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AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y

TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA

TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS –

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META

DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

BOGOTÁ

2009

2


DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y





TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para Optar el Título de

Microbiólogo Agrícola y Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBÍOLOGIA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

BOGOTÁ D.C.

2009

3

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

4


DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y




DIANA ALEXANDRA PACHON CUBILLOS

APROBADO

______________________________ ______________________________

Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarín MV. Carlos Alfonso Moreno Torres

Director. Revisor Consultor

Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia

______________________________ ______________________________

MV. MS.c. Rubiela Castañeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos

Jurado Jurado

Pontificia Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.

5


DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y





APROBADO

______________________________ _____________________________

INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P.

Decana Académica Directora

Facultad de Ciencias Carreras de Microbiología

6

A Dios por llenarme de bendiciones cada día y llevarme de su mano por el camino que

me permitirá alcanzar todos mis objetivos.

A mi madre por ser el mayor ejemplo de fortaleza, constancia, dedicación y superación;

por todo su esfuerzo para que juntas alcanzáramos esta meta, por su confianza y

dedicación y por haberme hecho el ser humano que soy ahora.

A mi padre por que desde el cielo me ha acompañado durante todos estos años, por su

ejemplo de entereza, sabiduría y fortaleza.

A mi hermano por su apoyo, confianza y compañía durante todos los años de mi vida, a

mi abuelita por estar siempre a mi lado haciendo de mi un ser humano fuerte y

perseverante, a mi sobrinito por ser la luz de mi vida.

A Javier por acompañarme durante todo este proceso, brindándome apoyo en los

momentos difíciles y por infundirme paciencia cuando creí que esto no sería posible.

7

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Adriana Pulido Villamarín, por haberme dado la confianza para la realización de

este proyecto, por su dedicación, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos

sus conocimientos para la realización de este trabajo.

Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para

concluir con éxito este trabajo.

Al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la

Universidad Nacional de Colombia, a su directora Dra. Judith Figueroa Ramírez y Dra.

Derly Fierro Toscano por haberme dado la oportunidad de trabajar en sus instalaciones,

ya que sin su colaboración esto no hubiera sido posible.

Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotación de medios de cultivo,

kit de identificación y sensidiscos.

A todo el personal de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su

colaboración y especialmente a su directora profesora María Cristina Ardila por sus

aportes al trabajo.

ENERO DE 2009

8

TABLA DE CONTENIDOS

Página

1. INTRODUCCIÓN 17

2. MARCO TEÓRICO 19

2.1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE 19

2.2. GÉNERO Salmonella 20

2.2.1. Caracterización morfológica y bioquímica 21

2.2.2. Clasificación taxonómica 22

2.2.3. Estructura Antigénica 22

2.2.4. Factores de virulencia 24

2.2.5. Patogénesis y patogenicidad 24

2.2.6. Salmonelosis 27

2.2.7. Diagnóstico 27

2.2.7.1. Métodos de aislamiento de Salmonella sp. 28

2.2.7.2. Identificación bioquímica 34

2.2.7.2.1. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. 35

2.2.7.3. Serotipificación 37

2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann - White 38

2.2.8. Sensibilidad Frente a agentes antimicrobianos 39

2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos 40

2.2.8.2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 41

2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby-Bauer) 41

2.2.8.2.2. Interpretación de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por

el método de difusión en agar. 42

2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos 42

2.3. EL GÉNERO Salmonella sp. ASOCIADO A LOS REPTILES 43

2.4. ESPECIES EN ESTUDIO 47

2.4.1. Caimán del Orinoco (Crocodylus intermedius) 47

2.4.2. Testudinos 48

2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles 49

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 51

3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 51

3.2 JUSTIFICACIÓN 52

4. OBJETIVOS 53

4.1 OBJETIVO GENERAL 53

viii

9

Página

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 53

5. MÉTODOLOGÍA 54

5.1. ÁREA DE ESTUDIO 54

5.2. POBLACIÓN MUESTRAL 54

5.3. TOMA DE MUESTRAS 54

5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal 56

5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques 57

5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques 58

5.4. FASE ANALÍTICA 59

5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp. 59

5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo 59

5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo 59

5.4.1.3. Aislamiento primario en medio selectivo y diferencial 59

5.4.1.4. Identificación bioquímica 63

5.4.1.5. Serotipificación 63

5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos 64

6. RESULTADOS Y DISCUSION 66

6.1. ANÁLISIS DE DATOS 66

6.2. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL GÉNERO Salmonella sp.

POR TÉCNICA BBL CRYSTAL® 66

6.3. POSITIVIDAD A Salmonella sp. EN ESTANQUES DE CROCODYLIA Y

TESTUDINEA 67

6.4. PRESENCIA DE Salmonella sp. SEGÚN LA ESPECIE 69

6.5. AISLAMIENTOS DE Salmonella sp. SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA

PARA EJEMPLARES DE CROCODYLIA Y TESTUDINOS 71

6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia según

grupos etáreos 74

6.6. SEROTIPIFICACIÓN 75

6.7. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS 77

6.8. MICROORGANISMOS DIFERENTES A Salmonella sp. AISLADOS EN

LOS ESTANQUES DE LA ESTACIÓN 80

7. CONCLUSIONES 85

8. RECOMENDACIONES 86

9. REFERENCIAS 87

10. ANEXOS 106

ix

10

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla Nº 1. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de

Salmonella sp. 34

Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de

microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. 37

Tabla Nº 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y número de cepas

de Salmonella sp. aisladas para cada especie según estanques muestreados 55

Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp.

aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los

antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer 77

Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp.

aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los

antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer. 78

x

11

INDICE DE FIGURAS

Página Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46 Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46 Figura Nº 3. Caimán del Orinoco o Caimán Llanero (C. intermedius) 48 Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F 49 Figura Nº 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56 Figura Nº 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius mediante hisopado cloacal. 57 Figura Nº 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58 Figura Nº 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos y Testudinos 58 Figura Nº 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58 Figura Nº 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros de los animales en estudio. 59 Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de cultivo selectivos. 60 Figura Nº 9 A. CRHOMagar Orientación 60 Figura Nº 9 B. Agar MacConkey 60 Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella sp. aisladas en los medios de cultivo diferenciales. 61 Figura Nº 10 A. CHROMagar Salmonella. 61 Figura Nº 10 B. Agar Hektoen Entérico. 61 Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. 62 Figura Nº 11 A. Staphylococcus saprophyticus. 62 Figura Nº 11 B. Escherichia coli. 62 Figura Nº 11 C. Enterococcus sp. 62 Figura Nº 11 D. Klebsiella sp. 62 Figura Nº 11 E. Citrobacter sp. 62

xi

12

Página

Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal® para microorganismos entéricos/no fermentadores. 63 Figura Nº 12 A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque de Testudinos número 21. 63 Figura Nº 12 B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán neonato en el estanque número 47 63 Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para la serotipificación de las cepas de Salmonella sp. y modo en que se empleó. 64 Figura Nº 14. Antibiograma 65 Figura Nº 15. Porcentaje de presentación de Salmonella sp. en los estanques de la E.B.T.R.F. 67 Figura Nº 16. Estanques de Tortugas positivos y negativos a Salmonella sp. 69 Figura Nº 17. Estanques de C. intermedius positivos y negativos a Salmonella sp. en la E.B.T.R.F. 70 Figura Nº 18. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra en Testudinea 72 Figura Nº 19. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra en estanques de C. intermedius 72 Figura Nº 20. Porcentaje de aislamientos positivos a Salmonella sp. en los estanques de Crocodylia según los grupos etáreos. 74 Figura Nº 21. Serotipificación de Salmonella sp. aislada en la E.B.T.R.F 76 Figura Nº 22. Pruebas de Sensibilidad a antimicrobianos 78 Figura Nº 23. Microorganismos diferentes a Salmonella sp aislados en los estanques de C. intermedius y Testudinos de la E.B.T.R.F 80 Figura Nº 24. Microorganismos aislados las muestras de agua y sedimento en los estanques de Testudinea muestreados 81 Figura Nº 25. Microorganismos aislados en las muestras de arena y materia fecal en los estanques de Testudinea muestreados 81 Figura Nº 26: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados cloacales de ejemplares de Testudinata muestreados 82 Figura Nº 27: Microorganismos aislados en las muestars de agua y sedimento de los estanques de C. intermedius muestreados 82 Figura Nº 28: Microorganismos aislados en las muestras de arena y materia fecal halladas en los estanques de C. intermedius muestreados 83

xii

13

Figura Nº 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 83

xiii

14

ÍNDICE DE ANEXOS

Página

ANEXO N º 1. Plano de la E.B.T.R.F 106

ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar

Orientación 107

ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/No

Fermentadores. 108

Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por

sistema BBL Crystal. 108

Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109

Anexo 3.3. Calculo del número de perfil 109

ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann – White 110

ANEXO Nº 5. Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 112

ANEXO Nº 6. Resultados obtenidos por estanque en cada muestreo. 114

xiv

15

RESUMEN

Durante mucho tiempo las enterobacterias pertenecientes al género Salmonella han sido

reportadas como patógenos para humanos y animales tanto domésticos como silvestres;

aunque también hacen parte de la flora normal intestinal de reptiles, especialmente de

tortugas.

La Estación de Biología Tropical Roberto Franco de la Universidad Nacional de

Colombia, ubicada en la ciudad de Villavicencio, lidera el programa de recuperación del

Caimán Llanero (Crocodylus intermedius) que se encuentra en inminente peligro de

extinción y además cuenta con una colección viva de Testudinos de diferentes géneros.

Con el fin de evidenciar la presencia del enteropatógeno en la Estación, se procedió a

aislar microorganismos del género Salmonella a partir de muestras de origen ambiental y

cloacal de las especies allí encontradas, utilizando la metodología microbiológica

estándar; posteriormente se procedió a serotipificar los aislamientos por el método

convencional de Kauffmann-White especialmente a nivel de antígeno somático y

finalmente se realizó la prueba de sensibilidad a antimicrobianos para cada cepa

encontrada en la Estación.

Los resultados reportan una prevalencia del 52% de Salmonella sp. en el total de la

población muestreada, con una mayor positividad a partir de muestras de

agua/sedimento y las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos determinaron que el

100% de los aislamientos fueron sensibles a la norfloxacina. Teniendo en cuenta que

microorganismos del serogrupo C2 fueron los más prevalentes (41,4%) y conscientes del

riesgo zoonótico se dio inicio a la implementación de un manual de bioseguridad para la

estación y así prevenir todo riesgo para la población animal y humana.

Los resultados obtenidos fortalecerán programas de sanidad animal que pretenden

garantizar la salud de los ejemplares y realizar nuevas investigaciones de patogenia,

nutrición, etología y genética.

16

ABSTRACT

Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild;

in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles.

The Estación de Biología Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is

part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the

Caiman Llanero (Crocodylus intermedius), which is in imminent extinction danger and

also bill with an alive collection of Testudinos of different families.

With the purpose of evidencing the presence of the enteropathogen, we proceeded to

isolate microorganisms of the gender Salmonella sp. starting from samples of

environmental and cloacae origin using the standard methodology; we proceeded to

serotyping the isolations for the conventional method of Kaufmann-White and finally we

did an antimicrobial susceptibility test for each strain found in the Estación.

Results reports a prevalence of 52% of Salmonella sp in the population sampled with a

bigger detection starting from samples of water/silt. Antimicrobial susceptibility test could

determine than 100% of the isolates were sensible to norfloxacine. Knowing that

microorganism of serogroup C2 were the most prevalent (41,4%) and aware of the

zoonotic risk we begin to the implementation of a biosecurity manual for the Estacion and

this way to prevent all risk for the animal and human population.

Results going to strength programs of animal sanity that seek to guarantee the health of

the animals and to carry out new in investigation in pathology, nutrition, etiology and

genetics.

17

1. INTRODUCCIÓN

Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se

encuentran como comensales y patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos

domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de

enfermedades en sus hospederos, considerándose como la principal enterobacteria de

importancia en salud pública (Selbitz et al.,1995. Turnbull, 1979).

Para el caso de Latinoamérica y especialmente para Colombia la investigación acerca de

microorganismos pertenecientes al género Salmonella se ha centrado en relación con las

enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha

investigado con respecto a la transmisión por reptiles donde esta enterobacteria hace

parte de la flora intestinal normal; a pesar que las autoridades reguladoras del medio

ambiente reconocen el problema zoonótico que representan las especies silvestres

frente a la población humana, las investigaciones en el área biológica y veterinaria son

insuficientes (Hernández, 2004)

Los reptiles frecuentemente son portadores asintomáticos de Salmonella sp. y por

consiguiente, los casos clínicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia

(Ramsay, et al, 2002). Sin embargo, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos

niveles de mortalidad en serpientes y tortugas, y a su vez, un gran porcentaje de

investigaciones han implicado la herpetofauna en la transmisión de Salmonella sp. hacia

los humanos, lo cual permite establecer la capacidad de generar procesos de infecciones

zoonóticas y la importancia de la bacteria a nivel de salud pública (Saelinger y Lewbart, 2006).

De manera natural los reptiles son susceptibles a enfermedades que contribuyen a la

disminución de las poblaciones; aunque en la mayoría de los casos se desconoce la

acción patógena de los microorganismos sobre estas especies silvestres, ignorándose el

impacto que tienen las enfermedades bacterianas sobre las mismas, así como el

tratamiento ideal para combatir los signos producidos (Mader, 1996). Sin embargo, es de vital

importancia tener en cuenta que la presencia de éste tipo de endopatógenos no se

asocia necesariamente con estados de enfermedad (Lax, et al., 1995). Desde el punto de vista

profiláctico, la susceptibilidad a patologías causadas por enterobacterias en reptiles se

relaciona con estados de depresión en el animal, que pueden producirce a causa del

estrés por el cautiverio, alteración en temperaturas medioambientales, el número de

microorganismos presentes, edad, estado nutricional del animal, entre otras (Mader, 1996).

Los resultados asociados a este tipo de condiciones son la afección de tejidos y fluidos

por generar un bloqueo de los vasos sanguíneos, edema, ulceraciones, necrosis,

18

disminución de actividad, pérdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitación,

diarrea, constipación y letargia. (Jertborn et al 1990).

Estudios sobre Salmonella sp. en especies silvestres demuestran que su presencia es

constante, pero se deben conocer las serovariedades implicadas y la sensibilidad que

tienen tanto animales cautivos como salvajes para ser afectados por el microorganismo

con el fin de minimizar los posibles inconvenientes que se pueden presentar en los

programas de recuperación debido a enfermedades asociadas al enteropatógeno;

además, parece ser que en los centros donde los reptiles están en condiciones de

cautividad, hay más posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre (Ramsay

et al., 2002). La Estación de Biología Tropical Roberto Franco, es el centro de recuperación

de especies silvestres en vía de extinción más importante en el país, ha demostrado una

excelente gestión en el manejo de estas poblaciones logrando así minimizar los riegos

de extinción de las especies; es una entidad encaminada al cuidado y recuperación de

ejemplares de Crocodylus intermedius (Caimán Llanero) y Testudines llevando a cabo

investigaciones en el ámbito de salud, nutrición y reproducción que permiten la

repoblación de estos ejemplares; sin embargo, las condiciones ex situ de los animales

producen estados de inmunosupresión donde microorganismos patógenos como

Salmonella sp. pueden llegar a colonizar generando cuadros de enfermedad en los

individuos; con base en ello, es necesario tener en cuenta que el conocimiento de la

microbiología entérica de estas especies es fundamental para diagnosticar desórdenes en

la flora digestiva así como para prevenir infecciones secundarias, todo ello dirigido a

optimizar los respectivos programas de conservación de estas especies silvestres (Saelinger y

Lewbart, 2006)

Mediante la realización de este estudio se pretende llevar a cabo un análisis sobre la

condición de los animales de Orden Crocodylia y Orden Testudinea cautivos en la Estación

de Biología Tropical Roberto Franco dependencia de la Facultad de Ciencias de la

Universidad Nacional de Colombia, en la ciudad de Villavicencio, debido a que de acuerdo

con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unión Internacional para

la Conservación de la Naturaleza (UICN), son las especies de vertebrados más

amenazados en Colombia (Min. Medio Ambiente, 2002). Para tal fin, se llevará a cabo el aislamiento e

identificación de enterobacterias del género Salmonella, estableciendo los serogrupos que

predominan en dichas especies, identificados mediante pruebas serológicas, para

posteriormente reconocer su valor zoonótico y finalmente lograr con la investigación hacer

un aporte sustancial en cuanto a los riesgos biológicos y epidemiológicos de importancia en

salud pública dentro de la Estación y asimismo, promover la preservación de la fauna nativa

que se encuentra en peligro de extinción.

19

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Familia Enterobacteriaceae

La familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), pertenece al orden XIII

Enterobacteriales. Según la segunda edición 2001 del Manual Bergey de Bacteriología

Sistemática, está conformada por 41 géneros y más de 100 especies (Quinn et al., 2002),

aunque menos de la mitad tienen interés desde el punto de vista veterinario (Stanchi, 2007).

Su hábitat natural es el intestino y muchos de estos microorganismos provocan

enfermedades tanto en los animales productores de alimentos (diarrea de los recién

nacidos y salmonelosis), como en los animales de compañía (infecciones y abscesos del

tracto urinario) y en el hombre (Biberstein, y Chung Zee, 1990). Esta familia incluye géneros de gran

importancia a nivel epidemiológico como son Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella

sp, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Edwarsiella

sp., Yesinia sp., Morganella sp., y Arizona sp. entre otras (Jawetz, et al, 2005).

Los microorganismos de esta familia son parecidos en cuanto a su morfología y

caracteres tintoriales por ser bacilos pleomórficos Gram negativos y asporógenos de un

tamaño de 2 – 3 µm por 0,4 – 0,6 µm, catalasa positivos y oxidasa negativo, por carecer

de citocromo c, lo cual es una propiedad bioquímica útil en el aspecto diagnóstico de la

familia (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990). Los representantes de este grupo de

microorganismos son anaerobios facultativos; en condiciones anaerobias, su crecimiento

depende de que en el medio existan carbohidratos como fuente de carbono; en

aerobiosis, la gama de sustratos apropiados para su crecimiento incluye ácidos

orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (Biberstein y Chung Zee, 1990). Mediante observación

microscópica resulta difícil diferenciar los representantes de un determinado género de

los pertenecientes a los demás géneros. Son clave para el diagnóstico los productos

resultantes de la fermentación de azúcares; casi todos los microorganismos de este

grupo fermentan la glucosa a ácido pirúvico por la vía de Embden Meyerhoff (glicolisis);

fermentan la D-glucosa a menudo con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos y

poseen un contenido de DNA del 39 al 59% de guanina mas citosina (G+C), algunos

poseen cápsula (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990).

Las propiedades que definen a la familia deben ponerse en evidencia para afirmar que la

cepa es una enterobacteria. A partir de ahí se realiza la identificación, fundamentalmente

por las características bioquímicas para estudiar el metabolismo proteico (presencia de

ureasa, producción de indol, degradación del triptófano), el metabolismo glucosídico

(fermentación de azúcares: glucosa, lactosa, sacarosa, etc.), la capacidad de utilizar el

citrato como única fuente de carbono, la presencia de enzimas descarboxilasa y

20

desaminasas y la producción de hidrógeno sulfurado, entre las características más

importantes (Biberstein y Chung Zee, 1990).

Las Enterobacterias pueden comportarse como apatógenas, patógenas oportunistas y

patógenas importantes. Las primeras, pueden encontrarse como contaminantes de

muestras clínicas, siendo aisladas del ambiente y/o materia fecal, como es el caso de

Hafnia; las enterobacterias patógenas oportunistas ocasionalmente producen

enfermedad a nivel del tracto digestivo, mientras que las patógenas importantes pueden

causar daños entéricos y sistémicos, por poseer una estructura antigénica compleja y

producir varias toxinas y otros factores de virulencia (Baümler et al. 1998, Muñoz et al, 2002, Biberstein y

Chung Zee, 1990).

2.2. El Género Salmonella

El género Salmonella recibe su nombre en honor al microbiólogo americano Daniel

Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en

medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a

Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes

descubrieron los gérmenes designados como salmonelas, en 1885, aislándolos de

cerdos con cólera (Stanchi, 2007)

Salmonella sp. es la enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pública por

producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino

en todas las especies animales (Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979, Lujan y Blas, 2007)

Los microorganismos del género Salmonella están extensamente diseminados en la

naturaleza como comensales y como patógenos del aparato digestivo de los mamíferos

domésticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir

una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonelas son potencialmente

patógenas (Stanchi 2007; Smith et al. 1952; Mahajan et al. 2003) al ser parásitos intracelulares y por

medio de los macrófagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo

afectado aprovechando la vía linfática y sanguínea (Smith et al. 1952; Suter, 1956; Stanchi, 2007). En

medicina humana están descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre

entérica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria

se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda,

subaguda y crónica, y abortos en diferentes especies animales (Stanchi, 2007). Las diversas

especies de salmonelas se transmiten por contacto tanto con enfermos como con

portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida por este agente

microbiano tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados

21

con el patógeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminación ambiental es

invariablemente la materia fecal (Stanchi 2007 ; Smith et al. 1952; CDC. 2007).

2.2.1 Caracterización morfológica y bioquímica

Los miembros del género Salmonella son bacilos Gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm,

no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados (Terragno et al, 2003);

generalmente móviles por flagelos perítricos con la excepción de Salmonella gallinarum y

Salmonella pullorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente (Stanchi

2007, Terragno et al, 2003).

Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo; fermentan glucosa con producción de

ácido y gas (excepto S. typhi), también fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, D-

manosa, L-ramnosa, Dsorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcitol (Terragno et al, 2003). Son

oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges- Proskauer (VP) negativo, rojo de

metilo y citrato de Simmons positivo, producen H2S, son urea negativo, lisina ornitina y

descarboxilasa positivo (Terragno et al, 2003). Entre otras características bioquímicas se

encuentran la reducción de nitratos a nitritos, no desaminan la fenilalanina y son

tetrationato reductasa (Jawetz, et al, 2005).

Las salmonelas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubación

por 18 a 24 horas a 32oC son de 2 a 3 mm de diámetro salvo algunos serotipos que

producen colonias pequeñas; con algunas excepciones no presentan cápsula (Smith et al.

1952; Suter 1956). Los miembros del género Salmonella crecen en un amplio rango de

temperaturas (7 - 28oC), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son

incapaces de tolerar altas concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada

durante periodos prolongados (Jawetz et al. 2005).

Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella sp. son relativamente

estándar, sin embargo puede haber variaciones en los medios de cultivo y algunas

pruebas bioquímicas, por lo cual como alternativa se están introduciendo cada vez más

los métodos moleculares que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más

simples de realizar, pero tienen como desventaja que son de costo elevado (Terragno et al,

2003).

22

2.2.2. Clasificación taxonómica

La más reciente clasificación del género Salmonella está basada en estudios realizados

sobre la base de técnicas de hibridación del DNA de la bacteria y se ha concluido que

éste está conformado por dos especies:

1) Salmonella enterica, dividida en seis subespecies aisladas de:

a. Subepecie I. S. enterica subsp. enterica: Humanos y Animales de sangre caliente

b. Subespecie II. S. enterica subsp. salamae: Animales de sangre fría y del ambiente.

c. Subsespecie III a. S. enterica subsp. arizonae: Animales de sangre fría y del

ambiente.

d. Subespecie III b: S. enterica subsp. diarizonae. Animales de sangre fría y del

ambiente.

e. Subespecie IV. S. enterica subsp. houtenae. Animales de sangre fría y del

ambiente.

f. Subespecie VI. S. enterica subsp. indica. Animales de sangre fría y del ambiente.

2) Salmonella bongori. Subespecie V: No constituye un patógeno para los humanos,

pero si ha sido implicada en ciertas patologías en animales (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y

Weill; 2007; Stanchi 2007; Farmer 2003 y Terragno et al 2003)

Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonelas

según su hibridación de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se

encuentran constituidas por más de 2400 variedades serológicas, determinadas según

las distintas asociaciones de los antígenos somáticos O y flagelares H (Stanchi, 2007).

También puede hacerse una clasificación de las salmonelas desde el punto de vista

epidemiológico en tres grupos:

1) Sin ninguna afinidad por hospedador

2) Afectan únicamente al ser humano

3) Adaptadas a un hospedador animal únicamente (Stanchi 2007; Terragno et al 2003).

2.2.3. Estructura antigénica

La estructura antigénica de Salmonella sp. es similar a la de otras enterobacterias,

contando con la presencia de dos clases de antígenos principales: Antígenos O

(somáticos) y Antígenos H (flagelares). En algunas cepas se encuentra un tercer tipo de

Antígeno de superficie, análogo funcionalmente a los Antígenos K (capsulares) de otros

23

géneros. Al estar este antígeno relacionado con la virulencia de las cepas se le

denomina Antígeno Vi (Koneman y Allen. 1999), que puede interferir con la aglutinación por

antisueros O y que se relacionan con invasividad (Jawetz et al, 2005).

a. Ag Somático (O de pared celular): Es un polisacárido, termostable, tipo-

especifico, que se halla en todas las especies (Stanchi 2007). Se distinguen dos clases:

mayores (determinantes del serogrupo) y menores (se hallan en algunas

Salmonelas y serogrupos de éstas), son compartidos por diferentes serovares y no

determinan los serogrupos (Stanchi 2007), aunque existen numerosos antígenos O, son

los factores O principales los que sirven para caracterizar los diferentes tipos

antigénicos. (Por ejemplo O4: se refiere al grupo B, O9: Grupo D, entre otros) (Muñoz et

al. 2002). El complejo de antígenos O determina el subgrupo somático al que

pertenecen los géneros de Salmonella, sp., Arizona sp., Citrobacter sp., Escherichia

sp., Providencia spp. Serratia sp. entre otros (Bayley y Schott, 1982).

b. Ag Flagelar (H): Es proteico y termolábil, constituido por flagelina, cuya

composición en aminoácidos es constante para un tipo antigénico determinado (Bayley

y Schott, 1982). Por lo general, los microorganismos que tienen este antígeno, poseen

dos fases diferenciables por medio de aglutinación en tubo de ensayo (Stanchi 2007; y

Terragno et al, 2003); esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase

1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria.

En el primer caso (H1), lo más relevante es que se trata de un Ag específico de

especie (según Kauffmann y White) y su síntesis reside en el gen hag1, que sólo se

expresa durante las primeras 24 h del crecimiento, en lo que se refiere al H2, es

compartido por varias especies de Salmonella y el gen que codifica para su

producción es el Hag2, el cmismo que se manifiesta a partir de las 24 h posteriores

al inicio del desarrollo. La mayoría de las cepas del género Salmonella pueden

expresar las dos especificidades de su antígeno H (difásicos), sin embargo existen

algunas que logran expresar solamente uno (monofásicos) (Parra et al. 2002). Cada

Salmonella sp. expresa alternativamente estos dos tipos de antígenos mediante un

mecanismo denominado “cambio de fase” (Quinn et al., 2002, Smith et al., 1952).

c. Ag capsular (K): Es un antígeno termolábil aunque existen pocas excepciones

(Bayley y Schott, 1982); es llamado en Salmonella el Ag (Vi), que protege a la bacteria

dándole resistencia antifagocìtica. La presencia de este antígeno hace imposible la

aglutinación de sueros anti O, debido a que recubre toda la bacteria; en este caso,

la cepa en estudio debe ser sometida a un calentamiento a 100oC durante 30

24

minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de

aglutinación con el Ag somático correspondiente (Stanchi 2007; Terragno et al, 2003). De allí

que la expresión de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo

necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresión tenga lugar (Parra et

al. 2002).

2.2.4. Factores de virulencia

Para Salmonella sp. se conocen varios factores de virulencia, uno de ellos es la

producción de al menos tres toxinas: las enterotoxinas que son sustancias liberadas al

intestino y que ocasionan síntomas gastrointestinales como cólico y diarrea, las

endotoxinas que hacen parte de la membrana externa de la bacteria y cuya actividad

biológica está asociada con los lipopolisacáridos (LPS) y por último, las citotoxinas que

están asociadas con la superficie celular, las cuales inhiben la síntesis proteica en la

célula hospedadora y pueden estar implicadas en la adherencia a las células epiteliales,

constituyendo esta última un segundo factor de virulencia de Salmonella sp.(Madigan et al 1997;

Salyers y Whitt 2002). También se ha descrito en algunas subespecies de Salmonella (S.

typhimurium) la formación de pseudópodos en la célula hospedera, lo que trae como

resultado la internalización de la bacteria en vesículas endocíticas; adicionalmente, la

producción de adhesinas que incluyen fimbrias codificadas por el plásmido de virulencia

pSLT, permiten la unión de la bacteria a las microvellosidades de los enterocitos,

fimbrias polares largas que se encargan de la unión de la bacteria a las placas de Peyer,

y las fimbrias agregativas delgadas llamadas curli que también pueden estar implicadas

en la unión a las vellosidades de los enterocitos (Madigan et al 1997, Salyers y Whitt 2002).

Otros factores relacionados con la adherencia son los polisacáridos de superficie celular

(O) y el antígeno Vi, un polisacárido capsular compuesto de ácido N-acetilglucosamin-

urónico el cual ayuda a prevenir la fagocitosis y puede proteger la bacteria de las formas

reactivas de oxígeno al interior de los fagocitos, las cepas negativas para el antígeno Vi

son menos infecciosas y virulentas que las positivas para este antígeno (Parry et al. 2002).

La respuesta de tolerancia al ácido, es otro aspecto importante de la virulencia de

Salmonella sp. lo que le permite a la bacteria atravesar el ambiente ácido del estómago,

requisito necesario para la infección (Salyers y Whitt 2002).

2.2.5. Patogénesis y patogenicidad

Todos los serotipos de Salmonella sp. conocidos son patogénicos para el hombre y los

animales (Parker y Collier, 1990). La virulencia de la bacteria se relaciona con su capacidad de

invadir las células hospedadoras, replicarse en su interior y resistir tanto la digestión por

25

los fagocitos como la destrucción por la acción del complemento, lo cual facilita la

difusión de las salmonelas en el organismo del hospedador (Henrici 1999, Quinn et al. 2002; Smith et al.,

1952).

El complejo proceso de invasión es mediado por los productos de la expresión de varios

genes cromosómicos, mientras que la capacidad de crecer en el interior de las células

hospedadoras depende de la presencia de plásmidos de virulencia (Vadillo et al 2002, Smith et al

1952. y Quinn et al, 2002). Algunos factores que determinan el carácter patógeno de ciertas

especies del género Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en

las que se denominan genéricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes

relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patógenos pero que

están ausentes o solo presentes de forma esporádica en las especies saprófitas (Vadillo et al

2002; Terragno et al 2003).

La Salmonella sp. cuenta con 5 islas de patogenicicidad, tres de ellas conteniendo genes

de virulencia (Salyers y Whitt, 2002):

§ Isla SPI1: Contiene genes inv responsables de la internalización de las células,

estos genes así como otros de la misma isla de patogenicidad (spa, prg y org)

codifican para un sistema de secreción tipo III; también contienen genes que

codifican proteínas que son inyectadas en la célula eucariótica por este tipo de

sistema de secreción, como por ejemplo el gen sptP que codifica para una

tirosina fosfatasa que altera las señales de transducción en células de la

mucosa, produciendo diarrea. De igual forma posee genes involucrados en la

regulación de genes de virulencia (hila, invF, sira y phoPQ), algunos de los

cuales controlan la expresión de genes localizados en otras partes del

cromosoma de la bacteria. Los genes contenidos en esta isla parecen ser

importantes en las etapas iniciales de la infección en la cual las bacterias

invaden las células de la mucosa.

§ Isla SPI2: Codifica un sistema de secreción tipo III, diferente al codificado por la

isla SPI1, usado por la bacteria al interior del fagosoma para evitar la fusión

fagosoma-lisosoma; también codifica las proteínas que inyecta a la célula

eucariótica. Esta isla de patogenicidad parece tener mayor importancia en la

fase sistémica de la infección.

§ Isla SPI3: Codifica un trasportador de Mg2+ de alta afinidad, el cual puede ser de

importancia en la supervivencia de la célula al interior de fagosomas. No codifica

sistema de secreción.

§ Islas SPI4 y SPI5: No se conoce su función, no codifican sistemas de secreción.

26

Las células blanco revisten el último tramo del intestino delgado y el primer tramo del

intestino grueso; si la célula blanco está “libre” con respecto al número de salmonelas, es

posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del género Salmonella

segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan que

la enfermedad generada sea diarreica o septicémica. Las cepas que producen diarrea se

multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolábil) que altera la

síntesis de los nucleótidos cíclicos, haciendo que el microorganismo invada la célula, ya

en el interior, las Salmonelas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su

desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y líquido

hacia la luz intestinal, lo que a su vez ocasiona diarrea. (Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990) La

gravedad de la enfermedad depende del número de células blanco afectadas (Blaser y

Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990). Aproximadamente 107 organismos viables son

requeridos normalmente para el inicio de una gastroenteritis en humanos; en animales,

se desconoce la dosis infectiva pero depende de la especie (Blaser y Newman 1982); en

animales, los síntomas de la enfermedad son dolor abdominal y diarrea acompañada de

señales de muerte celular (sangre, restos de células y células inflamatorias) (Biberstein y Chung

Zee 1990).

Adicionalmente, es posible que las cepas que producen septicemia provoquen o no

diarrea, destrucción de las células blanco, o ambas cosas. La acción de la enterotoxina

se basa en la interrupción de la síntesis de proteínas provocando la muerte celular

(Biberstein y Chung Zee 1990). Los síntomas que se presentan, aunque no siempre, suelen ser

septicemia y shock; las cepas que producen esta forma clínica de enfermedad eluden la

destrucción por parte del hospedador y se multiplican en el interior de los macrófagos del

hígado, bazo y también en el interior de los vasos sanguíneos (Hinton, 1971). Su destrucción

en la corriente sanguínea se encuentra obstaculizada en parte por las unidades

repetitivas del antígeno O del LPS, posiblemente porque se impide la unión entre el

complejo de ataque a la membrana del sistema del complemento y la membrana externa

de la bacteria (Barrow y Lovely 1991).

Las cepas de Salmonella sp. son relativamente hidrófilas, debido en parte a la fracción

de carbohidratos del LPS que provoca su repulsión de la membrana de las células

fagocitarias, la cual es relativamente hidrófoba; las salmonelas que son fagocitadas no

son destruidas fácilmente porque en el animal el contenido de los lisosomas del

macrófago no atacará con facilidad a las salmonelas que se encuentran en el interior del

fagosoma, debido a que las bacterias sintetizan enzimas que tienen la capacidad de

27

neutralizar las que son producidas por el fagosoma (Blaser y Newman 1982, Biberstein y Chung Zee 1990 y

Quinn et al 2002). La multiplicación del microorganismo origina una endotoxemia, la cual

explica la mayoría de los síntomas y el curso de la enfermedad (Stanchi, 2007).

2.2.6. Salmonelosis

Constituye un grupo de infecciones producidas por microorganismos del género

Salmonella sp. adquiridas por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas y

caracterizadas por presentar síndromes febriles asociados a manifestaciones

gastrointestinales sistémicas, con frecuencia severas (Saravia 2008). Las manifestaciones

clínicas de las salmonelosis en humanos y animales se presentan básicamente bajo tres

modalidades las denominadas fiebres entéricas, entre las cuales la más común es la

fiebre tifoidea producida por la S. typhi, las gastroenteritis producidas por varias

subespecies y la forma septicémica, caracterizada por la bacteremia asociada a lesiones

focales (Saravia 2008). Dentro de las manifestaciones clínicas comunes está la fiebre

acompañada de dolor abdominal, evacuaciones intestinales líquidas frecuentes, de

aspecto verdoso, fétidas, mucoides y en ocasiones con estrías de sangre (Saravia 2008, Report,

1989,1993).

2.2.7. Diagnóstico

Existe un gran número de métodos diagnósticos diferentes que pueden realizarse para la

determinación de Salmonella sp., sin embargo, según la mayor parte de estudios

realizados, el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente empleada para el

aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El método ideal debe tener

una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico.

Ningún método cumple con todos los criterios y ninguno es óptimo para todas las

condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y

algunas pruebas bioquímicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse también en los

nuevos métodos de diagnóstico que están innovando para el aislamiento de Salmonella

sp. mediante el uso de pruebas serológicas y moleculares como ELISA y PCR

respectivamente; esta última tiene la capacidad de detectar un pequeño número de

organismos del género Salmonella (102 a 104). Estos métodos arrojan resultados

favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos (Ward

et al 2005 y Terragno et al 2003).

Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio es

variado: se enviará en caso de infección intestinal, muestra de heces; en enfermedad

sistémica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estándar (Biberstein y

Chung Zee, 1990 y Stanchi 2007). Además, es posible determinar la contaminación de alimentos y

28

agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisión de una muestra al

laboratorio para ser analizada convenientemente (Stanchi 2007); el diagnóstico incluye

aislamiento, identificación bioquímica y serotipificación de las cepas aisladas (Stanchi 2007,

Luna 1991).

2.2.7.1. Métodos para el aislamiento de Salmonella sp.

Los métodos para el aislamiento de la bacteria están divididos en tres etapas sucesivas

las cuales son: (1) Enriquecimiento No Selectivo, (2) Enriquecimiento Selectivo, (3)

Siembra en Placa con medios sólidos selectivos y diferenciales. Posteriormente se lleva

a cabo el estudio de las características Bioquímicas de las colonias sospechosas en los

medios adecuados para su identificación, y finalmente el Análisis Antigénico (Luna, 1991).

1) Preenriquecimiento en medio no selectivo: Se utiliza cuando la muestra en

estudio ha sufrido un proceso de desecación o irradiación, cuando ha estado

congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento

puede determinar que las bacterias presentes en la muestra se encuentren en un

estado semilatente y tiene como finalidad la revitalización de los microorganismos

afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de

almacenamiento, permitiendo que las células bacterianas comiencen el proceso de

multiplicación normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que

puedan llegar a ser tóxicas para estas bacterias “debilitadas”, sustancias que si

están presentes en los medios selectivos de enriquecimiento. Se realiza en caldo

peptonado bufferado o lactosado al 0,2%, para incrementar la recuperación de

especies de salmonelas deterioradas por técnicas de elaboración, preservación,

preservantes, presión osmótica alta, cambios bruscos de pH, etc. (Luna 1991; Hurtado 2001).

2) Medios de enriquecimiento selectivo: Se realiza en caldos de enriquecimiento,

los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella sp, e

inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre los caldos

mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp. se

encuentran:

· Caldo selenito: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios

para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y el

mecanismo de acción del selenito, es inhibir el crecimiento de bacterias intestinales,

coliformes y Enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de

incubación. Salmonella sp., Proteus sp., y Pseudomona sp., no son inhibidos (Merck,

1994).

29

· Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de

salmonelas con excepción de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros

materiales. Mediante la utilización de este caldo, es posible obtener algunas

ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obteniéndose un

rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43oC y

previo enriquecimiento (Van Schothorst et al, 2004). El medio cuenta con una baja

concentración de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para

así obtener un mayor porcentaje de recuperación de Salmonella sp. Además la

reducción del pH a 5,2 mejora la selectividad (Trichopoulos 1972; Iveson 1964).

· Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma

coliformes y otras bacterias acompañantes, sin alterar las bacterias reductoras de

tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares

que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia

obligatoria en el intestino (Palumbo y Alford, 1970)

· Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) según Hajna: Favorece la

recuperación de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y

Salmonella sp., pues en su composición tiene triptona que actúa como nutriente en

el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con acción bactericida para organismos

Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos

esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer,

evitando la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de productos

metabólicos ácidos. Adicionalmente, la elevada concentración de manitol sobre la

dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y

Salmonella sp. (Hurtado, 2001)

Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectar

la recuperación de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos

serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inóculo es pequeño (S.

paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S.

treforest, entre otras)(Van Schothorst, et al, 1977).

3) Medios de cultivo selectivos y diferenciales

§ Medios de cultivo selectivos: Son aquellos que permiten seleccionar ciertos

microorganismos deteniendo el desarrollo de otros; esto se logra con el agregado

de sustancias inhibidoras como antibióticos, ciertos colorantes, sales biliares, etc.

Los medios EMB (a), MacConkey (b), desoxicolato (c) o CHROMagar Orientación

(d), permiten detectar con rapidez los microorganismos No fermentadores de

30

lactosa como Salmonella sp. y Shigella sp. El agente inhibidor en estos medios son

sales biliares (Stanchi, 2007).

a. Agar eosina azul de metileno (EMB), permite demostrar la presencia de

enterobacterias patógenas y propiciar su aislamiento, sin embargo, no es

confirmativo, solo permite una orientación al diagnóstico. El modo de acción del

medio se basa en que sus componentes lactosa y sacarosa permiten diferenciar las

enterobacterias de acuerdo con su capacidad de fermentarlos y por el aspecto y el

color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben notablemente el desarrollo

de gérmenes Gram Positivos. Las colonias de Salmonella sp. se observan en el

medio incoloras o con tonalidad ambar (Bonnie, 2001).

b. Agar MacConkey (McK), las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibición

significativa sobre las bacterias Gram Positivas. La lactosa y el indicador rojo neutro

permiten comprobar la degradación de ese disacárido; las colonias lactosa positivas

(Escherichia coli) aparecen rojas con halo turbio; las lactosa negativas (Salmonella

spp.) son incoloras (Stanchi, 2007).

c. Agar desoxicolato, es un medio altamente selectivo por ser el desoxicolato sódico

supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivos. Las colonias típicas de la

Salmonella sp. son pequeñas, incoloras, elevadas y opacas; algunas cepas

producen precipitado negro en el centro (Stanchi, 2007).

d. BD BBLTM CHROMagarTM Orientacion®: Medio de cultivo para el aislamiento e

identificación de patógenos del tracto urinario. Pemite la identificación de

Escherichia coli, Enterococcus, grupos KES (Klebsiella - Enterobacter . Serratia) y

PMP (Proteus – Morganella - Providencia), Staphylococcus saprophyticus y

Streptococcus agalactiae aunque requiere de pruebas confirmatorias. Algunos de

estos microorganismos producen enzimas para el metabolismo de lactosa,

glucósidos o ambos. Otros organismos no producen ningún tipo de enzima, por

ejemplo E. coli contiene enzimas para el metabolismo de lactosa pero es β

glucosidasa negativo; algunos miembros de la familia Enterobacteriacea, como

Salmonella sp. y algunos cocos Gram positivos son β glucosidasa positivo pero no

poseen las enzimas para la fermentación de la lactosa. Adicionalmente, la enzima

triptófano deaminasa es típicamente encontrada en el grupo PMP.

El medio contiene sustratos cromógenos que pemiten la diferenciación de los

microorganismos mediante la degradación de enzimas especificas de cada uno

(Bonnie, 2001; ISO, 2002) (Anexo Nº 2).

31

§ Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioquímicamente las

bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no

la bacteria, y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna

actividad enzimática que modifica su aspecto. En el proceso de recuperación de

Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa

en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la

observación de colonias características y propias de la bacteria (Stanchi, 2007). Los

medios más reconocidos para el aislamiento de Salmonella sp. son:

a. Agar Hektoen entérico: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para la

demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, a partir de los más

diversos materiales tales como heces y alimentos entre otros (Merck, 1994). Las colonias

del género Salmonella se desarrollan con producción de ácido sulfhídrico (H2S) y un

halo trasparente alrededor dando características de un “ojo de pescado” (Merck,1994 ,

Murray y Shea 2004). Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para

enterobacterias Hektoen aún cuando posee suficiente efecto supresor de la flora

acompañante, ejerce escasa inhibición de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo

tanto, permite la obtención de altos rendimientos en estos gérmenes (King y Meztger 1968,

Taylor y Schelhart 1971).

Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina ácida, las colonias

lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias

lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan

lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias

reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos

falsamente positivos. La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante y

una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias H2S

positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompañante (Merck,1994, Murray y

Shea 2004).

b. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): Medio para el aislamiento y diferenciación de

enterobacteriáceas patógenas, especialmente especies de Shigella sp. y

Salmonella sp. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil; el desoxicolato

genera la inhibición de bacterias coliformes y permite la dispersión de cepas de

Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonella;

adicionalmente, la diferenciación entre Salmonella sp. y Shigella sp. se da porque la

primera produce fermentación de Xilosa, descarboxilación de Lisina y genera ácido

sulfhídrico (Hurtado, 2001). La forma de acción del medio se basa en que la degradación

a ácido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje del medio a amarillo, por

32

el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formación de

ácido sulfhídrico por la precipitación de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las

bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo

– purpúreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias (Merck,1994, Murray y Shea

2004). Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o

suscesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de

pH, ó a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más

prolongada. Las colonias de Salmonella sp. se observan con pigmentación rosa o

roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras

(Murray y Shea 2004). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes y del

mismo color que el medio de cultivo. Este género bacteriano al no fermentar la

xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol; como

tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las

colonias, al no haberse producido cadaverina (Murray y Shea 2004).

c. Agar Salmonella – Shigella (SS): Es un medio selectivo y diferencial. La

selectividad está dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el

desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de coliformes y el desarrollo

invasor del Proteus sp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa y la

formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella sp,

desarrolla colonias traslúcidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a

causa de la producción de ácido sulfhídrico (Meljem, 1995, Murray y Shea 2004). ). Las colonias

sospechosas de Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas

(Murray y Shea 2004).

d. Agar verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo y diferencial para

el aislamiento de enterobacterias patógenas como Salmonella sp. a excepción de

S. enterica serovar typhi y paratyphi A. En el medio la pluripeptona y el extracto de

levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la

sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el indicador

de pH, que vira a amarillo cuando hay producción de acido a partir de la

fermentación de azúcares; el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el

verde brillante actúa como agente selectivo. Las colonias de Salmonella sp. se

observan con coloración rosa, blanca o transparente sobre un fondo rojo (Murray y Shea,

2004)

e. Agar bismuto sulfito: Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e

identificación de Salmonella enterica serovar typhi y otras bacterias entéricas. El

medio contiene peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato

férrico y sulfito bismuto que actúa como inhibidor de la mayoría de organismos

33

comensales. Las colonias típicas de Salmonella sp. pueden ser café, gris o negras

con o sin brillo metálico, generalmente el medio circundante (halo) es café que

posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la

formación del halo oscuro (Murray y Shea 2004).

f. AGAR XLT4®(DIFCO

tm): Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para el

aislamiento e identificación de microorganismos del género Salmonella excepto S.

enterica serovar typhi (Dush y Altwegg, 1955). El medio contiene peptona como fuente de

nitrógeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la

diferenciación de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la

fermentación de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilación de la lisina y la

producción de sulfuro de hidrógeno, la cual es detectada por la adición de iones

férricos. Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente de

sulfuro inorgánico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio y el

rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las

reacciones de fermentación y decarboxilación. Al medio base, es adicionado

suplemento de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos

diferentes a la Salmonella sp. Las colonias típicas de la bacteria (H2S positivas),

aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro después de 18 – 24

horas de incubación. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de

pigmento negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, con

centro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H2S negativas, aparecen

de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayoría de las colonias de Citrobacter

sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento. El

crecimiento de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus, Pseudomona,

Providencia, Alteromonas putrefaciens, Yersinia enterocolitica y Acinetobacter

calcoaceticus está completamente inhibido, mientras que las especies de Shigella

son parcialmente inhibidas; las colonias que aparecen son de tonalidad roja (Becton

Dickinson).

g. BD BBLTM CHROMagarTM Salmonella®: Es un medio selectivo y diferencial para el

aislamiento e identificación presuntiva de especies de Salmonella sp, permitiendo la

diferenciación de la enterobacteria de la flora acompañante dada la presencia de

sustratos cromógenos en el medio. Los organismos Gram positivos son inhibidos

como resultado de un medio base selectivo; adicionalmente cuenta con un agente

antifúngico que previene el crecimiento de especies de Candida; otros agentes

antimicrobianos presentes en el medio de cultivo inhiben el crecimiento de Gram

negativos, microorganismos no fermentadores de lactosa y especies de Proteus.

Debido a diferencias metabólicas en la presencia de cromógenos seleccionados, las

34

colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa – púrpura, mientras que los

microorganismos pertenecientes a otros géneros se observan con pigmento verde

– azulado, ó son completamente inhibidos (Gaillot, et al; 1999)

2.2.7.2. Identificación bioquímica

Los microorganismos para crecer requieren de polimerización de proteínas, ácidos

nucléicos, polisacáridos y lípidos; estos elementos deben encontrarse preformados en el

medio donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la propia

célula. Para realizar el metabolismo se requiere además la maquinaria biosintética para

transformar los substratos en materiales básicos o compuestos utilizables para la célula,

y la energía para realizar las reacciones químicas (Escobar, 2004).

En la identificación final de Salmonella sp. las colonias sospechosas observadas en el

medio de cultivo diferencial se someten a pruebas de reacción bioquímica con el fin

confirmar la presencia de la bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un

conjunto de pruebas que incluyen producción de indol, rojo de metilo, Voges- Proskauer,

Citrato, TSI, hidrólisis de la urea, deaminación de la fenilalanina, decarboxilación de

lisina, arginina y ornitina, motilidad, hidrólisis de gelatina, utilización de malonato,

fermentación de glucosa con producción de acido y gas, fermentación de lactosa,

sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa,

maltosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, eritritol, hidrolisis de esculina, fermentación de

melibiosa, de arabitol, de glicerol, utilización de acetato, lipasa, ADNasa, transformación

nitrato-nitrito, oxidasa y fermentación de manosa (Farmer, 2003, Forbes et al, 1998). (Tabla 1).

Tabla Nº 1. Propiedades Bioquímicas Diferenciales de las Subespecies de Salmonella sp.

Fuente: Instituto Nacional de Salud. 2003.

d

d

d

35

2.2.7.2.1. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp.

A. Pruebas bioquímicas: En la tabla Nº 2 es posible observar las reacciones

producidas en la batería de bioquímicas utilizada normalmente para la identificación de

enterobacterias pertenecientes al género Salmonella (Koneman y Allen, 1999), la cual consta de

las pruebas descritas a continuación:

TSI (triple azúcar hierro): es un agar diferencial basado en la fermentación de azúcares y

la producción de H2S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y lactosa; estas últimas en una

concentración 10 veces mayor a la glucosa. El indicador de pH es el rojo de fenol, el cual

vira a amarillo por formación de ácido a partir del carbohidrato, el sulfato ferroso es un

detector de la producción de ácido sulfhídrico. Por lo general Salmonella sp. da como

resultado de esta prueba una reacción alcalina/acido con producción de H2S que se

evidencia por el fondo negro del tubo (K/A H2S++); en ocasiones, como resultado de la

fermentación de glucosa también hay producción de gas (Instituto Nacional de Salud, 2003, MacFaddin,

2000).

LIA (agar lisina hierro): El fundamento de esta prueba es que los procesos de

decarboxilación y deaminación en el medio de cultivo tienen lugar con la previa

fermentación del carbohidrato que contiene el medio (glucosa) y la acidez producida por

esta reacción, si el microorganismo posee las descarboxilasas necesarias, se produce la

decarboxilación liberándose como producto final las aminas que alcalinizan el medio de

cultivo, por otro lado si el microorganismo posee las deaminasas se efectúa la

deaminación y el producto final son ácidos orgánicos que acidifican el medio de cultivo.

Salmonella sp. por lo general da como resultado tendido púrpura y fondo púrpura, (K/K),

con producción de H2S y gas, es decir, posee la enzima lisina-decarboxilasa (Instituto Nacional

de Salud, 2003).

Utilización del citrato: El principio de esta prueba es determinar la capacidad de los

organismos para usar el citrato de sodio como fuente de carbono para el metabolismo y

el crecimiento. El medio contiene fosfato sódico de amonio, fosfato de monopotasio,

sulfato de magnesio, citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. Si el

carbono del citrato de sodio es utilizado, el nitrógeno también es extraído del fosfato de

amonio contenido en el medio, liberando amonio, lo cual alcaliniza el medio que vira de

verde a azul. Salmonella sp. por lo general utiliza el citrato como fuente de carbono, por

lo cual se produce una variación en el color del medio (Koneman et al, 1997; Farmer, 2003).

36

Producción de indol: Esta prueba se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio

está en capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano; el indol es uno de

los componentes de la degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias

que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con

producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. La prueba se basa en la formación de un

complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-

dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y

Ehrlich, utilizados para la identificación de producción de indol por parte de los

microorganismos. Salmonella sp. no tiene la capacidad de generar el indol por lo cual no

se presenta ninguna reacción en el medio (MacFaddin 2000).

Prueba de motilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. La

movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos que se

encuentran principalmente entre los bacilos, aunque algunas formas de cocos son

móviles. Esta prueba es llevada a cabo en un medio de cultivo semisólido (SIM), donde

a su vez es evaluada la producción de indol y de ácido sulfhídrico por los

microorganismos. Las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del

medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario las

bacterias inmóviles permanecerán en la misma picadura donde se sembraron (MacFaddin,

2000). La mayoría de las salmonelas son motiles a excepción de S. pullorum y S.

gallinarum, huéspedes específicas de aves, responsables además de las enfermedades

pulorosis y tifoidea aviar respectivamente (Infante et al, 1991).

Hidrólisis de urea: La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que es transformado

por algunos microorganismos, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de

esta actividad microbiana, el nitrógeno es liberado en forma inorgánica como moléculas

de amoniaco. Cuando esta reacción ocurre, el medio de cultivo se alcaliniza y el

indicador de pH permite percibir visualmente el cambio de coloración en el medio debido

a la acidificación producida en el mismo. Salmonella sp.no tiene la capacidad de

hidrolizar la urea, por lo tanto la prueba es negativa. Esta prueba se considera vital en la

diferenciación bioquímica entre Salmonella sp. y Proteus sp. (MacFaddin, 2000).

37

Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de

microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. Fuente: Manual de pruebas

bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica (MacFaddin 2000)

PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO PARA Salmonella sp.

TSI K/A H2S++

LIA K/K H2S++

UREA -

MOTILIDAD +

INDOL -

CITRATO +

B. Sistemas BBL Crystal de identificación (Patógenos entéricos/No fermentantes) ®:

El sistema de identificación BBL Crystal de bacterias entéricas/no fermentadoras (E/NF) ®

sirve para lel reconocimiento de bacterias gram negativas que pertenecen a la familia

Enterobacteriaceae así como también de los bacilos Gram negativos fermentadores y

no fermentadores de glucosa aislados con más frecuencia (Muytjens et al, 1984).

Los análisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF® están basados en la utilización y

degradación de sustratos específicos por parte de los microorganismos detectados por

distintos sistemas indicadores. Las reacciones de fermentación detectan la capacidad de

un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxígeno atmosférico, y las

reacciones de oxidación están basadas en la capacidad de un organismo para

metabolizar el sustrato siendo el oxígeno el aceptor final de electrones, ambas

reacciones se detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el

sustrato del análisis (Murray et al, 1999). Los sustratos cromógenos al sufrir hidrólisis producen

cambios de color que pueden ser detectados visualmente. Además, existen otros análisis

que detectan la capacidad de un organismo para hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de

otro modo un sustrato en el sistema BBL Crystal® (Manafi et al, 1991). (Anexo Nº 3)

2.2.7.3. Serotipificación

La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica

y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una

serovariedad en distintas zonas geográficas, también es de utilidad para el estudio de

brotes y para conocer la fuente de infección y las vías de transmisión (Terragno et al, 2003).

Desde el punto de vista genético, el género Salmonella sp. constituye una sola especie

siendo el grupo más complejo de la familia Enterobacteriaceae (Biberstein y Chung Zee, 1990;

Crawford et al, 1971) dado que los representantes del género Salmonella sp. han sido objeto de

38

sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura y

taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas desarrolladas por Edwards y

Ewing, en la década del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del

género Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (Stanchi, 2007).

Las técnicas serológicas son comúnmente empleadas para identificar cultivos

desconocidos con sueros conocidos (Smith et al.1952); Salmonella sp. está serotipificada de

acuerdo a sus antígenos somáticos de superficie (LPS, antígenos O), antígenos

flagelares (proteínas, antígenos H) y antígeno capsular (Vi) (Terragno et al, 2003). Los antígenos

se identifican con anticuerpos monovalentes y polivalentes disponibles comercialmente,

mediante pruebas de aglutinación en lámina. Para identificar los antígenos O, se hace

una prueba con antisueros contra los grupos del O1 (A) al O67, luego se prueba el

antisuero Vi para antígeno capsular, y por último se incluyen los antisueros contra los

antígenos flagelares H (Farmer 2003, Brooks et al., 2000, Forbes et al., 1998, Jawetz et al .2005, Smith et al.1952).

En el género Salmonella existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la

mayoría de las salmonelas no producen cápsula (Hirsh 2006). La constitución antigénica de

la fracción polisacarídica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie;

asímismo, la clase y el número de azúcares junto con los enlaces existentes entre los

mismos, definen los determinantes antigénicos que contienen los antígenos O de un

determinado aislamiento; dichos antígenos O, junto con los determinantes antigénicos

existentes en la superficie de los flagelos (antígenos H), que poseen la mayoría de las

salmonelas, contribuyen, desde el punto de vista serológico, a definir como especie un

determinado aislamiento. Este esquema de clasificación se le denomina de Kauffmann-

White (Biberstein y Chung Zee, 1990)

2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann – White

La identificación de los serotipos sobre la combinación antigénica está dada en el

“Esquema de Kauffmann-White”, publicado por el Centro Colaborador de la

Organización Mundial de la Salud (OMS) de Referencia e Investigación de Salmonella

del Instituto Pasteur en Paris el cual agrupa todas las serovariedades de Salmonella sp.

conocidas (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; 2007) (Anexo Nº 4). Ambos investigadores diseñaron

su clasificación considerando ciertas determinantes antigénicas presentes en el AgO,

que determinan la existencia de grupos o serogrupos -de la A a la I- y a los antígenos

flagelares en fase 1, que hoy en día establecen el serotipo (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill;

2007).

39

Este esquema plantea las diferencias mediante la identificación de los antígenos de

superficie que se producen en la bacteria. La especificidad del factor “O” (somático) de

Salmonella sp. se determina por la composición y la estructura de la cadena polisacárida

O del lipopolisacárido. Al antígeno O, se lo designa con números; Salmonella sp. se

clasifica en serogrupos que surgen del antígeno somático O; a estos grupos se los

designa con letras mayúsculas, por ejemplo, A, B, C1, C2, D1, D2, E1, E2, etc. (Basualdo et

al.,1996). El antígeno flagelar representado por letras minúsculas y números, caracteriza a

los serotipos dentro de cada grupo, rara vez se hace referencia al antígeno Vi que es

asociado a la cápsula bacteriana.

2.2.8. Sensibilidad frente a agentes antimicrobianos

Los agentes antimicrobianos evalúan las diferencias de estructura o de función

bioquímica existentes entre el hospedador y el parásito (Biberstein y Chung Zee, 1990).

Durante los últimos 25 años, la investigación quimioterapéutica se ha centrado

fundamentalmente alrededor de las sustancias antibacteriales de origen microbiano

llamadas antibióticos (Jawetz et al., 2005); los cuales son compuestos químicos producidos por

microorganismos, que inhiben o matan otros microorganismos (Escobar, 2004). Sin embargo,

es de tener presente que ningún agente químico antimicrobiano tiene la capacidad para

actuar eficazmente sobre todo tipo de microorganismos, debido a la diferente actividad

del químico y las variadas características de sensibilidad y resistencia que presenta cada

bacteria, ante la sustancia (Escobar, 2004). La selectividad se explica por las diferencias

estructurales y bioquímicas entre las células eucariotas y procariotas (Gentilini 2007); lo cual

ofrece mayor oportunidad para que, en comparación con los agentes antifúngicos, los

agentes antibacterianos manifiesten su toxicidad selectiva ya que las células fúngicas, al

igual que en mamíferos, son eucariotas (Prescott 1988).

Los mecanismos de acción de los agentes antimicrobianos se encuadran en cuatro tipos;

(1) Inhibición de la Síntesis de Pared, (2) Alteración de la función de la Membrana

celular, (3) Inhibición de la Síntesis o de la Función del Ácido Nucléico y (4), Inhibición de

la Síntesis de Proteínas (Prescott, 1988). Sin embargo, el antibiótico ideal empleado con fin

terapéuticos, debe reunir una serie de condiciones.

a. Tener una toxicidad selectiva para el agente infeccioso, lo que implica escasa o

nula toxicidad para las células del huésped y alta para el patógeno.

b. Penetrar en los tejidos y las células del organismo para ejercer su acción sobre

el agente infeccioso.

40

c. Alcanzar la concentración adecuada para ejercer su efecto en el foco de la

infección y que se excrete lentamente.

d. Poseer una acción más bactericida que bacteriostática. Los agentes bactericidas

matan a los microorganismos, y los bacteriostáticos inhiben el desarrollo,

interviniendo los mecanismos de defensa del huésped en la erradicación final de

la infección.

e. No alterar los mecanismos de defensa naturales del hospedador (fagocitosis,

producción de anticuerpos, entre otros).

f. No generar aparición rápida de resistencia.

g. Poseer un amplio espectro de acción sobre los microorganismos que con mayor

frecuencia se aíslan.

h. Permanecer activo en presencia de plasma, líquidos corporales, exudados.

i. Poseer actividad antibacteriana in vitro.

j. Ser estable para garantizar un periodo razonable de almacenamiento.

k. Ser económicamente accesibles.

l. No producir efectos colaterales indeseables en el huésped (Stanchi, 2007).

2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos.

El desarrollo de cepas resistentes hace necesaria la determinación de la susceptibilidad

a los antimicrobianos de aislamientos provenientes de muestras biológicas. Esta se lleva

a cabo mediante pruebas in vitro de susceptibilidad, que permiten seleccionar los

quimioterapéuticos según la sensibilidad demostrada por el microorganismo causal

(Gentinili et al, 2002).

Los métodos empleados, son entre otros, la difusión con monodiscos de antibióticos,

método estandarizado por Kirby-Bauer, en el cual se emplea el agar Mueller Hinton,

único medio validado por el NCCLS (Comité Nacional para la Normatización de

Laboratorios Clínicos) para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, dado que existen

suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad

realizadas en este medio (NCCLS, 1996). Otro método realizado en laboratorio es la

determinación de la concentración mínima inhibitoria del antibiótico (CMI), el cual se

realiza mediante la técnica de dilución en tubo, donde se preparan una serie de tubos

con medio de cultivo, cada uno a una concentración diferente de antibióticos sembrados

con el microorganismo. Después de la incubación, se observa la mínima concentración

de antibiótico que inhibe el crecimiento del microorganismo (Escobar 2004 y Stanchi 2007). Estas

pruebas están cuidadosamente estandarizadas con el objeto de mejorar el valor

predictivo clínico de los resultados. Desde 1958, el Comité Nacional de Estandarización

de Laboratorios Clínicos (NCCLS) estableció un Subcomité de Pruebas de

41

Susceptibilidad Antimicrobiana Veterinaria (VAST). Gracias al desarrollo de NCCLS-

VAST, se están generando los criterios interpretativos de los agentes antimicrobianos

veterinarios específicos con el empleo de aislamientos animales (Stanchi 2007, Gentilini 2007).

2.2.8.2. Prueba de sensibilidad a los antimicrobianos

Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a

infecciones cuando su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificación. La

determinación de la sensibilidad está indicada en los casos en que el microorganismo

causal de la infección pertenezca a una especie capaz de exhibir resistencia a los

antibióticos de uso clínico. Los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos

incluyen: producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de acción y

modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas (Pasteran et al.,2003).

Para realizar pruebas de sensibilidad e identificación se debe partir de un cultivo primario

en medio sólido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de microorganismo

que pueda tener rol patógeno. No es aconsejable la realización de pruebas de

sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infección y la muestra contiene flora

normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados probablemente

tengan poca relación con el proceso infeccioso, ya que en estos casos los resultados

obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento (Pasteran et al.,2003).

2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby – Bauer)

El principio del método involucra la aplicación de una cantidad determinada de

antimicrobiano en un reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino,

etc.) en la superficie del agar sobre la cual se ha distribuido un inoculo del

microorganismo en cuestión; se formará así, por difusión, un gradiente de concentración

de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad del microorganismo estará

indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. El diámetro

obtenido dependerá no sólo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco,

sino también del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composición, de la

capacidad de difusión de la droga en ese medio, de la temperatura y atmósfera de

incubación, de la velocidad de duplicación bacteriana, del tamaño del inoculo y la fase de

crecimiento de la bacteria, etc, todas estas son las variables más importantes que

afectan el resultado del antibiograma (Pasteran, et al. 2003).

Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusión del antibiótico que

contiene comienza instantáneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de

concentraciones alrededor del reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a

las 6 hs. El tamaño de la zona de inhibición dependerá del equilibrio entre la difusión del

42

antibiótico y la velocidad de crecimiento del microorganismo. Las recomendaciones del

NCCLS son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de inoculada la placa y proceder

a la incubación de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la colocación de los

discos. Cualquier variación en estos tiempos ocasionará un desplazamiento del equilibrio

antes mencionado que se traduce en errores en el tamaño de la zona de inhibición.

Como la difusión del disco comienza instantáneamente después de apoyado sobre el

agar, estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque

seguramente ya no tendrán la carga de antibiótico original (Pasteran et al.,2003).

2.2.8.2.2. Interpretación de las pruebas de sensibilidad a los

antimicrobianos por el método de difusión en agar

Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones críticas" o "puntos de corte"

que permiten separar a los microorganismos en tres categorías, sensibles, resistentes o

de sensibilidad intermedia (Anexo Nº 5). Estas categorías se establecen para cada

bacteria frente a cada antibiótico comparando la CMI en cada caso con los puntos de

corte establecidos (Pasteran et al.,2003).

§ Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibiótico cuando se

puede esperar que una infección causada por el mismo responda al tratamiento

con dicho fármaco a la dosis recomendada.

§ Resistente: este término indica que no es probable que la infección causada por

el microorganismo responda al antibiótico en cuestión, cualesquiera que sean la

dosis y la localización de la infección.

§ Sensibilidad Intermedia: Esta categoría se aplica a dos situaciones. Por un lado,

se incluyen en ella las cepas con sensibilidad disminuida a un antibiótico que

puede utilizarse con éxito, para el tratamiento en dosis más altas, por ser poco

tóxico o porque se concentra en el foco de infección (por ejemplo, antibióticos ß-

lactámicos o quinolonas en la orina). En esta categoría se incluyen asimismo las

cepas de "sensibilidad intermedia" a antibióticos que, por ser más tóxicos, no

puede usarse en dosis más altas. En este caso, la categoría intermedia sirve

como una zona de transición entre las cepas sensibles y las resistentes y

previene pequeños errores causados por factores técnicos. Muchas veces un

resultado intermedio requiere la definición de la sensibilidad mediante el uso de

un método cuantitativo como la CMI (Escobar, 2004).

2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos

Para la selección de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se

deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clínica, prevalencia de

43

resistencia, costo, indicaciones del FDA (Administración de alimentos y Fármacos),

recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos (Pasteran et

al.,2003). Entre los antibióticos con actividad frente a Salmonella sp. se encuentran:

§ Aminopenicilinas (Ampicilina).

§ Cloranfenicol (sólo para aislamientos de infección sistémica).

§ Tetraciclinas (Tetraciclina)

§ Trimetoprim/sulfametoxazol

§ Fosfomicina

§ Nitrofuranos

§ Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)

§ Cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima/ceftriaxona solo para

aislamientos de infección sistémica)

2.3. El género Salmonella asociado a los reptiles

En general, la clase Reptilia, consta de más de 6000 especies que incluyen serpientes,

lagartos, tortugas y cocodrilos, muchos están clasificados por la UICN (Unión

Internacional para la Conservación de la Naturaleza) dentro de las categorías de

amenaza, por enfrentar un alto riesgo de extinción, principalmente a causa de

actividades antrópicas, y hoy en día se están viendo afectados por microorganismos

patógenos que los han llevado a un estado máximo de riesgo (Chatfield, et al 2007).

La herpetofauna (particularmente reptiles), ha estado frecuentemente relacionada con

casos de enfermedades asociadas a salmonelosis, por lo cual se reconoce que estas

especies son una vía directa de transmisión de Salmonella sp. a los seres humanos (Center

for Disease Control and Prevention -CDC- 1999); esta bacteria se considera de carácter zoonótico, por

generar cuadros patológicos de gran importancia en salud pública (Selbitz et al, 1995; Turnbull

1979) de esta manera, los reservorios animales tienen un importante papel en la

determinación de los factores epidemiológicos de la infección (Turnbull 1979).

Numerosos investigadores han reportado el aislamiento de Salmonella sp. a partir de los

excrementos de reptiles tales como las tortugas y cocodrilos en varias partes del mundo

(Bovre y Sandbu, 1959, Cohen et al, 1980, Chiodini y Sundberg, 1981, Shane et al, 1990. Woodward et al, 1997. Passmans et al, 2000)

y se ha establecido que el hábitat natural de los miembros del género Salmonella es el

intestino de vertebrados de sangre caliente y sangre fría; siendo posteriormente

dispersados en el ambiente, donde a su vez pueden sobrevivir y multiplicarse (Cohen, et al

1980). En los reptiles, Salmonella sp. es un microorganismo natural de la flora intestinal,

44

sin embargo, estos animales son catalogados como portadores asintomáticos de la

bacteria (Chiodini y Sulberg, 1981; Millan et al, 1997,; Mitchel y Shane, 2000; Abalem de Sá y Sorari, 2001; Geue y Löschner, 2002;

Corrente et al, 2004; Mermin et al, 2004), ya que según estudios realizados, ésta se ha encontrado en

90% o más de la población de reptiles evaluada (Chiodini y Suldberg, 1981, Woodward et al, 1997), pero

son relativamente pocos los reportes de cuadros patológicos en estas especies silvestres

(Boever y Williams, 1975; Isaza et al, 2000; Oros et al, 1996; Oros et al, 1997).

El primer reporte de aislamiento de Salmonella sp. en reptiles aparece en 1930 en

Indiana County, a partir del excremento de iguanas y desde este momento, se han

realizado numerosos estudios que determinan la presencia de la enterobacteria

Salmonella sp. en estas especies, además del hallazgo de microorganismos como

Arizona sp. Citrobacter sp., y Edwarsiella sp. a partir de animales silvestres y en

cautiverio (Jackson, et al, 1969; Jackson y Jackson, 1971., Kennedy, 1973., Mann y Bjotvedt, 1967, McNeil y Hinshaw, 1946,

Nasasai et al, 2005., Vadillo, et al, 2002), lo cual ha aumentado el interés de investigación, por

representar grandes relaciones con la enfermedad diarreica aguda (EDA), puesto que

según las estadísticas, para el año 2000 (de acuerdo con un estudio realizado a partir de

muestras de aves y humanos) se presentó en el país una tasa superior a los 1500 casos

de EDA por cada 100.000 habitantes, siendo aproximadamente el 50% de los casos,

relacionados con enterobacterias de los géneros Salmonella sp. y Shigella sp. (Jimenez y

Mayorga, 2000).

Dado que la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de los animales, la ruta de

infección puede ser por contacto directo con las heces del animal o indirectamente con la

piel contaminada con el excremento (Mahajan et al., 2003 y Minette 1984). En los reptiles, la

transmisión puede darse perinatalmente, por ingestión de presas contaminadas o por

contacto directo con la materia fecal de otros reptiles; las altas tasas de ejemplares

portadores de Salmonella sp. se relacionan con el comportamiento de coprofagia por

parte de las crias, lo que asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos

(Mader 1996; Schröter et al. 2004).

El primer riesgo real de contraer la enfermedad es para niños menores de 5 años y

personas inmunosuprimidas donde las septicemias por especies prevalentes de

Salmonella sp. se observan cada vez con mayor frecuencia. En segunda instancia, sólo

de 3 a 5% de los casos de salmonelosis son a causa de los reptiles; sin embargo, el

95% de estos casos están asociados con animales mantenidos en cautiverio como

mascotas, lo cual hace que desde 1975 se consideren los reptiles como importante vía

45

de transmisión de Salmonella sp. dado el gran incremento de la adopción de estos

animales como mascotas (CDC, 1999: Schröter et al, 2004).

Los caimanes (Orden Crocodylia) y tortugas (Orden Testudinata) son reservorios de

enterobacterias como Salmonella sp. y son ampliamente reconocidos como fuentes de

transmisión del microorganismo hacia los humanos demostrando su papel zoonótico (Ebani

et al, 2005)

En todas sus fases de desarrollo, las tortugas, como consecuencia de su amplia

distribución geográfica, sus hábitos y características biológicas, son altamente

vulnerables a la depredación natural, captura comercial, saqueo de nidos, matanza de

hembras anidadoras, comercio ilícito de subproductos de tortugas y pérdida del hábitat

entre otras, lo que ha disminuido la población de manera crítica (Bayley y Scott,1882; Boede y

Hernandez, 2004) .

Adicionalmente, existen otros factores que afectan de manera negativa las especies

silvestres anteriormente mencionadas al estar implicados en la disminución de la

población a causa de alteraciones físicas y/o patológicas que se pueden presentar.

Centros de cría, protección y preservación de la fauna silvestre (como la Estación de

Biología Tropical Roberto Franco) han dado a conocer las principales afecciones que

pueden presentarse en este tipo de animales siendo entre otras: daño renal por exceso

en la ingesta de proteínas; fracturas de huesos mandibulares y maxilares por golpes en

peleas territoriales, mordeduras cuando toman el alimento y errores en la manipulación

al ser capturados, alteraciones a nivel ocular, posiblemente por aguas contaminadas con

desinfectantes como hipoclorito, entre otras (Rodríguez y Ramírez 2000).

Existen numerosos reportes de infecciones por Salmonella sp. en animales

poiquilotermos, y las condiciones para que se presente enfermedad en estas especies,

están sujetas a la inmunosupresión debida al estrés por cautiverio, variación en las

temperaturas medioambientales, número de microorganismos presentes, edad y estado

nutricional del animal (Pasmans et al, 2002; Bäumler et al, 1998; Blanc et al, 1960; Cambre et al.1980, Dimow, 1996.)

Generalmente se presentan cuadros en el tracto gastrointestinal, aunque las condiciones

asociadas a salmonelosis en los reptiles incluyen gastroenteritis, meningitis,

osteomielitis, peritonitis, pleuritis (Figura Nº1) y bacteremia (Figura Nº 2) (Mahajan et al., 2003 y

Minette 1984); se ha reportado que en reptiles, la invasión de las células del epitelio intestinal

y subsecuente colonización de los órganos internos parece no ser necesaria para el

establecimiento de una infección por Salmonella sp. (Pasmans et al, 2002). Aunque los reptiles

46

son portadores asintomáticos y por consiguiente los casos clínicos de salmonelosis son

reportados con menor frecuencia, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos

niveles de mortalidad en serpientes y tortugas (CDC 1999, Chatfield et al, 2007; Durango et al, 2004; Muñoz et

al, 2000; Muñoz et al, 2002, Ramsay et al, 2002).

Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia. Fuente: Shotts, (2001)

Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudines. Fuente: Shotts, (2001)

Las infecciones por Salmonella sp. son comunes tanto en animales homotérmicos como

en poiquilotermos entre los cuales existen diferencias significativas en el curso de la

infección. Mientras que en aves y mamíferos las patologías son causadas por serotipos

de Salmonella entérica subespecie entérica, un gran número de serotipos de Salmonella

sp. han sido reportados asociados a los reptiles; entre ellos se incluye S. enterica

subsp. enterica, S. bongori, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S.

enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. Indica (Pignato et

al, 1998); siendo todas las especies causantes de infecciones persistentes pero sin producir

signos de salmonelosis clínica en la mayoría de los casos (Zwart et al, 1970; Greenberd y Sechter, 1992).

Sin embargo, en Colombia no se han desarrollado investigaciones específicas de

aislamiento e identificación de salmonelas en reptiles y tan solo se ha reportado su

47

importancia zoonótica con respecto al mantenimiento como especies silvestres en

cautiverio en calidad de mascotas o por medio de su comercialización (Hernandez 2004).

2.4. ESPECIES EN ESTUDIO

2.4.1. Caimán del Orinoco

El caimán llanero, cocodrilo del Orinoco ó Crocodylus intermedius (Figura Nº 3), es

nativo de la región Orinoquía Colombo-Venezolana, es uno de los cocodrilos de mayor

tamaño de América y actualmente se encuentra catalogado como una de las principales

especies de reptiles en peligro de extinción en el mundo, debido a que la

sobreexplotación para el comercio de las pieles entre los años 1930 a 1960, diezmó las

poblaciones silvestres y su recuperación no ha sido evidente desde ese tiempo (Ross, 1998).

En Colombia, según Medem (1981), el cocodrilo del Orinoco ocupaba un área de

253.530 Km2, entre los ríos Arauca al Oriente y Guayabero – Guaviare al occidente, el

límite occidental lo forma el rio Duda, tributario del Alto Guayabero. Censos realizados

por diferentes investigadores (Ardila et al, 1998, Ardila et al, 1999, Barahona et al., 1996a, Barahona et al., 1996b)

reportan que existen menos de 100 individuos distribuidos de forma natural. Todas estas

investigaciones le permitieron al gobierno nacional declararla en peligro de extinción;

actualmente la especie se encuentra protegida por un marco normativo a nivel nacional e

internacional. Rodríguez y Ramírez (2002) en el Libro Rojo de Reptiles de Colombia,

catalogan la especie en categoría global CR (peligro crítico), como una población

pequeña y en disminución con menos de 250 individuos maduros, con una rápida

reducción en su tamaño poblacional en extensión de presencia o área de ocupación

(Bejarano, 2001; Ramírez y Burbano, 2002). Tras la veda de la caza comercial las principales amenazas

para C. intermedius las constituyen: la fragmentación de las poblaciones, la pérdida de

hábitat, la caza que para protegerse de los animales ejercen los lugareños y, finalmente,

el asalto de los nidos para consumo humano de los huevos o para el comercio ilegal de

las crías (Ardila et al, 1999, Lugo, 1995). Además, según Boede y Sogbe (2000), la especie es

afectada por las siguientes enfermedades en individuos mantenidos en cautiverio en

zoocriaderos: anomalías congénitas e intoxicaciones en neonatos, avitaminosis por

deficiencias nutricionales, escoliosis, osteodistrofia, infecciones bacterianas, micóticas,

virales, parasitismo, traumatismos y estados de shock en crías y juveniles, traumatismos

e hiperparasitoidismo nutricional secundario en adultos. En ocasiones se ha visto que

por ingesta de trozos de caucho y telas, se han producido muertes por ahogamiento.

48

Figura Nº 3. Caiman del Orinoco o Caiman Llanero (C. intermedius)

2.4.2. Testudinos

Colombia con sus 25 especies de tortugas continentales, dentro de las que se

encuentran las tortugas acuáticas, semiacuáticas y terrestres (Figura Nº 4), constituye

uno de los países más ricos en Testudinata de la Región Neotropical, ya que posee casi

la mitad de las 53 especies de tortugas de la región (Ceballos, 2000). Sin embargo, la situación

de estas tortugas es altamente preocupante dado que al menos 14 especies enfrentan

un alto riesgo de extinción y se encuentran incluidas dentro de las categorías de

amenaza de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (2000) debido

a la sobreexplotación de manera intensiva, degradación de hábitats a tal punto que

muchas de ellas han desaparecido en vastos sectores de distribución natural o se hallan

confinadas en hábitats incapaces de sustentar poblaciones saludables(Boyer y Boyer, 1996).

Durante muchos años las especies de tortugas continentales han sufrido una fuerte

disminución en sus poblaciones por varias causas, principalmente antrópicas: consumo

de huevos y carne, uso del caparazón para la fabricación de artesanías, captura

accidental en redes de pesca y palangres, contaminación y destrucción del hábitat de

alimentación y de desove (National Research Council, 1990). Poco se conoce sobre el impacto de

las enfermedades infecciosas bacterianas en las poblaciones de tortugas en estado

natural y sobre el papel que varios microorganismos puedan desarrollar como agentes

patógenos (Glazebrook y Campbell 1990b).

49

Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F (Morroco

Amar – Geochelone denticulata)

2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles

Muchas bacterias han sido identificadas como las causantes de enfermedades en

reptiles mantenidos en cautiverio (Keymer 1978, Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook y Campbell 1990b,

Glazebrook et al. 1993). Sin embargo, se conoce que muchos microorganismos pueden ser

causa de elevada mortalidad en otras especies de animales acuáticos de vida libre (Medway

1980, Ghittino et al. 1984, Gulland 1999). Además, muchas de estas bacterias son patógenas para los

humanos. Según Santoro et al (2006); Aeromonas sp. es el microorganismo más

frecuentemente aislado, seguido de Citrobacter freundi, Salmonella sp, Acinetobacter sp.

y Pseudomona aeruginosa .

Aeromonas sp., Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus sp.,

Acinetobacter sp., Citrobacter sp., son bacterias potencialmente patógenas, que pueden

portarse como oportunistas, ingresar en los tejidos dañados por traumas o aprovechar

las condiciones de estrés causando enfermedades graves. Estas bacterias en reptiles en

cautividad, han sido asociadas a enfermedad cutánea septicémica ulcerativa, dermatitis

papilar, dermatitis focal erosiva, dermatitis ulcerosa traumática, dermatitis necrosante,

estomatitis ulcerosa, rinitis obstructiva, queratoconjuntivitis, septicemia, bronconeumonía

y osteomielitis (Draper et al, 1981, Lauckner, 1985; Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook et al.1993, Dickinson et al, 2001).

Por su parte, existen más de 2300 serotipos de Salmonella sp. , muchos de los cuales

fueron encontrados en reptiles silvestres y en cautiverio (Mermin et al. 1997), y algunos de estos

en quelonios marinos (Keymer et al. 1968; Keymer 1978; Glazebrook y Campbell 1990a; Raidal et al. 1998; O’Grady y

Krause 1999). Estos microorganismos son conocidos como oportunistas principalmente por

50

generar cuadros de enfermedad cuando los hospederos están debilitados y

ocasionalmente son identificados como agentes causales de gastroenteritis en los seres

humanos por consumo de carne de los animales portadores o contacto directo con heces

de los mismos (O’Grady y Krause 1999). Se considera actualmente que los reptiles son fuente de

transmisión de Salmonella sp. (Johnson-Delaney 1996). En reptiles terrestres, coliformes y

Enterobacter sp. son asociados a enfermedades locales y generales (Hoff et al. 1984; Glazebrook y

Campbell 1990a). Proteus mirabilis y Bacillus sp. son considerados saprófitas y parte de la

flora normal que se encuentra sobre la piel de los reptiles (Glazebrook y Campbell 1990a, Shotts, 2001).

Los estudios de la flora bacteriana en animales de vida libre son de fundamental

importancia pues permiten conocer el papel que tienen estos microorganismos en las

enfermedades infecciosas y como afectan la supervivencia de las poblaciones de

tortugas en condiciones naturales dentro del equilibrio biológico de estos vertebrados.

Considerando que el número de los microorganismos resulta mayor en reptiles con

inestable estado de salud, este aspecto puede ser utilizado como un importante índice

para identificar grupos de animales inmunosuprimidos o enfermos, evaluando la flora

bacteriana de una población durante varios años. En fin, el conocimiento de la flora

normal de animales silvestres es importante para entender los riesgos potenciales de la

zoonosis (Santoro et al., 2006).

51

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

En los reptiles, Salmonella sp. hace parte de la flora intestinal normal, por lo cual estos

animales son catalogados como portadores asintomáticos del microorganismo. Sin

embargo, la enterobacteria al tener un comportamiento de parásito intracelular, es

oportunista y puede llegar a causar afecciones en los ejemplares donde se presentan

altos niveles de inmunosupresión debido a las condiciones del cautiverio, situación que

es aprovechada por el microorganismo para la colonización de órganos internos

causando serias patologías en los animales incluso bajo ciertas condiciones llegando a

producir la muerte de los mismos. (Chiodini y Sulberg 1981; Millan et al. 1997; Mitchel y Shane 2000; Boever y

Williams 1975; Isaza et al. 2000; Oros et al. 1997).

Teniendo en cuenta lo anterior es indispensable conocer la implicación que puede tener

esta bacteria en los cuadros patológicos presentados por estos animales y además

reconocer el potencial riesgo zoonótico para las personas que trabajan en la E.B.T.R.F y

que están en contacto directo con los ejemplares de C. intermedius y Testudinos que

son preservados allí. Para tal fin, es necesario conocer la carga de Salmonella sp. que

se presente en la población animal, para poder involucrarla directamente con procesos

de enfermedad en los individuos y en el personal. Esto es de vital importancia, dado que

en el país no se ha realizado ninguna investigación que abarque todos los objetivos

propuestos para este estudio, relacionando la presencia de Salmonella sp. en la

predisposición de los animales a presentar patologías asociadas al microorganismo.

Teniendo en cuenta que todos los ejemplares muestreados se encuentran “ex situ” y el

objetivo de la Estación es la reintroducción de los mismos a su hábitat natural, el

proyecto sirve de guía hacia la preservación y disminución de los riesgos para las

poblaciones de éstas especies silvestres encontradas “in situ”, garantizando que los

ejemplares que salen de la Estación se encuentren completamente sanos, todo en

búsqueda de implementar estrategias que a su vez permitan conservar la integridad de

los últimos ejemplares que habitan el planeta en condiciones in situ.

52

3.2. JUSTIFICACIÓN

El caimán llanero (Crocodylus intermedius) es una especie declarada en peligro de

extinción; a partir de la resolución 0676 del 21 de julio de 1.997 emitida por el Ministerio

del Medio Ambiente, las acciones se han dirigido a la elaboración de un programa

general de conservación producto de la concertación de todas las Instituciones públicas

o mixtas con incidencia directa y/o indirecta tanto en los relictos poblacionales existentes

como en los territorios señalados como hábitats tradicionales de la especie. Por su parte,

las tortugas constituyen el segundo grupo de vertebrados tetrápodos más amenazados

en Colombia, ya que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas

publicadas por la UICN, mas de la mitad de las especies registradas en nuestro país (19

de 32 (taxones), poseen algún riesgo de desaparecer en un futuro cercano, si no se

adoptan medidas efectivas para su protección, manejo y conservación. Es por ello que

esta investigación pretende en primer lugar y con una visión conservacionista, establecer

científicamente si la Salmonella sp. puede estar afectando a los últimos ejemplares en

cautiverio que existen en Colombia y que son el soporte genético con el que cuenta

nuestro país para evitar su extinción; en segundo lugar y dada la implicación que tiene

esta bacteria en la salud pública, se busca establecer con precisión la presencia de este

enteropatógeno en tortugas que también se investigan en la Estación Roberto Franco,

ejemplares donde la literatura reporta que esta bacteria puede hacer parte de la flora

normal, constituyéndose en una fuente potencial de contagio para los caimanes y el

personal que labora en la Estación. Una vez conocida la situación real de la presencia

de este patógeno en los reptiles será posible establecer medidas de control más

pertinentes, enfocadas al establecimiento de la buena salud animal y humana.

La salmonelosis permanece como un importante problema de salud pública alrededor del

mundo y pese a los grandes esfuerzos en investigación, muchos detalles de su patogénesis

son aún desconocidos (Lax, et al 1995) y continúa siendo la principal enfermedad gastrointestinal

en los seres humanos. En Colombia, las investigaciones acerca de la enterobacteria

Salmonella sp. se han centrado en la implicación de la misma en las enfermedades

transmitidas por agua y alimentos (ETA) y son escasos los estudios llevados a cabo acerca

de los posibles contagios producidos por especies de reptiles, aunque se reconoce su gran

poder zoonótico; no se ha tenido muy en cuenta el porcentaje de casos de la enfermedad

que pueden ser generados a partir del contacto con especies cautivas, aunque, según

datos estadísticos, el aumento de la popularidad de esos animales como mascotas,

coincide con el número de casos de salmonelosis en humanos asociadas a reptiles, por lo

cual este problema ha sido en los últimos años de gran importancia a nivel de salud pública.

53

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar e identificar mediante diversos análisis microbiológicos, la presencia de

enterobacterias del género Salmonella en ejemplares de caimán llanero (Crocodylus

intermedius) y tortugas de diferentes géneros (Orden Testudinata); animales mantenidos

en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF), determinando

las serovariedades de mayor prevalencia en estos animales.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

· Determinar mediante pruebas microbiológicas, la presencia de enterobacterias del

género Salmonella aisladas a partir de muestras de hisopado cloacal, de diferentes

especies de tortugas de Orden Testudinata y Crocodylus intermedius neonatos.

· Establecer las especies del Orden Testudinata en las que hay mayor prevalencia de

la enterobacteria en estudio.

· Realizar un análisis indirecto de los ejemplares pertenecientes a la especie

Crocodylus intermedius, estableciendo la presencia de la enterobacteria Salmonella

sp. en el agua y sedimento de los estanques donde permanecen los animales.

· Aislar enteropatógenos del género Salmonella en las muestras de materia fecal

encontrada en los encierros de los ejemplares de caimán llanero en estudio.

· Realizar un análisis antigénico de todas las cepas compatibles con Salmonella sp.

para determinar el/los grupos predominantes en las especies en estudio.

· Establecer mediante pruebas estadísticas descriptivas, el porcentaje de presentación

de la bacteria tanto en Tortugas como en Crocodylia, para así mismo reportar el

grado de infestación en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco.

· Realizar los primeros aportes en Colombia acerca de la descripción de los serotipos

de Salmonella sp. encontrados en diferentes especies de tortugas y la presencia de

la bacteria en el caimán llanero (Crocodylus intermedius).

54

5. METODOLOGÍA

5.1 ÁREA DE ESTUDIO

Esta investigación se llevó a cabo en La Estación de Biología Tropical Roberto Franco

(E.B.T.R.F.) ubicada en la ciudad de Villavicencio - Meta, centro de investigación de la

Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia.

Las condiciones climáticas muestran un régimen de lluvias unimodal con una

precipitación media anual de 4085mm; temperatura promedio de 27oC y una humedad

relativa de 77,8% (Rodríguez y Ramírez, 2000).

La E.B.T.R.F, cuenta actualmente con una colección viva que supera los 300 ejemplares

de tortugas terrestres nativas del país, distribuidas en más de 20 especies y,

adicionalmente un número mayor a 200 ejemplares de Crocodylus intermedius

distribuidos en diferentes grupos etáreos entre los que se encuentra una gran cantidad

de neonatos y juveniles (80%), producto de investigaciones en el área reproductiva.

El estudio de esta colección permite el desarrollo de un sinnúmero de investigaciones y

proyectos que contribuyen a la conservación de estos individuos y asimismo avanzar en

el conocimiento de estas especies que constituyen el grupo de vertebrados tetrápodos

más amenazado de Colombia, de acuerdo con las listas oficiales de especies

amenazadas publicadas por la Unión Internacional para la Conservación de la

Naturaleza (UICN)

5.2 POBLACIÓN MUESTRAL:

El muestreo fue realizado sobre la totalidad de los ejemplares encontrados en la

Estación distribuidos en 52 estanques (Anexo Nº 1) así: 29 caimanes adultos (4 años en

adelante) ubicados en 8 estanques, 118 animales juveniles (3 – 4 años) encontrados en

8 estanques y 80 neonatos (1 – 2 años) distribuidos en 9 estanques; los ejemplares del

Orden Testudines se encontraban distribuidos en 27 estanques en cada uno de los

cuales se encuentran animales de diferentes especies en peligro de extinción (Tabla Nº

3).

5.3 TOMA DE MUESTRAS

Se realizaron tres muestreos seriados con un intervalo de 15 días entre cada uno. Se

obtuvieron muestras de arena encontrada alrededor de los estanques donde están

alojados los ejemplares en estudio procurando que en la muestra se incluyera materia

fecal; simultáneamente se muestreó el agua y sedimento de cada uno de estos

encierros. Adicionalmente, en cada uno de los estanques se obtuvo hisopado cloacal del

55

Tabla Nº 3: Especies de Testudines y Crocodylia muestreadas y número estanques y ejemplares muestreados para cada caso

Especies

Nombre Cientifico Nombre común

Nº Estanques Muestreados

Nº Ejemplares Muestreados

Caimanes

Crocodylus intermedius

Caiman del Orinoco / Caiman Llanero

25 24

227 226

Caiman crocodilus

Babilla

1

2

Tortugas

Rhinoclemmys melanosterna

Palmera

27 2

342 72

Rhinoclemmys diademata

Inguensa

2

32

Rhinoclemmys nasuta

Sabaletera

1

2

Híbrido Rhinoclemmys

Híbrido

2

115

Geochelone denticulata

Morroco Amar

1

4

Geochelone carbonaria

Morroco Negro

1

15

Rhinoclemmys funerea

1

1

Phrynos gibbus

Hedionda

1

4

Kinosternon sp

Tapaculo

1

3

Phrynos geoffroanus

Bachala

1

1

Peltocephalus dumerilianus

Cabezon

1

1

Chekus fimbriatus

Mata Mata

1

2

Podochnemis unifilis

Terecay

1

20

Podochnemis expansa

Charapa

1

8

Podochnemis vogli

Sabanera

1

26

Podochnemis lewyana

Lewyana

1

2

Trachemys scripta ornata

Pecho carey

1

3

Trachemys scripta callirostris

Icotea

1

31

25% de los ejemplares de la colección de Crocodylia neonatos y Testudines de todas las

edades presentes en la E.B.T.R.F y las muestras se trabajaron como un grupo por cada

estanque.Teniendo en cuenta que la obtención de muestras se realizó de forma

aleatoria, cabe aclarar que en cada muestreo las muestras remitidas eran diferentes a

las procesadas en el muestreo anterior.

56

5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal

Testudines: Se muestreó el 25% de la población total encontrada en cada estanque,

para lo cual se introdujo a través de la cloaca un hisopo estéril, haciendo movimientos

de rotación contra las paredes cloacales se garantizó la obtención de suficiente muestra

(Figura Nº 5); inmediatamente el hisopo se depositó en una bolsa de cierre hermético

que contenía caldo lactosado esteril (2%), con el fin de evitar la deshidratación y

contaminación (Saelinger y Lewbart 2006, Crawford et al,1971; Chambers y Hulse, 2006) Las bolsas que

contenían las muestras se remitieron al laboratorio debidamente etiquetadas con el

número de estanque y tipo de muestra; fueron transportadas en refrigeración por un

periodo menor de 6 horas (Luna, 1991) para inmediatamente ser procesadas en el

laboratorio de microbiología veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y de

Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá.

Figura Nº 5. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Testudines.

Caimanes neonatos: Se muestreó el 25% de la totalidad de los ejemplares neonatos

(menores de 1 año) encontrados en cada estanque (Figura Nº 6). De igual forma que en

los individuos de tortugas, las muestras se transportaron en bolsas de cierre hermético

que contenían caldo lactosado en un lapso menor de 6 horas (Luna, 1991) hasta su

procesamiento en el laboratorio de microbiología veterinaria de la Universidad Nacional

de Colombia.

57

Figura Nº 6. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Crocodylus intermedius

neonatos.

5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques:

Tortugas y Caimanes Neonatos: Una vez se homogenizaba el agua contenida en los

estanques, se introdujo una jeringa de 20cc a la cual previamente se le había colocado

una sonda estéril de 50 cm de longitud y se realizaba aspirado del fondo del estanque

hasta obtener una muestra de 250 ml de agua y sedimento; ésta se depositó en bolsas

de cierre hermético (Figura Nº 7 A y B). Se empleó una jeringa y una sonda por cada

estanque.

Caimanes adultos y juveniles:

La toma de muestras se realizó a partir de los canales de desagüe, se hizo apertura de

los sistemas de evacuación y se tomaron aproximadamente 250 ml de agua junto con

sedimento directamente en la bolsa de cierre hermético (Figura Nº 7 C).

Todas las muestras fueron transportadas en condiciones de refrigeración, debidamente

identificadas (Rodriguez, et al,1980) para posteriormente ser procesadas en el laboratorio de

microbiología veterinaria en la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá en un

periodo menor de 6 horas desde el momento de la toma.

58

A. B.

C.

FIGURA Nº 7. Muestreo de Agua y Sedimento de los Estanques. A y B. Muestreo en los

estanques de Tortugas y Crocodylia neonatos. C. Muestreo en estanques de Crocodylia

Adultos y Juveniles

5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques: Se abarcó la

totalidad de la playa de cada estanque, llevando a cabo un muestreo significativo en 5

puntos del terreno conformando la letra Z (Petersen y Calvin, 2006), se realizó una excavación

hasta aproximadamente 10 cm de profundidad y a partir de este punto se obtuvo una

muestra de 250g de arena, se procuró que el sitio de toma de la misma se encontrara

contaminado con restos de materia fecal; la muestras se depositaron en bolsas de cierre

hermético y se transportaron a la ciudad de Bogotá igualmente en un lapso menor a 6

horas (Figura Nº 8).

59

Figura Nº 8. Toma de muestra: Arena y materia fecal encontrada en los encierros de los

ejemplares en estudio.

5.4. FASE ANALÍTICA

5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp.

El cultivo de la bacteria fue realizado de acuerdo con la norma ISO 6579: 2002, con

adición de algunos medios de cultivo que han demostrado buenos resultados en la

recuperación del microorganismo (Chambers, y Hulse, 2006; Gaillot et al, 1999 Bonnie, 2001)

5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo

Las muestras de hisopado cloacal fueron enriquecidas con 20 ml de caldo lactosado

estéril, a las muestras de agua/sedimento y materia fecal/arena, se les adicionaron 250

ml de caldo lactosado esteril. Se llevaron a incubar a 37ºC, durante un periodo de 24

horas (Mann y Bjotvedt, 1967; Luna, 1991; Corrente et al 2004).

5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo

Se recuperaron 10 ml del caldo de preenriquecimiento y se adicionaron a un tubo de

ensayo con 10 ml de caldo tetrationatoBD®, el cual se incubó en baño serológico a

43±0,5oC por 24 horas (Luna, 1991)

5.4.1.3. Aislamiento primario en medios selectivos y diferenciales

Las muestras enriquecidas en caldo tetrationato, fueron inoculadas en medios de cultivo

selectivos como Agar MacConkeyBD® (Mck) y CHROMagar OrientaciónBD®

respectivamente mediante técnica de aislamiento o agotamiento con una incubación a

370C durante 24 - 48 horas. (Gaillot et al;1999) y a partir de los aislamientos realizados en los

60

medios de cultivo selectivos, se llevó a cabo la identificación de las colonias

“sospechosas” de Salmonella sp; el CHROMagar Orientación BD® permite la

identificación de microorganismos mediante reacciones de sustratos cromógenos

artificiales y Salmonella sp. no tiene la capacidad de reaccionar con ningún sustrato

cromógeno del medio, por lo cual las colonias sospechosas se identifican por no producir

ningún tipo de coloración; son de bordes definidos y tamaño regular (2 - 5µ) (Hengstler et al,

1997) (Figura Nº 9 A); en agar MacConkeyBD® Salmonella sp. no tiene la capacidad de

degradar la lactosa presente en el medio, por lo cual las colonias se consideraban

sospechosas cuando no presentaban ninguna coloración y se identificaban como

colonias Lactosa Negativas (Figura Nº 9 B) (Aguilar y Escolástica, 2001)

A B

Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de

cultivo selectivos. A. CRHOMagar Orientación, B. Agar MacConkey

Una vez detectadas las “colonias sospechosas” de Salmonella sp., fueron recuperadas y

aisladas en los medios de cultivo diferenciales CHROMagar SalmonellaBD® y Agar

Hektoen Entérico, trabajados en el estudio para confirmar la pureza del cultivo y

determinar si la morfología y característica de las colonias eran efectivamente

pertenecientes a Salmonella sp..

En Agar Hektoen Entérico la identificación de microorganismos del género Salmonella

está determinada por el crecimiento de colonias con una coloración negra en su parte

central debida a la producción y precipitación de ácido sulfhídrico y presentan un halo

transparente alrededor que ha permitido en el dialecto común definir que los

microorganismos del género Salmonella en agar Hektoen crecen con apariencia de “ojo

de pescado” (Figura Nº 10 A) (Luna, 1991; Richards, et al, 2004; Gaillot et al, 1999; Dusch y Altwegg, 1993; 1995;

Monnery et al, 1994). Adicionalmente, en CHROMagar SalmonellaBD® las colonias

pertenecientes a este género crecen con una coloración rosa – púrpura (Figura Nº 10 B),

61

mientras que los microorganismos no deseados son inhibidos o aparecen como colonias

con pigmento verde – azul (Bonnie, 2001; ISO, 2002; Dusch y Altwegg, 1993; 1995; Monnery, et al , 1994; Poisson et al,

1993; Ruiz et al, 1996).

A B

Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella

aisladas en los medios de cultivo diferenciales. A. Agar Hektoen.

B. CHROMagar Salmonella.

Los medios cromogénicos permitieron el hallazgo de otros microorganismos aunque no

era un objetivo propuesto para el trabajo, lo cual es de gran importancia, dado que

permite conocer la microbiología cloacal de las especies y de esta forma identificar si

existe alguna alteración a nivel de la flora gastrointestinal normal. En CHROMagar

OrientacionBD® se observaron colonias de coloración púrpura y opacas características de

Staphylococcus saprophyticus (Figura Nº 11 A), Escherichia coli se reconoce por crecer

con apariencia rosa – transparente de tamaño medio con o sin halos alrededor (Figura

Nº 11 B); Enterococcus sp. crece con pigmentación verde azulada y colonias de tamaño

pequeño (Figura Nº 11 C),. Simultáneamente fue posible identificar enterobacterias del

género Klebsiella sp. por presentar un tamaño medio y coloración azul oscuro; (Figura Nº

11 D), Proteus presentó morfología asimétrica en las colonias con una pigmentación

crema rodeada de halos marrón. Finalmente, Citrobacter sp. produce colonias azul –

violeta en el medio (Figura Nº 11 E).

62

Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. A: Staphylococcus saprophyticus. B: Escherichia coli. C. Enterococcus sp. D. Klebsiella sp.

E. Citrobacter sp.

A B

C D

E

63

5.4.1.4. Identificación Bioquímica

El reconocimiento de acuerdo con el metabolismo de los microorganismos

pertenecientes al género Salmonella sp. se llevó a cabo mediante el sistema de

identificación BBL cristal BD® para bacterias entéricas/no fermentadoras realizando el

montaje y lectura de las placas según las indicaciones, recomendaciones e instrucciones

del productor (Figura Nº 12) (Anexo Nº 3).

A B

Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal® para microorganismos

entéricos/no fermentadores. A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque

de Testudines número 21. B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán neonato

en el estanque número 47

Para la lectura del perfil del microorganismo por parte del Software fue necesario realizar

a las colonias “sospechosas” en los medios de cultivo diferenciales, un nuevo

aislamiento en agar tripticasa soya BD® enriquecido con 5% de sangre ovina y luego de

una incubación por 24 horas a 37ºC (Murray, 1999) se realizó prueba de indol en medio SIM y

simultáneamente se llevó a cabo prueba de oxidasa, Salmonella muestra un

comportamiento negativo para las dos pruebas.

5.4.1.5. Serotipificación

Una vez los aislamientos fueron identificados como Salmonella sp. por el método de

Crystal BD®, las cepas fueron recuperadas nuevamente a partir de Agar TSA con Sangre.

Los aislamientos de Salmonella sp. fueron expuestos a antisueros mono y polivalentes

específicos como lo indica la metodología de Kauffmann White (Grimont y Weill, 2007). En una

lámina hemoclasificadora se rotuló el primer cuadrante de forma vertical con el antisuero

a evaluar y cada recuadro horizontal con la identificación de la cepa a serotipificar

(Figura Nº 13). En la primera sección de la lámina (Grupo B/2 A+S) se depositaron 50µl

64

de solución salina 0,85% y se tomó una asada de la colonia a evaluar a partir del TSA

con sangre, se homogenizó la solución y posteriormente se adicionó una gota de 50µl

del antisuero correspondiente y se mezcló; se esperó la formación macroscópica de

agregados finos o grandes aglutinados que indicaba la positividad de la reacción; en

caso de no haber evidencia de aglutinación, se procedía a evaluar el antisuero siguiente

(Grupo D) y así sucesivamente hasta establecer el serogrupo del aislamiento (Anexo Nº

4). Para cada reacción positiva se realizaba un control positivo y negativo con el fin de

garantizar la inexistencia de falsos positivos (Bayley y Scott, 1982, Chatfield, et al., 2007. Luna, 1991, Winkle y

Rhode, 1961)

Cepa Antisuero

2 A+S

7 A + S

14 HC

24 A+S

31 A+S

38 A+S

44 HC

49 A + S

Grupo B + +

Grupo D1 +

Grupo C1 +

Grupo C2 + +

Poli B +

Poli C +

Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para la serotipificación

de las cepas de Salmonella sp. (+: Reacción positiva de aglutinación).

Para la serotipificación se emplearon los antisueros comerciales Polivalentes B DIFCO®

(grupos C1,C2, F, G y H) y Polivalente C DIFCO® (Grupos I, J, K, M, N, O) y antisueros

monovalentes para Grupo B DIFCO® (Factor 1, 4, 5, 12), Grupo C1 DIFCO® (Factor 6,7),

Grupo C2 DIFCO® (Factor 6,8), y Grupo D1 DIFCO® (factor 1,9, 12).

5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos

La prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realizó (mediante el método de Kirby –

Bauer o prueba de difusión por disco) a las cepas de Salmonella sp. identificadas por el

sistema de identificación BBL CrystalBD®.

A partir de los aislamientos en el medio de cultivo agar TSA + SangreBD® se tomaron

aproximadamente 2 o 3 colonias y se inocularon en un tubo con solución salina esteril,

garantizando una total dilución de las colonias hasta alcanzar una turbidez

correspondiente al patrón 0,5 de McFarland, con una concentración aproximada de 1,5

x 108 UFC/ml. (Chambers y Hulse, 2006 y Smith et al, 1952).

La suspensión anterior, se depositó sobre una caja de agar Mueller HintonBD®, medio de

cultivo validado por la NCCLS (Chambers y Hulse, 2006); se garantizó que toda la suspensión

entró en contacto directo con el agar y pasado un lapso de 2 minutos aproximadamente,

65

el exceso de solución se descartó e inmediatamente se ubicaron los discos

comercialesBD® impregnados con el agente antimicrobiano a enfrentar con la bacteria

haciendo una leve presión sobre el agar; las placas se llevaron a incubación durante un

lapso de 16 – 18 horas a una temperatura de 37oC. Los antibióticos evaluados fueron

Sulfatrimetoprim (25µg), Norfloxacina (10µg), Ampicilina (10µg), Cloranfenicol (20µg),

Cefoxitin (20µg), y Tetraciclina (30µg) BD® (Passmans, et al, 2005).

Posterior a la incubación, los halos inhibitorios fueron medidos en milímetros (Figura Nº

14) y de esta forma se clasificó el tipo de respuesta según las tablas de interpretación

provistas por la NCCLS. donde se evalúa la acción de antimicrobianos frente a

microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, estableciendo, la

sensibilidad total, sensibilidad moderada y/o resistencia a este tipo de agentes (Anexo Nº

5)

.

Figura Nº 14. Antibiograma

66

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Análisis de datos

Todos los datos obtenidos durante el proyecto fueron analizados mediante estadística

descriptiva y se representaron con tablas, histogramas, gráficos circulares, entre otros.

6.2. Identificación de microorganismos del género Salmonella por

técnica BBL Crystal®

Mediante esta técnica de identificación fue posible confirmar los aislamientos que se

habían identificado como “sospechosos” de Salmonella en los medios de cultivo

diferenciales. Se obtuvieron en total 36 aislamientos sospechosos, de los cuales 31

fueron identificados por el software (Libro electrónico de códigos BBL Crystal®) como

Salmonella sp. con un nivel de confianza promedio de 0.9908. De los 5 aislamientos

restantes, en tres se descartó la presencia de Salmonella sp. puesto que en uno se

obtuvo Escherichia coli con un nivel de confianza de 0,9029; en otro se aisló

Flavimonas oryzihabitans antes clasificada como Pseudomonas oryzihabitans la cual

según reportes bibliográficos es frecuentemente recuperada de ambientes tales como

plantaciones de arroz, suelos y agua estancada; y no tiene ninguna significancia clínica

(Treviño, et al 2001); finalmente, se aisló Providencia rustigianii, con un nivel de confianza de

0,7766. Dos de los aislamientos no pudieron ser identificados por el kit para la

evaluación de microorganismos Entéricos/No Fermentadores, por lo cual se reportaron

como negativos para Salmonella sp.

Adicionalmente, es necesario tener en cuenta que el sistema identificó dos de los

aislamientos como Salmonella cholerae suis subsp. arizonae, serovariedad encontrada a

partir de una muestra de origen ambiental la cual no ha sido reportada en especies de

reptiles, hecho que permitió plantear una hipótesis sobre la posible contaminación de la

arena en el encierro mediante fómites (botas, herramientas) que hubiesen sido utilizados

previamente en alguna granja donde se mantienen cerdos puesto que la serovariedad

aislada ha sido reconocida como agente causal de salmonelosis porcina (Thomas, 1997; Mc

Caughey et al, 2005). Sin embargo, mediante las indagaciones realizadas acerca del manejo en

la E.B.T.R.F. y las medidas de bioseguridad establecidas allí, esta hipótesis fue

descartada.

67

6.3. Positividad a Salmonella sp. en estanques de Crocodylia y

Testudinea

Entre los ejemplares de Crocodylia se encuentran especies de Crocodylus intermedius

en su mayoría, distribuidos en 24 estanques, en 15 de éstos se encontró la bacteria; el

estanque restante es ocupado por ejemplares de Caiman crocodylus (Babillas) donde

igualmente se encontró el microorganismo, lo cual permite concluir que el 64% de los

estanques de caimán se encontraban positivos a la bacteria. Por otro lado, de los 27

estanques de tortugas evaluados, 12 (44,4%) son positivos para Salmonella sp;

encontrándose la presencia del microorganismo en 7 de las 18 especies que conforman

la colección viva de la E.B.T.R.F; estos resultados son de gran preocupación puesto que

de acuerdo a los resultados obtenidos y haciendo un análisis general que reúne los

datos globales colectados en la Estación, para las dos especies evaluadas, se pudo

establecer que en 27 de los estanques (52%) fue posible recuperar microorganismos del

género Salmonella; mientras que los 25 (48%) restantes se encuentran negativos para la

bacteria (Figura Nº 14). Según el volumen de muestras remitidas al laboratorio, de un

total de 129 muestras, 30 fueron positivas para el microorganismo, lo cual equivale a un

24% . Es necesario aclarar que en el primer muestreo se remitieron al laboratorio 129

muestras, en el segundo muestreo 96 y en el tercero 73; debido a que si en alguno de

los estanques evaluados se reportaba el hallazgo de Salmonella en cualquiera de las

muestras procesadas, no era relevante muestrear nuevamente dicho estanque ya que el

proyecto estaba condicionado a la evaluación de la presencia/ausencia de la bacteria.

Figura Nº 15.

Es de vital importancia tener en cuenta que es muy poco lo que se ha investigado a nivel

mundial y mucho menos Nacional, con respecto a la presencia de la enterobacteria en

este tipo de reptiles, ya que por muchos años se han encaminado los estudios a las

N = 52

68

especies que son criadas como mascotas, tales como iguanas, lagartos, tortugas y

serpientes (Hidalgo et al, 2008; Corrente, et al, 2004; Kourany y Telford, 1982; Ebani et al; 2005; Mitchell y Shane, 2001), pero

en animales que se encuentran en via de extinción y que son el objetivo principal de los

centros de conservación y recuperación de las especies mediante programas de

reproducción, los ensayos acerca de la presencia de Salmonella sp. tanto en los

animales como en su hábitat natural son insuficientes. Adicionalmente, si bien es cierto

que el microorganismo hace parte de la flora comensal de los reptiles y que su

aislamiento en tortugas de diferentes familias ha sido reportado con mayor frecuencia

(Hidalgo, et al 2007,2008; Siebeling et al, 1975; Passmans et al, 2002; Saelinger y Lewbart 2006), no se puede ignorar el

hecho de que para todos los individuos evaluados, las condiciones de cautiverio donde

son mantenidos crean cuadros de inmunosupresión marcada donde la enterobacteria es

excretada de manera intermitente (Chiodini y Sundberg, 1981; Bradley et al, 2001; Ebani et al 2005) y puede

llegar a producir estados patológicos caracterizados por letargia, anorexia, septicemia,

pneumonia, celomitis, abscesos, shock hipovolémico y, bajo circunstancias extremas, la

muerte del ejemplar (Onderka and Finlayson, 1985; Frye, 1991).

Aunque todos los reptiles son considerados portadores naturales de Salmonella sp.,

lagartos, serpientes y tortugas en particular, son reservorios de dicha bacteria (Baümler et al,

1998) y no es claro cómo frecuentemente las especies de reptiles son colonizadas por

serovariedades de Salmonella; en algunos estudios realizados se ha evaluado la

capacidad de colonización de la bacteria en útero, contaminación perinatal, por ingestión

de presas contaminadas y/o contacto con heces de otros reptiles (Schöter, et al , 2004). Según

Kourany y Telford (1982), la predisposición a condiciones de estrés y escases de

alimento hacen que la bacteria atraviese la barrera sanguínea y linfática, llegando a

oviducto, causando la contaminación de los huevos; aunque Mitchell y Shane (2000),

sugieren que la contaminación de los huevos se da por abrasión del mismo cuando entra

en contacto con el suelo y cáscaras remanentes, en su ensayo descartan la transmisión

vertical puesto que no lograron el aislamiento del microorganismo a partir de ovarios,

oviducto y saco embrionario. Sin embargo, la mayor parte de investigaciones en esta

área concluyen que la ingestión de agua contaminada con heces es la principal vía de

infección considerándose el medio acuático favorable para la transmisión (Hidalgo, et al, 2007)

sin llegar a subestimar que el alimento y el contacto con otros reptiles también son una

importante vía de contaminación; además las altas tasas de ejemplares portadores de

Salmonella se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las crías, lo

que a su vez asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos (Mader, 1996) La

importancia de las infecciones por Salmonella sp. es su potencial zoonótico y los

aislamientos de la bacteria a partir de reptiles se han considerado como patógenos para

humanos, ya que poseen factores de virulencia cruciales para el desarrollo de una

69

gastroenteritis (Pasmans et al., 2005). Estos factores demuestran la importancia en la obtención

de los resultados ya que se ha informado a la Estación de Biología Tropical Roberto

Franco acerca de la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. tanto en los animales

como en su hábitat natural, con el fin de concientizar al personal que labora en sus

instalaciones y que se encuentra en un potencial riesgo de contraer salmonelosis

asociada a reptiles.

6.4. Presencia de Salmonella sp. según la especie

En la Estación de Biología Tropical Roberto Franco se encuentra una colección que

supera los 400 ejemplares de tortugas distribuidos en más de 18 especies y más de 200

ejemplares de Crocodylus intermedius. Es una población que se encuentra en buenas

condiciones de salud, a pesar de haberse obtenido aislamientos de Salmonella sp. en

un 46% de los estanques de tortugas (Figura Nº 16) y 60% de C. intermedius (Figura Nº

17). Cabe resaltar que ninguno de los animales presentaba sintomatología asociada con

Salmonelosis, lo cual puede ser compatible con varias investigaciones que se han

realizado en este tipo de ejemplares estableciéndose de esta forma que son portadores

aisntomáticos de la enterobacteria (Chambers y Hulse, 2006; Mitchell y Shane, 2000; Pasmans, et al 2005; Geue y

Lôschner, 2002; Chiodini y Sundberg, 1981; Millán et al, 1997; Abadem de Sá y Solari; 2001)

Figura Nº 16.

N = 27

70

Figura Nº 17.

Saelinger y Lewbart (2006) plantearon dos hipótesis de acuerdo con los resultados que

obtuvieron en el aislamiento de Salmonella sp. en ejemplares de tortugas silvestres; ellos

postulan que no lograron recuperar ningúna cepa, posiblemente porque las tortugas

excretan Salmonella sp. únicamente bajo condiciones de estrés como el cautiverio y/o

porque las tortugas silvestres no son portadores naturales de Salmonella sp. sino que la

adquieren cuando son incluidas en ambientes “ex situ”; de esta forma proponen que las

tortugas “salvajes” no pueden ser portadores de los organismos antes de la captura; sin

embargo tanto el análisis experimental llevado a cabo en la Estación Roberto Franco,

como el realizado por Chambers and Hulse (2006), contradice por completo el hallazgo

de dichos investigadores quienes a partir de ejemplares silvestres, reportaron que el 85%

de la muestras procesadas eran positivas para Salmonella sp. Nuestra investigación en

la Estación, soporta la primera hipótesis planteada por Saelinger y Lewbart (2006)

puesto que el porcentaje de recuperación de Salmonella sp. en los Testudines cautivos

en la E.B.T.R.F (Figura Nº 16), fue de 46% y se plantea que los resultados inesperados

obtenidos por dichos autores posiblemente se dieron por una errada metodología de

muestreo al haber empleado únicamente hisopado cloacal en la toma de las muestras

dado que la cantidad que se obtiene de esta manera es insuficiente y se conoce que la

concentración de Salmonella sp. frente a la flora acompañante es muy baja, lo cual hace

que su recuperación sea más difícil ó posiblemente al igual que Richards et al (2004), no

obtuvieron resultados favorables seguramente por no realizar previo enriquecimiento de

la muestra.

Por otra parte, el porcentaje de aislamiento de Salmonella sp. en C. intermedius

observado en la Figura Nº 17 fue mayor que el obtenido para ejemplares de Orden

Testudinata, lo cual concuerda con lo reportado por Geue y Löschner (2002) quienes

N = 25

71

obtuvieron un porcentaje de recuperación de la bacteria solo de 2,6% (una muestra) en -

Testudines, mientras que en lagartos obtuvieron un porcentaje de aislamiento de 47,4 %;

(36 muestras); de igual manera en un estudio realizado por Corrente et al (2004) se

obtuvo 50% de recuperación en lagartos y 10,3% en tortugas. Los resultados obtenidos

en la estación fueron mayores a lo esperado puesto que existen muchos más reportes

de aislamientos a partir de muestras provenientes de tortugas que de caimanes (Richards.

et. al 2004; Mitchell and Shane. 2001; Pasmans, et al 2005; Hidalgo, et al 2007, Lane, 1996).

Es importante destacar que estos resultados apoyarán bibliográficamente a muchos

investigadores en esta área pues no se conocen datos acerca del comportamiento de la

bacteria en ejemplares de Caimán y como se puede deducir, es de vital importancia

determinar la presencia de Salmonella en este tipo de animales puesto que la

prevalencia en los individuos ex situ es altísima y teniendo en cuenta que generalmente

se encuentran incluidos en programas de recuperación y repoblación de la especie es

necesaria la implementación de medidas que eviten la predisposición de los animales a

inmunosupresión extrema y adicionalmente mantener las medidas de bioseguridad

apropiadas que garanticen condiciones sanitarias ideales para los animales y el personal

que labora con los mismos.

Cabe resaltar que para animales mantenidos en cautiverio, es de vital importancia

conocer que Salmonella sp. es altamente resistente fuera de su hospedero y permanece

viable después de 89 días en suelo y/o agua y 30 meses en Materia Fecal, lo que

permite asegurar que todo el ambiente del encierro puede ser fuente para aislamientos

positivos para Salmonella sp. (Warwick, et al 2001). Adicionalmente, teniendo en cuenta que la

excreción de la bacteria no es constante y que el muestreo por hisopado cloacal no es lo

suficientemente sensible, se optó por llevar a cabo un muestreo mucho más amplio que

permitiera aumentar las probabilidades de recuperación del microorganismo a partir de

muestras de origen ambiental puesto que según reportes bibliográficos, han generado

resultados satisfactorios en el aislamiento del microorganismo (Hidalgo, et al 2007) siempre y

cuando el muestreo sea continuo y repetitivo (Woodward et al., 1997; Mermin et al., 2004).

6.5. Aislamientos de Salmonella sp. según el tipo de muestra para

ejemplares de Crocodylia y Testudinos

Las muestras de tipo ambiental obtenidas para el aislamiento de Salmonella sp. en este

ensayo han permitido una buena recuperación de la bacteria, consiguiéndose un mayor

índice de recuperación de la bacteria a partir de muestras de agua y sedimento de los

estanques donde se aisló el microorganismo en 7 (50%) de las 14 muestras positivas en

72

Testudines y 10 (71,4%) de 14 muestras igualmente positivas en Crocodylia; a diferencia

de los hisopados cloacales donde la recuperación del microorganismo fue menor.

Las figuras Nº 18 y 19 muestran claramente los resultados obtenidos de acuerdo al tipo

de muestras procesadas para el aislamiento de Salmonella en los ejemplares evaluados

y analizando los datos es posible afirmar que cualquier metodología que se emplee para

el aislamiento de la bacteria no es lo suficientemente sensible y específica por si sola;

deben emplearse diferentes muestras para garantizar la recuperación del

microorganismo; es así como es posible corroborar los resultados de ensayos previos

donde el aislamiento del enteropatógeno a partir de hisopado cloacal en muchos casos

no ha permitido la obtención de la bacteria (Geue y Löschner, 2002; Richards. et al .2004; Pasmans et al. 2002;

Saelinger y Lewbart, 2006) y refutar aquellos donde se ha obtenido un altísimo porcentaje de

aislamiento tal como Schröter et al (2004) quienes mediante hisopado cloacal obtuvieron

Figura Nº 18.

Figura Nº 19.

73

81% de recuperación de Salmonella sp. en serpientes y Pasmans et al (2005), con 25

aislamientos positivos para Salmonella sp. (75,8%) de 33 muestras obtenidas a partir de

hisopados cloacales en lagartos, aunque igual establecen que el muestreo único por

hisopado cloacal no es altamente sensible. Según los resultados obtenidos en este

trabajo, no es recomendable realizar hisopados cloacales en los animales porque el

estrés generado durante el procedimiento es muy alto y el porcentaje de recuperación

de la bacteria muy bajo; además, conociendo que la excreción de la bacteria es

intermitente, el aislamiento del microorganismo mediante hisopado cloacal va a

depender no solo de llevar a cabo una buena metodología diagnóstica, sino del factor

“azar” que garantice que en el momento del muestreo la bacteria este siendo excretada

por el animal (Hidalgo, et al 2007; Saelinger y Lewbart 2006; Pfleger,. et al, 2003; Warwick, et al 2001; Woodward et al, 1997;

Mermin et al. 2004).

Los datos sugieren que el agua, junto con el sedimento, es una fuente de transmisión

importante para los ejemplares que se encuentran alojados en cada estanque; a

diferencia de Mitchell y Shane (2000), quienes no obtuvieron resultados en las muestras

de agua procesadas, en su trabajo de investigación, al igual que en este lograron aislar

el microorganismo en la arena de los estanques contaminada con heces de los animales,

la cual según los resultados obtenidos, también puede ser tomada como una muestra

apropiada para el aislamiento de la bacteria aunque debe estar acompañada de otra

metodología de aislamiento. En nuestra investigación se realizaba una excavación

aproximada de 15 cm de profundidad y a partir de allí se obtenía la muestra, lográndose

un porcentaje de recuperación de 12,5% en Testudinea y 8% en Crocodylia aunque se

debe aclarar que el lugar de elección para la toma de la muestra era aquel contaminado

con excremento del animal en los estanques de Testudinea puesto que en ninguno de

los 3 muestreos realizados se encontró materia fecal sobre la arena de los encierros en

Crocodylia. Algunos reportes soportan la metodología empleada en este estudio; han

establecido que a profundidades de 5 – 50 cm hay una mayor supervivencia de

Salmonella sp. en la arena en comparación con la superficie (Platz, 1980; Purvis, et al, 2002), a

pesar de ser un ambiente más inestable expuesto a temperaturas extremas (Mitscherlich y

Marth. 1984; Bicudo y Goyal, 2003), desecación (Purvis, et al, 2002; Zibilske y Weaver, 1978) y rayos Ultra Violeta

(Schlundt, 1984). Aunque se expone que la persistencia de Salmonella sp. en la profundidad

puede verse afectada por el grado de infiltración de la columna de arena, lo cual a su

vez depende de las propiedades físico químicas del suelo tal como la textura, porcentaje

de arena, limo y arcilla que la compone, porcentaje de materia orgánica en la superficie,

pH, el movimiento y dirección del agua (Winfield y Groisman, 2003) .

74

Es claro que tanto para tortugas como para caimanes, la frecuencia de aislamiento de

Salmonella sp. en el ambiente de la Estación (19,2% n =10 en tortugas y 24 % n = 12 en

caimanes) indica la habilidad del microorganismo para sobrevivir fuera del hospedero, lo

cual favorece la contaminación de los otros animales que permanecen en contacto

constante con el estanque infectado (Winfield y Groisman, 2003); sin embargo, las propiedades

físico químicas del ambiente externo influyen fuertemente en la supervivencia de

Salmonella sp. y por consiguiente en el riesgo de infección asociado para los otros

ejemplares. Según Jensen et al (2006) es posible disminuir la carga bacteriana en el

suelo realizando tratamientos sobre la arena, como lo es el arado; sugirieron que el

hecho de recoger el excremento periódicamente podrá reducir la concentración del

microorganismo.

6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia

según grupos etáreos

En la figura Nº 20 se observa el porcentaje de aislamiento de Salmonella en cada uno de

los grupos, es notable que en caimanes adultos y juveniles el aislamiento de esta

bacteria en los estanques no varió de manera significativa puesto que se obtuvieron

porcentajes de 29% (n = 4) y 21% (n = 9) respectivamente. Estos resultados concuerdan

con los obtenidos por Geüe y Löschner (2002), donde la prevalencia de Salmonella sp.

fue calculada como 63,3% (12 de 19 muestras) en lagartos juveniles y 63,6% (14 de 22

muestras) en lagartos adultos aunque los resultados que obtuvieron en lagartos

neonatos difieren los obtenidos en este estudio ya que en este grupo encontraron el

menor porcentaje de prevalencia de Salmonella sp. (17,4%) a diferencia del 50%de

presentación de la bacteria en este experimento.

Figura Nº 20.

75

El hecho de que en caimanes neonatos se halla encontrado el mayor porcentaje de

aislamiento permite el planteamiento de varias hipótesis teniendo conocimiento de la

posible transmisión vertical del microorganismo que ha sido evaluada en varios estudios

reportados previamente. En esta instancia es posible citar a Kourany y Telford (1982),

quienes evaluaron la presencia de Salmonella sp. en oviducto y huevos a partir de

lagartos hembras, encontrando Salmonella rubislaw y S. sandiego en todas las muestras

a pesar de que los animales procedían de diferentes sitios; ellos plantearon que en

animales saludables la enterobacteria permanece en el tracto gastrointestinal pero bajo

condiciones adversas como estrés y/o escases de alimento atraviesa la barrera linfoide y

coloniza el contenido interno de los huevos y el oviducto. Por el hecho de haber aislado

los mismos serotipos en muestras de diferente orígen, sugirieron que la bacteria estaba

presente en oviducto y que los huevos son infectados en estadíos tempranos de

formación en el mismo. Por otra parte, también existen reportes en que los caimanes

neonatos pueden adquirir Salmonella sp. cuando se encuentran en estadío de huevo y

este se encuentra enterrado en arena o suelo húmedo contaminado con la bacteria o

también puede contaminarse con el microorganismo durante el pasaje a través de la

cloaca. Se ha reportado que Salmonella sp. está en capacidad de contaminar el

contenido interno de los huevos dentro de una hora post exposición (Austin y Wilkins, 1998).

Como medida de prevención, Mitchell and Shane (2001) plantean que el uso de

oxitetraciclina y cloranfenicol puede eliminar la Salmonella en huevos eclosionados antes

de 24 horas por metodología de inmersión; en huevos con 48 horas después de la

oviposición ya no surge ningún efecto el empleo de los antibióticos (Siebeling et al, 1975) .

6.6. Serotipificación

De los 31 aislamientos identificados mediante método de CrystalBD® como Salmonella sp.

29 se lograron clasificar con los antisueros comerciales DIFCO® empleados,

identificando 6 serogrupos prevalentes en la Estación. En la figura Nº 21 se observa que

el 40% de las cepas de Salmonella sp. halladas en la Estación pertenecen al serogrupo

C2; mientras que la prevalencia de bacterias clasificadas como pertenecientes al Grupo

B y Grupo C1 fue la misma, obteniendose un porcentaje de 20% para cada caso. En esta

instancia, se debe mencionar que hubo correlación entre las cepas de Salmonella

cholerae suis identificadas por el sistema BBL crystal y la serotipificación ya que las

cepas “sospechosas” son pertenecientes al serogrupo C1 donde se encuentra incluida S.

cholerae suis según el esquema de Kauffmann White (Anexo Nº 4).

El 20% restante de las cepas pertenecen a serotipos incluidos en los Grupos que abarca

el antisuero polivalente B (14%), Grupo D1 y serogrupos pertenecientes al Polivalente C.

76

Figura Nº 21.

Los serogrupos de Salmonella sp. que se han identificado en la E.B.T.R.F. mediante

antígeno somático han sido frecuentemente reportados en reptiles; teniendo en cuenta

que el grupo C2 fue el de mayor ocurrencia, según Grimont y Weill (2007) y Popoff y Le

Minor (1992); en este se encuentran incluidas serovariedades como S. newport y S.

muenchen; las cuales son agente causal de salmonelosis en humanos, reptiles y

caprinos entre otras especies (Passman, et al 2002; Simmons, 2002). Adicionalmente, los antisueros

polivalentes B y C, incluyen serovariedades de Salmonella sp. que han sido aisladas

constantemente a partir de muestras de reptiles; entre estas se encuentran S.

oranienburg, S. berta, S. panama, S. rubislaw entre otras, muchas de las cuales se han

reportado como agentes causales de patologías gastrointestinales en los reptiles y

algunas veces asociadas a salmonelosis en humanos producida por contacto directo con

el animal asintomático (Kourany y Telford, 1982; Ebani, et al 2005; Geue y Löschner, 2002; Saelinger, et al; 2006).

S. cholerae suis nunca ha sido reportada para reptiles, por lo cual es necesario realizar

una investigación profunda en la E.B.T.R.F. que permita determinar la causa o el origen

del hallazgo de esta serovariedad “específica” de porcinos, teniendo en cuenta que este

tipo de alimento no es suministrado a los animales y que las personas que manejan los

ejemplares aseguran no estar en contacto con porcinos, es probable que los individuos

introducidos recientemente a la Estación, hayan traido consigo el microorganismo y que

éste se encuentre establecido en el hábitat.

El hecho de que en la Estación se encontraran cepas de Salmonella sp. incluidas en los

Grupos B (20%) y Grupo D1 (3 %) permite inferir en la posibilidad de encontrar

serovariedades con alto potencial de transmisión a los humanos puesto que en estos

serogrupos se encuentran incluidas cepas como Salmonella typhimurium y S. enterididis,

dos de los serovares más comunes en Estados Unidos, implicados en aproximadamente

77

el 50% de los casos de Salmonelosis en humanos (Mermin et al, 2004), lo cual permite plantear

que el personal de la Estación se encuentra en riesgo de contraer el microorganismo

debido a su comportamiento zoonótico. Cabe resaltar que sin una serotipificación

completa de todos los microorganismos recuperados en la Estación Roberto Franco, no

es pertinente asegurar que el personal que labora allí se encuentre en inminente riesgo

de contraer salmonelosis, antes se debe evaluar su estado inmunológico pues, de la

misma manera que en reptiles, si los humanos se encuentran inmunosuprimidos podrían

desarrollar un cuadro clínico severo.

Como método de prevención es necesario el seguimiento de las normas de

bioseguridad establecidas en la Estación para el manejo de las poblaciones allí

mantenidas.

6.7. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad a antibióticos a partir de los

aislamientos obtenidos en la E.B.T.R.F. se encuentran consignados en las tablas Nº 5 y

Nº 6 donde se puede analizar el comportamiento de las cepas frente a los diferentes

antibióticos a los cuales se enfrentaron los aislamientos recuperados tanto a partir de

tortugas como de Crocodylia. Existen diferencias notables para cada una de las especies

puesto que las cepas aisladas de muestras provenientes de caimán son mucho mas

sensibles a los antimicrobianos que las de tortugas, donde varios de los aislamientos

eran resistentes a los antibióticos utilizados; por ejemplo, para cloranfenicol todas las

cepas provenientes de caimán fueron sensibles mientras que en tortugas 6 generaron

resistencia al antibiótico.

Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los

antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS EN TESTUDINES

Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n)

Ampicilina 8 - 5 Cefoxitin 7 1 5 Cloranfenicol 7 - 6 Norfloxacina 13 - Sulfatrimetoprim 8 - 6 Tetraciclina 1 10 2

78

Simultáneamente se puede asegurar que el antibiótico de elección para emplear en la

estación Roberto Franco es Norfloxacina debido a que todas las cepas de Salmonella

enfrentadas a este antimicrobiano tienen un alto grado de sensibilidad, de igual manera,

se establece que Tetraciclina tiene un comportamiento de sensibilidad intermedia para

todos los aislamientos. Cloranfenicol es un antimicrobiano que tendría alto rendimiento

contra los microorganismos del género Salmonella aislados a partir de ejemplares de

caimán; sin embargo, es un antibiótico que tiene restricciones para ser suministrado por

generar alteraciones y degeneraciones a nivel de médula ósea (Ebani. et al. 2005)

Figura Nº 22.

La resistencia a antimicrobianos en aislamientos de Salmonella sp. a partir de muestras

de origen animal es un problema emergente; estas cepas pueden ser una fuente de

plásmidos de resistencia para otras bacterias y producir alteraciones en el tratamiento

antimicrobiano clave para combatir enfermedades en medicina humana y veterinaria (Ebani

et al 2001).

Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibióticos

utilizados mediante el método de Kirby – Bauer.

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS EN CROCODYLIA

Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n)

Ampicilina 10 1 1 Cefoxitin 11 1 1 Cloranfenicol 13 - - Norfloxacina 13 - - Sulfatrimetoprim 11 2 Tetraciclina - 9 4

79

El porcentaje de sensibilidad, resistencia y sensibilidad moderada para todas las cepas

aisladas en las muestras de la E.B.T.R.F se observa en la figura Nº 22. Como ya se

habia mencionado, el 100% de las cepas fueron sensibles a la Norfloxacina; resultado

que se puede extrapolar para ser soportado por Mitchell et al (1999) quienes obtuvieron

100% (N = 20) de sensibilidad frente a cepas de Salmonella sp. aisladas a partir de

muestras de hisopados cloacales en tortugas a las cuales se les administró durante un

periodo de 14 días Enrofloxacina [10 mg/Kg] lapso en el cual se realizó un nuevo

aislamiento del microorganismo, obteniendo una totalidad de negativos a la bacteria.

Norfloxacina y Enrofloxacina son antibióticos pertenecientes a la familia de

Fluoroquinolonas que tienen actividad bactericida, propiedad que es indispensable en un

antibiótico ideal (Gentilini, 2007)

De igual forma, en la figura Nº 22 es posible observar que en general todos los

antibióticos empleados en los antibiogramas tienen un buen porcentaje de efectividad a

excepción de tetraciclina, antibiótico que para la mayoría de aislamientos producen

grados de sensibilidad intermedia a diferencia de varios reportes donde las cepas

exhiben un alto porcentaje de resistencia a este antimicrobiano (Corrente, et al, 2004; Mitchell y

Shane, 2001; CDC,1999); adicionalmente se debe aclarar que la elección de los antibióticos a

utilizar en este ensayo se basó en los resultados obtenidos en antibiogramas realizados

a distintos ejemplares de reptiles con patologías asociadas a algunas bacterias

diferentes a Salmonella sp.; casos que eran remitidos al laboratorio de Microbiología de

la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Nacional de Colombia,

los datos se colectaron mediante un estudio retrospectivo realizado a los archivos de

resultados obtenidos durante el año 2003 a 2007.

Es necesario tener presente que cuando el tratamiento antibiótico es incapaz de eliminar

las bacterias del intestino de los reptiles y en cambio promueve la persistencia de cepas

resistentes a antibióticos, el tratamiento de los portadores del Salmonella sp. debe

evitarse y se recomendarían las buenas prácticas de higiene a los propietarios del reptil

o al personal que labora en el centro de recuperación para minimizar el riesgo de

infección (Bradley et al 1998). Adicionalmente no se puede olvidar que el uso de antibióticos de

amplio espectro como las quinolonas (Norfloxacina) que mostraron un 100% de

efectividad para combatir las cepas aisladas en la estación (Figura 22), son ampliamente

utilizados en medicina herpetológica y pueden ser causa de alteración momentánea

grave de la flora tan rica de Gram Negativos y Gram Positivos que se encuentra en el

tracto gastrointestinal de estas especies. Existen datos bibliográficos que demuestran

80

una cierta tendencia a la anorexia o a alteraciones digestivas en reptiles herbívoros tras

terapias prolongadas de antibióticos (Jacobson, 1980;1999; Kaufman, 1998)

6.8. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en los estanques de la Estación

Aunque la identificación de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. no era un

objetivo propuesto para el trabajo, el medio de cultivo utilizado CHROMagar

OrientaciónBD®, permitió la identificación de los otros microorganismos presentes en cada

una de las muestras trabajadas de acuerdo a las reacciones de cada bacteria con los

sustratos cromógenos presentes en el medio (Anexo Nº 2).

Figura Nº 23.

De acuerdo con la Figura Nº 23, se puede establecer que en este estudio hay un

predominio de flora Gram negativa, lo que concuerda con lo reportado por Sunderland y

Veal (2001), sin embargo, Enterococcus sp. microorganismo Gram Positivo, fue el que

estuvo en un mayor porcentaje (33%) en todas las muestras trabajadas sin importar el

origen de las mismas.

Por su parte; en las figura Nº 24 y 25 es posible observar el porcentaje de presentación

de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. en las muestras de agua y

sedimento y arena junto con materia fecal respectivamente en los estanques de

Testudines muestreados y se puede notar que en los dos tipos de muestra evaluados

hubo una mayor prevalencia de microorganismos del género Enterococcus sp;

Eschericha coli y Klebsiella sp. Sin embargo se observa que en las muestras de agua y

sedimento se recuperaron más microorganismos que en las de arena y materia fecal

81

aunque los porcentajes de presentación no variaron significativamente entre las

muestras.

Figura Nº 24.

Figura 25.

Adicionalmente, se tuvieron en cuenta los microorganismos encontrados a partir de

muestras de hisopados cloacales de animales de Orden Testudinata, datos que se

pueden observar en la figura Nº 26; donde a su vez puede establecerse que la

recuperación de microorganismos fue menor para este tipo de muestra.

82

Figura 26.

Para los ejemplares de Crocodylus intermedius la prevalencia de los microorganismos

diferentes a Salmonella sp. fue muy similar a los aislamientos obtenidos en tortugas; sin

embargo, tal como se puede observar en la figura Nº 27 existe una marcada variación en

los porcentajes de microorganismos aislados a partir de agua y sedimento con respecto

al comportamiento presentado en las muestras de tortugas evaluadas previamente y los

resultados obtenidos en arena y materia fecal (Figura Nº 28) e hisopado cloacal (Figura

Nº 29) en ejemplares de caimán. Es así como en las muestras de agua y sedimento

obtenidas a partir de estanques de caimán, hubo una mayor prevalencia de

microorganismos del género Klebsiella sp. (31%) y contrario a lo encontrado en el resto

de las muestras se obtuvo 23% de aislamientos de Enterococcus sp.

Figura Nº 27.

Proc. Alligator Production Conference, La composición y diversidad de especies de

enterococos en las heces de animales silvestres parece depender sobre todo de la

83

alimentación y condiciones del ambiente en el que se desarrolla el ciclo vital del

hospedador. Así, los animales en cautiverio o de hábitats periurbanos o que tienen una

dieta oportunista son los que presentan una mayor diversidad de enterococcos, lo cual

explica los hallazgos del presente experimento. Por el contrario, cuando existe una

especialización en un alimento y/o habitan en ambientes con menor influencia de la

actividad humana se encuentra una menor diversidad del microorganismo (Ballesteros, 2003).

Figura Nº 28.

Figura 29.

De igual forma, en un estudio realizado por Mundt (1963), se obtuvo un 85,7% de

recuperación de Enterococcus sp. a partir de muestras fecales de reptiles, el alto

porcentaje de recuperación de estos microorganismos es interesante debido a la

marcada diferencia en temperatura corporal entre reptiles y mamíferos, y en

consecuencia se puede decir que las bacterias aisladas a pesar de ser mesófilas;

84

pueden tener una adaptación a la temperatura llegando a desarrollarse a temperaturas

inferiores de lo esperado (Boyer, 1992) Se han aislado también, Citrobacter, Klebsiella, y

Proteus, las cuales aunque son flora normal, bajo ciertas condiciones pueden llegar a

producir septicemias, enterocolitis y diarreas; Escherichia coli puede producir dolor

abdominal, diarrea, vómito y fiebre; Klebsiella produce enfermedades respiratorias y

Citrobacter alteraciones a nivel del colon (Martínez, et al, 2003).

Es necesario conocer la particular población saprofita en los reptiles debido a que

cualquier causa que altere este equilibrio puede desencadenar diarrea u otras patologías

digestivas (Martínez, et al, 2003). Adicionalmente, hasta el momento se han realizado análisis

como este en otras especies de reptiles, como serpientes y tortugas; sin embargo, la

información que se ofrece en este trabajo es la primera descripción microbiológica

realizada hasta la fecha en las especies de Crocodylus intermedius manejadas en

Colombia.

La población bacteriana estudiada refleja, por tanto, la normalidad de la flora digestiva en

este grupo de reptiles y no pueden establecerse conclusiones evolutivas o adaptativas

sin la realización de estudios adicionales. Por lo tanto, el conocimiento de la

microbiología cloacal de estas especies es fundamental para diagnosticar desordenes de

la flora digestiva así como prevenir procesos secundarios a estrés e inmunosupresión,

todo ello dirigido a optimizar programas de conservación como los implementados a

diario en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco.

85

7. CONCLUSIONES

§ Se logró aislar e identificar mediante análisis microbiológicos la presencia de

enterobacterias del género Salmonella en ejemplares de tortugas y Crocodylus

intermedius mantenidos en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto

en la Ciudad de Villavicencio; estableciendo su ocurrencia en el 52% de los

estanques

§ Se comprueba que ninguna metodología para el aislamiento de Salmonella es

por sí sola suficientemente efectiva para la recuperación del microorganismo; se

debe emplear más de un tipo de muestra para obtener mayor porcentaje de

resultados positivos.

§ Los ejemplares de la E.B.T.R.F son portadores asintomáticos de Salmonella sp.

, sin embargo, se deben implementar medidas de prevención que minimicen su

potencial como patógeno oportunista, desencadenando cuadros clínicos de

salmonelosis.

§ La Norfloxacina es el antibiótico ideal para tratar los ejemplares de la Estación

Roberto Franco que puedan presentar sintomatología asociada a salmonelosis,

aunque su administración debe ser cuidadosa con el fin de evitar alteraciones en

la flora digestiva natural de los reptiles.

§ Las muestras obtenidas a partir del hábitat (agua, lodos y sedimento)

proporcionan mayor sensibilidad en la búsqueda de Salmonella sp que el

hisopado cloacal.

§ La mayor presencia de Salmonella sp. se obtuvo a partir de la población neonatal

de caimán, aspecto que puede deberse a una transmisión vertical.

§ Teniendo en cuenta la presencia de aislamientos de Salmonella sp.

pertenecientes a los serogrupos B, C1, C2, D1 y otros atípicos, se hace

necesario implementar medidas de bioseguridad que disminuyan su riesgo

zoonótico.

§ Este documento es el primer reporte sobre microbiología entérica en ejemplares

de Crocodylus intermedius en Colombia, siendo un aporte básico para los

programas de conservación, reproducción y repoblamiento de la especie.

86

8. RECOMENDACIONES

§ Realizar muchas más investigaciones acerca de la microbiología cloacal de

animales de la Clase Reptilia puesto que muchos se encuentran en peligro de

extinción y estos microorganismos bajo ciertas condiciones pueden llegar a

causar serios cuadros patológicos e incluso la muerte de los ejemplares

§ Se recomienda realizar los aislamientos de Salmonella en reptiles a partir de

muestras de origen ambiental puesto que se obtiene mayor porcentaje de

aislamientos en relación a hisopado cloacal y no se genera estrés en los

animales

§ Se plantea el uso de quinolonas como terapia antimicrobiana al encontrarse

100% de senbilidad a norfloxacina

§ Los medios de cultivo CHROMagar Orientación BD® y CHROMagar

SalmonellaBD® son altamente selectivos y diferenciales para el aislamiento e

identificación de los microorganismos.

§ Se recomienda la implementación de medidas de bioseguridad en la estación

que disminuyan los factores de riesgo zoonótico; incluso recoger periódicamente

el excremento de los animales y realizar prácticas de arado en los encierros

puede reducir la concentración del microorganismo.

87

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Salmonellae and Arizonas in reptiles. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr

Hygiene. 213: 201-212.

106

10. ANEXOS

ANEXO Nº 1: Plano de la E.B.T.R.F

107

ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientación

MICROORGANISMO APARIENCIA DE LAS

COLONIAS

PRUEBAS

CONFIRMATORIAS

E. coli Colonias rosadas –

transparentes de tamaño medio

con o sin halos alrededor

Grupo KES Colonias de tamaño medio y

pigmento azul oscuro

BBL Crystal E/NF ,

Indol

Grupo PMP Colonias Beige o crema

redondeadas por halos marrón

BBL Crystal E/NF ,

Indol

Enterococcus sp. Colonias verde azul de tamaño

pequeño

S. agalactiae Colonias pequeñas , con

pigmento vede azul claro,

S. saprophyticus Colonias pequeñas color

purpura opacas con o sin halos

Disco de 5 µg

novobiocina

Otros (Incluyendo

Salmonella sp.)

Colonias sin pigmento, color

crema

Identificación

bioquímica y

serologíca.

108

ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/NoFermentadores.

Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por sistema BBL

Crystal.

A. Sacar las tapas de la bolsa

B. Tomar un tubo de inoculo y etiquetarlo con el número de muestra. Asépticamente

con un asa estéril tomar una colonia grande bien aislada o 4 – 5 colonias

pequeñas a partir de una placa de agar Tripticasa soya con 5% de sangre de

cordero. Suspender las colonias en un tubo de fluido de inoculo BBL Crystal,

taparlo y agitarlo en un vortex durante 10 – 15 segundos. Posteriormente, marcar

la base con el número de muestra y verter todo el contenido del tubo fluido en el

área objetivo de la base

C. Sostener la base con las dos manos y mover el inoculo de un lado a otro a lo

largo de las pistas hasta que se hallan llenado todos los pocillos. Descartar el

sobrenadante.

D. Alinear la tapa de forma que el extremo marcado de la tapa esté en la parte

superior del objetivo de la base.

E. Apretar hasta percibir una ligera resistencia. Colocar el pulgar en el borde de la

tapa hacia la parte media del panel y hacer presión simultáneamente hasta que

la tapa encaje.

F. Colocar los paneles en las bandejas y llevar a incubación por 18 – 20 horas.

109

Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para Lectura de Resultados.

Anexo 3.3. Calculo del Número de Perfil

110

ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann - White

Simplificación del Esquema de Kauffmann – White para identificación de antígenos

somáticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp.

ORGANISMO GRUPO ANTÍGENO SOMÁTICO

ANTIGENO FLAGELAR FASE 1 FASE 2

S. enteritidis bioser Paratyphi A ser Paratyphi B variante Odense bioser Java ser Stanley ser Schwarzengrund ser Saintpaul ser Reading ser Chester ser Sandiego *

ser Derby ser California ser Typhimurium variante Copenhagen ser Bredaney ser Heilderberg S. choleraesuis bioser Kunzendorf S. enteritidis ser Braenderup ser Montevideo ser Oranienburg ser Thompson ser Infantis ser Othmarseenn *

ser Tennessee ser Muenchen ser Manhattan ser Newport *

ser Blockley ser Litchfield ser Tallahassee ser Kentucky bioser Miami S. typhi

A B B B B B B B B B B B B B B B C1

C1

C1

C1

C1

C1

C1

C1

C1

C2

C2

C2

C2

C2

C2

C3

D1

D1

1,2,12 1,3,5,12 1,4,12 1,4,5,12 4,5,12 1,4,12,27 1,4, [5],12 4,5,12 4,5,12 4,5,12 1,4,5,12 4,5,12 1,4,5,12 1,4,12 1,4,12,27 [1],4,[5],12 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 [14] 6,7 [14] 6,7 [14] 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 (8), 20 1,9,12 9,12, Vi

a b b b d d e, h e, h e, h e, h f, g m, t i i i,v r c [c] e, h g, m, s m, t k r y z29

d d e, h k l, v z4, z32

i a d

- 1,2 1,2 [1,2] 1,2 1,7 1,2 1,5 e, n, x e, n, z [1,2] - 1,2 1,2 1,7 1,2 1,5 1,5 e, n, z15

-

-

1,5 1,5 1,5 - 1,2 1,5 1,2 1,5 1,2 - Z6

1,5

111

Cont. Simplificación del Esquema de Kauffmann – White para identificación de antígenos

somáticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp

ORGANISMO GRUPO ANTÍGENO SOMÁTICO

ANTÍGENO FLAGELAR FASE 1 FASE 2

S. enteritidis ser Berta ser Enteritidis *

ser Dublin ser Panama ser Javiana bioser Pullorum ser Anatum ser Meleagridis ser Give ser Newington ser Illinois ser Senftenberg ser Simsbury ser Rubislaw ser Poona ser Worthington ser Cubana ser Florida ser Madelia ser Nottingham *

ser Cerro ser Siegburg ser Minnesota ser Urbana

D1

D1

D1

D1

D1

D1

E1

E1

E1

E2

E3

E4

E4

F G1 G2

G2

H H I K K L N

9,12 1,9,12 1,9,12 1,9,12 1,9,12 9,12 3,10 3,10 3,10 3,15 (3), (15), 34 1,3,19 1,3,19 11 [1], 13,22, [36] 1,13,23 1,13,23 1,6,14,25 1,6,14,25 16 18 6,14,18 21 30

f, g, t g, m g, p l,v l, z28

- e, h e, h l,v e, h z10

g, s, t z27

[d], r z z z29

d y d z4, z23

z4, z23

b b

- - - 1,5 1,5 - 1,6 l, w 1,7 1,6 1,5 - - [d], e, n, x 1,6 l, w - 1,7 1,7 e ,n, z15 [z45] [1,5] e, n, x e, n, x

Nota: La primera columna indica el nombre de la serovariedad, en la segunda columna indica el serogrupo del Ag O, en la tercera, están consignados los Ags somáticos (O). Los números indican el o los factores del Ag O y se escriben separados por una coma. En las últimas columnas, se observan los Ags flagelares (H), estableciendo los factores pertenecientes a la fase 1 (motil) denominados con letras minúsculas y en la fase 2 (no motil) se usan números. El signo (-) indica que la fase está ausente. Los factores entre paréntesis aglutinan débilmente. Los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados y los que están entre corchetes pueden estar presentes o ausentes. * Serovariedades encontradas en reptiles Fuente: Laboratorios DIFCO®

112

ANEXO Nº 5: Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Metodo de Difusión en Agar (Normas CLSI – NCCLS Año 2005)

AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE

(mm)

INTERMEDIO

(mm)

SENSIBLE

(mm)

AMICACINA 30µg 14 15 - 16 17

AMOXICILINA/CLAVULANICO

Estafilococos – Haemofilus

Enterobacterias

20/10 µg

20/10 µg

19

13

-

14-17

20

18

AMPICILINA

Entericos Gram Negativos

Estafilococos

Enterococos

Haemofilus sp.

10 µg

10 µg

10 µg

10 µg

13

28

16

18

14 -16

19-21

17

29

17

22

AMPICILINA/SULBACTAM

Entericos Gram Negativos y

Estafilococos

Haemofilus sp.

10 µg

10 µg

11

19

12-14

15

20

CARBENICILINA

P. aeruginosa

Enterobacterias y Acinetobacter

100µg

100µg

13

19

14-16

20-22

17

23

CEFACLOR

Haemofilus

30µg

14

16

15-17

17-19

18

20

CEFALOTINA 30µg 14 15-17 18

CEFAMANDOLE 30µg 14 15-17 18

CEFAZOLINA 30µg 14 15-17 18

CEFEPIME

N. gonorrea

Grupo Viridans

30µg

30µg

30µg

14

21

15-17

22-23

18

31

24

CEFETAMET

N. gonorrea

10µg

10µg

14

15-17

18

29

CEFIXIMA

N. gonorrea

5µg

5µg

15

16-18

19

31

CEFMETAZOLE

N. gonorrea

30µg

30µg

12

27

13-15

28-32

16

33

CEFONICID 30µg 14 15-17 18

CEFOPERAZONA 75 µg 15 16-20 21

CEFOTAXIMA

N. gonorrea

Estreptococos Beta Hemoliticos

Grupo Viridans

30µg

30µg

30µg

30µg

14

25

15-22

26-27

23

31

24

28

113

TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Metodo de Difusión en Agar (Normas CLSI – NCCLS Año 2005)

AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE

(mm)

INTERMEDIO

(mm)

SENSIBLE

(mm)

CEFOXITINA

N. gonorrea

E. aureus y lugdunensis

E. coagulasa negativo excepto

lugdunensis

30µg

30µg

30µg

30µg

14

23

19

24

15 – 17

24-27

18

28

20

25

CIPROFLOXACINA

N. gonorrea

Haemofilus

5µg

5µg

5 µg

15

27

16-20

28-40

21

41

21

CLORAMFENICOL

E.pneumoniae

Haemofilus

30µg

30µg

30µg

12

20

25

13-17

26-28

18

21

29

DOXICICLINA 30µg 12 13-15 16

ENROFLOXACINA 5µg 15 16-20 21

ERITROMICINA

E.pneumoniae

15µg

15µg

13

15

14-22

16-20

23

21

ESTREPTOMICINA

Enterococos (alta resistencia)

Otros microorganismos

300µg

10µg

6

11

7-9

12-14

10

15

FLORFENICOL 30µg 16 17-20 21

GENTAMICINA

Enterococos (alta resistencia)

Otros microorganismos

120µg

10µg

6

12

7-9

13-14

10

15

KANAMICINA 30µg 14 14-17 18

NALIDIXICO ACIDO 30µg 13 14-18 19

NITROFURANTOINA 10µg 14 15-16 17

NORFLOXACINA 10µg 12 13-16 17

PENICILINA G

Estafilococos

Enterococos

Estreptococos (- E. pneumoniae)

N. gonorrea

10U

10U

10U

28

26

14

27-46

29

15

24

47

RIFAMPICINA

Estafilococos – Enterococos y

Haemofilus

E . pneumoniae

5µg

5µg

16

16

17-19

17-18

20

19

TETRACICLINA

Estafilococos

Estreptococos

30µg

30µg

14

18

15-18

19-22

19

23

SULFATRIMETOPRIM

1,25/23,75

µg

10 11-15 16

VANCOMICINA 30µg 14 15-16 17

114

ANEXO Nº 6. Muestras positivas para Salmonella sp. en cada estanque según cada

muestreo.

· Muestreo Nº 1 (N = 129)

MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE

TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 76 )

Nº ESTANQUE ORIGEN DE LA MUESTRA

AGUA / SEDIMENTO

MATERIA FECAL / ARENA

HISOPADO CLOACAL

2 X 5 X 6 X X 7 X 14 x 21 X 22 X 25 X

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 9 (12,3 %)

MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 53)

Nº ESTANQUE

ORIGEN DE LA MUESTRA AGUA /

SEDIMENTO MATERIA FECAL /

ARENA HISOPADO CLOACAL

30 X 31 X 34 X 38 X 43 X 45 X 46 X 47 X 48 X 51 X

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 10 (18,8%) Caiman Adulto: 2 / Caiman Neonato: 6 / Caiman Juvenil: 2


MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 60)

Nº ESTANQUE




11 X X 12 X

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (5%)

115

MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE

Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 34)

Nº ESTANQUE ORIGEN DE LA MUESTRA

AGUA / SEDIMENTO

MATERIA FECAL / ARENA

HISOPADO CLOACAL

42 X 44 X 49 X

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (8,8 %) Caiman Juvenil: 1 Caiman Neonato: 2


MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N =48)

Nº ESTANQUE


SEDIMENTO MATERIA FECAL/


8 X 24 X

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (4,2%)

MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N= 28)

Nº ESTANQUE




33 X 36 X

TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (7.14 %) Caiman Adulto: 2

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