Aislamiento de nuevos genes de resistencia en patata ... · NEIKER Instituto Vasco de...

NEIKERInstituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario

Nekazal Ikerketa eta Garapenarako Euskal Erakundea

Aislamiento de nuevos genes de resistencia en patata frente a Phytophtora infenstans y Globodera pallida.

Castañón, S.; Lucca, F.; Urreta, I; Oyanguren, I.; Bagazgoitia, E.; Herrán, A.; Ruiz de Galarreta, J. I. and Ritter, E.

Proyecto financiado por la Unión Europea PL ICA4-1999-30052



- Se conocen setenta especies de nemátodos que afectan al cultivo. Los más dañinos son los formadores de quistes como Globodera pallida(Stone) Behrens.- Las plantas de patata atacadas por el nemátodo presentan crecimiento y rendimiento reducidos y, a veces, en suelos muy infestados, el follaje presenta un ligero amarillamiento.- La manera más común de luchar contra estos patógenos consiste en utilizar cultivares de patata resistentes. Hasta el presente no existen muchos cultivares resistentes a los nemátodos debido a su carácter poligénico.

PATÓGENOS

- El Mildiu de la patata es la enfermedad más importante de este cultivo, atacando especialmente en condiciones de humedad, durante el desarrollo de la planta y en el periodo de almacenamiento del tubérculo.- Las patatas atacadas presentan manchas blancas en la piel que acaban por meterse en la carne del tubérculo contagiando a los sanos durante el almacenamiento.- La lucha contra el hongo se lleva a cabo mediante la aplicación de grandes cantidades de fungicidas, lo que ocasiona un aumento considerable en los costes de producción y provoca daños medioambientales debidos a la toxicidad de los mismos mientras se favorece la aparición de nuevas variedades resistentes.

Globodera pallida Phytophtora infestans



MATERIAL VEGETAL

1- BRACHISTOTRICHUM BST79862- BULBOCASTANUM BLB 80083- PHUREJA PHU484- PINNATISECTUM PNT38635- PINNATISECTUM PNT 81756- POLYADENIUM PLD 81827- POLYTRICHON PLT 536508- PAPITA PTA154429- DODDSII DDS2880

10- GOURLAYI GRL 718011- LEPTOPHYES LPH 2721512- MARINASENSE MRN 227813- PASCOENSE PCS 287714- TARIJENSE TAR 2471715- VENTURII VNT 823916- YUNGASENSE YUN 2173

AP24

Snakin

Gro1 y R7 (RGL)

Gpa2 y Rx

GlucanasasQuitinasas

Osmotinas

GENES CANDIDATOS

2- BULBOCASTANUM BLB 80083- PHUREJA PHU484- PINNATISECTUM PNT38635- PINNATISECTUM PNT 81756- POLYADENIUM PLD 81827- POLYTRICHON PLT 53650

1- BRACHISTOTRICHUM BST7986

8- PAPITA PTA15442

12- MARINASENSE MRN 2278

9- DODDSII DDS288010- GOURLAYI GRL 718011- LEPTOPHYES LPH 27215

13- PASCOENSE PCS 287714- TARIJENSE TAR 2471715- VENTURII VNT 823916- YUNGASENSE YUN 2173

CEBADORES DEGENERADOS

Dendograma filogenético de las 1,3-β-glucanasas descritas en diferentes organismos. El análisis de homología se realizó mediante ClustalW. En rojo aparecen las secuencias utilizadas para la creación de cebadores degenerados.

GLUCANASAS

Olea europaeaCoffea arabicaOryza sativaSinorhizobium melilotiLycopersicon esculentumSolanum tuberosumSolanum tuberosumArabidopsis thalianaBacillus thuringiensisCamellia sinensisPrunus persicaVitis viniferaPisum sativumHordeum vulgareNicotiana tabaccum

Citrus sinensisVitis vinifera

Saccharomyces cerevisiaeBrassica rapa

Citrus jambhiriGlycine soja

Glycine sojaAvena sativa

Solanum tuberosumHordeum vulgare

Avena sativa

Solanum tuberosumZea mays




U01900U01901U01902AF067863S26241AAA63540

GLUCANASAS

AF067863

------------------ATGGCTACCACACAAATAGCTGTTATCGTGCTTCTAGGATTACT---TGTTGCCACCAATATTCACATAACAGAG

ATGTCTACCTCAGATAAACATAATACTCCTCAAATGGCTGCTATCACACTGCTAGGATTACTACTTGTTGCCAGCACCATTGAGATAGCAGGGM60403

------------------ATGGCTACCTCACAAATAGCTGTTATCGTGCTTCTAGGATTACT---TGTTGCCACCAACATTCACATTACAGAGU01901




Snakin 14 15 16 14 15 16 14 15 16

Control (DNA) H N

AP24

1114900692

501-489404320

bp1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17

RT-PCR

PLANTAS INFECTADAS

PLANTAS CONTROL

RNA Control RNA muestra

cDNA Control cDNA muestra

P. Infestans24 h

G. pallida48 h

PCR

RT RT



RT-PCR Glucanasas y AP24

Resistentes a Phytophtora infectans Resistentes a Globodera pallidaESPECIES SILVESTRES BLB PHU

48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN 2173

Glucanasa (700 pb- 591 pb)Control R1 + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +

R2 + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +R3 + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +C + - + + + - + - + + + + + - + + + + + + + + + - + - + + + + + +

Infección con P. infestans R1 + - + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +R2 + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +R3 + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +C + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + + - + - + + + - + +

Infección con G. pallida R1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +C + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + + + - + +


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN 2173

AP24 (700 pb)Control R1 - - - - - + - - - - + - - + - -

R2 - + - - + + + - + + + + + + + +R3 - + - - + + + - + - + + + + + +C - + - - + + + - + - + + + + + +

Infección con P. infestans R1 - + + + + - + + - - + - + + + -R2 + + + + + + + + + + + + + + + -R3 + + + + + + + + + + + + + + + -C + + + + + + + + + + + + + + + -

Infección con G. pallida R1 - + + + + + + + - + + + + + + -R2 + + + + + + - - + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +



RT-PCR Snakin y Osmotina


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN 2173

Snakin (295 pb)Control R1 + + + + + + + + - + + + + + + -

R2 - + + + + + + + - + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + - + + + + + + +

Infección con P. infestans R1 - + + + + + + + + + + - + + + -R2 - + + + + + + + + + - + + + - +R3 - + + + + + + + + + + + + + - +C - + + + + + + + + + + + + + - +

Infección con G. pallida R1 - + + + + + + + + + + + + + + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN 2173

Osmotine (765 pb)Control R1 + + + + + + + + + + + + + + + +

R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +

Infección con P. infestans R1 + + + + + + + + + + + + + + + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +

Infección con G. pallida R1 + + + + + + + + + + + + + + + +R2 + + + + + + + + + + + + + + + +R3 + + + + + + + + + + + + + + + +C + + + + + + + + + + + + + + + +


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN2173

Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +

R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +

Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +

Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN2173

Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +

R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +

Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +

Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN2173


48PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN2173

Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +Gpa2 y Rx (800 pb-763 pb)Control R1 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +

R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +R2 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + + + - + - + + + + + + +R3 - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +C - + - + - + - + - + - + - - + + - - - + - + - + - + + + + + + +

Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +Infección conP. infestans R1 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - +R2 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +R3 - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +

- + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +C - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + + - + - + + + + + - +

Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +Infección con G. pallida R1 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R2 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + +R3 - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + +C - + - + - + - + - + - + - + + + + + - + + + - + + + - + - + + ++ - + - + + +



RT-PCR PGR y RGL

Resistente a Phytophtora infectans Resistente a Globodera pallida

ESPECIES SILVESTRES BLB PHU48

PNT3863

PNT8175

PLD8182

PLT53650

BST7986

PTA15442

MRN2278

DDS2880

GRL7180

LPH27215

PCS2877

TAR24717

VNT8239

YUN 2173

RGL I (600 pb)Control R1 s s s s - + s s s s + s s + + s

R2 s s s s - + s s s s + s s + + sR3 s s s s - + s s s s + s s + + sC s s s s - + s s s s + s s + + s

Infección con P. infestans R1 s s s s + + s s s s + s s + + sR2 s s s s + + s s s s + s s + + sR3 s s s s + + s s s s + s s + + sC s s s s + + s s s s + s s + + s

Infección con G. pallida R1 s s s s + + s s s s + s s + + sR2 s s s s + + s s s s + s s + + sR3 s s s s + + s s s s + s s + + sC s s s s + + s s s s + s s + + s



RT-PCR

HOMOLOGIA E-valueGlucanasa (S. tuberosum) 1e-66

Glucanasa (P. sativum) 1e-33

Glucanasa (N. tabaccum) 2e-54

Glucanasa (L. esculentum) 3e-64

Glucanasa (Vitis vinifera) 5e-28

Cebadores Glu1 y Glu2

GLUCANASAS

Cebadores PGR1 y PGR2

HOMOLOGIA E-valuePGR

Cebadores Pat S2 y Pat as2

HOMOLOGIA E-value

Monoxigenasa P-450 (Z. mays) 3e-04

Monoxigenasa P-450 (N. tabaccum) 8e-05

RGLIIIDRP (A. thaliana) 2e-08

RPS2 (A. thaliana) 2e-08

AP24

PGR



SEGREGACIÓN Y MAPEO

Snakin

Glucanasa

Población SH x RH (UHD)

Mapa UHDC-I C-IV

PLANTAS INFECTADAS

PLANTAS CONTROL

RNA Control RNA muestra

cDNAds Control cDNAds muestra

P. Infestans24 h

G. pallida48 h

AFLP



cDNA-AFLP

C N C N C N C N C N C N C N C N

Ase CAT Ase CGT

Taq GAC Taq GTA Taq GTG Taq GGC Taq GAC Taq GTA Taq GTG Taq GGC

C- Planta controlN-Planta infectada con nemátodo

Secuenciación

Análisis homología Diseño de cebadores específicos

Extracción del fragmento diferencial directamente del gel



cDNA-AFLP

Nª Gen Pb Especie Tipo Homologia E-value4 SCER4-BST 97 BST cDNA-AFLP No homologa5 SCER5-BST 137 BST cDNA-AFLP No homologa6 SCER7-BST 145 BST cDNA-AFLP Supuesta proteína de resistencia 0.687 SCER16-BST 82 BST cDNA-AFLP No homologa8 SCER17-BST 114 BST cDNA-AFLP No homologa9 SCER20-BST 83 BST cDNA-AFLP Maiz mRNA 0,38

A. thaliana: Transportador deamonio 0.59

10 SCER21-BST 103 BST cDNA-AFLP A. thaliana: proteína hipotética 0,007A. thaliana: región rica en Leu 0,007A. thaliana: proteina kinasa 0,015

11 SCER23-BST 92 BST cDNA-AFLP Helicobacter rRNA 0,02712 SCER24-BST 154 BST cDNA-AFLP Tabaco: ATPasa I 3e-1513 SCER25-BST 230 BST cDNA-AFLP Tabaco: DNA Cloroplasto 5e-72

No Fragmento pb Especie Tipo Homologia E-value

14 SCER9-BST 75 BST cDNA-AFLP Caernorhaditis elegans 0.5215 SCER12-BST 91 BST cDNA-AFLP Arroz: cromosoma 4 0.05

Región rica en glutamato 0,08316 SCERVx1 217 BST cDNA-AFLP Cloroplasto DNA 0,09717 SCERVx14 323 BST cDNA-AFLP Región rica en Leu 0.0031

P. infestans

G. pallida



ANÁLISIS DE GRUPOS SEGREGANTES (BSA)

RSApertura del Bulk

Resistentes SusceptiblesExtracción del fragmento diferencial directamente del gel

Secuenciación

Análisis homología Diseño de cebadores específicos



No Gen Pb Especie Tipo Homología E-value1 M87 700 AFLP 284 S.cmm AFLP-BSA No homología2 M70b 700 AFLPFL-1 187 S cmm AFLP-BSA *84% EST-Set of cDNA

microarrays*Cf-2

7e-22

6e-373 M85S 800 AFLP 208 S cmm AFLP-BSA No homología4 M87 700 AFLP 127 S cmm AFLP-BSA *98% EST-Set of cDNA

microarrays*A. thaliana putativeglucosyltransferase protein

1e-34

2e-06

5 M88 800 AFLP 160 S cmm AFLP-BSA No homología

ANÁLISIS DE GRUPOS SEGREGANTES (BSA)



MICROARRAYS

P. infestansControl

TC53628: leucine-rich repeat protein LRP - tomatoTC54362: Homeobox-leucine zipper protein ATHB-7 (HD-ZIP protein ATHB-7).TC53312: class I patatin - potatoTC53957: leucine-rich repeat transmembrane protein kinase 1 putative

CDNA aplificados diferencialmente

CDNA aplificados diferencialmenteTC41389: pathogen-inducible alpha-dioxygenase {NicotianaTC57021: calcium/calmodulin-dependent protein kinase CaMK1TC51558: tubulin beta-2 chain - riceTC49809: xyloglucan endotransglycosylase LeXET2 {LycopersiconTC53628: leucine-rich repeat protein LRP - tomatoTC53591: putative cell division related protein; 50012-47994TC46053: leucine-rich repeat resistance protein-like protein

G. pallida vs. control.

P. infestans vs. control.

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