de fases de cepas bacterianas. ...................40
Figura 9. Reconstrucción filogenética de la cepa O_6 y sus vecinos más cercanos derivado de un análisis tipo Neighbord Joining. El filograma fue calculado de la divergencia de secuencias parciales del gen 16S ARNr.......................................41
Figura 10. Reconstrucción filogenética de la cepa O_22 derivado de un análisis tipo Neighbord Joining. El filograma fue calculado de la divergencia de secuencias parciales del gen 16S ARNr.……………………………..........................................41
Figura 11. Reconstrucción filogenética que incluye las cepas O_22, O_23, O_24, O_26, O_27 y sus vecinos más cercanos derivado de un análisis tipo Neighbord Joining. El filograma fue calculado de la divergencia de secuencias parciales del gen 16S ARNr.......................................................................................................42
viii
Lista de tablas
Tabla I. Principales técnicas de aislamiento de microorganismos..........................8
Tabla II. Macroelementos que componen a la célula de procariontes y susfunciones fisiológicas (Tomado de Battley, 1995) ...................................................9
Tabla III. Mezcla para una reacción de PCR con Go taq Green Master Mix®......29
Tabla IV. Porcentaje en peso y porcentaje atómico de la composición química de submuestras de oncoide ..................................................................................32
Tabla V. Porcentaje en peso y porcentaje atómico de la composición química desubmuestras que excluye a los elementos oxígeno y al silicio .............................33
Tabla VI. Concentración en mg kg-1 de la composición elemental de submuestras de oncoide .......................................................................................34
Tabla VII. Asignación taxonómica por la secuenciación parcial del gen 16S ARNr de cepas ..............................................................................................40
Tabla VIII. Comparación de la concentración en mg kg-1 de la composición elemental de oncoides, de la ventila geotermal de Santispac en dos años consecutivos de estudio, y de la corteza terrestre........................................44
Tabla IX. Relación de los elementos químicos y la función de los microorganismos (Tomado y modificado de Gadd, 2010).....................................46
ix
Abreviaturas
°C: Grados Celsius16S ARNr: Molécula conformacional de la subunidad menor del ribosoma procariotaADN: Ácido desoxirribonucleico cm: CentímetrosDGGE: Electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante EDS: Espectroscopia de rayos X de dispersión de energíaet al.: Y colaboradoresg: gramosICP MS: Espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamentekb: Kilobasekg: Kilogramoskm: Kilómetro kV: Kilovoltio L: Litrosmg: Miligramosmin: Minutos mm: Milímetros μL: MicrolitrosμM: micromolar
micra mL: Mililitros NADH: Nicotinamida adenina dinucleótido reducidoNCBI: National Center for Biotechnology Informationnm: Nanómetrospb: Pares de bases PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa pH: concentración de iones hidrógeno [H]+PSU: Unidades prácticas de salinidads: Segundos
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Estrategias para el estudio de los microorganismos
Entre las disciplinas dedicadas al estudio de las diferentes formas de vida en
nuestro planeta, la Microbiología fue la última en establecerse. Como
consecuencia sus fronteras no están muy bien definidas. Substrayendo de la
totalidad de los organismos aquellos que pueden ser estudiados por las técnicas
clásicas de la botánica y la zoología, el resto se ha dejado a los microbiólogos. Lo
que usualmente queda son pequeños organismos que pueden ser visualizados
sólo mediante el uso de equipo especial, los microscopios. En contraste a los
animales y plantas, la morfología de los microorganismos es en general
demasiado simple para servir de base para una clasificación razonable y permitir
una fiable identificación. Así, hasta muy recientemente, la identificación microbiana
requirió del aislamiento de cultivos puros (o co-cultivos definidos), seguida por
múltiples pruebas de rasgos fisiológicos y bioquímicos. Se consideró como exitoso
a un microbiólogo por su habilidad de cultivar microorganismos. En consecuencia,
cualquier enfoque para identificar las poblaciones microbianas específicas en su
ambiente natural, sin su cultivo inmediato podría ser revolucionario, ya que podría
cambiar el carácter de la microbiología y cerrar la brecha metodológica que
todavía existe en comparación con la botánica y la zoología (Amann et al., 1995).
En las últimas décadas, los mayores avances en la Microbiología han sido en el
desarrollo de métodos para el estudio de los ácidos nucleicos. Técnicas como la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el gen 16S ARNr es la
más útil y empleada para la identificación de especies (Giovannoni et al., 1990;
Woese, 1977). La genómica de células individuales, clonación, electroforesis de
geles en gradiente desnaturalizante (DGGE), y la más reciente metagenómica,
han logrado identificar numerosos filotipos nuevos de microbios en una amplia
gama de hábitats (Munson et al., 2002; Rappe y Giovannoni, 2003; Zhou et al.,
2004; Aas et al., 2005). Estas técnicas independientes de cultivo permiten
2
monitorear la abundancia y diversidad de los microorganismos en el ambiente, y
permite describir sus relaciones evolutivas (Aas et al., 2005).
Sin embargo, los estudios metagenómicos revelan una preponderancia de genes
desconocidos de alrededor del 30 %, no teniendo similitud con los genes para los
que se ha atribuido una función o taxa. Una cuestión importante es que si estas
son especies con genes hipotéticos sean ecológicamente importantes o
biogequímicamente relevantes y varias líneas de evidencia sugieren que lo son,
puesto que los genes y las proteínas de función desconocida a menudo se
expresan en el ambiente y son indispensables para el organismo (Frias-Lopez et
al., 2008). Por lo que los enfoques ómicos idealmente deben de realizarse en
paralelo con los enfoques geoquímicos y microbiológicos tradicionales de manera
integrada (Oremland et al., 2005).
Para que la Microbiología siga desarrollándose es necesario reinventar nuevas
estrategias para recuperar y cultivar nuevos taxas de microorganismos o aquellos
poco representados en una muestra ambiental, posibilitando el estudio detallado
de los microorganismos lo que permite la verificación y comprobación sobre las
hipótesis del potencial metabólico determinado por los datos metagenómicos
(Zengler, 2009).
Para el 2016 un total de 1,411,234 secuencias completas del gen 16S ribosomal
de bacteria y 53,546 de arqueas han sido depositadas en bases de datos. De las
1,411,234 solamente 266,867 pertenecen a secuencias de organismos cultivables
y 1,144,367 son secuencias de bacterias no cultivables (Schloss et al., 2016).
Generaciones de microbiólogos desde hace años han sido conscientes de la
dicotomía entre las observaciones del mundo microbiano a través del microscopio
y los recuentos de microbios en medio sólidos (Staley y Konopka, 1985). A dichas
inconsistencias se le conoce como la anomalía del conteo en placa, la cual refiere
a que los microorganismos cultivables del ambiente representan solo del 0.001-
3
10 % de la diversidad total (Amann et al., 2000). El hecho de que no sean
cultivables significa que son resistentes a crecer aislados o no crecen en los
medios de cultivos convencionales. Esto se debe a que los microorganismos
pueden tener requerimientos fastidiosos para su crecimiento, como lo son el
requerir nutrientes específicos, condiciones específicas de pH, temperaturas de
incubación, ciertos niveles de oxígeno en la atmósfera o necesitar de las
interacciones con otros microbios (Zengler, 2009).
Los microorganismos no cultivables constituyen una gran parte de la biomasa y
biodiversidad terrestre (Rappé y Giovannoni, 2003). Esto representa retos y
oportunidades para los microbiólogos, por la falta de información sobre su
Biología, que será fundamental para poderlos crecer, en tal sentido que al lograr
su cultivo aprenderemos sobre los principios moleculares y celulares, permitiendo
el diseño de nuevas técnicas que permitan el acceso a la diversidad metabólica
desconocida (Staley y Konopka, 1985; Whitman et al., 1998; Amann et al., 2000).
1.2. Métodos independientes de cultivo
1.2.1. PCR-DGGE
La electroforesis de geles en gradiente desnaturalizante (DGGE) se utilizó
inicialmente para la detección de mutaciones en el genoma humano, pero fue
modificado por Muyzer y colaboradores para la separación de amplicones del gen
16S ARNr (Muyzer, 1999; Muyzer y Smalla, 1998; Muyzer et al., 2004). Este
método consiste en separar genes del mismo tamaño que se diferencian en su
perfil de fusión (desnaturalización) debido a las diferencias en la secuencia de las
bases. La DGGE emplea un gradiente de desnaturalización de ADN, basado en
una mezcla de urea y formamida. El uso de secuencias ricas en guanina y
citosina de 40 pares de bases (pb) unidas al extremo 5 'de uno de los cebadores,
impide la desnaturalización completa del ADN, y la separación parcial las bandas
resultantes durante la migración es lograda con un gel de poliacrilamida. Las
4
diferencias en la secuencia de bases causan diferencias en las propiedades de
fusión del ADN. Por lo tanto, las diferentes bandas observadas en un gel de
DGGE son filotipos que pueden diferir tan sólo en una base en la secuencia. Una
vez que se ha realizado la DGGE, se cortan las bandas individuales y se
secuencian. Se puede emplear el gen ARN ribosomal 16S o un gen funcional
como blanco y así evaluar el número de filotipos o el número de filotipos de un gen
específico en una muestra (Madigan et al., 2009).
1.2.2. Clonación
Durante 1990 las librerías de clonas generadas a partir de muestras ambientales
fue la estrategia predominante para describir la diversidad y detectar nuevos
grupos filogenéticos (Morris et al., 2002).
La clonación molecular se basa en el aislamiento de una secuencia de ADN de
interés para obtener múltiples copias de la misma in vitro (Lu et al., 2008).
El ADN de origen puede ser el ADN genómico total, ADN sintetizado a partir de
un molde de ARN por la transcriptasa inversa o un gen o genes amplificados por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si el ADN es genómico primero se
corta con enzimas de restricción para obtener una mezcla de fragmentos de
tamaño manejable. La inserción se hace por medio de un vector de clonación los
cuales son elementos genéticos pequeños que se replican independientemente y
por ello se utilizan para replicar genes. La mayoría de los vectores de clonación
proceden de plásmidos o virus. Los vectores de clonación permiten la inserción in
vitro de ADN exógeno en un sitio de restricción que corta al vector sin afectar su
replicación. Si el ADN y el vector se cortan con una enzima de restricción que
produce extremos cohesivos la unión será muy favorecida por el apareamiento de
dichos extremos cohesivos. Los extremos romos se pueden unir también
empleando ligadores o adaptadores sintéticos de ADN. En la transformación se
introduce ADN recombinantes en células huésped. En la práctica no todas las
células contienen el gen de interés clonado (Madigan et al., 2009) y la
5
recuperación de taxas es limitada respecto a la diversidad total (Lunn et al.,
2004).
Por otro lado, obtener la secuencia que será insertada puede complicarse debido
a los errores producto de los diferentes artefactos generados durante la PCR.
Existen tres tipos de artefactos que se pueden generar durante el transcurso de la
PCR: (a) la formación de quimeras, que representan productos de PCR
incompletos que pueden hibridar como oligonucleótidos en secuencias
heterólogas; (b) la formación de moléculas heterodúplex, se suelen producir en
los últimos ciclos de la PCR cuando puede llegar a existir una limitación en la
concentración de oligonucleótidos en la reacción de amplificación. En estos casos,
se puede producir una hibridación cruzada entre secuencias heterólogas formando
moléculas heterodúplex; (c) errores por la polimerasa, la introducción de una base
errónea, oscilando la tasa de error entre 10-4 a10-5 dependiendo de la enzima que
se utilice (Lunn et al., 2004).
En cuanto a la clonación de genes funcionales los principales desafíos son la
selección de genes funcionales para el diseño de cebadores adecuados que
permitan amplificar secuencias robustas en cobertura, y el establecimiento de
bases de datos con secuencias de estos genes a fin de permitir una asignación
(Petrii et al., 2000).
1.2.3. Metagenómica
El término metagenómica fue publicado por primera vez por Handelsman en 1998,
en un estudio de los microorganismos del suelo mediante la clonación aleatoria de
DNA ambiental. Esta herramienta de la microbiología refiere al estudio de los
genomas colectivos en una comunidad ambiental, con la pretención de detectar la
mayor cantidad de genes, o genomas completos de la muestra (Madigan et al.,
2009).
6
La principal tarea de la metagenómica basado en la secuenciación es reconstruir
el metabolismo de los organismos que componen la comunidad y predecir sus
roles funcionales en el ecosistema, mediante etiquetas de genes ambientales, es
decir, fragmentos de genes que codifican dominios conservados o motivos de
familias de proteínas. El procedimiento consiste en: (1) la selección de un nicho
ambiental; (2) el aislamiento del material genético directamente de la muestra
ambiental; (3) la manipulación del material genético; (4) la construcción de una
librería; y (5) el análisis del material genético en la librería creada para el
metagenoma (Simon y Daniel, 2011).
Es una herramienta muy empleada en la bioprospección, para la búsqueda de
microorganismos con producción de nuevos antibióticos, genes de resistencia a
antibióticos, enzimas, genes que degraden y sinteticen biopolímeros, etc.
(Riesenfeld et al., 2004). Su actividad se ha ido incrementando conforme el
desarrollo de las técnicas de secuenciación permiten mayor cobertura y menor
costo (Simon y Daniel, 2011).
1.3. Métodos dependientes de cultivo
Grandes logros de la microbiología incluyendo la fisiología, la bioquímica, la
genética, la medicina y la biotecnología se fundan en estudios de cultivos puros.
Mediante el cultivo se obtienen cepas de referencia y secuencias del genoma que
ayudan al diseño de mejores cebadores para el perfeccionamiento de los métodos
de detección molecular. La interpretación de las bases de datos de secuencias
actuales que sirven como punto de partida para estudios de cultivo independiente
depende de los microorganismos cultivados (Heylen et al., 2012).
Es importante diferenciar los términos aislamiento, crecimiento y cultivo de
microorganismos ya que frecuentemente son empleados erróneamente como
sinónimos (Zengler, 2009).
7
Durante el aislamiento son generados cultivos mixtos y cultivos puros. El
aislamiento puede ser (1) de un material matriz como el agua, el aire, partículas
del suelo o tejidos eucariontes; o (2) la separación física entre dos o múltiples
microorganismos lo cual es crucial para obtener cultivos puros (Zengler, 2009). Un
cultivo puro consiste en un solo clon de un microorganismo (Madigan et al., 2009).
Existen varios métodos para separar físicamente a las células microbianas,
probablemente el más común es la separación de las células mediante la difusión
en un medio sólido. Este método fue introducido por Robert Koch hace más de un
siglo, el principio básico de aislar las bacterias mediante la difusión en cajas Petri
consiste en tomar una sola colonia bacteriana, inocularla en una nueva caja que
al dividirse formará colonias visibles por el ojo humano o por microscopía. Estas
colonias luego se pueden separar entre sí mediante varias herramientas, por
ejemplo, un asa o un palillo, dependiendo en el tamaño de la colonia. El proceso
se define por una etapa de separación (propagación de las células en una placa),
una etapa de crecimiento (formación de las colonias), y la etapa de aislamiento
real (colonia por colonia). Otra técnica comúnmente utilizada es el aislamiento de
bacterias por dilución hasta extinción en medio líquido. Para la recuperación de
ciertos taxas se diseñan medios de cultivo de acuerdo a sus demandas
nutricionales, o se añaden químicos específicos (Jones y Krieg, 1984; Prakash et
al., 2013) (Tabla I).
8
Tabla I. Principales técnicas de aislamiento de microorganismos.
Técnica DescripciónModificación del medio de cultivo
Diseño de medios de cultivo, cambios en la composición, adición de químicos específicos, disminución del contenido de materia orgánica
Dilución por extinción Dilución del medio hasta lograr la separación de una sola célula
Modificación de las condiciones de crecimiento
Modificar el tiempo de incubación, tamaño del inóculo, condiciones de aireación
Micromanipulación Se emplean dispositivos que permiten tomar un filamento de cianobacteria
El crecimiento implica la división celular, que resulta en la duplicación del número
celular. La duplicación celular puede ser mediante la fisión binaria, la gemación o
la esporulación.
El crecimiento celular bacteriano depende de una amplia variedad de tipos de
reacciones químicas (Madigan et al., 2009) por ello el diseño de medios de cultivo
específicos no es trivial y la recuperación de microbios sigue siendo limitada.
Para entender la termodinámica del crecimiento es necesario conocer la
composición de biomasa las células microbianas. De los más de 100 elementos
químicos que aparecen en la tabla periódica 30 a 40 son considerados esenciales.
Seis no metales (C, O, H, N, S y P) y 4 metales (K, Mg, Fe y Ca) comprenden el
98% del peso seco de los procariontes (Tabla II) (Battley, 1995).
9
Tabla II. Macroelementos que componen a la célula de procariontes y sus funciones fisiológicas. (Tomado de Battley, 1995).
Elemento % peso seco Función fisiológicaC 48-59 Mayor constituyente orgánico celularO 13.1-23.9 Material orgánico y agua del citoplasmaH 6.4-8 Material orgánico y agua del citoplasmaN 13.6-14.7 Proteínas, ácidos nucleicos, y coenzimasS 0.9-1.4 Cisteína, metionina en proteínas. Coenzima
pirofosfato -lipoico
P 2-5.4 Ácidos nucleicos, nucleótidos, fosfolípidos, ácidos teicoicos y coenzimas
K 0.03-1.4 Catión divalente intracelular, mantenimiento de la osmolaridad de la célula, cofactor de algunas enzimas
Mg 0.007-0.05 Catión monovalente predominante en el citoplasma, cofactor de algunas enzimas, ésteres de fosfato, ribosomas, membranas y pared celular
Ca 0.00006-0.06 Presente en exoenzimas (proteasas) y en la pared celular, dipicolinato de calcio es un componente importante de las endoesporas
Na 1.45 Oxalacetato, glutaconil-CoA, metilmanolil-CoA decarboxilasa; coenzima M molibtopterina.
Cl 0.05 Toma activa de solutos compatibles y formación del flagelo en halófilas
Fe 0.003-0.02 Presente en citocromos, ferrodoxinas, y otras proteínas de hierro, cofactor en enzimas
Microelementos como Mn, Co, Cu, Mo, Zn, Ni, V, Se, W, B, también son
constituyentes de las células y necesarios para el crecimiento, así como factores
de crecimiento. Los factores de crecimiento en pequeñas cantidades (0.1 y 1 μM)
estimulan a la célula a crecer. Generalmente se reconocen tres tipos de factores
de crecimiento: 1) aminoácidos; 2) purinas y pirimidinas; y 3) vitaminas. Otros
factores que influencian el crecimiento de los microorganismos son el pH,
osmolaridad, temperatura, y la concentración de O2 (Dworkin et al., 2006).
En el cultivo, una población microbiana definida puede crecer y ser mantenida viva
en el laboratorio, usualmente a una escala que involucra billones de células a la
vez (Zengler, 2009).
10
Es muy importante preservar y mantener los cultivos a corto y largo plazo, para
futuros estudios, ya sea como referencia, como controles experimentales y
pruebas, para propósitos taxonómicos, o para aplicaciones biotecnológicas. A
corto plazo por lo general se almacenan en tubos de agar inclinado y a largo plazo
los cultivos son mantenidos liofilizados o criopreservados para prolongar su
viabilidad y reducir cambios genéticos por mutaciones (Prakash et al., 2013;
Dworking et al., 2006).
1.4. Ventilas hidrotermales someras
Las ventilas hidrotermales someras se forman en los márgenes continentales
afectados por tectonismo intenso. Son sistemas muy dinámicos, las fallas
formadas en las rocas por donde el agua fría fluye, entra en contacto con las
cámaras magmáticas de temperaturas elevadas y es forzada a regresar a la
superficie. Esta agua muy caliente disuelve minerales y gases de las rocas
basálticas, los cuales son liberados o precipitados en la ventilas (Tarasov, 2005).
Las ventilas hidrotermales someras se definen como aquellas que se encuentran a
menos de 200 metros de profundidad (Levin et al., 2000). Usualmente se
localizan en la zona fótica, donde la producción primaria es primeramente
fotosíntética, como la fuente dominante de carbono. Sin embargo, tapetes con
microorganismos quimiolitotrófos están presentes, y pueden ser potenciales
fuentes de producción primaria para organismos capaces de consumir y
metabolizar el carbono derivado de la quimiosíntesis. Una característica notable
de las ventilas hidrotermales someras es la ocurrencia de actividad
gasohidrotermal, donde gases son descargados en corrientes a lo largo de los
fluidos hidrotermales (Dando et al., 1995), esto no sucede en las ventilas
hidrotermales profundas (de profundidad mayor a 200 metros). Otras diferencias
son, que dentro de las especies de ventilas de profundidad hay numerosos taxas
específicos, ausentes o raras de encontrar en las someras; en la biomasa de las
11
comunidades biológicas de ventilas las profundas dominan formas simbiontes, lo
que es inusual o no es el caso de las ventilas someras (Tarasov, 2005).
En el oeste de México, en particular en el Golfo de California, a lo largo de la
península de Baja California, los sistemas de fallas peninsulares en el Golfo de
California involucran a la actividad hidrotermal (Libbey y Johnson, 1997; Canet et
al., 2003), detectándose en Bahía Concepción (McFall, 1968), San Felipe, Punta
Estrella, El Coloradito y Puertecitos en el Golfo de California a lo largo de la costa
oriental de la Península de Baja California (Barragán et al., 2001), y en Punta
Banda en el oeste de la costa de Baja California Norte cerca de Ensenada (Vidal
et al., 1978). También se han investigado en Punta Mita, cerca de Puerto Vallarta,
México (Rubio-Ramos y Prol-Ledesma, 2000; Prol-Ledesma et al., 2002; Taran et
al., 2002). En otras partes del mundo se han reportado en California (Stein, 1984;
Kleinschmidt y Tschauder, 1985), Nueva Zelanda (Sarano et al., 1989), norte de
Islandia (Fricke et al., 1989), Bahía de Kagoshima, Japón (Ossaka et al., 1992;
Hashimoto et al., 1993; Miura et al., 1997), las Islas de Tokara (Takeda et al.,
1993), La isla Nishino Shima Shinto (Takeda y Kubata, 1977), el mar Tirreno,
Italia (Abbiati et al.,1994; Sedwick y Stuben, 1996; Stuben et al., 1996), el mar
Egeo (Thiermann et al., 1994), y en las islas Feni en Papua Nueva Guinea (Pichler
y Dix, 1996).
1.5 Las ventilas hidrotermales como modelos del origen de la vida en la Tierra y en otros planetas
El descubrimiento de las ventilas hidrotermales a finales de 1970 expandió
nuestro conocimiento sobre los múltiples microhábitats de los microorganismos y
su posible origen sobre la Tierra. Se han propuesto a los sistemas hidrotermales
como los lugares donde surgió la vida hace aproximadamente 3,800 millones
atrás, debido a que en experimentos realizados de síntes abiótica bajo las
condiciones fisicoquímicas de estos ambientes han resultado en los aminoácidos
12
serina, glicina, ácido aspártico y ácido glutámico (Hennet et al., 1992; Hazen y
Deamer, 2007; Rauchfuss, 2008).
Corliss (1981), consideraba que las condiciones hidrotermales eran reactores
ideales para la síntesis abiótica dichas condiciones consistían en los gradientes
de la temperatura del agua, los gradientes en el pH del agua, y la concentración
de solutos en los manantiales calientes. También muchos geólogos creen que el
hidrotermalismo en la Tierra primigénea fue probablemente más frecuente de lo
que es ahora, ya que la gruesa corteza continental no había sido formada todavía
y el interior de la Tierra era todavía más caliente de lo que es ahora (Holm et al.,
1992).
En cuanto a lo que respecta del origen de la vida en otros planetas según esta
teoría, se han identificado ambientes hidrotermales en Marte, esto ha sido
investigado por muchos autores incluyendo Carr (1979), Newsom (1980),
Mouginis-Mark (1985, 1990), Brakenridge et al. (1985), Squyres et al. (1987),
McKay y Stoker (1989), Gulick y Baker (1990), MacKinnon y Tanaka (1989),
Gulick (1993), Clifford (1993), Greeley y Thomas (1994), Carr (1995), Gulick et al.
(1997), Wilson y Head (1997), Tanaka et al. (1998), y Dohm et al. (1998, 2000,
2001a, 2001b, 2004).
Por lo que los ambientes hidrotermales probablemente van a mantenerse como
focos de estudios en el futuro, ya que muchos de ellos son (1) blancos favorables
para el desarrollo y el sustento de la vida existente, (2) puede comprender una
gran variedad de compuestos minerales (3) Los ambientes hidrotermales
terrestres (antiguos y existentes) proveen el sitio para desarrollar experimentos, y
estudiar estos ambientes y extrapolarlos a otros planetas (Schulze-Makuch et al.,
2007; Dirk et al., 2007).
13
1.6. Geología
1.6.1. Geoquímica
Las descargas de agua de las ventilas hidrotermales proveen distintos gradientes
fisicoquímicos. Las ventilas hidrotermales enriquecidas en azufre en Nueva
Zelanda, Isla Norte (Castenholz, 1976), y el Parque Nacional de Yellowstone
(Brock, 1969; Castenholz, 1977) proporcionan gradientes de temperatura, sulfuros,
concentración de oxígeno, de pH, concentración de minerales y nutrientes
orgánicos; que cambian dependiendo la estación del año, lo que ocasiona
cambios en la composición de las comunidades microbianas (Bauld y Brock, 1973;
Castenholz, 1976).
1.6.2. Registro fósil
Los oncoides son excelentes indicadores paleoambientes, de la fluctuación del
nivel del mar y de las condiciones de depositación (Riding, 1983). Los oncoides
más antiguos datan del arqueano, eran de calcita, algunas veces con minerales de
arcilla, cuarzo o materia orgánica. Su composición correspondía con los minerales
presentes durante su desarrollo (Hofmann et al., 1999; Grotzinger y James 2000).
Se tienen registros de oncoides en el Fanerozoico y Ordovícico en el sur de
Escocia (Riding, 1977). En el Devónico en la Cuenca de Canning en el occidente
de Australia (Playford y Cockbain, 1976). En el Carbonífero al Sur de Galicia
(Wright, 1982). Anadon y Zamarreño (1981) describen oncoides y oncolitos de los
depósitos de los canales fluviales del Paleoceno en la Cuenca del Ebro, España.
Estos oncoides primitivos son similares a los recientes.
1.7. Oncoides modernos
Los oncoides marinos se forman en la zona intermareal y ambientes submareales
poco profundos (Peryt, 1983). El proceso es el siguiente: sedimentos erosionados
del basalto (sedimentos terrígenos) son depositados en la cuenca evaporítica, la
14
depositación es por capas, primero de basalto, luego arenas y lodos sedimentan
en la cuenca pudiéndose formar barreras que bloquean el agua, haciendo que
esta se estanque a poca profundidad, lo que propicia el desarrollo de
microorganismos ( Groves et al., 1981).
Heim, en 1916 acuña el término oncoides (del griego onkos que significa nódulo)
para denotar un tipo de grano cubierto, él fue el primero en atribuir que su
formación era producto de microorganismos, y por ello otros autores se refieren a
ellos como cianoides (Peryt, 1981) por que al principio se pensaba que en su
formación participaban solo cianofitas, después se supo que también era por el
producto del metabolismo de cianobacterias incluyendose posteriormente a
bacterias y arqueas (Monty, 1977; Peryt, 1981; Tarasov et al., 2005), por ello
deberían llamarse micronoides en vez de cianoides.
Una asociación de oncoides es conocida como oncolito (Peryt, 1981). Más
detalladamente podemos describirlos como estructuras biogeosedimentarias, con
un componente biótico representado principalmente por microorganismos, que al
excretar polímeros de alto peso molecular como polisacáridos, facilitan la adhesión
con el sedimento, conglomerándose de forma concéntrica y laminada. El
componente abiótico está dado por la composición mineral de los sedimentos y
rocas asociadas. Y también por precipitación de carbonato de calcio por el
consumo de dióxido de carbono por las cianobacterias durante la fotosíntesis.
Otros factores fisicoquímicos estarán influenciando la composición del oncoide son
el pH, la salinidad, la temperatura, la tasa de sedimentación, la exposición al aire,
la fuerza de la corriente de agua, el proceso de mineralización de los compuestos
orgánicos, la radiación UV, el potencial de óxido reducción, contenido de CO2
disuelto en el agua, y otros (Gerdes y Krumbein, 1967).
15
1.8. Microbiología de aberturas hidrotermales someras y oncoides
Comunidades microbianas de ventilas hidrotermales en la isla de Taketomi, Japón
de 23 metros de profundidad fueron estudiados empleando técnicas cultivo
dependientes y técnicas moleculares. Los parámetros fisicoquímicos obtenidos en
este estudio fueron un rango de pH de 6.6 a 7.8, la temperatura máxima fue de
alrededor de 52 °C. Y emisiones de gases como CH4, N2, CO2, O2 y H2 fueron
detectados. Los organismos más abundantes detectados por la aproximación
cultivo dependiente fueron cepas de bacterias autotrófas oxidadoras de azufre
incluyendo bacterias mesófilas del género Thiomicrospira y bacterias termófilas de
la especie Sulfurivirga caldicuralii; bacterias reductoras de hierro del género
Deferribacter, bacterias sulfato reductoras del género Desulfovibrio, bacterias
heterótrofas del género Pseudoalteromonas y de arqueobacterias termófilas del
género Thermococcus. El análisis cultivo independiente que consistió en la
recuperación de secuencias del gen 16S ARNr mostraron diversas arqueas de la
Clase Archaeoglobales y del Phylum Crenarchaeota y como el filotipo
predominante a las bacterias termófilas de la especie Sulfurivirga caldicuralii
(Hirayama et al., 2007).
Ventilas hidrotermales someras gaseosas de 8 metros de profundidad y 45 °C de
temperatura en Milos, Grecia, con presencia de gases de CO2, H2S, CH4, H2 ,
por aproximación cultivo independiente por la técnica de DGGE fueron estudiadas,
la secuenciación de bandas resultó en la bacterias heterótrofas de los géneros
Cytophaga y Flexibacter, bacterias sulfato reductoras del género
Desulfobacteriaceae, bacterias termófilas del género Caldicellulosiruptor, y
bacterias quimiolitoautótrofas del género Thiomicrospira (Sievert et al., 2000).
Tapetes microbianos asociados a ventilas hidrotermales someras en la Playa de
Seashore en Islandia de 95 °C de temperatura, a 4 metros de profundidad, con un
rango de pH de 6.7 a 8.3, enriquecidas con azufre, fueron estudiadas por
enriquecimientos in situ, y muestras de tapetes microbianos para el análisis del
gen 16S ARNr por medio de la técnica de clonación, revelando la presencia de
16
clonas relacionadas con microorganismos terrestres, termófilos, y mesófilos. Se
identificaron bacterias verdes no sulforosas del género Chloro exus. Los Phyla
Deinococcus-Thermus, Aqui cae, Thermotogae, Firmicutes, Chloro exi. La Clase
Thermomicrobium, y una nueva potencial división. También se identicaron arqueas
de los grupos Korarchaeota, Thermo liaceae, de la familia Desulfurococcaceae y
las especies termófilas Desulfurococcus mobilis, Thermo lum pendens
(Skirnisdottir et al., 2000).
En las ventilas hidrotermales someras marinas de las islas Eolian, Italia, de 5
metros de profundidad, cuya temperatura tiene un rango de 60 °C a 70 °C, un
rango de pH de 4.4 a 6.3, y los compuestos H2S, NO3 y PO4 disueltos en el agua.
Por la aproximación cultivo dependiente obtuvieron cepas de bacterias
heterótrofas de los siguientes géneros: Flavobacterium, Acinetobacter, Vibrio,
Pseudomonas/Alcaligenes, Micrococcus, Arthrobacter (Gugliandolo y Maugeri,
1998).
En ventilas hidrotermales someras en el noreste de Taiwán, cuyas características
fisicoquímicas con un rango de temperatura de 49 °C a 115 °C, pH de 2.82, con
iones disueltos de SiO2, CH4, NH4+ y PO4. Los microorganismos fueron estudiados
por la aproximación cultivo independiente por la técnica de pirosecuenciación para
el gen 16S ARNr de muestras ambientales, logrando identificar bacterias
termófilas moderadas quimiolitoautótrofas del género Nautilia. Bacterias
quimiolitotrofas de los géneros Caminibacter, Thioreductor, Lebetimonas,
Sulfurimonas, Sulfurovum, Hydrogenimonas, Nitratifractor y Sulfurospirillum.
Bacterias heterótofas del género Arcobacter y diversas bacterias de la clase
Epsilonproteobacteria (Zhang et al., 2012).
Estudios metagenómicos por pirosecuenciación del gen 16S ARNr de muestras de
agua superficial de ventilas hidrotermales en Taiwán, cuyas características
fisicoquímicas con rangos de temperatura de 30 °C a 116 °C, un rango de pH de
enriquecidas de azufre, y gases como CO2, H2, CH4 y H2S, revelaron que
17
las clases predominantes eran del grupo Epsilonproteobacteria (Nautiliales-like)
con 40 clases representativas (79.5 % del total de secuencias asignadas) y el
grupo Gammaproteobacteria (Thiomicrospira-like) (61.6 %), seguido por la clase
Alphaproteobacteria (16.2 %) y Betaproteobacteria (9.5 %). Nautilia,
Caminibacter, Thiomicrospira fueron los géneros más dominantes de bacterias
quimiolitotrofas. Otros grupos significativos fueron bacterias quimiolitotrofas de los
géneros Nitratriuptor, Sulfurovum, Lebetimonas, Sulfurimonas, Hydrogenimonas,
Nitratifractor, Sulfurospirillum, Nitrosococcus. Y bacterias heterótrofas de los
géneros, Campylobacter, Helicobacter, Shewanella, Vibrio, Arcobacter,
Marinobacter. El grupo Epsilonproteobacteria se considera como una fuente que
evolucionó a partir de formar parte primero como patógenos de humanos y
animales. Los géneros Campylobacter y Helicobacter filogenéticamente están
emparentados con patógenos de procariontes y son encontrados en ventilas
hidrotermales someras (Tang et al., 2103).
1.9. Biotecnología
Las ventilas hidrotermales en general son sitios poco explorados, en la base de
datos del NCBI existen aproximadamente 10,860 secuencias del gen 16S ARNr
correspondientes a 4,216 unidades taxonómicas operacionales (Schloss et al.,
2016). De las cuales, aproximadamente 80 microorganismos han sido cultivados y
solo 50 de ellos han sido asociados con patentes y aplicaciones. Algunos
organismos tienen varias patentes registradas, por ejemplo, Thermococcus
litoralis asociado a 50 patentes y un producto comercial, por ejemplo, la patente
de Estados Unidos número 5210036 es de una enzima termoestable (Neethu et
al., 2014). Las ventilas hidrotermales son reservorios genéticos, los cuales
representan opciones para convertirse en aplicaciones biotecnológicas.
18
1. ANTECEDENTES
2.1. Estudios de microbiología en Bahía Concepción B.C.S., México
La diversidad filogenética y funcional de microorganismos de ventilas
hidrotermales intermareales de Bahía Concepción, B.C.S., México ha sido poco
estudiada. En particular las comunidades microbianas asociadas a los oncoides
de manantiales hidrotermales en Playa Santispac. De los oncoides solo se conoce
una fracción de la diversidad microbiana correspondiente al grupo de las
cianobacterias y se desconoce la diversidad de bacterias y arqueobacterias. Las
cianoabacterias fueron estudiadas mediante la aproximación cultivo dependiente y
cultivo independiente. Las cepas obtenidas a partir de los oncoides fueron
asiganadas por la secuenciación del gen 16S ARNr al género Cyanobacterium y
a las especies Synechococcus elongatus, Leptolynbya thermalis, y Limnothix
amphigranulata. Empleando sondas del gen 16S ARNr en microarreglos y en
DGGE se obtuvieron secuencias del género Gleoethece y la especie Microcoleus
chthonoplastes. De acuerdo a su morfología empleando un microscopio de
contraste de fases, se identificaron los géneros de cianobacterias Geitlerinema,
Lyngbya, Gleoethece, Cyanobacterium, Chroococcus, Synechocystis, Cyanothece
y Microcoleus. Y de bacterias fotótrofas Chloroflexus, Thiocystis, Rhodospirillum
(López-Cortés, 1998, 2001; García-Maldonado, 2009).
Otro estudio cercano incluye la diversidad parcial microbiana en las ventilas
hidrotermales submarinas someras difusas conocidas como Mapachitos en Bahía
Concepción. Se obtuvieron secuencias del gen 16S ARNr por medio de la
clonación, las cuales pertenecen en orden de mayor a menor abundancia en la
muestras de sedimentos fueron los siguientes taxas: el 21 % correspondió a las
Clase Gammaproteobacteria, el 17 % la clase Bacteroidetes, el 14 % al grupo de
las cianobacterias, el 10 % al Phylum Chloroflexi, el 10 % al Phylum Firmicutes, el
4 % al Phylum Actinobacteria, el 10 % la Clase Deltaproteobacteria, el 7 % la clase
Epsilonproteobacteria, el 4 % la Clase Alphaproteobacteria, y por último el 3 % la
Clase Spirochaetes (Dávila-Ramos et al., 2015).
19
2. JUSTIFICACIÓN
Los oncoides que se desarrollan en los manantiales con aberturas hidrotermales
someras intermareales han sido poco estudiados en lo que respecta a la
composición geoquímica y la diversidad filogenética y funcional de los
microorganismos asociados. Se sabe la composición química del agua,
sedimentos y gases de las ventilas hidrotermales someras del manglar de
Santispac, presentando diversos metales y metaloides disueltos en el agua y
precipitados en los sedimentos, por lo que las fisilogías de los microorganismos
asociados a este sistema pueden ser de interés para la Biotecnología. Por ello,
consideramos relevante analizar la composición química de los oncoides y
realizar estudios microbiológicos dependientes de cultivo de los oncoides. Ya que
está bien documentado que los microorganismos que ocupan estos ambientes
tienen activa participación en fenómenos como la, productividad primaria,la
degradación completa de los compuestos orgánicos, la catálisis de la oxidación y
reducción de los metales y metaloides, la formación biogénica de los
minerales,desintegración de rocas y formación de sedimentos (Gerdes y
Krumbein, 1987; Gadd, 2010). Tales procesos son componentes importantes de
los ciclos biogeoquímicos, y en un contexto humano las transformaciones de
metales y metaloides pueden tener consecuencias perjudiciales o beneficiosas.
20
4. HIPÓTESIS
Si el agua y los sedimentos del sistema hidrotermal asociado a un manglar en
Playa Santispac contiene diversos metales y metaloides, entonces esperaríamos
que dichos elementos químicos se encontrarán en los oncoides que se desarrollan
en el manantial hidrotermal intermareal dos, lo que influenciaría en la composición
de las comunidades microbianas asociadas a esta estructura biogeosedimentaria.
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Explorar la diversidad de microorganismos cultivables en muestras de oncoides
asociados a manantiales hidrotermales intermareales y relacionarlos con la
composición química de los oncoides.
5.2 Objetivos particulares
1. Determinar la composición elemental de los oncoides de manatitiales
hidrotermales intermareales de Playa Santispac.
2. Aislar y cultivar microorganismos heterótrofos mesófilos del oncoide.
3. Caracterizar el fenotipo de los microorganismos cultivados.
4. Identificar a los microorganismos de cultivos por medio de la secuenciación
parcial del gen 16S ARNr.
21
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Área de estudio
Bahía Concepción está localizada en el Golfo de California en el Estado de Baja
California Sur, aloja un sistema hidrotermal que consiste en diversas
manifestaciones submarinas poco profundas, intermareales y subaéreas
(Ledesma-Vázquez y Jhonson, 2001). Algunas de estas se encuentran en playa
Santispac (Fig. 1) a 1 km de distancia de la entrada de acceso a la playa hacia el
mangle.
En ese sitio se han detectado manantiales hidrotermales asociados al manglar
costero que rodea una laguna (López-Cortés, 1999; López-Cortés et al., 2001). De
la laguna hacia la planicie evaporitica costera se ubicó el manantial número dos
entre los 26°45´45.73´´ de latitud norte y 111°53´39.31´´ de longitud oeste. Con
una dimensión de 4.0 metros de diámetro y 0.5 metros de profundidad (Fig. 2).
Durante la marea alta son inundados y en la etapa de bajamar los fluidos
geotermales son mezclados con el agua de mar dispersándose hacia las zonas
adyacentes (Leal-Acosta et al., 2010). Los fluidos de las ventilas son 40 % agua
de mar y 60 % agua de lluvia sometida a una circulación profunda. El agua termal
se descarga sub-aereamente hacia el mar, pero cuando existe marea alta, el agua
de mar cubre los manantiales (Prol-Ledesma et al., 2004). El agua tiene un rango
de temperatura de 28 a 45 °C, un pH de 7.1 y salinidad de 2.9 %. Comunidades
microbianas bentónicas se han observado adheridas a la superficie de las paredes
del manantial y otras comunidades microbianas que del fondo del manantial se
desprendieron formando natas flotantes en el agua. Y de interés particular
estructuras de color negro identificadas como oncoides en las paredes y en los
bordes del manantial (López-Cortés, 1999).
Estas comunidades microbianas se desarrollan bajo condiciones extremas, como
lo es la desecación, la radiación UV, cambios de temperatura, cambios de
salinidad, y diversos metales disueltos en el agua: Aluminio, Bario, Calcio,
22
Cadmio, Cesio, Cobalto, Cobre, Hierro, Litio, Manganeso, Mercurio, Molibdeno,
Níquel, Rubidio, Titanio, Uranio, Vanadio, Zinc; y al metaloide Arsénico. (Leal-
Acosta, 2012; Prol-Ledesma et al., 2004). También se ha reportado la presencia
de gases de CO2 (44%), N2 (54%), CH4 (2.2%), Ar (0.7%), He (0.04%), H2
(0.007%) y O2 (0.2%) (Forrest y Melwani, 2003).
Figura 1. Mapa de la localización de playa Santispac, Bahía Concepción Baja California Sur, México. ( ) Ventilas y manantiales hidrotermales.
23
Figura 2. Mapa de la localización del manatial hidrotermal 2 en playa Santispac. ( ) Acceso a playa Santispac.
6.2. Parámetros fisicoquímicos y toma de muestras
Del agua del manantial 2 se determinó la temperatura con un termómetro portátil
digital, el pH y la salinidad con un equipo HI pHep+ (Hanna Instruments, Italia).
Se obtuvieron muestras de los escurrimientos y de las paredes del manantial 2,
submuestras de biopelículas (10 mm) de color verde obscuro casi negro y
submuestras de oncoides se colocaron en crioviales con solución preservadora de
ácidos nucleicos denominada RNA later (Hilden Qiagen, Alemania) para los
estudios de biología molecular.
Para el análisis de la composición química de los oncoides, las muestras de
oncoides completos se depositaron en contenedores de plástico, los cuales se
24
secaron al sol durante 24 horas. Muestras secas de oncoides de 5 cm se
emplearon para la determinación de análisis de composición química.
6.3 Composición elemental de los oncoides
6.3.1 Microanálisis elemental por espectroscopía de energía dispersiva de rayos X
Se realizó una detección semicuantitativa de submuestras oncoides en el
Laboratorio de Microscopía Electrónica del CIBNOR, las cuales fueron secadas a
punto crítico siguiendo el método propuesto por Anderson (1956). En un
portamuestras con una etiqueta de carbón conductivo se analizaron dos puntos al
azar (1 mm) de las submuestras utilizando un microscopio electrónico de barrido
Hitachi S-3000N, acoplado a un detector de energía dispersiva (EDS) a 5,000 X de
amplificación y 15 kV de voltaje de aceleración. El análisis de la caracterización se
llevó a cabo con el Sofware SEM EDS Aztec energy.
6.3.2 Microanálisis elemental por espectrometría con plasma acoplado
inductivamente
El análisis cuantitativo se realizó en el Laboratorio de Espectrofotometría de
Absorción del CIBNOR, por medio de un espectrómetro con plasma acoplado
inductivamente (HORIBA). El método para la digestión de la muestra fué tomado
de la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos de acuerdo al
procedimiento 3052-B para determinar metales en sedimentos, lodos y suelos.
Las submuestras se digirieron con una mezcla de ácidos (3 mL HNO3 ultrapuro 60
%, 2 mL HF o H2O2 40 %) para 0.1 g de muestra (peso seco) en un recipiente de
teflón muy bien cerrado, calentado a 200 °C por 12 horas. Resultó una solución
incolora y se le añadió 95 mL de agua ultrapura de un sistema Milli-Q ®.
Para el microanálisis la calibración del equipo se llevó a cabo con soluciones
estándar de 28 metales y metaloides de alta pureza. Las condiciones de operación
25
del equipo fueron realizadas de cuerdo al método 6020-A de la Agencia de
Protección Ambiental de Estados Unidos, este método es para conocer la
composición elemental de muestras ambientales. Las condiciones para la tasa de
flujo de gas fueron: nebulizador 0.86 L/min; Auxiliar de flujo de gas1.2 L/min;
plasma de flujo de gas 15 L/min; voltaje de la lente 7.25 V; I.C.P. de potencia RF
1100 W.
6.4 Aislamiento, crecimiento y cultivo de microorganismos del oncoide
6.4.1. Aislamiento de cianobacterias
Cianobacterias filamentosas fueron crecidas en el medio ASNIII° sin la fuente de
nitrógeno (Rippka et al., 1979) empleado como medio selectivo, bajo las
siguientes condiciones, temperatura de 25°C, agitación de 120 rpm, intensidad de
luz de 35 mol m2s-1.
Se separaron filamentos de cianobacterias por medio de micromanipulación con
pipetas pasteur, con apoyo de un estereoscopio con aumento de 30X, fueron
lavadas con medio de cultivo ASNIII por arrastre. Las cianobacterias unicelulares
se aislaron por dilución hasta extinción y se inocularon en medio ASNIII agar por la
técnica de extensión en placa.
Se disolvieron 0.0025 gramos de antibiótico Inipenem en 50 mL de agua de mar
artificial estéril, obteniendo una solución 0.005%, se emplearon 10 mL de esta
solución en 250 mL del cultivo líquido ASN III, para obtener cultivos libres de
bacterias heterótrofas, con un tiempo de exposición de dos horas (Rippka, 1979).
26
6.4.2. Aislamiento de bacterias heterófrofas mesófilas
250 mL de medio de cultivo caldo 2216 Difco® (ZoBell, 1941) fueron enriquecidos
con trozos de oncoide al 25 % (P/V) para el aislamiento de microorganismos
heterótrofos. El medio de cultivo que contenía oncoide se dividió para aplicar dos
tratamientos. Una porción que no tuvo tratamiento térmico y fue incubado a 30 °C
por 24 horas, posteriormente 500 μL de este cultivo se inocularon por extenión en
placa que contenían medio sólido 2216 e incubadas hasta por 48 horas a 30 °C.
La segunda porción fue tratada, a una temperatura de 120 °C por 15 minutos, con
el objetivo de recuperar bacterias esporuladas, después del tratamiento, 500 μL
fueron inoculados en medio sólido 2216 e incubados a 30 °C hasta por 48 horas.
Cultivos puros, fueron logrados por la técnica de estría cruzada en medio sólido y
dilución hasta extinción (10-6) con extensión en placa en medio sólido agar marino
2216.
6.4.3 Crecimiento y cultivo de microorganismos aislados de oncoides
Las cianobacterias fueron cultivadas y crecidas en el medio de cultivo ASNIII
(Rippka et al., 1979) a 25 °C, agitación de 120 rpm e intensidad de luz de 35 mol
m2s-1 por 9 días.
Las bacterias fueron crecidas y cultivadas en el medio de cultivo comercial 2216
Difco® (ZoBell, 1941), y se incubaron a 30°C por 24 y 48 horas.
Para confirmar la presencia de solo un morfotipo, se realizaron preparaciones de
las muestras microbianas para su observación bajo microscopía de fases.
Aquellos que presentaron un solo morfotipo fueron elegidos para formar parte de
la colección de microorganismos del Laboratorio de Geomicrobiología y
Biotecnología de CIBNOR.
27
6.4.4. Preservación de cultivos de microorganismos
Se preparó un stock de glicerol, de tal manera que el glicerol estéril se diluyó con
agua de mar artificial estéril para obtener una concentración al 60 %. A 1 mL de
cultivos bacteriológicos en medio líquido en fase exponencial altamente densos se
le añadieron 500 μL de glicerol para quedar a una concentración final del 30 %.
Se pre congelaron a -4 °C, luego se pasaron al congelador de -80 °C para su
almacenamiento a largo plazo (Bonavia et al., 2012).
Cultivos líquidos de cianobacterias altamente densos en medio de cultivo líquido
fueron preservados con una solución de dimetil sulfóxido (DMSO) a una
concentración final del 0.5 % como crioprotector. Los cuales se pre congelaron a -
4°C, luego se pasaron al congelador de -80 °C para su almacenamiento a largo
plazo (Ripka et al., 1979).
6.4.5. Caracterización morfológica celular y colonial de los cultivos
Los cultivos puros de bacterias se tiñeron por la técnica de Gram (Gram, 1884).
Posteriormente se analizaron por microscopía de fases, para interpretar los
resultados. Son Gram positivas aquellas bacterias que poseen una pared celular
compuesta por una capa gruesa de peptidoglicano, además de los ácidos
lipoteicoico y tecoico y Gram negativas las bacterias cuya pared celular es delgada
y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior por medio de
lipoproteínas, una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana
compuesta por fosfolípidos y lipopolisacáridos. La diferencia que se observa en la
resistencia a la decoloración se debe a que la membrana externa de las bacterias
Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada
como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó
previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración
azul-violácea, mostrándose finalmente de color rosado. Por el contrario, las
28
bacterias Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor
proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente
orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros, cerrándolos, lo que impide
que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, manteniendo así la
coloración azul-violeta.
Fueron descritos los morfotipos de cultivos de cianobacterias de acuerdo a
sistemas de clasificación botánicos (Anagnostidis y Komarek, 1998; Geitler, 1932;
Tilden, 1968; Desikachary, 1959).
Para la observación de la morfología colonial se empleó un estereoscopio con
aumento de 30X y para la caracterización celular se empleó un microscopio de
contraste de fases acoplado a un sistema de epifluorescencia (Nikon Eclipse 80i,
Japón), la observación se realizó con un aumento de 1000X. Este sistema permite
detectar la presencia de clorofila y por lo tanto la viabilidad de células
fotosintéticas, ya que la clorofila es una molécula capaz de fluorecer al absorber
fotones, emitiendo fotones de menor energía que se observan en el microscopio
como una luz color roja con la ayuda de un filtro azul-violeta BV2 (400-440 nm
longuitud de onda de exitación; Nikon, Japón).
6.5. Secuenciación parcial del gen 16S ARNr
La asignación taxonómica de las cepas bacterianas se realizó a través de la
secuenciación parcial del gen 16S ARNr, para lo cuál se realizó la extracción de
ADN genómico, empleando el Kit comercial DNeasy Blood & Tissue Kit 50 (69504
Qiagen Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo del fabricante. Para conocer la
integridad del ADN aislado se preparó un gel de agarosa al 1 L
de ADN genómico de los cultivos se colocaron en los pozos del gel, en uno de los
pozos se colocó 5 μL de un marcador de peso molecular de 1 kilobase (kb)
(Thermofisher, Massachusetts EUA), las condiciones de la electroforesis fueron
90 volts por 30 minutos, después del tiempo transcurrido el gel se tiñó con el
29
colorante GelRed (Sigma-Aldrich, EUA), para la visualización de bandas de ácidos
nucleicos por excitación del colorante con la luz UV se empleó un fotocumentador
(Bechop UV transilluminator, UVP, BioDoc-it imaging System, EUA). Se determinó
la concentración de ADN (ng/ L) y pureza con respecto a la proteína asociada por
el cociente 260nm/280nm empleando un nanodrop (Lite Spectrophotometer,
Thermo Fisher Scientific, EUA).
Posteriormente, se llevaron a cabo diversas PCR de punto final y de gradiente. Se
emplearon cebadores universales del dominio bacteria, 8F (5'-
AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') y 1522R (5'-AAGGACGTCATCCAGCCGCA-3')
(Turner et al., 1999) más una mezcla de agua grado biología molecular, Go taq
Green master mix (Promega, China) y el ADN (Tabla III), llevándose cabo una
PCR con un termociclador (Gen Cycler, Bio Rad, Hercules, EUA). El programa
fue el siguiente: un ciclo de desnaturalización a 94 °C de 3 minutos, 30 ciclos para
el alineamiento de los cebadores a 94 °C por 1 minuto, 60 °C por 1 minuto, 72 °C
por 2 minutos, y un ciclo final de extensión a 72 °C por 7 minutos (López-Cortés et
al., 2006).
Tabla III. Mezcla para una reacción de PCR con Go taq Green master mix®
Componente Volúmen (μL) Concentración finalGo taq Green Master mix 5x 12.5 1 X
Cebador F 2
Cebador R 2
DNA template 1 15-20ng/μL
Agua (ultrapura) 7.5 -
Para el caso de cepas de cianobacterias se utilizaron los cebadores CYA106F (5’-
CGGACGGGTGAGTAACGCGTG A-3’) y una mezcla CYA781-Ra (GAC TAC
TGG GGT ATC TAA TCC CAT T CYA) + 781Rb (GAC TAC AGG GGT ATC TAA
TCC CTT T) (Nubel, 1997) así como los demás componentes de la mezcla de
reacción antes descritos, el programa del termociclador fue el siguiente: un ciclo
30
de 94 °C por 5 minutos, 30 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 60 °C por 1 minuto, un
ciclo de 72 °C por 1 minutos, un ciclo de 72 °C por 5 minutos (García-Maldonado,
2009).
Los productos se visualizaron en un gel de agarosa al 1 % a 90 volts por 30
minutos, se tiñó el gel con el colorante gel red y se comparó que el tamaño (pb)
del amplicón con los cebadores 8F y 1522R fuera de alrededor de 1500 pb, y para
el caso de los cebadores CYA106F y CYA781Rab fuera alrededor de 400 pb, se
precipitaron con acetato de amonio 5M y se enviaron secuenciar en ambos
sentidos a la compañía GENEWIZ (South Plainfield, N.J. USA). Las secuencias
fueron editadas en el programa Chromas Pro versión 1.7.7 y se realizó la
comparación por BLASTn del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, último acceso
en 2016) para designar una identidad de la cepa.
Dichas secuencias fueron depositadas en GenBank del NCBI
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, último acceso en 2016) con los siguientes
números de acceso asignados KX814337, KX814338, KX814339, KX814340,
KX814341, KX814342 y KX814343.
6.6 Reconstrucción filogenética
Secuencias de genes de bacterias que codifican para el 16S ARNr disponibles de
GenBank y aquellas determinadas en este estudio fueron alineadas usando la
paquetería CLC Genomics WorkBench 8. Los árboles filogenéticos de las cepas
aisladas y de sus vecinos emparentados más cercanos fue construido empleando
la misma paquetería.
Los filogramas fueron calculados de la divergencia en secuencias parciales del
gen 16S ARNr, empleando el método computacional Neighbor Joining (Saitou y
Nei, 1987) con un bootstrapp de 100 réplicas.
31
El árbol filogenético construido con secuencias de organismos del género
Nitratireductor incluyó 581 pb, mientras que el árbol construido con secuencias de
organismos que incluye a B. cereus comprendió 611 pb. Finalmente el árbol
construido con secuencias que incluye a B. licheniformis consideró 502 pb.
7. RESULTADOS
7.1. Parámetros fisicoquímicos del área de estudio
El día 26 de febrero de 2016 a las 12:30 horas, el manantial hidrotermal 2
presentó una temperatura de 38.5 °C, un pH de 7.1, y salinidad de 26 UPS.
7.2. Determinación de la composición química de los oncoides.
Los análisis semicuantitativos realizados con espectroscopía de energía dispersiva
de rayos X (EDS), acoplado a microscopio electrónico de barrido (SEM HITACHI
300) de submuestras de oncoides mostraron estar compuestos por los elementos
químicos Ag, Au, As, Co, Cu, Cl, Ca, Cd, Fe, Na, Mg, Mn, O, Si y S. Para ello se
realizaron dos análisis, el primero que incluyó los elementos oxígeno y silicio
(Tabla IV) (Fig.3) y el segundo excluyó a los elementos silicio y oxígeno, esto se
realizó considerando que estos dos elementos son los más abundantes en la
corteza terrestre, 47 % es oxígeno en forma de minerales (O2-) y 28 % es silicio
como minerales de silicatos (Si4+) comprendiendo el 75 % de la composición de
las rocas en la superficie terrestre (Mason, 1952) (Tabla V) (Fig.4), impidiendo la
detección de elementos representados por bajas abundancias, por ello se
procedió en un segundo análisis con la exclusión de dichos elementos.
32
Tabla IV. Porcentaje en peso y atómico de la composición química de submuestras de oncoide.
Elemento Tipo de radiación Peso % Atómico %
O K 66.24 79.36Na K 1.18 0.99Mg K 2.28 1.79Si K 18.97 12.95S K 0.48 0.29Cl K 1.08 0.58Ca K 4.86 2.33Mn K 4.88 1.70As L 0.02 0.01
Total 100.00
Figura 3. Línea de barrido tomada con SEM-EDS (composición elemental de submuestras de oncoide incluye a los elementos oxígeno y silicio).
Al omitir a los elementos oxígeno y silicio del análisis se evidenciaron los nuevos
elementos: Au, Ag, Cd, Co, Fe y S.
33
Tabla V. Porcentaje en peso y atómico de la composición química de submuestras de oncoide excluyendo los elementos oxígeno y al silicio.
Elemento Tipo de radiación Peso% Atómico%
S K 14.99 26.40Cl K 22.79 36.31Fe K 2.92 2.96Co K 1.14 1.09Cu K 0.00 0.00As L 33.56 25.30Ag L 1.96 1.03Cd L 1.91 0.96Au M 20.74 5.95Total 100.00
Figura 4. Línea de barrido tomada con SEM-EDS, muestra la composición elemental de submuestras de oncoide excluye a los elementos oxígeno y silicio.
Mediante análisis cuantitativos mediante espectrometría de masas con plasma
acoplado inductivamente se cuantificaron los siguientes elementos químicos
contenidos en submuestras de oncoide: Ca, Mg, Na, Mn, K, Fe, Sr, V, Al, Ba, As,
P, Se, Be, Pb, Co, Sb, Ni, Zn, Ag, Cr, Cd y Cu (Tabla VI) (Fig. 5).
34
Tabla VI. Concentración en mg kg-1 de la composición elemental de submuestras de oncoide detectados por espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente.
Elemento mg Kg-1
Ag 6.45Al 723.27As 550.78Ba 950.8333333Be 36.90666667Ca 56606.56Cd 2.743333333Co 23.36Cr 4.666666667Cu 2.256666667Fe 816.4733333K 1662.086667
Mg 28530.90667Na 11599.62333Ni 7.086666667P 133.71
Pb 40.78Sb 21.42666667Se 42.37666667Sn 163.58Sr 1001.193333V 770.0766667Zn 6.9Mn 138312.2333
35
Figura 5. Proporción de elementos químicos de submuestras de oncoides. Basado en el logaritmo base 10 de la concentración en mg kg-1 identificada por espectrometría con plasma acoplado inductivamente.
Ag
Al
As
Ba
Be
Ca
CdCo
CrCuFe
KMg
NaNi
P
Pb
Sb
Se
Sn
Sr
V
Zn Mn
36
7.3. Descripción del oncoide
Una submuestra de oncoide mostró las siguientes características, tamaño de 3 cm
en su corte vertical y 2.5 cm en el corte horizontal, forma semiesférica, de
consistencia compacta, la superficie es pustular, presenta laminación y desde la
sección transversal esta es plana (Fig. 6). Es un oncoide de tipo compuesto,
debido a que la biota dominante está integrada por una asociación de
cianobacterias (Fig. 7), algas, bacterias (Fig. 8), y pequeños caracoles
incrustados. Es calcáreo, y contiene 56606.56 mg kg-1 de calcio.
Figura 6. Oncoides del manantial 2 de Santispac, Bahía Concepción, Baja California Sur.
7.4. Aislamiento, crecimiento y cultivo de microorganismos de oncoides
Se obtuvieron 22 cepas de bacterias heterótrofas aerobias aisladas de oncoides.
De estas, 15 cepas son cultivos mixtos de dos mortipos bacterianos; se lograron 6
como cultivos puros. Todos ellos fueron preservados a largo plazo para la formar
parte de la colección del Laboratorio de Geomicrobiología y Biotecnología del
CIBNOR.
Se cultivaron cianobacterias a partir de cultivos mixtos de las cepas SP2A9606-8 y
LPV9602-5 proporcionadas por el Laboratorio de Geomicrobiología y
Biotecnología del CIBNOR.
10 cm
37
7.4.1. Características diagnósticas de las cepas
7.4.2. Morfología colonial de cultivos de cianobacterias
Cepa SP2A9606-8: Colonia es de forma circular con elevación convexa, el margen
es entero, de color verde, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es
opaco y hacia la luz reflejada es brillante, de consistencia dura, superficie lisa y de
1 mm a 1.5 mm de diámetro.
Cepa LPV9602-5: Colonia es de forma circular con elevación convexa, el margen
es entero, de color verde, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es
opaco y hacia la luz reflejada es brillante, de consistencia dura, superficie lisa y de
1 mm a 2 mm de diámetro.
7.4.3. Morfología celular de cultivos de cianobacterias (Fig. 7)
Synechococcus elongatus cepa SP2A9606-8: Cianobacteria unicelular, presenta
céulas esféricas y en forma de bacilo, de 1.5 a 2 μ de diámetro y de 2 a 4 μ de
longitud. Las células pueden ser unidas en agregados coloniales formando
cadenas de hasta 12 células de longitud unidas por la formación de un mucílago,
no produce vaina laminada bien definida.
Synechocystis pevalekii cepa LPV9602-5: Cianobacteria unicelular, células
esféricas de 1.5 μ. Las células aparecen solas o en parejas después de la división,
reproducción por fisión binaria en un plano.
Figura 7. Morfotipos de cianobacterias detectados por microscopia de contraste de fases. A. micrografía de la cianobacteria unicelular S. elongatus cepa SP2A9606-8 B. Micrografía de la cianobacteria unicelular Synechocystis cepa LPV9602-5
25μm5μm
A B
5μμμμμμmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm
AAAA
38
7.4.4. Morfología colonial de bacterias heterótrofas
Cepa O_6: Colonia de forma circular con elevación, el margen es entero, las
propiedades ópticas hacia la luz transmitida es translúcida y hacia la luz reflejada
es brillante, de consistencia butirosa, superficie lisa y de 1 mm de diámetro.
Cepa O_13: Colonia de forma circular con elevación, el margen es entero, de color
blanco, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es opaca y hacia la luz
reflejada es brillante, de consistencia mucoide, superficie áspera a lisa y de 2 mm
de diámetro.
Cepa O_17: Colonia de forma circular con elevación, el margen es entero a
rizoide, de color blanco, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es opaca
y hacia la luz reflejada es opaca, de consistencia butirosa, superficie áspera y de 2
mm de diámetro.
Cepa O_23: Colonia de forma irregular a filamentosa con elevación, el margen es
ondulado, de color rosa pálido, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es
translúcida y hacia la luz reflejada es brillante, de consistencia dura, superficie
rugosa y de 1 mm de diámetro.
Cepa O_24: Colonia de forma irregular con elevación convexa, el margen es
ondulado, de color crema, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es
translúcida y hacia la luz reflejada es brillante, de consistencia suave, superficie
suave y de 1 mm de diámetro.
Cepa O_26: Colonia de forma circular con elevación convexa, el margen es
entero, de color beige, las propiedades ópticas hacia la luz transmitida es
translúcida y hacia la luz reflejada es brillante, de consistencia mucoide, superficie
suave y de 1 mm de diámetro.
Cepa O_27: Colonia de forma irregular a filamentosa con elevación convexa, el
margen es filamentoso, de color blanco, las propiedades ópticas hacia la luz
transmitida es translúcida y hacia la luz reflejada es brillante, de consistencia dura,
superficie áspera y de 2 mm de diámetro.
39
7.4.5. Morfología celular de bacterias heterótrofas (Fig. 8)
Cepa O_6: Bacterias Gram negativas en forma de bacilos, mótiles, de 0.5 μm de
diámetro por 1 a 1.2 μm de largo, células solas y en parejas, no esporuladas.
Cepa O_13: Bacterias Gram positivas en forma de bacilos, células vegetativas
motiles, de 1 μm de diámetro por 2 a 5 de largo, presenta endoesporas a las
48 horas de incubación, las endoesporas son ovales, subterminales a centrales no
deformantes. Células solas, en parejas y forman cadenas.
Cepa O_17: Bacterias Gram positivas en forma de bacilos, células vegetativas
motiles, de 1 μm de diámetro por 2 a 5 de largo, presenta endoesporas a las
24 horas de incubación, las endoesporas son ovales subterminales no
deformantes. Células solas en parejas y forman cadenas.
Cepa O_23: Bacterias Gram positivas en forma de bacilos, células vegetativas
motiles, de 0.8 a 1 de diámetro por 4 a 8 de largo, presenta endoesporas a
las 48 horas, las endoesporas son ovales terminales no deformantes. Células
solas en parejas y forman cadenas.
Cepa O_24: Bacterias Gram positivas en forma de bacilos, células vegetativas
mótiles, de 0.5 de diámetro por 2 a 5 de largo, presenta endoesporas a las
48 horas, las endoesporas son circulares terminales deformantes. Células solas
en parejas.
Cepa O_26: Bacterias Gram positivas en forma de bacilos, células vegetativas
mótiles, de 1 μm de diámetro por 2 a 4 de largo, presenta endoesporas a las
48 h, las endoesporas son ovales subterminales no deformantes. Células solas y
en formando cadenas.
Cepa O_27: Bacterias Gram positivas en forma de bacilos, células vegetativas
mótiles, de 0.8 de diámetro por 2 a 6 de largo, presenta endoesporas a las
48 horas, las endoesporas son ovales subterminales a terminales no deformantes.
Células solas en parejas y forman cadenas.
40
Figura 8. Micrografías de contraste de fases con aumento de 1000X de cultivos bacterianos. A. Cepa O_6, bacteria no esporulada; B. Cepa O_17; C. Cepa O_22;D. Cepa O_23; Cepa E. O-24; Cepa F O_26; Cepa G O_27. B., C., D.,E., F., y G. muestran endosporas bacterianas a las 24 y 48 horas.
7.5. Asignación taxonómica por la secuenciación parcial del gen 16S ARNrde cepas.
Las secuencias del gen que codifica para el 16S ARNr de las cepas obtenidas fueron comparadas en la base de datos del NCBI GenBank, con acceso en Agosto de 2016 para la asignación taxonómica (Tabla VII) y las secuencias fuerondepositadas en esta misma base de datos.
Tabla VII. Asignación taxonómica por la secuenciación parcial del gen 16S ARNrde las cepas aisladas.
Cepa Longitud (pb) Taxa % de similitudSP2A9606-8 600 Synechococcus elongatus 100
O_6 700 Nitratireductor 99O_22 600 Bacillus 100O_23 800 Bacillus licheniformis 100O_24 600 Ornithinibacillus 99O_26 700 Bacillus 99O_27 800 Bacillus 100
41
7.6 Reconstrucción basada en secuencias de cepas cultivadas
La secuencia de la cepa O_6 estuvo muy emparentada con secuencias de
Nitratireductor sp. y distantemente relacionada con la agrupación de N.
aquamarinus (Fig. 9). La secuencia de la cepa O_22 fue idéntica a secuencias de
Bacillus thuringensis y B. cereus (Fig. 10).
Figura 9. Reconstrucción filogenética de la cepa O_6 y sus vecinos más cercanos derivado de un análisis tipo Neighbord Joining. El filograma fue calculado de la divergencia de secuencias parciales del gen 16S ARNr.
Figura 10. Reconstrucción filogenética de la cepa O_22 derivado de un análisis tipo Neighbord Joining. El filograma fue calculado de la divergencia de secuencias parciales del gen 16S ARNr.
42
Las cepas O_23 y O_27 se agrupan en dos subgrupos cercanamente
relacionados a B. licheniformis; mientras que la secuencia de la cepa O_24 fue
idéntica a secuencias del género Ornithibacillus; finalmente la secuencia de la
cepa O_26 fue idéntica a secuencias de B. amyloliquefaciens, B. subtillis y B.
siamensis (Fig. 11).
Figura 11. Reconstrucción filogenética que incluye las cepas O_22, O_23, O_24, O_26, O_27 y sus vecinos más cercanos derivado de un análisis tipo Neighbord Joining. El filograma fue calculado de la divergencia de secuencias parciales del gen 16S ARNr.
43
8. DISCUSIÓN
8.1. Área de estudio
En el sistema hidrotermal de playa Santispac, Bahía Concepción, B.C.S. se han
presentado variaciones fisicoquímicas temporales y espaciales. Leal-Acosta
encontró que la concentración de los elementos químicos de la abertura
hidrotermal cambió de un año a otro. Y en este estudio se detectó mayor
concentración de algunos elementos en el oncoide respecto a la composición
química del agua de las ventilas geotermales de Santispac reportada en años
anteriores (Tabla VIII) (Leal-Acosta, 2012). También se han registrado variaciones
de temperatura (Canet et al., 2003; García-Maldonado, 2009) y de diversidad
microbiana en cuanto al grupo de las cianobacterias (López-Cortés, 1998, 2001;
García-Maldonado, 2009). También una posibilidad del cambio en la composición
de las comunidades de cianobacterias es el impacto por la actividad turística en el
sitio, que conlleva al uso de los manantiales como albercas de baño.
8.2. Determinación de la composición química de los oncoides
Los elementos más abundantes por espectrometría en el oncoide son Mn (57 %)
el Ca (23 %) y el Mg (12 %). Mientras que las estimaciones semicuantitativas por
espectroscopía confirmaron que los elementos más abundantes en la corteza
terrestre corresponden al O (66 %) y el Si (19 %). Comparando la técnica por
espectrometría con la técnica de espectroscopia y considerando a los elementos
O y Si en el análisis, el Mn es un componente de menor porcentaje en el oncoide
(5 %) al igual que el Ca (5 %) y el Mg (2 %). Descartando el O y el Si del análisis
de espectroscopía la abundancia y el tipo de elemento cambió, evidenciando
aquellos que estaban en menor proporción en las submuestras de oncoide, siendo
los elementos detectados As (33 %), Cl (23 %), Au (21 %) y el S (15 %).
44
Se encontraron diferencias numéricas en cuanto a la composición y concentración
de elementos químicos entre el oncoide y las ventilas (Prol-Ledesma et al., 2004;
Leal-Acosta et al., 2012). Algunos elementos se encuentran en mayor
concentración en el oncoide que en la ventila geotermal de Santispac y que la
corteza terrestre (Tabla VIII).
Tabla VIII. Concentración en mg kg-1 de la composición elemental de oncoides, de la ventila geotermal de Santispac en dos años consecutivos, y la corteza terrestre.Elemento Oncoide Ventila 06-2010 Ventila 07-2011 Corteza
terrestre
Ag 6.45 Ni Ni 0.075Al 723.27 4.4 6.4 8.23As 550.78 162 116 1.8Ba 950.83 340 660 425Be 36.9 Ni Ni 2.8Ca 56606.56 Ni Ni 4.2Cd 2.74 27.7 267 0.2Co 23.36 74 115 25Cr 4.67 139 75 102Cu 2.26 123 627 55Fe 816.47 1.4 3.1 5.6K 1662.08 Ni Ni 20900
Mg 28530.9 3 4.1 23300Mn 138312.23 3 4.1 950Ni 7.08 30 45 75P 133.71 Ni Ni 1050
Pb 40.78 49 27 14Sb 21.43 18 4.2 0.2Se 42.34 11 4.8 0.05Sn 163.58 54 5.9 2.3Sr 1001.19 730 760 350V 770.077 168 183 85Zn 6.9 1838 9.4 70
NOTA: Ni= No identificado. Los valores en negritas se han resaltado para notar a los elementos que están en mayor concentración que en la corteza terrestre.
45
La acumulación de calcio en el oncoide puede deberse a la actividad metabólica
de cianobacterias y o a partir de una combinación de bacterias sulfato reductoras y
la actividad de las cianobacterias (Tekin et al., 2000).
El oncoide es un microhábitat debido a que es una mezcla de minerales y la
mayoría de los microorganismos viven unidos a las superficies (Holm et al., 1992),
parece probable que la estructura de las comunidades bacterianas esté
influenciada por los minerales en su microhábitat. Estudios de otros ambientes
demuestran que diferentes minerales en el suelo pueden seleccionar comunidades
bacterianas distintas formando microhábitats (Roberts, 2004). Los estudios in situ
de microorganismos del suelo y minerales también proporcionan evidencia de que
los minerales influyen en las comunidades bacterianas que viven en sus
microhábitats (Carson et al., 2009). Los minerales en el suelo pueden tener más
influencia en la estructura de la comunidad bacteriana en sus microhábitats
cuando contienen elementos que están ausentes o en concentraciones bajas en el
suelo. Gleeson y colaboradores en 2006, encontraron que la presencia de
ribotipos bacterianos específicos estaban relacionados con elementos químicos
particulares de los minerales.
Los microorganismos poseen metabolismos y funciones específicos para cada
elemento de la tabla periódica y en la siguiente tabla se muestra la función
conocida de los microorganismos en relación con los elementos químicos
detectados en el oncoide (Tabla IX).
46
Tabla IX. Relación de los elementos químicos y la función de los microorganismos. Tomado y modificado de Gadd, 2010.
Elemento Función microbiana
S Degradación de compuestos orgánicos que contienen S; Transformaciones orgánicas-inorgánicas de S; Absorción y asimilación de compuestos S orgánicos e inorgánicos; sulfidogénesis; S (0) acumulación; Reducción y asimilación de SO4-2; Reducción de S (0); Oxidación de compuestos S reducidos, p.e. S (O), tiosulfato, tetrationato; Oxidación de H2Sa S (0); Reducción de S (0) a H2S; Disolución de minerales que contienen S en suelos y rocas (sulfuros, sulfatos).
Fe Degradación de minerales que contienen Fe en rocas y suelos; Solubilización de Fe por sideróforos, ácidos orgánicos, metabolitos, etc.; Reducción de Fe (III) a Fe (II); Oxidación de Fe (II) a Fe (III); Fe biomineralización de óxidos, hidróxidos, carbonatos, sulfuros; Sorción de metales a óxidos de Fe
Mn Oxidación de Mn (II) e inmovilización como óxidos de Mn (IV); Reducción de Mn (IV); Reducción indirecta de Mn (IV)O2 por metabolitos (oxalato); Bioacumulación de óxidos de Mn sobre superficies y exopolímeros; Contribución a la formación del barniz del desierto; biosorción; acumulación; Precipitación intracelular; Biomineralización de Mn, como óxidos, carbonatos, sulfuros, oxalatos; Sorción de metales a óxidos de Mn
Cr Reducción de Cr (VI) a Cr (III); Cr (III) oxidación; Acumulación de oxianiones de Cr
Mg, Ca, Co, Ni,Zn, Cd, Sr
Degradación de minerales en rocas y suelo; biosorción; Absorción y acumulación; Bioprecipitación, como oxalatos, sulfuros, fosfatos, carbonatos; Reducción de Co (III)
Ag Reducción de Ag(I) a Ag (0); biosorción; acumulación
K, Na Absorción y acumulación; Movilización de minerales en el suelo
Cu Movilización de minerales que contienen cobre en rocas y suelos; Formación de CuS; biosorción; Absorción y acumulación; Bioprecipitación (oxalatos)
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Se Reducción de oxianiones de Se: Se (VI) a Se (IV) a Se (0); oxidación de Se (0) ; Biometilación y demetilación de los compuestos de Se; Asimilación de compuestos orgánicos e inorgánicos de Se
Pb Biosorción; Formación de oxalato de plomo; biometilación
Cl, Br Dehalorespiración; Biometilación; Acumulación en biomasa
Sn Degradación de organoestánnicos; Absorción y acumulación de especies de Sn soluble; Biometilación
Au Reducción de especies solubles a Au(0); Dispersión mineral y solubilización
As Biometilación de las especies As: Arsenito a trimetilarsina; Reducción de oxianiones de As: Arsenato a arsenito; Oxidación de oxianiones de As: Arsenito a arsenato
Al Movilización de minerales que contienen Al en suelos y rocas; Disolución de aluminosilicatos; Precipitación de Al como óxidos (fase temprana de la bauxitización); biosorción
Si Absorción de especies de Si soluble; Formación de complejos orgánicos de Si a partir de silicatos inorgánicos; Formación de siloxano orgánico; Degradación de sílice, silicato y aluminosilicatos; Movilización de Si a través de la producción de quelantes, ácidos, bases, exopolímeros; silicificación
V Acumulación de V; Reducción de V(V) a V(IV)
Como se muestra en la tabla anterior los elementos detectados en los oncoides
del manantial dos de Santispac pueden ser acumulados o asociados con la
biomasa microbiana, de tal manera que los microbios son capaces de mediar la
bioprecipitación de metales y minerales, por la producción de metabolitos,
cambiando las condiciones microambientales fisicoquímicas alrededor de la célula,
y también por la liberación de sustancias, como el fosfato por la descomposición
orgánica, también las paredes celulares microbianas contienen exopolímeros
capaces de absorber, unir o atrapar muchas especies de metales solubles e
insolubles (Gadd, 2010).
48
Deben considerarse para evitar daños a la salud humana los resultados del
análisis de espectrometría respecto a la concentración del metaloide As en el
oncoide que es de 550.78 mg kg-1 debido a que algunas especies químicas del As
son altamente tóxicas, el arsenato es un análogo estructural del fosfato,
interfiriendo en el metabolismo celular, en particular desacoplando el sistema de
fosforilación de la cadena respiratoria y el arsenito bloquea a los grupos sulfhidrilo
(- SH) y grupos (- OH) de proteínas, modificando su estructura (Wang et al., 2014).
Por otro lado la abundancia de As en las manifestaciones hidrotermales llama la
atención por la posibilidad de encontrar microorganismos que metabolicen
arsénico, de tal forma que lo pueden reducir oxidar o metilar, lo cual es importante
conocer por el impacto positivo y negativo que estas tranformaciones químicas
puedan significar a la sociedad.
Otros elementos que están enriquecidos en comparación de la corteza terrestre y
son tóxicos son el Ba y el V. El bario es un antagonista competitivo del canal de
potasio que bloquea el flujo pasivo del potasio intracelular, dando como resultado
un desplazamiento del potasio de los compartimentos extracelulares a los
intracelulares. El resultado neto de este cambio es una disminución significativa en
la concentración de potasio en el plasma sanguíneo. Los efectos asociados son
hipopotasemia, efectos gastrointestinales, daño cerebral, debilidad muscular y
parálisis (Tarasenko et al., 1976).
El vanadio provoca una variedad de efectos tóxicos tales como cambios
hematológicos y bioquímicos, por ejemplo, hemólisis y disminución en el recuento
de eritrocitos, nivel de hemoglobina, índice de hematocrito, lesiones neuronales,
afectandoo la actividad neuronal general y en el aprendizaje, anomalías en el
desarrollo y la reproducción, por ejemplo, embriotoxicidad, teratogenicidad o
lesiones morfológicas y funcionales en hígado, riñones, huesos, bazo y leucocitos.
La inhalación de vanadio puede causar rinitis, faringitis, tos crónica productiva,
49
traqueobronquitis, broncopneumonia y muerte (Barceloux, 2000; Ghosh et al.,
2015).
8.3. Aislamiento, crecimiento y cultivo de microorganismos de oncoides
Se aislaron bacterias Gram positivas, del género Bacillus formadoras de esporas,
tras aplicar un tratamiento de temperatura de 121 °C durante 15 minutos.
En un estudio donde el objetivo era saber la temperatura máxima de resistencia de
las esporas de Bacillus subtilis cepa STCC 4524, las esporas en buffer de citrato-
fosfato (pH 7) toleraron hasta 102 °C (Palop et al., 1999). Las esporas de B.
subtilis cepa PS832 comienzan a desnaturalizarse sus componentes (proteínas) a
una temperatura de 70 °C (Zhang et al., 2009).
Entre los factores importantes para determinar el nivel de resistencia a las
esporas. Estos factores incluyen la composición genética, las condiciones precisas
de esporulación, particularmente la temperatura, las capas de esporas, la relativa
impermeabilidad del protoplasto de las esporas, el contenido de agua del
protoplasto , el alto nivel de minerales en la espora, etc. Por ejemplo, las esporas
bacterianas suelen ser más resistentes al calor cuando esporulan a temperaturas
más altas (Berg et al., 1970; Condón et al., 1996). Temperaturas más altas de
esporulación se han correlacionado con mayores niveles de mineralización de
esporas (Lechowich y Ordal, 1962). Se cree que los minerales (calcio
principalmente) aumentan el grado de inmovilización de las moléculas y
estructuras, haciéndolos menos sensibles al calor (Gerhardt y Marquis, 1989). Los
tipos de minerales y el contenido global de esporas pueden modificarse un poco
cambiando la composición mineral del medio de esporulación (Slepecky y Foster,
1959).
La supervivencia de endosporas a condiciones adversas, permite especular sobre
la posibilidad de que las endosporas sean la forma en que los microorganismos
se transporten a Marte o visceversa, por elemplo, el caso de esporas de Bacillus
subtilis que sobrevivieron en el espacio por 6 años (Nicholson et al., 2000). Se
50
sabe que en la Tierra, las esporas pueden transportarse a través del aire, el agua
y organismos huésped, a ambientes potencialmente favorables para su
germinación y reanudar el crecimiento vegetativo.
8.4. Secuencias del gen 16S ARNr
La cepa O_6 se identificó dentro del género Nitratireductor con un valor de
similitud del 99 %, corresponde -proteobacteria, especies de este género
reducen nitratos a nitritos. Se reconocen seis especies aisladas de hábitats
marinos. N. aquibiodomus reduce nitratos a nitritos, y fue aislado de un sistema
de denitrificación marino en Montreal, Canadá. N. basaltis se aisló de arena de
playa de la isla de Jeju, Corea. N. kimnyeongensis se aisló de una muestra de
algas secas colectada de la playa de Kimnyeong en Jeju, Corea. N. indicus. y N.
aquimarinus fueron aisladas en el agua del mar del este en Corea y N. pacificus
fué aislada de aguas profundas del océano Índico y también de sedimentos de
aguas profundas del Océano Pacífico, respectivamente (Labbé et al., 2004; Kim et
al., 2009; Kang et al., 2009; Lai et al., 2011). Es la primera vez que este género es
aislado de un ambiente hidrotermal, y de especial interés sería conocer si estos
microorganismos poseen alguna estrategia para la detoxificación de metales y
metaloides por ejemplo, al As.
Las cepas O_22, O_26 y O_27 se identificaron dentro del género Bacillus con un
valor de similitud del 100 %. Este es un grupo extremadamente diverso pues
muestran una serie de habilidades fisiológicas que les permiten vivir en una amplia
gama de hábitats, incluyendo muchos hábitats extremos como las arenas del
desierto, las aguas termales y los suelos árticos. Las especies del género Bacillus
pueden ser termófilas, psicrófilas, acidófilas, alcalifílicas, halotolerantes o
halofílicas y son capaces de crecer a valores de pH, temperaturas y
concentraciones de sal en las que pocos otros organismos pueden sobrevivir
(Rüger et al., 2000). Son esporulados y cada célula puede formar una espora,
éstas se forman cuando el microorganismo se encuentra en un ambiente
51
desfavorable para su desarrollo, lo que les confiere gran resistencia en el
ambiente (Madigan et al., 2009). 15 cepas de Bacilllus fueron aislados de las
ventilas hidrotermales someras de las islas Panarea en Italia (Gugliandolo, 2012),
por lo que el aislar tres cepas de características coloniales y celulares distintas del
género Bacillus podemos comprobar su capacidad para adaptarse al ambiente.
La cepa O_24 que se identificó dentro del género Ornithinibacillus con un valor de
similitud del 99 %, pertenece a la familia Bacillaceae. Especies de este género han
sido aislados de varios ambientes, por ejemplo, Ornithinibacillus contaminans cepa
DSM22953T fue aislada de sangre humana, O. californiensis cepa DSM16628T fue
aislado de sedimento marino, O. scapharcae cepa TW25T fue aislado de una
almeja muerta, O. bavariensis fue aislada de leche de vaca de Baviera
enAlemania. Esta es la primera vez que este género es aislado de sistemas
hidrotermales, lo que parece no ser tan extraño ya que en el genoma de O.
californiensis cepa DSM16628T fueron encontrados genes de respuesta al estrés y
de resistencia a los metales pesados lo que refleja su adaptación al ambiente
complejo marino (Francis y Tebo, 2002; Bagheri et al., 2013; Lu, 2014).
La cepa O_23 fue asignada a la especie Bacillus licheniformis con un valor de
similitud del 100 %, esta es una especie que se encuentra en una amplia gama de
ambientes por ejemplo, en dieferentes clases de suelos, en alimentos, en
aminales, en las plumas de las aves, de agua marina y dulce, particularmente se
han aislado en ambientes hidrotermales, tales como salinas hidrotermales y
ventilas hidrotermales someras en Italia, los exopolisacáridos que excretan las
células de la cepa asilada en las ventilas hidrotermales somera de las islas
Vulcano en Italia son de alto uso potencial para el desarrollo de nuevos fármacos
(Spano et al., 2013). El hecho de obtener una cepa aislada de esta especie en un
ambiente hidrotermal no es nuevo, pero sí, las condiciones del microhábitat que
esta especie ocupa por que lo pudiera ser un ecotipo nuevo.
52
La especie de cianobacteria Synechococcus elongatus cepa SP2A9606-8 con un
valor de similitud del 100%, corresponde a una cianobacteria que se encuentra
ampliamente extendida en el medio marino. Ha sido empleada como modelo de
estudio en diversas disciplinas científicas. De particular interés en este estudio
sobresale su capacidad de resistencia a metales y metaloides, salinidad, y altas
temperaturas. Además esta especie presenta altas tasas de transferencia
horizontal de genes que resulta en una alta variabilidad genética con ventajas
evolutivas (Paerl et al., 2011). Lo que puede explicar su adaptación a las
condiciones fisicoquímicas de los oncoides.
Las bacterias cultivadas fueron asignadas a taxones que han sido aislados de una
gran versatibilidad de ambientes, lo que prueba que estos microorganismos se
adaptan a diversos nichos. Esto sugiere que forman parte de la biósfera común
de los oncoides, ya que fueron crecidos en medio de cultivo marino convencional.
Estudios demuestran que los microorganismos poco abundates o raros, sólo es
posible detectarlos empleando tecnología de secuenciación de punta. A estos
microorganismos se les ha llamado reservorios genéticos, puesto que están a la
espera de que las condiciones ambientales favorezcan su metabolismo para así
incrementar su crecimiento poblacional, y en tal caso, podría ser que las ventilas
hidrotermales son reservorios genéticos microbianos debido a los múltiples
cambios ambientales que están presentan (Sogin et al., 2006).
No existe ningún método para determinar la totalidad de la diversidad, abundancia
y función de los microorganismos en la Tierra. Sin embargo, los recientes
avances tecnológicos nos han permitido conocer mayores escalas de diversidad
microbiana. No ha sido sencillo establecer los métodos para su estudio, los
microorganismos (especialmente bacterias y arqueas) se distinguen mejor por su
diversidad metabólica más que por su morfologías. Crear estándares para
delimitar que hace un microbio diferente de otro ha sido contencioso (Banfield et
al., 2005), sobre todo si analizamos cuál es el concepto de especie en
53
microbiología. Una definición de especie microbiana, es aquella que refiere a su
ecología, podríamos referirnos a ellas como ecotipo microbiológico. La interacción
genética y procesos celulares se definen tanto por los organismos a su alrededor
como por las características físicoquímicas del ambiente. Los métodos
independientes de cultivo han aumentado considerablemente nuestra
comprensión de las comunidades microbianas que habitan el medio marino (Sogin
et al., 2006). Estamos en la era en la que en un etudio de diversidad pueden
revelarse simultáneamente un gran número (millones) de individuos y genes
(Bartram et al., 2011). Pero todas las técnicas tienen sus limitaciones y sesgos
(Schloss, 2016). Los resultados obtenidos están sujetos a una multitud de
factores, como lo son los cambios físicos y químicos del ambiente (temporales), a
las relaciones entre organismos, el método de colecta, el método de obtención del
ADN, etc. Pensar en que se ha llegado a un límite parece ser una suposicion muy
apresurada.
Además que pueden estar desempeñando funciones únicas y específicas en el
ambiente, como asimilar elementos químicos para poder ser metabolizados por el
resto de los organismos. Un ejemplo pudiera ser la transformación de compuestos
tóxicos en otros con de menor toxicidad de ciertos elementos del oncoide con
beneficio para el resto de la biodiversidad que se desarrolla en el manglar.
Existe evidencia fósil de hace 3,500 millones de años (Dunlop et al., 1978) que
apoya la existencia de los microorganismos. Durante todo este tiempo las
bacterias han interactuado con los elementos químicos. Un ambiente parecido a
estas condiciones son los ambientes hidrotermales, de los cuales se han
formulado teorías sobre el origen de la vida, sobre los mecanismos de regulación
y moleculares que hacen que la vida sea posible en condiciones adversas, y
posibilitan que organismos vivos se desarrollen en otros planetas (Brock, 1969;
Herschy et al., 2014). Entonces la hipótesis del origen de la vida a partir de las
ventilas hidrotermales nos deja claro que la vida sedesarrolla en la frontera de lo
abiótico y abiótico para formar biomoleculas, obteniendo compuestos que
54
permitieron dar forma a estructuras que les permitió encapsular un grupo selecto
de elementos químicos del resto (membrana), si a partir de aquí, evolucionaron
todas las formas biológicas actuales, pareciera ser que algunas formas de vida
siempre se adaptan al ambiente.
8.5. Diversidad filogenética de bacterias aisladas de oncoides
La secuencia del gen 16S ARNr de la cepa O_6 se localizó en la regiones
variables que van de la V1 a la V3 y mostró diferencias con aquellas reportadas en
GeneBank para el género Nitratireductor.
La secuencia del gen 16S ARNr de la cepa O_22 está comprendida en una
agrupación que incluye dos especies distintas del género Bacillus, aun siendo
idénticas 502 pb de las regiones variables que van de la V1 a la V4.
La secuencia del gen 16S rRNA de las cepas O_23 se localizó en regiones
conservadas correspondientes a V4 a la V7, la cepa O_26 incluyó regiones
variables y regiones conservadas, mientras que la secuencia O_27 se localizó en
la región variable V1 a la V4. Aun siendo secuencias correspondientes al género
Bacillus, se observaron en la topología del árbol subgrupos distantemente
relacionados.
La secuencia del gen 16S rRNA de la cepa O_24 se localizó en regiones variables
V1 a la V3. Esta secuencia es idéntica a una secuencia de un clon no cultivable,
por lo que la cepa O_24 obtenida pudiese ser el representante cultivable de dicho
clon.
55
9. CONCLUSIONES
Las ventilas hidrotermales intermareales asociadas a un manglar localizado en la
Playa Santispac en Bahía Concepción pueden ser consideradas como una fuente
geogénica de metales y metaloides, debido a que el estudio de la concentración
química de los oncoides indicó que 15 metales y metaloides, están por encima de
la concentración que de la corteza terrestre.
Las esporas de las cepas de bacterias obtenidas del género Bacillus son
resistentes a la temperatura de 121°C durante 15 minutos, por lo tanto podrían ser
utilizadas para fines biotecnológicos.
Las bacterias aisladas de los oncoides compuestos por 28 metales y 2 metaloides
crecieron en medio comercial 2216 enriquecido con oncoides. De la misma
manera las cianobacterias aisladas de los oncoides crecieron en medio ASN III
enriquecido con oncoides. Por lo que los cultivos obtenidos en este trabajo pueden
ser empleados como modelos de estudio para la identificación y análisis de los
mecanismos genéticos y bioquímicos responsables de la resistencia bacteriana a
metales y metaloides. Otros estudios pueden incluir la selección de las cepas con
el mejor potencial para su uso en biorremediación.
Los géneros Nitratirreductor y Ornithinibacillus se reportan por primera vez en
ventilas hidrotermales en el mundo. Son especies que se describieron
recientemente, por lo que cualquier aportación es de relevancia científica o
biotecnológica.
El análisis filogenético de las cepas recuperadas mostró que estos
microorganismos están lejanamente emparentados entre sí y muy variables,
posiblemente debido a las diferentes condiciones ambientales a las que se deben
de adaptar.
56
10. RECOMENDACIONES
Las ventilas hidrotermales difusas son comunidades muy complejas y diversas.
Por lo que se recomienda llevar a cabo estudios metagenómicos, los cuales
posibilitan estudiar el mayor número de genes posibles (el gen 16S ARNr y genes
funcionales). De esta manera sería posible detectar algunos de los
microorganismos que se encuentran en baja abundancia, pudiendo estos
representar la mayor parte de la diversidad filogenética del sitio, además que
puedieran tener gran relevancia ecológica.
Pueden llevarse estudios más específicos para revelar un metabolismo en
particular, por medio de la secuenciación masiva de un gen funcional. Siendo
necesario el diseño de cebadores específicos, y llevar a cabo estudios
geoquímicos más detallados, que permitan distinguir las especies químicas de los
elementos asociados al metabolismo.
Otros enfoques biotecnológicos o ecológicos pueden desarrollarse, por ejemplo,
estudiar los genomas completos de estas cepas, o comparar como cambian las
comunidades microbianas sujetas a las condiciones de este ambiente.
También las cepas obtenidas en estes estudio pueden ser empleadas como
modelos de estudio apoyándose con otras disciplinas (por ejemplo, bioquímica,
evolución).
57
11. LITERATURA CITADA
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