Manual de Procedimientos -...
83
spp spp . . SERVICIO ENTEROBACTERIAS DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA Buenos Aires – Argentina 2005 Ministerio de Salud y Ambiente Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Secretaría de Políticas, Regulación y Relaciones Sanitarias “Dr. Carlos G. Malbran” Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Secretaría de Políticas, Regulación y Relaciones Sanitarias “Dr. Carlos G. Malbran” Manual de Procedimientos Manual de Procedimientos Salmonella D D i i a a g g n n ó ó s s t t i i c c o o y y c c a a r r a a c c t t e e r r i i z z a a c c i i ó ó n n d d e e
Transcript of Manual de Procedimientos -...
spp spp . .
SERVICIO ENTEROBACTERIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
Buenos Aires – Argentina
2005
Ministerio de Salud y Ambiente
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Secretaría de Políticas, Regulación y Relaciones Sanitarias
“ Dr. Carlos G. Malbran”
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud Secretaría de Políticas, Regulación y Relaciones Sanitarias
“ Dr. Carlos G. Malbran”
Manual de Procedimientos Manual de Procedimientos
SSaallmmoonneellllaa
DDiiaaggnnóóssttiiccoo yy ccaarraacctteerriizzaacciióónn ddee
2
INDICE
CAPÍTULO I- INTRODUCCIÓN 4
CAPÍTULO II- AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SAMONELLA spp. 8
1.-EPECÍMENES 8
2.-PROCESAMIENTO 9
2.1.-AISLAMIENTO 9
2.2.-IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SALMONELLA spp. 14
Pruebas Bioquímicas 21
Agar Hierro Tres Azúcares y Agar Kligler 21
Prueba de la β-Galactosidasa 22
Agar Lisina Hierro 24
Agar SIM 25
Test de Utilización de Azúcares 26
Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa 28
Prueba del Malonato 31
Ensayo del Rojo de Metilo 32
Ensayo de Voges-Proskauer 34
Prueba de la Urea 35
Prueba del Indol 37
Problemas de Diagnóstico Diferencial 39
2.3.-SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp. 41
Antígenos Somáticos 42
Antígenos Flagelares 43
Antígeno Capsular 44
Descripción del Esquema de Kauffmann-White 44
2.3.1. SEROTIPIFICACION SOMÁTICA O 48
2.3.2. SEROTIPIFICACION FLAGELAR H 50
CAPÍTULO III- IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA spp. Y DETECCIÓN DE
FACTORES DE VIRULENCIA POR REACCIÓN DE LA POLIMERASA EN CADENA
(PCR) 57
1.- INTRODUCCIÓN 57
2.- PROCEDIMIENTO GENERAL 61
3
3.- PROTOCOLOS ESPECÍFICOS PARA SALOMONELLA spp. 64
3.1. PCR para Identificación de Salmonella spp. 64
3.2. PCR para Detección de Factores de Virulencia de Salmonella spp. 65
CAPÍTULO IV-MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES 70
Caldo Selenito 70
Caldo Tetrationato 70
Caldo Flagelar 71
Solución Salina 71
Agar Movilidad (Swarm Agar) 71
Agar Nutritivo 71
Agar Mueller-Hinton 72
Agar EMB 72
Agar McConkey 72
Agar SS 73
Agar Hektoen 74
Agar Verde Brillante 75
Agar XLD 75
PLANILLAS DE RESULTADOS 77
4
CAPÍTULO I -- INTRODUCCIÓN
El género Salmonella pertenece a la tribu Salmonelleae, de la familia Enterobacteriaceae.
Los miembros del género Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm,
generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos,
no esporulados.
El género Salmonella fue objeto de sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que
respecta a su nomenclatura y taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas
desarrolladas por P.R. Edwards y H.W. Ewing, en la década del 40, cuando definieron e
identificaron las primeras cepas del género Salmonella y de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Estudios del DNA mediante técnicas de hibridación mostraron que el género Salmonella está
constituído por 2 especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori. Salmonella enterica
está compuesta por 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica, Salmonella
enterica subespecie salamae, Salmonella enterica subespecie arizonae, Salmonella enterica
subespcie diarizonae, Salmonella enterica subespespecie houtenae y Salmonella enterica
subespecie indica.
A su vez las subespecies de Salmonella enterica y la especie Salmonella bongori se dividen
en más de 2400 serovariedades, que están definidas en función de diferentes asociaciones de
factores antigénicos somáticos O y flagelares H.
La mayoría de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre caliente
pertenecen a la subespecie enterica (subespecie I) y llevan un nombre por lo general
relacionado con el lugar geográfico donde se la aisló por primera vez.
Como las serovariedades no tienen nivel taxonómico de especie, sus nombres no siguen las
reglas del “International Code of Nomenclature of Bacteria”, de manera que sus nombres se
deben escribir en letras romanas (no itálicas) y con mayúscula; por ejemplo el nombre
completo de Salmonella Typhimurium es Salmonella enterica subesp. enterica serovariedad
Typhimurium. Como este nombre es muy largo, a los fines prácticos se usa directamente
Salmonella Typhimurium
5
Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes y a Salmonella bongori, de baja
incidencia en patología humana o animal, se designan con el nombre de la subespecie, seguido
de la fórmula antigénica, por ej: Salmonella subesp. IV 50: b : - (Salmonella enterica subesp.
houtenae 50:b : -)
Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de Kauffmann-
White, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de
Salmonella”, del Instituto Pasteur de París (1).
Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se los
encuentra como comensales y como patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos
domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades
en el hombre y los animales.
Los miembros del género se pueden clasificar en tres grupos:
a) Los que no tienen preferencia por algún huésped en especial, por lo que infectan tanto
al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayoría de las
serovariedades responsables de las salmonelosis.
b) Los que infectan sólo al hombre: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella Paratyphi C
c) Los que están adaptados a un huésped animal: S. Abortusovis, a los ovinos; S.
Abortusequi, a los equinos y S. Gallinarum, a las aves
La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección
es mayor en los lactantes y en niños de corta edad. Epidemiologicamente, las infecciones por
Salmonella pueden causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60 -
80% de los casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines
maternales, geriátricos, restaurantes.
Es una enfermedad fundamentalmente de origen alimentario, la fuente más frecuente de
infección son los alimentos contaminados, incluido agua. También puede ocurrir la
transmisión de persona a persona.
A pesar de todos los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella
debidas al consumo de alimentos contaminados continúa siendo un problema serio con
millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas
6
económicas. En el 2003, se estimó que solamente en los Estados Unidos, el costo de las
salmonelosis producidas por alimentos contaminados llegaba a la cifra de 3.000.000.000
dólares.
La vigilancia de Salmonella en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los
alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la
salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias
eficientes de control de la misma.
En programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes
para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella.
Se debe destacar que hay muchos procedimientos distintos para el aislamiento de Salmonella.
El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo
simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos criterios y ninguno es óptimo
para todas las condiciones. Por lo tanto es aconsejable consultar la literatura antes de elegir un
método para un determinado propósito y es recomendable la comparación frecuente de los
métodos de cada laboratorio con los nuevos métodos que surjan.
Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella están ampliamente descritos, sin
embargo estas pruebas dependen de la expresión fenotípica de las características analizadas y
pueden verse afectadas por variaciones en los medios de cultivo y en las condiciones de
incubación. Como una alternativa se están introduciendo cada vez más los métodos
moleculares; que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de realizar,
pero tienen la desventaja que son caros.
El sistema de serotipificación de Salmonella es probablemente el mejor sistema de tipificación
fenotípica bacteriano. Tiene un alto poder discriminatorio y provee información con
significado epidemiológico, desde el punto de vista de la vigilancia basada en laboratorio. La
disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad es un problema en algunos países y
regiones. La subtipificación molecular da información adicional, de mayor discriminación sin
embargo no es un sustituto de la serotipificación.
Los microorganismos del género Salmonellae son bacilos Gram negativos (0.7 a 1.5 x 5 µm),
no fermentadores de lactosa. Son móviles por medio de flagelos peritricos, con la excepción
de Salmonella Pullorum y Salmonella Gallinarum. Fermentan glucosa con producción de
7
ácido y gas (excepto S. Typhi). También fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, D-
manosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. Son oxidasa negativo,
catalasa positivo, indol y Voges-Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons
positivo, urea negativo y producen SH2.
Los procedimientos siguientes servirán como guía para realizar los pasos necesarios para
aislar adecuadamente Salmonella de heces, efectuar la identificación bioquímica de
Salmonella y serotipificar los aislamientos utilizando antisueros somáticos y flagelares
adecuados. También se incluyen los protocolos para la identificación y detección de factores
de virulencia de Salmonella spp. por PCR
• Recolección y transporte de muestras
• Aislamiento de Salmonella spp. de heces.
• Identificación bioquímica de Salmonella spp.
• Identificación de Salmonella spp. por PCR
• Serotipificación de Salmonella.
• Detección de factores de virulencia por PCR
Bioseguridad
Los procedimientos de laboratorio se realizan de acuerdo con las recomendaciones
establecidas en “Biosefety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 4 th. CDC/NIH
8
CAPÍTULO II – AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SALMONELLA
spp.
1.-. ESPECÍMENES
Para el diagnóstico de Salmonella se pueden usar muestras de materia fecal y fluidos de
humanos (sangre, orina, bilis y pus de abscesos).
Todas las muestras deben ser transportadas de acuerdo con las recomendaciones de la
Organización Mundial de la Salud.
a) Materia fecal:
La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el
tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge una pequeña cantidad de
una evacuación espontánea reciente, seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En
caso de no poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Las muestras que no se
pueden procesar dentro de las dos horas, se deben colocar en medio de transporte. Como
medio de transporte se usa Cary – Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses
después de su preparación, cuando las condiciones de almacenamiento son correctas. En este
medio de transporte se puede conservar la muestra hasta 5 días, siempre en refrigeración.
b) Sangre:
La muestra se toma en el momento del pico de fiebre. Se siembran 10 ml de sangre en un
frasco de hemocultivo de 100 ml (relación 1:10). Se incuba a 35 - 37ºC, durante 7 días,
haciendo un control (en medio de agar sangre) a ciegas a las 8 horas de incubación y controles
periódicos de acuerdo a la turbidez observada. El hemocultivo reviste un interés especial en el
caso de fiebre tifoidea y paratifoidea; pero no es constantemente positivo. Los porcentajes de
positividad, en ausencia de tratamiento antibiótico, son: 90% durante la primera semana de
evolución, 75% en la segunda, 40% en la tercera y 10% en la cuarta.
Los hemocultivos son negativos en los sindromes de infecciones transmitidas por alimentos
por serovariedades como S. Typhimurium ó S. Enteritidis, sin embargo estas serovariedades
causan septicemia en los inmunocomprometidos.
9
c) Material de abscesos y orina:
El pus y la orina se recogen en recipientes estériles y una alícuota se siembra directamente en
los medios de cultivo.
2.- PROCESAMIENTO
2.1.- AISLAMIENTO
Materiales y equipamiento
• Ansas descartables
• Placas de Petri descartables (9 cm diámetro) estériles
• Balanza
• Estufas a 37oC
• Mechero bunsen
• Hisopos de algodón
Medios
• Caldo nutritivo
• Caldo selenito
• Agar hierro – tres azúcares (TSI)
• Agar lisina – hierro (LIA)
• Estrías de agar tripticas de soja (TSA)
• Placas de agar Salmonella Shigella (SS)
• Placas de agar MacConkey (MC)
Procedimiento Comentarios
Día 1 Cultivo primario en placas de agar
(Camino I) y enriquecimiento selectivo
(Camino II) (Figura 1)
• Resuspender el hisopo en 1 ml de
caldo nutritivo de manera de tener una
suspensión homogénea de la materia fecal.
• Sembrar con ansa una muestra de la
suspensión de materia fecal, en placas de
• Para estas muestras se recomiendan dos
caminos simultáneos:
• Cultivo directo en medios sólidos,
aislamiento e identificación de las colonias
10
agar MC y SS (o XLD) (Camino I- Cultivo
directo)
• Subcultivar el hisopo en un tubo de
caldo selenito, (Camino II - Enrequicimiento
para la detección de Salmonella spp)
• Incubar las placas del Camino I y el
tubo (con el hisopo incluido) del Camino II,
a 37ºC, 18-24 horas
• Enriquecimiento en caldo selectivo,
se usa para favorecer el aislamiento de los
microorganismos cuando se encuentran en
muy bajo número en la muestra. La elección
del método depende del número de
microorganismos presentes en la materia
fecal, que está en relación con el proceso
diarreico o el estado de portador.
• Si en el camino de aislamiento directo
(Camino I) se identifica y confirma
Salmonella spp., no es necesario continuar
la vía del enriquecimiento (Camino II)
Día 2 Subcultivo de las colonias
sospechosas de ser Salmonella
• Observar la morfología y
características fenotípicas de las colonias
aisladas en las placas de agar MC y de agar
SS.
• Anotar los resultados en la Planilla 1
Registro de Resultados: Aislamiento de
Salmonella spp. Morfología en placas de
agar selectivo
• En la placa de agar MC las colonias
típicas son lactosa negativas e incoloras, y
en las de agar SS: las colonias típicas son
incoloras, translúcidas con un centro negro
debido a la producción de SH2. (Ver Tabla
1: Características de las colonias en medios
selectivos y diferenciales )
11
• Subcultivar 2 colonias sospechosas
de ser Salmonella de las placas de agar MC
y SS en estrías de agar TSA, agar TSI y agar
LIA.
• Sembrar con ansa una muestra del caldo
selenito en placas de agar MC y SS. Incubar
todos los medios a 37ºC, 18-24 horas.
(Camino II)
• El subcultivo de colonias sospechosas
de Salmonella en estrías de agar TSA al
mismo tiempo que la inoculación en TSI y
LIA permite ganar un día en la
identificación y serotipificación
• Si se obtienen resultados por el Camino I,
no continuar adelante por el Camino II.
Día 3 Confirmación bioquímica y
serotipificación de Salmonella (Camino I) y
subcultivo de colonias sospechosas de
Salmonella provenientes del camino de
enriquecimiento (Camino II)
• Leer las reacciones bioquímicas TSI
y LIA, si son compatibles con Salmonella
spp., realizar las pruebas bioquímicas
complementarias y la serotipificación
somática (Camino I). [Ver Procedimiento
Identificación y caracterización de
Salmonella spp (2.2) y Serotipificación de
Salmonella spp. (2.3) ]
• Subcultivar 2 colonias sospechosas
de Salmonella de las placas de agar MC y
SS provenientes del enriquecimiento en
caldo selenito (Camino II), en estrías de agar
TSA, agar TSI y agar LIA.
• Si se obtienen resultados por el
Camino I, no continuar adelante por el
Camino II
12
Día 4
• Leer los resultados de las pruebas
bioquímicas complementarias y realizar la
serotipificación flagelar de Salmonella spp.
(Camino I) y/ o los resultados de la
confirmación bioquímica preliminar y
realizar la serotipificación somática de
Salmonella spp. (Camino II).
TABLA 1. Características de las colonias en medios selectivos y diferenciales
Medio de cultivo Selectividad Aspecto de las colonias
Agar MC Baja Incoloras Agar EMB Baja Incoloras
Agar SS Alta Incoloras con centro negro Agar XLD Alta Rojas con centro negro Agar HK Alta Verdes-azuladas con centro negro
Agar BGA Alta Rosadas pálidas
Ver Flujograma de aislamiento e identificación bioquímica (Figura 1)
13
FIGURA 1.- FLUJOGRAMA DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA A PARTIR HECES
Camino II Camino I
(1) Caldo selenito (2) Agar MacConkey y agar SS, o agar Hektoen, o agar xilosa lisina desoxicolato, o agar verde
brillante. (3) Se seleccionan de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioquímicas
complementarias (P.bioq.) y se realiza la serotipificación O (Serotip. O) (5) Pruebas bioquímicas complementarias: RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotip: Serotipificación. Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos
procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificación flagelar H debe hacerse en una sola de ellas.
MATERIA FECAL (HISOPO)
Suspensión en solución fisiológica
Caldo de enriquecimiento (1) Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)
18-24 hs, 37ºC
Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2)
Colonias típicas (3)
TSI LIA Estría
18-24 hs, 37ºC
Lectura (4) Colonias típicas (3)
TSI LIA Estría
P. bioq. (5)
Serotip. O (6)
Caldo Flagelar
Lectura (4)
P. bioq. (5)
Serotip. O (6)
18-24 hs, 37ºC
Lectura Serotip. H
1er. día
2do. día
3er. día
4to. día
14
2.2.- IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SALMONELLA spp.
Las probables colonias de Salmonella spp. en los medios de aislamiento utilizados se
confirman mediante pruebas bioquímicas recomendadas por Le Minor y Richard: desarrollo
en agar hierro-tres- azúcares (TSI), utilización de urea de Christensen, determinación de lisina
y ornitina decarboxilasa y de arginina dehidrolasa, prueba de la beta-galactosidasa (ONPG),
prueba del rojo de metilo, reacción de Voges-Proskauer, prueba de fermentación de la dulcita
y utilización del malonato.
La mayoría de las serovariedades (99,8%) de Salmonella aisladas del hombre y de los
animales de sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (I) y tienen
propiedades bioquímicas características (Tabla 2), siendo excepciones las serovariedades S.
Typhi y S. Paratyphi A.
TABLA 2. Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)
Pruebas bioquímicas Salmonella enterica subep. enterica (I)
Lactosa *** - ONPG - Producción de SH2 + Glucosa (fermentación) *** +/con gas Dulcita (fermentación) *** + Adonita (fermentación) *** - Lisina decarboxilasa ** + Ornitina decarboxilasa** + Arginina dihidrolasa ** + Urea (hidrólisis)** - Indol - Rojo de Metilo * + Voges Proskauer * - Citrato de Simmons ** + Malonato (utilización)* -
*Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días
15
Las características bioquímicas que permiten diferenciar las distintas subespecies dentro de la
especie S. enterica y la diferenciación con la especie S. bongori se indican en la Tabla 3.
TABLA 3. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella spp.
Pruebas bioquímicas
S. enterica subesp. Enterica
(I)
S. enterica subesp. salamae
(II)
S. enterica subesp. arizonae
(IIIa)
S. enterica subesp.
diarizonae (IIIb)
S. enterica subesp.
houtenae (IV)
S. enterica subesp. indica (VI)
S. bongori
(V)
Dulcita + + - - - d + ONPG - - + + - d + Malonato - + + + - - - Gelatina - + + + + + - Sorbita + + + + + - + KCN - - - - + - + L(+) tartrato + - - - - - - Mucato + + + - (70%) - + + Salicina - - - - + - - Lactosa - - - (75%) + (75%) - d - Habitat de las cepas
Animales de sangre caliente
Animales de sangre fría y medio ambiente
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes
reacciones
Es importante tener en cuenta la posibilidad de aislar más de una serovariedad de Salmonella
de un alimento ó de un material patológico. Si bien esto no ocurre con frecuencia, hay que
tenerlo presente cuando se trabaja con muestras de materia fecal o de ganglios mesentéricos y
sobre todo en el caso de ciertos alimentos para consumo humano o animal, como huevos a
granel, embutidos, harinas de carnes o huesos. Es por ello que se recomienda estudiar varias
colonias simultáneamente.
Materiales y equipamiento
• Ansas descartables (1 µl)
• Ansa aguja
• Mechero Bunsen
• Estufa a 37oC
16
Medios
• Medio para la prueba de urea
• Medio para la prueba de la lisina decarboxilasa (LDC)
• Medio para la prueba de la ornitina decarboxilasa (ODC)
• Medio para la prueba de la arginina dihidrolasa (ADH)
• Medio control para las pruebas con aminoácidos.
• Vaselina estéril
• Medio base para azúcares
• Solución de dulcita al 5%
• Caldo Malonato
• Discos de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) o reactivo para la prueba de la
β-galactosidasa
• Agar SIM
• Reactivo de Erlich para la prueba de indol
• Medio RM/VP para la prueba de Voges-Proskauer
• Solución de KOH 40% para la prueba de Voges-Proskauer
• Solución alcohólica de alfa-naftol para la prueba de Voges Proskauer
Cepas bacterianas
• Colonias sospechosas de Salmonella en agar no selectivo, por ej., agar TSA.
• Cepas de referencia para el control de calidad de los medios.
17
Procedimiento Comentarios
Día 3 Siembra de las pruebas bioquímicas
complementarias
• Inocular a partir de un cultivo en estrías
de agar TSA, los medios para las
siguientes pruebas:
• Medio para la prueba urea.
• Medio para la prueba de LDC, ADH y
ODC y el medio control. Cubrir con una
capa de vaselina estéril.
• Medio para ONPG.
• Medio RM/VP.
• Agar SIM.
• Dulcita
• Caldo Malonato
• Incubar todas las pruebas bioquímicas a
37ºC por 18-24 horas.
• Test de la β-galactosidasa: Resuspender
un ansa del cultivo proveniente del TSI en
un tubo que contiene 0.5 ml de medio de
ONPG e incubar a 37°C. Se debe ver una
reacción positiva dentro de los 20 minutos
pero usualmente la prueba se lee a las 3-4
horas o más. También se pueden usar discos
de ONPG siguiendo las indicaciones del
fabricante
• La β-galactosidasa es una enzima
inducible, y como la lactosa, presente en el
TSI, es uno de los inductores del operón
lactosa, la prueba se realiza a partir del
desarrollo en este medio.
18
Día 4 Lectura de las pruebas bioquímicas
complementarias
• Prueba de urea.
• Prueba de LDC, ADH y ODC.
• Prueba de ONPG.
• Prueba de RM/VP.
• Prueba de SIM.
• Fermentación de Dulcita
• Utilización de Malonato
• Agregar los reactivos correspondientes a
las siguientes pruebas:
• RM: agregar a 0,5 ml del caldo
RM/VP 1 gota de rojo de metilo
• VP: agregar a 1 ml del caldo RM/VP,
0,6 ml de la solución alcohólica de α-
naftol y 0,2 ml de la solución de KOH.
• Indol: agregar 1 ml del reactivo de
Erlich al medio SIM.
• Leer los resultados de acuerdo a las
Tablas 4, 5 y ver Pruebas Bioquímicas –
Propiedades e Interpretación de los
Resultados.
• Anotar los resultados en las planillas de
registro.
• Si se presentan resultados no
concordantes con los esperados para la
identificación bioquímica de Salmonella
spp. se deben realizar pruebas diferenciales.
Ver Problemas de Diagnóstico Diferencial,
donde se presentan pruebas bioquímicas
comparativas con otros géneros de la familia
Enterobacteriaceae
• Agitar muy bien luego de la adición de
cada reactivo
.
19
TABLA 4. Pruebas bioquímicas: interpretación de los resultados
Resultados Medio Reacciones/enzimas
Negativo Positivo TSI Producción de ácido (si el fondo es
amarillo y la estría es roja, (la producción de ácido es sólo a partir de glucosa).
Fondo rojo Fondo amarillo
TSI Producción de ácido a partir de lactosa y/o sacarosa.
Estría roja Estría amarilla
TSI Producción de gas No hay burbujas en el fondo
Burbujas de aire en el fondo
TSI Producción de H2S No hay color negro Color negro LIA La decarboxilación de la lisina
produce una reacción alcalina (color violeta) a través del medio. Los organismos que no decarboxilan la lisina producen una estría alcalina y un fondo ácido (color amarillo).
Botón
purpura/Superficie amarilla
Botón púrpura/Superficie
púrpura
LIA Producción de H2S No hay color negro Color negro Urea Ureasa Amarillo Rosa/Cereza LDC Lisina decarboxilasa Color amarillo/marrón Color púrpura y color
amarillo/marrón en el medio control.
ODC test Ornitina decarboxilasa Color amarillo/marrón Color púrpura y color amarillo/marrón en el
medio control ADH test Arginina dihidrolasa Color amarillo/marrón Color púrpura y
amarillo/marrón en el medio control
ONPG β-Galactosidasa Permanece incoloro Amarillo Voges Proskauer
Producción de acetoína Permanece incoloro Color rojo/rosado
Indol Producción de Indol anillo amarillo anillo rojo/rosado SIM agar Producción de H2S No color negro Color negro SIM agar Producción de indol Anillo amarillo anillo rojo/rosado SIM agar Movilidad Desarrollo solo a lo
largo de la línea de punción
Muestra un crecimiento difuso que se disemina a
partir del punto de inoculación
20
TABLA 5. Resultados de las pruebas bioquímicas para Salmonella spp.
Prueba1) Reacción positiva o
negativa % de aislamientos de Salmonella
que muestran la reacción2) TSI glucosa (ácido) TSI glucosa (gas) TSI lactosa TSI sacarosa TSI sulfuro de hidrógeno LIA agar SIM agar (H2S) SIM agar (indol) SIM agar (movilidad) Utilización de urea Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dihidrolasa Reacción de β-galactosidasa Reacción de Voges-Proskauer Reacción de indol Utilización del Malonato Fermentación de Dulcita
+ + - - + + + - + - + + + - - - - +
100 91.93) 99.24) 99.5 91.6 98 97
98.9 97 99
94.65)
97 70
98.44) 100 98.9 100 96
1) Ewing W. H. and Ball M. M., The biochemical reactions of members of the genus Salmonella. National Communicable Disease Center, Atlanta, Georgia, USA (1966). 2) Estos porcentajes indican solo que no todas las cepas de Salmonella muestran las reacciones marcadas + o -. 3) Salmonella Typhi es anaerogénica. 4) Salmonella (subgénero) subespecie III (Arizona) da reacciones + o – para lactosa pero es siempre β-galactosidasa positiva. Salmonella (subgénero) subespecie II da una reacción negativa para lactosa y una reacción negativa para β-galactosidasa, (Antigenic Formulas of the Salmonella serovars, 2001). Para el estudio de las cepas, puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarias. 5) S. Paratyphi A es negativa.
21
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Agar Hierro Tres Azúcares (TSI) y Agar Kligler
I. Principio
El medio fue diseñado para determinar la habilidad de las bacterias de fermentar hidratos de
carbono y producir sulfuro de hidrógeno (SH2). El medio contiene 1 parte (0.1%) de glucosa y
10 partes (1.0%) de lactosa y sacarosa. El indicador de pH es el rojo fenol y el sulfato ferroso
pone en evidencia la formación de SH2. Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la
punción como la estría aparecerán de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y/o
sacarosa, la estría permanecerá ácida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve
alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del
medio o producirán productos alcalinos y el medio TSI permanecerá rojo. La producción de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%). Este medio puede
reemplazar al TSI, la diferencia entre ambos es la ausencia de sacarosa. Los fundamentos
bioquímicos y la interpretación de los resultados son los mismos para ambos medios.
II. Materiales
El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada y dispensar volumenes
de 5.0 ml en tubos con tapa a rosca; autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar inclinado
dejando un fondo de 5 a 10 mm. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular indicando fecha
de preparación y de expiración.
Guardar en heladera; si hay cambio de color no usar.
II. Resultados
A. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o
lactosa (E. coli).
B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente
(Shigella spp.).
C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa).
D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp).
22
E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.).
III. Control de Calidad
Bacteria Punción Estria Sh2
Salmonella Typhi Ac Alc + (*)
Salmonella Paratyphi A Ac/g Alc -
Salmonella spp. Ac Alc +
Shigella spp. Ac Alc -
Enterobacter aerogenes Ac/g Ac -
Enterobacter cloacae Ac/g Ac -
Escherichia coli Ac/g Ac -
Citrobacter Ac/g Ac +
Klebsiella Ac/g Ac -
Proteus vulgaris Ac/g o Ac Ac +(sucio)
Proteus mirabilis Ac/g o Ac Alc + (sucio)
Klebsiella pneumoniae Ac/g o Ac Alc -
(*) sólo en la parte superior de la punción o formación de un anillo.
Para el control de calidad selecionar entre aquellos microorganismos disponibles.
Prueba de la β-galactosidasa
I. Principio
La fermentación de la lactosa requiere dos enzimas; mientras la permeasa facilita la
penetración de la molécula de lactosa dentro de la célula bacteriana, la β-galactosidasa
hidroliza la lactosa para formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa
carecen de ambas enzimas, sin embargo hay bacterias que tienen β-galactosidasa pero no
permeasa. El o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) es un compuesto incoloro estructuralmente
similar a la lactosa. En presencia de β-galactosidasa, ONPG se rompe en galactosa y o-
nitrofenil, un compuesto color amarillo. Como la familia Enterobacteriaceae se agrupan de
acuerdo a su habilidad de fermentar lactosa, este test es útil en la identificación de
fermentadores de lactosa.
23
II. Materiales
A. Solución de ONPG
Disolver 80.0 mg de ONPG en 15.0 ml de agua destilada a 37º C, agregar 5.0 ml del buffer
fosfato, ajustar a pH 7.0 y esterilizar por filtración. La solución es estable por 6 meses.
Guardar refrigerada
(4 a 8º C), en recipientes de color caramelo o envueltos en papel de aluminio.
Rotular la solución, indicando fecha de preparación y de expiración.
B. Buffer fosfato de sodio 1M (pH 7.0)
Disolver 6,9 gr de NaHPO4.H2O en 45.0 ml de agua destilada. Agregar 3.0 ml de una
solución de NaOH al 30% (w/v) y ajustar el pH a 7.0. Llevar el volumen a 50.0 ml con agua
destilada y guardar a 4º C.III. Procedimiento
A. A partir de un cultivo en TSI, hacer una suspensión espesa del organismo a ensayar en
0.5 ml de solución salina. El volumen no tiene mayor importancia porque es una
prueba basada en la observación de un cambio de color.
B. Agregar un disco o dos gotas de solución de ONPG.
C. Incubar la mezcla a 37ºC y examinar cambio de color hasta 24 horas.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color amarillo.
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
V. Control de calidad
Escherichia coli (+)
Salmonella (-)
VI. Consideraciones
A. Se puede partir de estrías de agar nutritivo con 1% de lactosa, cuando no se dispone de
TSI.
B. La solución de ONPG preparada debe ser incolora antes de su empleo.
24
Agar Lisina Hierro (LIA)
I. Principio
La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y un viraje
al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene lugar en medio ácido,
es necesaria la fermentación previa de la glucosa.
Los microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un
viraje al amarillo en todo el medio.
La formación de SH2 produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.
Las bacterias del grupo Proteus-Providencia, con excepción de Morganella morganii,
desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico que forma compuestos pardo-rojizos en el medio
de cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis.
II. Materiales
El medio está disponible comercialmente. Disolver el polvo en agua destilada y dispensar en
volúmenes de 3 ml en tubos con tapa a rosca. Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar de
manera de tener estría y fondo. Guardar en heladera.
II. Resultados
Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta.
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al
amarillo.
La formación de SH2 se indica por la aparición de una coloración negra.
25
III. Control de Calidad
Bacteria Punción Estria Sh2
Salmonella sp. Violeta Violeta +
Proteus mirabilis Amarilla Pardo-rojiza +
Proteus vulgaris Amarilla Pardo-rojiza +
Morganella morganii Amarilla Pardo-rojiza -
Prov. rettgeri Amarilla Pardo-rojiza -
Providencia spp. Amarilla Pardo-rojiza -
Citrobacter spp. Amarilla Violeta +
Escherichia coli Amarilla Violeta -
Shigella spp. Amarilla Violeta -
Klebsiella Violeta Violeta -
Para el control de calidad seleccionar entre aquellos microorganismos disponibles.
Agar SIM
I. Principio
Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción
de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias.
II. Materiales
El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, calentar suavemente
hasta su disolución y dispensar en volumenes de 5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar a
121ºC, 15 minutos; enfriar en posición vertical y guardar en heladera.
III. Procedimiento
A.Con un ansa tomar material de una colonia y sembrar por punción.
B.Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
IV. Resultados
A. Para la producción de SH2
Ensayo positivo: ennegrecimiento del medio.
26
Ensayo negativo: no hay ennegrecimiento.
B. Para la movilidad
Ensayo positivo: hay una turbidez difusa del medio.
Ensayo negativo: sólo hay crecimiento a lo largo de la punción.
C. Para la producción de indol
Ensayo positivo: aparición de color rojo cuando se agrega el reactivo de Erlich.
Ensayo negativo: no hay aparición de color.
V. Control de Calidad
Escherichia coli: SH2 -, indol +, movilidad +
Klebsiella pneumoniae: SH2 -, indol -, movilidad -
Proteus vulgaris: SH2 +, indol +, movilidad +
VI. Consideraciones
Un organismo que produce sulfuro de hidrógeno puede mostrar ennegrecimiento en SIM pero
no en TSI por la presencia de sacarosa en este último medio. La utilización de la sacarosa
puede suprimir los mecanismos enzimáticos responsables de la producción del sulfuro de
hidrógeno.
Test de Utilización de Azúcares
I. Principio
Es un ensayo para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de
carbono con producción de ácido o ácido y gas. El patrón de utilización de azúcares ayuda en
la diferenciación e identificación de muchas bacterias. En este ensayo, determinados azúcares
se agregan a un medio basal estéril. La producción de ácido se manifiesta por un cambio de
color del indicador. La elección del medio y del indicador depende del camino metabólico del
organismo y de la claridad visual del cambio de pH.
II. Materiales
A. Medio base
• Peptona 10.0 g
• Extracto de carne 1.0 g
27
• Cloruro de sodio 5.0 g
• Azul de bromotimol 10.0 ml
• Indicador de Andrade 5.0 ml
• Agua destilada 1000 ml
Rehidratar los ingredientes con agua destilada, calentando suavemente si es necesario; ajustar
el pH a 7.1-7.2 (7.4). Autoclavar a 121ºC por 15 minutos y enfriar en baño de agua a 50ºC.
Fraccionar el medio base en alícuotas y agregar los azúcares esterilizados por filtración en
concentraciones de: 0.5% para dulcita y salicina y 1.0% para los otros azúcares. Dispensar en
volumenes de 4-5 ml en tubos con tapa a rosca, estériles. El medio se guarda en heladera y es
estable por 3 meses.
Para la glucosa y glicerol, el medio base se dispensa en tubos con campanita de Durham antes
de autoclavar. La campanita se llenará con el medio y luego se agrega el azúcar en forma
estéril después de enfriar a 50º C.
B. Indicador de Andrade
Disolver 0.5 gr de fucsina ácida en 100 ml de agua destilada, agregar 15.0 ml de NaOH 1N
(4%); mezclar bien y dejar descansar a temperatura ambiente durante 24 horas, agitando
frecuentemente. El color rojo se debe transformar en un color castaño. Si no se produce una
decoloración suficiente agregar 1.0 ml de NaOH 1N (4%).
III. Procedimiento
1) Con un ansa estéril tomar material de un cultivo en medio sólido.
2) Sumergir el ansa en cada tubo de hidrato de carbono.
Para una batería de 8 a 10 azúcares, es suficiente un único inóculo, no hay necesidad
de flamear el ansa entre tubo y tubo. La posibilidad de transportar el hidrato de
carbono de tubo a tubo es infinitesimal y no afectará los resultados. Para una batería
grande (15 a 20) de azúcares, puede ser necesario emplear 2 a 3 inóculos, flameando el
ansa antes de tomar nueva muestra.
3) Incubar a 37º C y examinar día por día por 4 a 5 días. Para algunos microorganismos
puede ser necesario una incubación más prolongada (7 días), registrando los resultados
día por día.
4) En laboratorios de referencia las lecturas se deben prolongar hasta 30 días.
28
IV. Resultados
Ensayo positivo: viraje del indicador al rojo-rosado por acidificación del medio.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
V. Control de calidad
Con distintos microorganismos que fermenten los azúcares, como por ejemplo:
Escherichia coli: glucosa +
Klebsiella: lactosa +
Yersinia enterocolitica: sacarosa +
VI. Consideraciones
A. Inocular un medio basal sin azúcar para cada microorganismo.
B. La campanita de Durham se usa en el tubo con glucosa.
C. Como cualquier indicio de gas, aún una burbuja pequeña, es evidencia de producción
de gas, observar cuidadosamente la campanita antes de inocular.
D. La campanita de Durham se agrega únicamente al medio con glucosa porque si el
microorganismo produce gas con glucosa producirá gas con los otros azúcares. No
obstante, si se sabe que el microorganismo en estudio no fermenta glucosa, es
aconsejable agregar campanita a otros azúcares, pero hay que tener en cuenta que todas
las Enterobacterias son fermentadoras de glucosa por definición, entonces sólo se pone
campanita al medio con glucosa.
Test de Decarboxilasa-Dehidrolasa
I. Principio
La descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de
los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en
la identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina
y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina da citrulina por acción
de una dihidrolasa. El test se debe acompañar con un tubo control que contiene el medio base
sin aminoácido. Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio
con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la
glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La
29
acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la
formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color
violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de
Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter
agglomerans (-)
La prueba de ornitina ayuda a diferenciar Klebsiella (-), Proteus mirabilis (+) de Proteus
vulgaris (-); Morganella morganii (+) de Providencia rettgeri (-); Yersinia enterocolitica (+)
de Yersinia pestis y Yersinia pseutuberculosis (-).
II. Materiales
El medio basal más utilizado es el medio de decarboxilasa de Moeller. El medio contiene
peptona 5.0 g, extracto de carne 5.0 g, glucosa 0.5 g, bromocresol púrpura 0.01 g, rojo cresol
0.005 g piridoxal 0.005 g pero está disponible comercialmente. Las concentraciones de
aminoácidos a usar son: 1% para la forma L y 2% para la forma DL. Fraccionar el medio base
en 4 porciones de 250 ml cada una. Agregar los aminoácidos a 3 porciones del medio. El pH
de la fracción que lleva ornitina se debe reajustar después de agregar el aminoácido y antes de
esterilizar. Fraccionar en volumenes de 3 a 4 ml en tubos con tapa a rosca y autoclavar a
121ºC por 10 minutos. El sustrato es estable por 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha
de preparación y de expiración y guardar en heladera.
Al aceite mineral se le agrega 1 ml de agua por cada 100 ml de vaselina, y se autoclava a
121ºC por 45 minutos.
III. Procedimiento
A. Tomar material con un ansa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidos.
B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.
C. Incubar a 37ºC
D. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día.
IV. Resultados
Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento.
30
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un
fermentador de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo).
V. Control de calidad
Bacteria Arginina Lisina Ornitina
Proteus vulgaris - - -
Morganella morganii - - +
Enterobacter cloacae + - +
Enterobacter
aerogenes
- + +
S. Typhimurium + + +
Klebsiella - + -
VI. Consideraciones
A. Inocular siempre un tubo control.
B. Debe haber desarrollo para que el resultado sea válido.
C. Si se observan capas de color amarillo y violeta, agitar suavemente el tubo antes de
interpretar la reacción.
D. Comparar todos los tubos positivos con el tubo control. Un color grisáceo puede
indicar reducción del indicador más que formación de productos alcalinos. Se debe
agregar más indicador antes de interpretar el resultado.
E. Si la reacción es difícil de interpretar, comparar el tubo con un tubo sin inocular.
Luego de 24 horas cualquier traza de color púrpura indica un resultado postivo.
F. Si se usa el medio de Moeller, se debe incubar por lo menos 18 horas ante de
interpretar los resultados.
G. Si no se agrega el aceite mineral, las reacciones se deben leer sólo a las 24 horas.
H. Un pequeño precipitado floculento en la ornitina no interfiere con su uso.
31
Prueba del Malonato
I. Principio
El ensayo pone en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar malonato como fuente de
carbono. Las cantidades mínimas de glucosa del medio, permiten el desarrollo de organismos
que no pueden usar malonato o sales de amonio, sin embargo esos organismos no pueden
mantener un pH alcalino. La producción de ácido por la fermentación de la glucosa impide
una posible alcalinización. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente
malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son
capaces de ejercer una acción buffer produciendo hidróxido de sodio. El aumento de la
alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie de verde a azul. Los
microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa hacen que el indicador cambie
de verde a amarillo. La mayoría de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato
de sodio. El ensayo también sirve para separar Salmonella arizonae (+) de otras especies de
Salmonella (-).
II. Materiales
El medio contiene: extracto de lavadura 1.0g, sulfato de amonio 2.0g, fosfato dipotásico 0.6g,
fosfato monopotásico 0.4g, ClNa 2.0g, malonato de sodio3.0g, glucosa 0.25g, azul de
brotimol (1g/500ml) 12.5g . Disolver en 1000 ml de agua destilada, dispensar 3 ml en tubos
con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. Enfriar antes de usar; el sustrato es
estable por 2 a 3 meses. Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración y
guardar en heladera. Si hay cambio de color en el medio no usar.
III. Procedimiento
A. Con ansa estéril tomar material e inocular el medio.
B. Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.
C. Continuar incubando los tubos negativos hasta 4 días, registrando los resultados día
por día.
IV. Resultados
Ensayo positivo: reacción alcalina (azul).
32
Ensayo negativo: no hay cambio de color (verde).
Ensayo negativo: reacción ácida, sólo fermentación de glucosa (amarillo).
V. Control de Calidad
Enterobacter aerogenes +
Escherichia coli -
VI. Consideraciones
A. Algunos organismos malonato (+) producen una ligera alcalinidad, que hace la
interpretación difícil. Cuando hay duda comparar con un tubo sin inocular. Cualquier
vestigio de color azul denota una prueba positiva luego de una incubación de 48 horas.
No se debe hacer una interpretación final negativa hasta no haber incubado los tubos
durante 48 horas.
B. A veces es necesario agregar extracto de levadura y glucosa para estimular el
crecimiento de algunos organismos.
C. Algunas cepas malonato (-) dan color amarillo por la fermentación de la glucosa
solamente. Esto produce una disminución del pH y el viraje del indicador al amarillo.
Ensayo del Rojo de Metilo
I. Principio
El test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo
fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en
ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido
pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en
cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador
del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la
diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo).
La mayoría de las Enterobacteriaceae tienen uno u otro camino metabólico, pero raramente
ambos.
II. Materiales
A. Preparación del medio
33
El medio está disponible comercialmente. Disolver en agua destilada, dispensar 5 ml en tubos
con tapa a rosca y autoclavar a 121ºC por 15 minutos. El sustrato es estable por 2 a 3 meses.
Rotular los tubos, indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.
B. Preparación del reactivo
Disolver 0.1 gr de rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir con 200 ml de agua destilada,
para alcanzar un volumen total de 500 ml. El reactivo es estable por 1 año. Rotular indicando
fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.
D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
IV. Resultados
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.
V. Control de Calidad
Escherichia coli +
Enterobacter aerogenes -
VI. Consideraciones
A. Variaciones en la cantidad de peptona del medio puede afectar el resultado.
B. Aumentando la concentración de glucosa en el medio no se acelera la reacción del rojo
de metilo.
C. No sobreinocular, el crecimiento bacteriano se inhibe cuando el inóculo es grande.
D. Una incubación de 48 horas es suficiente para la mayoría de los cultivos; pero el
ensayo no se debe realizar con cultivos que tengan menos de 48 horas de incubación.
34
Ensayo de Voges-Proskauer
I. Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un
microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como
productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el
camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y
2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos
metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un
complejo rojo. La sensibilidad del ensayo se aumenta por el agregado de α-naftol antes del
agregado de KOH.
II. Materiales
A.Preparación del medio
El medio está disponible comercialmente. Para la preparación del caldo RM/VP, ver el
procedimiento indicado para el test de rojo de metilo.
B. Preparación de solución de α-naftol
Disolver 5.0 gr de α- naftol en una pequeña cantidad de alcohol absoluto y luego llevar el
volumen a 100 ml. La solución debe ser incolora. El reactivo es estable por 1 año. Rotular
indicando fecha de preparación y de expiración. Guardar en heladera en frascos color
caramelo.
C. Preparación de la solución de KOH
Disolver los pellets de KOH en agua destilada y luego llevar el volumen final a 100 ml
(trabajar sobre baño de agua fría para evitar recalentamiento). El reactivo es estable por 1 año.
Rotular indicando fecha de preparación y de expiración.
III. Procedimiento
A. Con un ansa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP.
B. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tubo.
D. Agregar 0.6 ml del reactivo de α-naftol.
35
E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH.
F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos.
G. Observar la formación de un color rosado a rojo.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos.
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color.
V. Control de Calidad
Klebsiella pneumoniae –
Escherichia coli +
VI. Consideraciones
A. Cuando hay una incubación prolongada (más de 3 días) algunos organismos VP +
pueden producir un aumento de la acidez del medio, dando reacciones positivas
débiles o falsas reacciones negativas.
B. La mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae dan reacciones opuestas
entre el rojo de metilo y VP, sin embargo algunos organismos como Hafnia alvei
pueden dar ambas reacciones positivas.
C. Los reactivos se deben agregar en el orden indicado. Una inversión del orden puede
dar un resultado positivo débil o un falso negativo.
D. No se debe agregar KOH en exceso, porque se puede enmascarar una reacción positiva
débil por la formación de un color cobrizo por la reacción del KOH con el α-naftol.
No leer el ensayo después de 1 hora; puede aparecer una coloración cobriza dando un
resultado falso positivo.
Prueba de la Urea
I. Principio
La urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2
moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la
bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad
36
característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-)
y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)
II. Materiales
El medio base está disponible comercialmente, es el medio base de urea de Christensen, que
contiene peptona 1.0 g, glucosa 1.0 g cloruro de sodio 5.0 g, fosfato monopotásico 5.0 g,
solución de rojo fenol al 0.2% 6 ml. Se disuelve medio en agua destilada y esterilizar a 121ºC
por 15 minutos. Enfriar a 50ºC y agregar 5 ml de una solución de urea al 40% por cada 100 ml
de medio. Mezclar y fraccionar en volumenes de 2.5 ml en tubos estériles. Guardar en
heladera.
La urea se pesa asepticamente, se disuelve en agua y se calienta a 70ºC por 20 minutos, se
guarda en frascos estériles con cloroformo (igual que para los azúcares).
III. Procedimiento
A) Con un ansa estéril se toma abundante material y se inocula por punción
B) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se
observan diariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos
miembros de la familia, registrando los resultados día por día.
IV. Resultados
Ensayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
V. Control de Calidad
Enterobacter aerogenes –
Escherichia coli –
Proeus vulgaris +
37
Prueba del Indol
I. Principio
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio
rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos
aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para
detectar organismos productores de indol. Como indicador de la presencia del aldehído se usa
el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli,
y para diferenciar Edwardsiella (+) de Salmonella (-).
II. Materiales
A. Caldo triptofano
• Peptona 20.0 gr
• Cloruro de sodio 5.0 gr
• Agua destilada 1000 ml
A este caldo se le incorpora triptofano en una concentración del 1%. El medio se esteriliza a
121ºC durante 15 minutos y luego se ajusta el pH a 7.5. Dejar enfriar antes de su empleo y
guardar a 4-10ºC para su conservación.
B. Reactivo de Erlich
• p-dimetilaminobenzaldehido 1.0 g
• alcohol etílico, 95% 95.0 ml
• ácido clorhidríco, concentrado 20.0 ml
Se disuelve el aldehído en el alcohol (puede requerir un calentamiento suave), luego se agrega
lentamente el ácido. El reactivo de color amarillo es estable por un año. Identificar el reactivo
con una etiqueta donde conste la fecha de preparación y de expiración. Guardar refrigerado en
botellas color caramelo.
III. Procedimiento
1) Con un ansa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene
triptofano.
2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
38
3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo.
4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo.
6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
IV. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
después de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.
V. Control de Calidad
Cualquiera de los reactivos debe ser controlado con cultivos positivos y negativos conocidos,
antes de su empleo general. Como controles resultan convenientes cepas de fácil obtención y
que su conservación en cultivos madre no ofrezca problemas.
Escherichia coli +
Enterobacter aerogenes -
Klebsiella pneumoniae –
VI. Consideraciones
1) El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (7.4-7.8). La
disminución del pH provoca una reducción en la producción de indol y una reacción
falsamente negativa o débilmente positiva.
2) Los cultivos a los cuales se les efectúa la prueba del indol deben ser incubados
aerobicamente. El descenso en la tensión de oxígeno disminuye la producción de
indol.
3) No debe emplearse un medio de peptona que contenga glucosa porque la elevada
acidez producida por la fermentación del azúcar puede inhibir la actividad de la
triptofanasa. El agregado de triptofano estimula la producción de indol, mientras que la
glucosa la inhibe.
39
PROBLEMAS DEL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
A) Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi A, pueden diferenciarse de otras Salmonella spp,
por las siguientes pruebas bioquímicas:
TABLA 6. Pruebas bioquímicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y
Salmonella spp.
P. Bioquímicas S. Typhi S. Paratyphi A Salmonella spp.
SH2 (TSI) Trazas - +
Lisina decarboxilasa + - +
Ornitina decarboxilasa - + +
Arginina dihidrolasa - - +
Glucosa (gas) - + +
Citrato Simmons - - +
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
B) Algunas cepas de Salmonella spp. se pueden confundir con otras enterobacterias
productoras de SH2 como Proteus mirabilis y Citrobacter freundii que son comensales del
aparato digestivo del hombre y de los animales de sangre caliente, pero que no son
enteropatógenos.
TABLA 7. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica (I) Proteus
mirabilis y Citrobacter freundii
Pruebas bioquímicas Salmonella enterica
subesp. enterica (I) Citrobacter freundii Proteus mirabilis
SH2 (TSI) + + +
Urea (hidrólisis) - d +
Fenilalanina deaminasa - - +
Lisina decarboxilasa + - -
Ornitina decarboxilasa + d +
Lactosa (fermentación) - d -
Dulcita (fermentación) + d -
ONPG - + -
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones
40
C) Las cepas de Citrobacter freundii suelen ser identificadas por error como S. enterica
subesp. arizonae (IIIa) (serovariedades monofásicas) y S.enterica subesp. diarizonae (IIIb)
(serovariedades difásicas), (ex-género Arizona), en razón de compartir caracteres bioquímicos
tales como: SH2 (TSI) +, ONPG + y un perfil de fermentación de hidratos de carbono muy
parecido.
TABLA 8. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella subesp. enterica IIIa y IIIb y
Citrobacter freundii
Pruebas bioquímicas Salmonella subesp. enterica
IIIa y IIIb
Citrobacter freundii
Lisina decarboxilasa + -
Ornitina decarboxilasa + - (con excepciones)
Glicerol (fermentación) - +
Malonato (utilización) + -
Gelatina (hidrólisis) + (lenta) -
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
D) Muy raramente Salmonella pueden confundirse con otras entrobacterias productoras de
SH2, como E. coli SH2 + o Edwardsiella tarda
TABLA 9. Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I),
Edwarsiella tarda y Esherichia coli SH2 +
P. Bioquímicas S. enterica subesp.
enterica (I) E. tarda E. coli SH2 +
Indol - + +
Citrato Simmons + - -
Lisina decarboxilasa + + +
Arginina dihidrolasa + - -/+
Manita (fermentación) + - +
Dulcita (fermentación) + - +/-
Ramnosa (fermentación) + - +
Xilosa (fermentación) + - +
ONPG - - +
41
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
E) Puede suceder que dos o más serovares tengan la misma fórmula antigénica global, por lo
que su diferenciación se hace en base a pruebas bioquímicas.
TABLA 10. Caracteres diferenciales de las serovariedades S.Cholerasuis, S. Typhisuis y S.
Paratyphi C.
Pruebas Bioquímicas Cholerasuis Paratyphi C Typhisuis
SH2 - + +
Citrato deSimmons + o (+) + -
Arginina dihidrolasa - + o - -
Lisina decarboxilasa + + -
Ornitina decarboxilasa + + +
Tartrato de Jordan + o - + -
Arabinosa - + +
Dulcita - + -
Sorbita + o (+) + -
+ 90% o más de los resultados positivos; - 90% o más de los resultados negativos; (+) reacciones positivas después de 3 o más días.
2.3.- SEROTIPIFICACIÓN DE SALMONELLA spp.
La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y
desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad
en distintas zonas geográficas, como así también es de utilidad para el estudio de brotes y para
conocer la fuente de infección y las vías de transmisión.
El uso de reacciones antígeno – anticuerpo para la serotipificación de las bacterias se basa en
que los microorganismos presentan diferencias en su constitución antigénica, aún entre grupos
de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan una gran variedad de
antígenos (Ags): componentes estructurales de la célula (pared, cápsula, fimbrias); productos
de excreción (exotoxinas, enzimas extracelulares).
Químicamente, los Ags pueden ser proteínas, hidratos de carbono y complejos de polipéptidos
y carbohidratos. Como son moléculas complejas tienen más de una subestructura que puede
42
servir como determinante antigénico. Debido a esto en los sueros inmunes se encuentran
anticuerpos que reaccionan contra distintos determinantes antigénicos de la misma molécula.
La base de la serotipificación para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la
presencia de antígenos somáticos, flagelares y capsulares.
La serotipificación de cepas de Salmonella enterica involucra la identificación de antígenos
somáticos de superficie (LPS, antígenos O) y antígenos flagelares (proteínas, antígenos H). La
mayoría de las cepas de Salmonella expresan dos fases flagelares pero también se conocen
variantes afásicas, monofásicas y trifásicas.
La identificación de las serovariedades surge como consecuencia de la combinación
antigénica de factores somáticos O y flagelares H, con el agregado del antigeno capsular Vi
para unas pocas serovariedades y se presenta en el “Esquema de Kauffmann-White” (Popoff,
M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París,
Francia, 2001).
A) Antígenos somáticos (Ags O)
Están compuestos por complejos de fosfolípidos y polisacáridos; su composición es
aproximadamente: 60% polisacáridos, 20-30% lípidos y 3,5-4% hexosamina.
Son cadenas laterales de polisacáridos del lipopolisacárido de envoltura (LPS) que se
encuentra en todos los microorganismos gram-negativos.
La cadena de polisacáridos del Ag O es un polímero de unidades repetidas de oligosacáridos
(de 3 a 5 azúcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en
que se encuentran las unidades repetidas de la cadena determina la especificidad antigénica
somática de la bacteria. Como esta estructura difiere ampliamente entre las distintas
serovariedades, hay diferencias en la especificidad antigénica O.
Estos antígenos son termoestables y resistentes a ácidos diluidos y alcohol.
La estructura somática se denomina con la letra O seguida de números arábigos separados por
comas, por ej. S. Typhimurium O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12
43
Los Ags O se pueden clasificar de la siguiente manera:
1) Factores mayores, que identifican el grupo antigénico O; por ej., el factor O:4, el
factor O:9
2) Factores menores, que pueden ser:
a) Los que tienen poco o ningún valor discriminativo porque siempre están asociados
a otro factor; por ej., O:12 que siempre está asociado con O:2, O:4 y O:9, como se presenta en
S. Paratyphi A O: 1,2,12; S. Typhimurium O: 1,4,5,12 y S. Enteritidis O: 1,9,12
b) Los que surgen como consecuencia de una modificación química de los Ags
mayores; por ej., O:5 resulta de la acetilación de la abecuosa presente en las unidades
repetidas del polisacárido responsable de la especificidad O:4,12; O:1 resulta de la inserción
de un residuo de glucosa en la galactosa de la cadena de polisacárido, como es el caso de la
serovariedad S. Typhimurium O:1,4,5,12
B) Antígenos Flagelares (Ags H)
El flagelo es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión
(“hook”) y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la célula y el
“hook” une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificación flagelar de Salmonella se
usa solamente la especificidad antigénica del filamento.
El filamento esta constituido por flagelina, proteína de alto peso molecular. En Salmonella se
han encontrado más de 60 especificidades antigénicas flagelares. Las diferencias antigénicas
surgen debido a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminoácidos y orden de
ubicación) de las distintas moléculas de flagelina.
Estos antígenos son sensibles al calor.
Unas pocas serovariedades de Salmonella poseen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman
monofásicas, por ej. Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi (9,12 [VI]:d:-);
pero la gran mayoría de las serovariedades tienen dos fases flagelares o sea son cepas
difásicas; por ej., Salmonella Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y Salmonella Hadar
(6,8:z10:e,n,x), que expresan la fase 1 (constituida en los ejemplos por los antígenos: i ó z10 ) y
la fase 2 ( por los antigenos: 1,2 y e,n,x respectivamente).
44
C) Antígeno Capsular (Ag Vi)
El antígeno capsular es un polisacárido, constituido por ácido N-acetilglucosaminourónico.
Entre los antígenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el más importante en el género
Salmonella. Se encuentra en sólo tres serovariedades: S. Typhi, S. Paratyphi C y en algunas
cepas de S. Dublin.
Descripción del Esquema de Kauffmann - White
Sobre la base de los componentes antigénicos somáticos O y flagelares H se ha establecido lo
que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a todas las serovariedades
conocidas.
El esquema está conformado por cuatro columnas:
Primera columna: indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a
S. enterica subesp. enterica (I) ó las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando
que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II ó III a, etc.
Segunda columna: Antígenos somáticos (O). Los números indican el ó los factores del
antígeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en
grupos somáticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. Así se determinan
los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) está integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-)
entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- );
S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc.
El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego
continúa con números, desde el O:51 hasta el O:67
Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y
2, del antígeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras
minúsculas, seguidas algunas veces por un número que figura como subíndice y para la fase 2
se emplean en general números arábigos, aunque también se utilizan letras minúsculas. Un
signo "negativo" indica que la fase considerada está ausente y por lo tanto la serovariedad es
monofásica.
45
� Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica están
subrayados (por ej. 1,2,12)
� [ ] = los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o
ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B).
Cuando los factores H están entre corchetes significa que ellos se encuentran
excepcionalmente en cepas salvajes.
Ejemplos:
Salmonella Enteritidis 1, 9,12:g,m:-
El Ag O es 1, 9,12; el Ag H (fase 1) es g,m;
El Ag H (fase 2)es -; la fase 2 está ausente, por lo tanto
la serovariedad es monofásica.
Salmonella Typhimurium 1, 4,5,12:i:1,2
El Ag O es 1,4,5,12 ; el Ag H (fase 1) es i ; el Ag H (fase
2) es 1,2; las dos fases flagelares están presentes, por lo
tanto la serovariedad es difásica.
Salmonella Hadar 6,8:z10:e,n,x
Salmonella Typhi 1, 9,12[Vi]:d:-
46
ESQUEMA DE KAUFFMANN-WHITE (*)
47
Materiales y equipamiento
• Estufa de cultivo a 37ºC
• Heladera a 4ºC
• Baño de agua a 50ºC
• Ansas
• Tubos de ensayo
• Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca
• Tubos de Craigie
• Cajas de Petri
• Láminas de vidrio de 20x20 cm
• Pipetas de 5 ml
• Gradillas
• Mecheros
• Lámparas para leer aglutinaciones
• Palillos de madera
Medios
• Estrías de agar tripticasa de soja (TSA)
• Agar movilidad al 0,7% (para inversión de fase)
• Agar movilidad al 0,5% (para Craigie)
• Caldo flagelar
Reactivos y Soluciones
• Antisueros diagnósticos O y H (Servicio Antígenos y Antisueros – Insttituto
Nacional de Producción de Biológicos – A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”-
Argentina)
• Solución salina al 2%
• Solución fisiológica formolada al 1%
Cepas bacterianas
Cepas de Salmonella spp. en agar TSA, cultivos de 18 horas a 37ºC
Esquema de Kauffmann-White (Poppof, M.Y., 8ª Ed, WHO Centre for Referente and
Research on Salmonella, Instituto Pasteur, París, Francia, 2001).
48
2.3.1- SEROTIPIFICACIÓN SOMÁTICA O
Procedimiento Comentario
Dia 1 Serotipificación somática O
• La determinación del antígno O de
Salmonella spp. se hace en lámina a partir
de un cultivo en agar TSA, incubado a 37ºC
por 18-24 horas
• Verificar que el cultivo se encuentre en
forma lisa:
- Mezclar una ansada de cultivo puro se
mezcla con una gota de solución salina al
2%, cuiadosammente con un palillo. Rotar
suavemente la lámina, durante 2 minutos.
Observar la presencia o ausencia de grumos:
a) Si hay grumos la cepa está rugosa.
b) Si no presenta grumos se realiza la
serotipificación somática O
• La detección de los antígenos somáticos se
realiza por aglutinación en lámina. Los
anticuerpos en el suero específico aglutinan
con la bacteria cuando el antígeno
correspondiente está presente. Es
importante que el aislamiento esté en forma
lisa.
• La aglutinación con solución salina al
2% debe dar negativa
• Para revertir la rugosidad se deben
realizar subcultivos de la cepa en agar
sangre o en agar Mueller Hinton, de manera
de recuperar la forma lisa y poder continuar
con la serotipificación somática O.
• Si no es posible la reversión de la forma
rugosa a la lisa, se debe confirmar su
identificación bioquímica y realizar la
seropitificación flagelar H.
49
• Enfrentar sobre una lámina de vidrio una
ansada del cultivo en agar TSA, con una
gota de los antisueros polivantes OS-A y
OS-B. Mezclar cuidadosamente con un
palillo. Mover suavemente la lámina,
durante 2 minutos, para favorecer la
reacción antígeno-anticuerpo y observar
presencia o ausencia de aglutinación, con luz
indirecta.
• Si hay aglutinación con alguno de los dos
antisueros polivalentes, probar los antisueros
de grupo O correspondientes.
• Si hay aglutinación con un antisuero de
grupo O, probar los antisueros de factores O
• Lectura e interpretación de resultados
Registrar el grado de aglutinación de la
siguiente manera:
• 4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados
• 3+: 75% aproximadamente de
• Estos polivalentes comprenden el 98%
de las serovariedades aisladas del hombre y
de los animales. Estos antisueros cumplen
la función de una primera selección en
grandes grupos. Si la aglutinación no ocurre
con los polivalentes OS-A y OS-B puede
ser:
a) Una serovariedad no comprendida
en dichos antisueros, en tal caso remitir
la cepa al Laboratorio de Referencia
b) Una serovariedad que presente
antígeno de envoltura Vi (S. Typhi, S.
Paratyphi C y algunas cepas de S.
Dublin). En este caso se debe enfrentar
el cultivo con el antisuero Vi
50
microorganismos aglutinados
• 2+: 50% aproximadamente de
microorganismos aglutinados
• 1+: menos de 2% de microorganismos
aglutinados
• Negativo: ausencia de aglutinación. Se
observa una suspensión homogénea.
• Registrar los resultados tanto negativos
como positivos para los antígenos O
estudiados, en la Planilla 3 - Registro de
Resultados: Serotipificación Somática de
Cepas de Salmonella.
2.3.2- SEROTIPIFICACIÓN FLAGELAR H
Procedimiento Comentario
Día 1 Serotipificación flagelar H
• Sembrar la cepa de Salmonella spp. en 5
ml de caldo flagelar e incubar a 37ºC,
durante 18-24 horas.
Día 2
• Separar del caldo flagelar una alícuota de
0.5 ml en un tubo estéril de 13x100 con tapa
a rosca.
• Agregar al caldo flagelar restante 5 ml de
solución fisiológica formolada al 1% (caldo
• La detección de los antígenos flagelares
H se realiza por aglutinación en tubo o en
placa dependiendo de las características de
los antisueros. En este protocolo se describe
la aglutinación en tubo, ya que los
antisueros están preparados por el productor
para realizar la aglutinación en tubo.
51
formolado) y dejar reposar durante 1 hora a
temperatura ambiente
• Colocar en 4 tubos de ensayo una gota de
cada uno de los antisueros flagelares
polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y
agregar a cada tubo 0.5 ml del caldo
formolado.
• Incubar 1 hora a 50ºC en baño de agua y
registrar la presencia o ausencia de flóculos
con luz indirecta.
• Si hay aglutinación, con uno o dos de los
antisueros flagelares polivalentes, enfrentar
el caldo formolado, con los antisueros de
fase H correspondientes (una gota del
antisuero más 0,5 ml del caldo formolado)
• Si el antisuero de fase flagelar está
compuesto por más de un factor (por ej. 1,2),
determinar los factores H correspondientes,
utilizando los antisueros de factores
específicos
• La aglutinación flagelar tiene una
apariencia flocular, menos compacta que la
aglutinación somática. Su estructura
tridimensional no es estable, por lo tanto no
se deben agitar los tubos luego de la
incubación a fin de no disgregar los
flóculos.
• Si la cepa de Salmonella spp., de la cual
se ha identificado el antígeno O, no
reacciona con ninguno de los antisueros
flagelares polivalentes, hay que tener en
cuenta:
a) La cepa puede presentar un
antígeno no incluido en los
antisueros polivalentes, en este caso
debe ser remitida al Laboratorio de
Referencia, para completar su
serotipificación
b) Se puede tratar de una cepa
inmóvil, por la ausencia de flagelos
c) Se puede tratar de una cepa con
movilidad reducida. En este caso se
debe exaltar la movilidad por
52
Método de Inversión de Fase
• Fundir 10 ml de agar movilidad al 0.7%,
dejar enfriar a 50ºC.
• Mezclar en una caja de Petri dos gotas
del antisuero de la fase flagelar
predeterminada con el agar movilidad al
0.7%, homogenizar con movimientos de
rotación y dejar solidificar.
pasajes sucesivos en tubos Craigie o
en tubo en U con agar movilidad al
0.5%
• Si el cultivo aglutina con un solo
antisuero polivalente flagelar, puede ser:
a) Que se trate de una
serovariedad monofásica
b) Que sea una serovariedad
difásica, de acuerdo al Esquema de
Kauffmann-White, por los
resultados de la aglutinación O y
únicamente se expresa una sola fase
H, por lo tanto hay que poner en
evidencia la fase no detectada,
usando el “Método de inversión de
fase”.
• Es un método que permite poner en
evidencia, en caso de serovariedades
difásicas, la fase que no se expresó. Para
ello se inmoviliza la fase flagelar
establecida previamente con el antisuero
correspondiente a esa fase flagelar. Se trata
de un método de selección de los
microorganismos que presentan la fase
flagelar no expresada hasta ese momento.
53
• Sembrar una ansada del cultivo sin
formolar en el centro de la superficie del
agar
• Incubar a 37ºC, durante 18-24 horas.
Día 3
• Tomar el desarrollo bacteriano de la
periferia de la placa y enfrentar con el
antisuero de la fase sospechada.
• Lectura e interpretación de resultados
Registrar el grado de aglutinación de la
siguiente manera:
• 4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es un líquido
claro
• 3+: 75% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un líquido ligeramente
turbio
• 2+: 50% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un líquido moderamente
turbio
• 1+: menos de 2% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es turbio
• Negativo: ausencia de aglutinación,
caracterizada por una suspensión
homogénea.
54
• Registrar los resultados tanto negativos
como positivos para los antígenos H
estudiados, en la Planilla 4 - Registro de
Resultados: Serotipificación Flagelar de
Cepas de Salmonella spp.
• Identificación de la serovariedad
Combinando los antígenos O y H
identificados se determina la serovaridad de
acuerdo con el Esquema de Kauffmann-
White.
Ver Tubos de Craigie y en U (Figura 2)
Ver Flujograma de Serotipificación (Figura 3)
FIGURA 2.- TUBOS DE CRAIGIE Y EN U
Tubo de Craigie Siembra del inóculo
Recolección del desarrollo
Tubo en U
Siembra del Inóculo Recolección del
desarrollo
55
FIGURA 3.- FLUJOGRAMA DE SETROTIPIFICACIÓN
Cepa con características bioquímicas de Salmonella
Serotipificación somática Estría en TSA Serotipificación flagelar (aglutinación en lámina) (aglutinación en tubo)
Aglutinación con solución salina al 2% Caldo flagelar
Negativa Positiva Aglutinación c/ antisueros
poliv. flagelares H (4) Aglutinación c/ Cepa Rugosa (2) antisueros poliv. Negativa (5) Positiva somáticos (1) Aglutinación c/ Negativa (3) Positiva antisueros de fases H / factores H (6) Aglutinación c/ antisueros Positiva de grupo O
Positiva
Aglutinación c/ antisueros de factores O Positiva RESULTADO FINAL
(1) Antisueros polivalentes somáticos: OS-A y OS-B (2) Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si
no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificación por pruebas bioquímicas y realizar la serotipificación flagelar H.
(3) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación somática" (4) Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C (5) Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación flagelar”. (6) Si la serovariedad de Salmonella es difásica y sólo expresa una fase, realizar "Método de inversión de fases"
56
Referencias
1. Abbot, Sh. (1999). Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter and Serratia. En Manual of Clinical Microbiology.
Murray, P., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. (ed.) 7th Edition. Chapter 29, 475 - 482.
American Society for Microbiology. Washington D.C.
2. Bopp, Ch.A., Brenner, F.W., Wells, J.G., Strockbine, N.A. (1999). Eschericia, Shigella and Salmonella. En
Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. (ed.)
7th Edition. Chapter 28, 459 - 474. American Society for Microbiology. Washington D.C.
3. Ewing, W.H. (1986). Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th. Edition. Elsevier
Science Publishing Co., Inc., New York.
4. Farmer, J. J. et al. (1985). Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae
isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21(1): 46-76.
5. Farmer, J. J., Wells, J. G., Griffin, P. M., Wachsmuth, I. K. (1987). Enterobacteriaceae Infections, from
Diagnostic Procedures for Bacterial Infections, 7th Ed., cap. 14, 233-296, Am. Public Health Assoc., Inc.
Washington, D.C.
6. Farmer III, J.J. (1999) Enterobacteriaceae: Introduction and identification. En Manual of Clinical
Microbiology. Murray, P., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. (ed.) 7th Edition.
Chapter 27, 442 - 458. American Society for Microbiology. Washington D.C.
7. Holmes, B., Aucken, H.M. (1998). Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia and others members of
the Enterobacteriaceae. En Microbiology and Microbial Infections. 9th Edition. Ballows,A.; Duerden,I.B.
(ed.) Vol. 2 Systematic Bacteriology . Chapter 42. Oxfort University Press,Inc, New York, N.Y.
8. Le Minor, L., Veron, M., Popoff, M. (1982). Proposition pour une nomenclature des Salmonella. Ann.
Microbiol (Inst. Pasteur) 133B: 245-254.
9. Le Minor L., M. Popoff, B. Laurent, D. Hermant. (1986). Individualisation d'une septieme sous-espece de
Salmonella: Salmonella cholerasuis subsp. indica subsp., nov. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 137B: 211-
217.
10. Le Minor, L., Richard, C. (1993) Méthodes de laboratoire pour l´identificaction des Entérobacteries. Institut
Pasteur, Paris, France.
57
11. Mac Fadin, J.F. (1980). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Ed.
Panamericana.
12. Manual de Laboratorio de Infecciones Entéricas Agudas (1983). Organización Panamericana de la Salud.
Oficina Regional dela OMS. Ed. Española,.
13. Miller, S.I., Hohmann, E.L., Pegues, D.A. (1995). Salmonella (Including Salmonella Typhi) En Principles
and Practice of Infectious Diseases. Mandell, G.L., Douglas and Bennett´s (ed.) 4th Edition. Chapter 200.
De. By Mandell, G.L. M.D.; Bennet,J.E. MD.; Dollin, R. M.D.
14. Peluffo, C. (1973). Salmonella: Método simplificado de diagnóstico serológico. Oficina Sanitaria
Panamericana. Oficina Regional de la OMS.
15. Wray, C., Wray, A. (2000). Salmonella in domestic animals. CABI Publishing
16. Popoff M.Y., (2001). Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 8th edition. World Health Organization,
Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris.
58
CAPÍTULO III- IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA SPP. Y DETECCIÓN
DE FACTORES DE VIRULENCIA POR REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
1.- INTRODUCCIÓN
La técnica de PCR permite amplificar selectivamente un segmento de ácidos nucleicos que se
encuentra entre dos regiones de secuencias conocidas, produciendo un gran número de copias
a partir de pequeñas cantidades de ADN o ARN. Se utilizan dos oligonucleótidos como
cebadores o “primers”. Estos son cadenas de nucleótidos, que se unen a secuencias
complementarias en el extremo 5´ de cada hebra de ADN, limitando el segmento de ADN que
se quiere amplificar. La reacción de amplificación utiliza una ADN polimerasa termoestable,
en ciclos repetidos.
Cada ciclo de PCR consiste en tres etapas:
1) Desnaturalización: se produce la separación de las hebras de ADN por calentamiento a 90 -
96ºC. El tiempo va a depender del tamaño del fragmento y el contenido de G+C.
2) Hibridación o "annealing": los “primers” se unen a los sitios complementarios en el ADN
simple cadena a la temperatura óptima de hibridación (Ta). Esta depende de la composición
de bases, el largo y la concentración de los “primers”. La Ta ideal se encuentra generalmente
5ºC por debajo de la verdadera temperatura de melting (Tm) de los “primers” (temperatura a
la cual el 50% de las cadenas primers-target se encuentra separadas en solución).
3) Polimerización: luego del “annealing” de los primers se produce la extensión por acción de
la polimerasa. Comenzando a partir del “primer” la enzima lee la hebra de templado e
incorpora los nucleótidos complementarios. La DNA polimerasa utilizada es termoestable
por lo tanto no se desnaturaliza por la alta temperatura en el inicio de la reacción. Se utiliza
normalmente Taq polimerasa aislada de una bacteria termófila Thermus aquaticus, o
recombinante, cuya temperatura óptima de extensión es 72ºC. La enzima tiene una vida
media de 40 minutos a 95ºC, de manera que puede soportar aproximadamente hasta 30
ciclos repetitivos de PCR.
59
Precauciones a tener en cuenta en la realización de la PCR
Uno de los inconvenientes más importantes de esta técnica es la contaminación ya sea de
ADN proveniente del entorno, contaminación cruzada entre muestras de una misma reacción,
o por el producto amplificado. Existen medidas de control para minimizar estos
inconvenientes, para ello es necesario contar con distintas áreas dentro del laboratorio:
1. Área de preparación de la mezcla de reacción (cabina de seguridad o área limpia)
2. Área de manipulación de muestras, cultivo y extracción del ADN
3. Área de amplificación y análisis del producto de la reacción
Es necesario que los reactivos se almacenen en áreas libres de contaminación. En lo posible,
cada área debe tener dos entradas, circulación de aire para recontaminación de aerosoles y
lámparas de luz UV. El movimiento de las muestras y del personal tiene que ser de un área
libre de amplicones hacia áreas contaminadas con ellos y nunca en sentido contrario.
Equipos y materiales necesarios
• Equipos
- Micropipetas automáticas (10 µl, 100µl y 200µl)
- Bloque Térmico o equivalente
- Microcentrífuga
- Ciclador térmico
- Horno microondas o equivalente
- Cubas electroforéticas y accesorios
- Fuente de poder
- Transiluminador UV
- Cámara fotográfica
• Materiales
- Ansa aguja
- Guantes de látex descartables
- Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml
- Tubos para reacción de PCR de 0.2 ml (o 0.5 ml según requiera el ciclador)
- Tips con barrera para aerosoles
60
- Bloque térmico refrigerado a – 20º C ± 5 ºC (o recipiente con hielo)
• Reactivos
- Agua tridestilada o calidad molecular
- Primers
- Taq polimerasa
- Buffer de la enzima 10X (origen comercial, provisto con la Taq)
- Cloruro de magnesio 25 ó 50 mM (origen comercial, provisto con la Taq)
- Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
- Agarosa
- Buffer Tris Acetato EDTA (TAE) 1 X
- Buffer de siembra 6X (xilene-cyanol o azul de bromofenol)
- Marcador de peso molecular de 100pb
- Bromuro de etidio
- Agua destilada
Primers: se reconstituyen con agua tridestilada o buffer TE (Tris 10 mM-EDTA 1 mM) según
indicaciones del fabricante para obtener una concentración de 100 mM. Se realiza una
dilución 1/10 para obtener la solución de trabajo (10 mM), la cual debe guardarse en pequeñas
alícuotas. Ambas soluciones se conservan a -20ºC.
Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs): se prepara una solución de 2.5 mM mezclando
25µl de cada uno de los nucleótidos trifosfato de concentración 100mM en un volumen final
de 1 ml (diluir con agua calidad molecular). Conservar a -20º en pequeñas alícuotas.
Buffer TAE 1 X: se prepara diluyendo con agua destilada a partir de un stock 50X (20 ml de
stock para 1 l de buffer). Para preparar el stock 50X pesar 242 g de Tris base, agregar 500 ml
de agua destilada, 57.1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA y llevar a volumen final
de 1 litro con agua destilada.
Buffer de siembra 6X (xilene-cyanol o azul de bromofenol): se prepara una solución con 30 ml
de glicerol y 0.25 g de xilene cianol ó azul de bromofenol, llevando a volumen final de 100 ml
con agua destilada.
61
Bromuro de etidio: diluir con agua destilada hasta concentración final de 1 µg/ml. Se
recomienda utilizar una solución de 10 mg/ml como stock. Conservar el stock y la solución de
trabajo en recipientes opacos.
62
2.- PROCEDIMIENTO GENERAL
Procedimiento Comentarios
a) Preparación de ADN templado • A partir de un aislamiento sospechoso de Salmonella, tomar 4 a 5 colonias y suspender en 150 ul de agua calidad molecular estéril. • Calentar a 100ºC durante 10 minutos en bloque térmico o baño de agua. • Centrifugar 1 minuto a 10.000 rpm para decantar los restos celulares. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga rotulado. • Consevar los templados a -20ºC.
b) Preparación de la mezcla de reacción • Retirar los reactivos para PCR excepto la Taq polimerasa del freezer. Asegurarse que se descongelen completamente antes de utilizarlos. Mantenerlos en bloque frío o recipiente con hielo. Retirar la Taq Polimerasa en el momento de realizar la mezcla de reacción, poner en hielo o bloque frío. • Calcular el volumen total de cada reactivo para la mezcla de reacción según las muestras que se van a analizar, incluyendo las cepas controles y considerando dos tubos más, uno para el control de los reactivos y uno por el error en el pipeteo. • Rotular los tubos de PCR.
• Utilizar el ansa aguja para preparar la suspensión bacteriana. En lugar de agua, esta suspensión puede realizarse en buffer TE/Tritón X-100 1% (Tris 1 mM, EDTA 0.1 mM, Tritón X-100 1%). • Preparar los extractos de ADN de las cepas de referencia que se utilizarán como controles siguiendo el mismo protocolo. • Conservar los extractos de ADN en estantes que no contengan reactivos de PCR
• El procedimiento debe hacerse en una cabina de seguridad, flujo laminar o área limpia de amplicones. Es aconsejable utilizar tips con filtro para aerosoloes y trabajar con un juego de pipetas de uso exclusivo para la preparación de la mezcla de reacción. Estas pipetas deben ser guardadas en la cabina o flujo laminar y evitar el contacto de las mismas con cultivos bacterianos, extractos de ADN y amplicones (productos de PCR). • Las concentraciones de los reactivos de trabajo y los volúmenes por determinación se indican en los protocolos específicos de cada PCR.
63
• Realizar la mezcla de los reactivos en un tubo de 1.5 ml. Agregar primero los reactivos de mayor volumen (agua, buffer) y por último la Taq polimerasa. • Fraccionar en tubos de PCR de 0.2 ml. Cerrar y trasladar los tubos al área de carga de templados. c) Carga de templados y amplificación • Cargar el volumen correspondiente de ADN en cada tubo. Dejar un microtubo como control de reactivos sin ningún templado. • El ciclador debe tener programado los ciclos con sus respectivas temperaturas según los protocolos. Introducir los tubos e iniciar el programa correspondiente. d) Preparación del gel de agarosa y electroforesis • Pesar la agarosa según el porcentaje y el tamaño del gel que se desea preparar, agregar al volumen de buffer TAE 1 X correspondiente y se funde en el horno microondas a 40% de potencia. • Colocar la agarosa fundida en la bandeja o molde para el gel y ubicar el peine en la posición adecuada. • Una vez solidificada la agarosa, retirar el peine y colocar el gel en la cuba electroforética que deberá contener suficiente cantidad de buffer TAE 1 X para que el gel quede cubierto. • Retirar los tubos de PCR del ciclador y llevar al área de detección del producto de amplificación. Agregar a cada tubo el volumen correspondiente de buffer de siembra en una proporción 1/5
• Asegurarse que los templados estén bien descongelados en el momento de cargarlos. Utilizar una pipeta exclusiva para manipular ADN y tips con filtro para aerosoles. • Es importante mantener los tubos en hielo hasta el momento de introducirlos en el ciclador. Se recomienda hacerlo una vez que el bloque del ciclador alcanzó una temperatura de 95ºC (encender el equipo unos minutos antes y mantenerlo en pausa a 95ºC).
• La concentración de agarosa a utilizar depende del tamaño de los fragmentos de ADN amplificados. • El buffer de siembra 6 X contiene glicerol (30%) para darle densidad a la muestra y azul de bromofenol o xilene cianol (0.25%) para visualizar el frente o fondo de corrida respectivamente. La selección de uno
64
(buffer/muestra). • Cargar 10µl de cada muestra por pocillo, comenzando por las muestras, el control positivo y por último el control negativo (sin templado). • Sembrar en el mismo gel un marcador de peso molecular. • Conectar la cuba a la fuente de poder teniendo la precaución de que la línea de siembra se encuentre en el polo negativo ya que las moléculas de ADN migran hacia el polo positivo. Realizar la corrida electroforética a voltaje constante de 100 volts durante 30-40 minutos. • Sumergir el gel en una solución de bromuro de etidio de 1µg/ml durante 30 minutos. • Enjuagar en agua destilada por 30-45 min. • Observar el gel con luz UV y fotografiar. Comparando la distancia recorrida de los fragmentos de las muestras con el marcador de peso molecular se puede estimar el tamaño de los fragmentos.
de los dos colorantes depende del tamaño de los fragmentos a visualizar, de manera que los mismos no se superpongan a la banda del colorante. • Para los protocolos de PCR de Salmonella se recomienda utilizar como marcador de PM un “ladder” de 100 bp. • Se recomienda no incluir bromuro de etidio dentro del gel, a fin de minimizar la contaminación de materiales y equipos con esta droga, altamente tóxica. Mantener la solución de bromuro de etidio en un recipiente con tapa, opaco, ya que es sensible a la luz. Manipular con precaución, utilizando guantes. Para decontaminar la solución de bromuro de etidio sumar al recipiente el agua utilizada para enjuagar los geles e incorporar 1 g de carbón activado por litro de solución. Dejar en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Filtrar y descartar el filtrado. Sellar el filtro en una bolsa plástica y descartar con los residuos peligrosos.
65
3.- PROTOCOLOS ESPECÍFICOS DE PCR PARA SALMONELLA spp.
3.1. PCR para identificación de Salmonella spp.
El gen invA, descripto por Galan y Curtis en Salmonella Typhimurium, está localizado en la
isla de patogenicidad I y está involucrado en el proceso de ingreso a la célula del epitelio
intestinal (invasividad). La elección de esta secuencia para la identificación de Salmonella su
amplia y exclusiva distribución entre todas las serovariedades del género.
El protocolo descrito corresponde al trabajo de Malorny y col., basado en la amplificación de
un fragmento de 284 pb. Este protocolo fue validado en un proyecto internacional e incluye la
utilización de un control interno de amplificación (CIA), de especial utilidad para la detección
directa de Salmonella en alimentos.
Primers
Nombre Secuencia Tamaño del fragmento invA 139 GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA invA 141 TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C
284 pb, 157 pb (CIA)
PCR invA
Reactivos Concentración Final Volumen (ul)
H2O 11.6 Buffer 10X 1X 2.5
MgCl2 (50 mM) 1.5 mM 0.75 dNTPs (2.5 mM) 0.2 mM 2
Primer invA 139 (10 uM) 0.4 µM 1 Primer invA 141 (10 uM) 0.4 uM 1
Taq DNA Polimerasa (5U/ul) 0.75 U 0.15 Control Interno de Amplificación 200 copias 1
DNA 5 Volumen Final 25
Programa de Ciclado Temperatura Tiempo
Paso 1 95º C 1 min Paso 2 95º C 30 seg Paso 3 64º C 30 seg 38 ciclos Paso 4 72º C 30 seg Paso 5 72º C 4 min
Gel de agarosa: 2%
Tamaño del Fragmento: 284 pb (invA)
157 pb (CIA)
66
1 2 3 4 5
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen invA.
Calles: 1, marcador de PM 100 bp; 2, control negativo (Shigella sonnei); 3, S. Enteritidis 99-4282;
4, S. Typhimurium; 5, mezcla de reacción con control interno de amplificación (CIA)
Referencias
- Malorny B., J. Hoorfar, C. Bunge, R. Helmuth. 2003. Multicenter validation of the analytical
accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard. Appl. Environ. Microbiol. 69:
290-296.
- Galan J. E., and R. Curtis III. 1989. Cloning and molecular characterization of genes whose
products allow Salmonella Typhimurium to penetrate tissue culture cells. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86: 6383-6387
3.2. PCR para Detección de Factores de Virulencia de Salmonella spp.
Numerosos factores de virulencia han sido implicados en la patogénesis de Salmonella. Esta
bacteria utiliza dos sistemas de secreción tipo III para translocar proteínas efectoras hacia el
citoplasma de las células huésped. Los genes que componen estos sistemas de secreción están
altamente conservados y sólo algunas de las proteínas efectoras presentan distribución
variable entre los aislamientos de Salmonella (por ej. sopE). La adherencia a células
epiteliales también es un paso importante en la patogénesis y se han descripto distintas
fimbrias en aislamientos pertenecientes a diferentes serovariedades. Entre estas adhesinas, la
fimbria SEF, codificada en el cromosoma, se encontró predominantemente asociada a algunas
serovariedades de Salmonella, mientras que la fimbria PEF, de codificación plasmídica, está
presente en aislamientos de distintos serovares.
Además, la mayoría de las serovariedades no tifoideas contienen un plásmido, que lleva la
información genética de algunos determinantes de virulencia involucrados en la supervivencia
y proliferación de Salmonella en la célula huésped. Entre estos genes, se encuentran el operón
284 pb invA
157 pb CIA
67
spv y el operon fimbrial pefBACD. La región spv contiene cinco genes spvR, spvA, spvB, spvC
y spvD que están involucrados en la replicación intracelular en macrófagos.
Por otra parte, además de los genes de virulencia mencionados, otros factores del huésped y
del patógeno participan en la regulación y modulación de la patogénesis de Salmonella. Entre
estos factores, el gen avrA, identificado en S. Typhimurium codifica una molécula efectora
que inhibe la activación de los factores de transcripción proinflamatorios NF-kappaB. Se ha
postulado que esta molécula podría limitar la virulencia de Salmonella. En S. Paratyphi B, se
observó que el gen avrA estaba presente en aislamientos de infecciones entéricas mientras que
estaba ausente en cepas de origen sistémico.
Primers para detección de factores de virulencia en Salmonella spp.
Nombre Secuencia Tamaño del fragmento
avrF GTT ATG GAC GGA ACG ACA TCG G
avrR ATT CTG CTT CCC GCC GCC 385 pb
pefA F GGG AAT TCT TGC TTC CAT TAT TGC ACT GGG pefA R TCT GTC GAC GGG GGA TTA TTT GTA AGC CAC T
520 pb
invA F TTG TTA CGG CTA TTT TGA CCA invA R CTG ACT GCT ACC TTG CTG ATG
521 pb
sefD F TCA ACT ATT AAA GCA CAA GAA C sefD R TTA TAA TTC AAT TTC TGT CGC
374 pb
sopEtt F ACG GAG TTA TAA AAG GAT TGG sopEtt R TAA AGA CCC CGC ATA CG
224 pb
PCR pefA
Reactivos Concentración Final Volumen (ul)
H2O 27.25 Buffer 10X 1X 5
MgCl2 (50 mM) 1.5 mM 1.5 dNTPs (2.5 mM) 0.2 mM 4
Primer pefA F (10 uM) 1 uM 5 Primer pefA R (10 uM) 1 uM 5
Taq DNA Polimerasa (5U/ul) 1.25 U 0.25 DNA 2
Volumen Final 50
Programa de Ciclado pefA Temperatura Tiempo
Paso 1 94º C 2 min Paso 2 94º C 1 min Paso 3 63º C 1 min 30 ciclos Paso 4 72º C 1 min Paso 5 72º C 5 min
Gel de agarosa: 1%
Tamaño del Fragmento: 520 pb
68
1 2 3 4 5
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen pefA.
Calles: 1, 2 y 4 aislamientos negativos (S. Typhi); 3, control (S. Typhimurium 99-2728); 5, marcador
de PM 100 bp.
PCR sefD
Reactivos Concentración Final Volumen (ul)
H2O 33.5 Buffer 10X 1X 5
MgCl2 (50 mM) 1.5 mM 1.25 dNTPs (2.5 mM) 0.2 mM 4
Primer sefD F (10 uM) 0.4 uM 2 Primer sefD R (10 uM) 0.4 uM 2
AmpliTaq Polimerasa (5U/ul) 1.25 U 0.25 DNA 2
Volumen Final 50
Programa de Ciclado sefD Temperatura Tiempo
Paso 1 94º C 2 min Paso 2 94º C 1 min Paso 3 52º C 1 min 30 ciclos Paso 4 72º C 1 min Paso 5 72º C 5 min
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen sefD.
Calles: 1, marcador de PM 100 bp; 2, control positivo S. Enteritidis 99-4282; 3, aislamiento positivo
S. Enteritidis; 4, control negativo (sin templado).
Gel de agarosa: 1%
Tamaño del Fragmento: 374 pb
1 2 3 4
sefD 374 pb
520 pb pefA
69
PCR avrA
Reactivos Concentración Final Volumen (ul)
H2O 12.55 Buffer 10X 1X 2.5
MgCl2 (50 mM) 1.5 mM 0.75 dNTPs (2.5 mM) 0.2 mM 2
Primer avrA F (10 uM) 1 uM 2.5 Primer avrA R (10 uM) 1 uM 2.5
Taq DNA Polimerasa (5U/ul) 1 U 0.2 DNA 2
Volumen Final 25
Programa de Ciclado avrA Temperatura Tiempo
Paso 1 94º C 2 min Paso 2 94º C 1 min Paso 3 64º C 1 min 30 ciclos Paso 4 72º C 1 min Paso 5 72º C 5 min
1 2 3 4 5 6
Productos de amplificación por PCR para la detección del gen avrA.
Calles: 1, control positivo S. Typhiurium 99-2728; 2, 3 y 4 aislamientos positivos (S. Enteritidis); 5,
control negativo (sin templado); 6, marcador de PM 100 bp.
Referencias
- Bäumler, A.J., F. Heffron. 1996. The pef fimbrial operon of Salmonella Typhimurium
Mediates adhesion to murine small intestine and is necessary for fluid accumulation in the
infant mouse. Infect and Immun. 64:61-68.
Gel de agarosa: 1%
Tamaño del Fragmento: 385 pb (avrA)
avrA 385pb
70
- Bäumler, A.J., F. Heffron. 1997. Contribution of horizontal gene transfer and deletion events
to development of distinctive patterns of fimbrial operons during evolution of Salmonella
serotypes. J. Bacteriol.179: 371-322.
- Hardt, W.D., J.E. Galán. 1997. A secreted Salmonella protein with homology to an
avirulence determinant of plant pathogenic bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2; 94:9887-
9892.
- Prager, R., W. Rabsch, W. Streckel, et al. 2003. Molecular properties of Salmonella enterica
serotype Paratyphi B distinguish between its systemic and its enteric pathovars. J Clin
Microbiol. 41:4270-4278.
71
CAPÍTULO IV:-MEDIOS DE CULTIVOY SOLUCIONES
Descripción y Preparación
La mayoría de los medios de cultivo se encuentran disponibles comercialmente
Caldo Selenito
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en materia fecal, orina y tejidos infectados,
incluída Salmonella Typhi, pero no sirve para Shigella.
El selenito inhibe el crecimiento de coliformes intestinales y enterococos, principalmente en
las primeras 6 a 12 horas de incubación.
No son inhibidos Salmonella, Proteus, Pseudomonas.
Los componentes del medio son: peptona o triptona 5.0 g, lactosa 4.0 g, selenito de sodio 4.0
g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 3.5 g, fosfato monopotásico (KH2PO4) 6.5 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada calentando hasta 60ºC si es necesario y esterilizar
por filtración. NO AUTOCLAVAR
Si se observa un color rojo ladrillo de selenito precipitado, el medio no se debe utilizar.
El material sólido se inocula directamente en el caldo, el material líquido se debe mezclar en
una relación 1:1 con caldo a doble concentración. Se incuba 24 horas a 37ºC. El pasaje a
medios selectivos se puede hacer al cabo de 6 a 12 horas.
Caldo Tetrationato
Es un caldo que se usa para el enriquecimiento selectivo de Salmonella, excepto para S.
Typhi, S. Pullorum y S. Gallinarum. El tetrationato junto con el tiosulfato inhibe los
coliformes, mientras que las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus
pueden crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los micoorganismos intestinales
acompañantes y el verde brillante inhibe la flora gram positiva.
Solución de verde brillante: se disuelve 0.1 g del colorante en 100 ml de agua destilada estéril.
Solución de iodo-ioduro de potasio: se disuelven en 16 g de yodo y 20 g de yoduro de potasio
en 80 ml de agua destilada estéril.
72
Los componentes del medio son: extracto de carne 0.9g, peptona 4.5 g, extracto de levadura
1.8 g, cloruro de sodio 4.5 g, carbonato de calcio 25.0 g, tiosulfato de sodio 40.7 g, sales
biliares 4.75 g, solución de verde brillante 1:1000 10 ml, solución de iodo-ioduro de potasio
20 ml. Se disuelven los componentes 1000 ml de agua destilada estéril con agitación. Se
agrega en forma aséptica la solución de verde brillante y luego la solución de iodo-ioduro de
potasio. Se ajusta el pH a 7.4-7.8 a 25ºC. El caldo se guarda en heladera. NO
AUTOCLAVAR. El caldo preparado y listo para usar debe ser utilizado el mismo día de su
preparación.
Caldo Flagelar
Es un caldo que se usa para la determinación de antígenos flagelares. Los componentes del
medio son: caldo tripticasa de soja 15.0 g, caldo triptosa 13.0 g. Disolver los componentes en
1000 ml de agua destilada con ebullición hasta disolución completa. Se fracciona en
volúmenes de 5 ml en tubos de 16x150 con tapa a rosca y se autoclava a 121ºC por 15
minutos.
Solución Salina
Se disuelve 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.0 y
autoclavar a 121ºC por 20 minutos.
Agar Movilidad (Swarm Agar)
Los componentes del medio son: extracto de levadura 1,0g, extracto de carne 5,0g, caldo
tripticasa de soja 30g, agar-agar de 5 a 10g dependiendo de la dureza deseada. Los
componentes se disuelven en 1000 ml de agua destilada calentando si es necesario. Se ajusta
el pH a 7.4 y se autoclava a 121ºC por 15 minutos.
Agar Nutritivo
Los componentes del medio son: extracto de carne 3.0 g, peptona 5.0 g, agar 12.0 a 18.0 g.
Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada con ebullición si es necesario,
autoclavar a 121ºC por 20 minutos, ajustar el pH a 7.0 luego de esterilizar.
73
Agar Mueller-Hinton
El medio contiene: extracto de carne 2.0 g, hidrolizado ácido de caseína 17.5 g, almidón 1.5 g,
agar 17.0. Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada calentando si fuera
necesario, ajustar el pH a 7.2-7.4 y autoclavar a 110ºC por 20 minutos.
Agar EMB
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias patógenas intestinales
Gram (-). El contenido de lactosa y sacarosa hace posible la diferenciación de Salmonella y
Shigella lac/sac (-), de la flora acompañante lac (-)/lac (+) (Proteus vulgaris, Citrobacter,
Aeromonas hydrophila). La combinación de colorantes es la que permite diferenciar entre los
fermentadores y no fermentadores de lactosa. La sacarosa se incluye porque algunos
coliformes la fermentan más rápido que a la lactosa.
El desarrollo de las bacterias Gram (+) está inhibido por los colorantes del medio (eosina
amarilla y azul de metileno).
Agar EMB Levine contiene solamente lactosa.
Los componentes del medio son: peptona 10.0 g, fosfato dipotásico (K2HPO4) 2.0 g, lactosa
5.0 g, sacarosa 5.0 g, eosina amarilla 0.4 g, azul de metileno 0.07 g. Disolver los componentes
en 1000 ml de agua destilada y autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
Aspecto de las colonias
Salmonella, Shigella transparentes, ámbar rosado
Escherichia violáceas con brillo metálico y centro negro azulado
Enterobacter, Klebsiella más grandes que las anteriores, mucosas sin brillo
metálico y centro oscuro.
Bacterias lac (+) negras o centro oscuro, halo transparente
Bacterias lac (+) o sac (-) incoloras
Agar MacConkey
Es un medio selectivo y diferencial para aislar microorganismos fermentadores y no
fermentadores de lactosa.
74
Sirve para aislar Salmonella, Shigella, y coliformes de materia fecal, orina, alimentos y aguas
residuales.
Es un medio de baja selectividad para usar con inóculos pequeños.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben microorganismos Gram (+). La presencia de
lactosa permite el desarrollo de las cepas lac (+) que se manifiesta por el viraje del indicador
debido a la producción de ácido; luego se absorbe el rojo neutro dando color rojo a la colonia
y un halo turbio por la precipitación de las sales biliares por la acidez del medio. Las bacterias
no fermentadoras de lactosa (S. Typhi, S. Paratyphi, Shigella dysentariae) no alteran el medio,
dando colonias incoloras y transparentes. Para detectar S. Typhi hay que usar medio
MacConkey con agar SS y agar bismuto sulfito.
Los componentes del medio son: peptona 1.7 g, proteosa-peptona 3.0 g, lactosa 10.0 g sales
biliares 1.5 g, rojo neutro 0.03 g, cristal violeta 0.001g, cloruro de sodio 5.0 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada, calentando si es necesario, ajustar a pH 7.1 y
esterilizar a 121ºC, durante 15 minutos.
Aspecto de las colonias
Salmonella, Shigella incoloras, medio amarillo
Escherichia rojas, halo turbio
Enterobacter, Klebsiella grandes, rosadas a rojo, mucosas
Proteus Incoloras
Agar SS
Es un medio selectivo para Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y
animales; pero no es el ideal para Sh. dysenteriae y Sh. boydii. Sirve también para Y.
enterocolitica y para diferenciar fermentadores de lactosa de los no fermentadores. La
presencia de verde brillante, bilis de buey, alta concentración de tiosulfato y el citrato inhiben
la flora acompañante. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de
sulfuro de hierro. La degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo
neutro a rojo.
75
Los componentes del medio son: extracto de carne 5.0 g, proteosa-peptona 5.0 g, lactosa 10.0
g, citrato de hierro amoniacal 1.0 g, tiosulfato de sodio 8.5 g, sales biliares 8.5 g, verde
brillante 0.003 g, rojo neutro 0.025 g, agar 13.5 g. Disolver los componentes en 1000 ml de
agua destilada calentando hasta disolución de los mismos. NO AUTOCLAVAR
Aspecto de las colonias
Salmonella incoloras, transparentes, centro negro
Shigella incoloras, transparentes, medio amarillo
Proteus transparentes, centro rojo, medio amarillo
Escherichia coli rosadas a rojo, medio rojo
Enterobacter aerogenes rosadas a crema, opacas, mucosas
Bacterias lactosa+ rojizas, mucoides, centro negro
Agar Hektoen
Es un medio selectivo para bacterias intestinales, incluídas algunas shigellas. No tiene efecto
inhibidor sobre Salmonella y Shigella pero si sobre flora acompañante. Debido a los dos
indicadores (azul de bromotimol y fucsina), las colonias lac+ tienen una diferencia cromática
con las colonias lac-; lo mismo ocurre con bacterias fermentadoras de sacarosa y salicina. El
tiosulfato con el hierro dan coloración negra a las colonias sulfídrico+. Las sales biliares
inhiben a la flora acompañante. Puede agregarse novobiocina para inhibir Citrobacter y
Proteus.
Los componentes del medio son: peptona 15.0 g, extracto de levadura 3.0 g, sacarosa 14.0 g,
lactosa 14.0 g, salicina 2.0 g, tiosulfato de sodio 5.0 g, citrato de hierro amoniacal 1.5 g, sales
biliares 2.0 g, azul de bromotimol 0.05 g, fucsina ácida 0.08 g, agar 13.5 g. Disolver los
componentes en 1000 ml de agua destilada estéril. NO AUTOCLAVAR.
Aspecto de las colonias
Shigella, Providencia verdes, planas, transparentes
Salmonella, Proteus verde-azuladas, c/s centro negro
Pseudomonas verde-azuladas, planas, borde irregular
Coliformes salmón, halo de precipitación
76
Agar Verde Brillante
Excelente medio de gran selectividad para el aislamiento de Salmonella a partir de materia
fecal; pero no puede usarse para aislar S. Typhi.
Los fermentadores de lactosa o sacarosa que pueden crecer en este medio se diferencian
rápidamente debido a la formación de colonias verde-amarillentas, rodeadas de una zona de
igual color. Esto se debe a la fermentación de los azúcares que produce acidez, haciendo virar
el indicador (rojo fenol) a amarillo. En medio alcalino se observa un color rojo intenso.
El verde brillante inhibe microorganismos Gram (+), S. Typhi y Shigella. Para inhibir Proteus
se recomienda agregar 0,2% de desoxicolato de sodio. La selectividad del medio permite usar
inóculos densos. Si se exceden los 15 minutos de esterilización a 121ºC, disminuye la
selectividad del medio.
Los componentes del medio son: proteosa-peptona 10.0 g, lactosa 10.0 g, sacarosa 10.0 g
extracto de levadura 3.0 g, rojo fenol 0.09 g, verde brillante 0.0047 g, agar 12.0 g. Disolver
los componentes en 1000 ml de agua destilada hasta ebullición y mantener por 1 minuto;
ajustar a pH 6.7-7.1. NO AUTOCLAVAR
Aspecto de las colonias
Salmonella a veces Proteus y Citrobacer rosa pálido, transparentes
E. coli, Enterobacter verde-amarillo
Klebsiella, Bacterias lactosa + opacas, halo verde-amarillo
Agar XLD
Es un medio de selectividad moderada a alta que permite ser usado con Salmonella y Shigella.
La degradación de xilosa, lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al
amarillo. El tiosulfato y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfídrico. La
decarboxilación de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura
por aumento del pH. El desoxicolato inhibe Gram (+). La diferenciación de
Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación de
xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfídrico. La xilosa diferencia Shigella de
77
Providencia que no fermenta xilosa o lo hace muy lentamente; la lisina diferencia Salmonella
de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en exceso evitan que los
coliformes lis+ reviertan la condición alcalina de los microorganismos consumidores rápidos
de xilosa/lisina. La producción de sulfídrico ocurre en condiciones alcalinas dando colonias
con centro negro; en condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe.
Los componentes del medio son: extracto de levadura 3.0 g, xilosa 3.75 g, lactosa 7.5 g,
sacarosa 7.5 g, l-lisina hidrocloruro 5.0 g, desoxicolato de sodio 1.0 g, tiosulfato de sodio 6.8
g, citrato de hierro amoniacal 0.8 g, rojo fenol 0.08 g,cloruro de sodio 5.0 g, agar 15.0 g.
Disolver los componentes en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta que comience a hervir
(no sobrecalentar); llevar a un baño de 50ºC siempre con agitación. Ajustar el pH a 7.4±0.2 a
25ºC. Guardar a 4ºC por 14 días, en la oscuridad.
El precipitado que ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede
eliminarse por filtración.
Aspecto de las colonias
E. coli, Enterobacter amarilla, opacas, con precipitado
Aeromonas amarilla, opacas, con precipitado
Klebsiella amarilla, opacas, mucosas, c/precipitado
Citrobacter amarilla, opacas, centro negro
Serrati, Hafnia amarilla, opacas
P. vulgaris, P. mirabilis amarilla, translúcidas, centro negro
Salmonella igual color del medio, centro negro
Shigella, Providencia igual color del medio, translúcidas
S. Typhi amarilla, ligeramente opacas
78
PLANILLA 1 – REGISTRO DE RESULTADOS:
AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp.
MORFOLOGIA EN PLACAS DE AGAR SELECTIVO
Fecha:
Nombre:
Muestra: ____________
Color Resultados Comentarios Morfología en MC
Morfología en SS
Morfología en XLD
De Selenito: Morfología en MC
Morfología en SS
79
PLANILLA 2 – REGISTRO DE REDULTADOS: AISLAMIENTO DE SALMONELLA spp. PRUEBAS BIOQUIMICAS
Fecha:
Nombre:
Muestra:
Color Resultados Comentarios
TSI Botón
TSI Estría
TSI Gas
TSI H2S
LIA Botón
LIA Estría
LIA H2S
Hidrólisis de urea
Lisina decarboxilasa
Ornitina decarboxilasa
Arnina dehidrolasa
Reacción deβ-galactosidasa
Reacción de Voges-Proskauer
Reacción de indol
Agar SIM (H2S)
Agar SIM (Indol)
Agar SIM (Movilidad)
Fermentación de Dulcita
Utilización del Molonato
Resultado general: _______________________________________
80
PLANILLA 3 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION SOMATICA DE CEPAS DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
OSA OMB OMC OMD OME OMF Control
OSA 1,2,12 4,5,12 9,12 9,46 3,10 3,15 1,3,19 21
OSB 6,7,8 6,7 6,8 13,22 13,23 6,14,24 6,14 8,20 11
OSC 16 17 18 28 30
OSD 35 38 39 40 41 42 43 44 45
OSE 47 48 50 51 52
OSF
81
PLANILLA 4 – REGISTRO DE RESULTADOS: SEROTIPIFICACION FLAGELAR DE CEPAS DE SALMONELLA spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ______________
HSA HSB HSC HS1 Control
HSA a B c d i z10 Z29
HSB e,h e,n,x e,n,z15 f.g g,m g,p m,t
HSC k l,v l,w r y Z z4,z23
HS1 1,2 1,5 1,6 1,7 z6
HSA HSB HSC HSD HS1 Control
HSA a b c d i z10 z29
HSB e,h E,n,x e,n,z15 f.g g,m g,p m,t
HSC k l,v l,w r y Z z4,z23
HS1 1,2 1,5 1,6 1,7 z6
82
Planilla - Registro de Resultados: Serotipificación de cepas de Salmonella spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
Antígeno O A-67 A-I Gr. A Gr. B Gr. C Gr. D Gr. E
Gr. A O:1 O:2 O:12
Gr. B O:1 O:4 O:5 O:12 O:27
Gr. C O:6 O:7 O:8 O:14 O:20
Gr. D O:1 O:9 O:12 O:46
Gr. E O:1 O:10 O:15 O:19 O:34
Antígeno H H:H(a-z) H:L H:G H: no específico
H:L H:lv H:v H:w H:z13 H:z28
H:G H:f H:g H:s H:t H:m H:p H:q
H: no específico H:2 H:5 H:6 H:7 H:z6
Gr. B H:a H:b H:c H:d H:eh H:i
Gr. C H:a H:b H:c H:eh H:r
H:h H:x H:z15 H:z23 H:z24 H:z32
Fórmula Antigéncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________
83
Planilla - Registro de Resultados: Serotipificación de cepas de Salmonella spp.
Fecha:
Nombre:
Muestra: ________________
O:5 O:9 O:10 O:15 O:19 O:27 O:34 O:46
O:7 O:8 O:20 O:22 O:23
H:h H:x H:z15 H:m H:p H:s H:t H:f H:q H:u
H:v H:w H:z23 H:z24 H:z32 H:z13 H:z28
H:2 H:5 H:6 H:7
Fórmula Antigéncia: ___________________________ Serovariedad: _____________________
