AI2 3.30

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Investigación Bibliográfica

Aplicaciones de la Cromatografía de Capa Fina 1. Título de articulo

Metabolitos secundarios en losextractos secos de Passiflora incarnata L., Matricaria

recutita L.y Morinda citrifolia L.

2. Resumen (no mayor de 10 líneas)

Para la determinación de metabolitos secundarios en los extractos secos de Passiflora incarnata L.,Matricaria recutita L. y Morinda citrifolia L, se emplea la técnica cromatografía de capa fina con elobjetivo de identificar sus principios activos utilizados en la elaboración de productos farmacéuticos

para la cura de enfermedades. Los extractos se prepararon a partir de extractos fluidos con materialvegetal seco utilizando como fase estacionaria silica gel y diferentes fases móviles y reveladores paraobtención positiva de diferentes metabolitos. Identificándose flavonoides en P. incarnata, compuestosantraquinónicos y terpenos en M. citrifolia, y cumarinas en M. recutita se, entre otros compuestos quecoinciden con los reportados en la literatura para cada especie.

3. Identificación de:

a. Fase estacionaria

Silica gel

b. Fase móvil:

Componentes Fases móviles

Aceites esenciales yterpenos

Tolueno: acetato de etilo (95:5)

Flavonoides Tolueno: acetato de etilo:acetona:ácido fórmico (5:2:2:1);cloroformo:metanol:amoniaco concentrado (4:1:0.1); acetatode etilo:metanol:agua (10:1.5:1); acetato de etilo:ácidoacético:ácido fórmico:agua (10:1:1:2)

Glicósidosterpenoides Cloroformo:metanol:amoniaco concentrado (4:1:0.1); n-

butanol:etanol:amoniaco concentrado:agua (7:2:2:3)

Aminoácidos y aminas n-propanol:acetato de etilo:agua:ácido acético (4:3:2:1)

Azúcar y oligosacáridos n-propanol:acetato de etilo:agua:ácido acético (4:3:2:1)

Alcaloides Cloroformo:metanol:amoniaco concentrado(4:1:0.1)

Compuestosantraquinónicos ycoumarinas

Acetato de etilo:metanol:agua (10:1.5:1)



c. Tipo de cromatografía según relaciones de polaridad (normal o reversa):

Normal

d. Tipo de elución (en gradiente o isocratica):

Elución isocratica ya que se utilizan uno o varios solventes en adelante y su composición es

constante.

e. Técnica de detección o revelado:

Componentes ReveladoresAceites esenciales y terpenos Anisaldehído-ácido sulfúrico.

Flavonoides Solución de ácido bórico 10 % y solución de ácido oxálico10 % (2:1)

Glicósidosterpenoides Anisaldehído-ácido sulfúrico

Aminoácidos y aminas Ninhidrina

Azúcar y oligosacáridos -naphtol-ácido sulfúrico

Alcaloides Dragendorff y solución de ácido sulfúrico10 %

Compuestos antraquinónicos ycoumarinas

Solución etanólica de KOH 10 %; Solución de ácido bórico10 % y solución de ácido oxálico 10 % (2:1)

f. Tipo de analitos:

Flavonoides, aminoácidos, aminas, azúcares y oligosacaridos en los 3 extractos secos estudiados.

En el de M. citrifolia se observó además la presencia de compuestos antraquinónicos y terpenos,

mientras que en M. recutita se identificó la presencia de cumarinas.

g. Tipo de muestra:

Extractos secos de Passiflora incarnata L. (pasiflora), Matricaria recutita L. (manzanilla) y

Morinda citrifolia L. (noni).

4. Explicación breve del orden de elución de los analitos

Depende la polaridad de los metabolitos. Los metabolitos más apolares se desplazaran más en la

fase estacionaria (mayor distancia o recorrido) y metabolitos polares quedaran retenidos, se

desplazarán menos en la fase estacionaria ya que el método cromatografico utilizado es la capa



fina y esta solo se puede realizar en fase normal lo que indica que nuestra fase estacionaria va a

ser polar.

5. Comentario acerca de la selección de condiciones de análisis (fase estacionaria, fase móvil, flujo,

gradiente de solventes, gradiente de temperatura, tipo de detección, etc.)

Se utilizó como fase estacionaria silica gel y diferentes fases móviles para obtener la máxima separación

de cada metabolito analizado, el flujo se desplaza según la diferencia de polaridad con la fase

estacionaria, la elución es isocratica ya que se utilizó una fase móvil para cada metabolito en diferentes

placas, y la detección de los metabolitos se llevó a cabo por medio de reveladores.

6. Copia del Artículo.

Revista Cubana de Plantas Medicinalesversión On-line ISSN 1028-4796

Rev Cubana Plant Med v.14 n.2 Ciudad de la Habana abr.-jun. 2009

ARTÍCULO ORIGINAL

Metabolitos secundarios en losextractos secosde Passiflora incarnata L., Matricaria recutita L.y

Morinda citrifolia L.

Secondary metabolites in Passiflora incarnate

L. ,Matricaria recutita L. and Morinda citrifolia L. dryextracts

Caridad M. García PeñaI; Nguyen Kim BichII; Nguyen Bich ThuIII;Juana Tillan CapoIV; Jacqueline Aylema Romero DíazV; Orestes DaríoLópezVI; Viviana Fuste MorenoVII

I Máster en Tecnología y Control de Medicamentos. InvestigadoraAgregada. Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos(CIDEM). Ciudad de La Habana, Cuba.II Licenciada en Química. Investigadora. Instituto de Materia Médica.Viet Nam.

III Doctora en Ciencias. Investigadora. Instituto de Materia Médica. VietNam.IV Doctora en Ciencias Veterinarias. Investigadora Auxiliar. CIDEM.Ciudad de La Habana, Cuba.V Licenciada en Bioquímica. Investigador Aspirante. CIDEM. Ciudad deLa Habana, Cuba.VI Máster en Ingeniería de los Procesos Biotecnológicos. IngenieroQuímico. Investigador Agregado. CIDEM. Ciudad de La Habana, Cuba.



VII Técnica en Tecnología Farmacéutica. CIDEM. Ciudad de La Habana,Cuba.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: resulta de interés establecer una tecnología propiapara la elaboración y el establecimiento de especificaciones de calidad endiversas formulaciones sólidas de extractos secos de Passiflor a inc arnata L. (pasiflora), M at ric ari a recut i ta L. (manzanilla) y Morind a ci t rifoli a L.(noni).OBJETIVOS: realizar los estudios fitoquímicos y analizar parámetros decontrol de calidad de los extractos secos de Passiflor a inc arnata L., M at ric ari a recut i ta L. y Morind a ci t rifoli a L.MÉTODOS: para el estudio fitoquímico por cromatografía en capadelgada se emplearon técnicas simples, rápidas, selectivas y conequipamiento mínimo para determinados compuestos. Para el análisis de

los parámetros de calidad, se aplicaron los ensayos descritos en laNorma Ramal del Ministerio de Salud Pública (NRSP 309).RESULTADOS: se comprobó la presencia de flavonoides, aminoácidos,aminas, azúcares y oligosacaridos en los 3 extractos secos estudiados.En el de M. ci t rifoli a se observó además la presencia de compuestosantraquinónicos y terpenos, mientras que en M. recut i ta se identificó lapresencia de coumarinas.CONCLUSIONES: los resultados obtenidos demostraron que los 3extractos se encuentran dentro de los límites establecidos para suempleo como principio activo de origen natural.

Palabras clave: Passiflor a inc arnata, M at ric ari a recut i ta, Morind a ci t rifoli a, flavonoides, aminoácidos, aminas, azúcares, oligosacáridos.

ABSTRACT

INTRODUCTION: it is interesting to develop our own technology towork out and to set quality specifications for different solid formulationsof Passiflor a inc arnata L. ((passiflora), M aric ari a recut i ta L. (chamomile)and Morind a ci t rifoli a L. (noni) dry extracts.OBJECTIVES: toconduct phytochemical studies on and to examine thequality control parameters of Passiflor a inc arnata L. M aric ari a recut i ta L.and Morind a ci t rifoli a L. (noni) dry extracts.METHODS: for the phytochemical study based on thin layer

chromatography, quick, simple and selective techniques were used, andminimal amount of equipment was employed for certain compounds. Theanalysis of the quality control parameters included the assays describedin the Branch Standard of the Ministry of Public Health known as NRSP309.RESULTS: flavonoids, aminoacids, amines, sugars and oligosaccharideswere found in the three dry extractsunder study. Antraquninonecompounds and terpens were observed in the M. ci t rifoli a extractwhereas coumarins were present in the M. recut i ta leaf extract.



CONCLUSIONS: the results proved that the three extracts are withinthe set limits for their use as natural active principle.

Key words: Passiflor a inc arnata, M at ric ari a recut i ta, Morind a ci t rifoli a,flavonoids, aminoacids, amines, sugars, oligosaccharides.

INTRODUCCIÓN

Passiflor a inc arnata L., conocida como pasiflora, es una planta que se leha comprobado experimentalmente acción sedante sobre el sistemanervioso. Otras propiedades atribuidas son su efecto contra cólicos,epilepsia, neuralgia, neurosis, etc.1 Entre los componentes de la plantase encuentra un glicósido cianógeno denominado cianocarcina, ademásse le han encontrado alcaloides y flavonoides (responsables del efectosedante). Se ha reportado también la presencia de ácidos hidrociánico,cítrico, málico, pantoténico y tánico.1-4

M at ric ari a recut i ta L. (manzanilla) se conoce por sus propiedades

medicinales como: sedante, tónica, carminativa, antiespasmódica,antiséptica, entre otras; posee un uso variado en la preparación delicores y en la industria de cosméticos (talcos, cremas, champúes,dentríficos contra la inflamación de la boca, encías, entre otras).5

A Morind a ci t rifoli a L. (noni) se le atribuyen efectos relacionados conactividad antibacteriana, antiviral, antifúngica, antitumoral,antihelmíntica, analgésica, antiinflamatoria, hipotensora einmunoestimulante.6 Estudios realizados en Cuba, específicamente en elCentro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), handemostrado que presenta actividad antiinflamatoria y analgésica.

Los extractos secos de P . inc arnata, M. recut i ta y M. ci t rifoli a tienenmúltiples utilidades en la industria farmacéutica, en el desarrollo denuevas formas farmacéuticas, por su alta estabilidad del material departida y su fácil transportación.

Teniendo en cuenta las propiedades demostradas por otros autores y latendencia a desarrollar la Medicina Natural Tradicional en Cuba, serealizaron los estudios fitoquímicos y el análisis de los parámetros decontrol de la calidad a 3 extractos secos de especies diferentes, con elobjetivo de conocer sus componentes (principios activos) y de este modocontar con un basamento científico para su empleo en la cura dediversas enfermedades en la atención primaria de salud, con vistas a su

futura obtención para la elaboración de productos farmacéuticos.

MÉTODOS

En el presente trabajo se utilizaron extractos de Passiflor a inc arnata L., M at ric ari a recut i ta L. y Morind a ci t rifoli a L., estos extractos seprepararon a partir de extractos fluidos y todos se hicieron con materialvegetal seco. A continuación se relacionan el número de herbario para



cada una de las plantas empleadas, así como la parte utilizada y elmenstruo de extracción (tabla 1).

Las muestras empleadas en la realización del trabajo fueron preparadasde la manera siguiente: se pesaron 0,1 g de cada uno de los extractossecos objetos de estudio y se disolvieron en 20 mL de metanol, después

fueron concentradas mediante un baño de agua por 30 min yevaporados hasta obtener 2 mL, una vez concentradas se aplicaron encada una de las placas cromatográficas 10 µL de cada muestra.

En la tabla 2 se relacionan las fases móviles y los reveladores empleadosen el estudio fitoquímico, por cromatografía en capa delgada, realizadosa cada uno de los extractos evaluados, con el objetivo de identificarcomponentes activos

Tabla 2. Condiciones empleadas para el estudio fitoquímico Componentes Fases móviles Reveladores

Aceites esenciales yterpenos Tolueno:acetato de etilo (95:5) Anisaldehído-

ácido sulfúrico. Flavonoides Tolueno:acetato de

etilo:acetona:ácido fórmico(5:2:2:1);cloroformo:metanol:amoniacoconcentrado (4:1:0.1); acetato deetilo:metanol:agua (10:1.5:1);acetato de etilo:ácido acético:ácidofórmico:agua (10:1:1:2)

Solución deácido bórico 10% y solución deácido oxálico 10% (2:1)

Glicósidosterpenoides Cloroformo:metanol:amoniaco

concentrado (4:1:0.1); n-butanol:etanol:amoniacoconcentrado:agua (7:2:2:3)

Anisaldehído-

ácido sulfúrico

Aminoácidos y aminas n-propanol:acetato deetilo:agua:ácido acético (4:3:2:1) Ninhidrina

Azúcar yoligosacáridos n-propanol:acetato de

etilo:agua:ácido acético (4:3:2:1) -naphtol-ácidosulfúrico

Alcaloides Cloroformo:metanol:amoniacoconcentrado(4:1:0.1) Dr agendorff y

solución deácido sulfúrico10%

Compuestosantraquinónicos ycoumarinas

Acetato de etilo:metanol:agua(10:1.5:1)

Soluciónetanólica deKOH 10 %;Solución deácido bórico 10% y solución deácido oxálico 10% (2:1)



Las muestras de extractos secos fueron sometidas a un análisisfarmacognóstico descrito en la norma ramal de salud pública (NRSP) 309del Ministerio de Salud Pública (MINSAP).Se le realizaron los ensayossiguientes:

· Determinación de humedad residual.· Determinación de cenizas totales y cenizas ácidas insolubles.

Para llevar a cabo estos ensayos se empleó una balanza analítica digitalSartorius MC 1, AC 210s, estufa HS 62 A y mufla Phoenix Gurnaces TipoMRB 3-01.

RESULTADOS

En la tabla 3 se pueden apreciar los compuestos presentes en losextractos secos de P . inc arnata, M. recut i ta y M. ci t rifoli a.

En la tabla 4 se reportan los resultados de los parámetros de calidadpara cada uno de los extractos secos estudiados.



DISCUSIÓN

Se obtuvieron respuestas positivas para una gran diversidad de gruposfuncionales de compuestos; se comprobó la presencia de flavonoides,aminoácidos, aminas, azúcares y oligosacáridos en los 3 extractos secosestudiados. Estos resultados se encuentran en correspondencia con lo

reportado para esta especie,4 donde se identifica y cuantifica elcontenido de flavonoides totales en P . inc arnata. En el de M. ci t rifoli a seobservó además la presencia de compuestos antraquinónicos y terpenos,mientras que en M. recut i ta se identifica la presencia de coumarinas;estos resultados coinciden con los reportados en la literatura para cadauna de estas especies.

Los porcentajes de humedad obtenidos fueron inferiores al límiteconsiderado como adecuado por las farmacopeas10 para evitar elcrecimiento microbiano (< 14 %), los resultados de las cenizas totalesfueron inferiores a 5 %, mientras que las cenizas insolubles en medioácido se encuentran dentro de los límites establecidos (< 5 %), al nivel

nacional, por el Centro para el Control Estatal de los Medicamentos(CECMED), para el registro de productos de origen natural, en laRegulación 28/02 - Requisi t os par a l as solici t udes de inscripción , renov ación y modific ación en el regist ro de medic ament os de ori gennat ur al de uso humano.

En el presente trabajo se demostró que los 3 extractos secos de M.ci t rifoli a, M. recut i ta, P . inc arnata tienen en su composición flavonoides,aminoácidos, aminas, azúcares y oligosacáridos, mientras que losextractos de M. ci t rifoli a y de M. recut i ta poseen además compuestosantraquinónicos, terpenos y coumarinas, respectivamente. Además, losresultados obtenidos del análisis de 3 parámetros evaluados a varioslotes de los extractos secos, demostraron que los 3 se encuentrandentro de los límites establecidos para su empleo como principio activode origen natural.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Plantas Medicinales. FITOMED. La Habana: Editorial Ciencias Médicas;1991. p. 75.2. Duke JA. Handbook of Medicinal Herbs. Boca Ratón: CRC Press; 1991.p. 15.

3. Buchbauer C, Jirovetz JW. Passiflora and lemo-blossoms: Motility effectsafter inhalation of essential oil and of some of the constituents in animalsexperiment. Arch Pharm. 1992;325:247-8.4. Schmidt PC, González OG. Passion flower herb. Determination of totalflavonoid content of Passiflorae herbs. Dtsch Apoth Ztc. 1993;133:17-20.5. Acosta, de la Luz L. Proporciónese salud. Cultive plantas medicinales.La Habana: Editorial Científico-Técnica; 1995. p.12-225.



6. Wang MY, West BJ, Jensen CJ, Nowicki D, Su C, Palu AK, et al. Morinda

citrifolia (Noni): a literature review and recent advances in noni research. Acta Pharmacol Sin. 2002;23(12):1127-41.7. Carretero ME. Compuestos Fenólicos: quinonas. Panorama Actual Med.2000; 24(236):778-82.8. Cuba. Ministerio de Salud Pública. NRSP 311. Medicamentos de origen

vegetal: extractos fluidos y tinturas. Procesos Tecnológicos. La Habana:MINSAP; 1992.9. OMS. Métodos de control de calidad de plantas medicinales. Ginebra:OMS; 1984. p. 88 (International Organization for Standarization, ISO 6571.Species, condiments and herbs. Determination of volatile oil content).10. Farmacopea de los Estados Unidos USP 30. The United StatesPharmacopeial Convention. NF- 25. 30 ed. Rockville: Mack Printing; 2007.p. 3.

Recibido: 26 de octubre de 2008. Aprobado: 5 de abril de 2009.

M. C. C aridad M. García Peña. Centro de Investigaciones y Desarrollo deMedicamentos (CIDEM). Ave. 26 # 1605 e/. Boyeros y Puentes Grandes.CP. 10600. Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf.: 8810818/8810830 Fax:(537) 335556. Correo electrónico: [email protected];[email protected]

© 2011 1999, Editorial Ciencias Médicas

Calle 23 # 177 entre N y O - Edificio Soto, Piso 2Vedado, Ciudad de La Habana, CP 10400

Cuba

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1. Título:

DESARROLLO DEUN METODO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA

FINA INSTRUMENTAL PARA ANALISIS CUANTITATIVO DE ACIDO

ACETILSALICILICO

2. Resumen:

Se desarrolló y validó un método por cromatografía en capa fina instrumental (HPTLC) para

cuantificar ácido acetilsalicílico. La validación del método indicó que éste es lineal entre 100 y

600 ng/mancha, con un coeficiente de regresión de 0,996. Presentó buena repetitividad y

reproducibilidad (desviación estándar relativa entre 2,1 y 3,5% y entre 4,8 y 6,0%,

respectivamente) y una exactitud promedio de 99%. Además, se demostró ser selectivo para el

principio activo ensayado, lo que lo hace adecuado para su análisis cuantitativo.

3. Identificación:

a. Fase estacionaria: Silica gel F254

b. Fase Móvil: acetato de etilo + metanol + ácido acético glacial (80+19+1, v/v)9), y

ciclohexano +cloroformo + ácido acético glacial.

c. Tipo de Cromatografía: Fase Normal

d. Tipo de Elución: Isocratica.

e. Tipo de detección o revelado: Las lecturas se realizaron por densitometría.Para esto se

utilizó un espectrodensitómetro Scanner Camag III acoplado a un computador con

software CATS versión 4,05, y como fuente de radiación una lámpara de deuterio.

f. Tipo de analito: Las soluciones de ácido acetilsalicílico se prepararon en

acetonitrilo/ácido fórmico

g. Muestra: Ácido Acetilsalicílico: La siembra de las muestras se realizó en bandas de 3 mm

mediante el uso de un aplicador semiautomático Linomat IV.

4. Factores de referencia de los analitos:

Los Rf fueron de 0,8 y de 0,15, respectivamente. La longitud de desarrollo fue de 5 cm, en un

tiempo aproximado de 10 minutos para la primera y de 2 cm, en un tiempo aproximado de 17

minutos para la segunda fase móvil. Se eligió la segunda, ya que ésta permite visualizar mejor las

manchas, las cuales quedan más separadas del frente de solvente. Se utilizaron cámaras de

desarrollo vertical.

5. Comentario acerca de la selección de condiciones.



Las fases móviles fueron desarrolladas conforme a la mayor polaridad de sus analitos, siendo una

mezcla de tres compuestos, los más utilizados fueron, acetato de etilo, metanol, y ácido acético glacial.

La fase estacionaria fue la silica gel F254, que es la más recomendada para muchos análisis de este tipo,

los gradientes de solventes fueron seleccionados fueron del ciclohexano, cloroformo, y ácido acético

glacial ya que permitió visualizar mejor las manchas.

Para la detección se realizaron a cabo por lecturas realizadas por densitometría.Para esto se utilizó un

espectrómetro Scanner Camag 3 acoplado a un computador con software Cats Versión y como fuente

de radiación una lámpara de Deuterio.

DESARROLLO DE UN METODO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA

FINA INSTRUMENTAL PARA ANALISIS CUANTITATIVO DE ACIDO

ACETILSALICILICO.

1Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Casilla

237, Concepción, Chile.2Departamento de Bromatología, Nutrición y Dietética, Facultad de Farmacia, Universidad

de Concepción, Casilla 237, Concepción, Chile.

(Recibido: Octubre 14, 2000 - Aceptado: Agosto 14, 2000)

RESUMEN

Se desarrolló y validó un método por cromatografía en capa fina instrumental (HPTLC) para cuantificar

ácido acetilsalicílico.

La validación del método indicó que éste es lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de

regresión de 0,996. Presentó buena repetitividad y reproducibilidad (desviación estándar relativa entre2,1 y 3,5% y entre 4,8 y 6,0%, respectivamente) y una exactitud promedio de 99%. Además, demostró

ser selectivo para el principio activo ensayado, lo que lo hace adecuado para su análisis cuantitativo.

Palabras claves: HPTLC (cromatografía en capa fina instrumental), análisis cuantitativo, ácido

acetilsalicílico, validación, medicamentos.

ABSTRACT

A High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) method was developed and validated to

determine quantitatively acetylsalicylic acid.

The results proved that the method is linear between 100 and 600 ng/spot, with repeatability (RSD =

2,1-3,5%), reproducible (RSD = 4,8-6,0%), accurate (99%) and selective for tested substance. In

conclusion, it is an adequate method for its quantitative analyses.

K eywords: HPTLC (High performance thin layer chromatography), quantitative analysis, acetylsalicylic

acid, validation, drugs.



INTRODUCCION

El ácido acetilsalicílico es el analgésico-antiinflamatorio-antipirético más usado en todo el mundo. Se

estima que la cantidad de este fármaco consumida solo en los Estados Unidos es del orden de las

200.000 toneladas al año.1)

Producto de su estructura química es estable en aire seco, pero en contacto con la humedad se hidroliza

lentamente 1,2,3,4), degradación que depende principalmente de la presión de vapor de agua y de la

temperatura (factores medioambientales).4)

Por esto es importante cuantificar el ácido acetilsalicílico presente en sus especialidades farmacéuticas,

como modo de asegurar una terapia adecuada.5,6)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es el método de elección para la mayoría de los

protocolos de análisis de medicamentos.7) Sin embargo, ya que se requiere analizar un gran número de

especialidades farmacéuticas del principio activo, y, por ende numerosas muestras, sin que ello

demande un tiempo considerable y un alto costo, es que en el presente trabajo se valida y propone unmétodo analítico por HPTLC para cuantificar ácido acetilsalicílico. Esta técnica posee importantes

ventajas sobre otros métodos cromatográficos, pues no requiere de purificaciones exhaustivas, utiliza

cantidades mínimas de solventes, es una metódica rápida y, además, por ser un sistema abierto,

permite analizar distintas muestras y diferentes analitos en forma simultánea, lo que se traduce en

economía de tiempo, materiales y reactivos. 8)

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS:

Para el estudio se utilizó ácido acetilsalicílico estándar USP. Todos los reactivos fueron de calidadproanálisis.

Las soluciones de ácido acetilsalicílico se prepararon en acetonitrilo/ácido fórmico (99:1) como solvente.2)

CROMATOGRAFIA:

La cromatografía se realizó en placas HPTLC de sílica gel F254, previamente lavadas con metanol y

activadas a 130ºC por 30 minutos.

La siembra de las muestras se realizó en bandas de 3 mm mediante el uso de un aplicadorsemiautomático Linomat IV.

Se probó como fase móvil acetato de etilo + metanol + ácido acético glacial (80+19+1, v/v)9), y

ciclohexano +cloroformo + ácido acético glacial (60+5+5, v/v)10). Los Rf fueron de 0,8 y de 0,15,

respectivamente. La longitud de desarrollo fue de 5 cm, en un tiempo aproximado de 10 minutos para la

primera y de 2 cm, en un tiempo aproximado de 17 minutos para la segunda fase móvil. Se eligió la



segunda, ya que ésta permite visualizar mejor las manchas, las cuales quedan más separadas del frente

de solvente. Se utilizaron cámaras de desarrollo verticales.

Las lecturas se realizaron por densitometría. Para esto se utilizó un espectrodensitómetro Scanner

Camag III acoplado a un computador con software CATS versión 4,05, y como fuente de radiación una

lámpara de deuterio.

ESPECTROGRAMA DE ABSORCION:

La longitud de onda de máxima absorción (231 nm) se determinó realizando un espectrograma in situ

del compuesto cromatografiado.

VALIDACION DEL METODO:

Los parámetros analíticos que se validaron fueron linealidad, límites de detección y de cuantificación,

precisión, exactitud, selectividad y robustez.

La validación se llevó a cabo según normas internacionales 2,11,12) y utilizando estimadores estadísticos

apropiados (desviación estándar relativa, t de student, análisis de varianza).11,13)

LINEALIDAD:

Para establecer el rango de linealidad del método se elaboró una curva de calibración mediante la

aplicación de concentraciones del estándar entre 100 y 600 ng por mancha. Las siembras se hicieron en

triplicado.

LIMITES DE DETECCION Y DE CUANTIFICACION:

Para su obtención se trabajó con concentraciones de analito que estuviesen en la parte inferior delrango lineal de la curva de calibración. Para esto se prepararon soluciones de concentraciones de 50, 75

y 100 ng/uL, cada una de las cuales se sembró tres veces (1 uL cada vez).

PRECISION:

Para este estudio se utilizaron soluciones de ácido acetilsalicílico de 100, 300 y 500 ng/uL. Estas cubren

el rango lineal determinado (siembra: 1uL).

Para evaluar la repetitividad del método se prepararon cinco soluciones de cada concentración, cada

una de las cuales se sembró tres veces.

Para evaluar la reproducibilidad se trabajó con una solución de cada concentración, cada una de las

cuales se sembró tres veces y durante cinco días.

EXACTITUD:



Se evaluó utilizando comprimidos comerciales de ácido acetilsalicílico. Se prepararon seis soluciones, de

las cuales a tres se les hizo recarga basal con ácido acetilsalicílico estándar, para calcular el porcentaje

de recuperación.

SELECTIVIDAD:

Para evaluar la selectividad del método se preparó una solución de ácido acetilsalicílico más ácido

salicílico. Se utilizó el ácido salicílico por tratarse del principal producto de degradación del ácido

acetilsalicílico. La solución se preparó a una concentración de 300 ng/uL de ácido acetilsalicílico y 150

ng/uL de ácido salicílico. Se sembró cinco veces, obteniéndose un Rf de 0,22 para el ácido acetilsalicílico

y de 0,27 para el ácido salicílico. Las concentraciones obtenidas fueron de 304,3 ng/uL para el ácido

acetilsalicílico y de 149,6 ng/uL para el ácido salicílico.

ROBUSTEZ:

La robustez del método se evaluó cambiando la proporción de los componentes de la solución para

diluir muestras, y la proporción de los solventes de la fase móvil.Se trabajó con soluciones de 100, 300 y

500 ng/uL.

Como se mencionó, la solución para diluir las muestras fue de acetonitrilo/ácido fórmico (99:1, v/v). Se

estudió el efecto que tenía en los resultados el cambio de esta proporción a 90:10, v/v. La proporción de

los solventes de la fase móvil se cambió de 60:5:5 a 50:10:10, v/v.

RESULTADOS Y DISCUSION

El método resultó lineal entre 100 y 600 ng/mancha, con un coeficiente de regresión de 0,996 y un p de0,0001. (Fig. 1.)

Para la determinación de los límites de detección y cuantificación se graficó la cantidad de analito por

mancha versus respuesta (área del pico) promedio y se determinó la ecuación de esta recta, obteniendo

de ella una estimación de la respuesta del blanco: ybl11) (Fig. 2).



El valor de ybl corresponde al intercepto de la curva, y resultó ser de 6,48. El coeficiente de regresión fue

de 0.999.

Posteriormente se obtuvo una segunda curva, graficando cantidad de analito por mancha versus

desviación estándar de las respuestas. De la ecuación de esta recta se obtuvo una estimación de la

desviación estándar del blanco: sbl.11) que corresponde al intercepto de esta curva, que resultó ser de

5,92.

Los límites de detección y de cuantificación se calcularon mediante las ecuaciones: 11)límite de

detección = (ybl + 3sbl)/b; límite de cuantificación = ( ybl + 10sbl)/b donde "b" es la pendiente de la curva

de calibración obtenida en el estudio de linealidad.

El límite de detección resultante fue de 3 ng/mancha, y el de cuantificación de 9 ng/mancha.

Los resultados del estudio de precisión fueron una desviación estándar relativa entre 2,1% y 3,5% (n=5)

para la repetitividad, y entre 4,8% y 6,0% (n=10) para la reproducibilidad.

El porcentaje promedio de recuperación fue de 99%, con una desviación estándar de 5,01 y una

desviación estándar relativa de 5,06% (n=15).

El intervalo de confianza del 95% fue de 96,271- 101,823. El test de student permitió concluir que no

existen diferencias significativas entre recuperación media y 100 (tobservado= 0,76; ttabulado (grados de libertad=14,

alfa = 0,05) = 1,76).

El método permite la separación del ácido acetilsalicílico y del ácido salicílico con una resolución de 1,5,

lo cual indica que bajo las condiciones establecidas, es selectivo para el principio activo estudiado.

(Fig.3).

Para estudiar la influencia del cambio de los parámetros considerados en la robustez del método se

realizó análisis de varianza de los resultados obtenidos, mediante el diseño de experimento factorial.13)

El cambio de proporción de los componentes de la solución para diluir muestras dio un Fc = 1,03 y un

Ftab. = 9,33 (alfa =0.01), lo que permitió concluir que no existen diferencias significativas en los

resultados al usar una u otra proporción. Por tanto, ante esta variación de condiciones, el método es

robusto (Fc: valor F calculado; Ftab : valor F tabulado. Distribución F).



Sin embargo, el cambio de proporción de los solventes de la fase móvil arrojó diferencias significativas

entre los resultados, al emplear una proporción u otra (Fc = 37,89; y Ftab = 9,33) (alfa = 0,01). Esto indica

que se debe ser muy riguroso en las medidas de los volúmenes de los solventes de la fase móvil, de

modo de garantizar óptimos resultados.

CONCLUSIONES

El método validado presentó una buena linealidad entre las concentraciones empleadas en el estudio,

como así mismo resultó preciso, exacto y selectivo para el principio activo ensayado.

Estos resultados permiten postular que es una buena alternativa al método oficial (USP) por HPLC para

análisis cuantitativo de ácido acetilsalicílico.

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AI2 3.30

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