Medida de la actividad enzimática

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: MEDIDA POR MÉTODOS CONTINUOS Y DISCONTINUOS.

Salvo para unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas

espectroscópicas directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reacción. Además, la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia para la investigación y análisis de proteínas.

La figura 1 muestra una curva típica de formación de un producto (P) en función del tiempo para una reacción catalizada enzimáticamente. Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo, hecho que puede deberse a las siguientes causas:

Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima El transcurso de la reacción produce una

disminución significativa de la concentración de sustrato (S)

La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al aumentar la concentración de P

La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad inicial, esto es, obtener la tangente al origen del gráfico mostrado en la figura 1. De esta manera, las diferentes causas que producen la disminución de la actividad con el tiempo son eliminadas.

La figura 2 ejemplifica medidas experimentales

de la formación de P en función del tiempo (como en la fig.1), determinadas a tres concentraciones diferentes de S. Puede observarse que la velocidad (v) que se obtendría en cada caso dependería del intervalo de tiempo que se tomara para medirla.

En este ejemplo, si medimos v para cuando S=S1, obtendríamos el mismo valor, independientemente de haber elegido el intervalo 0-1 o el 1-2. En cambio para S=S2, la v obtenida sería distinta según el intervalo elegido. Para estos dos casos, la v podría calcularse adecuadamente eligiendo el intervalo 0-1, donde la formación de P es función lineal con el tiempo. Para el ejemplo de la figura 2, la medida de v, cuando S=S3, usando el intervalo 0-1, no es enteramente confiable ya que se necesitan más puntos experimentales que verifiquen la condición de linealidad en la estimación de v realizada.

Figura 1

Tiempo

0 2 4 6 8 10

P

0

2

4

6

8

Figura 2

Tiempo

0 1 2 3 4 5

P

0

1

s1

s2

s3

Medida de la actividad enzimática

2

2

250 350 400λ(nm)

NAD(P)+

NAD(P)H

Coef.deextinción

Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo, hay que tener en cuenta que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la fuerza iónica, el pH, la concentración de S, la cantidad de enzima en el medio de medida. Todos estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de actividad enzimática.

La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la aparición de un P de la reacción en función del tiempo. La determinación cuantitativa de S o de P puede hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos (los más comunes), volumétricos, potenciométricos, radioquímicos, espectrofluorométricos. Independientemente del método utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una reacción enzimática: Sa + Sb P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros componentes de la mezcla de reacción. En este caso, la reacción enzimática podría seguirse continuamente en función del tiempo. En consecuencia, podrían obtenerse numerosos puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la producción de Q en función del tiempo, a partir de un único medio de reacción. Esto es lo que se denomina método continuo de medida de la actividad enzimática.

Los ejemplos típicos de métodos continuos

empleados para medir actividad los constituyen las deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como coenzima. Estos métodos se basan en que la forma reducida de la coenzima (NAD(P)H), pero no la forma oxidada (NAD(P)), absorbe a 340nm (la Fig. 3A muestra los espectros de absorción del NAD+ y del NADH).

Así, la actividad de la Lactato deshidrogenasa:

piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+

podría seguirse por un método continuo midiendo la disminución de absorbancia a 340nm, con lo que se obtendría la curva mostrada en la figura 3B.

En ciertos casos, aunque no haya una propiedad analítica diferencial de un S o de un P que permita su dosaje continuo, aún puede medirse la actividad de una enzima por un método continuo si se acopla otra reacción enzimática a la de la enzima en cuestión. Por ejemplo, la actividad de la piruvato quinasa (PK) podría medirse en forma continua por un método que utilice a la LDH como enzima acoplada de forma que se dose el piruvato producido por acción de la PK:

Fosfoenolpiruvato + ADP piruvato + ATP (PK) Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+ (LDH)

Si las cantidades de LDH y de NADH

Figura 3

Tiempo (min)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Abs

340n

m

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

B

Figura 3 A

Medida de la actividad enzimática

3

3

agregadas al medio de reacción son los suficientemente elevadas, la disminución de la absorbancia a 340nm va a medir la velocidad de producción de piruvato por parte de PK.

En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse determinando continuamente un dado S o P en presencia de los demás componentes del medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere detener la reacción enzimática. En estos casos se utilizan métodos discontinuos, en los que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reacción diferente. Por ejemplo, la actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa:

ADPGlc + PPi Glc1P + ATP, puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la formación de ATP radioactivo. Si no se separa el ATP formado del PPi que no reaccionó no se observa cambio de la radioactividad en el medio de reacción. Para determinar cuánta radioactividad está en forma de ATP es necesario detener la reacción enzimática y separar el ATP del PPi. De esta forma, para tener una curva de ATP formado en función del tiempo, es necesario preparar tantos medios de reacción como puntos experimentales se deseen.

Un método discontinuo puede comprender también aquel en el que el dosaje de un S o P no implique su separación del medio de reacción, sino su reacción química en condiciones que afectan la actividad de la enzima. Por ejemplo, la actividad de la fosfoglucosaisomerasa:

Glc6P ∏ Fructosa6P podría medirse dosando Fru6P por el método de Roe. Pero las condiciones del método de dosaje hacen que necesariamente se detenga la reacción enzimática con cada medida de Fru6P. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto experimental de cantidad de Fru6P producida.

Nótese que, en general, el uso de un método continuo brinda con mayor facilidad un número elevado de medidas de variación de S o P en función del tempo (inclusive puede tenerse un trazo continuo) que un método discontinuo. Por esto, y teniendo en cuenta lo antes mencionado sobre la variación de v en función del tiempo, al usar un método discontinuo para medir actividad enzimática hay que ser particularmente cuidadoso para estar seguro de medir velocidades iniciales.