Prctica No

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Prctica # 1.

Aislamiento de Bacterias Amilolticas y Produccin de Amilasas.

Laboratorio de Biosntesis Microbianas 1938.

Febrero-Mayo de 2010. Semestre 2010/2Objetivos Generales:

Aprender y aplicar tcnicas de Microbiologa bsicas, que se utilizan en la manipulacin de microorganismos.

Desarrollar la tcnica de screening primario y secundario para el aislamiento de bacterias degradadoras de almidn.

Determinar la actividad enzimtica de las amilasas cualitativamente.

PRIMERA SESION (viernes 26 de febrero)ELABORACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS ESPECFICOS

Aprender el concepto de esterilizacin y su utilidad en Microbiologa.

Conocer las principales formas de preparar el material para esterilizacin.

Comprender el concepto de medio de cultivo en Microbiologa y Biosntesis, as como su clasificacin y validacin.

Manejar los conceptos de trabajo en rea estril, manejo asptico del material, conservacin de la esterilidad.

MATERIAL Y REACTIVOS

1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml1 Probeta de 100 ml

2 Pipeta de 10 ml.1 Esptula

2 Pipetas de 1 ml.1 Vidrio de reloj

1 Varilla en L1 Balanza granataria

1 Mechero2 Tubos de 22X100 con tapn de rosca

1 Tripi14 Tubos de 16X150.

1 Base para mechero1 embudo de vidrio

MEDIO DE CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

Composicing/L

Extracto de levadura3.0

NaCl5.0

Almidn soluble10.0

Agar15.0

Agua destilada cbp.1000 mL

pH7.0 + 0.2

METODOLOGIA

a) Preparacin del material

1. Verificar el material para verificar su estado.

2. Lavar el material de vidrio, enjuagar y dejar sacar al aire.

2. Preparar el material con algodn y papel para su esterilizacin, en el caso de las pipetas serolgicas.

b) Preparacin de los medios de cultivo.

1. Verificar que se encuentren todos los reactivos para preparar el medio de enriquecimiento.

2. De acuerdo a la composicin de medio de enriquecimiento realizar los clculos para preparar 80 ml de este medio (7 ml para 4 tubos de 16X150mm y 20 ml para los tubos de 22X100)

3. Adicionar 40 ml de agua destilada a un matraz erlenmeyer.

4. Pesar lo ms rpido posible los reactivos y colocarlos en el matraz Erlenmeyer.

5. Adicionar el volumen restante de agua destilada. Agitar para disolver.6. Colocarle un tapn de algodn.

7. Calentar el medio hasta ebullicin para que se disuelva el agar, el medio tiene que pasar de turbio a translucido.

8. Con la ayuda de un embudo de vidrio distribuir en los tubos tal y como se indica en el punto 2.

9. Colocarles un tapn de algodn a los tubos que lo requieran10. Mandar esterilizar los tubos y las pipetas envueltas en autoclave a 121C, durante 15min.

12. Al trmino de la esterilizacin se inclinan los tubos para forma un pico de flauta

13. Hacer la prueba de esterilidad incubando los medios, hasta la siguiente sesin.

14. Las pipetas se guardan en las gavetas.

SEGUNDA SESION (viernes 5 de marzo)

TCNICAS DE SIEMBRA

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Realizar algunas tcnicas de siembra que se utilizan para cultivar microorganismos y comprender la utilidad y propsitos de cada una.

-Comprender el concepto de promocin del desarrollo microbiano.

MATERIAL Y REACTIVOS

2 Mecheros2 Asas bacteriolgicas

1 Gradilla1 Vaso de precipitados de 250 ml

1 Tripi y charola de metal

MEDIOS DE CULTIVO

4 Tubos de 16X150mm con caldo nutritivo y 8 Cajas Petri.

Diferencial (agar almidn)

Composicing/L

Peptona de carne5.0

Extracto de levadura3.0

NaCl5.0

Almidn soluble10.0

Agua destilada cbp.1000 mL

pH7.0 + 0.2

MATERIAL BIOLGICO. Muestras de tierra o alimentos como elote y tubrculos con alto contenido de almidones (papas, camote) sin lavar. Agua de la llave

METODOLOGA

a) Generar rea asptica.

1.- Limpiar la mesa de trabajo.

2.- Aplicar solucin desinfectante en la mesa de trabajo y dejar secar.

3. Colocar medios de cultivos y el material necesario para sembrar, como: asas bacteriolgicas, pipetas estriles, etc.

b) Hervir el agua

1. Colocar en el vaso de precipitados aproximadamente el equivalente a dos cucharadas de material biolgico y 100 mL de agua de la llave.

2. Calentar a ebullicin durante 10 minutos y dejar asentar la tierra presente en la muestra.

c) Tcnicas de siembra.

Inoculacin con asa bacteriolgica en cajas Petri.

1. Esterilizar al rojo vivo el asa.

2. Dejar enfriar.

3. Tomar de la muestra de tierra hervida una asada.

Agotamiento de asa.

Colocar la muestra que se tom, en la caja Petri, realizar un estriado continuo de izquierda a derecha, sin levantar el asa ni repetir el estriado

Siembra masiva. Con la pipeta estril, colocar 1 ml de agua donde se hirvi la tierra. Destapar la varilla de su envoltura y distribuir la muestra en toda la superficie de la caja.

Cuadrante simple.

Dividir el fondo de la caja en cuatro cuadrantes. Esterilizar el asa, Tomar la muestra y depositarla en un cuadrante de la caja, sin esterilizar el asa se pasa al segundo cuadrante y as hasta terminar, evitar tocar los cuadrantes ni lateralmente ni en el centro.

Cuadrante radial. 1. Tomar el inculo y estriar en un segmento, se esteriliza el asa y se arrastra del primero al segundo, se esteriliza el asa y se arrastra del segundo al tercero, se esteriliza el asa y se arrastra del tercero al cuarto y el cuarto termina con un estra ondulada al centro, no deben tocarse la primera y la ltima estra.

Inoculacin con asa bacteriolgica en tubos inclinados.

1. Esterilizar el asa.

2. Tomar una muestra de la tierra hervida.

3. Inocular los tubos con agar inclinado (pico de flauta) colocando la muestra hasta el fondo,

Inoculacin por estra ondulada se va moviendo de lado a lado mientras se sube el asa (realizar en un tubo de 16150 y en uno de 22x170).

Inoculacin por estra recta se desliza el asa hacia arriba en forma recta asa (realizar en un tubo de 16150 y en uno de 22x170).

Inoculacin con asa bacteriolgica en medios lquidos.

1. Esterilizar el asa.

2. Tomar muestra de la tierra hervida.

3. Inocular en un tubo de 16X150 mm que contiene caldo nutritivo, (sumergiendo el asa con la muestra, casi al fondo del tubo. Agitar el medio lquido

Incubar las cajas Petri y los tubos en la gaveta y el lunes refrigerarlas hasta la siguiente sesin.

TERCERA SESION (viernes 12 de marzo) MORFOLOGA MACROSCPICA Y MICROSCPICATincin Diferencial de Gram

PRIMER AISLAMIENTO

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Identificar algunas caractersticas culturales macroscpicas y microscpicas de los microorganismos y la importancia que tienen en Biosntesis.

Realizar algunas de las preparaciones y tinciones ms utilizadas en Microbiologa.

Seleccionar una colonia de acuerdo a las caractersticas macro y microscpicas para realizar el primer aislamiento para el aislamiento de bacterias degradadoras de almidn.

MATERIA Y REACTIVOS

2 Microscopios2 Gradillas

2 Mecheros2 Asas bacteriolgicas

2 Bulbos de goma2 Pipetas Pasteur

Colorantes de GramAzul de metileno

Rojo de metilo

MEDIOS DE CULTIVO

2 Tubos de 13X100 mm con agua destilada estril.

8 Cajas Petri con agar almidn

Medio Diferencial (agar almidn)

Composicing/L

Peptona de carne5.0

Extracto de levadura3.0

NaCl5.0

Almidn soluble10.0

Agua destilada cbp.1000 mL

pH7.0 + 0.2

MUESTRAS BIOLGICAS. Cultivos de la sesin pasada, Bacillus subtilis y Serratia marcescens

METODOLOGA

Generar rea asptica.

1.- Limpiar con solucin desinfectante la mesa de trabajo y dejar secar.

2. Colocar medios de cultivos y el material necesario para sembrar, como: asas bacteriolgicas, pipetas estriles, etc.

Morfologa macroscpica y microscpica

1. Observar las cajas Petri inoculados la sesin pasada, de acuerdo a las instrucciones de los profesores.

2. Observar los tubos inoculados la sesin pasada, de acuerdo a las instrucciones de los profesores.

Tincin Diferencial de Gram (esta tincin se realizar con los microorganismos problema y las muestras control)1. Elegir las cajas petri que contengan colonias (crecimiento microbiano) aisladas

2. En un portaobjetos colocar una pequea gota de agua

3. Con ayuda del asa estril tomar una pequea muestra de una colonia aislada 4. Mezclar la muestra con el agua y hacer el extendido (frotis)

5. Dejar secar al aire.

6. Tomarlo por un extremo con pinzas.

7. Pasar por el mechero 4 5 veces para fijar con calor.

8. Cubrir el frotis con el cristal violeta (colorante primario) y dejar actuar por un minuto.

9. Eliminar el exceso y lavar con agua.10. Agregar el lugol, dejar actuar por un minuto.

11. Eliminar el exceso y lavar con agua. 12. Decolorar con 5 a 10 gotas de la solucin de alcohol-acetona.

13. Parar la decoloracin lavando con agua.

14. Aadir la safranina (colorante de contraste) y dejar actuar por un minuto.

15. Eliminar el exceso y lavar con agua, dejar secar la preparacin.

16. Observar con el objetivo de 100X. No olvidar utilizar aceite de inmersin y reportarPrimer aislamiento

2 cajas con agar almidn

Asa bacteriolgica

Mechero

1. Esterilizar el asa bacteriolgica.

2. Tomar una asada de la colonia aislada de donde se realiz la tincin de Gram y resuspenderla en un tubo de solucin salina estril (SSI)3. Inocular dos cajas Petri con medio de agar almidn (medio diferencial), utilizando la tcnica de cuadrante radial4. Cada miembro del equipo debe de tomar dos collonias y sembrar en dos cajas petri.

Alumno 1

Alumno 25. Incubar a temperatura ambiente durante 72 horas.

Segundo aislamiento, extraclase (lunes 15 de marzo):

Cajas con agar almidnAsa bacteriolgica.

Mechero

METODOLOGIA

1. Seleccionar dos colonias aisladas, (dos colonias por alumno) que tengan buen crecimiento y que el medio a su alrededor parezca ligeramente translucido.

2. Aislar por cuadrante radial una caja. Incubar a temperatura ambiente hasta la siguiente sesin.

CUARTA SESION (viernes 19 de marzo):Tercer aislamiento

Seleccion de cepa amilolitica silvestre

OBJETIVOS especificos

Continuar con la tcnica de screening secundario para el aislamiento de bacterias capaces de degradar el almidn.

Seleccionar una cepa silvestre amiloltica y que produzca esporas.

Material

2 mecheros1 tripi

2 asas bacteriolgicas1 charola de metal

1 microscopio1 vaso de pp de 250 mL

1 gradilla1 juego de colorantes de Gram

1 frasco con verde de malaquita al 5%1 frasco con safranina 0.5%

Papel filtro

MEDIOS DE CULTIVO. 2 Cajas con agar almidn. METODOLOGIA

1. Seleccionar de entre las colonias aisladas en cada caja del aislamiento anterior aquella que macroscpicamente se observe pura y se encuentre ms separada del resto de las colonias adems de que se observe un halo de hidrlisis a su alrededor.

2. Marcar la colonia seleccionada con nmero en el reverso de la caja.

3. A partir de cada colonia inocular por estra radial, por duplicado, en cajas Petri con medio diferencial y hacer dos frotis.

4. Incubar las cajas a 37C.

5. Teir uno de los frotis con una tincin de Gram y el otro con una tincin de esporas.

6. Revelar con lugol alrededor de la colonia seleccionada.

7. Observar los frotis.

8. Realizar un cuadro con las caractersticas observadas en las colonias:

ColoniaMorfologa macroscpicaTincin de GramTincin de esporasDegradacin del almidn

1

2

3

4

Tincin Selectiva de espora (esta tincin se realizar con los microorganismos problema y las muestras control)

1. Elegir las cajas petri que contengan colonias (crecimiento microbiano) aisladas

2. En un portaobjetos colocar una pequea gota de agua

3. Con ayuda del asa estril tomar una pequea muestra de una colonia aislada

4. Mezclar la muestra con el agua y hacer el extendido (frotis)

5. Dejar secar al aire.

6. Poner a calentar agua en el vaso de precipitados (1/2 vaso de agua) cuando el agua suelte vapores colocar el portaobjetos con el frotis en los bordes superiores del vaso.

7. Colocar un papel filtro sobre el frotis e impregnarlo del colorante verde de malaquita, mantener hmedo el papel filtro con el colorante durante 10 minutos.

8. Transcurrido el tiempo retirar el papel filtro y lavar con agua.

9. Eliminar el exceso de agua.

10. Aadir la safranina al 0.5 % (colorante de contraste) y dejar actuar por un minuto.

11. Eliminar el exceso, lavar con agua y dejar secar la preparacin.

12. Observar con el objetivo de 100X. No olvidar utilizar aceite de inmersin y reportar

QUINTA SESION (Viernes 26 demarzo)

Exposicin de resultados, discusin y conclusiones.3

2

1

4

1 ml de muestra