UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

Práctica No. 6

ABSORCIÓN DE GLUCOSA

Grupo 7

Laboratorio de Fisiología

Integrantes

Campos Maya Diana Laura

Juárez Salas Blissa Alondra

Martínez Carranza Rodolfo

Ortiz Jiménez Diana Jazmín

Sánchez Vázquez Vania A.

Ramírez Parra Vanesa

OBJETIVOS

Verificar el transporte de glucosa a través del intestino delgado de rata (íleon). Demostrar de que manera influye la oxigenación en la absorción intestinal. Determinar el efecto del 2-4 dinitrofenol en la absorción intestinal en la glucosa.

HIPÓTESISLa absorción de glucosa es impulsada por un gradiente de Na+, formado por la acción de la Na+/K+-ATPasa y la hidrólisis de ATP, y la formación de ATP a través de la fosforilación oxidativa depende de la presencia de O2, por lo que la falta de oxigenación disminuirá la producción de ATP así como la absorción de la glucosa.

Debido a que el transporte de glucosa a través del la mucosa intestinal requiere de un consumo de energía, éste se verá afectado por el efecto del 2-4 dinitrofenol, desacoplador de la fosforilación oxidativa.

DIAGRAMA DE FLUJO.

Preparación de sacos intestinales.

Se sacrifica la rata por medio de administración de pentobarbital seguida de trasección de la médula espinal Abrir el abdomen y extraer el intestino delgado.

Cortar tramos de intestino con 2 a 3 cm de longitud, insertar una cánula en la luz del segmento intestinal y, por medio de una jeringa que contenga solución salina de Tyrode, lavar los segmentos intestinales.

Sostener con unas pinzas el saco intestinal e introducir por su extremo abierto el tubo de vidrio d la cámara de órganos aislados hasta que sobrepase unos 5 mm, se amarra cuidadosamente este extremo a la varilla

Se anuda con un hilo uno de los extremos del segmento de manera que quede ocluido completamente; con ayuda de una varilla de vidrio se impulsa el extremo ocluido hacia el extremo abierto, deslizándolo por la varilla

Se procede a colocar el saco intestinal en la cámara de órganos aislados para hacer los experimentos con las diferentes soluciones.

Experimento control.

Toma de muestra.

Llenar uno de los sacos intestinales con solución Tyrode a 37 °C, utilizando una cánula acoplada a una jeringa o una pipeta Pasteur, después de verificar que el saco no presenta fugas.

Sumergirlo en una solución Tyrode con glucosa al 2% a 37°C, teniendo cuidado de que la solución no sobrepase el borde superior del saco.

Acoplar el sistema de aeración. La preparación debe estar en baño de maría para mantener constante la temperatura

Tome una muestra, tiempo cero, tanto de la solución exterior como de la interior del saco intestinal, utilice una cánula conectada a una jeringa o una pipeta Pasteur

Utilizando las tiras reactivas determinar la concentración de glucosa en las muestras; deje pasar 15 minutos y mida nuevamente la concentración de glucosa, sólo de una muestra del interior del saco.

Hacer determinaciones cada 15 minutos hasta completar 5; en el tiempo de la última determinación mida nuevamente la concentración de glucosa en el exterior del saco

Verificar que las condiciones de aeración y temperatura se mantengan constantes durante todo

Efecto de la ausencia de oxígeno en la absorción intestinal de glucosa.

Efecto del 2-4 dinitrofenol en la absorción intestinal de glucosa.

Determinación de glucosa por medio de tiras reactivas.

RESULTADOS.

Colocar un saco intestinal que contenga en su interior solución salina de Tyrode a 37C dentro de una cámara que contenga solución salina de Tyrode-glucosa a 37C.

La preparación se mantiene sin adaptar el sistema de aeración pero manteniendo la temperatura constante

Se hacen determinaciones de glucosa de la solución interior y de la exterior del saco y proseguir con las determinaciones en la misma forma y en los tiempos descritos

Llenar el saco intestinal con una solución de Tyrode a 37C, en este caso el saco se colocará en una solución de Tyrode-glucosa con 2-4 dinitrofenol (solución exterior).

Colocar un saco intestinal en una cámara de órganos aislados

Se mide la concentración de glucosa en el tiempo cero dentro y fuera del saco intestinal .

Se realizan 5 determinaciones cada 15 minutos.

Obtener una gota de la solución problema, ya sea la del interior del saco intestinal o de la solución exterior, por medio de una cánula limpia conectada a una jeringa

Colocar la gota de la solución problema en la zona reactiva de la tira y se deja reaccionar durante el tiempo establecido por el fabricante de la tira (el tiempo necesario para la reacción está indicado en el recipiente de las tiras y puede variar.

El cambio de color se efectuará de acuerdo con la concentración de glucosa presente en la muestra y éste deberá ser comparado con la

escala cromática

Los resultados que aparecen después de 3 minutos o sólo en los bordes de la zona de prueba no tienen significado confiable

Tabla 1. Valores obtenidos de concentración de glucosa

Tiempo (min)

Control (glucosa + oxigeno) Glucosa + 2-4dinitrofenol + oxigeno

Glucosa

0 0 0 010 2.8/5 5.5/100 0 - 2.8/515 2.8/5 - 5.5/100 5.5/100 5.5/10020 5.5/100 2.5/50-5.5/100 5.5/10025 ------ 2.8/50 2.8/50

Para la construcción de las gráficas se le asignó un valor a cada uno de los intervalos de concentración. 2.8/5=1 5.5/100=2

Gráfica 1. Control (glucosa + oxigeno)

0 5 10 15 20 250

0.5

1

1.5

2

2.5

Gráfica 2. Glucosa + 2-4dinitrofenol + oxigeno

0 5 10 15 20 25 300

0.5

1

1.5

2

2.5

Gráfica 3. Glucosa/Ausencia de oxígeno

0 5 10 15 20 25 300

0.5

1

1.5

2

2.5

Reacción enzimática que se produce en una tira reactiva para la detección de glucosa

La glucosa se oxida, para producir ácido glucónico y peróxido, en presencia de la glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno reacciona con el chromogen de potasio yoduro. La extensión en la que el cromogeno es oxidado produce la coloración en la tira reactiva (verde-marrón).

ANALISIS DE RESULTADOS

Control / glucosa y oxígeno

En el experimento control las condiciones de temperatura y la aeración se mantuvieron constantes. Observamos cómo es que se lleva a cabo la absorción de glucosa en el intestino delgado (íleon), sin la intervención de factores que afecten su transporte desde la luz intestinal hacia el enterocito, y determinamos que el movimiento de la hexosa se llevaba a cabo del exterior al interior del saco intestinal mediante el uso de tiras reactivas de detección de glucosa. En el tiempo cero se determinó, que la concentración glucosa en el exterior era de 5.5/100; mientras que en el interior la concentración de glucosa era 0 ya que fue llenada sólo con solución Tyrode. Observando la Gráfica 1. Control (glucosa + oxigeno), notamos que la absorción de glucosa aumenta constantemente, por lo que en el exterior disminuye.

La glucosa entra en las células epiteliales intestinales en contra de su gradiente de concentración por medio de un mecanismo de cotransporte dependiente de Na+. El ion sodio, es el que da la fuerza para que la glucosa se mueva hacia el interior de la célula. El gradiente electro químico del Na+ se mantiene por la acción de la bomba de Na+ y K+, la cual utiliza ATP como fuente de energía. Una vez que entraron la glucosa y en Na+ en la célula, el ion es bombeado al exterior de nuevo. La glucosa continúa su recorrido y se mueve, por gradiente de concentración, hacia los vasos sanguíneos intestinales y cruza la membrana basolateral, posteriormente llega a los capilares y los atraviesa por difusión.

Sabemos que la absorción de glucosa requiere de ATP para que ésta se pueda llevar a cabo, pero como veremos en los siguientes dos experimentos, hay condiciones en que inhiben la producción de ésta fuente de energía y por tanto el proceso de absorción se ve interrumpido.

Glucosa / Ausencia de oxigeno

La ausencia de oxígeno en el medio influirá en el simporte de la glucosa, bajo el siguiente fundamento:

En el proceso de respiración celular, más específicamente en la cadena de transporte de electrones, en el último paso de ésta, el Complejo IV, o también llamado citocromo oxidasa, transporta electrones del citocromo c hacia el O2 molecular reduciéndolo a H2O . En total 4 electrones son transferidos y a este proceso se acopla una translocación de protones a través de la membrana mitocondrial originando un gradiente electroquímico que la enzima ATPsintasa utiliza para sintetizar ATP.

La reacción global es la siguiente:

4 Fe2+-citocromo c + 8 H+in + O2 → 4 Fe3+-citocromo c + 2 H2O + 4 H+

fuera

Al no haber oxígeno en el medio no se puede llevar a cabo el proceso anteriormente descrito, lo que provoca que al no haber un gradiente de protones (H+) la ATPsintasa no pueda llevar a cabo su función, a nivel de absorción de glucosa esto afecta debido a que al no haber ATP disponible en las células, la Bomba de Na+/K+ no lleva a cabo su función provocando que el Na+ no salga de los enterocitos, de éste modo al no existir un gradiente de Na+ no se puede llevar a cabo el simporte de glucosa.

A nivel experimental, más específicamente en un gráfico podríamos observar que en cierto punto la concentración de glucosa en la célula se mantiene constante, sin embargo el comportamiento que se observa es un tanto diferente, ya que existe un decaimiento en la concentración de la misma. Al buscar explicación a esto, una primera opción fue que se había roto el intestino, pero al pensar mejor esta hipótesis se llega a la conclusión de que si este fuera el caso, la concentración dentro del saco (intestino) sería mayor esto debido a que se daría una difusión simple en el medio, al no haber nada que limitará la entrada de la solución Tyrode.

Otra hipótesis para tratar de explicar el evento es que las células al no contar con la moneda energética trataron de empezar la respiración celular, lo cual propició un descenso en la concentración de la glucosa, debido a la glucolisis, esta hipótesis se podría comprobar al hacer una medición de pH o una prueba para el piruvato

Glucosa + 2-4dinitrofenol + oxigeno

A continuación, se muestra la molécula del 2,4-dinitrofenol.

El dinitrofenol (DNP) es un agente desacoplante, porque tiene la capacidad de aislar el flujo de los electrones y el bombeo de H+ de la síntesis de ATP. Esto significa que la energía de la transferencia de electrones no se puede usar para la síntesis de ATP. Hace 50 años, se suministraba DNP como un fármaco para ayudar a los pacientes a perder peso.

En la fosforilación oxidativa, el flujo de electrones desde el NADH y el FADH2 hasta el oxígeno conduce al bombeo de H+ desde la matriz hacia el espacio intermembranoso. Este gradiente de H+ puede producir ATP cuando pasa a través de la ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna.El dinitrofenol disipa el gradiente de H+, reduciendo la producción de ATP. Bajo estas codiciones, los alimentos que se comen no se usan para producir ATP, lo que hace perder peso. Sin embargo, un exceso de inhibidor puede rebajar demasiado el nivel de ATP hasta un límite incompatible con la vida. La diferencia entre la pérdida de peso y la muerte está sólo en una pequeña diferencia en la concentración de dinitrofenol, por lo que este compuesto es peligroso.

En el experimento control (tabla 1), donde se mantuvieron condiciones de aeración y temperatura constantes durante todo el experimento, se observa que al transcurrir el tiempo la concentración dentro del intestino incrementa mientras que la concentración fuera del intestino disminuye.

Al estudiar el efecto de la oxigenación en el paso de glucosa a través de la mucosa intestinal se observa un cambio en la concentración dentro del intestino muy pequeña en el intervalo de 20 minutos, ya que en el minuto cero, al introducir el intestino en la solución Tyrode con glucosa, la tira de glucosa no detectó ninguna concentración de glucosa y en el minuto 20 registró una concentración de 0.1g/dL.

Con respecto al tercer experimento donde se estudia el efecto del 2-4 dinitrofenol en la absorción intestinal de glucosa no hubo ningún cambio en la concentración ni dentro ni fuera del intestino.

CONCLUSIONES

Bibliografia.

http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp10a.pdf

http://www.facmed.unam.mx/publicaciones/ampb/numeros/2007/02/e_TranspoGlucosa.pdf