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Mt ~4?

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDDepartamento de Nutrición y Bromatología III

(Higiene y Tecnología de los Alimentos)

FACULTAD DE VETERINARIA

CARACTERIZACION PARCIAL,BIOQUíMICA E INMUNOLOGICA,

DE UNA SUSTANCIAANTIMICROBIANA PRODUCIDA

POR Lactobacillus sake 148

Memoria que, para optar al gradode Doctor en Veterinaria,

presenta el Licenciado:

ODON JULIAN SOBRINO ABUJA

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PABLO ELPIDIO HERNANDEZ CRUZA, CATEDRATICO DE NUTRICION Y

BROMATOLOGíA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD

COMPLUTENSE DE MADRID,

CERTIFICA:

Que la tesis doctoral titulada ‘CARACTERIZACION PARCIAL, BIOQUIMICA E

INMUNOLOGICA. DE UNA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA PRODUCIDA POR

LACTOBACILLUS SAKE 148, de la que es autor D. Odón Julián Sobrino Abuja, ha sido

realizada en el Departamento de Nutrición y Bronntología III (Higiene y Tecnología de los

Alimentos), bajo la dirección conjunta del catedrático D. Bernabé Sanz Pérez, de la profesora

titular Dña. María E. Fernández Alvarez y del que suscribe y cumple las condiciones exigidas

para optar al título de Doctor en Veterinaria.

Madrid, 1 9 de enero de 1993

cnAQNcttx~c {OwkJ) __

.—rd~EÉ~rnabé Sanz Pérez Edo: Maria FiFétrá~d~~ Alvarez Edo: Pablo E. Hernández Cruza

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero agradecer al Prof D. Bernabé Sanz Pérez la confianza

depositada en mi al acogerme en el Departamento, que tan acertadamente ha dirigido durante

años y, en el que se ha desarrollado este trabajo. Deseo agradecerle también su paciencia y

comprensión durante mis primeros pasos, torpes y vacilantes, porel laboratorio así como sus

enriquecedoras orientaciones, que han contribuido sobremanera a mi completa formacion.

De manera especial quiero mostrar mi agradecimiento al Prof. D. Pablo E. Hernández

Cmza, verdadera piedra angular y soporte científico de este trabajo. Agradecerle, sobre tQdo.

su ejemplo, modelo de trabajo, dedicación, abnegación y sacrificio. Su acertado

asesoramiento, apoyo, comprensión y constante estímulo han conseguido, además de hacerme

permanecer cientos de horas (incluidos fines de semana y festivos) en el laboratorio,

mculcanne una enorme pasión porel trabajo de investigación desarrollado.

No puedo olvidar, por supuesto, expresar mi agradecimiento a los restantes miembros

del “Hogar del Lactobacilo”; a Juan Miguel, ‘socio cofundador” y compañero de las

situaciones más inverosímiles que en un laboratorio presentarse puedan (Rodríguez, 1991); a

Wagner Luiz, por su amistad y por compartir conmigo peripecias, desaguisados y muchas

horas de trabajo, jalonadas en algunas ocasiones, de pequeños éxitos; al resto de lo s miembros

del “Hogar”, a Luis por su entusiasmo y, en especial a Fernanda por su peculiar sentido del

humor y por la ayuda, comprensión y cariño demostrados en lo s momentos más dificiles de

este trabajo.

También quiero agradecer al resto de los componentes del Departamento de Nutrición

y Bromatología III su contribución al clima de amistad y trabajo que han alimentado el

desarrollo de esta tesis. A Almudena y Manuela por las agradables y terapéuticas tertulias, a

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Olga por su colaboración en las técnicas de HPLC, esencial en la obtención de algunos de los

resultados de este trabajo. A todos, en general, agradecerles su ilusión por mantener viva la

titilante llama de la investigación y el compañerismo.

A Industrias Cabo, S.A. por su generosacolaboración al proporcionamos las muestras

de embutidos cuando fueron requeridas.

Al personal del hospital militar ‘Gómez Ulla” por su contribución al desarrollo de laspruebas inmunológicas.

A la Comunidad de Madrid por la concesión de una Becade Formación de Personal

Investigador, con la que se ha realizado parte de esta tesis. Asimismo, este trabajo ha sido

parcialmente subvencionado por el BRIDGE (Biotechnology Research for Innovation,

Development aud Growth in Europe) T-Provect on Lactic Acid Bacteria (Contract BIOT-0263)y por la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT ALI91-0255).

Por último, mi más especial agradecimiento a Cristina, por haber renunciado a más de

un fin de semana y fiestas de guardar, y por la comprensión y cariño demostrado durante todos

los años que ha durado la ejecución de este trabajo.

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INDICE

CAPITULO 1 : EXPOSICION GENERAL DEL PROBLEMA

A INVESTIGAR

CAPITULO II: REVISION BIBLIOGRÁFICA 6

II. 1.- Utilización de agentes antimicrobianos en los alimentos;

presente y futuro 71.- Temperatura 7

2.- Actividad del agua 8

3.- pH 9

4.- Gases y atmósferas modificadas o controladas 9

5.- Ácidos orgánicos 1 1

6.- Sales de curado 1 1

7.- Antibióticos 12

8.- Radiaciones 129.- Envasado 1 3

10.- Interacción de factores 13

II.- Las bacterias lácticas y su posible empleo como conservadores de los

alimentos 14

II. 2.- Bacterias lácticas; ¡ntroducción histórica 14

1.- Características generales 17

2.- Taxonomia 20

II. 3.- Género Lactobacillus 23

3. 1.- Morfología 23

1.- Motilidad 24

2.- Tinción 24

3. 2.- Pared celular y ultraestructura 25

3. 3.- Desarrollo y características de las colonias 25

3. 4.- Necesidades nutritivas 26

¡

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1.- Medios de cultivo 27

3. 5.- Metabolismo 28

3. 6.- Consideraciones taxonómicas; Clasificación 316. 1.- Grupo 1.- Homofermentativos obligados 32

6. 2.- Grupo II.- Heterofermentativos facultativos 33

2. 1.- Estreptobacterias atípicas 33

1.- Lactobacillus sake 33

6. 3.- Grupo III.- Heterofermentativos obligados 34

3. 7.- Ecología, habitats y biotecnología 34

II. 4.- Actividad antimicrobiana de la s bacterias lácticas 354. 1.- Actividad antimicrobiana de los ácidos orgánicos 36

4. 2.- Actividad antimicrobiana de componentes inorgánicos 37

1.-Dióxido de carbono 37

2.- Peróxido de hidrógeno 38

3.- Diacetilo 39

4.- Reuterina 39

4. 3.- Efecto antimicrobiano de las bacteriocinas y sustancias afines 40

II. 5.- Bacteriocinas; Definición 40

5. 1.- Detección de bacterias productoras de bactenocinas 41

1.- Detección de las cepas productoras 41

2.- Prueba del antagonismo directo 41

3.- Prueba del antagonismo diferido 42

5. 2.- La acción de las bacteriocinas y su diferenciación de otras posibles

causas de inhibición 42

5. 3.- Producción óptima de bacteriocinas 445. 4.- Purificación 44

5. 5.- Propiedades de las bacteriocinas de las bacterias lácticas 45

1.- Composición química 45

2.- Propiedades físicas 46

3.- Espectro de acción 46

4.- Mecanismo de acción 47

5. 6.- Regulación genética 48

II

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5. 7.- Bacteriocinas de las bacterias lácticas 50

1.- Bacteriocinas producidas por especies del género Loctobacillus 50

2.- Bacteriocinas producidas por especies del género Lactococcus 513.- Bacteriocinas producidas por especies del género Pediococcus 51

4.- Bacteriocinas producidas por especies del género Carnobacteriwn. 52

5.- Bacteriocinas producidas por especies del género Leuconostoc 52

CAPITULO III: MATERIALES Y METODOS 53

III. 1.- Materiales 54

1. 1.- Material biológico 54

- Microorganismos empleados 54

2.- Obtención de los inmunosueros 54

1. 2.- Productos y reactivos 55

1. 3.- Material de laboratorio 55

III. 2.- Métodos 60

2. 1.- Medios de cultivo empleados en el crecimiento de lo s

microorganismos 60

1.- Medios de cultivo para el crecimiento de las bacterias lácticas 60

2.- Medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos

indicadores distintos de las bacterias lácticas 62

2. 2.- Aislamiento y selección de las bacterias lácticas de lo s embutidos

crudos madurados 63

2. 3.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas seleccionadas 65

3. 1.- Soluciones tampón empleadas 653. 2.- Pruebas directas de antagonismo 65

1.- Prueba directa de antagonismo en pocillos 65

3. 3.- Actividad inhibidora dc lo s sobrenadantes concentradoslibres de células 66

1.- Preparación de lo s sobrenadantes 662.- Detección de la actividad inhibidorade lo s sobrenadantes

concentrados 20 veces 67

3. 4.- Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias

III

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lácticas seleccionadas 67

2. 4.- Identificación y caracterización bioquímica de algunas bacterias

lácticas con actividad antimicrobiana 681.- Morfología y tinción por el método de Gram 68

2.- Prueba de la catalasa 68

3.- Producción de gas a partir de glucosa 68

4.-Hidrólisis de la arginina 70

5.- Producción de ácido sulfhídrico 71

6.- Prueba de Voges-Proskauer 72

7.- Fermentación de carbohidratos 73

8.- Tolerancia al cloruro sádico 759.- Tolerancia al pH de 3,9 75

10.- Desarrollo a diversas temperaturas 75

2. 5.- Espectro antlinicrobiano de las sustancias inhibidoras producidas

por las cepas de L. sake números 77, 90, 148 y 180 76

2. 6.- Efecto de lacomposición del medio de cultivo en la actividad

antimicrobiana de Lactobacillus .sake 148 76

2. 7.- Crecimiento de L. sake 148, cinética del desarrollo y producción de

sustancia antimicrobiana a diversas temperaturas 777. 1.- Crecimiento de los cultivos 77

7. 2.- Parámetros cinéticos del desarrollo microbiano 78

1.- Velocidad específica de crecimiento (g) 78

2.- Tiempo de duplicación (td) 79

3.- Número de generaciones por hora (g/h) 79

4.- Determinación del peso celular seco 80

2. 8.- Purificación parcial de la actividad antimicrobiana exocelular de

L. sake 148 82

8. 1.- Cromatografía de filtración en geles 82

1.- Soluciones tampón empleadas 82

2.-Geles 82

3.- Condiciones de trabajo 83

8. 2.- Determinación de la proteina 84

2. 9.- Caracterización parcial de la actividad antimicrobiana exocelular

parcialmente purificada de L. sake 148 86

Iv

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9. 1.- Preparación de la solución patrón de la sustancia antimicrobiana

parcialmente purificada 86

9.2.- Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidora de L. sake 148 87

9. 3.- Efecto de diferentes pHs en la actividad inhibidora de

L. sake 148 87

- Preparación de las soluciones tampón de distintos pHs 87

2.- Condiciones de trabajo 88

9. 4.- Cinética de tennodestrucción de la actividad inhibidora de

L. sake 148 89

1.- Tratamiento térmico 892.- Parámetros cinéticos de termodestruccion 89

9. 5.- Determinación del peso molecular de la sustancia inhibidora de

L. sakc 148 por cromatografía de filtración en Sephadex 0-50... 94

9 . 6- Electroforesis en geles de poliacrilarnida con dodecil sulfato sódico

(SDS-PAGE) 94

6. 1.- Técnica de Swank y Munkres (1971) 96

1.- Tampones, geles y soluciones empleadas 96

2.- Preparación de las muestras 983.- Preparación de los geles 98

4.- Electroforesis 99

5.- Tinción de los geles 99

6.- Determinación del peso molecular 99

6. 2.- Técnica de Laemli (1970) 100

1.- Tampones, geles y soluciones empleadas 100

2.- Preparación de las muestras 103

3.- Preparación de los geles y electroforesis 103

4.- Tinción de los geles 103

5.- Determinación del peso molecular 104

9. 7.- Determinación de la composición aminoacídica de la sustancia

antimicrobiana de L. saLe 148 porcromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) 104

1.-Tampones y reactivos 104

y

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2.- Digestión ácida de la muestra problema 106

3.- Preparación de los patrones 106

4.- Derivatización de los aminoácidos 1065.- Técnica de la cromatografía en HPLC 107

2. 10.- Mecanismo de acción de la sustancia inhibidora deL sake 148 108

2. 11.- Concentración inhibidora mínima de la sustancia antimicrobiana

parcialmente purificada en diversos microorganismos indicadores. 109

2. 12.-Métodos inmunológícos 109

12. 1.- Obtención de los inmunosueros 109

1.- Pauta de inmunización 109

2.- Sangría final 1103.- Obtención y conservación del suero 112

12. 2.- Inmunodifusión en geles de agarosa 113

1.- Preparación del gel 113

2.- Preparación de las placas de inmunodifusión 114

3.- Llenado de los pocillos e incubación de las placas 114

4.- Lavado y secado de los geles 114

5.- Tinción 115

12. 3.- Técnicas inmunoenzimáticas 115

1.- Técnicas del ELISA indirecto 115

2.- Técnica del ELISA indirecto clásico 115

3.- Técnica del ELISA indirecto utilizando el sistema de amplificación

biotina-avidina 119

CAPITULO IV: RESULTADOS 123

IV.1.-Evolución de las bacterias lacticas durante la maduración

de un lote de embutidos crudos curados 124

IV. 2.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas

seleccionadas 124

2. 1.- Actividad inhibidora directa 124

2. 2.- Actividad inhibidora de los sobrenadantes de lo s cultivos libres de

células 152

VI

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2. 3.- Efecto de lacatalasa en la actividad inhibidora de las bacterias


IV. 3.- Identificación y caracterización bioquímica parcial de las

bacterias lácticas seleccionadas por su actividad

antimicrobiana 154

1.- Morfología y tinción por el método de Gram 154

2.- Prueba de la catalasa 154

3.- Producción de CO2 a partir de glucosa 154

4.- Hidrólisis de la arginina 154

5.- Producción de ácido sulfhídrico 155

6.- Prueba de Voges-Proskañer 155

7.- Fermentación de carbohidratos 155

8.- Tolerancia al cloruro sódico 156

9.- Tolerancia al pH de 3,9 157

10.- Crecimiento a diversas temperaturas 157

IV. 4.- Espectro antimicrobiano de la sustancia inhibidoraexocelular d e l a s cepas de L. sake 77 , 90 , 148 y 180 162

IV. 5.-Efecto de la composición del medio de cultivo en la

actividad antirnicrobiana de Lactobacillus sake 148 165

IV. 6.- Parámetros cinéticos y actividad inhibidora de L. sake 148a distintas temperaturas 167

1.- Crecimiento y actividad antimicrobiana de L. sake 148 1672.- Parámetros cinéticos del crecimiento microbiano 173

IV. 7.- Purificación parcial de la actividad antimicrobiana

exocelular de L. sake 148 175

1.- Cromatografía de filtración en Sephadex G-150, G-75 y G-50 175

VII

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IV. 8.- Caracterización parcial de la actividad antimicrobiana de

Lactobacillus sake148 182

Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidora. 1822.- Efecto del pH en la actividad inhibidora 184

3.- Cinética de termodestrucción de la actividad antimicrobiana

exocelular de Lactobaciltus sake 148 184

4.- Determinación del peso molecular por cromatografía de filtración en

Sephadex G-50 188

5.- Determinación del peso molecular por electroforésis en geles de

poliacrilamida con dodecil sulfato sódico 188

1.- Electroforesis según la técnica de Swank y Munkxes 1902.- Electroforesis en geles del 20% poliacrilarnida con SDS

(Laemly, 1979) 190

6.- Determinación de la composición aminoacídica de la sustancia

antimicrobiana parcialmente purificada 191

IV. 9.- Mecanismo de acción de la sustancía antimicrobiana

exocelular de Lactobacillus sake 148 194

IV. 10.- Concentración inhibidora mínima (CIM) de la sustancia

antimicrobiana exocelular de L. sake 148 194

IV. 11.- Caracterización inmunológica parcial de la sustancia

antimicrohiana de L. sake 148 19911. 1.- Análisis por inmunodifusión en geles de agarosa, de lo s inmuno-

sueros de conejos cuando se emplea como antígeno la sustancia

anfimicrobiana exocelular de L. sake 148 199

11. 2.- Detección de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada

de L. sake 148, mediante técnicas inmunoenzimáticas (ELISA).... 200

2. 1.- Detección por la técnica del ELISA indirecto clásico 200

Evaluación de la concentración idónea de lo s reactivos que

intervienen en el ensayo 200

2.- Determinación de la respuesta inmunológica de los conejos

frente al extracto antigénico inoculado 201

VIII

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2. 2.- Detección de la sustancia antimicrobiana deL. sake 148 en el

medio de cultivo MM-triptosa 203

1.- Evaluación de la concentración idóneade lo s reactivos queintervienen en el ensayo 203

11. 3.- Detección de la sustancia antimicrobiana deL. sake 148 mediante

la técnica del ELISA indirecto con el sistema de amplificación

biotina-avidina 207

CAPITULO V: DISCUSION 209

V. 1.- Aislamiento de bacterias lácticas de embutidos crudos

curados 210

V. 2.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas

seleccionadas 211

2. 1.- Elección de las pruebas de antagonismo microbiano 211

1.- Pruebas directas de antagonismo microbiano 211

2.- Antagonismo de lo s sobrenadantes libres de células213

2. 2.- Actividad inhibidora de los cultivos de las bacterias lácticas

seleccionadas 215

2. 3.- Actividad inhibidora de los sobrenadantes libres de células 217

2. 4.- Efecto de lacatalasa en la actividad inhibidora de las bacterias


y. 3.- Identificación y caracterización bioquímica parcial de las

bacterias lácticas co n actividad antimicrobiana 219

V. 4.- Espectro antimicrobiano de los sobrenadantes libres de

células de las cepas de L. sake seleccionadas, una vez

neutralizados y concentrados 225

V. 5.- Efecto de la composición del medio d e cultivo e n l a

producción de actividad inhibidora 229

Ix

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V. 6.- Parámetros cinéticos y producción de la actividad inhibidora

de L. sake 148 a diversas temperaturas 231

V. 7.- Caracterización bioquímica parcial de la actividad

antimicrobiana de L. sake 148 232

V. &- Mecanismo de acción de la bacteriocina producida por

L. sake 148 241

V. 9.- Propiedades antigénicas de la bacteriocina de L. sake 148.. 248

CAPITULO VI: CONCLUSIONES 251

CAPITULO VII: TRABAJO FUTURo.... 254

CAPITULO VIII: BIBLIOGRAFíA 257

x

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EXP. GRAL. DEL PROBLEMA A IN VES? lOAR

CAPITULO 1

EXPOSICION GENERAL

DEL

PROBLEMA A INVESTIGAR

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EXP. ORAL. DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

La masificación y complejidad de los medios de producción y distribución de

alimentos y el empleo de la refrigeración como principal método de conservación de los

mismos, obliga a pensar en el desarrollo de nuevas técnicas que, unidas a las ya existentes,

permitan, no sólo garantizar la calidad higiénica, sino prolongar la vida útil de los alimentos.

Para alcanzar estos objetivos en los últimos años se han aplicado en la carne y productos

cárnicos otras metodologías de conservación. Algunas podrían mejorarse empleando técnicas

basadas en el antagonismo biológico existente entre algunos géneros microbianos saprofitos y

los posibles microorganismos patógenos o alterantes cuya presencia se quiere eliminar.

Si se dispusiese de métodos que destruyeran selectivamente la flora patógena

potencialmente presente en la carne o si se inhibiese el desarrollo de su flora psicotrofa

alterante, la calidad higiénica y la vida útil de este alimento mejo¡-ai-ían considerablemente

(Molin y Ternstom, 1982; Shaw y Latty, 1982, 1984; Dainty, 1986). Si bien éstos objetivos

pueden cumplirse con la utilización de aditivos, antibióticos o radiaciones ionizantes, talesmétodos presentan muchos inconvenientes. Asimismo, es conveniente disponer de otras

alternativas que aumenten la calidad higiénica y la vida útil de las carnes envasadas al vacío o

de las que, a pesar de someterse a la acción del calor, sufren .u n proceso tecnológico previo que

puede permitir un desarrollo microbiano excesivo que determina una pérdida de su calidad

tecnológica cuando no un peligro sanitario para el consumidor.

Las bacterias lácticas constituyen un grupo de microorganismos que, además de no Ser

peligrosos para el consumidor, inhiben el crecimiento de los microorganismos patógenos

potencialmente presentes en la carne yen sus productos. Aunque el mecanismo íntimo de la

acción antimicrobiana de éstas bacterias no seconoce completamente, se sabe que sintetizan

metabolitos como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, etc. que desempeñan un papel

importante en la inhibición del desarrollo de otros microorganismos. Además también

sintetizan otras sustancias inhibidoras, que cuando son de naturaleza proteica reciben el

2

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EXP. ORAL. DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

nombre genérico de bacteriocinas.

La posible utilización de las bacterias lácticas o de las bacteriocinas que producen como

conservadores o factores de “seguridad” en un amplio número de productos alimenticios,

constituye una línea de trabajo desarrollada recientemente por algunos investigadores (Barefoot

y Klaenhamrner, 1984; Pucci y col, 1988; Daeschel, 1989: Bhunia y col.. 1991) que han

logrado purificar y, en algunos casos, caracterizar algunas bacteriocinas.

El objetivo de éste trabajo consiste en la búsqueda. identificación, purificación, y

caracterización bioquímica e inmunológica parcial de sustancias antintcrobianas elaboradas por

las bacterias lácticas procedentes de embutidos crudos madurados. Una vez purificadas y

establecidas sus características bioquímicas se estudiará su posible utilización como factores de

seguridad que incrementan la calidad higiénica y la vida útil de la carne y de los derivados

cárnicos. Presumimos que, como factores de “seguridad”, podrían utilizarse tanto las bacteriaslácticas inhibidoras, como las sustancias antimicrobianas que producen, una vez que hayan

sido purificadas.

Para lograr los objetivos propuestos se necesita desarrollar el programa de trabajo que

se describe a continuación:

1v).- De lo s embutidos crudos madurados, que son teóricamente los sustratos cárnicos

más adecuados pal-a el desarrollo de bacterias lácticas productoras de sustancias inhibidoras, se

seleccionará al azar un número de colonias microbianas cuyo potencial inhibidor del desarrollo

de otros microorganismos será convenientemente evaluado.

29.- El antagonismo bacteriano se estudiará tanto en las colonias aisladas como en el

medio extracelular.

3

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EXP. CHAL. DEL PROBLEMA A INVESTICAR

39).~ Los grupos microbianos frente a los que se evaluará el potencial inhibidor de las

bacterias lácticas escogidas serán: bacterias lácticas de diversos origenes (leche, carne,

hortalizas), micrococáceas, enterococos, Pseudonionas sp. psicotrofas de la carne refrigerada,

microorganismos de las carnes envasadas al vacío (Brochothrix therínosphacta y

enterobacteriáceas) y microorganismos patógenos diversos como E. coli enteropatógeno,

Staphylococcus orn-cus, Lisreria tnonocyíogenes, Sairnonella spp., Clostridium boutulinum y

Clostridiuni peifringens.

4$.- Mediante técnicas microbiológicas adecuadas se identificarán el género y la

especie de las bacterias lácticas con mayor poder antagonista.

5Q).~ Se evaluará el efecto de diversos parámetros como composición del medio de

cultivo, pH, temperatura, tiempo de crecimiento, etc, en la síntesis de las sustancias

inhibidoras.

6$.- Mediante técnicas de separación de filtración en geles se intentará purificar la

actividad inhibidora extracelular de la que resulte más interesante.

79.- Se procederá a la caracterización bioquímica parcial de L a sustancia inhibidora

seleccionada, determinando su peso molecular y su sensibilidad al pH, al calor, y a los

enzimas proteolíticos. lipolíticos y amilolítícos.

8~).- A partir de conejos se obtendrán anticuerpos policlonales frente a la bacteriocina

parcialmente purificada.

9$.- Finalmente se establecerá, mediante técnicas inmunoenzimáticas (ELISA). la

capacidad de lo s anticuemos obtenidos para caractenzar inmunológicamente dicha bacteriocina

4

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EXP. GRAL. DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

que se comparará con las producidas por otras bacterias lácticas. También se estudiará la

utilidad de los anticuerpos en la posible detección y cuantificación de la bacteriocina en medios

de cultivo liquidos y en sustratos cárnicos.

5

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REVISION BIALIOGRAFIC’A

CAPITULO J I

REVISION

BIBLIOGRAFICA

6

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REVISION il/BLIOGRA PICA

II. 1.- Utilización de agentes antimicrobianos en lo s alimentos: presente y futuro

Uno de los mayores problemas con lo s que el hombre se ha enfrentado a lo largo de su

historia ha sido la necesidad de evitar, de una forma u otra, la alteración de los alimentos,

incrementando su vida útil. Para solventarlo ha utilizado los materiales y técnicas a su alcance

como miel, sal, especias, ahumado, desecación y otros sistemas sencillos de conservación. La

mayor parte de los mismos se siguen empleando actualmente, en algunos casos sin variación

tecnológica alguna y, en otros, con las modificaciones necesarias introducidas por losadelantos técnicos. A medida que crecen los conocimientos sobre los alimentos y la causa de

su alteración, aumentan también las metodologías necesarias para evitar ésta última. Los

métodos empleados para evitar la alteración de lo s alimentos e incrementar su vida útil se basan

en la utilización de:

II. 1. 1.- Temperatura

La temperatura desempeña un papel muy importante en el desarrollo bacteriano y al

modificarla se retrasa e incluso se elimina el desarrollo de los microorganismos patógenos y

alterantes (ICMSF, 1980). Las temperaturas de refrigeración sólamente retrasan el crecimiento

de los microorganismos mesófilos o termófilos, permitiendo el desarrollo de los psicrófilos,

entre los que se encuentran muchos alterantes de los alimentos y otros patógenos, por lo que la

refrigeración no se puede considerar, por sí sola, como un método que permita asegurar unos

alimentos sanos, en periodos de tiempo que superen una o, en el mejor de los casos, dos

semanas.

Si la temperatura es tan baja que tiene lugar la congelación del agua, incluso se inhibe

el desarrollo de lo s microorganismos psicrófilos, permitiendo la conservación de lo s alimentos

durante largos periodos de tiempo (Speck y Ray, 1977). Pero la utilización de temperaturas de

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REVISION BIBLIOGRA PICA

congelación no implica la eliminación de los microorganismos patógenos o alterantes que

pueden permanecer viables (Obafemi y Davies, 1986). Además la congelación provoca daños

celuLares en las bacterias aunque. con el tiempo, también ocasiona modificaciones perjudiciales

en los alimentos.

El empleo de temperaturas altas permite la destrucción de la mayor parte de los

microorganismos (pasterización) asi como de sus formas de resistencia (esterilización), sin

embargo no pueden aplicarse a todos los alimentos por que modifican su estructura y/o suscaracterísticas organolépticas.

La temperatura ambiental puede emplearse como factor de seguridad si favorece el

desarrollo de ciertos microorganismos que, además de modificar los caracteres organolépticos

de los alimentos, mejoran su calidad microbiológica. Los procesos más representativos de la

industria alimentaria que tienen lugar a temperatura ambiente son los que se basan en lafermentación láctica y/o alcohólica desarrollada por microorganismos distintos (Gibbs, 1987).

II. 1 . 2.- Actividad del agua

El desarrollo de los microorganismos depende, invariablemente, de la presencia de

agua libre (ICMSF, 1980). La actividad del agua (a~) de un alimento orienta, objetivamente,

de la cantidad de agua de que disponen los microorganismos para su desarrollo. La

determinación de la a~ limitante del desarrollo de un microorganismo dado, es importante para

pronosticar su viabilidad en un alimento concreto. La aw disminuye al aumentar la

concentración de solutos (azúcares o sales) y al eliminar el agua disponible para el desarrollo

microbiano por calentamiento o liofilización.

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REI’ISION BIBLIOGRA PICA

IL 1.3.- p1 1

Al igual que ocurre co n la temperatura, los microorganismos poseen un pH mínimo,

óptimo y máximo para su crecimiento. El pH de lo s alimentos es uno de lo s factores que

determinan los microorganismos que se desarrollan en ellos, originando su alteración, una

fermentación deseable o un riesgo para la salud del consumidor.

La disminución natural o artificial del pH se ha utilizado, durante cientos de años, paragarantizar la estabilidad microbiológica de los alimentos. Como ejemplos de disminución

natural del pH en conservación de alimentos citaremos las fermentaciones controladas de la

leche, carne y hortalizas, que originan productos tan estables y seguros como el queso, yogur,

embutidos y encurtidos. La acidificación artificial de los alimentos se consigue añadiéndoles

ácidos orgánicos.

Los alimentos ácidos (pH<4,6). aunque pueden alterarse, es muy dificil que permitan

la proliferación de lo s microorganismos patógenos o la germinación de esporas, en cambio

esto si ocurre en los alimentos débilmente ácidos (pH>4,6) cuyo pH no garantiza, por sí

mismo, su estabilidad microbiológica (Tanaka y col., 1986).

II. 1. 4. - Gases y atmósferas modificadas o controladas

Durante los últimos años se ha generalizado el empleo de ciertos gases como

conservadores de lo s alimentos. En la acción inhibidora de estos gases influyen, además de la

naturaleza del gas, un gran número de factores relacionados con el alimento, el proceso

tecnológico utilizado y el tipo de microorganismo implicado. Así porejemplo. cl CO2 inhibe el

desarrollo de un número variable de microorganismos, dependiendo de la concentración del

gas, temperatura de almacenamiento del alimento y actividad de agua del medio. En general, se

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REVISION BII)LJOORAFICA

considera que las mezclas gaseosas con un 10% de CO2 inhiben el desarrollo del 50% de lo s

microorganismos (Ledward y col., 1971). Este gas se emplea para inhibir el crecimiento de

microorganismos en productos envasados al vacío y en atmósferas modificadas; sin embargo,

la evidencia de que el CO2 puede favorecer el crecimiento de algunos esporulados, como lo s

del género Clostr¡diurn, hace necesario un estudio previo de las características del alimento en

el que se va a utilizar

Otros gases experimentados han sido; el monóxido de carbono (CO) (Davidson y col.,

1983), que se ha comprobado que inhibe el desarrollo de psicotrofos, hongos y levaduras

(Clark y Takacks, 1980) pero cuya toxicidad para quienes lo manipulan desaconseja su

empleo, y el N2 que inhibe el desarrollo de lo s mohos. El dióxido de azufre (SO2) es efectivo

frente a bacterias, hongos y levaduras (Dziezak, 1986), por formar sulfitos con los

compuestos orgánicos de las soluciones acuosas que inhiben el desarrollo microbiano. Sinembargo, solamente es activa la forma iónica que se produce a pH=4.de otro lado originaen

las personas sensibles reacciones de hipersensibilidad, por lo que no es aconsejable su uso en

los alimentos. El óxido de etileno también se ha empleado para reducir el número de

microorganismos de lo s alimentos, pero su elevada toxicidad limita su utilización. El óxido de

propileno, menos estudiado que el anterior, también se ha empleado para inhibir el desarrollo

microbiano (Skinner y Hugo, 1976). Y, por último, citaremos el ozono, cuyo empleo selimita a la esterilización de líquidos (Torricelíl, 1959).

Las atmósferas modificadas o controladas se consiguen mediante la mezcla de varios

gases que se introducen en el interior del envase que protege al alimento, pudiéndose mantener

constante la mezcla gaseosa inicial (atmósferas controladas) o no (atmósferas modificadas). En

lo s alimentos envasados al vacío lo que se hace es extraer el aire del interior del alimento

empaquetado. El objetivo de lo s métodos descritos es limitar el desarrollode la flora alterante

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de los alimentos. El problema es que con ello aumenta la posibilidad del desarroLlo de

anaerobios como C. botulinum.

II. 1 . 5.- Acidos or2ánicos

A los ácidos orgánicos se les considera los antimicrobianos naturales más difundidos

en la naturaleza. Los más empleados en la industria alimentaria son el acético, benzoico,

propiónico y sórbico. El ácido acético y sus sales ejercen su mayor acción inhibidora a pH

próximo a 4,5. El ácido benzoico es más eficaz en el control de mohos y levaduras que en el de

bacterias (Chichester y Tanner, 1972). Generalmente en los alimentos se emplea la sal sódica.

El ácido propiónico y sus sales inhiben a los mohos, pero muy poco a bacterias y levaduras. El

ácido sórbico es activo en alimentos cuyo p l - ] está próximo a 6,0. Generalmente los sorbatos

son más efectivos en las levaduras y mohos que en las bacterias (Ldck. 1976).

II. 1 . 6.- Sales de curado

El curado es uno de los métodos más antiguos de conservación de los alimentos;

inicialmente se realizaba de forma empfrica co n sa l común contaminada con nitro o salitre, más

tarde, a la sal común se le añadía nitrato sódico; las impurezas o contaminantes del cloruro

sódico, es decir el salitre, eran lo s responsables de la aparición de la tonalidad rosa-rojiza típicade los alimentos curados. Los nitritos, procedentes de la reducción de lo s nitratos, originan

NO que reaccionando con la mioglobina dom a lo s alimentos curados de un color atractivo para

el consumidor e impide el desarrollo bacteriano pero, a su vez, participa en la fonnación de

nitrosaminas cancerígenas por lo que el empleo de nitratos y nitritos está regulado por la

legislación alimentaria.

1 1

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II. 1 . 7.- Antibióticos

Los antibióticos, producidos por microorganismos o por síntesis química, inhiben el

desarrollo de muchos microorganismos incluso a concentraciones pequeñas. Sin embargo, su

presencia en los alimentos y lo s riesgos que ello conlíeva para el consumidor, limitan su

empleo. La nisina, un polipéptido producido por Lacrococcus facÉis, ha sido aceptado como

aditivo para su empleo en los alimentos por la comunidad científica internacional desde 1956. y

sus condiciones de empleo sc encuentran reguladas por la ED A (Food and Drug

Administration) (CFR, 1988).

En los últimos años se ha descrito la síntesis por las bacterias lácticas, de sustancias

antimicrobianas de naturaleza proteica. denominadas bacteriocinas, cuyas propiedades han

permitido concebir grandes esperanzas sobre su potencialidad como conservadores de lo s

alimentos.

U. 1 . 8.- Radiaciones

Las radiaciones ionizantes se caracterizan por su gran poder de penetración y su

letalidad a nivel celular (ICMSF. 1980). La aplicación práctica de las radiaciones ionizantes

para destruir microorganismos en productos alimenticios se ha desarrollado en las últimasdécadas. Durante los últimos 30 años, el empleo de las radiaciones ha sufrido constantes

cambios. Así, mientras a principios de los 60 se permitía su empleo en algunos alimentos, un

poco más tarde la administración americana las prohibió, basándose en que quizá éste método

de conservación pudiera inducir la formación de compuestos potencialmente mutagénicos,

cancerígenos o teratógenos. Por último, lo s resultados de múltiples estudios han demostrado la

seguridad de éste método: de ahí que la Comisión de expertos de la FAO/WHO haya

recomendado su empleo como procedimiento de conservación de los alimentos

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REVISION BIRLIOORA PICA

(FAO/IAEA/WHO Expert Committee. 1977).

La utilización de las radiaciones ionizantes presenta una serie de ventajas sobre otros

métodos higienizantes de conservación de los alimentos ya que, a dosis pequeñas (<0,5 Mrad)

no se producen cambios organolépticos apreciables en los alimentos e incluso a dosis más

elevadas (>1 Mrad), los cambios químicos son mínimos. Además, la penetración de la

radiación es instantánea, homogénea y profunda, permitiendo un control exacto del proceso, lo

que no ocurre en lo s tratamientos térmicOs.

II. 1 . 9.- Envasado

El envase que envuelve a lo s alimentos durante su almacenamiento, transporte y

manipulaciones posteriores, les proporciona una protección; química, impidiendo el paso de

agua, oxigeno y otros gases: física, al proteger al alimento de la luz, polvo o suciedad, de lapérdida de peso y de las alteraciones de origen mecánico y aú n biológico, al prevenir la entrada

de microorganismos e insectos. Los factores de lo s que depende el desarrollo microbiano en

los alimentos envasados son, aparte de la naturaleza del alimento y del tipo de

microorganismo, la permeabilidad del material del envase al 02, CO2 y vapor de agua, sobre

todo cuando en el envasado se utilizan el vacío o las atmósferas modificadas (Calvet, 1968).

II. 1 . 10.- Interacción de factores

Ninguno de lo s métodos descritos pueden, aisladamente, garantizar la calidad higiénica

de los alimentos, lo que lleva a eniplearlos conjuntamente para conseguir una actividad aditiva

o sinérgica.

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II. 1. II.- Las bacterias lácticas y su posible empleo como conservadores de los

alimentos

Los mecanismos mediante los que las bacterias lácticas ejercen su acción aniinicrobiana

se describirán en la sección II. 4. Las bacterias lácticas reunen una gran parte de las actividades

antimicrobianas utilizadas actualmente para la conservación de los alimentos en la industria

agroalimentaria; además poseen otros mecanismos que, si bien aisladamente no tienen gran

importancia, conjuntamente contribuyen a mejorar la efectividad antimicrobiana.

La síntesis por las bacterias lácticas de productos metabólicos finales como el CO2,

H2 02 y los ácidos orgánicos, el descenso del pH que ello conlíeva y la producción de

sustancias antimicrobianas como la reuterina y las bacteriocinas, hacen que, cada vez más, se

profundice en el estudio de las bacterias lácticas que han sido seleccionadas por su actividad

antimicrobiana, para su empleo como conservantes de los alimentos. (Friend y col.. 1983;

Raccach. 1981; Rubin y col., 1982)

II .2.- Bacterias lácticas: introducción histórica

Bajo el nombre genérico de “bacterias lácticas” se agrupan un número de

microorganismos cuya principal característica es la producción de ácido láctico a partir de

hidratos de carbono fermentables. El término “Bacterium acidi lactici” se debe a WeiEmamn

que lo propuso en 1899, aunque las primeras referencias a este tipo de bacterias se deban a

Hueppe (1884), quien describió una parte de la flora microbiana responsable de la acidificación

de la leche y productos lácteos, a la que se denominó “Milchsauerbacillus”.

Las bacterias lácticas se encuentran en los más variados habitats, entre los que se

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REI’LSVON BIBLICORA PICA

incluyen la leche y productos lácteos, carne y productos cárnicos, pescado, productos

vegetales, tracto gastrointestinal y urinario de personas y animales e, incluso, aguas residuales

y estiercol. Esta diversidad ecológica también origina una diversidad morfológica y fisiológica

de las especies de este grupo, lo que entraña una gran dificultad para establecer los rasgos de

semejanza que permiten reunir a todas las especies en un grupo homogéneo desde el punto de

vista taxonómico.

Orla-Jensen (1919) fué responsable de lo s primeros intentos de demarcación de éstegrupo microbiano, y son esos mismos criterios lo s que constituyen, todavía en la actualidad,

las bases de su clasificación:

1).- Criterios morfológicos: El grupo estada constituido por cocos y bacilos Gram-

positivos, no esporulados e inmóviles.

2).- Criterios fisiológicos: Microorganismos fermentativos con producción final de

ácido láctico, catalasa-negativos, microaerófilos o anaerobios, mesófilos, y con complejos

requerimientos nutritivos.

A pesar de que las características esenciales no se han alterado desde su

establecimiento por Orla-Jensen, s i se ha modificado la nomenclatura del grupo. Así por

ejemplo, de los seis géneros establecidos inicialmente (Bembaceiun;, Streptobacter¡un¡,

Thermobaceriuni, Betacoccus, So-eptococcus y Teti-acoccus) (Orla-Jensen. 1919), sólamente

se mantiene el género Sffepwcoccus. Los otros 5 han sido sustituidos por lo s géneros

Lac~robaciIIus (englobaría a Betabacterium, Sueptobacu’riuni y Thcrmobacteriu,n ),

Leuconoswc y Pediococcus. Estos cambios en la asignación de los nombres genéricos no son

más que un reflejo del dinamismo y fluidez de lo s criterios de clasificación, ya que, a medida

que se producen avances en las metodologías analíticas y en la filosoña de su clasificación,

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REVISION BIBLIOORAFICA

también se producen cambios en la denominación de géneros y especies, trasvase de especies

de unos géneros a otros y aumento del número total de especies. Como mejor se aprecia esta

evolución es observando las especies que se describen en las tres últimas ediciones del manual

de Bergey (Tabla I I . 1) (Breed y col., 1957; Buchanan y Gibsons, 1974; Kandler y Weiss,

1986).

Tabla II. 1.- Modificaciones en el número de especies de las bacterias lácticas

N ~ d e e s p e c i e s l i s t a d a s e n e l m a n u a l d e Be rg e v e n

l a s e d i c i o n e s d e

1 9 5 7 1 9 7 4 1 9 8 6Bacterias

B a c i l o s

Gén. Lactobacillus

Cocos

Gén.

Gén.

Gén.

1 5

Streptococcus

Pediococcus

Leuconostoc

1 9

2

3

N 9 t o t a l d e e s p e c i e s 3 9

2 7

2 1

5

6

59

45

29

8

4

86

1 6

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II . 2. 1.- Características generales

L o s m i c r o o r g a n i s m o s d e es t e gr u p o s e c a r a c t e r i z a n pri n c i pa l m e n t e p o r s e r b a c t e r i a s

Gram-positivas, catalasa-negativas, no esporuladas, inmóviles, anaerobias o microaerófilas,

ácido-tolerantes, no reductoras del nitrito y p r o d u c t o r a s d e á c i d o l á c t i c o como p ro d u ct o f i n a l d e

l a f e rm e n t ac ió n d e l o s h i d r a t o s d e c a r b o n o .

S in e m b a r g o l a t i n c i ó n d e Gram e s l a ú n i c a c a r a c t e r í s t i c a d e f i n i t o r i a , e xcl u yé n d o se d e l

gr u p o t od o m i c r o o r g a n i s m o Gra m- n e gat ivo. L a s o t r a s , n i s o n e x c l u s i v a s d e l a s b a c t e r i a s

l á c t i c a s , n i s o n con st ant es de nt ro d e l g r u p o . A s í p or e j e mp l o, a p e s a r d e con sid e ra rse

c a t a l a s a - n e g a t i v o s , s e c o n o c e d e sd e h ac e t ie m p o l a s r e a c c i o n e s c a t a l a s a - p o s i t i v a s d e l o s

Pediococcus ( F e l t o n y c o l . , 1 9 5 3 ) e incluso de otros géneros, incluido el Lactobacillus

( W h it t e n b u r y , 1 9 6 4 ) .

Las bacterias lácticas son generalmente inmóviles, aunque se han descrito un gran

número de cepas móviles con flagelos peritricos, especialmente cuando proceden de medios

diferentes de la leche y sus derivados; así se han descrito en la carne (Deibel y Niven, 1958),

en zumos de frutas (Hays y Reister, 1952) y en diversos productos fermentados (Vankova,

1957). El carácter microaerófilo es muy variable (Whittenbury, 1963), considerándose que es

la tensión de CO2. más que la anaerobiosis. la que favorece el desarrollo de las bacterias

lácticas.

La reducción de lo s nitratos a nitritos no se detecta en lo s medios que se emplean en el

desarrollo de éstas bacterias (Rogosa, 1961). La concentración de glucosa (2%) de estos

medios origina una elevada producción de ácido láctico y, consecuentemente, un gran

descenso de pH que inhibe la reducción. La capacidad reductora sólamente se aprecia

empleando medios de cultivo con un 0,1-1% de glucosa (Rogosa. 1961). De esta manera se ha

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REVISlON I3IBLIOGRA PICA

visto que la mayor parte de las bacterias lácticas aisladas de carnes curadas reducen los

nitratos.

La producción de ácido láctico o, más exactamente, la síntesis de este metabolito como

producto final de la fermentación de lo s hidratos de carbono, es uno de lo s principales criterios

para la diferenciación fisiológica de lo s distintos componentes del grupo. Las bacterias lácticas

se dividen en tres grupos fisiológicos distintos en virtud de sus diferencias enzimáticas (Buyze

y col., 1957):

1$.- Heterofermentativas obligadas: poseen los enzimas glucosa- 6-fosfato

deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa, pero carecen de la fructosa difosfato

aldolasa, originando como productos finales de la fermentación de las hexosas CO2 y ácido

láctico. Como fuente de hidratos de carbono sólamente pueden utilizar las hexosas.

2v).- Homofermentativas obligadas: poseen fructosa difosfato aldolasa, pero carecen

de las dos deshidrogenasas. Al igual que las anteriores son incapaces de utilizar las pentosas

como fuente de hidratos de carbono.

3$.- Homofermentativas facultativas: poseen las dos deshidrogenasas pero

metabolizan la glucosa por la vía de Embden-Meyerhof (glicolisis); utilizan las pentosas y se

corresponden con las Streptobacteria de Orla-Jensen.

Los esterolsómeros (D, L, DL) del ácido láctico resultante de la utilización de los

hidratos de carbono sirven como criterios de clasificación del grupo. Las especies del género

Leuconosíoc producen el isómero D(-) exclusivamente, mientras que lo s lactobacilos

heteiofermentativos producen la fonna racémica (DL). Esta diferenciación bioquímica se refleja

en la Tabla II. 2.

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REVISION BIBLIOGRA PiCA

Tabla II. 2.- Diferenciación bioquímica de las bacterias lácticas

Tipo de Producto final Configuración

Género fermentación del metabolismo del ácido láctico

Streptococcus Homofermentativa ácido láctico L(+)

Pediococcus Homofermentativa ác. láctico DL, L(+)

Lactobacillus:

Thermobac’terium Homofermentativa ác. láctico D(-), L(+), DL

Streptobacteriwn H om of e rm e n t at iv a á c . l á c t i c o D (- ) , L ( ± ) ,DL

Heterofermentativa (1) ~ láctico: ác . acético

(1:1) D(-), L(+), DL

Retabacterl ¡¡n i Heterofermentativa ác. láctico:ác. acético:C02

(1:1:1) DL

Leuconostoc Heterofermentativa ác. láctico:ác. acético:C02

(1:1:1) D (— )

(1 ) Utilización d e pentosas.

Fuente: Kandler, 1983.

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REVISION BIBLIOGRAFICA

IL 2. 2.- Taxonomia

La clasificación de las bacterias lácticas según la última edición del manual de Bergey

Kandler y Weiss, 1986) se muestra en la Tabla II . 3. Los Grupos 1 , 1 1 y 1 1 1 sustituyen a las

denominaciones de Therrnobacreriurn, Streptobacreriuní y Betabacíeriurn establecidas por

Orla-Jensen. Sin embargo, desde la publicación de ésta edición en 1986, y gracias a la

flexibilidad taxonómica y modificaciones de lo s criterios de clasificación anteriormente citados,

ya se han producido nuevos cambios en la taxonomía de este grapo.

Recientemente (Schillinger y Holzapfel, 1990), se ha propuesto la creación de un

nuevo género, denominado Carnobacteriurn, integrado por especies relacionadas con los

lactobacilos pero con peculiaridades diferenciadoras, como son el no poder desaiTollarse en

agar acetato, y hacerlo en medios con un pH alto (pH 8,5-8,9) y el sintetizar ácido oleico en

lugar de ácido cis-vaccénico. Actualmente Lactobacillus divergens y L. piscicola sedenominan, respectivamente, Carnobacteriuní divergens y C. piscicola, mientras C. mobile y

C. gauinarurn son los restantes componentes del nuevo género.

La sugerencia de separar a los estreptococos lácticos (tipo N de Lancefleld) del resto de

los estreptococos, creando con ellos un nuevo género denominado Lactococcus (Schleifer y

col., 1985), cristalizó en 1986 con la validación del nuevo género por la “International Unionof Microbiological Societies”. En éste caso, los criterios empleados para establecer la nueva

clasificación resultaron de tecnologías basadas en la hibridación de ácidos nucleicos, afinidad

ininunológica, composición lipídica y características químicas de la pared bacteriana (Sandine,

1988).

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REVíSlON RIIJLIOORA PICA

Tabla II. 3.- Taxonornia de las bacterias lácticas(a)

Género N9 de especies

Lactobacillus

Grupo 1 : Homofermentativos obligados 16

Grupo II : Heterofermentativos facultativos 1 1

Grupo III: Heterofermentativos obligados 18

Strepíococcus

Estreptococos piógenos 5

Estreptococos orales 9

Enterococos (tipo D de Lancefield) 4

Estreptococos lácticos (tipo N de Lanceñeld) 2

Estreptococos anaeróbicos 4

Otros Estreptococos 5

Pediococcus 8

Leuconostoc 4

N 2 total de especies 86

(a) Fuente: Kandlery Weiss, 1986; Hardie. 1986 yGarvie, 1986a, ]986b.

2 1

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Estas modificaciones taxonómicas se muestran en la Tabla 11 -4 : actualmente el grnpo

de las bacterias lácticas está constituido por microorganismos pertenecientes a lo s géneros

Lactobacillus, Lactococcus, Carnobaceriun¡, Pediococcus y &U¿co,,ostoc

Tabla II. 4.- Modificaciones recientes en la taxonomia de las bacterias lácticas

Nueva denominación

Género Loctococcus

Lactococcus Itictis subsp.

Lactococcus ¡cicÉ is subsp.

Lactococcus ladis subsp.

Lactococcus lactis subsp.

Lactococcus. garv¡ae

Lactococcus plantaruní (1)

Loctococcus raifinolacús

Género Carnobacíeriuní

Carnobacteri uní divergens

Carnobacterium piscicola

Car,¡obacterium niobile

Carnobacteriun, gaulinrn-un2

It,ctis

lacas

cremoris

hordinae

Antigua denominación

Streptococcus lactis subsp. lactis

Streptococcu.s ¡o c fis subsp. diacetvlactis

Streptococcus lacris subsp. crernoris

Lactobacillus hordince

Streptococcus garx’¡ae

Streptococcus planíau-u¡n

Streptococ-cus raifinolactis

Lociobacillus divergens

Lactobacillus piscicola

(1) No confundir con Lactobacillus plan taruní

Fuente: Sandine, 1988 y Schillinger y Holzapfel, 1990

22

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I I . 3.- Género Locrobacillus

Realizar una descripción profunda de los componentes de las bacterias lácticas

resultaría larga, tediosa e incluso improcedente, dado el tema central de este trabajo. Sin

embargo, si es interesante conocer algunas de las características morfológicas, fisiológicas y

bioquímicas más relevantes del género Lactobacillus.

La última edición del “Bergev’s Manual of Svstematic Bacteriologv” (1986) clasifica algénero Lactobacillus en el volumen 2. sección 14 como “bacilos Gram-positivos no

esporulados”. La sección comprende 7 géneros (Lacrobacillus, ErysipelothrLr. Brochothrix,

Listeria, Kurthia, Ca¡yophanon y Renibacrerium) que poseen en común ser bacilos

Gram-positivos, no esporulados, mesófilos, y que requieren medios complejos para su

crecimiento.

II. 3. 1.- Morfología

La morfología de los lactobacilos es variable, desde bacilos largos, rectos o

ligeramente curvados, hasta cocobacilos. Su longitud y curvatura depende de la edad del

cultivo, la composición del medio y la tensión de oxígeno. Como ejemplo de variabilidad en su

morfología podría citarse a L. delbrueckii subsp. buí garicus que en medios de cultivo líquidos

o en agar MRS crece en formaciones espirales debido a que las células permanecen unidas

después de la división, mientras que en la leche origina cadenas largas y filamentosas.

Según Bottazzi (1988), los distintos lactobacilos podrían distinguirse por sus

diferencias morfológicas. Así por ejemplo, lo s lactobacilos mesófilos son bacilos cortos,

gruesos, regulares y unidos, formando filamentos (Srreptobacteria ). Las especies wrmóñlas

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REVISION BiBLIOGRA PICA

son bacilos largos y rectos, de células separadas, en parejas o en empalizada. En las especies

heteroferínentativas obligadas, la morfología típica es la de bacilos cortos, rectos y separados.

Algunas especies de lactobacilos productores de gas (L. ferrnentum o L. brevis) pueden

presentar una morfología mezcla de bacilos largos y cortos, en el mismo cultivo e, incluso, en

una misma colonia (Kandler y Weiss. 1986).

Los cocobacilos pueden ser tan extremadamente cortos que pueden llegar a

confundirse con los Leuconostoc o estreptococos. De otra parte, algunos estreptococosligeramente alargados se han confundido durante mucho tiempo con lactobacilos (Garvie y

col., 1981). La división celular de lo s lactobacilos tiene lugaren un solo plano, mientras que la

tendencia a formar cadenas varía entre las distintas especies e, incluso, entre las distintas

cepas, dependiendo de la fase de desarrollo y del pH (Rhee y Pack, 1980).

1 1 . 3. 1 . 1.- Motilidad

El género Lactobacillus comprende bacterias inmóviles, aunque algunas especies se ha

visto que son móviles por poseer flagelos peritricos. En cualquier caso su motilidad depende

del medio y de la edad del cultivo, y sólo se observa en el momento del aislamiento,

perdiéndose al resembrarías en diversos medios de cultivo.

1 1 . 3. 1 . 2.- Tinción

Quizá la característica común de éste género (al igual que en las bacterias lácticas en

general) sea la reacción positiva a la tinción de Gram. Sólo las bacterias de cultivos viejos y las

deterioradas muestran resultados variables. Si se emplea la tinción de Gram o la del Azul de

Metileno pueden observarse granulaciones internas, sobre todo cuando se trata de lactobacilos

homofermentativos que forman bacilos Largos. Observados con microscopia electrónica

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RE VLSION BIBLIOORA PICA

En los medios de cuhivo líquidos las bacterias sediiíientan rápidamente cuando cesa su

desarrollo. El sedimento es liso y homogéneo, siendo muy rara la presencia de precipitados

granulares o mucilaginosos. Los lactobacilos no forman películas superficiales ni originan

olores específicos durante su crecimiento en lo s medios de cultivo ordinarios, a pesar de

contribuir al desarrollo del aroma de lo s alimentos fermentados. Este aroma es consecuencia de

la producción de compuestos volátiles, como diacetilo y derivados. 1 - 1 2 5 y aminas, que se

liberan al medio durante el desarrollo microbiano (Sharpe y Franklin, 1962).

II. 3. 4.- Necesidades nutritivas

El género Lactobacillus, al igual que el resto de las bacterias lácticas, tiene unas

necesidades nutritivas muy complejos ya que necesitan como fuente de energia y de carbono,

además de hidratos de carbono. nucleótidos, aminoácidos y vitaminas. Todas las especies del

género, (salvo algunas cepas) requieren ácido pantoténico y nicotínico, mientras que la tiamina

sólo es necesaria para el desarrollo de los lactobacilos heterofermentativos. Las necesidades de

vitaminas son variables dependiendo de la especie, pero la mayoríanecesita riboflavina y, muy

pocas, biotina o vitamina B2.

A pesar de necesitar medios muy complejos para su desarrollo, la mayor parte de lo scomponentes del género (sino todos) tienen en su genoma la información necesaria para

sintetizar todos los nutrientes citados. Además, se ha visto que los mutantes de L. casei

sintetizan determinados aminoácidos en medios carentes de los mismos (aunque crecen mucho

más lentamente), dicha capacidad la pierden cuando crecen en medios más complejos, lo que

acelera su velocidad de crecimiento (Morishita y col., 1974). Estos complejos requerimientos

nutritivos de los Lactobacilos actuales reflejan la selección natural de inutantes deficientes endeterminados rutas biosintéticas. lo que les permite crecer más rápidamente que las cepas

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REVISION BII3LIOCRA PICA

originarias en medios de cultivo con muchos nutrientes

II. 3. 4. 1.- Medios de cultivo

Los medios empleados para el crecimiento de lo s lactobacilos cubren sus necesidades

nutritivas y están constituidos por hidratos de carbono fermentables, extractos de carne y

extracto de levadura. Además, la mayor parte de las especies necesitan otros compuestos

específicos que favorezcan su crecimiento; en algunos casos son esenciales para el desarrollo,tal como ocurre con el jugo de tomate, manganeso, acetato y ésteres del ácido oleico

(especialmente Tween 80). Los compuestos citados, excepto el jugo de tomate, forman parte

del medio de cultivo MRS (De Man y col., 1960) que es. sin duda, el más utilizado para el

crecimiento de los lactobacilos.

Por otra parte, algunos lactobacilos adaptados a sustratos muy particulares necesitan

factores de crecimiento especiales. Algunas especies aisladas del vino de arroz, necesitan ácido

D-mevalónico, mientras que L. sanfranciscus necesita un péptido de bajo peso molecular

aislado del extracto de levadura (Berg y col., 1981).

El pH del medio también influye en el crecimiento que es mayor en medios ligérarnente

ácidos, cuyo pH inicial varía de 6,4 a 4,5. El crecimiento se detiene cuando se alcanza un pH

de 4,0 a 3,6 dependiendo de la especie y cepa. La aireación también es importante ya que,

aunque la mayor parte de las cepas se desarrollan en condiciones normales de aerobiosis, el

crecimiento será óptimo bajo condiciones de anaerobiosis o microaerofilia. Pero, más que la

anaerobiosis, lo que influye en el crecimiento es la tensión de CO2 (más incluso que la tensión

de 02 ) , considerándose óptima la presencia de un 5-10% de CO2 (Kandler y Weiss. 1986).

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R IP VISION BII3LIOGRA PICA

La temperatura de incubación óptima, que fué uno de los criterios iniciales de

clasificación de las bacterias lácticas (Orla-Jensen, 1919), también varía con la especie. La

mayor parte de las especies (mesófilas) tienen una temperatura óptima de crecimiento de 25-30

con un límite superior de 40 0C. Algunas crecen a temperaturas menores de 1 5 0C y, muy

raramente, a menos de 5 0C siendo el limite inferior lo s 4 0 C , temperatura a la que crecen

algunas estreptobacterias atípicas de indudable interés bromatológico (Schillinger y Locke.

1987a).

1 1 . 3. 5.- Metabolismo

Desde el punto de vista metabólico se considera que lo s lactobacilos se encuentran en

el límite entre el metabolismo anaeróbico y aeróbico. No poseen quinonas isoprenoides

(excepto L. vanrnnwshiensis y L casel subsp. rhwnnosus ) (Collins y iones, 1981) , ni

sistemas de citocromos con los que realizar la fosforilación oxidativa típica del metabolismoaeróbico. Sin embargo, poseen oxidasas y peroxidasas que oxidan el NADH

2 utilizando al 02

como aceptor final de electrones. A pesar de no tener catalasas ni peróxido~dismutasas también

metabolizan lo s peróxidos mediante un sistema enzimático catalizado por el Mg++ (Gótz y

col., 1980).

los lactobacilos son de metabolismo esencialmente fenuentativo; degradan las hexosas

utilizando dos vías enzimáticas (fig. 2.1):

lo).- Via de Em~en-Meverhof (glucolisis), por la que convierten un niol de hexosa en

dos moles de ácido láctico (fermentación homoláctica).

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ciio

« 1- ‘ -1

m

ti)

ti)*4 -4os .lti )4 -)eJ

Tríasa - 32

ADP

P

rFiruvato

-6P

62 - Gluconato

Xiluiosa 5 2 + 00 2

4—

Triosa - 3P + Acetíl - 2

AD 2

AT 2

Piruvato

l f rLactato Lactato

r1

Acetato ( E t a n o ] >

VIA EMBDEN-MEYERHOF VTA 6 — FOSFOGLUCOPJATO

(Otucotisis)

(Homofermentativas) (Heterofermentat i v a s >

Figui-a 2. 1.- Repi-esentación esquemática de las rutas metabólicas del género Lacwbacillus.

( A d a p t a d o d e K a n d l e r , 1 9 8 3 ) .

Fructosa — 1,6 F Glucosa

o

r

E n

o

tiIt ji‘-1

uIt

14 - 1

1

Ho4Jti )- uo41

o4 - 1

m

29

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REVIS ION IIIBLIOGRA PICA

2v).- Vía del 64osfogluconato, por la que producen un mol de CO2, un mol de etanol

( o d e á cid o a c é t i c o ) y u n ml d e á c i d o l á c t i c o ( f e r m e n t a c i ó n h e t c r o l á c t i c a ) . E n co n d ici on e s d e

a e ¡ o b i o s i s , l a m a y o r pa r t e d e l a s c e p a s u t i l i z a n a l 0 2 como a c e p t o r f i n a l d e e l e c t r o n e s , mien t ras

no reducen el Acetil-CoA (Kandler, 1983).

El ácido pirúvico es un metabolito intermediario dc las dos rutas metabólicas

f e r m e n t a t i v a s , s i e n d o l a c a n t i d a d d e h e x o s a d e l me d io l a q u e r e g u l a e l t ip o d e f e r m e n t a c i ó n , d e

forma que si escasea éste azucar, la fennentación homoláctica se conviene en heteroláctica con,

p r o d u c i ó n f i n a l d e á c i d o s a c é t i c o . f ó r m i c o y d e e t a n o l ( T h o m a s y c o l . . 1 9 7 9 ) . E l á cid o láctico

formado, puede oxidarse originando ácido acético y fórmico mediante mecanismos no bien

conocidos (Kandler, 1983).

L ad i f e r e n c i a e n t r e

l a c t o b a c i l o s homoy h e t e ro f e rm e n t at iv os s e e n c u e n t r a e n l a

p r e s e n ci a o au se n ci a d e lo s enzimas difosfofructo-aldolasa y fosfocetolasa. Así, mientras los

lactobacilos heterofermentativos obligados sintetizan fosfocetolasa pero no Mdolasa, los

homofermentativos sintetizan aldolasa pero no fosfocetolasa.

Los lactobacilos heterofermentativos hidrolizan las pentosas gracias al enzima

fosfocetolasa, originando cantidades equimolares de lo s ácidos acético y láctico. Sin embargo,algunos lactobacilos liomofermentativos (Su-epíobacíeriun¡ de Oila-Jensen) poseen un aldolasa

y un fosfocetolasa que se activan únicamente en presencia de pentosas, de manera que

hidrolizan las hexosas siguiendo la vía Embden-Meyerhoff, originando ácido láctico, mientras

que las pentosas por la v í a d e l 6 - f o s f o g l u c o n a t o d an l u g a r a c a n t i d a d e s e qu im ol ar e s d e á cid os

láctico y acético, pero no originan CO2, convirtiéndose así en los denominados

heteroferníentarivos facultativos (Kandler. 1983).

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El ácido láctico procedente de la fermentación de los hidratos de carbono, posee una

configuración D- o L- dependiendo de la estercoespecificidad del lactato deshidrogenasacelular. En presencia de O- y L-lactato deshidrogenasas, el ácido láctico se produce en su

forma racémica (DL). Lo mismo que ocurre cuando coexisten L-lactato deshidrogenasa y

lactato racemasa inducible. Esta última circunstancia es la que se produce en L. casel, L.

cuivatus y L. sa/ce (De Vries y c o l . , 1 9 7 0 ) . L a m a y o r p a r t e d e l o s e n z i m a s n o s o n a l o s t é r i c o s ,

pero algunas especies (L. cusei, L. cur’.’atus, L. sa/ce y L- bavaricus), poseen L-lactato

deshidrogenasas alostéricos cuyos activadores son la fructosa difosfato y el Mn±±(Hensel y

c o l . , 1 9 7 7 ) .

L o s l a c t o b a c i l o s t am b ié n e m p l e a n l o s h i d r a t o s d e ca rb on o c o n o t r o s f in es a d e m á s d e l a

obtención de energía. La sacarosa se utiliza en la síntesis de mucopolisacáridos y la fructosa

puede utilizarse como aceptor de electrones dando lugar a la formación de manitol. La mayoria

de lo s monosacáridos y oligosacáridos que utilizan las células como fuente de energía proceden

del medio extracelular, penetrando en su interior con ayuda de permeasas específicos, no

obstante, en algunas espeéies la lactosa y la galactosa se transportan mediante un sistema

enzimático fosfoenol piruvato fosfotransferasa (PEP-PTS) (Chassy y Thompson, 1983).

T a m b i é n s e c o n o c e n o t r o s s i s t e m a s d e t ra n sp on e a c t i v o d e a m i n a s y a m i n o á c i d o s ( L a w y

Kolstad, 1983).

I I . 3 . 6 . - C o n s i d e r a c i o n e s t a x o n ó m i c a s ~ C l a s i f i c a c i ó n

P a r a l a c l a s i f i c a c i ó n d e l a s d is t in t as e s p e c i e s d e l gé n e ro Lactobacillus se han

co n sid e ra d o n u m e ro s o s p a r á m e t r o s , e n t r e l o s q u e s c e n cu e n t ra n l a d e t e rmi n ac i ó n d e l o s t i p o s

d e p e p t id ogl ican o d e l a p a r e d c e l u l a r ( W i l l i a n s , 1 9 7 5 ) , l a f e rm e n t ac ió n d e l o s az ú ca re s y l a

temperatura de crecimiento (Schillinger y L o c k e . 19 8 7b ) , l a m o vi l i d a d e l e c t r o f o r é t i c a d e

d i v e r s o s e n z i m a s ( Lo n d o n , 1 9 7 6 ) , e l an á li si s i n mu n o l ó gi co d e l a s l a c t a t o deshidrogenasas

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REi’I~SION fi IBLIOGRA PICA

homólogas (London, 1976), el grupo antigénico (Sharpe, 1970), la determinación de los

isómeros de ácido láctico y, por último, la de hibridación del DNA, que es la más emplea da en

la actualidad para determinar L a proximidad filogenética entre dos especies (Simonds y col.,

1971).

El primer intento de clasificación de lo s lactobacilos lo realizó Orla-Jensen (1919),

quién los dividió en tres géneros d istintos según las temperaturas óptimas de crecimiento y los

productos finales de su metabolismo fermentativo. Estos tres géneros, (“Thermobacteriurn“Stre¡nobacíe¡-iurn “ y “Betabacíe,-iurn” ) , ya no aparecen como tales en la última edición del

“Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” (Kandler y Weiss., 1986) al considerarse que

la división de Orla-Jensen no origina grupos homogéneos desde el punto de vista filogenético.

Así, y a pesar de que la mayoi-ía de las especies de cada uno de lo s grupos actuales

(denominados 1 , II y III ) coincide con las características d e las “termobacterias”,

“estreptobaterias” y “betabacterias” respectivamente, algunas de las especies descubiertas

recientemente no cumplen dichas características. La clasificación en tres grupos se realiza en

virtud de su metabolismo fermentativo.

II. 3 . 6. 1.- Gruno 1 .- Homofermentativos obligados

Este grupo se encuentra formado por dos subgrupos de especies relacionadas entre si:

en el primero se encuentran L. delbrucck-ii, L. bulgaricus, L. lactis y L. leichrnanníi, mientras

en el segundo aparecen L. acidophilus, L. gasseri y L. crispatus. Dicho grupo comprende la

mayor parte de las termobacterias de Orla-Jensen.

3 2

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REt’íSION BíBLIOCRAFICA

II. 3. 6. 2.- Grupo II.- Heterofermentativos facultativos

El grupo lo integran tres subgrupos: Uno primero, representado mayoritariamente por

L. plantaruni, un segundo con distintas subespecies de L. casei y un tercero que comprende a

L. sa/ce, L. curvatus y L. bavaricus . Los dos primeros subgrupos de esta división se

corresponderían con las antiguas “estreptobacterias”, mientras el tercero comprendería las

denominadas “estreptobacterias atípicas” (Thornley y Sharpe, 1959).

II . 3 . 6 . 2. 1.- Estreytobacterias atínicas

Las dos primeras especies de éste grupo, L. sa/ce y L. curva/as, muestran un alto

porcentaje de homología según las técnicas de hibridación del DNA. Además, las dos poseen

una racernasa inducible por ácido láctico, que convierte el ácido L(±)-lácticoen ácido láctico

racémico (Kandler y Weiss, 1986). Esta circunstancia, y otras características fenotípicas

diferencian éstas dos especies del tercer componente del grupo, L. bava¡-icus. La diferenciación

entre L. sa/ce y L. curvatus se fundamenta en su capacidad de utilizar diversos azúcares

(Schillinger y Liicke, 1987b). Este subgrupo también se considera como los “lactobacilos

psicrotofos verdaderos” (Reuter, 1981), al ser lo s que se desarrollan a temperatura más baja de

todos los lactobacilos (2-4 0C) . Otra característica que las diferencia de las estreptobacterias

típicas es su aspecto cocoide cuando se siembran en medios sólidos (Reuter, 1981).

II. 3. 6. 2. 1 . 1.- Lactobacillus saLe

Lactobacillus saL-e recibe esta denominación (Katagiri y col.. 1934) por haberse

a i s l a d o p or p ri me ra v e z d e e s t e p ro d u ct o j a p o n é s, s i e n d o s u s p r i n c i p a l e s c a r a c t e r í s t i c a s

(Champomier y col., 1987) las de poseer una morfología cocobacilar ligeramente curvada y

regular, sobre todo en la fase estacionaria, con un tamaño de 0,8-1 p.m de ancho por 2-3 gm

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de largo y por desarrollarse aislado o en cadenas co¡-tas Heterofermentativo facultativo,

produce lo s isómeros D- y L- del ácido láctico, sedesaiTolla a 2-4 0C y 1 5 0C, pero no a 45

crece a pH 3,9 y en medios con un 8% de NaCí, pero no cuando tienen un 10% de NaCí y

utiliza los siguientes hidratos de carbono: D-ribosa, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa,

D-manosa, N-acetilglucosamina, D-melibiosa, 0-trealosa, sacarosa y gluconato, pero no estos

otros: dulcitol, inulina, D-melicitosa, D-rafinosa, glucógeno, D-wgatosa, L-fucosa, D-arabitol,

D-arabinosa, D-xilosa, L-sorbosa, ramnosa, D-manitol y sorbitol. L. sa/ce también se ha

aislado de ensilados, carne, embutidos crudos madurados (Schillinger y Lúcke, 1987b. 1989)

y d e p rod u ct os c á r n i c o s e n vasa d os a l v a c í o .

II. 2. 6. 3.- Grupo ¡IL- l-ieterofennentativos obligados

E st e g ru p o l o f o r m a n c a s i i n t e g r a m e n t e l a s “ b e t a b a c t e r i a s ” d e O r l a - J e n s e n , a l a s q u e s e

han unido otras especies de reciente descubrimiento y comprende 18 especies entre las que

d e s t a c a n : L. bife,-mentans, L. vi¡-idescens, L. safranciscus L. ferrnenturn, L. reuteri, L.

confusus, L. brevis, L. halotolerans, L. kefir y L. fructivoraus.. En la última edición del

Ber2ev’s Manual of Svstematic Bacteriolotzv (Kandler y Weiss,1986) también se incluye en

e s t e gr u p o a L. diveí-gens, a u n q u e act ual men t e s e admite que esta especie pertenece al género

Carnobacteriun;.

1 1 . 3. T- Ecolo2ía. habitats y biotecnología

E l g é n e ro Lactobacillus, como el resto de las bacterias lácticas, se encuentra

ampliamente distribuido en la naturaleza debido a que es capaz de desarrollarse en las

co n d ici on e s am b ie n t al e s m a s d i v e r s a s , s i e mp r e y c u a n d o e x i s t a n e n e l m e d i o l o s complejos

nutrientes que necesita (hidratos de carbono, péptidos y aminoácidos, ácidos nucleicos yv i t a m i n a s ) . E l d e s a r r o l l o e n a n a e r o b i o s i s y e n t r e u n am p l io i n t e r v a l o d e t e mp e ra t u r as (2 - 4 5

3 4

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REVISIÓN BIBLIOCRA PICA

0 C ) . a s í como s u t o l e r a n c i a a u n a t e n s i ó n d e 0 2 b a j a , pe rmit e d e t e c t a r l o s e n l o s m á s v a r i a d o s

habitats, como en los ensilados y productos fermentados vegetales, zumos de frutas, cerveza,

vino (Whitting, 1975; Sharpe, 1981: Kandler, 1984), queso (Botazzi y col., 1973), yogur

(Davis, 1975) y otras leches fermentadas (Kandler y Kunath, 1983), productos cárnicos

refrigerados (Reuter. 1975). embutidos crudos curados y productos cárnicos envasados al

vacío (Holzapfel y Gerber, 1983). También se han aislados de pescados (Cone, 1982) del

tracto gastrointestinal y urinario de personas y an im al e s ( S h a r p e y c o l . , 1 9 7 3 ; S h a r p e , 1 9 8 1 ;

Dent y Willians, 1982), asi como del estiércol y de las aguas residuales (Okada y col., 1979;Weiss y col., 1981).

El efecto beneficioso de éstos microorganismos al impedir de diversas maneras el

desarrollo de otros microorganismos patógenoso alterantes, así como los cambios

organolépticos y nutritivos favorables que originan al multiplicarse en diversos sustratos.

hacen que algunas especies del género Lacrobacillus se hayan utilizado desde hace tiempo enl a e l a b o r a c i ó n d e al ime nt os f e r n i e n t a d o s ( y o g u r , k e f i r , l e c h e s acidificadas, embutidos crudos

curados) y ensilados. Son microorganismos tecnológicos indispensables y seguirán siéndolo

en la futura tecnología de lo s alimentos y, sin duda, aumentará su interés en salud humana y

animal.

1 1 . 4.- Actividad antimicrobiana de l a s b a c t e r i a s l á c t i c a s

La actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas se conoce desde hace tiempo, s i

bien de una forma empfrica. Hasta hace muy poco tiempo no se inició el estudio científico del

mecanismo, o los mecanismos mediante los que las bacterias lácticas manifiestan su actividad

a n t i m i c r o b i an a.

A c t u a l m e n t e s e p i e n s a q u e e l p ri me r m e c a n i s m o an t im ic ro b ia n o e j e i c i d o p or l a s

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RE VISíaN BIBLIOGRA PICA

bacterias lácticas pod¡ia serel de la simple competencia por lo s nuti-ientes, como consecuencia

de las distintas velocidades de crecimiento de lo s microorganismos, es muy posible que una

determinada especie bacteriana de crecimiento rápido agote lo s nutrientes c¡íticos presentes en

el sustrato, perjudicando la existencia de otros microorganismos. Este sistema no es exclusivo

de las bacterias lácticas, aunque s i lo s so n los que a continuación se detallan.

II. 4. 1.- Actividad antimicrobiana de lo s ácidos orgánicos

Como consecuencia de su metabolismo fermentativo, las bacterias lácticas sintetizan

ácidos orgánicos, lo que se acompaña de una notable caida del pH del medio.

L a acción antimicrobiana de los ácidos orgánicos puede deberse a tres factores

( Be u c h a t y G o l d e n , 1 9 8 9 ) :

i Q ) . ~ A l e f e c t o a n t a g o n i s t a d e l a c a i d a d e l p H , qu e i n h i b e e l d e s a r r o l l o d e o t r o s

microorganismos ácido-sensibles.

2Q)< A la actividad antagonista de la forma no disociada del ácido que penetra en el

interior de las células e inhibe algunas reacciones enzimáticas metabolicamente importantes.

39.- A l a a c c i ó n e s p e c í f i c a d e l o s á c i d o s o r g á n i c o s , y a q u e l o s d e m á s d e 4 á t o m o s d e

c a rbo n o a u m e n t a n s u a c t i v i d a d a n t i m i c ro bi a n a a m e d i d a q u e l o h ac e l a l o n g i t u d d e l a c a d e n a .

No obs t ant e, l a e sca sa l i p o s o l u b i l i d a d d e l o s á c i d o s d e m á s d e 8 á t o m o s d e ca rb on o,

d i s m i n u y e s u a c t i v i d a d e n l a s b ac t er ia s G r am- n e gat ivas ( B a i r d P a r k e r , 1 9 8 0 ) .

L o s á c i d o s o rgá n i c o s d e ca d e n a c o r t a , como e l l á c t i c o y a c é t i c o , s o n l i p o f í l i c o s c u a n d o

no están disociados, por lo que pueden penetrar al interior de lo s microorganismos

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REVÍSION BíBLIOGRA PICA

disminuyendo el pH intracelular, alterando sustratos enzimáticos e inhibiendo funciones

metabólicas esenciales corno la fosforilación oxidativa (Haird Parker. 1980). E L queel ácido

acético sea más inhibidor en mohos y levaduras (Baird Parker, 1980) que el láctico podría

deberse a que a pH 4,0-4,6 (e l natural del entorno donde se desarrollan las bacterias lácticas)

este ácido está entre 2 y 4 veces menos disociado que el láctico (Lindgren y Dobrogosz,

1 9 9 0 ) . L o s á cido s a c é t i c o y l á c t i c o p u e d e n a c t u a r s i n é rg i c a m e n t e i n h i b i e n d o e l cr e cim ie n t o d e

salmonelas (Rubin, 1978) y levaduras (Moon, 1983) ya que el bajo pH que proporciona el

ácido láctico aumenta la concentración del ácido acético no disociado. Otros ácidos producidospor las bacterias lácticas en diversos sustratos, como fórmico, cítrico y málico, tienen una

actividad antimicrobiana menor que lo s citados.

II. 4. 2.- Actividad antimicrobiana de componentes inorgánicos

Las bacterias lácticas también producen otros compuestos antimicrobianos como CO2,

H202 y el diacetilo.

I I . 4 . 2 . 1.- Dióxido de carbono

El CO2 producido como consecuencia del metabolismo heterofermentativo obligado

e j e r c e s u a c c i ó n a n t i b a c t e r i a n a c r e a n d o un ambiente anaeróbico al reemplazar el 02, impidiendo

así el desarrollo de los microorganismos aeróbios obligados, o bien mediante una actividad

inhibidora intrinseca y variable según el microorganismo de que se trate (Clark y Takacs,

1980).

A u n q u e n o s e c o n o c e c o n e x a c t i t u d e l mecanismo íntimo por el que el CO2 ejerce su

a c c i ó n a n t i m i c r o b i a n a , q u i z á s e d e b a a l e f e c t o d e d ich o c o m p u e s t o e n l a i n h i b i c i ó n d e

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REl’ISION BIBLIOGRA PICA

d e sca rb ox il acio n e s e n z i m á t i c a s ( Ki n g y N a g e l , 1 9 7 5 ) o p o r a c ú m u l o d e ¡ CO2 e n l a b i c a p a

lipidica de la membrana celular, alterando su permeabilidad (Eklund, 1984).

1 1 . 4. 2. 2.- Peróxido de hidró2eno

A l g u n a s b a c t e r i a s lá ct ic as s i n t e t i z a n H202 e n p r e s e n c i a d e o x í ge n o g r a c i a s a l a

actividad de determinadas flavoprotein-oxidasas o NADH-peroxidasas. Este H202 se

acumula en el medio exocelular ya que las bacterias lácticas carecen, de actividad catalasa

(Kandler y Weiss, 1986). La producción de H202 por las bacterias lácticas depende de la

c e p a y d e l a c a n t i d a d d e ox ig e n o p r e s e n t e ( C o l l i n s y A r a m a k i , 1 9 8 0 ) . D a h i y a y S p e c k (1 96 8 )

y P r i c e y L e e ( 1 9 7 0 ) . d e mo st rar on e l e f e c t o i n h i b i d o r d e l H202 p rod u ci d o p o r l a s b a c t e r i a s

l á c t i c a s , e n d i v e r s a s c e p a s d e Sraphylococcus al/leus y Pseudornonas spp. El efecto bactericida

d e l H202 s e a t r i b u y e a s u p o t e n t e a c c i ó n o x i d a n t e e n l a c é l u l a b a c t e r i a n a ( F o o s t e r y c o l . , 1 9 5 7 )

y a la destrucción de estructuras moleculares básicas de las proteinas celulares (Sykes, 1965).

Asimismo, algunas bacterias lácticas presentes en la leche, activan el sistema

a n t i b a c t e r i a n o d e l a l a c t o p e r o x i d a s a ( B j ó r c k , 1 9 8 5 ) , d e b i d o a l a s í n t e s i s e n a e r o b i o s i s d e H202

(Carlsson y col., 1983). La actividad antimicrobiana del H202 es variable, no afectando

prácticamente a las bacterias Gram-positivas entre las que se incluyen las bacterias lácticas,

mientras que las Gram-negativas, como Escherichia coIi, Salmon ella s p p . y Pseudomonas

spp. son muy sensibles a su actividad (Bjórck, 1985). Se cree que el efecto antimicrobiano del

sistema lactoperoxidasa se debe a la oxidación de lo s grupos -SH de algunos enzimas

metabólicos vitales, como la hexoquinasa, aldolasa y gliceraldehido-3P deshidrogenasa

(Bjórck, 1985).

3 8

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REVISIÓN I3IULIOGRAFICA

II. 4. 2. 3.- Diacetilo

Algunas especies de bacterias lácticas producen, a partir del citrato, díacetílo

(2.3-butanodiona) (Jay,1982), siguiendo la vía del piruvato que es el metabolito intermediario

( Ka n d l e r , 1 9 8 3 ) . A p e s a r d e q u e e l me t ab ol is mo d e l a s h e x o sa s i n h i b e l a p ro d u cc ió n d e

diacetilo, éste se acumula en el medio y, además de generar el aroma que caracteriza a ciertos

productos como la mantequilla, ejerce una actividad inhibidora sobre un gran número de

microorganismos, tanto Gram-positivos como Gram-negativos (Jay, 1982). Esta actividad sefavorece cuando el pH del medio es bajo (Jay, 1982). El diacetilo inhibe el desaiTollo de los

microorganismos Gram-negativos al interaccionar con el metabolismo de la arginina,

impidiendo la utilización de éste aminoácido (Jay. 1986).

II. 4. 2. 4.- Reuterina

Lactobacillus reuteril es el único lactobacilo y q u i z a s l a ú n i c a b a c t e r i a , q u e p ro d u ce

reuterina y la libera en el medio exocelular como consecuencia del metabolismo anaeróbico del

glicerol.

La reuterina (Axelsson y col., 1989), es una sustancia antimicrobiana activa frente a

bacterias Gram-positivas, Gram-negativas, levaduras, hongos y protozoos. Químicamente es

una mezcla homogénea de monómeros, monómeros hidratados y dímeros cíclicos del aldehido

3-hidroxipropiónico (Talaricco y Dobrogosz, 1990) que proceden del glicerol mediante una

reacción catalizada por una coenzima glicerol-deshidratasa dependiente de la vitamina 812

(Talaricco y Dobrogosz, 1990; Talaricco y col., 1990). De ésta formaL. reuter¡i es la única

bacteria conocida capaz de utilizar el glicerol como aceptor alternativo de hidrógeno durante la

fermentación de los hidratos de carbono, produciendo mayor cantidad de aldehido

3-hidroxipropiónico del que es capaz de reducir, por lo que éste se libera en el medio

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REVISION BIBLiOGRA PICA

extracelular donde manifiesta su actividad antimicrobiana. Entre los microorganismos sensibles

a esta sustancia se encuentran Salmondlla sp., Shigella sp., clostridios, estafilococos,

listerias, candidas y tripanosomas.

II. 4. 3.- Efecto antimicrobiano de las bacteriocinas y s u s t a n c i a s a f i n e s

La primera noticia sobre la producción por las bacterias lácticas de sustancias

antagonistas, distintas de los productos finales del metabolismo microbiano, se atribuye a

Rogers (1928), quien describió la actividad antimicrobiana de &reptococcus lactis

( ac t ual me n t e Lacococcus ladús) sobre L. ac¡dophilus . D e s d e e n t o n c e s s e h an i d e n t i f i c a d o u n

c i e r t o n ú m e r o d e s us t a n c i a s p r o t e i c a s , c o n act ivid ad an t im ic ro b ia n a sob re ot ros

microorganismos. Este grupo está constituido por una serie de sustancias de composición

q u í m i c a , m e c a n i s m o d e a c c i ó n y e s p e c t r o a n t i m i c ro bi a n o va r ia b le .

Por la importancia que tiene este grupo de sustancias, al que pertenece el agente

an t imi cro bi an o a i s l a d o y c a r a c t e r i z a d o par cial ment e e n es t e t r ab aj o , s e á n o s p e r m i t i d o d e s c r i b i r

y r e v i s a r c o n c i e r t o d e t a l l e s u s a s p e c t o s m á s so b r es al ie n t es .

I I . 5.- Bacteriocinas: Definición

L a s b a c t e r i o c i n a s s e d e f i n e n como p r o t e i n a s o c o m p l e j o s d e n a t u r a l e z a p r o t e i c a c o n

acción bactericida en microorganismos filogenéticamente muy próximos a la bacteria

productora (Tagg y col., 1976). Este grupo heterogéneo de sustancias, generados tanto por

m i c r o o r g a n i s m o s G ra m- p os it ivo s como G ra m- n e ga t iv os , v a r í a mucho e n p ro p ie d a d e s

b i o q u í m i c a s , e s p e c t r o a n t i m i c ro bi a n o y m e c a n i s m o d e a c c i ó n .

4 0

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REI’ISION BIBLIOGRA PICA

1 1 . 5. 1 .- Detección de bacterias nroductoras de bacteriocinas

La detección de bacterias con actividad antirnicrobiana, a t r i b u i b l e a l a s b a c t e i i o c i n a s , s e

realiza en dos fases o etapas: 1).- detección de la cepa productora de la actividad antagonista, y

2).- diferenciación de la actividad antimicrobiana debida a las bacteriocinas de otras posibles

causas de inhibición.

I I . 5. 1 . 1 . - Detección de las ceDas uroductoras

Silo que se pretende es detectarla posible actividad antimicrobiana de un gran número

de bacterias lácticas aisladas de diversos sustratos alimentarios, el método de elección consiste

en utilizar la denominada “prueba general de antagonismo”, que se realiza en un medio de

cultivo sólido en el que se observan fácilmente los halos resultantes de la inhibición del

desarrollo de un microorganismo indicador producida al crecer en la misma placa cada una delas bacterias lácticas aisladas. Los métodos experimentales más utilizados son el “antagonismo

directo” y el “antagonismo diferido” (Tagg y col.,1976). En cualquier caso, se basan en la

siembra de colonias aisladas de la cepa problema en un medio sólido apropiado, sobre el que

se deposita una capa de medio sólido o semisólido que lleva el microorganismo indicador.

II. 5. 1 . 2.- Prueba del anta2onismo directo

La prueba más sencilla y utilizada se basa en el método desarrollado por Orada (1946).

En este caso, la cepa problema y el cultivo indicador se desarrollan simultáneamente y la

v i s u a l i z a c i ó n de la actividad antimicrobiana sólo es posible s i se produce durante las primeras

f a s e s d e cr e ci mi e n t o d e l a c e p a p r o b l e m a ( Ta gg y c o l . , 1 9 7 6 ) . T a m b i é n e s i m p o l - t a n t e l a

densidad del cultivo indicador utilizado (Kuttner, 1966). El cultivo indicador se deposita en las

placas inmediatamente después de inoculadas co n la cepa problema.

4 1

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REVISION BI/?LIOGRA PICA

Una variante de éste método consiste en cortar pocillos en las placas de medio sólido y

rellenarlos con una gota del mismo medio conteniendo la cepa problema. Unavez solidificado

el agardel pocillo se siembra sobre la placa el microorganismo indicador (Tagg y col., 1976).

Pero quizás el método de elección sea el empleado por De Klerk (1967). En esta

variante la cepa problema se siembra en profundidad, con un asa de platino o un palillo, en el

m e d i o d e c u l t i v o s ó l i d o y d e sp u és s e i n o c u l a s u su per f ici e c o n e l m i c r o o rg a n i s m o i n d i c a d o r .

I I . 5 . 1 . 3 . - P r u e b a d e l an t ag on ismo d i f e r i d o

En e s t a p ru e b a l a b a c t e r i a p ro b l e ma s e s i e m b r a y d e s a r r o l l a e n p l a c a s d e m e d i o s ó l i d o ,

d u r a n t e u n p e ri od o d e t ie m p o d a d o , i n a c t i v á d o l a a c o n t i n u a c i ó n p o r e xp osi ci ó n a l c a l o r o a l

cl orof ormo. Más t a r d e , e l c u l t i v o i n d i c a d o r m e z c l ad o c o n a g a r s e m i s ó l i d o , s e si e mb ra e n l a s

p l a c a s i n a c t i v a d a s como q u e d a d i c h o ( F r e d e r i c q , 1 9 4 8 ; B a r e f o o t y K l a e n h a m m e r , 1 9 8 4 ) . E st e

si st e ma t i e n e l a v e n t a j a d e p e n n i t i r e l c r e c i m i e n t o d e l a b a c t e r i a p r o b l e m a y d e l i n d i c a d o r e n

co n d ic io n e s ó p t im a s d e t e m p e r a t u r a y a q u e l a i n c u b a c i ó n n o e s s i m u l t á n e a . No o b s t a n t e , p u e d e

ocurrir que el cultivo indicador sea sensible a los métodos que inactivan el cultivo problema

(Tagg y col., 1976).

I I . 5 . 2 . - L a a c c i ó n d e l a s b a c t e r i o c i n a s y su diferenciación d e o t r a s p o s i b l e s cau sas d e

i n h i b i c i ó n

L o s m é t o d o s a n t e s d e s c r i t o s n o g a r a n t i z a n q u e l a a c t i vi d a d an t ím íc ro b ia n a d e l

m i c r o o r g a n i s m o e s t u d i a d o s e d e b a a l a s b a c t e r i o c i n a s , e n c on se cu e n c ia d e b e e va l u ar se l a

a c t i v i d a d ant imicr obia na d e l o s m i c r o o r g a n i s m o s d e i n t e r é s u t i l i z a n d o e n sa y o s e xp e ri m e n t al e s

co mp l e me n t ari os . En e s t o s e n sa yo s s e t r a t a d e e l i m i n a r l a p r e s e n c i a e n e l m e d i o d e c u l t i v o d e

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REl’LSION BIBLIOCRAPICA

otros microorganimos o productos metabólicos con actividad antimicrobiana.

Consecuentemente, la bacteria problema que interesa se siembra en un medio líquido que se

cultiva en condiciones óptimas para la producción máxima de actividad antimicrobiana Tales

condiciones se determinarán experimentalmente ya que no tienen porqué coincidir con las

ó p t i ma s d e c r e c i m i e n t o ( T a g g y c o l . , 1 9 7 6 ) . a c o n t i n u a c i ó n s e e s t e r i l i z a e l m e d i o d e c u l t i v o p o r

filtración para eliminar la posible presencia de bacteriófagos (Tagg y col., 1976), que podrían

ser los responsables de los halos de inhibición observados al cultivar las bacterias problema

con el microorganismo indicador

L a a c t i vi d a d a n t a g o n i s t a d e l H20 2 q u e p u d i e r a p r o d u c i r l a c e p a d e i n t e r é s s e el imin a

incubandoel microorganismo en anaerobiosis estricta (Schillinger y Liicke, 1989), o también

añadiendo al medio de cultivo catalasa (Su, 1949) o peroxidasa (Holmberg y Hallander,

1 9 7 3 ) , a n t e s d e d e t e rm i n a r s u a c t i v i d a d a n t i m i c r o b i a n a f r e n t e a l m i c r o o r g a n i s m o i n d i c a d o r .

F in a l m e n t e , l a a c i d e z d e l m e d i o d e c u l t i v o s e n e u t r a l i z a t r a t á n d o l o co n u n a s o l u c i ó n

básica fuerte (Tramer, 1966>.

De esta manera, una vez eliminadas otras causas de inhibición distintas de las

b a c t e r i o c i n a s , s e eval úa l a a c t i v i d a d a n t i m i c ro bi a n a d e l o s m e d i o s d e c u l t i v o l i b r e s d e cé lu la s.

Esto se realiza de tres formas:

1).- Depositando una gota del medio líquido problema neutralizado, en una placa de

Petri con agar semisólido en la que se desarrolla el microorganismo indicador (Daeschel y

Klaenhammer, 1985).

2).- Practicados unos pocillos en placas de medio sólido, se recubre su superficie con

a g a r y s e d e p os it a u n a go t a d e l m e d i o l í q u i d o p r o b l e m a p re vi a m e n t e n e u t r a l i z a d o , s e d e j a

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RPA’ISION BIBLIOCRA PICA

transcurrir un tiempo suficiente para que difunda y, finalmente, se rellenan los pocillos con

agar y se deposita en ellos el microorganismo indicador (Daeschel y col., 1990; Ahn y Stiles,

1 9 9 0 a) ; t am b ié n s e p u e d e s e p a r a r e l aga r d e l a p l a c a d e P e t r i q u e l o c o n t i e n e y , después de

i n v e r t i d o , s e si e mb ra e l m i c r o o r g a n i s m o i n d i c a d o r e n l a o t r a c a r a d e l a ca p a d e agar ( T a g g y

McGiven, 1971; Schillingery Lúcke, 1989).

3).- Saturando un disco de papel de filtro con una cantidad suficiente del medio líquido

neutralizado. Una vez seco el disco, se coloca sobre el microorganismo indicador sembrado enagar semisólido (Bhunia y col., 1987; Bhunia y col., 1988).

II. 5. 3.- Producción óptima de bacteriocinas

Tanto l a c o m p o s i c i ó n d e l o s m e d i o s d e cu lt iv o , como l a s co n d ic io n e s d e d e s a r r o l l o

n e c e s a r i a s p a r a u n a p rod u cc ió n ó p t im a d e b a c t e r i o c i n a s v a r i a n d e u n a s b a c t e r i a s pro d uct oras a

o t r a s ( Ta gg y c o l . , 1 9 7 6 ) . A s í p o r e j e m p l o , a l g u n a s b a c t e r i o c i n a s s ó l o s e p ro d u c e n c u a n d o e l

m i c r o o r g a n s i m o s e c u l t i v a e n m e d i o s s ó l i d o s o s e m i s ó l i d o s ( G e i s y c o l . , 1 9 8 3 ) , mi e n t ras q u e

o t r a s ba c t e ri a s pr od uct oras n e c e s i t a n s u p l e m e n t o s e s p e c í f i c o s como e x t r a c t o d e levadura

( N i e l s e n y c o l . , 1 9 9 0 ) o gl u co sa ( Bhu n i a y c o l . , 1 9 8 7 ) . L o s m e d i o s s e m i s i n t é t i c o s , d e

composición más sencilla, se emplean para favorecer las labores de purificación de las

bacteriocinas (Bhunia y col., 1987). La temperatura, el tiempo de incubación el cultivo conagitación o estacionario también influyen en la producción de bacteriocinas (Biswas y col.,

1991).

II. 5. 4.- Purificación

En la caracterización bioquímica parcial de las bacteriocinas se necesita su purificación

previa a partir del medio de cultivo libre de células en el que se encuentra la sustancia

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inhibidora. Con esta purificación se pretende separar la sustancla activa del resto de

componentes del medio de cultivo y de las células que en él crecieron. Debido a [a

heterogeneidad de estas sustancias es muy dificil establecer un protocolo modelo de

purificación, cada tipo de bacteriocina requiere una técnica específica que debe determinarse

empíricamente, al igual que las condiciones de cultivo, (Tagg y col., 1976).

En general, el primer paso de la purificación de las bacteriocinas consiste en

concentrarías en el medio de cultivo neutralizado mediante precipitación con sales, ácidos oetanol, diálisis o liofilización. Una vez obtenido el concentrado, se procede a la separación de

los distintos compuestos por su tamaño molecular (cromatografía de filtración, ultrafiltración,

centrifugación, etc.) o por su distinto potencial eléctrico (cromatografía de intercambio iónico,

electroforesis, etc.)

El único punto en el que coinciden todos lo s métodos de purificación es en la pérdidade actividad, a veces masiva, durante la purificación de las bacteriocinas (Tagg y col., 1976).

Por eso es importante determinar, en cada paso del proceso de purificación, [a cantidad de

proteina y su actividad específica (actividad inhibidora/mg de proteina) a fin de evitar aquellos

pasos que impliquen una gran pérdida de actividad (Tagg y col., 1976).

II. 5. 5.- Propiedades de las bacteriocinas de las bacterias lácticas

U. 5 . 5 . 1.- Composición química

Las bacteriocinas son, según la definición de Tagg y col. (1976), sustancias

antagonistas de naturaleza proteica. Por tanto, la inhibición o desaparición de la actividad

antagonista mediante la utilización de enzimas proteoliticos es definitiva para catalogar a una

sustancia inhibidora como bacteriocina. No obstante, aunque las bacteriocinas suelen ser

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REVISION IJIBLIOGRAPICA

moléculas sencillas (agregadas o no), algunas presentan en su composición al menos durante

los estadios previos a su purificación, además de proteina, componentes [ipídicos y/o

hidrocarbonados (De Klerck y Smith, 1967; Upreti y Hinsdill, 1973).

II. 5. 5. 2.- Propiedades físicas

El peso molecular de estas sustancias varía desde los 2.700 daltons de la pediocina

AcH (Bhunia y col., 1988), hasta lo s 37.000 daltons de la helveticina J que puede llegar aformar agregados de hasta 300000 daltons; agregados de éste tamaño sólo se separan

mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE)

(Joerger y Klaenhammer, 1986). El peso molecular suele determinarse por cromatografía de

filtración en geles empleando agentes disociantes para evitar la formación de agregados

(Pulusani y col., 1979; Joerger y Klaenhammer, 1986) también puede hacerse por

electroforesis en SDS-PAGE (Bhunia y col., 1987).

Una característica que prácticamente la presentan todas las bacteriocinas es su

termoestabilidad (West y Warner, 1988; Daeschel y col., 1990; Schillinger y Lúcke, 1989);

sin embargo, esta característica es díficil de cuantificar, ya que depende de su grado de

purificación, del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de moléculas termoprotectoras (Tagg

y c o l . , 1 9 7 6 ) .

I I . 5. 5 . 3 .- Espectro de acción

En cuanto a su espectro de acción, las bacteriocinas se han dividido arbitrariamente en

dos tipos (Klaenhammer, 1988):

19.- Bacteriocinas con un espectro de acción muy restringido, limitado a especies

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REVISION BIBLIOGRAPICA

bacterianas muy relacionadas filogenéticamente con la cepa productora. lo que concuerda con

la definición clásica de bacteriocinas (Tagg y col., 1976) y entre las que se incluyen muchas

bacteriocinas caracterizadas hasta ahora, como la diplococina, lactacinas B y F y lactocina 27.

2v).- Bacteriocinas con un espectro más amplio activas, además de frente a las especies

con ellas relacionadas, frente a otras bacterias Gram-positivas. Como ejemplo de este grupo se

cita la nisina, que impide la esporulación y crecimiento de especies bacterianas de los géneros

Clostridiurn y Racillus. No obstante, todavía no se han descrito bacceriocinas activas frente abacterias Gram- negativas (Klaenhammer, 1988).

II. 5. 5. 4.- Mecanismo de acción

El mecanismo de acción suele determinarse adicionando la sustancia, más o menos

purificada, a un cultivo líquido en crecimiento inoculado con una población determinada delmicroorganismo sensible. Durante su incubación (microoganismo±bacteriocina), se toman

muestras a intervalos de tiempo regulares y se determinan las bacterias viables mediante

recuentos en placa. La sustancia será bactericida si disminuye el número de microorganismos

viables y bacteriostática silos recuentos se mantienen constantes.

Según la definición clásica de Tagg y col. (1976), las bacteriocinas son bactericidas

para los microorganismos sensibles. El mecanismo mediante el que ejercen esta acción no es

bien conocido ya que, aunque algunos autores (Tagg y col., 1976) describen esta actividad en

dos etapas: a).- adsorción a la pared bacteriana y b).- destrucción de la pared bacteriana

seguida de lisis celular, otros (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Harding y Shaw, 1990) han

puesto de manifiesto la adsorción de la bacteriocina incluso en las paredes de bacterias

resistentes; por tanw, la actividad antimicrobiana no estaría ligada a la presencia de receptores

específicos en la pared celular.

4 7

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R IE l ISIOiV BII?LIOGRA PICA

También se han descrito sustancias con características idénticas a las bacteriocinas,

pero cuyo mecanismo de acción es bacteriostático. Entre ellas se encuentran la lactocina 27

(U pr et i y H i n s d i l l , 1 9 7 5 ) y o t r a s t o d a v í a n o c a r a c t e r i z a d a s b io qu imi ca me n t e ( R a c c - a c h y c o l . ,

1989). El mecanismo por el que la lactocina 27 ejerce su acción bacteriostática se debe a su

adsorción a la pared celular de las bacterias sensibles y a la posterior inhibición de la síntesis

proteica celular sin afectar a la del ADN, ARN ni ATP.

1 1 .

5. 6.- Regulación senética

Una de las cuestiones sobre las que lo s investigadores han puesto mayor énfasis en los

ú l t im os a ñ o s e s l a d e c a r a c t e r i z a c i ó n g e n é t i c a , a n i v e l mol ecul ar, d e l a p ro d u cc ió n d e

bacteriocinas. De hecho, lo s ensayos destinados al estudio de lo s determinantes genéticos que

re g u l an s u p ro d u cc ió n y l a r e s i s t e n c i a a s u a c c i ó n , a s í c o m o e l e s t u d i o d e l o s m e c a n i s m o s d e

transferencia genética de éstos determinantes han contribuido significativamente al desarrollo y

aplicación de las modernas técnicas genéticas (Klaenhammer, 1988).

Se ha demostrado con ello que la producción y la resistencia a las bacteriocinas suele

encontrarse codificada en plásmidos, generalmente en un mismo plásmido (Klaenhammer,

1988). Pero la producción de bacteriocinas no está siempre codificada en estos elementos

genéticos. Así por ejemplo, la lactacina B producida por L. acidophilus N 2 n o s e e n c u e n t r a

a s o c i a d a a l a p r e s e n c i a d e p l á s mi d o s y l o m i s m o o c u r r e c o n l a l a c t a c i n a F ( Bar e f oot y

Klaenhammer, 1984). Tampoco se ha determinado la existencia de plásmidos ni de otros

elementos genéticos extracromosomales en la producción de la lactostrepeina Las 5 de L. lacás

subsp. c’ernoiis (Dobrzanski y col., 1982).

Pero como ya se ha dicho, son numerosos lo s investigadores que han comprobado que

la producción de bacteriocinas se encuentra ligada a la presencia de plásmidos. De esta forma.

48

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R íE VISION BIBLIOCRA PICA

la diplococina de L. lactis subsp. crernoris 346 se halla ligada a un plásmido de 54

Megadaltons (Davey, 1984), mientras la pediococina A de P. pentosaceus FBB6I estácodificada en un plásmido de 13.6 Megadaltons (Daeschel y Klaenhamrner, 1985). Asimismo

la producciónde nisina por diversas cepas de L. ¡actis se encuentra codificada en un plásmido

d e 2 8 - 3 0 M e g ad al t on s, e n e l q u e t am b ié n s e c o d i f i c a l a r e s i s t e n c i a a d i c h a b a c t e r i o c i n a y l a

fermentación de la sacarosa (Gonzalez y Kunka, 1987).

Además, no sólo se han identificado los plásmidos que codifican la síntesis debacteriocinas, sino que se ha llegado, incluso, a donar los genes responsables de su

producción y de la resistencia a la acción de dicha bacteriocina en otras bacterias receptoras

( V a n B e l k u m y c o l . , 1 9 8 9 ) , d e t e r m i n á n d o s e l a se cu e n ci a d e n u c l e ó t i d o s d e l o s op e ro n e s q u e

l o s regu l an ( Va n B e l k u m y c o l . , 1 9 9 1 ) .

El rápido desarrollo de las tecnologías genéticas en los últimos años puede permitir el

d e s a r r o l l o d e b a c t e r i a s l á c t i c a s d e i n t e r é s p o r t a n d o p l á sm id os d e p ro d u cc ió n y r e s i s t e n c i a a l a s

bacteriocinas, facilitando su supervivencia al crecer con otras bacterias carentes de éstos

plásmidos (Klaenhammer, 1988). Estas técnicas también permitirían expresar en una misma

bacteria los determinantes de varias bacteriocinas, pero no ya sólo de las bacteriocinas de otras

bacterias lácticas, sino de otras especies bacterianas distintas, con lo que el espectro

antimicrobiano de las bacterias lácticas se vería notablemente aumentado. Además se les podría

p ro p or ci on ar r e s i s t e n c i a f r e n t e a t o d o s l o s c o m pu e s t o s a n t i m i c r o b i a n o s l o q u e su p on d rí a u n a

ventaja adicional al poder crecer en un medio hostil (Klaenhammer, 1988). El empleo de estas

metodologías genéticas en la producción y ‘mejora” de las bacterias lácticas productoras de

bacteriocinas (sobre todo en las cepas de mayor interés industrial), abre unas perspectivas

prometedoras a la industria de fermentación y conservación de alimentos (Klaenhammer,

1988).

49

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REVISIÓN RIBLIOGRAPIC’A

1 1 . 5. 7.- Bacteriocinas de las bacterias lácticas

Prácticamente todos lo s géneros de las bacterias lácticas presentan especies o cepas

productoras de bactenocinas:

II. 5. 7. 1.- Bacteriocinas producidas porespecies del 2énero Lactobacillus

La primera especie de este género en la que se identificó una actividad antimicrobianaasociada a una bacteriocina fué en L. ferment¡i (De Klerk y Goetzze, 1961). A partir de

e n t o n ce s s e h an i d e n t i f i c a d o y , e n al gun os c a s o s c a r a c t e r i z a d o , s u s t a n c i a s d e é s t e t ip o e n o t r a s

especies del género

a) L. helveticus .- Se conocen dos bacteriocinas producidas por esta especie, la

lactocina 27 (Upretti y Hinsdill, 1973), y la helveticina J (Joerger y Klaenhamer, 1986).

b) L. acidophilus .- A la primera sustancia con actividad bacteriocina identificada en

esta especie se le denominó acidofilina (Vicent y col., 1959), aunque más tarde se identificaron

la lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1984) y la lactacina F (Muriana y Klaenhammer,

1991).

c) L. plantarurn .- En esta especie se h a n descrito tres bacteriocinas, la lactolina

(Kodama, 1952), la plantaricina SIK-83 (Andersson y col., 1988) y la plantaricina A

(Daeschel y col., 1990).

d) L.sake .- En los últimos años y de forma casi simultánea se han identificado dos

bacteilocinas producidas por microorganismos de esta especie, la sakacina A (Schillinger y

Lticke, 1989), y la lactocina 5 (M0rtvedt y Nes, 1990).

50

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REVISION RIBLJOGRA PICA

También se ha citado la producción de bacteriocinas en L. delb,-ueckii subsp. ladis

(Toba y col., 1991). L. bulgaricus (Abdel-Bar y col., 1987) y en cepas de lactobacillosaislados a partir de intestino humano (Silva y col, 1987) y de la flora vaginal saprofita

(McGroaríy y Reid, 1988).

II. 5. 7. 2.- Bacteriocinas producidas por especies del género Lactococcus

La nisina producida por L. lactis subsp. lactis es, quizá, la bacteriocina mejoridentificada y caracterizada de todas las producidas por las bacterias lácticas (Hurst, 19813. No

obstante, además de la nisina se han descrito otras bacteriocinas, como la diplococina

producida por L. lactis subsp. cA-enioris (Davey y Richardson, 1981) y las lactostrepcinas,

distintas a la nisina y producidas por diversas cepas de L. lacris subsp. lactis y L. lactis

subsp. crernoris (Kózak y col, 1978; Dobrzanski y col, 1982). También se han identificado,

en otras especies de este género, 8 tipos diferentes de bacteriocinas que son claramente

distintas de la nisina y las lactostrepcinas, (Geis y col., 1983).

II. 5. 7. 3.- Bacteriocinas producidas por especies del género Pediococcus

Los primeros indicios de producción de bacteriocinas por parte de este género datande

mediados de lo s años 70, cuando se identificó una actividad inhibidora distinta del H202 en

una cepa de P. cerevisae (Fleming y col., 1975). Posteriormente se ha caracterizado la

pediococina A de?. pentosaceus (Daeschel y Klaenhammer, 1985) y las pediococina PA-1

(Gonzalez y Kunka, 1987) y pediococina AcH (Ehunia y col., 1988) producidas por 1’.

acidilacrici.

5 1

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REVISiÓN BIBLIOGRAPICA

II. 5. 7. 4.- Bacteriocinas producidas por especies del género Carnobacwrium

Aunque es un género de nueva creación (Collins y col., 1987), ya se ha descrito [a

producción de bacteriocinas por C . piscicola (Ahn y Stiles, 1990) y C . d¡veigens (Schillinger

y Holzapfe¡, ¡990).

II. 5. 7. 5.- Bacteriocinas producidas porespecies del género Leuconostoc

A este género solamente se le atribuía actividad inhibidora debida a la producción de

ácidos orgánicos y diacetilo, hasta que se ha caracterizado la producción una bacteriocina por

una cepade Leu. gelidun¡ (Harding y Shaw, 1990; Hasting y Síiles, 1991).

5 2

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MATERIALES Y METODOS

CAPITULO III

MATERIALES

Y

METODOS

5 3

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MATERIALES Y MEFODOS

¡U . 1 .- MATERIALES

III. 1 . 1.- Material b i o l ó 2 i c o

Iii 1 . 1 . 1.- Microoreanismos empleados

Las bacterias lácticas utilizadas en la realización de este trabajo se han aislado de

embutidos crudos madurados, elaborados sin cultivo iniciador industrial y donados

generosamente por la empresa cárnica Industrias Cabo S.A., de Madrid. Las cepas se aislaron

siguiendo un método aleatorio y la mayor pai-te de ellas se identificaron tentativamente como

Lactobacillus sake s i g u i e n d o e l e s q u e m a d e i d e n t i f i c a c i ó n d e S c h i l l i n g e r y L i i c k e ( 1 9 8 7 b ) .

En la tabla 1 1 1 .1 se muestran lo s microorganismos utilizados como indicadores para

evaluar la actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas procedentes de los embutidos

crudos madurados, así como su origen. Todos los microorganismos se liofilizaron en un

medio de leche desnatada al 10% para garantizar su conservación. Los “stocks” de trabajo se

mantuvieron en congelación a -20 oc en caldo nutritivo con un 15% de glicerol,

revitalizándolos cadados meses mediante dos o tres pases en el mismo caldo.

II. 1. 1. 2. - Obtención de lo s inmunosueros

Los inmunosueros se obtuvieron por inoculación de la sustancia antirnicrobiana

parcialmente purificada en conejos machos de raza “New Zealand”, de 2,5-3 Kg de peso,

cedidos por el animalario del Departamento de Cirugía Experimental de Hospital Militar Central

“Gómez Ulla” de Madrid.

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MAIIERIALES Y MIETDDOS

III. 1 . 2. - Productos y reactivos

Los productos químicos utilizados en las experiencias descritas en este trabajo fueron

de calidad reactivo y suministrados por las siguientes firmas: “Merck”, “Probus”, “Sigma”,

“FLuka” o “Panreac”.

Los productos utilizados en las experiencias microbiológicas procedían de las firmas

“Difco” y “Oxoid”, excepto los componentes minerales, azúcares y colorantes que fueronsuministrados por “Merck”, “Panreac” y “BDH”.

En las técnicas cromatográficas y electroforéticas se emplearon productos

suministrados por “Pharmacia” y “Bio-Rad” y los utilizados en los ensayos enzimáticos,

inmunológicos e inmunoenziniáticos lo fueron por “Sigma”, “Difco”, “Pharmacia” y

“Nordik”.

II. 1 . 3. - Material de laboratorio

En la preparación de lo s medios de cultivo y soluciones acuosas se ha empleado agua

destilada, obtenida de un destilador “Afora”(1) y desmineralizada en un intercambiador iónico

“Seta” mod. R600.

Las pesadas ordinarias se realizaron en balanzas monoplato “Sauter” mod. S-1000 y

las de precisión en balanzas analíticas “Sartorius” mod. 2443 y “Microwa” mod. 6620. Para

equilibrar las muestras a centrifugar se utilizó una balanza biplaso “Cobos” mod. 28

( 1) La cita de marcas comerciales no significa que el autor las recomiende

con preferencia a otras del mercado.

5 5

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MATERIALES YMIPTODOS

T ab l a I I I . 1 . - M i c r o o r g a n i s m o s in d ic ad or e s e m p l e a d o s p ar a e val u ar l a ac t ivi d ad

a n t i m i c ro b i a n a d e l a s b ac t er ia s l á c t i c a s aisl a d a s d e e m b u t i d o s cr u d os m a d u r a d o s

Microorganismo indicador Cepa n ~ Origena

Bacterias Gram-positivas

Lactobacillus acidophilus 289 CEOE

Lactobacillus brevis L b 2 2 6 IMTH Lactobacillus carnis L v 6 l FRIB LaCtobaCillus casel 4 7 5 CEOE Lactobacillus curvatus L b 7 2 6 IMTH Lactobacillus farcinzinis L b 3 4 I M T I - I Lactobacillusfermentunz 2 8 5 CEOE Lactobacillus n)eseItteiiCus 3 9 4 CEOE Lactobocillus plantarwn 2 2 1 CEOE

L b S ? ? IMTH Lactobacillus sake L b 6 8 4 IMTH Lactobacillus mesentericus MR 3 6 4 FRIB

Carnobacteriunz divergens Lvi 3 FRIBCainoba Cte/lun? piscicola MR37 1 FRIB

Micrococcus varians 230 CEOE

Enteí-ococcusfaecalis 481 CEOE Enterococcusfaecalis (var. liquefaciens) 1 84 CEOEEnterococcusfaeciunz 410 CEOE

Bacillus stearoterrnophilus 49 CEOE

Bacillusce,~eus

148 CEOE Brochotrív thermosphacua 10018 NCIB

Staphylococc’us xylosus 237 CEOEStaphylococcus aureus 59 CEOEStaphylococcus aureus 1 37 FR 1Staphylococcus aureus 361 FRI

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MATI?í?IALES Y METODOS

Tabla 1 1 1 . 1 . - (continuación)

Microorganismo indicador Cepa & O¡.igena

Bacterias Gram-positivas

Listeria rnonocytogenesListeija nhonocytogenes

Listeija rnonoc’vtogenesListeria rnonoCytogenesListeria nzonocyíogenes

51057973

LIS sv 1/2LI 1 sv 4Scott A

NOECNOEC

FVMFVMCEOE

Clostridinin pef,-ingeas

Clostridiurn botulinurn

376

551

CEOE

CEOE

Bacterias Gram-ne2ativas

194 CEOE Enterobacter cloacae

Escherichia coli

Escheí-icia Coli enteropatógeno

BW545

B4 1

MIT

IEKC

Salnzonella typhiSalmonella thyphimurjan;Salmonella thyphimuriunz

409443T9 1

CEOECEOECENAN

Pseudornonafluoí-escensPseudomonafluorescensPseudornonafluorescens

DC5DC?

NT1 9

FRT EFR IBFRIE

Yersinia enteí~ocoliricaYersinia enterocolificaYersinia enterocoliric’a

WAE20

14405

DHHSNCIPP

a Abreviaturas: CEOE, Colección Española de Cultivos Tipo (Burjasot, Valencia); CENAN,Centro Nacional de Nutrición y Alimentación (Majadahonda, Madrid); DHHS. Dpt. of Health and Human Services. (Washington DC. USA); FRI, Food Research Institute(Madison, USA); FRIB, Food Research Insticute (Bristol, Reino Unido); FVM, Facultad deVeterinaria (Madrid); IEKC, International Escheñchia and Klebsiella Centre (Copenhage,Dinamarca); IMTH, Institute flir Mikrobiology, Toxicology und Histology (Kulmbach,RFA); IPP, Institut Pasteur (Paris, Francia); MIT, Masachussets Institute of Technology(Boston, USA); NCIB, National Collection of Industrial an d Marine Bacteria (Aberdeem,Reino Unido); NOEC, National Collection of T~pe Cultures (Londres, Reino Unido)

5 - 7

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MATERIALES Y MIITODOS

Los ajustes y determinaciones de pH se llevaron a cabo co n pH-metros “Crison” mod.

Digit 501 y “Radiometer” mod. 28.

Las esterilizaciones de los medios de cultivo y de las soluciones cuya naturaleza así lo

permitía se realizaton en autoclaves “Averly’ y “Selecta” mod. 437-G. La esterilización del

material de vidrio se efectuó por calor seco en una estufa de aire forzado “I-Ieraeus” mod.

KFTU-K. La esterilización de otras soluciones tuvo lugar por filtración con filtros “Millipore”

de 0,22 y 0,45 gm de diámetro de poro.

Las homogenizaciones se llevaron a cabo en un homogenizador-Stomacher

‘Colworth” mod. 400.

Las centrifugaciones se efectuaron en una centrífuga refrigerada “Sorvalí” mod.

RC-5B, equipada con rotores SS-34 y GSA y en una microcentrífuga “Heraeus” Christ, mod.Biofuge, equipada con un rotor tipo 1220.

Las siembras microbianas se realizaron en una cámara de flujo laminar “Telstar” mod.

CE-A. Las incubaciones se efectuaron en estufas “Heraeus”, mods. KB-500 y B6200 y

“Selecta”. mod. Termotronic 338, termostatadas a la temperatura deseada. Los tratamientos

térmicos e incubaciones que requerían un control de la temperatura más preciso se realizaron en

baños de agua o de glicerina provistos de termostatos “Selecta”, mod. Tectron.

El crecimiento de lo s cultivos microbianos se estimó porturbidometría. empleando un

colorímetro “Klett-Summerson” mod. 800-3. Los recuentos microbianos se hicieron en un

contador de colonias “WTW” mod. BZG-24. Las observaciones microscópicas se realizaron

en un microscopio óptico “Nikon”, ruod. L-ke, equipado con un dispositivo de contraste de

fases.

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MATERIALíIS Y MEPODOS

Las determinaciones espectrofotométricas se llevaron a cabo en espectrofotómetros

“Kontron”, mod. Uvikon 820, e “Hitachi”, mod. U-2000, registrándose lo s resultados en una

impresoi-a térmica “Kontron”, mod. Uvikon LS Thennoprinter 4B .

Las muestras se conservaron en arcones congeladores “Kelvinator”, mods. AC-550 y

ACK-55 y “Liebherr”, mod. GT6102, así como en frigoríficos “Aspes”. “Kelvinator” mod.

AKR y “Liebherr” y en un armario frigorífico termostatado a 4 0C±1 0C construido por una

firma local.

Las liofilizaciones se efectuaron en una aparato “Terruzzi Melvisa”, mod. TP-3.

Las cromatografias de filtración en geles se realizaron utilizando columnas de

diferentes dimensiones de las marcas “Phai-macia” y ‘Wright”. Las fracciones cromatográficas

se recogieron en colectores de fracciones “LKB-Bromma” mod. 7000 Ultrarac y 2212 Helirac.

Las electroforesis en geles de poliacrilamida co n dodecil sulfato sódico se practicaron

en una cubeta de electroforesis “Bio-Rad’. mod. Protean II, empleando como fuente de

alimentación un aparato “Shandon”, mod. SAE 2761.

En los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), se emplearon placas de ELISA marca“Costar” mod. 3590 de 96 pocillos y la lectura de las mismas se efectuó en un lector de placas

ELISA “Titerek Multiskan” mod. Plus.

En la determinación de la composición aminoacídica de la susíancia antimicrobiana

p arc ia l me n t e p u r i f i c a d a m e d i a n t e t é n i c a s d e c r o m a t o g r a f í a l í q u i d a d e a l t a r e s o l u c i ó n ( H P L C ) .

se empleó un cromatógrafo Beckman mod. 332. dotado de una columna (25 cm x 4,6 mm) de

fase reversa Spherisorb ODS-2 (Supelco) y un detector UV. Beckman mod. 160. El

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MATER/ALES Y MÉTODOS

cromatograma se obtuvo en un integrador Hewlett Packard mod. HP-3394A.

Como material general de laboratorio se han utilizado pipetas, micropipetas

automáticas “Gilson”, mods. P-20, P-200. P-l000, agitadores, mecheros de gas,

termómetros, etc. El material de vidrio empleado fué siempre del tipo “Pirex” -

I I I . 2. - METODOS

III. 2. 1 . - Medios de cultivo empleados en el crecimiento de lo s mlcroor2antsmos

1 1 1 . 2. 1 . 1 . - Medios de cultivo para el crecimiento de las bacterias lácticas

1. - Medio de Man. Rogosa y Sharpe <MRS. de “Oxoid”

Contiene:

Peptona 10,0

Extracto de carne 8,0

Extracto de levadura 4,0

Dextrosa 20,0

A c e t a t o s ó d i c o 5 , 0

Fosfato dipotásico 2,0

Citrato triamónico 2,0

5 ulfato magnésico 0,2

Sulfato de manganeso 0,05

Tween 80 í ml

pH 6,2

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MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación

Se suspenden 52 g del medio de M RS en 11500 ml de agua destilada calentando la

solución hasta su disolución y esterilizándola en un autoclave a 121 0C durante 15 minutos.

Cuando el medio se depositaba en placas de Peni, a lo s componentes citados se les añadía 10,0

g/l de agar bacteriológico (DIFCO) y 7,5 gil cuando se elaboraba el agar de MRS semisólido

para los experimentos de inhibición.

2. - Medio base

Contiene: g/l

Dextrosa 10,0


Cloruro sódico 2,0

Citrato amónico 2,0Fosfato potásico dihidrogenado 1 ,0

Fosfato dipotásico 1 ,0

Sulfato magnésico 0,20


Sulfato feaoso 0,01

Tween 80 1 mlpH final llevado a 6,2 co n HCI iN

Pieparación.

Para estudiar la influencia de la fuente de nitrógeno en la producción de las sustancias

antibacterianas, este medio base se suplementó con 1 5 g/l de uno de lo s siguientes extractos:

triptona, triptosa. proteosa-peptona, casitona, peptona (suministrados por Difeo) o extracto de

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MA TER/ALE S Y MÉTODOS

carne (Oxoid>. Los componentes citados se disolvieron en 1.000 ml de agua destilada. La

preparación ulterior de cada uno de lo s medios semisintéticos así obten idos es idéntica a laseñalada para el medio de MRS (sección III. 2. 1 . 1) El medio base suplementado con 1 5 gil

con triptosa (MM-Triptosa) se empleó para la purificación de las sustancias antimicrobianas

producidas por las bacterias lácticas.

III. 2. 1 . 2.- Medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos indicadores

distintos de las bacterias lácticas

1 . Caldo infusión de cerebro y corazón (BHI, “Oxoid”

Contiene: g/ l

Extracto de ce jebro 12,5

Extracto de corazón 5,0

Proteosa-peptona 5,0

Cloruro sódico 5.0

Dextrosa 2,0

Fosfato disódico 2,5

pH 7,4

Preparación

Se suspenden 37 g del producto deshidratado en polvo en un litro de agua destilada.

La preparación ulterior del medio así obtenido es idéntica a la señalada para el medio de MRS

( s e c c i ó n I I I . 2 . 1 . 1 )

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MATERIALES Y MI7FODOS

2. Caldo con Tween para todos lo s uropósitos (APT. “Difco”~

Contiene:

Triptona

Dextrosa

Extracto de levadura

Citrato sódico

Cloruro sódico

Fosfato dipotásicoSulfato magnésico

Cloruro de manganeso

Sulfato ferroso

Clorhidrato de tiamina

Tween 80

pH 6,7

g/ l

12,5

10,1

7,5

5,0

5,0

5,00,8

0,14

0,04

0,001

0,2

Preparación

Se suspenden 46,2 g del polvo deshidratado en un litro de agua destilada. La

preparación ulterior del medio así obtenido es idéntica a la señalada para el medio de MRS

(sección III. 2. 1 . 1).

III. 2. 2. - Aislamiento y selección de las bacterias lácticas de lo s embutidos crudos

madurados

Las bacterias lácticas (cepas LAB) utilizadas en este trabajo se aislaron durante la

maduración de un lote de embutidos comerciales a lo s que no se les había añadido ningún

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MATERIALES Y MEXODOS

cultivo iniciador. Las muestras se tomaron de la masa cárnica durante lo s siguientes dias de

maduración: 0, 2, 6, 10, 21 y 35. Para el aislamiento de las bacterias lácticas se recogieron

asépticamente 20 g de la porción central de los embutidos que se homogeneizaron durante 10

minutos en 180 mIde un medio que contenía peptona (1 gIl) y cloruro sódico (8,5 gIl) en agua

destilada.

El recuento total de microorganismos presentes en el homogeneizado se realizó en

placas de PCA suplementado con cloruro sódico (1%). El agar de recuentos en placa (PCA,“Oxoid”) contiene (por litro); 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 1 ,0 g de

dextrosa y 9,0 g de agar. Su pH final es de 7,0 y se prepara suspendiendo 17,5 g de polvo del

medio deshidratado en un litro de agua destilada. El resto de las operaciones de preparación

del medio son idénticas a las indicadas para el medio de MRS (sección III. 2. 1 . 1 . 1). El

recuento de bacterias lácticas se efectuó en agar de MRS. Las placas de PCA y de MRS se

incubaron a 320C durante 3 días.

De las colonias crecidas en agar de MRS se seleccionaron 180, en grupos de 30,

durante lo s dias 0, 2, 6, 10 , 21 y 35 de maduración siguiendo el método aleatorio descrito por

Ordóñez (1979). Las colonias seleccionadas se recogieron con una asa de platino y se

sembraron en tubos que contenían caldo de MRS, manteniendo los tubos durante 16 h a 32

0C. A los cultivos obtenidos se les adicionó un 15% de glicerol estéril y se almacenaron encongelación a -20 0C hasta su posterior utilización. Alícuotas de cada una de las cepas se

almacenaron en liofilización con leche desnatada al 10 %.

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III. 2. 3. - Actividad antimicrobianade las bacterias lácticas seleccionadas

1 1 1 . 2. 3. 1 . - Soluciones tampón empleadas

1.) Tampón de fosfato 4 mM, pH 7,0.

a. Solución de Na2HPO4, 4m iN 4.

Contiene 0,76 g de Na2HPO4 en 1 litro de agua destilada.

b. Solución de NaH2PO4, 4 mM.

Contiene 0,55 g de NaH2PO4 en 1 litro de agua destilada.

Preparación

Se añade la solución (b) a la (a) hasta que su pH alcanza el valor de 7,0.

III. 2. 3 . 2 . - Pruebas directas de antagonismo

111.2.3.2. 1.- Prueba directa de antaEonismo en pocillos

Para detectar la actividad inhibidora de las bacterias lácticas (LAB), aisladas de lo s

embutidos crudos madurados, frente a lo s microorganismos indicadores, se ideé un sistema

consistente en utilizar placas de Petri con medio MPS sólido en las que, con un sacabocados

de? mm de diámetro, se hicieron pocillos, cuyo fondo se tapizó con 1 0 ~fldel mismo medio.

A continuación se depositaron en cada pocillo 20 pl de los cultivos de las cepas LAB

escogidas y cultivadas en caldo MRS, después de laxadas y resuspendidas en el mismo medio.

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MATERIALES Y MEIVDOS

Las placas se prepararon por duplicado y cada pocillo se rellenó con agar MRS.

Posteriormente, los microorganismos indicadores a una concentí-ación ap¡-oxiinada de 1 x ío~ufc/ml, se sembraron en una de las placas del par, que contenía agar MRS, cuando se trataba

de bacterias lácticas y agar BHI en el resto de los casos. Tanto las placas a las que se les había

añadido el indicador como sus compañeras del par carentes del mismo, se incubaron a 32 0C

durante 24 horas. Transcurrido éste tiempo se añadió indicador a las placas del par que

carecían del mismo y cuyas cepas LAB habían obtenido una ventaja de crecimiento de 24

horas, siguiendo la pauta citada (prueba de actividad inhibidora diferida). Estas placas seincubaron durante a 32 0C durante otras 24 horas.

Con esta técnica la inhibición ejercida por las bacterias lácticas en el microorganismo

indicador se manifiesta porla aparición de halos en la superficie de las placas. Dicha inhibición

se cuantifica determinando el área de la corona circular del halo de inhibición (mm2) por

unidad de densidad óptica de los cultivos en unidades Klett y por 0,020 ml de medio de

cultivo.

III. 2. 3 . 3 . - Actividad inhibidora de los sobrenadantes concentrados libres de células

¡U. 2. 3 . 3 . 1 - Preparación de los sobrenadantes

Las 24 bacterias lácticas seleccionadas (20 con gran actividad inhibidora directa y 4

con una actividad manifiestamente menor), se cultivaron en caldo MRS durante 16-18 h a 32

y los sobrenadantes libres de células se obtuvieron centrifugando lo s cultivos a 12.000 g

durante 10 minutos. El pH de los sobrenadantes se ajustó a 6,2 con NaOH IN y, a

continuación, se filtraron por un filtro de 0,22 gm de diámetro de poro. Los filtrados se

liofilizaron y antes de su utilización se concentraron 20 veces, resuspendiéndolos en tampón de

fosfato 4 mM, de pl] 7,0.

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III. 2. 3. 3. 2. - Detección de la actividad inhibidora de los sobrenadantes

concentrados 20 veces

Para detectar y cuantificar la actividad inhibidora de dichos sobrenadantes se utilizaron

discos de papel de filtro Whatman n 9 3. de 7 mm de diámetro, que contenían 0,030 ml de los

sobrenadantes concentrados 20 veces. Estos discos se colocaron en placas de Petri que tenían

su fondo tapizado con una fina capa de agar base y en las que se depositaron aproximadamente

3 x io~ células de los microorganismos indicadores de interés señalados en la tabla III 1,

resuspendidos en 6 ml de agar semisólido MRS o BHI (0,75 % de agar en todos los casos).

Las placas se incubaron a 32 0C durante 24 h y la actividad inhibidora de los sobrenadantes se

determinó midiendo lo s halos de inhibición formados alrededor de lo s discos de papel de filtro.

Para ello se utilizó la expresión: Diámetro del halo de inhibición (Radio de la zona de

inhibición x 2) + d i á m e t r o del papel de filtro (7 mm).

III. 2. 3. 4. - Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lácticas

seleccionadas

La influencia del H202 en la actividad inhibidora de las bacterias lácticas se evaluó

adicionando catalasa (130 UI/mí) a lo s cultivos libres de células neutralizados y filtrados. La

actividad inhibidora se determinó empleando el sistema de discos en placas descrito en la

sección III. 2. 3. 3. 2. La actividad inhibidora debida al H202 se determinó cuantificando la

diferencia de diámetro entre los halos de inhibición de las muestras problema y las de los

controles a las que no se les había adicionado catalasa.

67

7/10/2019 Ad 2009501


MATERIALES Y MI7iODOS

IIL 2 . 4 . - Identificación y carac¡erización bi~uímica de al2unas bacterias lácticas con

actividad antimicrobiana

III. 2. 4. 1 . - Morfolo2ía y tinción por el método de Gram

Los cultivos de las 6 bacterias lácticas seleccionadas por la mayor actividad inhibidora

de sus cultivos libres de células, se tiñeron por el método Gram y se observaron al

microscopio para determinar su morfología y sus afinidades tintoriales.

TU. 2 . 4 . 2 . - Prueba de la catalasa

La producción de catalasa se realizó añadiendo una gota de peróxido de hidrógeno

(110 vol) a una alícuota del cultivo a analizar. Como control positivo se empleó un cultivo de

S. aureus. La prueba se basa en la descomposición del peróxido de hidrógeno por la catalasadando agua y oxígeno, manifestándose este último por la presencia de burbujas.

1 1 1 . 2. 4. 3. - Producción de gas a partir de glucosa

La producción de C O2 a partir de L a glucosa se determinó de dos mane;-as diferentes:

1.) —

composición

cultivos, éste

Introduciendo campanas de Durham en tubos con caldo MRS de cuya

se suprime el citrato. Si las cepas producen gas durante la incubación de los

se manifiesta por la presencia de burbujas en el interior de la campana.

2.) - Colocando en lo s tubos de medio CS-T modificado tapones de agar (2 % p/v) y

observando si durante la incubación de aquellos se produce un desplazamiento de lo s tapones

debido a la presencia de gas.

68

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MA ¡‘ERIALES Y METODOS

El medio CS-T modificado contiene:

g/l

Casaminoácidos~1> 5,0


Fosfato monopotásico 0,6


Sulfato magnésico (7 H20) 0,2

Sulfato de manganeso (1 H20) 0,05

Sulfato ferroso 0,01

Clomro sódico 0,01

Bromotimol azul 0,08

Agar 2,5

Tween80

1,0 mlpH 6,2

Preparación

A un litro de medio de cultivo esterilizado a 1210C durante 1 5 minutos, se le añade

una solución de glucosa al 10 % en una proporción del 10% (y/y). La solución de glucosa se

esteriliza por filtración con filtros Millipore de 0,22 ~.tmde tamaño de poro. Una vez enfriado

el medio, se le adicionan 150 jil del cultivo a investigar realizándose a continuación picaduras

en el medio semisólido. Se le añaden 2,5 ml del agar al 2 %. La formación de gas se detecta

porel desplazamiento del tapón hacia arriba después de 3 días de incubados los tubos a 32 0C.

Una mezcla comercial de aminoácidos obtenidos por hidrólisis de caseína

69

7/10/2019 Ad 2009501


MATERIALES Y MCI ODOS

III. 2. 4. 4. - Hidrólisis de la ar2inina

L) Caldo Arginina

Contiene: g / 1

Peptona 10,0



Acetato sódico 5,0Citrato sódico 2.0



L-Arginina 3,0

Tween 80 1,0

Preparación.

Una vez disueltos los componentes del medio, se distribuye en tubos que se esterilizan

en autoclave a 121 0Cdurante 1 5 minutos.

2.) Reactivo de Nessler

a.) Solución 1 .

Contiene:

Yoduro potásico 7 g

Yoduro mercúrico lO g

Agua destilada 40 mi

70

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MATERIALES Y M171ODOS

b.) Solución 2.

Contiene 1 0 g de NaOH en 50 ml de agua destilada.

Preparación.

Una vez preparadas las dos soluciones (y dejada enfriar la solución 2), se mezclan en

un matraz aforado de 100 ml y se añade agua destilada hasta enrasar. Se deja que sedimente el

precipitado, se decanta el líquido sobrenadante claro, que se guarda, y se desecha elprecipitado.

Sembradas las bacterias lácticas de interés en caldo de Arginina, se incuban a 32 0C

durante 2 días; a 1 mIde éstos cultivos se le añade 1 ml del reactivo de Nessler. La hidrólisis

de la arginina, con formación de amoníaco, produce una alcalinidad que se manifiesta por el

desarrollo deun

colorentre anaranjadoy

marrón.

¡U . 2. 4. 5. - Producción de ácido sulfhídrico

III. 2.4. 5. 1. - Técnica de Shav y E~an (l981~

1 . Agar base de acetato de plomo (Difco).Contiene: g/l

Peptona 15,0

Pioteosa 5,0

Dextrosa 1 ,0

Acetato de plomo 0,2

Tiosulfato sódico 0,08

Agar 15,0

71

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MA ¡ERIALES Y MÉTODOS

pH 6,6

Pre pw-ocíón.

Se suspenden 36 g del medio deshidratado, 1 ml de Tween 80 y 0,05 g de sulfato de

manganeso en 1 litro de agua destilada La suspension se calienta hasta ebullición y se

esteriliza en autoclave a 121 0C durante 1 5 minutos. El medio esterilizado sedeja enfriar hasta

45 0C para distribuirlo finalmente en placas.

Si las colonias desarrolladas en las placas incubadas a 32 0C durante 3 días producen

ácido sulfhídrico, se observa un ennegrecimiento del medio.

III. 2 . 4 . 5 . 2 . - Asar hierro de Klieser

Los cultivos seleccionados se inocularon en tubos inclinados de agar hierro de Klieger,

tanto en picadura como en estría. Los tubos se incubaron durante 7 días a 32 0C ,

manifestándose la producción de ácido sulfhídrico por un ennegrecimiento del medio.

H l. 2. 4 . 6 . - Prueba de Voses-Proskauer

a.) Caldo MR-VP.

Contiene: g/l

Peptona 7.0

Fosfato dipotásico 5.0

Dexuosa 5,0

pl] 7,5

72

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MATERIALES Y MElaDOS

a.) Solución de a-naftol en etanol

Contiene:

a-naftol

Etanol

c.) Solución de hidróxido potásico.

Contiene:K O I- I

Agua destilada

Prepún -ación.

Una vez disuelto el medio a.) se distribuye en tubos que se esterilizan en autoclave a

121 0C durante 1 5 minutos Sembrado el inóculo de la cepa problema e incubados los tubos a

32 0C, a 5 ml de los cultivos se añaden 0,5 ml de la solución b.) y 0,5 ml de la cj y se observa

el cambio de coloración del medio. El desarrollo de un color rojo intenso se debe a la

producción de acetil metil carbinol a partir de la dextrosa que, en presencia de ICOR, reacciona

con el a-naftol.

III. 2. 4 . 7. - Fermentación de carbohidratos

1.) Medio API Cí-IL (BioMérieux)

Contiene:

Peptona

Extracto de levadura

Tween 80

gil

10,0

5,0

1 ,0

6

100

40

100

g

ml

g

ml

73

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Acetato sódico 5,0

Citrato diamónico 2,0


Sulfato de manganeso 0.05

Bromocresol púrpura 0,17

pH 6,9-7,0

2.) Tiras API 5 0 C H (BioMérieux).

Cada tira contiene los siguientes carbohidratos: 0. control; 1 . glicerol; 2. eritritol; 3.

D-arabinosa; 4. L-arabinosa; 5. ribosa; 6. D-xilosa; 7. L-xilosa; 8. adonitol; 9. ~3-metil

D-xilósido; 10. galactosa; 11 . glucosa; 12 . fructosa; 13 . manosa; 14 . sorbosa; 15. ramnosa;

16. dulcitol; 17. inositol; 18. manitol; 19 . sorbitol; 20. a-metil D-manósido; 21. a-metil

D-glucósido; 22. N-acetil glucosamina; 23. amigdalina; 24. arbutina; 25. esculina; 26. salicina;

27. celobiosa; 28. maltosa; 29. lactosa; 30. melibiosa; 31. sacarosa; 32. trealosa; 33. inulina;

34. melicitosa; 35. rafinosa; 36. almidón; 37. glucógeno; 38. xilitol; 39. gentibiosa; 40.

D-turanosa; 41. D-lixosa; 42. D-tagatosa; 43. D-fucosa; 44. L-fucosa; 45. D-arabitol 46.

L-arabitol; 47. gluconato; 48. 2-cetogluconato y 49. 5-cetogluconato.

Procedimiento.

Los cultivos seleccionados, desarrollados previamente en caldo MRS, se centrifugaron

a 12.000 g durante 1 0 minutos y el sedimento (las células) obtenido se resuspendió en el

medio API CHL. El sedimento resuspendido se depositó en microtubos en lo s que se

encuentran los carbohidratos La zona aeróbica de los microtubos (superficie) se cubrió con

aceite de parafina para crear las condiciones de anaerobiosis requeridas. Las tiras con lo s

74

7/10/2019 Ad 2009501



distintos microtubos se incubaron a 32 0C, realizando dos lecturas de las mismas a las 24 y 48

h, respectivamente. La fermentación de lo s carbohidratos se manifiesta por un cambio de colordel microtubo, debido a la producción anaeróbica de ácido, que es detectado por el indicador

de pH incluido en el medio API CHL.

III. 2 . 4 . 8 . - Tolerancia al cloruro sódico

La tolerancia de las bacterias seleccionadas a la sal se determinó en caldo MRSsuplementado con un? y un 1 0 % de NaCí, respectivamente. El medio, una vez inoculado, se

incubó durante 6 días a 32 0C.

III. 2. 4. 9. - Tolerancia al pH de 3.9

El crecimiento de los cultivos a pH 3,9 se evaluó en caldo MRS cuyo pH se había

ajustado a 3,9 con HCI IN. El medio se incubó durante 5 días a 32 0C.

III. 2. 4. 10 . - Desarrollo a diversas temperaturas

El desarrollo de lo s cultivos a diversas temperaturas se analizó depositando alícuotas

de cada uno de ellos en tubos de ensayo que contenían caldo MRS. Una vez inoculados los

tubos, se procedió a su incubación a las diversas temperaturas durante periodos variables de

tiempo. El desarrollo de lo s cultivos se determinó a intervalos de tiempo regulares midiendo su

absorbancia en Unidades Klett.

‘7 5

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MATERíALES Y MEraDOS

III. 2. 5.- Esnectro antimicrobiano de las sustancias inhibidoras producidas por las

cepas deL. sate números 77. 90. 148 y 180

El espectro antimicrobiano de las 4 cepas de U sake que mostraron una mayor

actividad antagonista, se detenninó viendo la actividad inhibidora frente a lo s microorganismos

indicadores citados en la tabla III. 1 del sobrenadante concentrado libre de células, e laborado

según se describe en la sección Hl. 2. 3. 3. La actividad inhibidora se determinó midiendo lo s

halos de inhibición alrededor de lo s circulos de papel de filtro y se expresó como: Diámetro de

inhibición — (Radio de la zona de inhibición x 2) + d i á m e t r o del papel de filtro (7 mm).

III. 2. 6. - Efecto de la composición del medio de cultivo en la actividad

antimicrobiana de Locwbacillus s a k e 148

Para estudiar el efecto del medio de cultivo en la actividad antimicrobiana deL. saLe

148, este se sembró en diversos medios de cultivo que se incubaron durante 1 6 h a 32 ‘C . Los

medios empleados fueron los siguientes:

1.) Medio de APT

2.) Medio de APT suplementado:

a) con 1 0 g de triptosa/l (APT-Triptosa)

b ) con 1 0 g de proteosa-peptona/l (APT-Proteosa)

c) con 1 0 g de peptonail (APT-Peptona)

d) con 1 0 g de extracto de came/l (APT-Extracto de carne)

3.) Medio EHI

4.) Medio BHI con las supletnentaciones descritas:

a) BHI-Triptosa

b) BHI-Proteosa

c) Rl-II-Peptona

76

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MATERIALES Y METOI)OS

d) EHI-Extiacto de carne

5.)

Medio base suplementado:a) con 15 g de triptosall (MM-Triptosa)

b) con 15 g de proteosa/l (MM-Proteosa)

c) con 15 g de peptona/l (MM-Peptona)

d) con 15 g de extracto de carne/l (MM-Extracto de carne)

e) con 15 g de caseina/1 (MM-Caseina)

fl co n 1 5 g de triptonall (MM-Triptona)

Terminada la incubación se prepararon lo s sobrenadantes concentrados libres de células

y se determinó su actividad antimicrobiana de la manera descrita en la sección III. 2. 3. 3.,

utilizando a L.fermcntunz CEGI’285 como el microorganismo indicador

III. 2. 7. - Crecimiento de L. saLe 148. cinética del desarrollo y producción de

sustancia antimicrobiana a diversas temperaturas

III. 2.7. 1. - Crecimiento de los cultivos

Alícuotas de 100 ~.dde un cultivo de L. sake 148 se inocularon en tubos con caldo

MRS y MM-Triptosa y se incubaron a 4, 8,15,20 y 32 0C durante? días, 5 días, 30 h, 1 6 h y12 h, respectivamente. El desarrollo de lo s cultivos se estimó por turbidometría a determinados

intervalos de tiempo; con los datos obtenidos se calcularon los parámetros cinéticos del

desarrollo microbiano que se describen en la sección III. 2. 6 . 2 . En lo s mismos intervalos se

determiné el valor del pH del cultivo.

La actividad antimicrobiana de los sobrenadantes obtenidos en cada intervalo, se

determinó como se indica en la sección III. 2 . 3 . 3., empleando a Lferrnentum CECT285

77

7/10/2019 Ad 2009501


MATERIALES Y MITODOS

como el microoraanismo indicador.

1 1 1 . 2. 7. 2. - Parámetros cinéticos del desarrollo microbiano

111.2.7.2. 1.- Velocidad específica de crecimiento (u

Se define como el aumento de la masa celular de lo s cultivos respecto del tiempo de

incubación y se calcula a partir de la ecuación de la recta de regresión de una gráfica que

representa la masa celular de lo s cultivos en función del tiempo de incubación (figura 3.1)

xc

t

Figura 3. 1.- Representación gráfica teórica del incremento de la masa celular de lo s

cultivos en función del tiempo de incubacion.

1 - ’

78

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De la figura 31 se deduce que:

dx uxdt

siendo “x ” la densidad óptica de lo s cultivos en unidades Klett, “ t ” e l tiempo de i n c u b a c i ó n e n

horas y “ 1 ” l a v e l o c i d a d e sp e cíf ic a d e c r e c i m i e n t o .

Asimismo,

X 2 dx

5 5 x o

gdt;

X2

In

X 2

In = jit ; p o r t ant o,

t

III. 2. 7. 2. 2. - Tiempo de dunlicación ( t1

Se define como el tiempo que tardan lo s cultivos en duplicar su masa celular a una

temperatura de incubación determinada. Su valor se calcula de la expresión:

x2In ____ r ¡ i t ; cuando X2 = 2X1;

xl

2X1In =jlt<j: ln

2=Jitd;0,693

td =

xl

III. 2. 7. 2 3. - Número de generaciones por hora (st/h

Este término indica el número de generaciones microbianas de lo s cultivos en una hora

a una temperatura detenninada y su valor se corresponde con el inverso del tiempo de

79

7/10/2019 Ad 2009501



duplicación «a).

I I I . 2. 7. 2 . 4 . - Determinación del peso celular seco

El peso celular seco se determinó por interpolación en una gráfica (figura 3. 2) en la

que se representa el peso celular seco con respecto a la absorbancia en Unidades Klett

III. 2. 7. 2. 4 . 1 . - Elaboración de la recta patrón para la determinación del yeso celular

seco

Para determinar la recta patrón se prepararon una serie de tubos con medios de cultivo

estériles de MRS y MM-triptosa, que se inocularon con J i. saLe 148 y se incubaron a 32 0C.

La absorbancia de los cultivos se determinó cada ciertos intervalos de tiempo al

progresar el tiempo de incubación; para ello se tomaban alícuotas de 5 ml de lo s medios de

cultivo a intervalos regulares en lo s que se determinaron las Unidades Klett hasta que éstas se

estacionaron (ya no aumentaban más).

Las alícuotas se filtraron por filtros Millipore, de 0,45 ~m de diámetro de poro,

previamente tarados. Los filtros, en los que habían quedado retenidas las células, se

introdujeron en placas de Petri de vidrio y se desecaron durante 10 h a 80 0C. El peso celular

seco (n Jml), correspondiente a cada absorbancia se estableció determinando la diferencia en

peso del filtro con y sin microorganismos dividida por 5. La absorbancia en Unidades Klett se

relacionó con el peso celular seco mediante una recta de regresión (fig 3. 2).

80

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MATER/A LE S Y MÉTODOS

300

250

y,

u

2- aoy,n

200

150

100

50

o0,0 2.0

Peso celular seco (mg/mí)

Figura 3. 2.- Recta patrón para la determinación del peso celular seco en virtud de la

absorbancia del medio de cultivo.

E

u

uu

u

u

0,5 1,0 1 ,5

81

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III. 2. 8 . — Purificación parcial de la actividad antimicrobiana exocelular deL. saLe 148

III. 2. 8. 1 . - Cromatografía de filtración en celes

Esta técnica cromatográfica se basa en la separación de las moléculas por su tamaño

molecular.

III. 2 . 8 . 1 . 1 . - Soluciones tampón emoleadas

1.) Tampón de ácido cítrico-fosfato, de pH 5,6.

(a.) Solución de ácido cítrico, 0,1 M.

Contiene 21,01 gde ácido cítrico (1 H20) por litro de agua destilada.

(b.) Solución de Na,HPO4, 0,2 M.

Contiene 28,4 g de Na2HPO4 por litro de agua destilada.

Preparación.

Se mezclan 42 ml de ácido cítrico, 0 ,1 M con 58 ml de Na9HPO4. 0,2

M.

2.) Tampón de ácido cítrico-fosfato, de pH 5,6, con urea 0 ,1 M, y 1 M

A la solución tampón base (sección III. 2. 8. 1 . 1 . 1), se l e a ñ a d e n , re sp e c t iv am e n t e , 6

g ó 60 g de urea p or l i t r o d e s o l u c t o n .

I I I . 2. 8. 1 . 2. - Geles

El Sephadex es un polímero resultante de la formación de enlaces ciuzados entre las

moléculas de dextrano y de epiclorhidrina. Debido al gran número dc grupos hidroxilo de su

molécula este polímero es muy hidrofílico y se hincha fácilmente en el agua y en soluciones

82

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MA TiRRiALE S Y MÉTODOS

electrolíticas. Los tipos de Sephadex difieren en su grado de entrecruzamiento, por lo que se

utilizan par-a alcanzar fraccionamientos co n diversos intervalos de tamaño molecular y que en elcaso de los Sephadex 0-150 fino, G-75 y 0-50 son, respectivamente, de 5.000 a 300.000

daltons, de 3.000 a 80.000 daltons y de 1.500 a 30.000 daltons.

Los geles se prepararon y activaron según las normas de la casa suministradora

(“Pharmacia Fine Chemicals). Los geles hidratados se conservaron en refrigeración hasta su

utilización.

III. 2 . 8 . 1 . 3. - Condiciones de trabaio

La cromatografía se realizó en una cámara termostatada a 4±10C y el eluato

cromatografiado se recogió en un colector de fracciones.

El sobrenadante, libre de células y liofilizado, de cultivos de Ji . saLe 148

desarrollados en MM-triptosa durante 1 6 h a 32 0C , se resuspendió en el tampón de ácido

cítrico-fosfato, de pH 5,6 y urea 1 M, hasta una concentración 20 veces mayor que la inicial. A

continuación 20 ml de esta solución se depositaron en una columna (3,2 x 4 4 3 cm) de Sephadex

G-150, previamente equilibrada con el tampón de ácido cítrico-fosfato, de pH 5,6 y urea 0 ,1

M. El eluato, en fracciones de 5 mí, se sometió a una lectura espectrofotométrica a 280 nmpara determinar su contenido proteico, mientras que su actividad inhibidora se estableció de la

manera descrita en la sección III. 2 . 3 . 3 . 2 . utilizando L. fermentum CECT285 como el

microorganismo indicador. Las fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana se

juntaron, liofilizaron y resuspendieron en el tampón de elución para depositarias de nuevo en

una columna (2,5 x 90 cm) de Sephadex 0-75, previamente equilibrada con cl tampón de

clución. Las fracciones eluidas dotadas de actividad antimicrobiana se manipularon corno se ha

descrito antes y se depositaron de nuevo en una tercera columna (1,6 x 90 cm) de Sephadex

83

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G-50. Las fracciones cromatográficas con actividad antimicrobiana se juntaron, liofilizaron y

se mantuvieron en un desecador a 4 0C hasta su utilización posterior.

III. 2. 8. 2. - Determinación de la proteína

Se realizó por la técnica de Lowry, según la modificación de Markwell y col. (1978).

La técnica se basa en el desarrollo de color al poner en contacto las proteínas con los reactivos

que posteriormente se detallan. El desarrollo del color se debe a una combinación de

reacciones:

a.) Formación de un complejo entre lo s enlaces peptídicos de las proteínas con el cobre

en tin medio alcalino (reacción tipo Biuret).

b.) Reducción del reactivo fosfomolíbdico-fosfotúngstico por la tirosinay

eltriptófano.

Esta técnica pone de manifiesto lo s grupos fenoles presentes en las proteínas; por ello

es necesario extrapolar los resultados a una curva patrón construida con anterioridad. Como

proteína estándar para construir la curva patrón se empleó la fracción V de la seroalbúmina

bovina (figura 3. 3).

Reactivos:

- Solución A: Na,C03 al 2 %, NaOH a l 0.4 % y tartrato sódico

p ot á sic o (NaKC4H4O6) (4 H90) al 0,16 % en agua destilada.

84

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0,4

0,3

0,2

01

0,0120

Proteina (~ag/mI)

Figura 3.3.- Recta patrón para la determinación de proteína por el método de Lowry

modificado.

u

uoso‘o

u

‘O

o‘di

.0

o 20 40 60 80 100

85

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MATERIALES Y M5IODOS

- Solución B: CuSO4 (5 H-,O) al 4 % en agua destilada.

- Solución C: Se obtiene mezclando 100 v o l ú m e n e s d e l a so l u ci ó n A c o n

1 volumen de la solución R

- Solución D: Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido en agua destilada en la

proporción 1:1 (y/y).

P,ocedimie,ito.

A 1 ml de una muestra que contenga entre 1 0 y 100 ¡ig de proteína se le añaden 3 ml

de la solución C; la mezcla se deja en reposo a temperatura ambiente durante 1 0 minutos. A

c o n t i n u a c i ó n s e a d i c i o n a n 0,3 ml de la solución D , a gi t á n d ol a i n m e d i a t a m e n t e y d e j á n d o l a

reaccionardurante 45 minutos, al término de los cuales se mide el aumento de la absorbancia a

660 nm con referencia a un blanco preparado de la misma manera pe¡o con agua destilada.

III. 2. 9. - Caracterización parcial de la actividad antimicrobiana exocelular

parcialmente purificada d e J i. saLe 148

III. 2. 9. 1. - P r e p a r a c i ó n d e l a s o l u c i ó n p a t ró n d e l a su st an ci a a n t i m i c r o b i a n a

parcialmente purificada

Para realizar las pruebas de estabilidad enzimática y térmica, se resuspendieron 200 mg

de la sustancia antimicrobianaparcialmente purificada, obtenida de la columna de Sephadex

G-50 (sección III. 2 . 8 . 2), en 1 ml de una solución t a m p ó n d c c i t r a t o - f o s f a t o 4mM, d e p H ? .

Esta solución se preparaba justo antes de su empleo.

86

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I I I . 2 . 9. 2 . E f e c t o d e d iv e rso s e n z i m a s e n l a a c t i v i d a d i n h i b i d o i - a d e J i saLe 148

Para determinar la sensibilidad de la actividad inhibidora a los enzimas proteolíticos

(tripsina, pepsina, papaína, proteasa II y proteasa XIV), lipolíticos (lipasa 1 y lipasa VII) y

amilolíticos (a-amilasa), se preparó una solución de la sustancia inhibidora parcialmente

purificada (sección III. 2 . 9 . 1). A lo s pocillos de placas de ELISA en los que se habían

depositado 60 gí de las dos soluciones (2 y 1 0 mg/mí) de lo s distintos enzimas en tampón de

citrato-fosfato, se añadieron 60 ¡il de la solución conteniendo la sustancia inhibidora, de talmanera que la concentración final del enzima fué de 1 y 5 mg/ml respectivamente en cada dos

pocillos. Como control positivo en un pocillo se colocó la sustancia antimicrobiana diluida al

50% con el tampón citado. Para determinar la posible acción inhibidora o estimulante del

crecimiento del microorganismo indicador, ejercida por los enzimas empleados, se determinó

l a p osi b l e act ivid ad an t imi cr ob ian a a l a s co n ce n t rac io n e s d e s c r i t a s . L a act ivid ad a n t i m i c r o b i a n a

re si d u al d e l o s po ci l l os s e d e t e r m i n ó t r a s 2 . 6 , y 1 2 h o r a s d e i n c u b a c i ó n d e l a s m e z c l a s a 3 2

0C , segúnel método descrito en la sección [It. 2.3. 3. 2; como microorganismo indicador se

u t i l i z ó L.ferrnentwn CECT285.

III. 2 . 9 . 3 . - Efecto de diferentes vHs en la actividad inhibidora de J i. saLe 148

1 1 1 . 2. 9. 3 . 1.-

Preparación de las soluciones tampón de distintos vHs

E) Tampón universal (Dawson y col., 1969).

a) Solución A.

Contiene: gp

A c i d o c í t r i c o 6 , 0 0 8

Fosfato monopotásico 3,893

87

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MATERIALES Y MErODOS

Acido bórico 1,769

Acido dietilbarbitújico 5,266Agua destilada hasta 1000 ml

b) Solución B.

Contiene 0,8 g de NaOH en 1.000 ml de agua destilada.

Procedimiento:

A 100 ml de la solución A se le añaden lo s ml de la solución B necesarios para obtener

el valor de pH deseado. Se realizaron soluciones con valores de pH de 2,6, 3,6, 4,6, 5,6, 6 , 6 . .

7 , 6 , 8 , 6 , 9 , 6 , 1 0 , 6 , 11 , 6 y 1 2 , 0 .

III. 2 . 9 . 3 . 2 . - Condiciones de trabaio

Para establecer la estabilidad de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada

(sección III. 2. 8. 2.) a lo s diferentes pHs, se distribuyeron en tubos alícuotas de 1 ml de la

solución tampón. Después de incubar los tubos 24 h a 2 40 C , se determinó su actividad

antimicrobiana por el sistema de los discos (sección III. 2. 3. 3. 2), utilizando a L.fermentunz

CECT285 como microorganismo indicador. Para comprobar que lo s tampones de diferente pHno ejercían acción inhibidora en el microorganismo indicador, se realizó la misma prueba de

inhibición con soluciones de la sustancia con actividad antimicrobiana.

88

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MATERIALES Y AtETaDOS

I I I . 2 . 9 . 4. - Cinética de tennodestrucción de la actividad inhibidora deL, saLe 148

III. 2.9.4. 1.-Tratamiento térmico

En viales de vidrio (10 x 30 mm) herméticamente cenados se colocaron 0,1 ml de la

solución de sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de Ji . saLe 148 que se calentaron

a 80, 100, 121, 135 y 150 0C en un baño de glicerina termostatado, durante intervalos de

tiempo variables en función de la temperatura de calentamiento. Finalizado el tratamiento

ténnico L as muestras se enfriaron rápidamente en un baño de hielo picado y se determinó su

actividad antimicrobiana residual de la manera descrita en la sección III. 2. 3. 3. 2. empleando

como indicador a L.fermentunz CECT285.

III. 2. 9. 4. 2. - Parámetros cinéticos de termodestrucción

A) Valor “D ’ o tiempo de reducción decimal

Se define como el tiempo necesario para disminuir en un 90 % a u n a t e m p e ra t u ra

determinada, la actividad inhibidora inicial de la sustancia antimicrobiana parcialmente

purificada de Ji . saLe 148, y se corresponde con el tiempo en el que la curva de supervivencia

a t r a v i e s a u n c i c l o l o g a r í t m i c o . S e c a l c u l a a p a r t i r d e l a e c u a c i ó n d e l a r ect a d e r e g r e s i ó n d e u n a

g r á f i c a d e t e rm od e st ruc ci ó n , q u e r e p r e s e n t a e l l oga rit mo d e l po rc e n t a je d e l a a c t i vi d a d

inhibidora inicial en función del tiempo de calentamiento (figura 3. 4).

De la figura 3. 4, se deduce que:

log x=

-kt + C

89

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o

t

F igu ra 3 . 4 .- R e p re se n t ac ió n g r á f i c a t e ó r i c a d e l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a e n f u n ci ó n d e l

t ie mp o d e c a i e n t a m i e n t o .

siendo X” el % dc actividad inhibidora residual; ‘1” la constante de inactivación en m m - y

‘t’ el tiempo de calentamiento de las muestras

A s i m i s m o :

( l o g x ~ - log xí) = -k (t2- t1>

log x~ - l o g x i 1 logx,-logx~

l o g X2 - l o g x 1

o

k

7

tI - D

ti - t 2

90

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MATERIALES Y METODOS

B) Tiempo medio It l/2~

S e d e f i n e c o m o e l t ie mp o e n e l q u e l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a i n i c i a l s e r e d u c e e n u n 5 0 %

a u n a t e m p e ra t u ra d e t e rm i n ad a. E l t ér mi n o p u e d e c a l c u l a r s e gr á f ic am e n t e ( f i g u r a 3 . 5 ) ,

representando la variación de la actividad inhibidora inicial en función del tiempo de

calentamiento, o bien matemáticamente, asumiendo que el cambio de la actividad

inhibidora con respecto al tiempo es función de la actividad inhibidora inicial (ecuaciones 1 y

2 ) ,

dX

- kX(l)

dt

dX

— k d t ( 2 ) ;

x

d o n d e x representa l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a , ‘t’ el tiempo de calentamiento a una determinada

temperatura y ‘k ” l a constante de inactivación d e l a a c t i v i d a d inhibidora en min1.

Integrando la expresión (2) entre dos valores de x diferentes (x0 y x) a (t0 y t) y siendo

x 0 l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a inicial en el tiempo t0, resulta:

t

dr In _x0 —

to x

k(t-t0) ó 2 ,3 logxo=k(t~t0)

x

Si x =50, 2,3 log100 2,3 log 2

____ =ktíp; t1¡2=

50 kti!2 ZQSAi23

k

x

- s dx k 5

x

91

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MATERIALES 1 ’ MÉTODOS

~100

y

y,4 >i- 50

-‘-a

u

t 1/2

F ig u ra 3 . 5 . - Representación gi-áfica teórica de l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a e n f u n c i ó n d e l

tiempo de calentamiento.

C) Valor ‘7

S e d e f i n e como l a t emp erat ura n e c e s a r i a p a r a d i s m i n u i r e l v a l o r D e n u n 9 0 %, y s e

calcula a partir de la ecuación de la recta de regresión, obtenida al representar gráficamente el

l oga rit mo d e l o s v a l o r e s “ D e n f u n c i ó n d e l a t e m p e r a t u r a a l a q u e f u e r o n o b t e n i d o s ( f i g u r a 3 .

6).

l)e la figura 3. 6 se deduce que:

l o g D a T + C

donde “D es el tiempo de reducción decimal a una determinada temperatura y ‘Y’ es la

t

9 2

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T

Figura 3 . 6 . - Representación gráfica teórica de lo s valores D en función de la

temperatura.

1 — lSipordefinición, a=- — , logD=- T±C

z z

1

l o g D2 - log D1 = - (T2 - l o g D2 - l o g D 1 = ____

z z

lo g D2 - lo g D¡

temperatura del tratamiento térmico en0C.

o o >o

z

a

(T1 - T2)

93

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III. 2. 9. 5. - Determinación del peso molecular de la sustancia inhibidora deL. sake

148 por cromatoiirafía de filtración en Sephadex 0-50

La cromatografía de filtración en geles de Sephadex 0-50 para determinar el peso

molecular de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada, se realizó de la manera

descrita en la sección III. 2. 8 . 1 . 3. Para ello 20 mg de la sustancia parcialmente purificada,

disuelta en 3 ml de tampón de ácido cítrico-fosfato, de pH 5 ,6 y urea 1 M se depositaron en la

columna (1,6 x 90 cm) que contenía el Sephadex 0-50, determinándose posteriormente laabsorbancia a 280 nm y la actividad antimicrobiana de las fracciones eluidas resultantes.

A continuación, en la misma columna se depositaron 3 ml de una solución de 5 mg de

dextrano azul, 6 mg de a-quimotripsinógeno A (25.000 daltons), 8 mg de RNasa pancreática

bovina (13.700 daltons) y 1 mg de vitamina B12 (1.300 daltons), disueltos en el mismo

tampón en el que se disolvió la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L. sake

148. La absorbancia de tas fracciones etuidas se determiné a 280 nrn, mientras el peso

molecular de la sustancia problema se determinó por interpolación en una gráfica (figura 3. 7),

en la que se representaba el logaritmo de los pesos moleculares de las proteínas estándar en

función de la fracción cromatográfica en la que se encontraban.

III. 2. 9. 6. - Electroforesis en 2eles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico

(SOS-PACE

Esta técnica permite separar mezclas complejas de polipéptidos en función de su

tamaño molecular. La electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sádico

(SDS-PAGE). se realizó según las técnicas de Swank y Munkres (1971) yde Laemli (1970).

El dodecil sulfato sódico es un detergente que con otros agentes, como el mercaptoetanol y el

calor, ínte¡-vicne en la desnaturalización de las proteínas a subunidades y. además, proporciona

94

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MATER¡ALLS Y MEPODOS

1 • ¡

40

Fracción n 9

Figura 3. 7. - Recta patrón para la determinación de pesos moleculares porcromatografía de filtración en Sephadex 6-50. (A) a-quimo-

tripsinógeno, (B) RNAsa pancreática bovina. (C) vitamina Ej2.

5

A

B1~

u

o Eoo,

0 -~

b iJ o

4

3

c

20

II

10

-1

20 30 5 0

-1

60

95

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A lA TIERIALES Y MUFODOS

a las cadenas polipeptídicas una densidad decarga similar. De esta forma cuando el complejo

SDS-proteína se somete a electroforesis en un gel que contiene SDS, su velocidad de

migración viene deterirtinada principalmente por la masa de la partícula SDS-polipéptido según

el pricipio de exclusión molecular. El campo eléctrico, en este caso, sólo suministra la fuerza

impulsora.

III. 2. 9. 6 . 1 . - Técnica de Swank y Munkres (1971

III. 2. 9. 6. 1 . 1 . - Tampones. geles y soluciones emuleadas

1.) Tampón para solubilizar las muestras.

Se compone de:

Urea

3-mercaptoetanol

SDS

Acido ortofosfórico

2.) Tampón de ácido fosfórico 1

Condene:

4,8

0,5

0.25

10,00,01 M hasta

g

in I

g

ml

M-SDS, pH 6.8.

Acido ortofosfórico (85 %)SDS

Agua destilada, hasta

El pH se ajuna a 6,8 con Tris.

3.) Solución de acrilamida-bisacrilamida.

Está formado por:Acri lamida

33,75,0

500,0

mlg

ml

18,75 g

96

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MATERIALES Y MIETODOS

N,N’-metilén-bisacrilamida 1,87 g

Agua destilada hasta 50,0 ml

4.) Gel de separación.

Consta de:

Solución de acrilamida-bisacrilarnida 9,99 ml

Tampón de ácido fosfórico 1 M-SDS 3,0 ml

Urea 14,4 g

Agua destilada 29,0 ml

TEMED (N,N,N’.N’, tetrametilén-etilen-diamina) 9,0 gí

Persulfato amónico (6 %) 0,3 ml

5.) Gel de concentración.

Le forman:

Solución de acrilamida-bisacrilamida 1,65 ml


Urea 2,45 g


TEMED 1,5 gí

Persulfato amónico (6%) 0 ,1 ml

6.) Tampón de electroforesis.

Contiene:



9 7

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MATERiALES YMETODOS

7.) Solución de fijación.

Consta de isopropanol: ácido acético: agua destilada (2,5:10:6,5 y/y).

8.) Solución de tinción.

Consiste en una solución de azul brillante de Coomassie al 2 % en ácido acético al

7 %.

9.) Solución de lavado.

Es una solución al 7 % de ácido acético en agua destilada.

III. 2 . 9 . 6 . 1 . 2. - Preparación de las muestras

Las muestras solubilizadas en tampón de solubilización, con 50, 100 y 200 gg de la

sustancia antimicrobiana, parcialmente purificada, se mantuvieron durante 5 minutos en bañode agua hirviendo antes de depositar 30 gí de cada solución en el gel de concentracion.

III. 2. 9. 5. 1 . 3. - Preparación de lo s Leles

Los geles se prepararon de la manera descrita por Swank y Munkres (1971). El gel

consta de dos porciones: fase inferior (gel de separación) y fase superior (gel deconcentración). Los geles se prepararon como se describe en las secciones III. 2. 9 . 6 . 1 . 4 y

III. 2. 9. 6. 1 . 5. Para evitar la presencia de burbujas de aire en los geles, la mezcla se

desgasificó a temperatura ambiente por sonicación en un baño, durante 5 minutos, antes de

añadirle el TEMED y el persulfato amónico. Los receptáculos de formación de lo s geles se

llenaron primero con la solución del gel de separación hasta unos 3 cmde su extremo superior,

mientras en la superficie de la mezcla, y para que no se formaran meniscos, se depositó un

pequeño volumen de una solución saturada de butanol. La mezcla se mantuvo durante 1 h a 37

98

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MATERIALES YMFTODOS

0C y, una vez polimerizada, se retiró el butanol y se lavó su superficie con agua destilada. A

continuación se depositó el gel de concentración y se introdujo el peine que forma los pocillos

donde se depositarán L a s muestras. El gel se polimeriza durante 30 minutos a 37 0C . quedando

listo para realizar la electroforesis.

III. 2 . 9 . 6 . 1 . 4. - Electroforesis

La electroforesis tuvo lugar pasando por el gel una corriente de 18-20 mA y evitando

las temperaturas inferiores a 1 6 0C, para minimizar el riesgo de precipitación de la urea

Finalizada la electroforesis, el gel se extrajo de lo s vidrios del soporte.

III. 2. 9 . 6 . 1 . 5. - Tinción de los geles

Terminada la electroforesis, los geles se sumergieron en la solución de fijación y se

mantuvieron fijándose durante, aproximadamente 8 h, cambiando la solución de fijación 2 ó 3

veces. A continuación, se introdujeron en la solución de tinción donde se mantuvieron durante

2 h a temperatura ambiente. La eliminación del colorante no fijado se realizó con la solución de

lavado.

III. 2. 9. 6. 1 . 6-- Determinación del peso molecular

El peso molecular se determiné por interpolación en una gráfica en la que se representa

el logaritmo del peso molecular de las proteínas estándar frente a su distancia de migración en

el gel (figura 3. 8). Las proteínas utilizadas en la confección de la recta patrón procedían de un

“kit” comercial que contenía las siguientes proteínas estándar de bajo peso molecular:

mioglobina 1 1 1 (2,5 KDa), mioglobina 11(6,2 KDa). mioglobina 1(8,1 KDa). mioglobina 1 y

11(14 KDa) y mioglobina (16,9 KDa).

99

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111.2.9.6.2. - Técnicade Laemli (1970

III. 2. 9.6. 2. 1 . - Tampones. Eeles y soluciones empleadas

1.) Tampón para solubilizar las muestras.

Se compone de:

Tris HCI 0,5 M, pH 6,8

GlicerolSDS (10%)

j3-rnercaptoetanol

Azul de bromofenol (0,05 %)

Agua destilada

2.) Solución de acrilamida-bisacrilamida.Está formada por:

Acrilamida

N,N-metilén-bisacrilamida

Agua destilada hasta

3.) Gel de separación.

Contiene:

Solución de acrilarnida-bisacrilamida

Tris HCI 1,5 M, pH 8,8

Agua destilada

SDS (10%)

Persulfato amónico (10 %)

TEMED

1,0 ml

0,8 ml

1 ,6 ml

0,4 ml

0.2 ml

4,0 ml

14,6 g

0,4 g

50,0 ml

20,0 ml

7,5 ml

1,9 ml

0,3 ml

0,15 ml

15,0 1 . 1 1

100

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4.) Gel de concentración.

Contiene:

Solución de acrilamida-bisacrilamida 1,3 ml

Tris HCI 0,5 M. pH 6,8 2,5 ml


SDS (10%) 0,1 ml

Persulfato amónico (10 %) 50,0 gí

TEMED 10,0 gí

5.) Tampón de electroforesís.

Consta de:

Tris base 6,6 g

Glicina 28,8 g

SDS 2,0 gAgua destilada 2,2 1

6.) Solución de tinción.

Está formado por:

Ácido acético 10,0 ml

Alcohol metflico 40,0 ml


Azul de coomasie 0,25 g

7.) Solución desteñidora

Se componede:

Acido acético 10.0 ml

Alcohol metílico 40,0 ml

101

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4,5

~ 4,04)

4)

o E

o o,4)

b) 3~5o

3,0o íoo

Distancia migrada (mm)

Figura 3. 8.- Recta patrón para la determinación del peso molecular por la

técnica de Swank y Munkres. Patrones de bajo peso molecular;

(A) Mioglobina, (E) Mioglobina 1 y T I, (C) Mioglobina 1 , (D)

Mioglobina II y (E ) Mioglobina 1 1 1 .

A

B

C

D

E

u

20 40 60 80

102

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8 .) Solución de fijación:

Etanol:ácido ac¿tico:agua destilada (10:5:85 y/y).

Hl. 2. 9. 6. 2. 2. - Preparación de las muestras

Cinco, 10 y 15 gg de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada se

disolvieron y se mantuvieron durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, antes de

depositar lO jil decada solución en el gel de concentración.

III. 2. 9 . 6 . 2. 3. - Preparación de lo s eeles yelectroforesis

Tanto la preparación de lo s geles como la electroforesis correspondiente se realizó de [amanera descrita en las secciones III. 2 . 9 . 6 . 1 . 3 . y III. 2. 9.6. 1.4.

III. 2. 9. 6. 2. 4. - Tinción de lo s 2eles

III. 2. 9. 6. 2.4. 1. - Técnica del nitrato de plata

Los geles se tiñeron con el reactivo de nitrato de plata distribuido comercialmente por

la casa Bio-Rad. Este reactivo, elaborado según el método de Merril y col. (1981), es unas

10-50 veces más sensible que el azul brillante de Coomassie para visualizar las proteínas en

los geles de poliacrilamida con SDS. La tinción se realizó siguiendo estrictamente las

instrucciones recomendadas por la casa suministradora.

103

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III. 2. 9. 6. 2 . 5 . - Determinación del peso molecular

El peso molecular se deterruinó interpolando en una gráfica los pesos moleculares de

las proteínas estándar frente a la distancia recorrida en su migración en el gel. Las proteínas

estándar utilizadas en la confección de la recta patrón procedían de un “kit” comercial que

contenía las proteínas de bajo peso molecular descritas en la sección 111.2.9.6. 1.6.

III. 2. 9. ~7.- la composición aminoacídica de la sustancia

- L. sake 148 por cromatografía líquida de alta

Determinación de

antimicrobiana de

resolución (HPLC

La determinación de lacomposición aminoacídica se realizó segúnla técnicadescrita

por Beaver y col (1986).

III. 2. 9. 7. 1 . - Tampones y reactivos

1.) Solución A: tampón acetato-¡rietilan,ina. de pH 6.8

a) Solución de acetato sódico 0,03M.

Disolver 2,46 g de acetato sádico en 1 litro de agua destilada.

b) Solución de trietilamina al 0,05% y/y.

Diluir 0,5 mIde trietilamina en 1 litro de agua destilada.

104

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Procedimiento:

Mezclar ambas soluciones hasta obtener un pH de 6,8.

2.) Solución 1 3 : acetonitrilo al 90%

A 900 ml de acetonitrilo de calidad HPLC, añadirle agua Milli-Q hasta 1 litro.

3.) Solución de acetonitrilo en tampón fosfato 0.5M. de pH 7.4

a) Solución de fosfato sódico dibásico. 0.5M

Disolver 7 g de fosfato sódico dibásico en 100 mIde agua destilada.

b) Solución de fosfato sódico monobásico, 0.5M

Disolver 6,8 g de fosfato sádico monobásico en 100 ml de agua destilada.

Procedimiento

Añadir solución b) a la a) hasta obtener un pH de 7,4. La solución así obtenida se filtra

por un filtro de 0,45 ¡linde diámetro de poro y se añade acetonitrilo calidad HPLC hasta una

proporción del 5% (y/y).

4.) Solución de fenilisotiocianato

Contiene: ¡tI

Alcohol etílico 500

Trietilarnina 350

105

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Fenilisotiocianato 100

Agua destilada 50

III. 2. 9. 7. 2 - DiLestión ácida de la muestra problema

En viales de vidrio (10 x 30 mm) que se cerraron herméticamente al vacío, se

colocaron previamente 10 mg de proteina de la sustancia antimicrobiana (sección 111.2. 8. 1.),

disuelta en 1 ml de HCI6 N ;

a continuación se calentaron a120

oc durante 24 horas pararealizar la hidrólisis ácida de la muestra. Una vez hidrolizada se liofiliza y el liofilizado

obtenido después se resuspende en 750 ¡ t I de HCI 0,2N y se le añaden 100 ¡ f i de una solución

acuosa de norleucina a l 1% (plv) en agua Milli-Q. Este aminoácido, que no se encuentra

normalmente en las muestras, actúacomo patrón interno.

III. 2. 9. 7 . 3 .-

Preparación de los patrones

De cada uno de los aminoácidos patrón y de la norleucina se pesaron 1 0 mg, que se

disolvieron en 10 ml de una solución de 0,2N HCI. Les aminoácidos patrón empleados fueron

los contenidos en un kit” comercial de la casa Sigmt

III. 2. 9. 7. 4.-

Derivatización de los aminoácidos

Tanto la solución de aminoácidos procedente de la hidrólisis de la sustancia

antimicrobiana como la de los aminoácidos patrón, se derivatizaron haciéndolas reaccionar

durante lO minutos en el doble de volumen de la solución de derivatización de

Etanol:Trietilamina: Fenilisotiocinato (7:2:1). Una vez terminada la reacción, el medio líquido

se evaporó en corriente de N 9. El material desecado resultante se resuspendió en una solución

de acetonitrílo en tampón fosfato 0,5M, de pH 7,4.

106

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III. 2. 9. 7. 5. - Técnica de la cromatoLrafía en HPLC

En un cromatógrafo HPLC dotado de una columna de fase reversa (Supelco lSc)

termostatada a 35 0C se inyectaron alícuotas de 20 ¡tI de la solución problema y de lo s

aminoácidos patrón derivatizados. La fase móvil estaba constituida por un gradiente de la

Solución B en la A (tabla III. 2) y la detección de lo s aminoácidos derivatizados se realizó

determinando su absorbancia a 254 nm. La composición aminoacídica, cualitativa y

cuantitativa, de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada se determinó comparando el

cromatograma obtenido con elde lo s aminoácidos patrón.

Tabla III. 2.- Condiciones de trabajo para la determinación, mediante cromatografía líquida

de alta resolución (HPLC), de la composición aminoacídica de la sustancia

antimicrobiana parcialmente purificada de Ii sake 148

Tiempo

(mm)

Flujo

(ml/niin) % de E en A

Duración

(mm)

0 1 4 0

0,5 1 6 5

5,5 1 15,5 9,5

15 1 35 7

22 1 38,5 10

32 1,5 99 5

107

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1 1 1 . 2. 10 . - Mecanismo de acción de la sustancia inhibidora deL. sake 148

Su determinación se realizó esencialmente de la forma descrita por Schillinger y Lucke

(1989). Se procedió como sigue: El sobrenadante de un cultivo de L. saLe 148, crecido en

medio MRS, se concentró unas 20 veces.

De este concentrado se tomó una alícuota de 0,5 ml que se vertió en 5 ml de medio

MRS o 1381 (dependiendo del microorganismo indicador utilizado) recién inoculado con un

microorganismo indicador; la concentración del inóculo fué en todos los casos de unas 5 x

u fc/ml.

Como microorganismos indicadores se emplearon los siguientes: L. fern¡entunz

CECT285, L. curvarus CECT726, Car. diuergens LVI3, Leu. mesenteroides CECT394, L.

monocytogenes NCTC5 105, L. monocwogenes LIS sv 1/2, L. nzonocyw genes Scott A, S.

typhiínuriun¡ T91, Y . enterocolihca E20. S. aureus FRII3Y, S. aureus FR1361 y C.

botulinun¡ CECT5Sí. C. pezfrin4’elzs CECT3J6. Los cultivos se incubaron, a 32 0C o37 oc y

en aerobiosis o anaerobiosis según el microorganismo indicador, durante 5 h y, a

continuación, se hicieron lo s correspondientes recuentos microbianos depositando alícuotas de

100 ¡ t I de dicho cultivo en placas de MRS o EHI. Como control se realizó una experiencia

similar en la que al microoraanismo indicador se le añadieron 0,5 ml del sobrenadante

concentrado de un cultivo deL. saLe 23. microorganismo cuyo sobrenadante concentrado no

mostraba ninguna actividad inhibidora detectable.

El mecanismo de acción de la suslancia antimicrobiana de L.sake 148 sería bactericida

SI SC observase una disminución de la viabilidad del microorganismo indicador y

bacteriostática, s i las ufc/ml del microor2anismo indicador permanecieran constantes respectode su valor inicial.

108

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Hl. 2. 11.- Concentración inhibidora mfnima de la sustancía antimicrobiana en

diversos microorganismos indicadores

Para determinar la concentración inhibidora mínima (CIM), se preparó una solución de

la proteína purificada en tampón de fosfato 4 mM, de pH 7,0 a una concentración de 8 mg/mi;

a continuación se diluyó 2, 4, 8 y 1 6 veces. De cada dilución (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16) se

tomaron alícuotas de 30 ¡ tI cuya actividad antimicrobiana se evaluó según la técnica descrita en

¡a seción III. 2. 3. 3. 2. Los microorganismos indicadores empleados fueron L. ferrnentumCECT285, C. divergens LV 13 , L. nbonocywgenes 7973, LIS sv 1/2 y Scott A, S. aureus

FRI 137, FRI 349 y FRI 362, C. botulinuin 551 y C.pe;fringcns 376.

La concentración inhibidora mínima (dM), se define como la concentración mínima

de proteína que produce un halo de inhibición en el medio sólido de crecimiento del

microorganismo indicador empleado. En este ensayo, únicamente se consideraron como halosdc inhibición aquéllos cuya corona circular tenía un radio mayor de 1 mm.

III. 2. 12 . - Métodos inmunológicos

III. 2. 12 . 1 . - Obtención de lo s inmunosueros

La stístancia responsable de la actividad inhibidora de L. saLe 148 (sección hL 2. 8.

1), se empleó para la inmunización de conejos con el fin de obtener lo s correspondientes

inmunosueros portadores de anticuemos.

III. 2. 1 2 . 1 . 1 - - Pauta (le i nífluni zacióil

(Domo animales de experi¡nenlación se empIcaron 2 conejos machos dc la raza ‘New

109

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MAI’ERIALES Y MÉTODOS

Zealand” de 2,5-3 Kg de peso a los que se ¡noculó la sustancia inhibidora parcialmente

purificada. Depilada y desinfectada (con alcohol) la zona de inoculación se inyectaron

subcutáneamente a los conejos, en ambos lados de la espina dorsal, comenzando por la zona

más proxima a la región cervical. Como inóculo se emplearon 1-4 mg del antígeno (sustancia

inhibidora parcialmente purificada), emulsionados en una mezcla de 0,5 ml del Adyuvante

Completo o Incompleto de Freund (Difco) y 1 ml de aguadestilada estéril; las inyecciones se

llevaron a cabo durante un periodo de 91 días a intervalos de? días (tabla III. 3).

Antes de la primera inoculación se realizó una sangría parcial inicial (S0), para

comprobar la ausencia de reactividad de los animales frente a los antígenos utilizados.

Asimismo a los 21, 42, 63, 84 y a lo s 91 días del proceso de inmunización y, con el fin de

verificar la efectividad de dicho proceso, se realizaron sangrías parciales (S¡, 52, 53 y 54).

En las sangrias parciales la sangre se obtuvo de la vena marginal de la oreja, según el

siguiente procedimiento: El animal se introducía en una caja, de la que sobresalía la cabeza,

para inmovilizarlo; la zona elegida de la oreja se frotaba con algodón empapado en xilol para

producir una vasodilatación que favoreciera la sangría y, a continuación, se efectuaba una

punción con aguja o bien se seccionaba el vaso cuidadosamente con bisturí, recogiéndose por

goteo dc 5 a 10 ml desangre.

lii. 2. ¡2. 1 . 2. - SanEría final

Después de anestesiado el animal por vía intramuscu[ar con Keto!ar (clorhidrato de

ketamina) a una dosis de 1 0 mg/kg de peso, se colocaba en una mesa en posición de decúbito

supino y se inmovilizaba por las 4 extremidades.

Ho

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Tabla III. 3. - Patita de inmunización de lo s conejos por inoculación subcutánea de la

sustancia con actividad antimicrobiana deL. sake 148

Adyuvante Adyuvante

completo incompleto

Días

Exuacto antigénico

(mg)

de Freund

(mí)

de Freund

(mí) Sangría

1

1

14

21

28

35

42

49

56

63

70

77

84

91

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5 Sf

= sangría inicial

S~= sangría parcial día 2 1

= sangría parcial día 42

53 =sangría parcial día 63

=sangría parcial día 84Sf = sangría final día 91

111

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MATERIALES YMETODOS

Una vez depilada y desinfectada perfectamente la zona cervical inferior, con el material

quirúrgico apropiado se practicaban las incisiones cutáneas siguientes:

a) longitudinal a lo largo de la línea media ventral

b) transversal a nivel de la segunda vertebra cervical

c) transversal a nivel de la sexta vertebra cervical

A continuación se disecan los músculos ventrales del cuello visibles en este área: Ms.

cleidomastoideus (parte del Ms. cleidocephalicus y éste a su vez del Ms. brac/iiocephalicus),

Ms. sternornastoideus (parte del Ms. sternocephalicus), Ms. sternohyoideus y Ms.

síernothyroideus.

Por el borde lateral del Ms. síernothyoideus se diseca en profundidad hasta llegar al

paquete vásculo-nervioso situado a uno y otro lado de la tráquea (A . carotis cornunis, V.

jugularis y Troncus vagosimpathicus). Se diseca la A. carotis comunis y con una pinza de tipo

“mosquito” se fija el N. vagus, que continúa unido al tronco vascular. De este modo al efectuar

la sección de la arteria se puede dirigir el flujo sanguíneo a un tubo o recipiente donde se

recoge la sangre.

Cuando disminuye el flujo de sangre, se recomienda aplicar un masaje cardiaco con el

fin de conseguir el mayor volumen de sangre posible.De cada animal se recogieron de 120 a150 ml de sangre cuando la sangría final se realizaba según las normas señaladas.

III. 2. 12 . 1 . 3. - Obtención y conservación del suero

La sangre obtenida se trasvasa lentamente a un tubo de centrífuga, a fin de evitar su

hemólisis, y se centrifuga a 2.000 g durante 1 0 minutos. A continuación, el coagulo formadose desprende de las paredes laterales con una espátula o aguja y el sobrenadante se recoge con

112

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MATERIALES Y M E F O D O S

una jeringa. En caso de requerirlo, el sobrenadante se centrifuga de nuevo. Una vez obtenido

el suero se distribuye en fracciones dc 2 ml en viales, añadiéndoles una o dos gotas de una

solución de azida de sodio al 0,01 % que actúa como agente conservador. El suero se mantiene

en congelación a -20 0C hasta su utilización posterior.

Iii. 2. 12 . 2. - Inmunodifusión en Leles de agarosa

Esta técnica, que permite visualizar la interacción entre antígenos y anticuerpos, se

basa en su difusión por un medio semisólido (agarosa). Si ambos se corresponden, se forma

una línea de precipitación cuya posición dependerá del coeficiente de difusión de lo s antígenos

y anticuerpos, de sus respectivas concentraciones y del tiempo de reacción.

En este trabajo se ha empleado la técnica de inmunodifusión doble descrita por

Ouchterlony (1949), que permite verificar el proceso de inmunización de los animales de

experimentación y la correspondencia inmunológica entre lo s inmunosueros obtenidos y lo s

extractos antigénicos de interés.

Los extractos antigénicos utilizados fueron el sobrenadante neutralizado y concentrado

deL. sake 148 (sección III. 2. 3 . 3 . 1.) y la sustancia responsable de su actividad inhibidora

obtenida tal y como se describe en la sección III. 2. 8 .

III. 2. 12 . 2. 1. - Preparación del gel

El gel se preparaba inmediatamente antes de usarlo, constaba de agarosa al 1% en

solución de cloruro sódico al 0,85% (Suero fisiológico salino): se le adicionaba como agente

conservador un 0,0 1% de azida de sodio. Para prepararlo, la solución de agarosa en el suerosalino se calentaba con agitación hasta ebullición, añadiendo a continuación la solución de

113

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azida de sodio.

III. 2. 12 . 2. 2. - Preparación de la ulacas de inmunodifusión

Se utilizaron portaobjetos de vidrio de 7.5 x 5 cm que se situaban sobre una mesa

niveladora depositando sobre cada uno de ellos 6 ml de la solución de agarosa caliente. Una

vez solidificada la agarosa, con la ayuda de moldes metálicos de sección circular, se realizaron

excavaciones: una central, de 1 2 mm de diámetro y 6 periféricas, dispuestas en forma de roseta

de 6 mm de diámetro que deistaban de la central 7 mm. Seguidamente, y con ayuda de una

aguja, se retiraron cuidadosamente lo s discos de agarosa añadiendo a continuación un par de

gotas de agarosa fundida en el fondo de lo s pocillos formados y evitar así posibles anomalías

en la difusión de los anticuemos.

III. 2. 12 . 2. 3. - Llenado de lo s pocillos e incubación de las placas

Preparadas las placas de inmunodifusión se depositaron 150 ¡tI del inmunosuero en el

pocillo central y 50 ¡tI de lo s extractos antigénicos en lo s pocillos periféricos. A continuación

se colocaron en unas bandejas que se introdujeron en una cubeta que contenía de 5 a 10 ml de

una solución de azida de sodio al 1%: de esta forma, además de inhibir el crecimiento

microbiano, se mantenía la humedad de la cubeta que, por último, se tapaba y se manteníadurante 18-24 horas a 37 0C.

III. 2. 12 . 2. 4. - Lavado y secado de los Leles

Una vez incubadas, las placas se lavaron en solución salina al 0,85% durante 48 horas

a temperatura ambiente; la solución de lavado se cambió tres veces cada día y el último lavadose realizó con agua destilada; la superficie de las placas se secó con una tira de papel de filtro

114

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Whatman n 9 1 procurando eliminar las burbujas de aire que se sitúan entre el gel y el papel.

Unavez seco el gel, el papel se desprende con facilidad de la superficie de la placa.

III. 2. 12 . 2 . 5 . - Tinción

Tuvo lugar sumergiendo los portaobjetos durante 2 horas en una solución formada por

90 partes de metanol, 10 de ácido acético y un gramo de negro amida 1 0 1 3 (Merck).

Posteriormente se lavan 30 minutos con una solución de ácido acético al 5%, tras lo cual el

último se arratra con lavados repetidos de agua destilada.

III. 2. 12. 3. - Técnicas inmunoenzimáticas

III. 2. 12 . 3. 1 . - Técnica del ELISA indirecto

En este trabajo se han utilizado dosprocedimientos diferentes del ELISA indirecto. El

primero fué un ELISA indirecto clásico empleando un conjugado comercial de anticuerpos

anti-IgG de conejo conjugados al enzima peroxidasade rábano. En el segundo se utilizó un

sistema de amplificación biotina-avidina.

III. 2. 12 . 3. 2. - Técnica del ELISA indirecto clásico

En esta técnica los antígenos se inmovilizan por adsorción pasiva en una superficie

inerte; los anticuerpos específicos reconocen a sus correspondientes antígenos y el complejo

formado lo detecta un segundo anticuerpo marcado con un enzima, que reconoce como

antígenos a los anticuerpos anteriores. La reacción es visible porque al actuar cl enzima sobre

el sustrato se ¡ibera un compuesto coloreado.

115

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MATERIALES YMETODOS

a) Antígenos

Como antígenos se emplearon la actividad antimicrobiana deL. sake 148 parcialmente

purificada (obtenida tal y como se describe en la sección III. 2. 8. 1.) así como los

sobrenadantes libres de células de L. sake 148 y de una cepa (L. sake 23), que no manifiesta

ninguna actividad antimicrobiana detectable; en ambos su desarrollo se llevó a cabo en

MM-Triptosa y en MRS.

b) Anticuerpos

Se utilizó el inmunosuero total obtenido al inmunizar los conejos con la sustancia

antimicrobiana parcialmente purificada.

c) Coniugado

El conjugado utilizado fué uno comercial de anti-inmunoglobulinas de conejo,

obtenidas en macho cabrio, y marcadas con el enzima peroxidasa de rábano (Nordic).

d) Tamuones y reactivos

1 . Tampón PES. de oH 7.2

NaCí 8,0 g

KH-,P04 0.2

Na2HPO4 (12 H,O)

KO

2,9

0,2

g

g

g

116

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.LfATERIALES Y MÉTODOS

Agua destilada hasta 1000 ml

2. Tamnón PBST

Se prepara como el PES y se le añade un 5% de Tween 20.

3. Tampón de ácido cítrico-fosfato de pH 3.9

a) Preparar una solución de ácido cítrico monohidratado 0dM disolviendo 21,01

g en 1.000 ml de aguadestilada.

b) Preparar una solución de N a9HPO4. O,2M, disolviendo 28.4 gen 1.000 mIde

agua destilada.

c) Mezclar las dos soluciones hasta obtener un pH de 3,9.

4. Sustrato

Preparar una solución de ácido 2-2’-azino-bis-3-etil benzotiazolina sulfónico

(ABTS) (Sigma) en agua destilada a una concentración de 1 5 mg/ml y después preparar una

mezclade la siguiente composición:

- Solución de AETS (15 mg/mí) 0.4 ml

- Tampón cítrico-fosfato, pH 3,9

- H202 (30% en peso)

10.0 ml

20.0 i - ’ ~

117

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MATERIALES Y M E F O D O S

5. Solución de frenado

- Fluoruro sódico (NaF) al 2% en agua destilada.

6. Solución de tapizado

- Gelatina a l 1% en tampón PES

e) Metodolo2ía del ELISA indirecto

Los pocillos dc las placas de ELISA (Costar 3590) se llenaron con 100 ¡tI de una

solución de la sustancia inhibidora en tampón PBS, de pH 7,2 o con 100 ¡tI de los

sobrenadantes de lo s cultivos de interés. Las placas se incubaron durante una hora a 37 0C, tras

lo cual se lavaron 5 veces con PEST para eliminarel exceso de antígeno no adsorbido en los

pocillos.

Unavez secas las placas y. para tapizar las zonas del pocillo en las que no se hubiese

adsorbido el antígeno, se añadieron a cada pocillo 200 ¡tI de gelatina a l 1% en PES,

incubándose las placas durante una hora a 37 0C. Después de lavadas otras cinco veces con

PBST, se añadieron a lo s pocillos 100 ¡tI de suero de conejo diluido en PBST; las placas se

incubaron en un agitador de placas de ELISA durante una hora a temperatura ambiente.

Terminada la incubación, se lavaron de nuevo cinco veces con PBST para eliminar los

complejos antígeno-anticuerpo formados en la neutralización y los restos de anticuerpo que no

hubieran reaccionado. Seguidamente se adicionaron a los pocillos 100 ¡tI del conjugado

anti-conejo diluido en PBST y, de nuevo, se incubaron las placas durante una hora atemperatura ambiente en el agitador.

lIS

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Tras lavar las placas cinco veces con agua destilada para eliminar los restos de

conjugado libre, se añadieron a cada pocillo 150 ¡fl del sustrato y las placas se incubaron en el

agitador durante 45 minutos a temperatura ambiente; inmediatamente se para la reacción

adicionando a cada pocillo 50 ¡tI de NaF al 2%. El color verde de los pocillos se cuantificó

midiendo su absorbancia a 405 nm en un lector espectrofotométrico de placas de ELISA.

Además, en la prueba descrita se realizaban siempre lo s siguientes controles:

- Control del anticuerpo: Antígeno + Gelatina + Conjugado + Sustrato.

- Control del antígeno: Gelatina + Anticuerpo + Conjugado + Sustrato.

- Control del conjugado: Conjugado + Sustrato.

Si en alguno de lo s controles se alcanzaba una A~5 mayor de 0,150, el experimento se

consideraba nulo.

III. 2. 12 . 3 . 3 . - Técnica del ELISA indirecto utilizando el sistema de amplificación

biotina-avidina

Se diferencia de la técnica anterior en que los anticuerpos procedentes de•la

inmunización de lo s conejos se conjugan con la biotina, y en que la detección del complejo

antígeno-anticuerpo/biotinase realiza con un conjugado de avidina o de estreptavidina marcada

con peroxidasa de rábano.

En los últimos años, se ha visto que el complejo avidina-biotina es un mediador muy

útil y versátil en una gran variedad de aplicaciones analíticas, incluidas las técnicas

119

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MATERIALES YMEFODOS

inmunoenzimáticas. El hecho de que en poco tiempo se haya generalizado su uso en campos

muy diversos, se debe a la elevadísima afinidad (1015 M-1) de la avidina por la biotina y a la

gran estabilidad deesta interacción no covalente.

Utilizando las propiedades del complejo biotina-avidina, se pueden amplificar las

reacciones inmunoenzimáticas (ELISA). En este caso, lo s anticuerpos específicos de la

reacción se conjugan con la biotina (biotinización) y se detectan por un conjugado de

avidina-enzima, en lugar de por las antí-inmunoglobulinas de la especie de la que procede el

anticuerpo unido al enzima.

III. 2. 12 . 3. 3. 1 . - Biotinización de lo s anticuemos

Los inmunosueros procedentes de la inmunización de los conejos, deben sufrir un

tratamiento previo antes de conjugarse a la biotina.

a.) Obtención de lo s anticuerpos a partir del inmunosuero

1) Tampones y reactivos

a) Solución saturada de Sulfato amónico

Se obtiene disolviendo 76,1 g de (NH4)2504 en 100 ml de agua destilada, hasta que la

solución precipUa. Momentos antes de su empleo, esta solución se filtra a través de un papel de

filtro Whatman n91 y su pH se ajusta a 7,4 con NaOH IN.

120

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b) Tampón de PES. de nH 7.4

Obtenido tal y como se describe en la sección 111.2. 12. 3. 2. d.) 1.)

Procedimiento

25 ml del suero procedente de lo s conejos inmunizados se centrifugaron a 3.000 g

durante 30 minutos. Al sobrenadante obtenido se le añadió un volumen igual de solución

saturada de sulfato amónico y se dejó reposar a 4 0C durante 12 h. Pasado este tiempo, se

realizó una segunda centrifugación a 3.000 g durante 30 minutos y el precipitado obtenido tras

la eliminación del sobrenadante se diluyó en 12,5 ml de tampón PBS. Los anticuerpos asi

obtenidos se dializaron frente a PES y se liofilizaron antes de su conjugación con la biotina.

b.) Conjugación de los anticuerpos purificados con la biotina

Los anticuerpos precipitados se conjugaron con el éster biotin amidocaproato-

N-hidroxi-succinimida (Sigma), siguiendo la técnica de Bonnard y col. (1984), pero con

ligeras modificaciones. Se procedió como sigue:

1 . Preparar una solución del reactivo de biotina (1 mg/ml de dimetilsulfóxido).

2. En el tampón PES de pH 7,2, preparar una solución del anticuerpo precipitado (con

una concentración de, al menos, 1-3 mg/mí).

3. Añadir la solución de biotina a la del anticuerpo, en una relación molar

biotina/anticuerpo de 50/1.

1 2 1

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MATERIALES YMETODOS

4. Incubar la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente.

5. Eliminar la biotina no reaccionante mediante diálisis de la mezcla frente al tampón

PBS (16ha40C).

6. Los anticuerpos conjugados se conservan en fracciones de 0,1 ml a -20 0C hasta el

momento de su utilización.

III. 2. 12 . 3 . 3 . 2 - MetodoloEía del ELISA indirecto utilizando el sistema de

amplificación biotina-avidina

La técnica sigue lo s mismos pasos y tiempos de incubación que los descritos en el

ELISA indirecto clásico (sección III. 2. 12 . 3. 2.), salvo que el conjugado empleado es uno

comercial de Estreptavidina-peroxidasa de rábano (Sigma).

122

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RESULTADOS

CAPITULO IV

RESULTADOS

123

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RESULTADOS

IV . 1 . - Evolución de las bacterias lácticas durante la maduración de un

lote de embutidos crudos curados

Cuando se analiza la relación entre carga microbiana total y carga de bacterias lácticas,

durante la maduración de un lote de embutidos se observa (Fig. 4.1) un rápido aumento del

número de bacterias lácticas que alcanza su punto álgido hacia el sexto día de maduración

igualándose con el recuento microbiano total, lo que sugiere que casi la totalidad de los

microorganismos de los embutidos crudos madurados pertenecen a este grupo. Los altos

recuentos de bacterias lácticas se mantienen, prácticamente sin sufrir modificaciones, a lo largo

de la maduración de los embutidos.

IV. 2. -Actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas seleccionadas

IV.2.1.- Actividad inhibidora directa

Como ya se ha descrito en la sección 111.2.3.1 de este trabajo, durante la maduración de

un lote de embutidos crudos se aislaron 30 bacterias lácticas en los días 0, 2.6. 10 , 21 y 35 de

maduración, de forma que al final del periodo madurativo se reunieron 180 bacterias cuya

actividad antimicrobiana directa se estudió frente a diversos microorganismos indicadores. Les

resultados de la prueba directa de antagonismo se reflejan en las figuras 4. 2 a 4. 5. De lasmismas se deduce que la actividad inhibidora es distinta en cada cepa analizada, siendo

significativamente mayor cuando las bacterias se incubaron en las placas 24 h antes de la

incorporación de lo s microorganismos indicadores.

124

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RESULTADOS

1 0

9

8

7

6

5

4

3

2

10 5 10 15 20 25 30 35 40

Días de maduración

Figura 4. 1.- Evolución de la flora microbiana total (O), y láctica (U ) durante la

maduración de lo s embutidos crudos curados.

12 5

o

.0

E

u4-

o

tÉo

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RESULTADOS

La actividad antimicrobiana de las 180 bacterias lácticas seleccionadas se determinó

empleando como microorganismos indicadores a Lactobacillusfern;entunz CECT285 (fig. 4.

2), L. planrarum CECT22l (fig. 4. 3), Staphylococcus aureus CECTS9 (fig. 4. 4) y

Salmonella ¡yphimuriunz CECT443 (fig. 4. 5). Los resultados obtenidos indican una mayor

actividad inhibidora cuando las cepas seleccionadas se enfrentaron a otras bacterias lácticas,

tanto cuando crecían simultáneamente como cuando lo hacían 24 h antes de incorporales el

indicador. Frente a las bacterias patógenas como 5. aureus y S. typhimuriunz no se aprecia una

actividad inhibidora definida cuando se desarrollan simultáneamente con ellas, lo que contrastacon lo que ocurre cuando las bacterias lácticas seleccionadas se desarrollan en las placas 24 h

antes de la incorporación del indicador.

Es de destacar la presencia de halos de inhibición de bordes nitidos y definidos en

algunas de las cepas evaluadas frente a L. fermenturn y L. plantarum. Estas cepas, que

parecían poseer un mecanismo de inhibición diferenciado de las demás, representan un 25 %de las analizadas y en las figuras se señalan con un asterisco.

De las 180 cepas estudiadas, se seleccionaron 20 que estaban dotadas de una

manifiesta actividad antimicrobiana (halo de bordes nítidos) y 4 cuya actividad era menor. En

las figuras 4. 6 a 4. 29 se muestra la actividad antimicrobiana de las 24 cepas frente a L. brevis

LB826, L. carnis, L. curvalus LE726, L. dii’ergens MR375, L.farciminis LB34, L. sake

LE684, Leu. mesenteroides MR364, M. i’arians CECT23O, B. thermosphacta NCIB 10018,

S.faecium CECT4lO, E. cok LE841, B. stearothermophylus CECf49, E. cloacae CECT149,

8. cereus CECTI48, J’s.fluorescens DC7. Y . eníerocolitica NC E20, S.flexnerii CECT58S,

5. faecalis CECT48I, L. monocytogenes Lllsv4, L.fermeníum, L. plantarun> CECT22I. 5 .

typ/zimurium CECT443 y 5. ~weus CECT59. Las actividades inhibidoras observadas son

similares a las reseñadas antes y notablemente superiores cuando se emplean como indicadores

otras bacterias lácticas.

126

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RESULTADOS

La mayor parte de las 24 cepas analizadas poseen una actividad antimicrobiana directa

claramentecuantificable frente a Y . enterocolláca E20 y 5. íyphiinuriunz CECT443 y. sobre

todo, frente a 5. aureus CECT59 y L. monocyíogenes LI lsv4, originando en los dos

últimos indicadores halos de inhibición definidos y de un diámetro apreciable, similares a los

observados frente a las bacterias lácticas. No obstante, frente a otros indicadores, como 8.

cereus CECTl48 y S.flexnerii CECT585, son pocas las cepas que ejercen acción inhibidora

definida.

127

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

1 1 1 u 1 — rl ~ -t .r,’.0 t— 20 ~ — rl en -t •n ‘c r— CC 0~’ ~— — rl en — ti rl rl rl u .ta ‘.0 20 0’ 0

rl rl rl rl ~l rl en

Ce ¡ n ~ n”

Figura 4. 2(1).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente aL.

fern¡entunz CECT2S5.

m Actividad Inhibidora directa. ~ Actividad Inhibidora diferida.

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A *

Ce1ni u”Figura 4. 2(11).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

L.fe,-menwm CECT2SS. Las columnas poseen el mismo significadoque en la figura 4. 2(1).

160

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12 8

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

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(~ ? e ¡ni n’

Figura 4. 2(111).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

L.fermentum CECT2S5. Las columnas poseen el mismo significado

que en la figura 4. 2(1).

— r~ en —t < t~ ~ ‘.5 U- 200 0—4 r-¡en’t lCa 5’ 0’ 050’ 050’ 0’ 050’

‘SU- C C Os — rl en Ú .4 ‘5 5— CC 0’ rl

(e¡:I II”

Figura 4. 2(1V).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

Lfermentum CECT2S5. Las columnas poseen el mismo significado

que en la figura 4. 2(I).

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129

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

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- - * 4 $ *4+4+

Cepa u

Figura 4. 2(V).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

L.ferinentunz CECT28S. Las columnas poseen el mismo significado


¡ 2 < >

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90

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o 2 70

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— z 50

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9- * **wt

(eíu:i it

Figura 4. 2( y VI).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente

a L. fe’-,nenturn CECT28S. Las columnas poseen el mismo

significado que en la figura 4. 2(1).

o

u4-

e-]

130

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RESULTADOS

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. 1

I t0’ 0 — 4+1 ‘5 -t In SO U- CC Cx O — tI ti $9 $9 <9 rl el $9 $1 $9 rS

4 +

(Ú¡h~ 11<’

Figura 4. 3<!).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a L.

plantarun; CECI’221. Las columnas poseen el mismo significado que en

la figura 4. 2(1).

[tiU 1 1 1 1 1 1 I I I I I j i 1 1 U 1 4 1 1 1 1 , ’ d i f l i n W ~ a<9’t ‘t It, SO U- CC Cx O — rl rfl -t OC . sC U- 20 0 — ti’t t •C4 SO U- 20 Cx O

rs en ‘senen ~. en < -e -. <n — 1 ~ -t —t -~t —t —t —1’ —, — r ~n ~r. ‘e, ~r> ti-, sr, ti-, ti-, ‘osr,xc

U <pa ti’’


L. plantarunr CECT221. Las columnas poseen el mismo significado que

en la figura 4. 2(1).

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70

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131

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RESULTADOS

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4 +

( Ciflí u


L. pIa~aarurn CECT22I. Las columnas poseen el mismo significado


f i~ii— ú-~ tfl t < C ~ ‘.0U-20 QN O — e—] ‘t <0’.0 5 -— Sr 0’ = QNOsOsOsOsQNZNCN —

w ~id ii i t • i— Cx] r~, •1- «4 SO t- 20 Os O

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L. plantarurn CECT22I. Las columnas poseen el mismo significado


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70

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132

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RESULTADOS

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¡ 1 0

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34)

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it’ ½ JWhibi1Li ji 1— rl ‘ e - , t•t. C U- C C 5 N — e - - f i en fl ~ ir, SOU- C i ? S N 0 — r~ en ~t ~tí ‘ - .0 U- 20 05 0<9<9 el C x l rlrj e - ~ f i r—ir—]enenenenenenenen’nen rr-r--r-r-r -t-t-t In


L. plantarun¡ CECT22L. Las columnas poseen el mismo significado


120

110

100

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5 < >

rl 44 )

34>

2 < >

1 < )

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t cina u ’’

Figura 4. 3(y VI).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frentea L. planíarurn CECT22L Las columnas poseen el mismo significado


133

I I — e — f i en •t. SO U- 20 SN — e-.> en Ú‘ti SO U- ~t SN = — e--fi e5t If;j SO 1-- 20 SN 0It, SC, It. St, It. St, It. It, Ir. SO SO SOSO ‘SSO SO SO S O S O U- U- t~ U-U—U-U-U-U-U-CC

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RESULTADOS

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5< )

40

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M U u t i II

O — Cx]’t ‘t •t, SO U- 20 050Cx] e--] e--] e-] r—t e-—, e-] e-] e--] r—i en

t’eí>:i I I

Figura 4. 4(1).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a 5.

aureus CECT59. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(I).

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3 < )

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sC U- 20 QN =•ta Ita •ti ta SO

(‘epa u”


5. ant-cus CECT59. Las columnas poseen el mismo significado que en

la figura 4. 2(1).

1 1 4 )

1 0< )

9 < >

.0

-1 -

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e-]- — e -

-

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134

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RESULTADOS

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4 SC U— 20 OsSOSO SOSO ‘SSO SO \C SO U-U-U- U- U- U- U- U- U- U-

0—rl C C 2020

H u5 t ‘ti ‘Ct~ 20 05

20fl20cC2020cS

C t— íní u”


S. aureus CECTS9. Las columnas poseen el mismo significado que en

la figura 4. 2(1).

1 2< )

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80

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30

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4 ) I I ¡ 1 . f i t i U I I t i 1 t i— e-fi en t ‘C~ SO U-CE Os O—rl en’? Ita SC U- C C 050 — r-i en’? ‘tí SO 5-— ~ 05 005Z’Z’05QNCN05ON —— Cx>

e p :m Ji ’

Figura 4.4(1V).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

5. aureus CECTS9. Las columnas poseen el iiiismo significado que en

la figura 4. 2(1).

1 2 4 >

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1 04 )

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e . > —

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135

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RESULTADOS

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(.?cpzi II’’


5. aureus CECT59. Las columnas poseen el mismo significado que en

120

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10 0

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1 < )

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la figura 4. 2(1).

t i f i k u a 1 j i ’ t i — < --fi en It. S O U- 20 QN 0 — e-] en t It, SO U- 20 05 = — ~ re-. Id-a SO 5-- 20 050•Cí Ita íd-, Ita It, tCa MC, It. It. SO SO SO SO SO SO SO SO SO SO U- U- U- U- U- U- U- U- U- U- 20

Figura 4. 4(y VI).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

5. aurcus CECT59. Las columnas poseen el mismo significado que enla figura 4. 2(l).

C d —

o

e- -

t

— .4

136

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RESULTADOS

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rl

F i F f i i; L I I I — <—fi en ‘ti SO U- 20 05 0e-fi < - — f i Cx] Ci e -~ f i e--fi Cl e--fi < - - f i en

t’e ~

Figura 4. 5(I).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a S.

typhimuriurn CECT443. Las columnas poseen el mismo significado que

en la figura 4. 2(1).

‘ $ 1 I I—$9 en Ira SO U-en en en en en en en

ji’. j i H [1 1~ F - iC iD 05 0 — $9 ‘5 t ‘C, SO e- — 20 05 0 — e~fi ~e- •C, SO U- Y? 050en en t ‘t ~t ~t —t -t Ití tCj ICj ~t’a Ifl •Ca MC¿ I d -a SC, Ca SO

te1n, n’ ’

Figura 4. 5(11).- Actividad inhibidora dc las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

S. ¡yphimurium CECT443. Las columnas poseen el mismo significadoque en la figura 4. 2(1).

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4 )

137

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RESULTADOS

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— $9 rfl Id-a’..0 U- C C 050 — r—fi’5 ,t ‘Ca SO U- C C 05 0 — < — 5 en íd-> SO U- 20 QN OSO SO ‘.0 SO SO SO SO SO SO U- U- U- U- U- U- U- U- U- U- 2020202020202020202005

(?eí>a i)<

Figura 4. 5(111).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas se leccionadas frente a

S. typhimuriuni CECT443. Las columnas poseen el mismo significado


¡20 t en

A t ~

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3<)

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NQNSNONSN050’0’05 e-’

(-t.InI II


S. iyp/ñmuriwn CEGI’443. Las columnas poseen el mismo significadoque en la figura 4. 2(l).

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21

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138

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RESULTADOS

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2

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ti $9 rl rl <-‘fi rl $9 $9 <9enenenenenrsenenen’?’?tr’?-tÚ’o

(‘ epa u’

Figura 4. 5(V).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frentea

S. typhinturiutn CECT443. Las columnas poseen el mismo significado


~~11~

2 < >

1 ¡ < )

loo

90C d — y 80

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— — 50 — < - - f i

— — 4< )

— e-’ 30Q

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I4 )

4 > 1 4 Ix ’ ¡ 1 f I f i I I— $9 en’? It) SO U- 20 QN O — $9 en ‘t Ita -0 U- 20 0’. 0 — rl en -t It) ‘.0 U- 20 O~0

Ita fiCa It) 4 C ~ It4 It. It) ‘Ca fiCa SOSO ‘.0 SO SO SC SO SO SO SO U- U- U- U- U- U- U- U- U- U- 20

(tl>:fi II’

Figura 4. 5(y VI).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lácticas seleccionadas frente a

5. ryphimuriunz CECT443. Las columnas poseen el mismo

significado que en la figura 4. 2(1).

139

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RESULTADOS

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¡ 4 ) 4 )

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Figura 4. 6.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a L. brevis

L8826. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(I).

1 2 4 )

¡ ¡ o

¡ < ) < )

90

8< )o 4

74 )

( >4 )

5< ) — rl

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— e-fi

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( ‘..¡>.~ ti

Figura 4. 7.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a L. carnis

MR3Y 1 . Las columnas poseen el mismo significado que en ¡a figura 4 2(1).

140

‘t en SN — el U- — ‘e-. — e-i ir, Ci ? O- en < -n U- SO U- C C O— rl $9 <--1 < -n ‘? ‘? U- U- SN ~ $9 en ‘? -t t~ Ira SO SO U- U- U- C C

ji

trfltQN~-~tSOri5-—0—-en~efl&t.CiZ0’.nenr—CU-CCZ$9 $9 <-—1 T t~— U- 05 rl e-> t, ‘4+ ~t t t. S O SO U- U- 1 — C i?

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RESULTADOS

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114)

1 04>90

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70

— 60

-54 ) — < - — 1

40

30

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Figura 4. 8.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a L.

curvatus L8726. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(1).

12<)

¡ lO

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8< )4

70

— . 6< )

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20

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Ce ¡ni a’’


divergens MR3’75. La s columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4 . 2(1).

141

(?cpa u”

efl QN — SC < - — f i 5-’— ‘0 — en — <—1 ICí 20 Os e n e n ,—— ‘.0 U- 20 ‘0 — e-fi Cxl rl re-, t fl~ U- U- 05 Cxi Cxl -n -t ~t t Ita ‘.0 SO U- U- U- C C

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RESULTADOS

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.0 ~_ 60

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I iitrn’?05tSOrflroen.Cx¡hnCC-~...e-U-’0U-

20— < ‘ f i < ‘ f i rl en U- U- 0’ e-fi e-fi en fl ‘? ‘t ? It. SO SO Cx— U- U- 20

(c¡ní u


farcirninis L1334. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(I).

r i ‘ ; ~ .‘~ u U f i r , ¡ [it”’, -I . I’J-1~ rs -t 05 — -t SO e-fi I V — = — te-. — e-~ IF. C i? 0‘~‘ e-fi <‘fi e-fi < - - n t t~— t— 05 Cx] Cx] ‘~ —t $

1 í ~ i i

‘1’- C SO r - — - U- U- 20

( cpa it

Figura 4. II.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente aL. sakeL8684. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4.

2(1).

¡ 2<)

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1 0<)

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70 -o :4Cx

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142

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RESULTADOS

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— 60

— — 50 — rl

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.3<)

E ‘ 24>

1 < )

4 )

Figura 4. 12.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a Leu.

rnesenteroides MR364. Las columnas poseen el mismo significado que en

la figura 4. 2(1).

¡2< >

¡ ¡ o

14)0

90

— . 80o :4‘.4 7< )

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— Cxl $9 <-fi rn t -t U- U- 05 $9 <‘fi fe-,

I i ~ 1 * ~—i

e-l Ita 20 0’ en en í- ‘o U- 20 ‘0‘? t Ir, SO SO U- U- U- C i?

Figura 4. 13.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a M.

varians CECT23O. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(1).

Ce¡~í II”

1 4 3

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RESULTADOS

F I ~ ~ ~

INi

N M k ’ 5 IN .N 1 1 ifil

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‘SU- SO U- 200— O SO U- U- U- 20

Figura 4. 14.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a B.

tern2osp harto NCIB 10018. Las columnas poseen el mismo significado que

en la figura 4. 2(I).

I ’ - 1ji ¡ - 1 i ~ ) [Jf ~

< - — f i e - f i rs t -t 5-—- U- 0’ rl e-> -5 ~t r — t- -t >r . en C x — SO U- 200SO SO U- U- U- 20

(epa u

Figura 4. 15< Actividad inhibidora de 24 bacterias Jácticas seleccionadas frente a S.

xdosus CECT237. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(1).

[24)

114)

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144

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RESULTADOS

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‘ 5 l i i i f i L l F i [1en~tOs.~,rSOrlU-0-4entiIC,20SN~n~nU-SOU-CC0

— $9 $9 < - — - f i ‘n — 1 - -t U- U- SN $9 $9 en t ‘t ‘~t Ir. -~ SO 5 - - — 5 — — 5 - - — 20

Úcíni ti

Figura 4. 16.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a S.

faecium CECT4IO. Las columnas poseen el mismo siEnificado que en la

figura 4. 2(I).

¡20

¡ < >

¡ < ) O

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en 05 — SO $9 U- ‘0 — en — $9 It, 20 0’ ~. U- SO 5--— C C =

— $9 rl < ~ — t en t ‘t U- U- Os e-] e-fi t t Ii, SO SO C x — U — 5 - ’ — - C C

(.e¡:¡ u’

hl ¡S\ ‘‘-‘u , - . rl

Figura 4. 17.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a E. ccliLB841. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4.

2(1).

I20

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¡ < ) 4 )

9<)

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145

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RESULTADOS

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¡ 4 )

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— Cxl $9 rl en t U- U- SN rl <9 en ? tt ¶t Ú Ita SO SO U- U- 1> 20

(..~el)a n’


stearotermophylus CECT49. Las columnas poseen el mismo significado

que en la figura 4. 2(I).

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‘ 5

‘ 5

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(?~~>~ n’ ’

Figura 4. 19.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a E.

clcacae CECTI49. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(1).

o

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CxlC d

‘0

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o

- -4

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146

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RESULTADOS

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— $9 <‘-fi $9 en -t U- U- QN e-1 $9 <e-, C d ~ It. SO ‘O t~- U- U- 20

C — ¡> a u’


cereus CECTL48. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(1).

ui ¡III Ñ F I L i Ñ L I I I fiL [1HÑ~IIt < e - , -t 0% — t ~C rl U- O — —. — $9 •t. 20 Os U- SO U- 00 0~

—~ < ‘ f i Cx ] $9 ‘S t U- U- SN e - f i e — f i ‘5 ‘t ~t Ú t It, ‘O SO U- U- U- 20

U~ ~>3 1 1 1 1

F ig u ra 4 . 2 1 . - Act ivid ad i n h i b i d o r a d e 2 4 b a c t e r i a s lácticas seleccionadas frente a Rs.

fluorcscens D C 7 . L a s c o l u m n a s p os e e n e l m i s m o s i g n i f i c a d o q u e e n l a

f i g u r a 4 . 2 ( 1 ) .

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147

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RESULTADOS

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— <‘fi 4 +1 < NI en ~t U- U- 0\ e-fi <‘fi rs 7 T ~ It> ‘.0 SO U- C x — r’— CC

(‘epa n

Figura 4. 22.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a Y.

enterocolitica E20. Las columnas poseen el mismo significado que en la

figura 4. 2(I).

¡2<)

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U cp:t ~>lI

Figura 4. 23.— Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a S.

flexnerii CECT585. Las columnas poseen el mismo significado que en La

figura 4.2(l).

148

‘t 05 — SO ú-~ U- 0 — re - — r- ] ~ti YO SN efl rs U- SO Cx — 20 ‘0 — <‘fi e-fi <‘fi ‘t -t U- U- Q N < ‘~ fl e-fi ‘t t t -t ‘t It) 5- 0 St U- U- U- 20

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RESULTADOS

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— $9 Cx] <N i en -t U- Cx ’ Os < - ‘ - 3 <NI en r ‘? t It) S O 5 -0 U- U- U- ~Q

(‘epa u ”

Figura 4. 24.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a S.

faecalis CECT481. Las columnas poseen el mismo significado que en la

f i g u r a 4 . 2 ( I ) .

80 -

74) --

6 4 )

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nionocytogenes Ll l sv4 . L a s c o l u m n a s p os e e n e l m i s m o s i g n i f i c a d o q u e

e n l a f i g u r a 4 . 2 ( 1 ) .

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RESULTADOS

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fertnentunz CECT285. Las columnas poseen el mismo significado que en

l a f i g u r a 4 . 2 ( 1 ) .

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F ig u ra 4 . 2 7 . - Act ivid ad i n h i b i d o r a d e 24 b a c t e r i a s lá ct ic as s e l e c c i o n a d a s f r e n t e a L.

planíarunz CECT22 1 . Las columnas poseen el mismo significado que en lafigura 4. 2 (1> .

t en ‘1’ 05 — SO ti U- ‘0 — en — ti It, CE 05 e - e - ~ en U- SO U- YO O — Cx] Cx-] <‘fi e . ~ . -t -t U- IV— 05 e--fi Cx] en t ..t -t Ir, SO ‘.0 U- U- U- 20

t en -t QN — t SO <‘~ 1-—- — — en — $9 It, C E QN en en U- SO U- Y O O — <‘fi e-fi <‘fi e”, t — t U- U- 0’ <‘fi e-~fi < -n t ‘t -t 1 <-a SO SO U- U- U- 20

1 5 0

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RESULTADOS

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110

14)4)

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4 )

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‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5

‘ 5 ‘ 5en O S — ‘O $9 U- O — en - rl tt) 20 QN e n e n U- SO U- 20 o‘Ni ti e-] en ‘Ú ‘tt C x - — U- 0” <‘1 <‘fi en Ú ‘t “t ‘t ~t) S O SC U- Cx’- C x — 20

1~

Cepa n < ’

F ig u ra 4 . 2 8 . - Act ivid ad i n h i b i d o r a d e 2 4 - b a c t e r i a s l á c t i c a s seleccionadas frente a S.

typhirnurium C E C T 4 4 3 . L a s c o l u m n a s p os e e n e l m i s m o s i g n i f i c a d o q u e

e n l a f i g u r a 4 . 2 ( I ) .

120 -

110 —

100 -

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(Sepa i-i”

F ig u ra 4 . 2 9 . - Act ivid ad i n h i b i d o r a d e 24 bacterias lácticas seleccionadas frente a S.

aureus C E C T 5 9 . L a s c o l u m n a s p os e e n e l m i s m o s i g n i f i c a d o q u e e n laf i g u r a 4 . 2 ( 1 ) .

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151

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RESULTADOS

IV. 2. 2. - Act ivid ad i n h i b i d o r a d e l o s s o b r e n a d a n t e s d e c u l t i v o s l i b r e s d e c é l u l a s

En l a t a b l a I V . 1 s e mu e st ra l a a c t i v i d a d an t im ic ro b ia n a d e l o s s o b re n ad an t e s d e

c u l t i v o s l i b r e s d e c é l u l a s d e l a s 2 4 ce p as p r e v i a m e n t e d e s c r i t a s d e s p u é s d e f i l t r a d o s ,

neutralizados y concentrados siguiendo el procedimiento descrito en la sección 1 1 1 . 2. 3. 3.

Como se observa, algunos presentan una actividad notable frente a ciertos microorganismos

i n d i c a d o r e s , sob re t od o f r e n t e a o t r a s b a c t e r i a s l á c t i c a s . Es d ign o d e m e n c i ó n q u e l o s

sobrenadantes de las cepas 148 y 180 presenten una notable actividad frente a L.

nz’onocytogenes. No obstante, frente a otros indicadores carecen de actividad inhibidora

detectable, lo que significa que, o bien éstos son insensibles a dicha actividad, o bien que la

concentración de la sustancia inhibidora es demasiado pequeña para detectarse con esta técnica.

IV. 2. 3. - Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lácticas

seleccionadas

Ya se ha descrito que el peróxido de hidrógeno (H,O,), producido por algunas

bacterias lácticas, inhibe el crecimiento de otras bacterias. Sin embargo, el tratamiento con 130

UY/ml de catalasa de los sobrenadantes de lo s cultivos libres de células con actividad inhibidora

no disminuye dicha actividad (no se muestran los resultados). Así pues, una vez comprobado

que, ni la acidez, ni la síntesis de H,02, ni la presencia de bacteriófagos estaban involucrados

en la actividad antimicrobiana de las cepas estudiadas, se pensó que éstas quizás sinteticen

o t r o s c o m pu e s t o s a c t i v o s d e b a j o pe so mo l e cu l ar y / o b a c t e r i o c i n a s . P or e l l o s c p r o c e d i ó a l a

identificación y caracterización bioquímica parcial de aquellas cepas cuyos sobrenadarnes libres

d e cé lu la s, u n a ve z co n ce n n ad os, ma n if e st ab an l a máxima actividad antimicrobiana

152

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RESULTADOS

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¡ 1 ¡ 1 1 ¡ 1 1 1 1 ¡ i 1 1 ¡

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i 1 1 ¡ i i 1 i 1 1 1 1 ¡ 1 ¡

1 1 1 1 1 1 ¡ i 1 1 i i

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RESULTADOS

I V . 3 . - I d e n t i f i c a c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n b i o q u í m i c a p a r c i a l d e l a s b a c t e r i a s lá ct ica s

s e l e c c i o n a d a s n or s u a c t i v i d a d a n t i m i c ro bi a n a

L a s s e i s b a c t e r i a s l á c t i c a s c u y os s o b re n a d an t e s co n ce n t ra d o s l i b r e s d e c é l u l a s

ma n if e st aro n l a m á x i m a a c t i v i d a d a n t i m i c r o b i a n a , s e som e t ie ron a l a m a y o ría d e l a s p ru e b a s

r e c o m e n d a d a s p o r S c h i l l i n g e r y L ñ c k e ( 1 9 8 7 b ) , re se ñad as e n l a s e c c i ó n I I I . 2 . 4 . , p a r a l a

i d e n t i f i c a c i ó n r á p i d a d e l a s b a c t e r i a s l á c t i c a s p r o c e d e n t e s d e l a c a r n e y p ro d u ct os c á r n i c o s . L a s

ce p as sel ecci onad as f u e r o n l a s c o r r e s p o n d i e n t e s al o s n ú m e r o s 3 1 ,

7 7 ,9 0 ,

1 4 8 . 1 7 7 y 1 8 0 .

I V . 3. 1 . - Mor f ol ogía y t i n c i ó n p o r e l m é t o d o d e Gram

L a o b s e i ’ v a c i ó n mic ros có p ica d e l a s c e p a s seleccionadas, teñidas con el método de

G r a m , e v i d e n c i a u n a moifología de bacilos cortos Grarn positivos (tabla IV . 2).

I V . 3. 2 . - P r u e b a d e l a c a t a l a s a

To d a s l a s c e p a s a n a l i z a d a s f u e r o n c a t a l a s a n e g a t i v a s ( t a b l a I V . 2 >

I V . 3 . 3. - Pr od u cc ió n d e CO , a p a r t i r d e gl ucos a

L a ca p ac id ad d e l a s c e p a s a n a l i z a d a s d e p r o d u c i r C O , , s e investigó como se describe

e n L a s e c c i ó n 1 1 1 . 2 . 4 . 3 . N i n g u n a d e l a s c e p a s s e l e c c i o n a d a s p r o d u j o d i c h o g a s ( t a b l a I V . 2 ) .

I V . 3. 4. — H i d r ó l i s i s d e l a a r g i n i n a

L o s r e s u l t a d o s d e l a p r u e b a d e hidrólisis de la arginina se muestran en la tabla IV . 2,

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RESULTADOS

n o o b s e rv á n d os e u n a re s pu e s t a u n if or me e n l a s d i f e r e n t e s ce p as se l e cci on ad as. D i c h a

re s p ue s t a v a r í a d e sd e l a r e a c c i ó n n e g a t i v a d e l a s c e p a s 3 1 , 7 7 , 9 0 yl S O , h a s t a l a p o s i t i v a d e l a s

ce p as 1 4 8 y 1 7 7 .

I V . 3 . 5 . - Producción de ácido sulfhídrico

L a r e a l i z a c i ó n d e l a s t é c n i c a s d e s c r i t a s e n l a s e c c i ó n I I I . 2 4 . 5.. n o e v i d e n c i é , e n

n ig ú n c a s o , l a p ro d u cc ió n d e á c i d o s u l f h í d r i c o p o r n in g u n a d e l a s c e p a s a n a l i z a d a s ( t a b l a I V .

2 ) .

I V . 3 . 6 . - P r u e b a d e Voges-ProskaUer

L a pr od uc ció n d e a c e t o í n a p o r l a s c e p a s seleccionadas seevaluó mediante la prueba de

Vo ge s- P ro sk aú e r ( s e c c i ó n I I I . 2 . 4 . 6 . ) . L o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s s e m u e st ra n e n l a t ab la I V .

2 ; d e ell o s s e d e d u c e q u e t o d a s l a s c e p a s p ro d u c e n a c e t o i n a e n c a n t i d a d e s m a y o re s ( c e p a s 7 7 y

90 ) o m e n o r e s ( c e p a s 3 1 , 1 7 7 y 1 8 0 ) . S i n e m b a r g o , l a c e p a 1 4 8 f u é n e g a t i v a e n e s t a p r u e b a .

I V . 3 . 7 . - F e rm e n t ac ió n d e c a r b o h i d r a t o s

L a cap acid ad fermentativa de carbohidratos de las cepas seleccionadas se evaluós i gu ie n d o e l procedimiento descrito en la sección III. 2. 4. 7 . L o s r e s u l t a d o s o b t e n i d os s e

mu e st ra n e n l a t a b l a I V . 3 . D e e l l o s s e d e d u c e q u e :

1 . ) To d a s l a c e p a s a n a l i z a d a s f e r m e n t an l a r i b o s a , g a l a c t o s a . D-gl uc o s a , D - f r u c t o s a ,

D - m a n o s a , N -ac et il gl ucos amin a. e s c u a l i n a , m e l i b i o s a , s a c a r o s a , t r ea lo sa y g l u c o n a t o .

2 . ) L a f e rm e n t ac ió n d e l o s a z ú c a r e s L—arabinosa, a-metil D-Qlucósido, D—turanosa,

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RESULTADOS

s a l i c i l i n a , ma l t os a, lac t o sa , D - r a f i n o s a , c e l o bi o s a y 2 cet o-gl ucon at o e s v a r i a b l e d e p e n d i e n d o

d e l a s ce p as a n a l i z a d a s . A s í , mien t ras l a c e p a 1 7 7 e s l a ú n i c a q u e f e rm e n t a l a L - a r a b i n o s a ,

a- me t il D - g l u c ó si d o y D - t u r a n o s a , t o d a s , c o n e x c e p c i ó n d e l a 7 7 , u t ili z an l a s a l i c i l i n a . L a

ma l t os a e s f e r m e n t ad a p o r l a s c e p a s 3 1 , 7 7 y 1 7 7 y l a l a c t o s a p o r l a s c e p as 9 0 , 1 4 8 . 1 7 7 y

1 8 0 . L a s c e p as 3 1 , 7 7 y 1 7 7 u t i l i z a n l a D - r a f r n o s a , mie nt ras q u e l a 1 4 8 y 1 7 7 f e r m e n t an e l

2 - c e t o g l u c o n a t o . L a c e l o bi o s a s ó l o e s dé bil ment e f e r m e n t a d a p o r l a c e p a 1 8 0 .

3 . ) N i n g u n a d e l a s ce p as a n a l i z a d a s f e r m e n t a e l g li ce r o l, e r i t r i t o l , D - a r a b i n o s a ,

D-x i l o s a , L - x i l o s a , a d o n i t o l , ¡ 3 - m e t i l xi ló si d o , L - s o r b o s a , r a m n o s a , d u lci t o l, i n o s i t o l , m a n i t o l ,

s o r b it o l, a - m e t í m a n ó s i d o , a m i g d a l i n a . a r b u t i n a , in u li n a, m e l i z i t o s a , a l mi d ó n , gl u c ó ge n o.

x i l i t o l , ¡ 3 - g e n t i b i o s a , D - l i x o s a , D - t a g a t o s a , D- f u cos a, L - f u c o s a , D-arabitol, L-arabitol y 5

c e t o - g l u c o n a t o .

L a f e rm e n t ac i ó n d e l o s a z ú c a r e s m a n i t o l , r i b o s a , m e l i bi o s a , m a n o s a , s a c a r o s a y

t r eh al o sa , e s d e g r a n i m p o r t a n c i a e n l a c l a s i f i c a c i ó n d e l o s lactobacillos de origen cárnico. Con

l o s r e s u l t a d o s ob t e n id os y sigu ien do e l e s q u e m a d e i d e n t i f i c a c i ó n p ro p u e st o p or Sehillinger y

L ñ c k e ( 19 8 7b ) , t oda s l a s b a c t e r i a s lá ct ic as a n a l i z a d a s s e c l a s i f i c a r o n tentativamente como

Lactobacillus sake.

IV. 3 . 8 . -

Tolerancia al clomro sódico

En l a t a b l a I V. 2 s e mu e st ra e l d e s a r r o l l o d e l a s bacterias lácticas seleccionadas en

m e d i o MRS s u p l e m e n t a d o c o n u n 7 o u n 10% d e N aC í , i n cu b ad o a 3 2 0 C d u r a n t e u n t ie m p o

m á x i m o d e 6 d i a s . To d a s l a s c e p a s s e l e c c i o n a d a s , s a l v o l a 7 7 , c r e c e n a u n a co n ce n t rac ió n d e

N a C í d e l 7 % . s i n e mb argo , n in g u n a m a n i f i e s t a d e s a r r o l l o mensurable cuando la concentración

d e N a C í s e el eva a l 10%.

156

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RESULTADOS

I V . 3 . 9 . - To l e ra n c i a a l pH d e 3 . 9

N i n g u n a c e p a s e d e s a r r o l l a e n e l m e d i o MRS a pH d e 3 , 9 ( a j u s t a d o c o n H C I , I N )

( t a b l a I V . 2 )

I V . 3 . 1 0 . - C re ci mi e n t o a d i v e r s a s t e m p e r a t u r a s

L a s t e m p e ra t ura s a l a s q u e l a sb ac t er ia s

l á c t i c a s s ed e s a r r o l l a n

s o n t am b ié n i m p o r t a n t e s

e n e l e s q u e m a d e i d e n t i f i c a c i ó n d e S c h i l l i n g e r y L i i c k e ( 1 9 8 7 b ) . En l a s e c c i ó n I I I . 2 . 4 . 1 0 s e

d e s c r i b e l a me t od ol ogí a s e g u i d a p a r a es t u d ia r el crecimiento bacteriano a l a s t e m pe ra t ura s d e 4 ,

1 5 y 45 0C, cuyos resultados se recogen en la tabla IV . 2. Todas las cepas seleccionadas se

d e s a r r o l l a n a 4 y 1 5 0 C , pe ro a 4 5 “ C ú n ic am e n t e l o h a c e n l a s c e p a s 1 4 8 y 1 7 7 .

1 5 7

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RESULTADOS

T ab l a I V . 2 . - C a r a c t e r í s t i c a s m o rf o l ó gi c a s y b i o q u í m i c a s d e l a s b a c t e r i a s l á c t i c a s s e l e c c i o n a d a s

C e p a N ~

C a r a c t e r í s t i c a

3 1 77 9 0 1 4 8 1 7 7 1 8 0

M o r f o l o g í a

Ti n ció n Grambacilo

+

b a c i l o b a c i l o b a c i l o b a c i l o b a c i l o

+

C a t a l a s a

Pr od u cc ió n d e CO ,

H i d r ó l i s i s d e l a a r g i n i n a

Pr od u cc ió n SR2

Voges-ProskaUer

C re c i mi e n t o e n

7% N a C í

10% N a C í

Crecimiento a

pH 3 , 9

40C

¡ 5 0C

+ +

+

+

+

+

+

4 5 o c

+ + + +

+ +

+ + +

+ + + +

‘4 -

+

+

+

+

+ +

+ +

+

1 5 8

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RESULTADOS

Ta b l a I V . 3 . - U t i l i z a c i ó n d e l o s c a r b o h i d r a t o s p o r l a s b a c t e r i a s l á c t i c a s s e l e c c i o n a d a s

C e p a N 9

Carbohidrato

3 1 7 7 9 0 1 4 8 1 7 7 1 8 0

G l i c e r o l - - - - -

E r i t r i t o l - - - - - -

D— arab in osa - - - - -

L - a r a b i n o s a - - - - +

R i b o s a + + + + + +

D- xi l osa - - - - - -

L - x i l o s a - - - - - -

Adon it ol

¡ 3 -m et il- xi lo sid o - - - - - -

G al act osa + + + + + +

D - G l u c o s a + + + + + +

D- F ru ct os a + + + + + +

D — M a n o s a - - --

- -

L -So rbo s a

R a m n o s a

D u l c i t o l

I n o s i t o l

1 5 9

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RESULTADOS

T ab l a I V . 3 . - ( c o n t i n u a c i ó n )

C e p a N 9

C ar b oh id ra t o

3 1 7 7 9 0 1 4 8 1 7 7 1 8 0

Mani t ol - - - - -

S o r b i t o l - - - - -

a - m e t i l D — m a n o s i d o - - - - -

a-metil D-glucosido - - - - +

N-acetil glucosarnina + + + + + +

Amigdalina - - - - - -

Ar b u t in a - - - - - -

E s c u a l i n a + + + + + +

Salicilina + - + + + +

C e l o b i o s a - - - - - +

Ma l t os a + + - - + -

Lact osa - - + + + +

Me l ib ios a + + + + + +

S a c a r o s a + + + + + +

T rea l osa + + + + + +

I n u l i n a — — — — — —

D - r a f i n o s a + + - - + -

A l m i d ó n — — - — — —

1 6 0

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RESULTADOS

T ab l a I V . 3 . - ( c o n t i n u a c i ó n . . y 2 )

C e p a N 2

C ar bo h id rat o

3 1 77 90 148 177 1 8 0

G l u c ó g e n o - - - - - -

X i l i t o l - - - - - -

¡ 3 - g e n t o b i o s a - - - - - -

D- t uran osa - . - - + -

D - l i x o s a - - -. - - -

D - t a g a t o s a - - - - - -

D- f u co sa - - - - - -

L- f u co sa - - - - - -

0 - a r a b i t o l - - - - - -

L - a r a b i t o l

G l u c o n a r o + + + + + +

2 ceto-gluconato - - - + + -

5 ceto-gluconato - - - - - -

1 6 1

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RESULTADOS

I V . 4 . - Esoe ct ro an t imic rob ian o d e l a s u s t a n c i a i n h i b i d o r a e x o c e l u l a r d e l a s ce oas d e

L . s a L e 7 7 . 9 0 . 1 4 8 y 1 8 0

Una v e z c a r a c t e r i z a d a s b io qu imi ca me n e l a s s e i s b ac t er ia s l á c t i c a s d e i n t e r é s , e n c u a t r o

d e e l l a s s e e va l u ó d e n u e v o l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a d e s u s s o b r e n a d a n t e s co n ce n t ra d os l i b r e s d e

c é l u l a s f r e n t e a u n n u m e r o m a y o r y m á s d i v e r s o d e b a c t e r i a s al t er an t es y p a t ó g e n a s . Co n l a

m e t o d o l o gí a se ña l ad a e n l a s e c c i ó n 1 1 1 . 2 . 5 ( t a b l a I V . 4 ) s e ob se rvó q u e l o s s o b re n ad an t e s

c on ce n t rad os d e l a s 4 ce p as d e L. saLe a n a l i z a d a s e r a n a c t i v o s f r e n t e a c e p a s d e L. brevis, L.

curvatus, Carnobacteriurn di~’ergens, Leu. ¡nesenreroides, S. aui’eus, C’ botulinun,, C.

pe,f,’ingens y L. rnonocvtogenes.

L a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a d e l a s c e p a s e s t u d i a d a s v a r i a b a n o s o l o d e s d e e l p u n t o d e v i s t a

c u a n t i t a t i v o s i n o t amb ié n c u a l i t a t i v o . A s í p o r e j e m p l o , e l sobrenadante d e L . saLe 1 4 8 f u é e l

ú n ic oq u e

s e m o s t ró a c t i v o f r e n t e a t o d a s l a s c e p a s d e L. monocytogenes e s t u d i a d a s ,a d e m á s

f u é t am b i é n e l ú n i c o q u e i n h i b í a e l d e s a r r o l l o d e l a s c e p a s CECT5 10 5 y S c o t t - A .

L a m a gn i t u d d e l a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a , c u a n d o é st a e x i s t í a , t am b ié n f u é d is t in t a e n

c a d a c e p a e n s a y a d a s i e n d o , e n g e n e r a l , e l so b re n ad an t e d e L. saLe 1 4 8 e l m á s p o t e n t e , s i s e

e x c e p t ú a aL. saLe 1 8 0 c u y a capacidad de inhibir a S . aureus FR1137 o L. nzonocytogenes

L I S s v 1 /2 e r a m a y o r . S i n e m b a r g o , n o s e i n h i b i ó n in g u n a d e l a s b a c t e r i a s G r a r n - n e g a t i v a s

ensayadas, entre las que se incluían microorganismos potencialmente productores de

t o x i i n f e c c i o n e s a l i m e n t a r i a s como Salmonella £yphirnur¡wn y Ye,’sinia enterocolítica.

162

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RESULTADOS

T ab l a I V . 4 . - E s p e c t r o a n t i m i c r o b i a n o d e l a s c e p a s d e Lactobadillus saLe s e l e c c i o n a d a s

Inhibición por el sobrenadante

concentrado de la cepa de L. sa/ce

Microoganismo Origena 77 90 148 180

&

B a c t er i a s G r a m - p o s i ti v a s

Lactobacillus ac¡dophilus 2 8 9 CECÍ O O 0 0

Loctobacillusbrei’is L b 2 8 9 IMTH 16 ,8 1 5 2 0 , 4 1 2

Loctobacillus ccn-n¡s L v 6 l F R I B O O O O

Lactobacillus casei 4 7 5 CECÍ O O O O

Lactobaci/lus curvatus L b 7 2 6 IMTH ¡ 4 , 2 15,6 17,2 13,8

Ca,-nobacteriun; divergeus L v 1 3 ERIE 1 7 1 7 2 1, 6 1 3

Lactobacillusfernientuni 2 8 5 CECT 1 9 , 4 1 7 , 4 2 3 , 8 1 4

Lactobacillus mesentericus 3 9 4 CECÍ O O O O

Lactobacilius planta¡’uni 2 2 1 CECÍ O O O O

Loctobacillus saLe L b 6 8 IMTH O O O O

Leuconostoc mescnw,’o¡des 3 9 4 CECÍ O O O O

Micrococcus i’arians 23 0 CECÍ O O O O

Staphy/ococcus riJosas 2 3 7 CECÍ O O O O

Sireptococcusfaecalis 4 8 1 CECÍ O O O O

Strepbococcusfaecalis

( v a r . Iicuejhc¡ens) 1 8 4 CECÍ O O O 1 )

Streptococcusfaúciuni 4 1 0 CECT 0 0 0 0

Bacillus stea¡’oíe¡’mophilus 4 9 CECÍ O O O O

BacH/as cen~us 1 4 8 CECÍ O O O O

B¡’oc’ho¡h,’Lv the¡-nmospl¡acu-¡ 1001 8 NCIB 0 0 ( 1 0

Swp/o’Iw’oc’c’us ameus 1 3 7 F R 1 O 8 . 4 9 1 0

Staphylococcus am-cus 3 6 1 FRI 0 8 . 8 9 , 2 8

1 6 3

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RESULTADOS

T ab l a I V . 4 . - ( c o n t i n u a c i ó n )

I n h i b i c i ó n p o r e l so b re n ad an t e

co n ce n t ra d o d e l a c e p a d e L . s a k e

M i c r o o g a n i s m o O rige na 7 7 9 0 1 4 8

n 9

1 8 0

Listeria nzonocyrogenes

Listeria rnonocytogenes


Listei’ia rnonocytogenes

Listei’ia nhonocytogenes

Clostridium botulinum

Clostridium pe,fringens

5 1 0 5

7 9 7 3

L I S s v 1 / 2

L I í s v 4

Scott A

551

376

Bacterias Gram-negativas

Ente,’obacter cloacac

Escherichia cok

Escherichia colie n t e ro pa t o ge n i c a

Salmonella ¡‘yphi

Salmon ella iyphinwrium

Pseudornonas fluorescens

Pseudonzonas fluorescens

Pseudomonas fluorescens

Ye,’sinia enterocolitica

Yersinia enterocolitica

194

BW545

B4 1

4 0 9

T91

DC5

DC?

NTI9

E20

1 4 4 0 5

CECÍ

MI T

IEKC

CECÍCENAN

FR 1 1 3

FRIB

FR I B

Nuestía

IPP

oo

0

o

o

o

0

0

colección O

4 1 )

a A b r e v i a t u r a s como e n t ab la I I I . 1

b Act ivi d ad i n h i b i d o r a e x p r e s a d a c o r n o di á me t ro d e h a l o d e i n h i b i c i ó n e n mm.

NCÍC

NCÍC

FVM

FVM

FVM

CECÍ

CECÍ

o

9

17,2

9

0

0

11,4

o

9 , 6

9 , 6

o

o

9,41 0

14 ,2

17

17

17

15,2

9 , 8

1 5

o

l o

1 9 , 4

9

0

10,2

10 ,6

o

o

o

o

o

( 3

o

O

o

o

oo

o

o

o

O

o

o

o

o

oo

ooo

o

o

0

o

o

164

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RESULTADOS

De l o s r e s u l t a d o s o bt e n i d o s s e d e s p r e n d e q u e :

1). Las sustancias inhibidoras producidas por las cepas deL.sake seleccionadas son

d is t in t as , y a q u e v a r í a n t a n t o e n s u e s p e c t r o an t im ic ro b ia n o como e n l a m a g n i t u d d e s u

i n h i b i c i ó n .

2). La sensibilidad de lo s distintos microorganismos indicadores frente a las sustancias

i n h i b i d o r a s v a r í a d e a c u e r d o c o n la especie y cepa utilizada, de donde se desprende que la c e p a

p rod u ct or a n o s ó l o o r i g i n a u n a sustancia inhibidora específica, sino que la sensibilidad frente a

dicha actividad del microorganismo indicador empleado depende además de la especie también

d e l a c e p a .

3 ) . L a a c t i v i d a d i n h i b i d o r a d e L. sa/ce 1 4 8 f u é s u p e r i o r a l a d e l r e s t o d e l a s ce p as

e s t u d i a d a s , p or l o q u e s e s e l e c c i o n é d i c h o m i c r o o rg a n i s m o p a r a l a r e a l i z a c i ó nd e

e s t u d i o s

p o s t e r i o r e s .

I V . 5 . - E f e c t o d e l a comnosición del medio de cultivo en la actividad antimicrobiana

d e Loctobacillus sa/ce 148

El medio MRS, que se emplea generalernente p a r a e l d e s a r z ’ o l l o d e l a s b a c t e r i a s l á c t i c a s

es muy rico en sustancias proteicas por lo que dificultaría la purificación de las sustancias

proteicas antimicrobianas. Consecuentemente, la actividad inhibidora de L. saLe 148 se

detei’minó en otros medios de cultivo, unos complejos y otros más definidos, de acuerdo con

l a me t od ol og ía descrita en la sección III. 2 . 6. La actividad inhibidora de los sobrenadantes

co n ce n t rad os d e l o s c u l t i v o s l i b r e s d e c é l u l a s s e c o m p a r ó c o n l a cor re sp on d ie n t e d e L s a L e

1 4 S crec ido e n m e d i o MRS ( t a b l a I V . 5 ) .

1 6 5

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

T ab l a I V . 5 . - Act ivid ad an t imi cr ob ian a d e L. saLe 1 4 8 d e s a r r o l l a d o a 3 2 0 C e n d i v e r s o s

me d io s d e c u l t i v o

M e d i o d e c u l t i v o Actividad inhibidora a

MRS ++

ART

ART + Triptosa ++

APT + P r o t e o s a p e p t o n a ++

API + E x t r a c t o d e c a r n e ++

API’ + Peptona ++

BHI

BHI + Triptosa

BHI + P r o t e o s a p e p t o n a

BHI + E x t r a c t o d e c a r n e

BHI + Peptona

MM + Triptosa ++

MM + P r o t e o s a p e p t o n a +

MM + E x t r a c t o d e c a r n e ++

MM + P e p t on a +

MM + Tr’íptona

MM + C a s i t o n a

a Símbolos para el ensayo de difusión en agar: ++, Diámetro de inhibición grande (15-21

mm); +, Di á me t ro d e i n h i b i c i ó n pequeño (<15 mm); -.Sin inhibición.

1 6 6

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RESULTADOS

Los resultados de la tabla IV . 5. indican que los medios de cultivo APT y EHI

(suplementado o no) no son adecuados para que se exprese la actividad antiínicrobiana de L.

saLe 148. Lo mismo ocurre con el medio base (MM), suplementado con triptona o casitona,

(hidrolizados proteicos derivados de la caseina). Sin embargo, la actividad inhibidora es

cuantificable cuando el microorganismo se cultiva en medio complejo de APT o en medio base

MM, suplementados con tripbosa, proteosa-peptona, peptona o extracto de carne (todos ellos

son hidrolizados proteicos de origen cárnico>. La actividad inhibidora de en el medio base

suplementado con triptosa (MM-triptosa), es similar a la obtenida en el medio MRS. Dado que

la triptosa es, como se ha dicho, un hidrolizado proteico cárnico que contiene,

fundamentalmente, aminoácidos y péptidos pequeños lo que facilita la purificación de la

sustancia antimicrobiana deL, s a L e 148.

IV. 6.- Parámetros cinéticos y actividad inhibidora de L saLe 148 a distintas

temperaturas

IV. 6. 1.- Crecimiento y actividad antimicrobianadeL. s a L e 148

En las figuras 4,30 a 4,34 se muestra la relación entre crecimiento y actividad

antimicrobiana de L. saLe 148, al desarrollarse en lo s medios M RS y MM-triptosa a diversas

temperaturas. De lo s resultados obtenidos se deduce que:

1 . ) L. saLe 1 4 8 manifiesta un crecimiento cuantificable a 4, 8, 16 , 25 y 32 0 C . s i b i e n

el desanollo es mayor a 25 y 3 2 oc.

167

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RESULTADOS

3 00 -

2 5 0

200

1 5 0

loo

5 0

o

A

o l o 1 5 2 0 2 55 3 0

6 00

5 00C d1~o

4 00

300 ~

C d ‘o

200 ~zu

<‘fi

E

loo

O

Tiempo (días)

3 00

o

B

.2.

o 5 l o 1 5 20 2 5

6 00

5 0 0C d 1.,o

4 0 0

300 ~

C d ‘o

200 ~Zu

loo

03 0

< ‘ f i

EE

Tiempo (días)

Figura 4. 30.- Crecimiento ~o)y a c t i v i d a d an t imi cr ob ian a (u) de Lacm oba cil l us s a L e

1 4 8 c u l t i v a d o e n l o s m e d i o s MRS (A) y MM-triptosa (B) a 4 o c .

1 6 8

-5-.. 4 - - a

CC

‘o C d‘o

C d

u

C d.0 LI

oCC

.0

250

200

1 5 0

loo

5 0

CC

4 >e C d

‘o

C du

C d .0 1~

OCC

.0

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RESULTADOS

Tiempo (días)

.1. E A

4 6 8

Tiempo (días)

Figura 4. 31.- C re ci m i e n t o ~o)y a c t i v i d a d a n t i m i c r o b i a n a ( M ~ d e Locwbacillus s a L e

1 4 8 cul t ivad o e n l o s me d io s MRS (A) y M M - t r i p t o s a (8) a 8 0 C .

169

3 00

4>

CC

4>e C d ‘o

C d

ue C d.0 1~

o u,.0

2 5 0

200

1 5 0

loo

5 0

6 00

5 0 0C d1-O

400

e

e 300 -o

C d

‘o

200 ~zu

E

fi-fi

Ee

o

3 00

o 2 4 6 8 1 0

loo

o12

B6 00

5 00- 5 - 1

~1

e>

CC

4>‘o C d ‘o

e

C d

ue C d .0

1-OCC

.0

250 -

200 -

1 5 0

loo

5 0 -

o

C d 1-O

400

e

e

3 0 0 - oC d

‘o

; 1.

200 zu

e-fi

e E

o.o 2

~1 loo

olo 12

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RESULTADOS

3 00

25 0

200

150

loo

5 0

o

3 00 -

25 0

B

E

200 -

1 5 0 -

loo

5 0

o

6 0 < )

5 0 0C d 1-.o‘o

4 00 ~

e e

3 00 - oC d

200 zu

4+ 1

EA

loo

o

6 00

5 0 0 C d

o4 00

e

e

3 0 0 ~C d

2 0 0 • zu

4+.

EE

-

loo

1 1

O l O 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0o

Tiempo (horas)

Figura 4. 32.- Crecimiento (O) y actividad antimicrobiana (U) de L saLe 148

c u l t i v a d o e n l o s f i f l e d i o s MRS (A) y MM - t ri p t os a (II) a 1 6 0 C .

1 7 0

4 - - a-4-a 4>

CC

e>‘o C d‘o

e

C d

u e C d

.0 oCC

.0

0 10 20 30 40 5 0 6 0 7 0 8 0

Tiempo (horas)

-4-4-ae>

u,a)‘o C d‘o

e

C dc ae C d.0 fi-o‘ti

.0

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RESULTADOS

3 0 0

250

200

1 5 0

loo

5 0

o

300

~50

200

150

loo

5 0

o

6 00

5 00C d1-.o

4 00

e

e

3 0 4 1 ) oC d

‘o

200 ~-zc a

e-fi

EE

loo

o

6 00

5 00C d1-.O

400

e e

300 ~

C d

2 00 1=U

4+-fi

EE

1 0 < )

o

Tiempo (horas)

Figura 4. 33.- Crecimiento (o) y actividad antimicrobiana (u ) d e Lacrob acil l us s a L e

1 4 8 c u l t i v a d o e n los medios MRS (A) y MM—triptosa (II) a

250C.

e>

C Ce>

o C d

‘o e

C d

c ae C d .0

1~

OC C.0

o 6 1 2 1 8 24 3 0 3 6

Tiempo (horas)

- 5 - 14>

C Ce>

0 C d

e

C d

c ae C d.0

1-OC C

.0

o 6 1 2 1 8 24 3 0 3 6

171

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RESULTADOS

3 00

250

200

1 5 0

loo

5 0

o

3 00

250

2 00

1 5 0

loo

5 0

o

Ligura 4. 34.-

6 00

500C d 1-o

4 00 ~e

e 3 00 c

C d

‘o

2 00 - zca

Cx.

EE

loo

o

6 00

5 00C d 1-o

4 00.0

e

3 00 ~C d ‘o

200 ca

rl

EE

loo

o

C re c im i e n t o (o) y a c t i v i d a d a n t i m i c ro bi a n a ( u > d e Lactobacillus s a / c e

1 4 8 c u l t i v a d o e n l o s me d io s MRS (A) y MM-triptosa (B) a 3 20 C .

172

. 5 - - a

a)

CC

e>‘o C d ‘o e

C d

c ae C d

.0

o u,

.0

~«

0 6 12 1 8 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8

Tiempo (horas)

4>

u,a)

‘o C d

‘o

e

C d

c ae C d

.0 1-

ou,

.0

0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8

Tiempo (horas)

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RESULTADOS

2 . ) D e n t ro d e u n a m i s m a t e m p e r a t u r a , e l d e s a r r o l l o ó p t i m o s e al c an z a e n e l m e d i o

M RS.

3 . ) A l a s t e m p e ra t ura s d e i n c u b a c i ó n e mpl e ad as , l a a c t i v i d a d antiinicrobiana se detectó

p o c o d e s pu é s d e i n i c i a r s e l a f a s e l o g a r í t m i c a d e c r e c i m i e n t o . P or t a n t o , l a act ivid ad

antimicrobiana de esta cepa es una propiedad ligada al desarrollo celular, siendo detectable y

cuantificable durante su crecimiento en un medio base o mínimo, suplementado con triptosa.

4 . ) T an t o e n e l m e d i o MRS como e n e l MM- t rip t osa , l a a c t i v i d a d an t im ic ro b ia n a f u é

máxima cuando L. saLe 148 se cultivaba a 32 0C, no obstante, la actividad fué siempre mayor

e n e l niedio complelo MRS. La actividad máxima a esta temperatura se detecta a las 16 horas

d e c r e c i m i e n t o ; po s t e ri o rm e n t e s e ob se rva b a u n l i g e r o d e s c e n s o h a s t a el final de la incubación.

IV. 6. 2. - Parámetros cinéticos del crecimiento microbiano

Los parámetros cinéticos estudiados en L. saLe 148 cultivado en lo s medios MRS y

MM-triptosa a 4, 8, 16 , 25 y 32 0 C , fueron los siguientes; velocidad específica de crecimiento

(gt), tiempo de duplicación celular (td), número de generaciones por llora (g/h) y peso celular

seco final (mg/mí).

Los parámetros citados, así como el pH y la actividad antimicrobiana final se muestran

en la tabla IV . 6. De ella se deduce que:

1.) La velocidad específica de crecimiento y el número de generaciones/tora fué mayor

y, consiguientemente, el tiempo de duplicación menor, cuando L . s a k e ¡48 se desarrollaba a

2 5 y 3 2 0 C . El crecimiento fué ligeramente inferior cuando el medio empleado era elMM-triptosa.

173

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

Ta bl a I V . 6 . - Pa rá me t ro s c i n é t i c o s d e c r e c i m i e n t o , pH final y actividad inhibidora de

Loctobacillus saLe 148, cultivado en lo s medios MRS y MM-triptosa ad i f e r e n t e s t e m p e ra t ura s

Pa rá me t ro ( a ) M e d i o T e mp e ra t u ra d e i n c u b a c i ó n ( 0 C )

4

MRSMM -t rip t osa

0,0010 , 0 0 1 .

8

0 , 0 0 60 , 0 0 5

1 6

0 , 0 3 50,035

25 32

0,0750,073

0,0930,087

MRS

MM -t rip t osa

MRS

MM -t rip t os a

MRS

MM-triptosa

MRS

MM- rri p t osa

MRS

MM- t rip t osa

MRS

MM -t r i p t o s a

5,4 5,2

5,2 4,8

137 160

101 101

0,8

0,8

0 .9

0 ,6

( a ) ~, velocidad específica de crecimiento (h~ 1);

generaciones/hora; pcs, peso celular seco (ng/mí):

td, tiempo d e d up l ica ció n (h), g/h,

pH, pH final: Al y AlE, actividad

inhibidora del sobrenadante (inín2/ml) y actividad inhibidora específica del mismo

(min2/rnl/Unidad K lem t)

td

pcs

563

700

0.002

0,00 1

0,82

0,83

108

137

0,009

0,007

0,89

0,87

19,2

19,8

0,050

0,050

1,14

1,15

9,2

9,9

0.108

0,100

1,25

1,20

7,4

7,9

0,130

0,120

1,34

1,28

pH

Al

AlE

4,9

4,4

170

108

0,7

0,5

4,5

4.3

541)3

502

1 ,9

2.2

4,5

4,3

513

485

1,9

2,2

174

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

2.) El peso celular seco final fué mayor a 32 0C. Con el medio de MM-triptosa se

o b t e n í a u n p e s o c e l u l a r l i g é r a m e n t e i n f e r i o r .

3 . ) E l pH final fué más bajo a las temperaturas óptimas de crecimiento, siendo menor

que el obtenido cuando el medio de cultivo empleado era el de MM-triptosa.

4.) La actividad inhibidora máxima se alcanzó a lo s 32 0C en el medio MRS, sin

embargo. la actividad inhibidora específica, es decir, el cociente de dividir la actividad

inhibidora máxima por la absorbancia del cultivo (Unidades Klett), fué igual a 25 y 32 0C y

ligeramente stiperior en el medio de MM-triptosa.

IV. 7. - Purificación parcial de la actividad antimicrobiana exocelular deL. sa/ce 1 4 8

Conocidas las condiciones óptimas de producción de la sustancia antimicrobiana

e xo ce l u l ar d e L. scA-e 148 en medio semisintético de MM-triptosa, se procedió a su

p u r i f i c a c i ó n por cromat ograf ía d e f i l t r a c i ó n e n geles.

IV. 7. 1 . - Cromatoizrafia de filtración en Sephadex G- 150. 0-75 y G-50

El sobrenadante concentrado libre de células de Lsake 148, obtenido como sedescribe en la sección 111.2. 3. 3. 1 . se purificó parcialmente en columnas de Sephadex 0-150

fino, 0-75 y G-50 de la manera descrita en la sección 111 .2 . 8. de este trabajo. El resultado de

ésta purificación se refleja en las figuras 4.35, 4. 36 y 4. 37 , en las que se muestra la actividad

antirnicrobiana y la absorbancia de las fracciones eluidas.

Al pasar el sobrenadante concentrado por la columna de Sephadex 0-150 fino (figura

4. 35), la actividad antiíuicrobiana eluye tardiarnente aunque antes de que aparezca el ~mayor de la absorbancia. Dado que este pico coincide con el volumen de eiución de Ja columna

175

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

se suponeque el peso molecular de la sustancia antimicrobiana se encuentra muy próximo al

límite inferior de exclusión del Sephadex G-150 fino, que es de unos 5.000 daltons. Para

obtener una mejor separación, las fracciones con mayor actividad antimicrobiana se juntaron y

liofilizaron, volviéndolas a pasar por una columna de Sephadex G-75.

El resultado de la segunda filtración se observa en la figura 4. 36 , apreciándose 2 picos

de absorbancia máxima no bien definidos. El primero de ellos, más pequeño, coincide con el

de la actividad inhibidora, mientras que el segundo coincide con el volumen de elución de lacolumna. La actividad inhibidora queda, por tanto, retenida en la columna. Sin embargo. Ja

capacidad de separación de ésta columna es muy amplia (3.000 - 80.000 Da) por lo que, para

obtener la mayor separación posible por cromatografía de filtración, se recurrió a una tercera

columna con un intervalo de separación entre 1.500 y 30.000 Da. De nuevo, las fracciones con

mayor actividad inhibidora procedentes de la segunda columna se juntaron y liofilizaron,

pasándolas a continuación por una columna de Sephadex G-50.

Los resultados obtenidos con la columna de Sephadex G-50 se reflejan en la figura 4.

37, en la que se observa que el pico de actividad se corresponde con el de absorbancia

máxima.

176

7/10/2019 Ad 2009501


oo o

CI e e‘ o c

a

c

a

o c

C d

1 -

o‘ o o~1 -

o e - f i

o

4

w u O S Z

E

EI 3

U C t J J O S q~

o 0 0~-1

‘ -- a ,

4 , t

C

d

C

d

O

O

- e

O

. 0

u

C

d

O ( - 3

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e :

o o

t

o c

—

el

C

d

C

d

e - )

~ O ,

~ O

O

C

d

‘ O

. 0

—

‘ -- a

o

o C

d

‘ o

o

. 0

t f l C

d

- e • 0 en

o

o

o

o

o

o

o c

S O

‘ t

O —

]

1

7

7

7/10/2019 Ad 2009501


o c

O O

— ( - . 3

0 4

e - )

‘ o ; ~. <

4 ,- o C

d

O

o

. c

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>

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5-’

o

4 ,

~

—

el

C d

C d

C d

a 0 e

O

C

d

o

‘ 0 .

0 4

~ 5

C

d

‘ o

o . 0

t e

C d

0~.-’

en

o

O S O

4 2 )

WL i O

S Z

U

E i 3 uE q J o s q~

2 u - ’

1

7

8

O

O

O

O

O

L f l

en

el

7/10/2019 Ad 2009501


O S

O

c

i

‘ o c

a

c

a

C

d

S-4

O- Ú O el O

t

t

i

u

I i

4

>

o c‘ =4LI ,

L

I

,

( .4 O )

~

C d

C

d

O

c e

- e

~ .- 5 f l

t c e

5

- e

t é C d

O

4 - >

0—

el

C d

—

C d

e - >

~ O ,

U O C d

‘ O

. 0

o~

i .f l

C d

o” - ,

U-

en-f -I t 2 )

u - .

e n

el

o

1

7

9

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

La purificación de la actividad antimicrobiana exocelular de L. saLe 148 se muestra en

la tabla IV. 7, en la que se detalla el grado de purificación y porcentaje de recuperación para

cada una de las etapas. La purificación final fué de 6,7, con una recuperación de la actividad

antimicrobiana del 8 %.

1 8 0

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

Tabla IV.?. - Purificación pai-cial de laactividad antimicrobiana de Lactobaciflus sa/ce 148

Actividad Actividad

Actividad Inhibidora Proteína Inhibidora Actividad Grado de

Volumen Inhibidora Total Total Específica Recuperad-a Purificación

(mí) (cm2/nil) (cm2) (mg/mi) (cin2/ml) (%) (veces)

Sobrenadantedel cultivo librede células 500 6,5 3.267 10 0,6 100 1

SephadexG-150 1 7 148,5 2.525 50 2,9 77 4,5

Sephadex4 1 3 - 7 5 6 111,6 670 25,9 2,2 21 3,2

SephadexG-50 3 88,3 265 30 4,4 8 6,7

La purificación se calcula corno la Actividad inhibidora específica de la fracción X/Actividad

inhibidora específica fracción 1 .

La recuperación se calcula como la Actividad inhibidora de la fracción X/Actividad inhibidora

de la fracción 1 multiplicado por 100.

181

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

IV. 8. - Caracterización parcial de la actividad antimicrobiana de Lactobacillus saLe

148

IV. 8 . 1 . - Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidora

Para determinar la sensibilidad de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada a

los enzimas proteolíticos, lipolíticos y amiloliticos, se realizó el ensayo descrito en la sección

III. 2. 9. 2. Los resultados obtenidos se observan en la Tabla IV . 8, de la que se deduce que:

1.) - La actividad antimicrobiana de L. saLe 148 es destruida por los enzimas

proteolfticos inespecíficos papaina, proteasa XIV y proteasa II. Otros enzimas proteoliticos,

como la tripsina y pepsina, reducen la actividad antimicrobiana en un 92 % tras 12 horas de

incubación a 32 0 C .

2.) - Los enzimas lipolíticos lipasa 1 y lipasa VII, no modifican la actividad

antimicrobiana de Lactobacillus saL -e 148 y lo mismo ocurre cuando se emplean enzimas

amilolíticos.

Los resultados obtenidos indican que la actividad antimicrobiana de L. saL -e 148 es de

naturaleza proteica, sin que existan en su estructura componentes lipídicos ni hidrocarbonados

que intervengan en dicha actividad.

1 8 2

7/10/2019 Ad 2009501


RESULTADOS

Tabla IV . 8. - Efecto de diversos enzimas en l a actividad antimicrobiana

purificada de Lactobacil/us saLe 148

parcialmente

Actividad residual (%)

EnzimaConcentraciónFinal Tiempo de incubación (h)

(mg/mí) 2 6 12

T r i p s i n a 1 46

5 31

P e p s in a 24

5 31

67Pa p ai n a

Proteasa XIV

P rot eas a I I

Lip asa 1

Lipasa VII

a-ami lasa

2 1

.7 ?1

5 37

1

5

loo

1 0 < )

loo5 loo

1 < 1 < )

5 loo

25 8

8 8

8

8

8

8

o5 5

16

26

1 6

100

1 0 0

1 0 0

1 0 0

O

16

o

1 0 0

100

100

1 0 0

1 0 01 0 0

10 < ) loo

183

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RESULTADOS

IV. 8. 2. - Efecto del oH en la actividad inhibidora

El ensayo se realizó como se describe en la sección 1 1 1 . 2. 9. 3., variando el pH del

tampón utilizado en la disolución de la actividad antimicrobiana entre 2,6 y 12 y utilizando aL.

fernzentunz CECT285 como microorganismo indicador.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 4. 38, de laque se deduce que la

sustancia antimicrobiana es activa en el intervalo de pH analizado, aunque la mayor actividad

se observa a valores de pH entre 5.6 y 6,6. La actividad inhibidora es ligeramente inferior

cuando lo s valores de pH son extremos, tanto ácidos como básicos.

IV. 8. 3. - Cinética de termodestmcción de la actividad antimicrobiana exocelular de

Lactobacillus saLe 148

La cinética de termodestrucción de la actividad antimicrobiana de L sake 148, se

determinó depositando en viales de vidrio 20 mg de la sustancia parcialmente purificada en 100

gí de tampón citrato-fosfato 4 mM de pH 7, a continuación se cierran herméticamente, y se

calientan durante intervalos de tiempo variables, dependiendo de la temperatura de

calentamiento (sección III. 2. 9. 4).

La figura 4. 39 muestra la inactivación térmica de la sustancia antimicrobiana de L.

saLe 148 a80, 100,121, 135 y 150 0C ; deella se deduce:

La actividad antimicrobiana deL. saLe 148 es resistente a temperaturas de 80 y 100

0C. perdiendo únicamente un 40 % de su actividad inhibidora inicial cuando se calienta a 100

0Cdurante 30 mm.

184

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RESULTADOS

1 0 0

8 0

6 0

40 -

2

20

o4 6 8 1 0 1 2

pH

Figura 4. 38. - Efecto del pH en la actividad de la sustancia antimicrobiana parcialmente

purificada deL. saLe 148.

185

Cd1~

O‘o

.0

.0

‘o C d

‘o

c a

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RESULTADOS

Esta termorresistencia también se manifiesté cuando las temperaturas de calentamiento’

fueron de 121, 135 y iso 0C.

2.- A las temperaturas empleadas, la inactivación de la sustancia antimicrobiana se

ajustó, con ligerasvariaciones, a ecuaciones cinéticas de primer orden, mientras lo s parámetros

de termodestrucción “D”, ‘t

14’ y Z se calcularon, como se describe en la sección 1 1 1 . 2. 9.

5. 3 . 2 . , a partir de los resultados de termodestrucción (figura 4. 39)-

Los valores “D ’ a 80, 100, 121. 135 y 1500C, calculados asumiendo una cinética de

¡nactivación de primer orden, fueron de 285,7, 119, 23,8, 17,4 y 15,2 minutos

respectivamente. Los valores “t1~”, calculados par a las mismas temperaturas, fueron de 198,

82,5, 16,5, 12,05 y 10,6 minutos respectivamente. Finalmente, de la ecuación de la recta de

regresión obtenida al representar gráficamente el logaritmo de lo s valores ‘D” en función de la

temperatura a la que fueron obtenidos, se calculó el valor ‘7; dicho valor, procedente de la

recta comprendida entre 121 y 150 ‘=C,fué de 153,40C.

1 8 6

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RESULTADOS

C d1~o

‘o

.0

.0

‘oC d

‘o

-ao

1 0 0

8 0

6 0

40

20

o6 0

Tiempo (mm)

Figura 4. 39.- Resistencia térmica de la actividad antimicrobiana parcialmente purificadade Lactobacillus saL -e 148 tras su calentamiento a 80 0C (m Il, 100 0C (o>,

121 0C(Á), 135 0C(A)y 1500C(•).

o 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

1 8 7

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RESULTADOS

I V . 8 . 4 . - Determinación del ceso molecular por cromato2rafía de filtración en

Seohadex G-50

El peso molecular aparente de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificadadeL.

saL-e 148, se determinó sometiéndolo a una nueva cromatografía de filtración en un gel de

Sephadex G-50. Como se describe en la sección III. 2. 9. 5, la representación gráfica de lo s

eluatos cromatográficos de marcadores de peso molecular estándar, en función del logarítmo

de sus pesos moleculares, permite determinar el peso molecular de una proteína problema por

interpolación en la gráfica de la fracción cromatográfica que la contiene.

La cromatografía se realizó en las condiciones descritas en la sección III. 2. 9 . 5 , y su

resultado se refleja en la tabla IV. 9. E n dicha tabla se muestran el peso molecular en daltons,

su logaritmo y las fracciones de elución de lo s compuestos estándar y de la actividad

antimicrobiana de L. saL-e 148. El peso molecular de la sustancia inhibidora, obtenido porinterpolación gráfica de lo s resultados obtenidos (fig. 3 . 7), fué de 4.640 daltons.

IV. 8. 5. - Determinación del Deso molecular por electroforesis en aeles de

poliactilamida co n dodecil sulfato sódico

Para confirmar el peso molecular de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificadade L. saL-e 148. determinado por cromatografía de filtración, se utilizaron las técnicas de

electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico y urea según la técnica de

Swank y Munkres (1971) y en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico

(SDS-PAGE) según la técnica de Laemli (1970).

188

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RESULTADOS

Ta bl a IV. 9. - De t e rmi n ac ió n d e l p e s o mo l e c u l ar d e l a a c t i v i d a d an t im ic ro b ia n a p ar ci al me n t e

p u r i f i c a d a d e Lactobacillus saLe

S e p h a d e x G - 5 0

Compuesto

F r a c c i ó n d e

e l u c i ó n n 2

L o g a r i t m o d e l

pe so mol ec ul ar

Pe so mo l e c u l ar

( D a l t o n s )

a-quimotripsinógeno 27 4.40 25.000

RNAsa pancreático 32 4,14 13.700

Actividad

antimicrobiana 43 3,67 4.640

Vitamina 55 =13 1.355

1 8 9

1 4 8 , p o r c r o m a t o g r a f í a d e f il t r ac ió n e n

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RESULTADOS

IV. 8. 5 . 1 . - E l e c t r o f o r e s i s s e 2 ú n la t é c n i c a d e S w a n k y M u n k r e s ( 1 9 7 1

E st a t é c n i c a p e r m i t e s e p a r a r ca d e n as p e p t í d i c a s d e p e q u e ñ o t a m a ñ o mo l e c u l ar g r a c i a s a

l a in corp orac ió n d e ur e a a l o s g e l e s d e p o l i a c r i l a m i d a . Co n t a l f i n s e p a r a d o r , 5 0 , 10 0 y 200 g g

d e l a a c t i vi d a d i n h i b i d o r a pa rc ia l me n t e p u r i f i c a d a d e L , saL -e 1 4 8 s e som e t ie ron a u n an á li si s

e l e c t r o f o r é t i c o e n g e l e s d e S D S - p o l i a c r i l a m i d a - u r e a , se gú n l a t é c n i c a d es cr it a e n l a s e c c i ó n I I I .

2 . 9 . 6 . 1 .

No o b s t a n t e , u n a v e z t e ñ i d o s l o s g e l e s n o s e a p r e c i ó n in g u n a b a n d a p r o t e i c a e n l o s

l u ga re s e n l o s q u e s e h ab ía n d e p os it ad o l a s sol uc ion e s q u e co n t e n ía n l a sust ancr a

an t im ic ro b ia n a parc ial ment e p u r i f i c a d a . C on si d e ra n d o q u e l a f a l t a d e bandas proteicas nítidas

en los geles podía ser consecuencia de una falta de poder separador del gel con urea o de un

fallo del método de tinción de los geles, se recurrió a la electroforesis en geles de

poliacrilamida con SDS según la técnica de La e ml i ( 1 9 7 0 ) .

I V . 8 . 5 . 2 . - E l e c t r o f o r e s i s e n g el es d e 20 % p o l i a c r i l a m i d a c o n SDS ( L a e m l i . 1 9 7 0

A u n q u e e s t a t é c n i c a e l e c t r o f o r é t i c a t ie n e u n m e n o r p o d e r d e r e s o l u c i ó n e n l o s péptidos

d e b a j o p e s o m o l e c u l ar q u e l a d e S w a n k y Mu n kr e s, a l u t i l i z a r e l método de tinción de Merril y

c o l . ( 1 9 8 ] ) , a b a s e d e n i t r a t o d e p l a t a , f a c i l i t a l a t i n c i ó n d e l a s pr o t ei n as . E s t a t i n c i ó n a p l i c a d a a

l a s pro t e í n a s d e l o s g e l e s d e p o l i a c r i l a m i d a c o n S D S , e s 1 0 - 5 0 v e c e s m á s s e n s i b l e q u e l a d e l

a z u l b r i l l a n t e d e C o o í n a s s i e .

S ig u ie n d o l a t é c n i c a d e s c r i t a e n l a s e c c i ó n I I I . 2 . 9 . 6 . 2 . s e a p l i c a r o n e n e l e c t r o f o r e s i s

5 , 1 0 y 1 5 ~igd e l a s u s t a n c i a a n t i m i c r o b i a n a p ar ci al me n t e p u r i f i c a d a d e LsaL-c 1 4 8 . En l a

figura 4 . 4 0 s e i n d i c a n l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s . Como p u e d e observarse, no se detectan

bandas proteicas definidas en los lugares de lo s geles en lo s que se depositó la sustancia

1 9 0

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RESULTADOS

a n t i í n i c r o b i a n a p a r c i a l m e n t e pu r if ic ad a. S ó l o e n el frente electroforético se puede distinguir una

b a n d a d e t i n c i ó n d i f u s a . L a d e n s i d ad d e e s t a banda aumenta a medida que crece la

co n ce n t ra ci ó n d e sust anci a a n t i í n i c r o b i a n a p ar c ia l me n t e purificada depositada en el

c o r r e s p o n d i e n t e p o c i l l o .

IV. 8. 6.- D e te r m in a c i ón d e l a c o m p o s i c i ó n a m i no a c í di c a d e l a su st an ci a

antimicrobiana narcialmente nurificada

L a u t i l i z a c i ó n d e l a t é c n i c a d e d e t e c c i ó n d e am in oá ci d os p o r cro mat ograf ía líquida de

alta resolución (HPLC). descrita en la sección III. 2. 9. 7 . a s í como e l e s t u d i o c o m p a r a t i v o d e

l o s c r o m a t o g i - a m a s d e l hidrolizado ácido de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada

y d e lo s aminoácidos patrón, dió lugar a lo s resultados que se reflejan en la tabla 1W 10 . De

ella se deduce que:

1 . ) L a s us t a n c i a an t imic rob ian a p ose e 1 4 am in oá ci d os d i s t i n t o s , d e l o s q u e 1 3 s e

corresponden a los siguientes: ácido aspártico. ácido glutámico, glicina, histidina, treonina,

a l a n i n a , pr o lin a, valina, tirosina, metionina, leucina, fenilalanina y lisina; el decimotercero, que

elufa entre el ácido glutámico y la glutamina, no pudo identificarse al no corresponder a

n in g u n o d e l o s am in oá cid os e m p l e a d o s c o r n o p a t r ó n .

191

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RESULTADOS

16,9 Kd—14,4 Kd—

8,1 Kd—

6,2 Kd-»

2,5

F r e n t ee l e ct ro f o r é t i c o

F igu ra 4 . 4 0 . -

-h

1 234

Electroforesis por SDS-PAGE de la actividad antimicrobiana

parcialmente purificada de L. s a L -- e 148. Lineas: 1, marcadores de

peso molecular standard (de arriba a abajo, 16.949, 14.404, 8.159,

6.214 y 2.512 daltons); 2, 3 y 4 corresponden, respectivamente a

1 5 , ¡ 0 y 5 gg de la sustancia antimicrobiana parcialmente

purificada.

192

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RESULTADOS

T ab l a I V . 1 0 . - C o m p o s i c i ó n a m i n o a c í d i c a d e l a sustancia antimicrobiana parcialmente

p u r i f i c a d a d e L. saL -e 1 4 8

Aminoácido Contenido

(nmol)

Residuos por molécula

(probable)

Acido aspártico 7,7 4

Ac id o g l u t ¿ i m i c o 1 0 , 9 6

No Identificado’~ 7,1 3(4)

G l i c i n a 8 , 6 4 ( 5 )

Histidina 1,9 ¡

Tr e on in a 4 , 3 2

Alanina 8,4 4

P r o l i n a 1 1 , 6 6

T i r o s i n a 2 1, 9 1

V a i n a 5 , 9 3

Metionina 2,1 1

Leucina 4,5 2Fenilalanina 1,5 1

Lisina 4,8 2 (3)

Pe so mo l e c u l ar asignado igual a l a me d ia d e l d e l o s am in oá ci d os e m p l e a d o s como p a t r ó n .

‘ 93

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RESULTADOS

2.) La sustancia antimicrobiana es muy rica en aminoácidos de carácter hidrofóbico;

(alanina, leucina, valina, fenil alanina, metionina y prolina) que constituyen el 50% de la

molécula. Los más frecuentes son prolina (6 residuos/molécuLa), ácido glutámico (6) y glicina

(4-5), y los menos histidina (1), treonina (2), metionina (1). leucina (2) y fenil-alanina (1). El

aminoácido que no pudo identificarse eluye en una posición muy próxima de la glicina, y en

cada molécula hay unos 3-4 residuos (asumiendo un peso molecular medio de 130) .

3.) La sustancia antimicrobiana de L.sake 148 posee unos 40 a 43 aminoácidos por

molécula, lo que da idea de su pequeño tamaño molecular (5047); ello se corresponde bastante

bien con el peso molecular obtenido por cromatografía de filtración en Sephadex 0-50 (4640).

pero no con su comportamiento en la electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil

sulfato sódico (2500).

IV. 9 .- Mecanismo de acción de la sustancia antimicrobiana exocelular de Lactobaclihís

sa/ce 148

Cuando a los medios MRS, APT y BHI incubados con unas 5 x í0~ ufc/ml de diversos

microorganismos indicadores (sección III. 2. 10) se les adicionan 0,5 ml de sobrenadantes de

L. saLe 148 libres de células, debidamente concentrados, se detiene el Crecimiento de las

bacterias sensibles (tabla IV . 11), pero no disminuye el número de ufc/ml. Sin embargo, laadición de 0,5 ml de un cultivo de L saL -e 23, carente de actividad inhibidora, no afecta al

desarrollo de estos microorganismos indicadores. Los resultados obtenidos indican que la

actividad antimicrobiana deL. saL -e 148 posee un mecanismo de acción bacteriostático.

194

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RESULTADOS

IV. 10. - Concentración inhibidora mínima <ClM~ de la sustancia antimicrobiana de L

su/cc 148

La concentración inhibidora mínima (CIM) de la sustancia antimicrobiana parcialmente

purificada deL. saL -e 148 frente a diversos microorganismos indicadores, se determinó de la

manera descrita en la sección 1 1 1 . 2. 11. Los resultados se muestran en la tabla IV. 12. Como

se ve, la CIM varía entre 1 y 1 8 mglml, dependiendo de los microorganismos indicadores

utilizados.

195

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RESULTADOS

Tabla IV. 11.- Efecto de lo s sobrenadantes concentrados de Lactobacdlus sake 148 y 23,antagonista (1) y no antagonista (C) respectivamente, en el desarrollo a 32 oc

de algunos microorganismos indicadores.

Microorganismoa log ufc/m]

Oh 4h 8h 16h

Loctobacillusfernzentuni

Lactobacillus cwvatus

Carnobacterium diveigens

Leuconostoc mesenteroides

Listei-ic¡ nio¡zocytogenes


285

726

LV 1 3

395

5105

7973

TC

Tc

TC

T

C TC

TC

5,35,5

5,65.6

5,75,6

5,7

5.75,85,7

5,35,3

5,3 5,46,8 8.7

5,6 5,76,9 8,5

5,7 5,36.9 8,7

5,8 5,9

6,9 8,95,8 5,76,9 8,9

5,2 5,76,8 8,7

Listeria rnonocytogenes LIS sv 1/2 1C

5,85,8

5,7 5,96,9 8.9

Listeria n¡onocytogenes

Salinon ella tvph¡niu’v¡nn

Yersinia enterocolitica

5/cpbviococcus am-cus

Scott A

T9 1

E20

T

CTC

1

13 7

5,8

5,8

5,55,4

5,75.8

5,35.2

C

1C

5,7 5,9

6,9 8,86,9 8,86.8 8,7

6,1 6,96,3 7,1

5,1 5,66.9 8,9

5,59,8

6,19,8

5,49,5

6,4

9,55,79,3

5,79,1

6,29,5

6,1

9,5

9,59,4

8.28.9

6,39,2

196

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RESULTADOS

Tabla IV. 11. (continuación)

Microorganismoa log ufc/ml

Oh 4h 8h 16h

Staphylococcus aureus 371 CC

5,25,3

5,36,7

5.38,7

6,59,8

Clostridiun; botulinun; 551 C

C

4,9

4,9

4.8

5,0

4.9

5,7

4,9

6.3Clostridiun¡ pe4’ringens 376 C

C5,1

5,1

5,25,3

5,37.7

6,49,3

a Para conocer la procedencia de los microorganismos ver tabla III. 1

197

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RESULTADOS

Tabla IV. 1%- Concentración Inhibidora Mínima (CIM) de la susíancia antimicrobiana

exocelular de L.sake 148, en diversos microorganismos indicadores.

Concentración

Microorganismo Inhibidora Mínima

indicador (¡ng/mi)

Loctobacillusferinentun; CECT28S

Carnobacter¡uin dit’e.’-gens LV 1 3 2

Listeria nzonocytogenes NCTC5 105 9

Listeria nhonocytogenes LIS sv 1/2 9

Listeria rnonocytogenes Scott A 9Staphvlococcus aureus FR1137 9

Staphvlococcus am-cus FR1349 1 8

Staphylococcus aureus FR136 1 1 8

C/osuldiurn botulinu.rn 551 4

Clostridiun; peífringens 376 4

198

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RESULTADOS

IV. 11.- Caracterización inmunológica parcial de la susrancia antimicrobiana deL, sa/ce

148

IV. 11. 1.- Análisis por inmunodifusión en Leles de aaarosa. de los inmunosueros

de conejos cuando se emolea como antízeno la sustancia antimicrobiana

exocelulardeL. sa/ce 148

La sustancia antimicrobiana exocelular parcialmente purificada de L. sa/ce 148, se

obtuvo como se describe en la sección III. 2. 1 2 de este trabajo. Antes de inocularía a los

conejos se comprobó por inmunodifusión en geles de agarosa que lo s sueros de lo s conejos no

originaban líneas de precipitación visibles al enfrentarse con la sustancia.

Durante la inmunización de lo s animales se realizaron 4 sangrías parciales para

comprobar la produción de anticuerpos frente al extracto antigénico, así como para determinar

la presencia o ausencia de reacciones cruzadas con otros componentes procedentes del medio

MM-triptosa (concentrado 20 veces por liofilización); lo mismo se comprobó con el

sobrenadante libre de células de un cultivo de L sa L -e 148 en medio MM-triptosa y con el

mismo sobrenadante concentrado 20 veces por liofilización. No obstante, en ningún caso se

detectaron 1 incas de precipitación.

199

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RESULTADOS

IV. 11 . 2.- Detección de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL, sa/ce

148 por técnicas inmuno-enzimáticas (ELISA

IV. 11 . 2. 1.- Detección por la técnica del ELISA indirecto clásico

Antes de la inoculación de los conejos con el extracto antigénico de interés, se

comprobó que ninguno de ellos presentaba reactividad inmunológica al someter una muestrade

su suero al ELISA indirecto que se describe a continuación.

IV. 11. 2 . 1 . 1.- Evaluación de la concentración idónea de los reactivos que

intervienen en el ensayo

Para garantizar que la sustancia antimicrobiana exocelular deL. sake 148 saturaba el

fondo de los pocillos de las placas de ELISA, se diluyeron 100 ~xgdel extracto antigénicocitado en 1 ml de tampón PBS. Con idénticos fines, y como extracto antigénico control, se

empleó el medio MM-triptosa liofilizado a la concentración dc 1 mg de proteina por ml de

tampón PBS.

Como conjugado se utilizó uno comercial, anti-IgG de conejo, obtenido de cabras y

marcado con peroxidasa de rábano (Nordic). Para establecer la dilución de trabajo de esteconjugado, se siguieron las indicaciones de l fabricante y el criterio aplicado pal-a la elección del

antígeno, es decir, garantizar la presencia de conjugado en exceso. La dilución elegida fué la

1/1000.

200

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RESULTADOS

IV. 11 . 2. 1. 2.- Determinación de la respuesta inrnunoló~ica de lo s conejos frente al

extracto antigénico inoculado

Durante la inmunización de los conejos se realizaron varias sangrías parciales para

comprobar que producían anticuerpos frente al extracto antigénico inoculado, y que no se

originaban reacciones cruzadas frente al extracto antigénico control. En la figura 4. 41 se

muestran lo s resultados procedentes de estadeterminación. Dela figura se desprende que:

1.) En las sangrías parciales efectuadas a lo s 2 1 y 42 días de la primera inoculación

antigénica no aumenta significativamente la respuesta inmunológica de lo s conejos frente a lo s

antígenos de interés.

2.) En las sangrías realizadas a lo s 63 y 84 días de la primera inoculación la respuesta

inmunológica de los conejos aumentó significativamente, haciéndolo también pero ligeramenteen la sangría final que tuvo lugar a lo s 9 1 días de la inoculación iniciaL

201

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RESULTADOS

3,0

2,5

2,0

1,5 -

1,0

0,5 -

0,01,0 1,5 2,5 3,0 3,5 4,0

Log. dilución del anticuerpo

Figura 4. 41.- Detección inmunológica por un ELISA indirecto, de la sustancla

antirnicrobiana parcialmente purificada de L.saLe 148 a lo s O (A),

21 (A). 42 (0), 56 (•), 84 (o) y 9 1 (U) días de inoculación en

conejo Concentración del andgeno 10 < ) gtg/ml. Dilución del

conjugado 1/1000.

E

U)

o

u

1-

oTJ~

.0

1—- —1

2,0

202

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RESULTADOS

LV . 11 . 2. 2.- Detección de la sustancia antimicrobiana deL. sa/ce 148 en el medio de

cultivo MM-triptosa

La misma técnica del ELISA indirecto empleada para determinar la respuesta

inmunológica de los conejos inmunizados con la sustancia antimicrobiana deL, sa/ce 148, se

utilizó para evaluar la presencia de dicha sustancia en el medio de cultivo MM-triptosa.

IV. 11.2. 2. 1.- Determinación de la concentración idónea de los reactivos queintervienen en el ensayo

Las indicaciones del fabricante, junto con lo s resultados de experiencias preliminares,

permitieron establecer como dilución de trabajo del conjugado la de 1/1000.

Una vez ajustada la concentración de trabajo del conjugado, se procedió a establecer lamás idónea para el inmunosuero (cuya concentración inicial de proteína era de 20 mg/mI). Para

ello, en un ensayo previo, se determinó la dilución del inmunosuero más apta para diferenciar

la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada disuelta en tampón PBS, de la disuelta en

medio MM-triptosa (figura 4 42). De L o s resultados obtenidos se desprende que los

componentes del medio de cultivo interfieren en la detección de la sustancia antimicrobiana de

L. sa/ce 148, s i bien el inmunosuero disuelto 1 6 veces en tampón PBSTes el que ¡nejordetectadicha sustancia en el medio de cultivo de MM-triptosa.

203

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RESULTADOS

• • 1 • 1 • ¡ • ¡

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Log. dilución de l anticuerpo

Figura 4. 42 .- ELISA indirecto dc

148 en tampón P135

parámetros como en

la sustancia antimicmbiana exocelular de LsaLc

( m ~ y en medio de MM-¡rip¡osa (ny El resto de lo s

la figura 4. 41.

3,0 -

2 ,5

E

U)oxl.

u

.0 1-o

.0

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

1,0 1,5

204

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RESULTADOS

Posteriormente, se realizó un ensayo para detectar la sustancia antimicrobiana

exocelular de L. sa/ce 148 cultivado en medio de MM-triptosa. Los resultados del ELISAindirecto de la sustancia antimicrobiana de L. saLe 148 en tampón PBS, en medio de

MM-triptosa y en el sobrenadante libre dc células de un cultivo de este microorganismo

realizado en medio de MM-triptosa se muestran en la figura 4.43. De lo s resultados obtenidos

se deduce que:

1.- Cuando la bacteriocina parcialmente purificada de L. saLe 148 se disuelve entampón PBS se puede detectar la presencia de hasta 6 ~tgde proteina por cada pocillo de la

placa de ELISA.

2.- Sin embargo cuando se emplea el ELISA indirecto para detectar la sustancia

antimicrobiana de L. sa/ce 14 8 crecido en medio de cultivo MM-triptosa, los inmunosueros

empleados no detectan dicha sustancia.

Dada la imposibilidad de detectar la sustancia antimicrobiana en medio de MM-tríptosa

y con la finalidad de aumentar la sensibilidad del ELISA indirecto, se optó por mejorar la

sensibilidad del ensayo mediante la utilización de anticuemos conjugados a la biotina.

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RESULTADOS

¿ tu

2,5

E~ 2,0

U)

o

t 1, 5

.0 1~oCC

.0 <1,0

0,5

0,0

0,0Log. dilución del antígeno

Figura 4. 43.- ELISA indirecto de la sustancia antimicrobiana exocelular de L. saL -e

148 en tampón PES (u), en medio de MM-triptosa (c) y en el

sobrenadante de un cultivo de t s a L - e 148 en MM-triptosa (•).

Dilución del anticuerpo 1/160. Dilución del conjugado l/10(XY

0,5 1,0 1,5 2,0 2.5 3,0 3,5

206

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RESULTADOS

IV. 1 1 . 3.- Detección de la sustancia antimicrobíana de L. sa/ce 148 mediante un

ELISA indirecto con el sistema de amDlificación biotina-avidina

El empleo de esta técnica con los mismos extractos antigénicos y en las mismas

condiciones no mejoró los resultados ya que, paralelamente a la mejora observada en la

detección de la sustancía antimicrobiana parcialmente purificada, se aprecia también una mayor

interacción de los anticuerpos biotinizados con lo s extractos antigénicos empleados como

control (figura 4. 44). Se concluyó por lo tanto, que en el medio de MM-triptosa. a pesar detener una composición muy sencilla, existen compuestos que, de una forma u otra, interfieren

con la detección inmunológica de la actividad antimicrobiana.

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RESULTADOS

3,0

2,5

2,0E

U)

o

c ~ 1, 5

u

.0 ~ 1, 0C C

.0

0,5

0,00,0

Figura 4. 44.- ELISA indirecto de la sustancia antimicrobiana exocelular de L. soke

148 en tampón PBS (u), en medio de MM-triptosa (o) y en el

sobrenadante libre de células de un cultivo deL sa L -e 148 desarrollado

en el medio de MM-triptosa (4). Dilución del anticuerpo biotinizado1/160. DiLución del conjugado 1/3000.

0,5 1,0 1,5 2.0 2,5 3.0 3,5

Log. dilución de l antígeno

208

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DISCUSION

CAPITULO V

DISCUSION

209

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DISCUSION

y. i. - Aislamiento de bacterias lácticas de embutidos crudos curados

Para la realización de este trabajo, que pretende el aislamiento y caracterización parcial

de bacterias lácticas utilizables para mejorar la calidad higiénica de la carne y sus productos,

primerose procedió al aislamiento de estas bacterias de embutidos cnidos curados. La elección

de estos productos como fuente de bacterias lácticas se debe a que las que contienen están

mejor adaptadas a la ecología bacteriana de la carne y lo s productos cárnicos que las aisladas de

otras fuentes, como leche, productos lácteos y hortalizas (Schillinger y LOcke, 1989).

Además las bacterias lácticas son, invariablemente, el grupo microbiano predominante

en la mayoría de los productos cárnicos yen las carnes envasados a vacio, constituyendo entre

el 75 y el 95 % de su población bacteriana total (Mol y col., 1971: Kitchell y Shaw, 1975;

Reuter, 1975; l-litchener y col., 1982; Shaw y Harding, 1984; Korkeala y Mátehl, 1989).

De otra parte, los recuentos de bacterias lácticas respecto del microbiano total

obtenidos por otros investigadores (LOcke, 1986; Holley y col., 1988> durante la maduración

de los embutidos crudos madurados, coinciden con lo s nuestros (Tabla 1W 1 ); en ambos casos

se ha visto que la mayor parte de la microflora cárnica está constituida por bacterias lácticas.

El número de bacterias lácticas al final de la maduración de las muestras estudiadas

(aproximadamente 8-9 x 108 ufc/g de embutido) concuerda con lo s resultados señalados por

otros investigadores para el bacon (Cavett, 1963), los embutidos crudos madurados (Egan,

1983) y las carnes envasadas al vacio (Hitchener y col.. 1982; Egan. 1983). En muchos

productos cárnicos, estas bacterias constituyen el principal componente de su microflora

debido a la supresión del desarrollo de otros grupos microbianos por mecanismos de

antagonismo microbiano no bien evaluados (Reuter, 1981).

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EJISCUSION

V. 2. - Actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas seleccionadas

y. 2. 1 . - Elección de las pruebas de anta2onismo microbiano

V. 2. 1 . 1 . - Pruebas directas de antaLonismo microbiano

El antagonismo microbiano puede evidenciarse de diversas maneras. En los estudios

preliminares, las pruebas de antagonismo se realizaron utilizando generalmente medios decultivo sólidos e implicaron la detección de la inhibición del crecimiento que ejercía el

microorganismo analizado (activo) en el microorganismo indicador (pasivo) (Tagg y col.,

1976).

Las dos pruebas enpleadas con este propósito son la directa o simultánea y la indirecta

o diferida. La concentración del microorganismo indicador es importante en la sensibilidad del

método (Kuttner, 1966).

En la prueba directa, el microorganismo a evaluar y la cepa indicadora se desarrollan al

mismo tiempo. Una de las pruebas directas más sencillas es la “prueba de la gota”, utilizada

originalmente por Gratia (1946), y cuyo empleo está ampliamente difundido (Geis y col.,

1983; Daeschel y Klaenhammer, 1985; Gonzalez y Kunka, 1987; Raccach y col.. 1989;

Spelhaug y Harlander, 1989; Daeschel y col., 1990; Ahn y Stiles, 1990a). En ella, una gota

del cutivo del microorganismo a evaluar se deposita en un medio de cultivo sólido,

previamente inoculado con el microorganismo indicador. Entre las variantes de este

procedimiento se incluye el empleo de pocillos excavados en el medio sólido que se rellenan

con una cantidad conocida del cultivo del microorganismo a evaluar (Sabine. 1963; Tagg y

McGiven. 1971; Tagg y col., 1976; Silva y col.. 1987; Harris y col.. 1989; Rodriguez y col..

1989).

211

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DISCUSION

Otra modificación de gran utilidad es la siembra por picadura de los microorganismos a

estudiar en placas cuya superficie se ha sembrado con el microorganismo indicador (DeKlerk,1967; Gagliano y Hinsdill, 1970; Davey y Richardson, 1981; Barefoot y Klaenhammer,

1983).

Fredericq (1948) fué el primero en utilizar las pruebas diferidas de antagonismo. En

este caso, el microorganismo a evaluar se siembra e incuba en un medio sólido durante un

cierto tiempo, transcurrido el cual se cubre con otra capa de medio que contiene elmicroorganismo indicador. Las pruebas diferidas son a menudo más sensibles que las directas

(Taggycol., 1976).

Como en la prueba directa, una de las variantes de las pruebas diferidas más empleada

es la de la “gota (Andersson y col, 1988; Harris y col., 1989; Schillinger y LOcke, 1989;

Spelhaug y Harlander, 1989; Ahn y Stiles, 1990a). Con esta prueba y para resaltar más laacción .d e las sustancias inhibidoras difusibles de los cutivos, se inactivan las células del

microorganismo productor con calor (Geis y col, 1983; Ahn y Stiles, 1990a) o, mejor aún,

con vapores de cloroformo (Kekéssy y Piguet. 1970; Davey y Richardson, 1981; Geis y col.,

1983; Ahn y Stiles, 1990a). No obstante, esto conlíeva algunos inconvenientes como el que

algunos agentes inhibidores se inactivan al exponerse a los vapores de cloroformo. Brock y

Davie (1963) demostraron la sensibilidad al cloroformo de una sustancia inhibidora producidapor Enrerococcusfaecalis subsp. zvrnogenes. Los vapores de cloroformo también impiden el

empleo de placas de Petri de plástico; además el cloroformo residual de los medios de cultivo

puede originar resultados erróneos (Kekéssy y Piguet, 1970).

Otra alternativa, cuando se sospecha la existencia de sustancias antagonistas difusibles,

consiste en sembrar el cultivo indicador en una cara del medio de cultivo sólido y el cultivo a

evaluar en la opuesta, ya sea empleando el sistema de gotas (Kekéssy y Piguet. 1970) o el de

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DISCUSION

pocillos (Tagg y McGiven, 1971; Barefoot y Klaenhammer, 1983; Spelhaug y Harlander,

1983). Una ventaja de este método es que así se excluye la actividad inhibidora debida abacteriófagos (Tagg y col., 1976).

Tanto en las pruebas de antagonismo directo, como diferido, es recomendable colocar

lo s cultivos de los microorganismos a analizar en pocillos abiertos en los medios sólidos, lo

que permite que si se deposita siempre el mismo número de microorganismos, pueden

establecerse comparaciones entre los diámetros de las zonas de inhibición obtenidas. Otraventaja de este método esel aumento de la sensibilidad, puesto que entre el microorganismo

estudiado y las cepas indicadoras únicamente se interpone una capa fina de agar; esto, además,

excluye la inhibición debida a bacteriófagos, que son microorganismos no difusibles (Tagg y

McGiven, 1971). Por todo ello, se eligió este método para la realización de las pruebas de

antagonismo, tanto directo como diferido, de las 180 bacterias lácticas aisladas y seleccionadas

de los embutidos crudos curados (sección IV. 1 ) .

V. 2. 1 . 2. - Antagonismo de los sobrenadantes libres de células

Cuando en las pruebas de antagonismo microbiano se emplean cultivos no es fácil

identificar la causa del mismo (Tagg y col., 1976). En la identificación de bacterias lácticas

productoras de sustancias antagonistas difusibles es importante excluir de los ensayos no sóloa los microorganismos productores de tales sustancias, sino también a otros metabolitos con

actividad inhibidora.

Las sustancias que en las pruebas de antagonismo bacteriano poseen una actividad

inhibidora similar a las bacteriocinas. pueden neutralizarse o eliminarse utilizando

sobrenadantes libres de células neutralizados o dializados. Los sobrenadantes se obtienen por

centrifugación de los cultivos y por filtración por filtros de 0.22 o 0.45 um de diámetro de

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DISCUSlON

poro.

La neutralización de la actividad antagonista de los ácidos orgánicos puede realizarse

ajustando el pH de lo s sobrenadantes a un valor próximo a la neutralidad (pH 6,9-7,0) (Geis y

col., 1983: Barefoot y Klaenhammer, 1984; Rodriguez y col., 1989; Nielsen y col., 1990;

M0rtvedt y Nes, 1990), o dializando los sobrenadántes por membranas que permiten la

difusión de sustancias de un tamaño molecular menor de 6000 daltons. La diálisis puede ir

precedida de una precipitación de lo s sobrenadantes con sulfato amónico (Bhunia y col, 1987;González y Kunka. 1987; Ray y col., 1989). El precipitado, constituido fundamentalmente por

proteínas, se reconstituye y dializa. N o obstante, la mayoría de lo s autores prescinden de esta

precipitación (Andersson, 1986; Andersson y col., 1988; Harris y col., 1989; Schillinger y

LOcke, 1989; Daeschel y col., 1990; Ahn y Stiles, 1990b).

El efecto del peróxido de hidrógeno de lo s sobrenadantes puede evitarse incubando lo scutivos en anaerobiosis (Schillinger y LOcke, 1989), o tratando con catalasa los sobrenadantes

libres de células (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Muriana y Klaenbammer, 1987; Ferreira y

Gilliland, 1988; Schillinger y LOcke, 1989; Rodriguez y col., 1989; ~arminati y col., 1989;

Ahn y Stiles, 1990a). Geis y col. (1983), añaden la catalasa directamente al medio de cultivo

del microorganismo indicador.

Los sobrenadantes libres de células también pueden concentrarse con el fin de

aumentar su actividad inhibidora. Entre lo s sistemas de concentracién más empleados destacan

la evaporación a vacío en rotavapores (Geis y col., 1983; Silva y col., 1987) y la liofilización

(Rodriguez y col., 1989).

La actividad inhibidora de lo s sobrenadantes puede detectarse con cualquiera de lasvariantes de antagonismo directo e indirecto citadas, estando muy difundidos lo s métodos “de

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DISCUSION

la gota” (Geis y col., 1983; Ray y col.. 1989; Carminati y col., 1989: Ahn y Stiles, 1990a) y

la disposición de lo s sobrenadantes en pocillos abiertos en las placas (Joerger y Kiaenhammer,

1986; Ahn y Stiles, 1990a). Otro método muy empleado cuando se investigan bacteijas lácticas

bacteriocinogénicas, consiste en colocar lo s sobrenadantes en papeles de filtro estériles. Los

discos de papel de filtro, impregnados con el sobrenadante, se depositan en placas de agar

sembradas con el microorganismo indicador (Shahani y col, 1976; Ferreira y Gilliland. 1988)

o bien se deposita en lo s filtros una cantidad determinada de sobrenadante (Abdel-Bar y col.,

1987;Bhunia

ycol.,

1987;Bhunia

ycol.,

1988;Rodriguez y col., 1989). La segunda

opción

ha sido la utilizada en este trabajo, lo que permite comparar la actividad inhibidora de los

diversos sobrenadantes analizados.

V. 2. 2 . - Actividad inhibidora de lo s cultivos de las bacterias lácticas seleccionadas

Tanto las 180 bacterias lácticas examinadas en primera instancia, como las 24seleccionadas con posterioridad de entre las primeras, manifestaron actividad inhibidora frente

a alguno de los microorganismos indicadores empleados (figuras 4 6 a 4. 29). La actividad

inhibidora generalmente es mayorcuando lo s microorganismos a evaluar se siembran 24 horas

antes que lo s microorganismos indicadores, algo en lo que nuestros resultados coinciden con

los de Ahn y Stiles (1990a).

La sensibilidad de lo s microorganismos indicadores a la actividad inhibidora de las

bacterias lácticas analizadas es variable, lo que demuestra que dicha actividad es característica

de cadacepa y no de la especie bacteriana (Schillinger y LOcke, 1989: Daeschely col., 1990).

Los resultados obtenidos por otros investigadores que han evaluado la actividad

antimicrobiana de las bacterias lácticas varían bastante. Al igual que nosotros, Kozak y col.(1978) observaron que las 47 cepas deL. lacis subsp. lacús que estudiaron, eran activas

215

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DISCUSION

frente a otras dos cepas de L. lacás subsp. ladis y frente a una de L. lacris subsp. Cremoris.

El mismo resultado obtuvieron Ahn y Stiles (1990a) al examinar la actividad inhibidora de 1 0

cepas de diversos géneros de bacterias lácticas frente a 1 0 indicadores que también eran

bacterias lácticas.

El 63 % de las 52 cepas de L acidophilus analizadas por Barefoot y Klaenhammer

(1983), inhibieron el desarrollo de diversas cepas de L. ¡eichn,anni, L. bulgaricus, L.

heIvetíCLis y L. lacds, porcentaje idéntico al obtenido por Raccach y coL (1989) con 1 1 cepas

de Lactobacillus y de Sireptococcus sp., empleando como indicadores diversas cepas de 6

especies distintas de bacterias lácticas y 4 cepas de L. monocytogenes. De otra parte,

únicamente el 15 % de las 79 cepas de Lacwbacillus sp. examinadas por Rammelsberg y

Radíer (1990) inhibieron una, al menos, de las 9 cepas indicadoras deL. brevis, P. daninosus

y Leuc. oenus ensayadas. El porcentaje de cepas inhibidoras registrado por Davey y

Richardson (1981) fue aún menor, ya que sólo el 7 % de las 150 cepas deL. ladis susbsp.

crenzork analizadas, inhibieron el desarrollo de variascepas de L. lactis subsp. crernoris y L.

lactis subsp. lactis.

Schillinger y LOcke (1989), al evaluar 142 cepas deL, saL-e, 4 deL. plantarwn y 75

de L. curvatus, observaron que el 13, el 75 y el 1 %, respectivamente, eran activas frente, al

menos, uno de los 31 microorganismos indicadores empleados; estos resultados contrastancon los de Ahn y Stiles (1990a) y con lo s nuestros, ya que en nuestro caso prácticamente todas

las cepas aisladas manifiestan actividad inhibidora sobre varios indicadores, contraste que

llama poderosamente la atención si se tiene en cuenta que en los tres trabajos las bacterias

lácticas proceden de una fuente común, lo s embutidos crudos madurados.

Lo expuesto anteriormente ofrece una idea de la dificultad que presenta el establecer laactividad inhibidora de las bacterias lácticas, lo que se agrava por la escasa uniformidad en las

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DISCUSION

condiciones de trabajo y por la diversidad de microorganismos indicadores empleados. No

obstante, las bacterias lácticas analizadas en los trabajos citados son especialmente activas

frente a otras bacterias lácticas y nunca, o de forma excepcional. frente a las bacterias

Gram-negativas.

V. 2. 3. -Actividad inhibidora de los sobrenadantes libres de células

La actividad inhibidora de los sobrenadantes libres de células se estableció sólamente

en los aislados más activos. Los sobrenadantes libres de células de lo s cultivos de nuestras 24

bacterias lácticas seleccionadas, una vez concentrados, mostraron una actividad antimicrobiana

variable dependiendo de la cepay del indicador empleado (tabla IV. 1 ) ; fueron especialmente

sensibles las bacterias lácticas empleadas como indicadores.

Quizá sea conveniente recordar que las bacterias lácticas activas seleccionadas, se

aislaron durante la maduración de un lote de embutidos; en cada muestreo se seleccionaron 30

colonias. Esto significa, por ejemplo, que las cepas 24 y 29 procedían de la masa cárnica

original, la 31 y 46 del embutido en segundo día de maduración y, así sucesivamente, hasta la

cepa 180 que se alsió el último día (35) de maduración. De la observación de la tabla IV. 1, se

concluye que es posible aislar bacterias lácticas productoras de sustancias antimicrobianas,

distintas de los ácidos orgánicos o del agua oxigenada, en cualquier momento de la maduración

e, incluso, a partir de la masa cárnica inicial. Algunas de las cepas evaluadas mostraron

actividad frente a varias cepas de L. nionocytogenes y S. aureus, microorganismos

productores de toxiinfecciones alimentadas.

La actividad inhibidora de las bacterias lácticas frente a otras de su mismo grupo y a

menudo estrechamente relacionadas entre si, es un hecho ampliamente documentado (Geis y

col., 1983; Barefoot y Klaenhammer, 1984; Joerger y Klaenhaínmer, 1986; Andersson, 1986;

217

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DISCUS ION

Gonzalez y Kunka, 1987; Bhunia y col., 1987; Schillinger y LOcke, 1989; Harris y col.,

1989; M0rtvedt y Nes, 1990; Ahn y Stiles, 1990a; Ahn y Stiles, 1990b). Sin embargo, son

mucho más escasos lo s estudios que demuestran que las bacterias lácticas inhiben el desarrollo

de cienos microorganismos patógenos Gram-positivos, como 5. aureus (Andersson, 1986;

Andersson y col., 1988; Bhunia y col., 1988) y L. inonocytogenes (Ehunia y col., 1988;

Carminati y col., 1989; Schillinger y LOcke, 1989; Harris y col., 1989; Spelhaug y Harlander,

1989; Ahn y Stiles, 1990b). La mayor parte de lo s autores citados coinciden en señalar que las

bacterias Gram-negativas son insensibles a las sustancias antibacterianas producidas por las

bacterias lácticas estudiadas. Quizá la excepción mejor conocida a este respecto la constituyan

las cepas de L. laCté productoras de nisina (Hurst, 1981). En general, la actividad

antimicrobiana es muy heterogénea y depende de cada cepa en particular (Harris y col., 1989).

V. 2. 4. - Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lácticas

seleccionadas

Los resultados obtenidos indican que la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes

concentrados no puede ser, en ningún caso, atribuible al peróxido de hidrógeno. La capacidad

de algunas bacterias lácticas de producir peróxido de hidrógeno es una propiedad indeseable,

especialmente si en las emulsiones cárnicas existe un alto contenido de oxígeno, si se emplea

mucha grasa en la formulación del embutido o si la actividad de los enzimas que degradan el

peróxido de hidrógeno es pequeña (Schillinger y LOcke, 1987a). En estos casos, la presencia

en la carne y productos cárnicos de microorganismos productores de peróxido de hidrógeno

produce alteraciones del color o un enranciamiento precoz.

Las bacterias lácticas difieren en su capacidad de producir y degradar el peróxido de

hidrógeno. L-lastings y Hólzaptel (1987) observaron que el 50 % de las cepas de L. sa L -e de

origen cárnico producían peróxido de hidrógeno y, de ellas, la mayoría lo hacía muy

218

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DISCUSION

débilmente. La falta de una buena selección de las bacterias lácticas autóctonas explica, en

parte, el que t. plantaruni, P. acidilacticí y P. pentosaceus sean lo s microorganismos más

empleados como cultivos iniciadores en la elaboración de productos cárnicos y no L. sa/ce o

L. curvatus, que son especies mucho más competitivas (LOcke y Hechelmann, 1987).

y. 3. - Identificación y caracterización bioquímica parcial de las bacterias lácticas con

actividad antimicrobiana

Cuando se aislan bacterias lácticas y en panicular lactobacilos, de la carne y productos

cárnicos, no es posible clasificarlos adecuadamente siguiendo lo s sistemas de identificación

empleados clásicamente, ya que éstos se basan en las propiedades de microorganismos

procedentes de otras fuentes (OrIa Jensen, 1919; Rogosa, 1970; Sharpe, 1979). Hasta muy

recientemente, las cepas difíciles de identificar se englobaron bajo la denominación de

estreptobacterias o lactobacilos atípicos” (Thornley y Sharpe, 1959; Reuter, 1975; Sharpe,

1979). No obstante, como sugirió Ingram (1975), el término de “estreptobacterias atípicas” es

poco afortunado ya que las bacterias lácticas de origen cárnico no son menos típicas que las

demás, en todo caso lo serán los criterios de identificación y clasificación, debido a la

ignorancia de las propiedades de las especies de origen cárnico.

Con el transcurso del tiempo se han realizado diversos intentos de identificar y

clasificar las estreptobacterias de origen cárnico (Reuter. 1975; Kitchell y Shaw, 1975;

Hitchener y col., 1982). Todos ellos se basan en reacciones bioquímicas variables que, al no

emplear métodos numéricos en el establecimiento de lo s grupos, han llevado a la creación de

grupos innecesariamente complicados y arbitrarios (Shaw y Harding. 1984). No obstante, en

1987, Schillinger y LOcke elaboraron un esquema de identificación rápidade lactobacillos de

origen cárnico, basado en sus características fisiológicas, la mayor parte de las cuales sonfácilmente determinables. Este esquema, que se muestra en la figura 5. 1 , incluye especies

219

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DISCUSJOJkI

recientemente caracterizadas, como L. sa/ce, L. cun’atus, C. piscicola y C. divergens, por le ’

que la hemos utilizado en la identificación y clasificación de nuestros aislados.

En las tablas IV . 2 y IV. 3 se muestran las características morfológicas y bioquímicas:

más significativas de nuestros aislados. De ellas se deduce que se trata de bacilos

homofermentativos, que crecen a 1 5 oc, no fennentan el manitol, pero s i la ribosa, sacarosa y

trealosa por lo que, siguiendo el esquema de la figura 5. 1 , los clasificamos tentativamente

como L. sa/ce; las características descritas coinciden con las señaladas por Kandler y Weiss

(1986) y por Champomier y col., (1987) para esta misma especie.

En nuestro caso, ninguna de las cepas aisladas crece en medio MRS de pH 3,9.

Schillinger y LOcke (1987b) han señalado que aproximadamente el 11% de las cepas de E.

sa/ce no crecen a dicho pR. A este respecto conviene destacar que lo s lactobacilos incluidos en

las “estreptobacterias atípicas” son menos acidificantes y acidotolerantes que los demás

(Reuter, 1975; Reuter, 1981).

Todas las cepas analizadas crecieron a una concentración de cloruro sódico del 7%, a

excepción de la número 77. lo que coincide con lo s resultados de Champomier y col. (1987),

Schillinger y LOcke (1987b), M0rtvedt y Nes (1990) y Rodríguez (1991). Sin embargo,

ninguna de las cepas estudiadas se desarrolló cuando la concentración de cloruro sódico fué del10%. Existen discrepancias en cuanto a la capacidad de E. sa/ce de desarrollarse a esta

concentración de cloruro sódico, ya que mientras Schillinger y LOcke (1987b) indican que el

93 % de 131 cepas de E. sa/ce crecen a esta concentración, Champomier y col. (1987)

mantienen que se trata de una característica excepcional.

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DISCUSION

heremfermentativos

casei pseudo- ptontoruni

Figura 5. 1 . - Esquema de identificación rápida de bacterias de origen cárnico.

Fuente: Schillinger y LÍicke (1987b).

Lactococcus homofermentativos

LeuconosrocLacrobacillí

L.

subsp. subsp.

221

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DISCUSION

Las cepas de L. sa/ce analizadas muestran una capacidad variable de hidrolizar la

arginina, pues mientras las cepas 90 y 148 producen amoniaco a partir de dicho aminoácido,

las cepas 31, 77, 1 7 7 y 1 8 0 n o lo producen (tabla IV. 2). Schillinger y LOcke (1987b),

observaron que la mayoría de las cepas de L. sa/ce poseían esta capacidad, lo que concuerda

con los resultados de Champomier y col. (1987). Sin embargo, resulta curioso que Kandler y

Weiss (1986) describan aL. sa/ce como incapaz de hidrolizar la arginina, ya que la cepa que

consideraron tipo, la L. sa/ce ATCC15521. carece de esta capacidad. Reuter (1981) y

Rodríguez(1991), concuerdan con nuestros resultados

enque la capacidad de hidrolizar la

arginina varía de unas cepas de L. sa/ce y de L. curvatus a otras.

La capacidad de algunos lactobacilos de producir ácido sulfhídrico es una característica

tecnológica perjudicial, ya que su proliferación en lo s alimentos acarrea su deterioro (Egan.

1983). Ninguna de las cepas que hemos ensayado producía ácido sulfhídrico en ninguno de

los medios estudiados (tabla IV. 2). No obstante, Schillinger y Locke (1987b), observaron enel 50 % de las cepas de L. sa/ce analizadas la producción de ácido sulfhídrico.

Las cepas de L. sa/ce comparten características básicas que las diferencian de otras

especies de lactobacilos. Sin embargo, poseen otras propiedades en las que la variabilidad

entre cepas es la nota predominanante. Las discrepancias entre la cepa tipo y las propiedades de

las de origen cárnico explican las dificultades de muchos investigadores para identificar susaislamientos (Reuter, 1981). En este sentido, la fermentación de la arabinosa, amigdalina.

esculina, arbutina, salicina, celobiosa, maltosa y lactosa, que en la descripción deL. sa/ce en

el Berizev’s Manual of Svstematic Bacterioloav (Kandler y Weiss, 1986) se admiten como

pruebas de identificación, variaron en las 13cepas de esta especie que analizaron Champomier

y col. (1987>. Quizás esto justifique la variabilidad de nuestras cepas en lo que concierne a

fermentación de azúcares.

222

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DISCUSlON

Que todos nuestros aislados se hayan identificado como L. sa/ce no es sorprendente.

ya que algunos investigadores han observado que esta especie puede convertirse en la

predominante a las temperaturas de maduración normalmente empleadas en Europa en la

elaboración de los embutidos crudos (LOcke. 1986; Schillinger y LOcke, 1987a). LOcke y

Hechelmann (1987) apoyan esta observación al confirmar el predominio natural deL. sa/ce y

L. curvatus en embutidos europeos madurados tradicionalmente.

Holy y Holzapfel (1988) también han observado que entre las bacterias lácticasaisladas de carne de vacuno, envasada a vacío y almacenada a temperaturas de refrigeración,

hay un fuerte predominio de L. sa/ce, constituyendo L. sa/ce, L. curvatus y E. bavaricus casi

el 80 % del total de bacterias lácticas identificadas. Conviene recordar que L. bavaricus se

diferencia deL. sa/ce en que carece de racemasa (Kandler y Weiss, 1986a). Asimismo, Monte!

y col. (1989) consideran a L saL- -e como la bacteria láctica más abundante en la carne de

vacuno. Korkeala y Mákelá (1989), utilizando el esquema de clasificación de Sehillinger yLOcke (1987b), han establecido que L sa/ce es la bacteria láctica mayoritaria de lo s productos

cárnicos envasados a vacío. Hastings y col. (1986) también han observado que E. sa/ce es la

especie predominante en la carne picada de vacuno irradiada (5 KGy), adjudicando a esta

especie 100 de las 113 cepas aisladas.

Globalmente consideradas, y de acuerdo con numerosos estudios anteriores, las“estreptobacterias atípicas” también han constituido el grupo bacteriano más numeroso del

bacon (Cavett, 1963), de una gran variedad de productos cárnicos (Reuter, 1975) y de las

carnes envasadas a vacío (Mol y col., 1971; Reuter. 1975; Kitchell y Shaw, 1975; Hitchener y

col., 1982; Holzapfel y Gerber, 1986). Su presencia se ha considerado deseable, ya que

contribuyen al aumento de la vida útil de lo s productos citados (Egan. 1983). Recientemente, y

como contribución a una mejor comprensión de la clasificación de las bacterias lácticas deorigen cárnico, Champomier y col. (1987) han comprobado que lo s 6 grupos de lactobacilos

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LIVSCUSION

aislados de productos cárnicos por Laban y col. (1978) y la mayoría de los integrantes del

grupo 1 1 de Shaw y Harding (1984). encajan perfectamente en la descripción tipo de U saL-e.

Actualmente L. saL-e y L. curvanis se consideran microorganismos psicrotrofos,

siendo de entre las bacterias lácticas lo s que crecen a las temperaturas más bajas (Reuter, 1981;

Kandler y Weiss, 1986 9 . Esta característica se refleja en todas las cepas analizadas, ya que

todas ellas se desarrollan a 4 oc (tabla IV. 2). Estos resultados coinciden con los obtenidos por

Schillinger y LOcke (1987b) y Champomier y col. (1987), dado que el 99 % de las cepas deL.

sa/ce estudiadas por los primeros, y todas las ensayadas por los segundos, crecieron a 4 0C.

Por el contrario, sólo el 50 % de las cepas de L. planrarwn se desarrollan, y débilmente, a esta

temperatura (Reuter, 1981; Schillinger y LOcke, 1987b). Hasting y Holzapfel (1987) han

observado que ninguna de la 100 cepas de L. sa/ce aisladas de carne radurizada se

desarrollaban ni a 4 oc ni a 8 0C . Quizás esta anomalía se deba a alteraciones de la fisiología

celularde lo s lactobacilos provocadas por la irradación.

De nuestras cepas de U sa/ce únicamente las 148 y 177 se desarrollan a 45 0C. La

mayoría de los estudios realizados hasta la fecha, coinciden en señalar que la mayor parte de

las cepas de L. sa/ce no se desarrollan a 45 oc (Reuter. 1975; Champomier y col., 1987;

Hasting y Holzapfel, 1987; Korkeala y Mákelá, 1989) o lo hacen muy débilmente (Reuter,

1981). Sin embargo, Schillinger y LOcke (1987b) han observado que el 87 % de las cepas de

L. sa/ce y el 77 % de las de L. cur”atus, crecen a dicha temperatura. La mayoría de las cepas

deL. plantarun¡ sise desarrollan a 45 0C (Reuter, 1981: Schillinger y LOcke, 1 987b).

La temperatura óptima de crecimiento de las bacterias lácticas constituye un parámetro

de gran importancia tecnológica en la elección de cultivos iniciadores cárnicos. Así, mientras

1 > . ac¡d¡lactic¡ se desarrolla bien a temperaturas superiores a 40 0C, las temperaturas óptimas de

crecimiento de It pentosaceus y L. planta¡-un¿ se sitúan entre 30 y 35 0C. siendo las deL.

224

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DISCUSION

sa/ce y L. Curvatus algo menores (Locke y Hechelmann, 1987). En un estudio comparativo de

las bacterias lácticas normalmente incluidas en lo s cultivos iniciadores cárnicos (L. sa/ce, L

curvatus, L. planrarurn, P. acidflactici y 1 ’ . penzosaceus ), Schillinger y Locke (1989)

comprobaron que L. sa L -e era la especie que se desarrolla más rápidamente y con mayores

recuentos en una mezcla cárnica mantenida a 20 0C; su mayor rapidez de desarrollo fué

especialmente significativa respecto de lo s lactobacilos “nativos” de un lote control a] que no se

le había adicionado ningún cultivo iniciador.

V. 4.- Esoectro antimicrobiano de lo s sobrenadantes libres de células de las cepas de

L. sa/ce seleccionadas, una vez neutralizados y concentrados

El conocimiento exacto del espectro antimicrobiano de las bacteriocinas producidas por

las bacterias lácticas es muy importante, ya que su empleo podría inhibir el desarrollo de las

bacterias lácticas que se utilizan como cultivos iniciadores en la elaboración de productos

cárnicos. En este sentido. Hammes y col. (1990) observaron que cepas de E. curvatus y E.

sa/ce, productoras de sustancias inhibidoras no inhibian únicamente a las bacterias

contaminantes, como S. aureus, sino que también afectaban a microorganismos que se

emplean corrientemente como cultivos iniciadores como E. plantarunz o Micrococcus varians.

Por tanto, el conocimiento de las propiedades antimicrobianas de las bacterias lácticas,

facilitará la selección de las cepas que formen parte de un cultivo iniciador, de forma que se

minimicen lo s riesgos sanitarios provenientes lo s productos cárnicos.

Los sobrenadantes libres de células, neutralizados y concentrados, de 4 cepas de E.

saL-e (77, 90, 1 4 8 y 180), ejercieron una actividad antagonista diversa en distintos

microorganismos indicadores (tabla IV . 1). El espectro antimicrobiano de cada una de las

cepas es significativamente distinto, lo que induce a suponer que las sustancias antimicrobianas

son distintas entre sí . Este aspecto ya había sido observado por Bhunia y col. (1988), quienes

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DISCUSION

comprobaron que algunas cepas de pediococos eran más activas que otras frente a diversos

microorganismos patógenos y alterantes de lo s alimentos.

La actividad antimicrobiana de las cepas de L. sa/ce estudiadas no se limita a especies

bacterianas filogenéticamente próximas, como parece ser la situación predominantante en las

sustancias inhibidoras producidas por el género Lactobacillus (Andersson y col., 1988;

Schillinger y Holzapfel, 1990; Toba y col., 1991), sino que también afecta a microorganismos

Gram-positivos, patógenosy

alterantesde

lo s alimentosde

graninterés en

la industriacárnica

como los pertenecientes a lo s géneros Lisreria, Swphylococcus y Closrridiunz. También es

importante destacar que las cepas ensayadas no inhiben el desarrollo de 5. carnosus ni de M.

varians, microorganismos cuya presencia en lo s alimentos no sólo es beneficiosa sino

deseable, ya que son lo s responsables de reacciones químicas que influyen beneficiosamente

en la calidad higiénica y en las características organolépticas de lo s alimentos.

Algunos investigadores han observado la reducción de los nitritos y el enrojecimiento

de los embutidos se suprimen cuando se utiliza como iniciador un cultivo compuesto de cepas

de L. sa/ce antagonistas de M. varians (Hammes y col., 1990). La resistencia de 5. carnosus y

M. varians, microorganismos utilizados como cultivos iniciadores comerciales, frente a la

acción antimicrobiana de las cepas de L. sa/ce que hemos aislado en este trabajo es muy

importante, ya que permite su empleo en los cultivos iniciadores al garantizar la calidadhigiénica de lo s alimentos sin inhibir reacciones bacterianas deseables.

Por otro lado, la posibilidad de inhibir el desarrollo de L. monocvtogenes es muy

interesante, sobre todo s i se tiene en cuenta que este microorganismo crece en un intervalo de

temperaturas muy amplio (1-45 0C) y en presencia de un lO % de NaCí (Seelinger y iones.

1986); además permanece viable durante el procesado y almnacenamniento de algunos alimentos

fermentados (Juntilla y col., 1989), proliferando en sustratos cuyo pH es ligéramente menor

226

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DISCUSION

de 5,6 (Conner y col., 1986); no obstante, es relativamente sensible a los medios más ácidos

(Rodríguez, 1991).

Los alimentos pueden contaminarse durante su elaboración y manipulación con 5.

aureus que, posteriormente, puede desarrollarse y, si son cepas enterotoxigénicas, producir

toxinas (Smith y Palumbo, 1981), que pueden originar brotes de intoxicaciones alimentarias.

La actividad antimicrobiana de las cepas de L. sa/ce analizadas frente a 5. aureus

enterotoxigénico permite suponer que su empleo, junto a otros factores de seguridad (Hammes

y.col.. 1990), podría aumentar mucho la calidad higiénica de los alimentos y disminuir la

incidencia de estas toxiinfecciones alimentarias.

El crecimiento y producción de toxinas por C. boíulinurn se previene mediante la

adición a los alimentos de nitratos y nitritos; sin embargo, su incorporación a lo s alimentos

está limitado por su posible conversión en nitrosaminas, compuestos que son cancerígenos.Smith y Palumnbo (1981) comprobaron que las bacterias lácticas previenen el crecimiento y

producción de toxinas de C. borulinun;, únicamente cuando el sustrato contiene glucosa y

nitritos. Recientemente (CFR, 1988), la “Food and Drues Administration” ha permitido la

utilización de la nisina como antagonista de C. botulinum en algunos alimentos. Por ello, la

capacidad de nuestras cepas de L. sa/ce de inhibir el desarrollo de C. botulinunz, resulta

esperanzadora en cuanto a su posible utilización como inhibidor del desarrollo de este patógenoen los alimentos. Asimismo, la utilización de las cepas aisladas en este trabajo o las sustancias

inhibidoras elaboradas por ellas, permitirían disminuir los niveles de nitritos habitualmente

empleados en algunos derivados carnmcos.

Se sabe poco sobre el efecto de las bacterias lácticas en C. pe,fringens. Baran y

Stevenson (1975) demnostraron que este microorganismno supervivía en lo s embutidos crudosmadurados de pavo, elaborados con P. cerevisiae comno cultivo iniciador. Aunque no se

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7/10/2019 Ad 2009501


DISCUSION

conoce bien la persistencia o destrucción de C. perfringens durante el procesado,

almacenamiento y distribución de muchos productos cárnicos, es posible hipotetizar que las

sustancias antimicrobianas producidas por las cepas aisladas en nuestro trabajo dificultarían el

desarrollo de este patógeno.

La sensibilidad de las listerias a sustancias antagonistas de especies del género

Lactobacillus no es sorprendente, ya que estos dos géneros están estrechamente relacionados

(Wilkinson y Jones, 1977; Seelinger y Jones, 1986; Rhuland y Fiedíer, 1987). Además, sehan publicado numerosos trabajos que confirman la actividad antimicrobiana de diversos

lactobacilos sobre L. rnonocyrogenes (Harris y col., 1989; Schillinger y Holzapfel, 1990;

Harding y Shaw, 1990). Sin embargo, en lo s trabajos publicados, la actividad antagonista se

limita a otros lactobacilos y listerias. siendo muy rara su actividad frente a otros patógenos

Gram-positivos como 5. aureus (Andersson. 1986; Talarico y col., 1988). Hasta ahora, no

tenemos constancia de que existan cepas de L. sa/ce cuyo espectro antimicrobiano sea tanamplio corno el de las cepas que se han aislado en este trabajo.

El espectro antimicrobiano de estas cepas es similar al mostrado por cepas del género

Pediococcus. Sin embargo, la síntesis de sustancias antimicrobianas por especies de origen

cárnico pertenecientes a este género se limita únicamente a P. ac¡dilactici H con actividad

antimicrobiana frente a microorganismos Gram-positivos como C. perfringens, Listeria

nzonocyto genes y Staphylococcus aureus y dos especies Gram-negativas, Acromonas

hydrophila y Pseudornonas pulida (Bhunia y col.. ~988).

Por lo que respecta a lo s lactococos la nisina producida porLactococcus lactis inhibe el

desarrollo de L. monocvtogenes (Ehunia y col, 1988) y especies del género Clostridiurn

dificultando, además, la germinación de las esporas de C. botulinum (Daeschel. 1989). Sinembargo, es inactiva frente a microorganismos Gram-negativos. hongos o levaduras.

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DiSCUSION

El amplio espectro de acción de las cepas de L. sa L -e estudiadas en este trabajo y, de la

cepa 148 en particular, permite concebir esperanzas sobre el futuro empleo de estosmicroorganismos como agentes conservadores de ciertas carnes y productos cárnicos, ya que

es precisamente la especificidad mostrada por las bacterias lácticas la que ha limitado el empleo

de estos microorganismos como cultivos iniciadores o protectores (Hastings y Stiles, 1991).

No obstante, antes de estimular su utilización en la industria cárnica. se necesita conocer silos

resultados de inhibición obtenidos “in vitro” son reproducibles en un sistema cárnico

experimental.

y. 5.- Efecto de la composición del medio de cultivo en la producción de

actividad inhibidora

Una vez seleccionado el microorganismo con mayor actividad antimícrobiana y con

unas características de crecimiento más favorables, se necesita establecer las condicionesóptimas de producción de su actividad para acometer su purificación con las mejores garantias

de éxito. Para ello se seleccionó la cepa L. sa/ce 148, cuyo intervalo de temperaturas de

crecimiento es muy amplio (4-45 oc) y cuyo sobrenadante cultural presenta una actividad

antimicrobiana comparable, sino superior, al de las otras cepas de L. sa/ce aisladas.

Tagg y col. (1976) ya señalaron que ciertos componentes del medio de cultivo podríanser críticos en la producción de ciertas bacteriocinas. Sin embargo. existen pocos trabajos

sobre el efecto de los distintos nutrientes en la producción de compuestos antagonistas por las

bacterias lácticas (Reddy y Ranganathan. 1983; Batish y col.. 1990; Biswas y col., 1991); en

la mayor parte de lo s casos no se ha llegado, a resultados concluyentes. Algunas cepas

productoras de sustancias antimicrobianas pierden esta capacidad cuando crecen en medios

líquidos y la recuperan cuando lo hacen en medios sólidos o semisólidos, tal es el caso de lalactacina B (Barefoot y Klaenhammer. 1983) y de la propionicina PLG-l (Lyon y Glatz,

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DISCUSION

1991). Contrariamente a los resultados obtenidos por éstos investigadores, L. sa/ce 148

mostraba actividad inhibidora tanto en medios sólidos como líquidos.

De los resultados obtenidos en este trabajo (tabla IV . 5). debe destacarse la ausencia de

actividad antagonista cuando L. sa/ce 148 se desarrollaba en medios de cultivo semidefinidos

suplementados con hidrolizados de proteinas lácteas (caseinas). No sucede así cuando el

suplemento es un hidrolizado de proteinas cárnicas (peptona o extracto de carne), a pesar de

que la actividad antagonista es fácilmente mensurable y cuantificable. La producción óptimaacaece en el medio complejo MRS. Esta último observación concuerda con la de McGroarty y

Reid (1988) acerca de la producción de bacteriocinas por L. casei sp. rharnnosus y L.

acidophilus 76. Los resultados obtenidos refuerzan la teoría de Schillinger y LOcke (1989)

según la cual las bacterias lácticas aisladas de productos cárnicos, serían más adecuadas para

asegurar la calidad higiénica de la carne y productos cárnicos que las procedentes de otros

productos.

Tampoco se detectó la actividad antimicrobiana en L. sa/ce 148 cuando éste se

desarrollaba en caldo de APT sin suplementar. Sin embargo, cepas Carnobacterí un ; piscícola

(Ahn y Stiles, 1990a) y Leuconosíoc gelidunz (Hastings y Stiles, 1991), aisladas de productos

cárnicos envasados al vacío, sintetizan bacteriocinas en caldo de APT. Lo mismo ocurrió en el

medio BRI, que es un caldo de cultivo compejo de cuya composición forman partehidrolizados de cerebro y corazón bovino. En este caso resulta muy dificil explicar la ausencia

de actividad antagonista, tanto en el medio sin modificar como en el suplementado con

diversos extractos cárnicos, dada la extraordinaria riqueza nutritiva de este medio.

Las diferencias observadas en la producción de actividad antimicrobiana dependiendo

de la fuente proteica, se justificarian por la variación en algún componente específico(posiblemente aminoacídico) o por la existencia de mecanismos reguladores de origen

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DISCUSION

genético. estimnulados o reprimidos por componentes del extracto proteico. Esto último

explicaría la falta de actividad inhibidora de L. saL -e 148 al crecer en el caldo BHI, tantosuplementado como sin suplemento. Morishita y col. (1974), demostraron que algunos

mutantes de L. cosed sintetizaban detenninados aminoácidos en medios carentes de lo s mismos;

dicha capacidad la perdían cuando crecían en medios complejos. De los resultados obtenidos se

deduce que sería conveniente estudiar más profundamente estos posibles mecanismos

reguladores, con el fin de predecir la posible inhibición o represión de la actividad antagonista

de L. sa/ce 148, cuando éste se desarrolle en la carne o en sus productos.

V. 6.- Parámetros cinéticos y producción de la actividad inhibidora de

L. sa/ce 148 a diversas temperaturas

L. sa/ce 148 se desarrolló a 4, 8. 16, 25 y 32 0C, tanto en medio complejo MRS como

en medio mínimo MM con triptosa (tabla IV. 6), obteniéndose unos parámetros de crecimiento

similares a lo s encontrados por otros investigadores con cepas de L. sa/ce y otras bacterias

lácticas de origen cárnico (Rodríguez. 1991).

Según Daeschel y col. (1990) la producción de bacteriocinas por las bacterias lácticas

puede iniciarse en cua[quier etapa del crecimiento, tanto en su comienzo (fase logarítmica)

como al final (fase estacionaria). La actividad antagonista de L. sa/ce 148 es detectable y

cuantificable al poco tiempo de iniciarse su crecimiento en todas las temperaturas ensayadas

(fig. 4. 30 a 4. 34). Estos resultados coinciden con los de la mayor parte de los trabajos

publicados (Gálvez y col., 1986; Ahn y Stiles, 1990b; Hastings y Stiles. 1991) en lo s que la

produción de sustancias inhibidoras parece ser una propiedad asociada al crecimiento.

Corno ya señalaron Ahny

Stiles (199Gb). la producción de bacrnriocinas en la fasemnicial del crecimniento bacteriano podría favorecer el predominio de la cepa productora en una

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DISCUSlON

población bacteriana mixta con bacterias sensibles. Asimismo, la detección de la actividad

antagonista al comienzo del crecimiento indica que no corresponde a un metabolito secundario.

La disminución de la actividad durante la fase estacionaria (fm g. 4. 34), podría deberse a la

acción de enzimas proteoliticos endo o exocelulares, a que la sustancia responsable de la

actividad se convierte en otros metabolitos o a su inestabilidad ante el aumento de la acidez del

medio de crecimiento.

El incremento de la actividad antibacteriana al hacerlo la temperatura se debe, alparecer, al mayor desarrollo celular, ya que la actividad aumenta a medida que la temperatura

se aproxima a la óptima de crecimiento deL. sa/ce 148. Hasting y Stiles (1991) comprobaron

que la producción de bacteriocinas por Leuconosíoc gelidun; es directamente proporcional a la

masa celular del cultivo microbiano. Es de destacar que L. sa/ce 148 producía actividad

antimicrobiana a todas las temperaturas ensayadas.

La producción de la actividad antagonista a temperaturas de refrigeración, contribuida

a dificultar el desarrollo de los microorganismos alterantes y patógenos en lo s alimentos

refrigerados.

V. 7.- Caracterización biocuimica narcial de la actividad antimicrobiana deL, sa/ce 148

Una vez establecidas las condiciones óptimas de crecimiento y de producción de la

actividad antimicrobiana deL. sa/ce 148, el siguiente paso consistió en intentar su purificación,

con el fin de separar la entidad activa de otros productos o restos celulares y de las proteínas

del medio de cultivo. Hay que reconocer que el medio complejo M RS no es el más indicado

para iniciar la purificación de la actividad antagonista de L. sa/ce 148, ya que los

sobrenadantes procedentes de este medio contienen una concentración elevada de proteínas y

péptidos (Barefoot y Klaenhamnmer, 1984), lo que no sucede con el medio mínimno con triptosa

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DISCUSION

que, siendo un medio semidefmnido sencillo, permite la síntesis de la actividad antimicrobiana

deL. saL- -e 148 (tabla IV . 6).

Debido a la heterogeneidad de las bacteriocinas, sus protocolos de purificación se han

diseñado empíricamente para cada una de ellas.

Barefoot y Klaenhammer (1984), tras emplear sin éxito la cromatografía de

intercambio iónico, purificaron la lactacina E creando condiciones disociantes (urea 8M) antes

de someterla a ultracentrifugación y a cromatografía de filtración en geles. Los resultados

obtenidos indicaron que el peso molecular de la bacteriocina parcialmente purificada era de

6.500 daltons. Sin embargo, cuando la lactacina B parcialmente purificada se sometió a

electroforesis en poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) no se apreciaron

bandas en los geles, a pesar de teñirlos con reactivos de plata, que es un proceder de gran

sensibilidad para la detección de las bandas de proteinas en los geles. Dos años más tarde,Joerger y Klaenhammer (1986) también purificaron la helveticina . 1 por cromatografía de

filtración en geles que llevaban dodecil sulfato sódico (SOS) como agente disociante. El peso

molecular de la bacteriocina purificada fué de unos 37.000 daltons.

De otra parte, Rammelsberg y Radíer (1990) han encontrado dificultades al intentar

purificar la brevicina 37 y la caseicina 80, utilizando lo s procedimientos de purificaciónproteica tradicionalmente empleados. Dichos investigadores han observado, asimismo. que la

concentración de los sobrenadantes por liofilización origina una pérdida importante de la

actividad antimicrobiana.

En contraste con la utilización de las técnicas cromatográficas de filtración en geles,

empleadas en la purificación de bacteriocinas producidas por lactobacilos, la purificación de lapediocina PA-l (Gonzalez y Kunka, 1987) y de la pediocina AcH (Bhunia y col.. 1988),

233

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DISCUSION

producidas por pediococos, se ha realizado por cromatografía de intercambio iónico. El peso

molecular de la pediocina PA-I parcialmente purificada (16.500 daltons) se determinó por

cromatografía de filtración en geles, mientras que el de la pediocina Acl-i (2.700 daltons) se

estimó por SDS-PAGE.

En nuestro trabajo, la purificación de la actividad antimicrobiana exocelular deL. sa/ce

148, se realizó concentrando los sobrenadantes por liofilización y separando las proteínas por

cromatografía de filtración en geles. Utilizamos la urea (a una concentración 1 M) como agente

disociante de los posibles agregados proteicos, formados por la sustancia antimicrobiana

consigo misma o con otros componentes del medio del cultivo (figuras 4. 35 a 4. 37). El

proceso de purificación se tradujo en un aumento poco apreciable de la actividad inhibidora

específica (7 veces) y en una baja recuperación de la actividad inhibidora original (8 %) (tabla

IV. 7). Los resultados obtenidos confirman que, según se ha observado en otras ocasiones, las

bacteriocinas son, a veces, bastante resistentes a su purificación por las técnicas standar de

separación de proteinas (Ranimelsberg y Radíer, 1990). La concentración de las muestras por

liofilización antes de someterlas a cromatografía de filtración, posiblemente afecta

negativamente a la actividad antimicrobiana.

La pérdida de actividad, que a menudo es grande, producida durante la purificación

constituye un problemna corriente en las bacteriocinas originadas por las bacterias lácticas (Taggy col., 1976).

Barefoot y Klaenharnrner (1984) y Joerger y Klaenhammer (1986), únicamente

lograron recuperar el 0,4 % de la actividad inhibidora inicial de la lactacina E y el 4 % de la

helveticina J. Sin emnbargo, mientras la purificación final de la lactacina B fué de 3.222 veces y

1 - a de la helveticina 3 de 837 veces, la purificación final de la sustancia antimicrobiana de L.

sa/ce 148 es mucho menor. De ello se deducequeel método de purificación empleado es poco

234

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DISCUSION

eficaz, por lo que conviene desarrollar otros más potentes.

La sustancia antimicrobiana de L. sa/ce 148 parece que se sintetiza en forma de

polipétido de pequeño tamaño molecular como lo demuestra que, en los experimentos de

filtración en geles de Sephadex G-150 fino, G-75 y G-50 (figuras 4. 35 a 4. 37), se eluye

lejos del volumen de vacio, volumen en el que se encuentran las moléculas de un tamaño

molecular mayor que el diámetro de poro del gel. En este aspecto, la sustancia antimicrobiana

de L. sa/ce 148 difiere de la lactocina 25 (Upreti y Hinsdill, 1973), lactacina B (Barefoot y

Klaenhammer, 1984), helveticina J (Joerger y Klaenhammer, 1986), lactacina F (Muriana y

Klaenhammer, 1991), propionicina PLG-1 (Lyon y Glatz, 1991) y la bacteriocina deL. sa/ce

449 (Rodríguez, 1991), que se aislaron primero, bien como agregados proteico-polisacáridos

complejos (partículas globulares parecidas a las micelas) o bien como grandes agregados

protéicos, que se separaron más tarde utilizando diversas técnicas analíticas.

Una vez realizada la purificación parcial de la actividad antimicrobiana conviene

realizar su caracterización físico-química. Uno de los criterios básicos para que una sustancia

antimicrobiana se considere una bacteriocina es que sea un componente proteico

biológicamente activo (‘Tagg y col.. 1976), lo que se determina por su sensibilidad a diversos

enzimas proteoliticos. En la tabla IV. 8 se m rm u estra el efecto de diversos enzimas proteolíticos,

lipolíticos y amilolíticos, en la actividad antimicrobiana exocelular parcialmente purificada de

L. saL- -e 148. En ella se observa que lo s enzimas inespecíficos, corno la papaína, proteasa II y

proteasa XIV, anulan la actividad inhibidora, mientras que otros enzimas más específicos la

disminuyen mucho; de ahí se deduce que la sustancia antimicrobiana deL. sa/ce 148 posee una

estructura proteica biológicamente activa.

Además, su resistenciaa

la acción de los enzimas lipoliticosy

amiloliticos indica queen su composición no entran a formar parte elementos lipídicos ni hidrocarbonados y, silo

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DISCUSION

hacen, no influyen en su actividad antimicrobiana.

La sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL. sa/ce 148 es muy estable en

un amplio intervalo de valores de pH (fig. 4. 38), mostrando su mayor actividad a valores de

pH comprendidos entre 5,6 y 6,6; cuando el pH se situaba entre valores extremos (2,6-4,6;

10-12) la actividad disminuía ligeramente (sin superar nunca el 20%).

Gonzalez y Kunka (1987), comprobaron que la pediocina PA-1 producida por 1’.acidilacticí era estable entre valores de pH de 4 y 7, si bien mostraban ligeras pérdidas de

actividad a pH de 2.3 y 10. Bhunia y col. (1988) establecieron el intervalo de pH al que la

pediocina AcH era activa entre pH 2,5 y 1 0 y observaron una pérdida total de la actividad

cuando el pH era mayor de 10.

La nisina, producida por L. lactis es inactiva cuando el pH es superior a 7 (Hurst,1981; Liu y Hansen, 1990). La propionicina PLG-1 permanece estable a valores de pH entre 3

y 9, con ligeras pérdidas de actividad a pH de 3-4 (Lyon y Glatz, 1991).

La gran estabilidad frente al pH mostrada por la bacteriocina de L sa/ce 148 es muy

imnportante de cara a su posible utilización como agente antimicrobiano, tanto en lo s alimentos

fermentados como en otros productos alimenticios.

La resistencia al tratamiento térmico es una característica muy extendida entre las

bacteriocinas, no obstante, el criterio seguido para determinar la estabilidad de estas sustancias

varía bastante, ya que esta propiedad depende del grado de purificación de las bacteriocinas y

de otros factores como pH, fuerza iónica y presencia de moléculas termoprotectoras (Tagg y

col., 1976). La existencia de bacteriocinas termosensibles es menos corriente, aunque entre

éstas se encuentran la helveticina J (Joerger y Klaenhammer, 1986), la caseicina 80

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DISCUSION

(Rammelsberg y Radíer, 1990), la bacteriocina sintetizada por L. delbruec/cii sp lactis (Toba y

col., 1991) y la propionicina PLG-í (Lyon y Glatz, 1991). La bacteriocina producida porL.

sa/ce 148 es muy termoestable (fig. 4. 39), pareciéndose en esto a las bacteriocinas de L.

acidophilus, (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Muriana y Klaenhammer, 1987), L. helvericus

(Upreti y Hinsdill, 1973; Joerger y Klaenhammer, 1986), L. plantarurn (West y Warmer,

1988; Daeschel y col., 1990), L. sa/ce (Schillinger y LOcke, 1989; M0rvedt y Ness, 1990) y

L. brevis (Rammnelsberg y Raedler, 1990).

La gran termoestabilidad de la bacteriocina de L. sa L -e 148 le confiere ventajas en

cuanto a su posible utilización en alimentos higienizados por el calor, ya que permanece

biológicamente activa tras los tratamientos de pasterización y esterilización a los que se

somenten éstos productos.

La determinación del peso molecular aparente de la bacteriocina de L. sa/ce 148

mediante filtración en geles de Sephadex G-50, dió un peso molecular de 4640 daltons (tabla

IV. 9). La elución de esta bacteriocina en un solo pico de bajo peso molecular no es corriente,

dada la baja concentración del agente disociante empleado (urea 1M en el tampón de disolución

y urea 0,1M en el de elución). Lo corriente es que las bacteriocinas producidas por las

bacterias lácticas formen agregados de alto peso molecular (Muriana y Klaenhammer, 1991;

Rodríguez, 1991).

El peso molecular de las bacteriocinas de las bacterias lácticas es muy variable, con

moléculas grandes, como la helveticina J cuyo peso molecular es de 37.000 daltons (Joerger y

Klaenhammer, 1986), la caseicina 80 de un peso molecular entre 40.000 y 42.000 daltons

(Rammnelsberg y Raedíer, 1990) y la bacteriocina de L. sa L -e 449 de unos 30.000 daltons

(Rodríguez, 1991). No obstante, ta l y como ocurre con la bacteriocina de L. sa/ce 148, lamayor parte presentan un peso molecular relativamente pequeño, menor de 10.000 daltons. En

237

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DISCUSION

este grupo se incluyen: nisina (Hurst. 1981), diplococina (Davey y Richardson, 1981),

lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1984). pediocina AcH (Bhunia y col., ¡988). ¡actacinaF (Muriana y Klaenhammer, 1991), lactocina 5 (M0rtvedt y col., 1991) y carnocina U149

(Stoffels y col., 1992). Cuando las bacteriocinas forman agregados moleculares es difícil

determinar su peso molecular mediante técnicas de filtración en geles, por lo que se recurre a

la electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS), con o sin urea.

Sin embargo, la utilización de la electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS, cono sin urea, para determinarel peso molecular de Ja bacteriocina deL. sa/ce 148 dió resultados

negativos cuando la tinción se realizó con Azul Brillante de Coomasie (Laemmli, 1970). Esto

no es extraño, ya que Muriana y Klaenhammer (1991) obtuvieron el mismo resultado al

determinar el peso molecular de la lactacina F con este colorante. Por otra parte, Davey y

Richardson (1981) y Stoffels y col. (1992), observaron la existencia de una banda difusa

asociada al frente electroforético al determinar el peso molecular de la diplococina y lacarnocina U149 respectivamente. Cuando Barefoot y Klaenhammer (1984) utilizaron nitrato de

plata como agente tintorial para determinar el peso de la lactocina B obtuvieron, igual que

nosotros (fig. 4. 40), una banda de tinción difusa asociada al frente electroforético.

La dificultad de determinar el peso molecular de las bacteriocinas por técnicas

electroforéticas se atribuye a que las condiciones creadas durante la electiroforesis originan lahidrólisis espontánea de las moléculas proteicas (Muriana y Klaenhammer, 1991); de otra

parte, la cantidad de proteína depositada en lo s geles es lo suficientemente grande para poder

detectarse con el nitrato de plata, cuyo límite de detección es menor de 1 nanogramo de

proteína (Merril y col., 1981). Además, la falta de bandas proteicas en lo s geles indica que la

muestra se encuentra libre de otras proteinas contaminantes, lo que facilita la determinación de

la composición aminoacídica de las bacteriocinas parcialmente purificadas.

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DISCUSION

Al comparar la composición aminoacídica de la bacteriocina de Ib . sa/ce 148, obtenida

por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con la de otras bacteriocinas de peso

mnolecular semejante, se obtiene la tabla V.1. De esta tabla se desprende que, al igual que la

lactocina 5 de I b . sa/ce L45 (M0rtvedt y col., 1991), la bacteriocina de I b . sa/ce 148 tiene en su

composición un 50% de aminoácidos apolares, presentando ambas, además, una cierta

similitud en su composición cualitativa pero no cuantitativa, de aminoácidos. De la observación

de la tabla también se desprende que la bacteriocina de L. sa/ce 148 difiere de otras como la

nisina. subtilina y diplococina (Davey y Richardson, 1981), lactacina E (Muriana y

Klaenhammer, 1991) olacarnocina U149 (Stoffels y col., 1992)

La mejor conocida de las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas es la

nisina, de la que no sólo se conoce su composición de aminóacidos sino, además, la

disposición de los mismos en la cadena peptídica. Una característica fundamental que

diferencia a la nisina, subtilina, epidermina (Ailgaier y col., 1986), galliderinina (Kellner y

col., 1988), PepS (Kellner y col., 1989), ¡actocina 5 (M0rtvedt y col., 1991) y carnocina

U149 (Stoffels y col., 1992) de otras bacteriocinas como la diplococina y la lactacina E es la

presencia, en las tres primeras, de aminoácidos modificados postransíacionalmente como la

dehidroalanina, dehidrobutimna, lantionina y beta-metil lantionina. Esto determina que se haya

propuesto el nombre de “lantibioticos” para aquellas bacteriocinas que, como la nisina, posean

tales aminoácidos (Muriana y Klaenhammer, 1991).

En el cromatograma obtenido al análizar por HPLC el hidrolizado de la bacteriocina de

Ib . sa/ce 148 (resultados no mostrados), también se observa la presencia de un pico

cromatográfico que no se corresponde con ninguno de lo s patrones empleados.

239

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DiSCUSION

En nuestro caso fué imposible determinar con exactitud la identidad de este

aminoácido, sin embargo, su elución en la columna cromatográfica, en una posición muypróxima a la glicina, coincide con los resultados obtenidos al analizar, por el mismo sistema de

HPLC, la lactocina 5 (M0rtvedt y col.. 1991) y la carnocina U149 (Stoffels y col., 1992).

Estos autores demostraron que la lantionina eluye precisamente en esta posición, por lo que no

es descabellado plantear la hipótesis de que el aminoácido no identificado de la bacteriocina de

L. sa/ce 148 fuera la lantionina, lo que la convetiría, por definición, en un lantibiótico.

Si bien conviene conocer los aminoácidos que conforman la sustancia inhibidora,

también tiene un gran interés saber la localización o secuencia de dichos aminoácidos en la

estructura proteica. El conocimiento de la secuencia facilitaría la elucidación de los

determinantes antigénicos de esta bacteriocina, así como su donación, mediante técnicas de

amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en vectores genéticos de interés.

Tanto la secuenciación como el estudio de lo s determinantes, forman parte del esquema detrabajo futuro a desarrollar como continuación del actualmente en curso. La caracterización

completa de la bacteriocina de L. sa/ce 1 4 8 y el estudio genético de los mecanismos

responsables de su síntesis, permitirán conocer la relación existente entre su estructura y su

mecanismo de acción, sus relaciones estructurales con las bacteriocinas producidas por otras

bacterias lácticas y, por último, la biología molecular de la producción de bacteriocinas en el

género Lactobacillus.

V. 8. - Mecanismo de acción de la bactem-iocina producida por I b . sa/ce 148

La sustancia inhibidora elaborada por Ib . sa/ce 148 se aparta ligeramnente de la

definición que Tagg y col. (1976) dieron de las bacteriocinas, al considera¡-las como proteinas

o complejos proteicos con acción bactericida en especies bacterianas filogenéticamenterelacionadas con la cepa productora; esto no se cumple en la bacteriocina de I b . sa/ce 148 que,

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DiSCUSION

como hemos visto, posee acción bacteriostática en lodos los microorganismos indicadores

estudiados (Tabla IV. 11).

La primera característica, su naturaleza proteica, se cumple en todas las bacteriocinas

de las bacterias lácticas descritas hasta la fecha. La segunda, su limitado espectro de acción, ya

fué cuestionado por Klaenhammer (1988), quién propuso la división de las bacteriocinas de las

bacterias lácticas en dos tipos: el primero constituido por sustancias con un espectro de acción

limitadoa otras

bacterias lácticas relacionadascon la

cepa productora; aeste grupo, que es

muy

numeroso, pertenecen entre otras, la lactacina E (Barefoot y Klaenhammer, 1983) y F

(Muriana y Klaenhammer, 1991), la lactocina 27 (Upreti y Hinsdill, 1975), la helveticina J

(Joerger y Klaenhammer, 1985), la sakacina A (Sehillinger y LOcke, 1989), y la lactocina 5

(M0rtved y Ness, 1990). El segundo grupo estaría formado por sustancias con un espectro de

acción más amplio en el que. además de las bacterias lácticas, se incluirían otros

microorganismos Gram-positivos como 5. aureus, L. monocytogenes, C. botulinunz y C. pe,f¡-ingens. Pertenecen a este grupo la nisina, la pediocina AcH y la sustancia antimicrobiana

objeto de este trabajo, producida por Ib . sa/ce 148.

En la tercera característica citada por Tagg y col. (1976), el mecanismo de acción

bactericida, es donde mayor es la discrepancia con los resultados de este trabajo.

Efectivamente, tai y como se aprecia en los recuentos microbianos realizados después de tratarvarios cultivos de diversos microorganismos sensibles con un sobrenadante neutralizado y

concentrado deL. sa/ce 148 (tabla IV. 11). el mecanismo de acción de esta bacteriocina es

bacteriostático.

La acción bactericida descrita para las bacteriocinas se produce en dos etapas (Tagg y

col.. 1976). En la primera, la bacteriocina se une a receptores específicos situados en lasuperficie de los microorganismos sensibles. Esta unión altera la permneabilidad de su

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DISCUSION

membrana; en la segunda etapa de su mecanismo de acción se provoca la ruptura de la

membrana y la muerte celular. Esta acción bifásica se ha comprobado mediante examenmicroscópico, al apreciarse cambios morfológicos y posterior lisis celular en las bacterias

sensibles a la nisina (l-Iurst, 1981), plantaricina SIK-83 (Andersson y coL,1988) y lactacina F

(Muriana y Klaenhammer, 1991).

La acción de la nisina se atribuye a su elevada hidrofobicidad, lo que le permite

interaccionar con la membrana bacteriana y originar poros en la misma aumentando supermeabilidad y provocando la muerte celular por estallido (Hurst, 1981). Esta acción, similar

al efecto surfactante de ciertas moléculas hidrofóbicas, es también la causante de la acción

bactericida de la lactacina E (Muriana y Klaenhammer, 1991).

En ocasiones se puede apreciar un efecto bactericida sin que se produzca la lisis

celular, lo que ocurre en el caso de la pediocina AcH, cuyo mecanismo de acción ha sidoestudiadoen profundidad por Bhunia y col. (1991). E sta sustancia ejerce su actividad en varias

etapas: (1) inicialmente se une a receptores inespecificos de la pared celular, posiblemente

ácido lipoteicoico; (2 ) cuando se saturan estos receptores se une a receptores específicos,

originando alteraciones funcionales en la membrana que (3), provocan la pérdida de iones

potasio y la entrada en la célula de moléculas de pequeño tamaño; además, la bacteria pierde su

capacidad de multiplicarse. (4) Solo en algunas cepas especialmente sensibles la pared celularpierde su integridad estructural y el microorganismo se lisa. (5) La resistencia mostrada por

otras bacterias Gram-positivas se debería a ¡a falta o inaccesibilidad de los receptores

específicos y (6) la resistencia de las bacterias Gram-negativas estaría motivada por la carencia

tanto de receptores específicos, como inespecíficos. La lactacina B, que tiene acción

bactericida, tampoco origina alteraciones en la permeabilidad de la membrana ni lisis celular

(Earefoot y Klaenhammer. 1984).

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DISCUSION

Las lactostrepcinas (Dobrzanski y col., 1982), lactacina E (Barefoot y Klaenhammer,

1983> , helveticina J (Joergery Klaenhammer, 1985), sakacina A (Schiljingery LOcke, 1989),

bacteriocina de Leuconostoc gelicluni (Harding y Shaw, 1990), plantaricina A (Daeschel y

col., 1991) y carnocina U149 (Stoffels y col., 1992), junto con las citadas nisina, lactacina F,

plantaricina SIK-83 y pediocina AcH son algunas de las bacteriocinas que, como la mayor

parte de las producidas por las bacterias lácticas, poseen un mecanismo de acción bactericida

independientemente del mecanismo intimo que conduce a la muerte bacteriana.

E] efecto bacteriostático de la bacteriocina de I b . sa/ce 148 contrasta con el bactericida

de la sakacina A, producida por otra cepa de I b . s a L -- e (Sehillinger y LOcke, 1989). Este

resultado refuerza la hipótesis, apuntada al analizar el espectro de acción, de que las

bacteriocinas producidas por distintas cepas de una misma especie no son idénticas entre sí.

Sin embargo esta acción bacteriostática no es única dentro de las bacterias lácticas, yaque este carácter se ha descrito en la lactocina 27 de I b . acidophilus (Upreti y Hinsdill, 1975),

aunque en algunos casos se ha observado un efecto bactericida sobre cepas de Ib .

ínonocytogenes (Raccach y col., 1989); el efecto bacteriostático también se ha descrito en

lactobacilos de origen cárnico identificados como Ib . sa/ce (Ahn y Stiles, 1990a) y en

Leuconostoc gelidurn (Hastings y Stiles, 1991).

Incluso el efecto bactericida atribuido a la pediocina AcH podría no ser tan evidente a

tenor de la observación de los resultados de Ehunia y col. (1988). Según dichos

mnvestigadores, la adición de pediocina AcH a un cultivo de Ib . plantarurn WSO-30 en

crecimiento (con una población inicial de 3 x io7 ufc/ml) originó una disminución de,

únicamnente, 0.8 unidades logarítmicas en el recuento de microorganismos viables efectuado

una hora después de dicha adición. En lo s recuentos realizados a las 3. 5, 7 y 1 1 horas

posteriores, se observa una recuperación, mientras posteriormente se mantienen los valores

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DISCUSION

obtenidos al inicio del experimento (3 x io~ ufc/ml). Mientras tanto, el cultivo control continúa

su crecimiento normal hasta alcanzar valores de 2 x ío ~ ufc/ml. Hasting y Stiles (1991)

obtuvieron resultados similares a lo s anteriormente señalados y. a pesar de todo, adjudicaron

un mecanismo de acción bacteriostático a la bacteriocina producida por Leuconostoc gelidunz

UALl87.

Los resultados de Bhunia y col. (1988) contrastan con los claramente bactericidas de

Schillinger y LOcke (1989) quienes,empleando

un procedimiento idénticoal

nuestro y. muy

similar al de Bhunia y col. (1988), comprobaron que lo s recuentos del microorganismo

indicador (cuya población inicial era deS x i05 ufc/ml), disminuía 3,5 unidades logarítmicas

dos horas después de añadir el sobrenadante libre de células, neutralizado y concentrado de I b

sa/ce Lb706; en recuentos posteriores fué imposible detectarlo. Por otra parte, Ehunia y col.

(1991) señalan, que la bacteria indicadora es incapaz de multiplicarse; la ruptura de la pared

celular y la muerte bacteriana sería un destino reservado únicamente a cepas de

microorganismos especialmente sensibles.

Realmente, es difícil aceptar que ninguna de las cepas que emplemos como

microorganismos indicadores fuera sensible y que la bacteriocina de I b . sa/ce 148 ejerciera una

acción bactericida en otras cepas sensibles; por ello y, a diferencia de Bhunia y col. (1988),

consideramos que la sustancia inhibidora ejerce una acción bacteriostática ya que detiene el

crecimiento de los microorganismos sensibles, disminuyendo su vitalidad y no su viabilidad,

algo que no ocurre en las experiencias de Schillinger y LOcke con L. sa/ce LB706 .

La única bacteriocina de las bacterias lácticas de la que se conoce con exactitud la

formna en que ejerce su acción bacteriostática es L a lactocina 27, que detiene la síntesis proteica

sin afectar la del ADN o ARN, y sin modificar lo s niveles de APT (Upreti y Hinsdill, 1975).

Este mecanismo de acción, diferente del atribuido a otras bacteriocinas. es uno de lo s motivos

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DISCUSION

que hace que cada vez se emplee más el término de “sustancias similares a bacteriocinas” para

referirse a las sustancias antimicrobianas que, como la lactocina 27 o la producida por Ib . sa /ce -

148, difieren en alguna de las propiedades atribuidas a las bacteriocinas clásicas

(Klaenhammer, 1988). En la tabla y. í se señalan algunas propiedades de las bacteriocinas

mejor conocidas, lo que permite comparar las coincidencias y diferencias de nuestra

bacteriocina parcialmente caracterizada y las de aquellas caracterizadas por otros

investigadores.

Nuestros resultados, junto a otros que ponen de manifiesto el efecto bacteriostático de

algunas bacterias lácticas (Upreti y Hinsdill, 1975; Raccach y col., 1989; Ahn y Stiles, 1990a;

Hastings y Stiles, 1991), explicarían porqué persiste pero no se desarrolla Ibisteria

monocytogenes en carne fresca de bovinos y en la carne y productos cárnicos de poílo en

presencia de una flora láctica competitiva Buchanan y col., (1989), Johnson y coL, (1988);

también explicaría el que Shelef (1989) haya observado que I b . monocytogenes no sedesarroua durante la maduración de embutidos elaborados con carne de bovinos.

La concentración inhibidora mínima de la sustancia antagonista parcialmente purificada

de Ib . sa/ce 148 en los diversos microorganismos ensayados (tabla IV. 12), oscila entre 1 y 18

i~gml, siendo las cepas de S. aureus FR1349 y FR1361 las más resistentes a su acción

inhibidora. Los resultados obtenidos sugieren, una vez más, la posible utilidad de las bacteriaslácticas y de sus bacteriocinas como factores de seguridad de la carne y de los productos

cárnicos.

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2 4 7

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DiSCUSION

V. 9.- Propiedades antigénicas de las bacteriocina de I b . sa/ce 148

El conococimiento de las propiedades inmunológicas de las bacteriocinas es interesante

por varios motivos. Primero, paradeterminar su seguridad para el consumidor, esto es,que no

le provoque reacciones alérgicas o indeseables. De otra parte, la obtención de anticuerpos

frente a las bacteriocinas permitiría su detección y cuantificación en las carnes y productos

cárnicos. Asimismo, lo s anticuerpos específicos facilitarían la purificación a homogeneidad de

la sustancia antimicrobiana por técnicas de cromatografía de afinidad, lo que permitiría supurificación en un solo paso, evitando la utilización de otros procedimientos de separación

proteica menos eficaces.

El primer aspecto, la salud del consumidor, parece garantizado ya que el carácter

proteico de la sustancia estudiada, su pequeño tamaño y su sensibilidad a lo s enzimas

proteoliticos hacen pensar que su uso per os, con lo s alimentos, carecerá de peligros para lasalud humana. Posiblemente esta característica es común a todas las bacteriocinas de las

bacterias lácticas, prueba de ello es que una de éstas sustancias cuyas propiedades antigénicas

no son del todo conocidas, la nisina, es la única bacteriocina autorizada en muchos paises para

su uso en alimentos dé consumo humano, ya que se ha demostrado que no origina reacciones

tóxicas en el consumidor (Hurst. 1981). Igualmente la bacteriocina deL. sa/ce 148 carece de

propiedades alergénicas, ya que su inoculación a lo s animales de experimentación no lesproduce reacciones alérgicas ni tóxicas.

En cuanto al segundo aspecto ennumerado, las características antigénicas de las

bacteriocinas, no está suficientemente estudiado ni siquiera en las sustancias mas ensayadas;

no obstante, se sabe que ciertas bacteriocinas de algunas bacterias Gram-negativas poseen

propiedades antigénicas (Gagliano y Hinsdill, 1970; Tubylewicz, 1970; Tagg y col., 1976).

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DISCUSION

Unicamente Ehunia y col. (1990), han evaluado la antigenicidad de la pediocina AcH

de P. acidilacfici, llegando a la conclusión de que la inoculación de esta sustancia a ratones yconejos no genera la síntesis de anticuerpos neutralizantes. La explicación de este fracaso

inmunógeno habría que buscarla, según dichos autores, en el pequeño tamaño molecular de

ésta sustancia (2700 Da) que la haría comportarse como un hapteno; en que las técnicas de

mnmunización o lo s adyuvantes empleados no fueron lo s adecuados o en que el número de

animales de experimentación utilizados fué pequeño.

Además, la calidad del antígeno no era la mas indicada para estas experiencias, ya que

emplearon una bacteriocina parcialmente purificada cuya fracción activa (de 2700 daltons) iba

acompañada de, al menos, 2 proteinas de alto peso molecular visibles por electroforesis en

geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE).

Coincidiendo con nuestros resultados, Bhunia y col. (1990), mediante un sistemainmunoenzimático (ELISA) indirecto, observaron una respuesta inmunológica frente a la

pediocina AcH parcialmente purificada; tal respuesta la atribuyeron a las proteinas de alto peso

molecular, pero sin actividad inhibidora, presentes en la muestra inoculada. En nuestro caso, la

respuesta inmunológica no puede atribuirse a compuestos proteicos de elevado peso molecular,

ya que la electroforesis en geles de poliacrilamida (fig. 4. 40) demuestra claramente que la

preparación estaba libre de sustancias de este tipo.

De los resultados obtenidos, parece deducirse que la sustancia antimicrobiana

parcialmente purificada de I b . sa/ce 148 presenta cierta acción inmunógena, ya que el título de

anticuerpos obtenido en cada una de la sangrías parciales es superior a la anterior (fig. 4. 41).

Además, dicha sustancia puede identificarse y diferenciarse del antígeno empleado corno

control, cuando ambos se disuelven en tampón de PBS (ñg 4 42 ) Sin embargo, fué

imposible la detección de dicha sustancia cuando se añadió al medio de cultivo MM-triptosa

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DISCUSION

debido, posiblemente, a la interferencia provocada por alguno de sus componentes. De los

resultados obtenidos puede concluirse, al igual que hicieron Ehunia y col. (1990), que labacteriocina deL. sa/ce 148 no es detectable mediante el ELISA indirecto cuando se encuentra

disuelta en un medio de cultivo, por lo que quizás sería necesario desarrollar una técnica más

sensible que evitara las interferencias citadas.

En cualquier caso, la respuesta inmunológica de lo s animales de experimentación fué

muy pequeña lo que pudo serdebido, aparte del tamaño de la partícula, a otros condicionantesya citados por Bhunia y col. (1990), como: a) que el número de animales inmunizados no

fuera suficiente para permitir la generalización de las conclusiones; b) que lo s adyuvantes, vías

y protocolos de inmunización no fueran lo s más adecuados o c) que el tamaño de la sustancia,

sea incapaz de generar una respuesta en el organismo receptor. En este caso sería necesario

incrementar la potencia inmunógena conjugándola con sustancias que le otorguen esta

capacidad como, por ejemplo, con la seroalbúmina bovina (BSA).

Las interferencias con otros componentes del medio podrían evitarse empleando otras

variantes del método ELISA. Pero quizá fuera más efectiva la obtención de anticuerpos

monoclonales que, al ser más específicos que los policlonales empleados en este trabajo,

evitarían reacciones indeseables con otros compuestos.

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CONCLUSiONES

CAPITULO VI

CONCLUSIONES

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CONCLUSIONES

1).- Las 1 8 0 bacterias lácticas seleccionadas durante la maduración de u n lote d e

embutidos crudos presentaron actividad inhibidora directa, variable y cuantificable, frente a

diversos microorganismos indicadores. De ellas, 20 manifestaron actividad antimicrobíana

exocelular; dichas cepas s e aislaron e n todas las etapas del proceso d e maduración, desde la

masa cárnica inicial hasta el producto final listo para s u consumo.

2).- Las 6 cepas con mayor actividad inhibidora s e identificaron como Lacrobacillus

sake. Todas s e desarrollaron a 4 y 1 5 oc, pero sólo las cepas 1 4 8 y IT 7 lo hicieron a 45 < ‘C . E l

espectro antimicrobiano d e las 4 cepas con mayor actividad inhibidora sugiere que las

sustancias inhibidoras son diferentes, ya que la sensibilidad d e los distintos microorganismos

indicadores e s variable dependiendo d e la cepa d e L. sake productora.

3).- L. sakc 148 e s capaz d e desarrollarse y producir actividad antimicrobiana

cuantificable a 4, 8 , 1 6 , 2 5 y 3 2 “C. La produción de es ta sustancia depende d e la composiciónde l medio de cultivo, s e detecta al poco t iempo d e iniciarse el crecimiento microbiano y alcanza

sus niveles óptimos a las 1 6 horas d e incubación a 3 2 0C .

4).- Cuando la sustancia antimicrobiana exocelular d e L. sake 148, s e purifica por

liofilización y cromatografía d e filtración e n geles, aumenta muy poco s u actividad inhibidora

específica (7 veces), siendo muy pequeña la recuperación d e la actividad inhibidora original

(8%).

5Y - La sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L saLe 148 t iene

naturaleza proteica, e s estable a valores d e pH comprendidos entre 2,6 y 1 2 , resistente al calor

y bacteriostática frente a los microorganismos sensibles, características que comparte con otras

bacteriocinas de las bacterias lácticas. La fracción activa d e la sustancia antimicrobianaparcialmente purificada por cromatografía d e filtración e n geles, reveló que t iene u n peso

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CONCLUSIONES

molecular de 4.640 daltons. La sustancia parcialmente purificada s e compone de 1 3

aminoácidos; además, y por cromatografía HPLC, s e aprecia un pico que pertenece a un

aminoácido distinto d e los utilizados corno patrones. E s ta compuesto desconocido eluye junto

a la glicina, lo mismo que el aminoácido lanuonina.

6).- Consideramos que la sustancia antimicrobiana d e L. sake 1 4 8 e s bacteriostática,

ya que detiene el crecimiento d e los microorganismos sensibles, pero n o s u viabilidad. Su

concentración inhibidora mínima varía entre 1 y 1 8 mg/mI, dependiendo de losmicroorganismos ensayados.

7).- La inoculación d e la sustancia antimicrobiana a los animales d e experimentación

(conejos) originó una respuesta inmunógena débil. El desarrollo y puesta a punto d e u n ELISA

indirecto no permitió la detección d e la bacteriocina parcialmente purificada e n u n medio d e

cultivo semidefinido (medio d e MM-triptosa).

8).- Las características fisico-quimicas d e la bacteriocina producida por L i. saLe 1 4 8 y

su acción antimicrobiana frente a bacterias patógenas Gram-positivas d e gran interés e n la

industria alimentaria, hacen concebir esperanzas sobre la posible utilidad de las bacterias

lácticas o d e sus bacteriocinas, como factores d e seguridad tanto e n la carne y productos

cárnicos como e n otros sustratos alimentarios diversos.

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TRAUIiIO FUTURO

CAPITULO VII

TRABAJO FUTURO

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TRABAJO FUTURO

Las cepas de L. saLe con actividad antimicrobiana exocelular aisladas y caracterizadas

parcialmente, pueden ser d e gran utilidad e n la inhibición de l desarrollo d e microorganismos

alterantes y patógenos d e la carne y productos cárnicos, a s í como d e otros alimentos. S in

embargo, las condiciones d e u n sustrato alimentario sólido como la carne, son distintos d e las

que s e dan en los medios de cultivo líquidos. Por ello, la síntesis y la actividad de la s

sustancias antimicrobianas d e las bacterias lácticas descritas, deben examinarse e n sistemas

alimentarios reales, máxime ten iendo e n cuenta la incapacidad d e L. saLe 1 4 8 de producir la

actividad antimicrobiana cuando s e desarrolla e n diversos medios d e cultivo. En consecuencia,

parece conveniente acometer estudios tendentes a aclarar los mecanismos responsables de la

estimulación o represión d e la síntesis o actividad d e e s t a s sustancias antimicrobianas.

El empleo de cepas bacteriocinogénicas de L. sake, como cultivos iniciadores en la

elaboración de productos cárnicos, presupone tanto la prevención del desarrollo de

microorganismos indeseables, como un a mayor homogenidad de l proceso fermentativo. Porello, el desarrollo y puesta a punto d e sistemas novedosos d e transformación genética de las

bacterias lácticas, como la electroporación, permitiría introducirles genes que codifiquen

propiedades de importancia tecnológica. Gracias a la tecnología de l ADN recombinante, los

determinantes genéticos d e la p roducción d e bacteriocinas y d e la resistencia a las mismas

podrían utilizarse como marcadores genéticos o como genes d e interés para la producción d e

bacteriocinas como aditivos alimentarios. De aquí que constituya u n objetivo prioritario d e

nuestro trabajo futuro el estudiai-, co n la máxima amplitud posible, las características genéticas

d e los determinantes que codifican la produción d e bacteriocinas e n las cepas d e L i. sake d e

interes.

Otra 1 inca d e nvesti gac ión n tic sería importante desaíro ¡¿ ir ca el futuro e s la

determinación (le la secuencia aruinoacídica ( le la bacteriocina ( le L saLe 148, ya que elconocimiento de s u estructura proteica pemiitiría elucidar el papel que ésta desempeña e n s u

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TRABAJO FUTURO

mecanismo de acción, favorecería el estudio d e lo s determinantes genéticos responsables de s u

síntesis y regulación y, por último, permitiría comparar las relaciones existentes entre

estructura-actividad e n la s distintas bacteriocinas producidas por la s bacterias lácticas.

De otra parte, el bajo poder inmunógeno mostrado por la bacteriocina de L i. sake 148

dificulta s u detección e n los alimentos por métodos inmunoenzimáticos (ELISA), este aspecto

e s fundamental, ya que uno de los requisitos que e s más importante cumplir para que s e

autorize la adición de e s t a bacteriocina a los alimentos e s , prec isamente, que s e pueda detectar

y cuantificar después d e incorporarse a los mismos. Por este motivo, s e pretende mejorar la

capacidad antigénica de e s t a sustancia empleando métodos d e inmunización alternativos, entre

los que s e incluiría s u conjugación a otras moléculas e , incluso, la obtención de anticuerpos

monoclonales específicos. Es necesario desarrollar y poner a punto otras variantes de la s

técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) empleadas e n el presente trabajo para permitir la

detección y cuantificación de la sustancia antimicrobiana d e interés e n diversos sustratosalimentarios. Asimismo, los anticuerpos específicos podrían permitir la purificación a

homogeneidad de la sustancia antimicrobiana, por cromatografía d e afinidad, lo que permitida

s u purificación e n u n solo paso y evitada la utilización d e otros procedimientos de separación

proteica menos eficaces.

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BIBLIOCRA E/A

CAPITULO VIII

BIBLIOGRAFíA

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