Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

6a.

Editores:

CoordinaAutores:

Diagnósticomicrobiológico de lainfección por el VIH

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Emilia Cercenado y Rafael Cantón

dor: Juan Carlos López Bernaldo de QuirósRafael Delgado VázquezFederico García GarcíaJosé María Eiros BouzaJuan Carlos López Bernaldo de QuirósRaul Ortiz de Lejarazu

ISBN: 84-611-3538-5

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INDICE DEL DOCUMENTO CIENTIFICO1. Introducción2. Diagnóstico serológico

2.1. Condiciones del laboratorio y precauciones con las muestras2.2. Objetivos de las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH2.3. Características operacionales de las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH2.4. Pruebas de cribado de anticuerpos frente al VIH2.5. Pruebas de confirmación de la presencia de anticuerpos frente al VIH2.6. Estrategias de cribado y confirmación2.7. Problemas en el cribado y confirmación. Algoritmo de decisión

3. Detección de la viremia plasmática del VIH (carga vírica plasmática –CVP-)3.1. Técnicas disponibles3.2. Indicaciones

3.2.1. Monitorización del tratamiento antirretroviral (ARV)3.2.2. Predicción de progresión en pacientes crónicamente infectados3.2.3. Valoración del riesgo de transmisión3.2.4. Diagnóstico de infección aguda

3.3. Obtención y manejo de las muestras3.4. Carga vírica en LCR, semen y otros fluídos3.5. Interpretación de los resultados

3.5.1. Resultados y variabilidad3.5.2. Factores que aumentan la carga vírica plasmática (CVP)3.5.3. Episodios cortos de aumento de la CVP (Blips)3.5.4. CVP indetectable en pacientes infectados pero sin tratamiento3.5.5. Viremia detectable por debajo del umbral de 50 copias/mL

4. Detección de resistencias4.1. Técnicas genotípicas

4.1.1. Secuenciación de ácidos nucleicos4.1.2. Otros ensayos genotípicos4.1.3. Interpretación del genotipo

4.2. Técnicas fenotípicas4.2.1. Método de sensibilidad del virus en células mononucleadas de sangre periférica (CMSP)4.2.2. Técnicas con virus recombinantes4.2.3. Interpretación del fenotipo

4.3. Predicción del fenotipo a partir del genotipo: fenotipo virtual4.4. Indicaciones de las pruebas de resistencia4.5. Limitaciones de las pruebas de resistencia

5. Bibliografía

DOCUMENTOS TÉCNICOSPNT-VIH-01. Diagnóstico serológico de la infección por el VIHPNT-VIH-02. Determinación de la carga vírica plasmática (CVP) del VIH-1PNT-VIH-03. Secuenciación de ácidos nucleicos para la detección de resistencias a antirretrovirales

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

6a. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR EL VIH. 2006

Coordinador: Juan Carlos López Bernaldo de Quirós

Autores: Rafael Delgado VázquezFederico García GarcíaJosé María Eiros BouzaJuan Carlos López Bernaldo de QuirósRaul Ortiz de Lejarazu

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1. INTRODUCCIÓNEn el año 2006 se cumplen los 25 años de la

primera descripción de lo que posteriormenteconstituiría el llamado Síndrome deInmunodeficiencia Adquirida. Pocos meses despuésde la descripción de este síndrome se descubría elVirus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) y seabría la puerta para el diagnóstico microbiológico dela enfermedad. Durante estos años la epidemia noha dejado de crecer y nuestro país no ha sido ajenoa este hecho. En la actualidad se calcula que enEspaña existen alrededor de 150.000 personasinfectadas por el VIH. Afortunadamente el número denuevas infecciones ha bajado, pero la generalizaciónde los tratamientos antirretrovirales de gran eficaciaha condicionado que aunque exista una tendencia alestancamiento de la enfermedad, la atenciónasistencial que precisan ha aumentado al tener unamayor expectativa de vida.

Los laboratorios de microbiología han tenido quehacer un gran esfuerzo para adaptarse a lasdemandas clínicas que requieren estos enfermos. Sidurante los años 80 y 90 se tuvieron que desarrollare implantar nuevas técnicas para el diagnósticomicrobiológico de las infecciones oportunistas,durante el final de los años 90 y el comienzo de estadécada se ha generalizado el uso de lasdeterminaciones de la carga vírica plasmática y de ladetección y análisis de las mutaciones que confierenresistencias a los fármacos antirretrovirales.

El presente procedimiento constituye la segundaedición del “Diagnóstico microbiológico de lainfección por el VIH” y en él se han intentado reflejary actualizar las principales tareas y cometidos que unlaboratorio de microbiología debería tener pararealizar la atención integra al paciente infectado porel VIH. Su objetivo ha sido orientar de formaconceptual y práctica la metodología empleada en eldiagnóstico y seguimiento de la infección por el VIH.A efectos prácticos se ha dividido en 3 apartadosclaramente diferenciados.

En primer lugar se analiza y actualiza eldiagnóstico serológico, que aunque es el terreno enel que, quizás, se han producido menores cambios,sí que hay novedades y actualizaciones que merecela pena ser resaltadas respecto a la anterior edición.El cribado de anticuerpos continúa siendo el métodomás comúnmente empleado para el diagnóstico delaboratorio de la infección por el VIH. A pesar de losavances logrados en el desarrollo de estas pruebasse siguen produciendo casos de falsos positivos yfalsos negativos, atribuibles al enorme crecimientode esta demanda analítica dentro de la asistenciaclínica. La importancia de estos hechos es obvia,pudiendo provocar situaciones que generanansiedad en los pacientes y desconcierto en losprofesionales encargados de dicho diagnóstico.

En una segunda parte se describe ladeterminación de la carga vírica plasmática (CVP),técnica que ha experimentado un enorme desarrollo.En la infección por el VIH, más que en ningún otroproceso infeccioso, la cuantificación y monitorizacióndel agente tiene un extraordinario valor informativo.

La determinación de la CVP mediante lacuantificación del ARN vírico por métodos de biologíamolecular es una herramienta clave en el manejo depacientes infectados fundamentalmente por su valorpronóstico y evolutivo. Dicho valor quedó claramenteestablecido al confirmar su consistencia comoparámetro independiente de desarrollo de SIDA yrespuesta a tratamiento. Las técnicas para sucuantificación mediante RT-PCR y bADN estánactualmente disponibles desde el punto de vistacomercial y pueden llegar a alcanzar un nivel desensibilidad de al menos 50 copias por mililitro.

Finalmente, un tercer apartado que se introducepor primera vez en el Procedimiento es el estudio delas resistencias a los fármacos antirretrovirales. Yadesde el mismo momento de la introducción de lazidovudina en monoterapia se observó que el virusera capaz de hacerse resistente a dicho fármaco através del desarrollo de mutaciones en el gen de latransciptasa inversa. En la actualidad la resistencia alos fármacos antirretrovirales constituye una de losprincipales problemas en el manejo clínico diario,calculándose que alrededor del 40% de los pacientestienen algún tipo de resistencia a los 6 años del iniciode la terapia antirretrovírica (TAR). La granimportancia que esta adquiriendo la detección y elestudio de las resistencias a estos fármacosjustifican su inclusión en este procedimiento yprobablemente se convierta en los próximos años enuna de las piedras angulares del diagnósticomicrobiológico de la infección por el VIH.

2. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO2.1. CONDICIONES DEL LABORATORIO YPRECAUCIONES CON LAS MUESTRAS

Los laboratorios que realicen diagnóstico deanticuerpos frente al VIH en suero deben observarlas normas de seguridad de nivel 2. Todas lasmuestras deberán considerarse comopotencialmente infecciosas para evitar el manejo dealgunos sueros con precauciones distintas omenores. Esto implica la necesidad de trabajar conguantes en todos los procesos, pipeteado mecánico,utilización de contenedores de seguridad biológicapara desecho de fómites, muestras y reactivos asícomo observación de normas y precaucionesconsideradas como bona praxis. Las superficies detrabajo deberán descontaminarse con desinfectantes(alcohol-acetona al 70% v/v, lejía, detergentes,incluido el jabón, etc.) activos contra el VIH.

Los sueros se deben recoger en la forma habitualy evitar mantenerlos más de 24 horas a temperaturaambiente. Para minimizar las contaminacionesmicrobianas se recomienda usar tubos estériles y noconservarlos a +4ºC más de 72 horas. Para periodosde conservación más prolongados se deben utilizartemperaturas de –20º y –70ºC, sobre todo si seprevé la necesidad de detectar antígeno p24 u otroscomponentes estructurales del VIH, ya que estosúltimos se desnaturalizan paulatinamente atemperaturas superiores a –70ºC. Los sueros nodebieran inactivarse por calor por las razonesexpuestas.

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Existen centros que realizan la extracción desangre en el mismo laboratorio por personalentrenado para ello, en otros se confía dicha tarea apuntos de extracción comunes para todos loslaboratorios del hospital y, en casi todos, se recibenmuestras de suero que se han obtenido sin que ellaboratorio que realiza las pruebas diagnósticas delVIH tenga posibilidad de supervisar los métodos ypautas de extracción, conservación o el tratamientoprevio de los sueros. A este respecto cabe señalar laimportancia de una correcta y cuidadosaidentificación de los pacientes y su correspondientesuero cuando el objetivo sea el diagnóstico del VIH.La relación de confianza entre los pacientes y elpersonal sanitario hace que, en ocasiones no severifique de forma fehaciente la identidad de lapersona que acude a realizarse el análisis. Esteproceder cuando se refiere a pruebas de diagnósticodel VIH, basadas en el consentimiento informado porparte del paciente, tiene gran trascendencia paraevitar lo que denominamos errores en la extracción eidentificación de sueros y pacientes. Los laboratoriosque reciben y almacenan gran número de suerospara realizar determinaciones de anticuerpos anti-VIH deben asegurar un sistema de registro que evitecoincidencias y confusiones.

Todas estas condiciones y precaucionesobservadas de forma sistemática, constituyen elprimer peldaño para la ejecución correcta de laspruebas para el diagnóstico de la infección por elVIH.

2.2. OBJETIVOS DE LAS PRUEBAS DEDETECCIÓN DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIH

La Organización Mundial de la Salud (OMS)definió hace años, de manera clara y sucinta cualesson los objetivos de las pruebas de detección deanticuerpos frente al VIH. La mayoría de casos osituaciones en la práctica diaria del laboratoriopueden ser incluidos en uno de los siguientesapartados: seguridad biológica (cribado de donantesde sangre, órganos, semen, óvulos,…), diagnósticode la infección por el VIH, vigilancia epidemiológica einvestigación.

Los objetivos que se persiguen con el diagnósticoinfluyen en la elección de la técnica apropiada, en laactitud del profesional de laboratorio ante unresultado y en la estrategia o algoritmo deconfirmación. De forma conceptual se denominanpruebas diagnósticas a las que se emplean deforma individualizada en el suero de una personabajo los principios clínicos de consentimientoinformado y sirven para la identificación clínicade un paciente como infectado o no infectado porel VIH. Cuando las pruebas se aplican en virtud decriterios de seguridad biológica, vigilanciaepidemiológica o investigación y el objetivo principalno es el diagnóstico clínico de infección por el VIH,las denominamos pruebas de detección deanticuerpos frente al VIH en sentido estricto y enestos casos se pueden emplear con éxito muestrasalternativas al suero. Como veremos más adelante,esta distinción, aparentemente semántica,

condiciona la utilización de las pruebas de detecciónde anticuerpos frente al VIH de forma coordinada ysecuencial.

En todo caso, las pruebas habituales dedetección de anticuerpos frente al VIH constituyen unprimer escalón en el diagnóstico de la infección poreste virus y se aplican en la práctica clínica a un grannúmero de sueros. Así la sencillez y la posibilidad deautomatización son cualidades que deben tenerse encuenta a la hora de elegir una prueba en particular.

2.3.- CARACTERÍSTICAS OPERACIONALES DELAS PRUEBAS DE DETECCIÓN DEANTICUERPOS FRENTE AL VIH

La sensibilidad y la especificidad son losparámetros más importantes para valorar una pruebay, en el caso de la aplicación clínica de las pruebasutilizadas para el diagnóstico de la infección por elVIH son muy importantes el valor predictivo positivo(VPP) y el valor predictivo negativo (VPN).

La sensibilidad de los equipos actuales haalcanzado límites máximos; es frecuente leerartículos en los que se mencionan sensibilidades deun 99-100% para el conjunto de muestrasensayadas. Conviene señalar sin embargo lasdificultades de alcanzar una sensibilidad real del100% en una infección en la que la seroconversiónocurre en un lapso de tiempo de 2 a 4 semanas en lamayoría de los casos y, a veces, hasta varios meses(“período ventana”). Cabe recordar a este respecto laposibilidad de encontrar individuos infectados por elVIH que son seronegativos debido a causasorgánicas o a defectos inmunes (falsos negativos).

Es bien conocido que el incremento de lasensibilidad lleva aparejado un descenso de laespecificidad (falsos positivos); aunque las técnicasactuales ofrecen cifras de especificidad en torno al99%, el aumento espectacular que ha experimentadola demanda analítica de pruebas de diagnóstico de lainfección por el VIH hace que los hallazgos de falsospositivos de anticuerpos frente al VIH sean cada vezmás frecuentes, a pesar de las mejoras técnicasintroducidas en las pruebas primarias de detecciónde anticuerpos frente al VIH.

Por otra parte la prevalencia de la infección por elVIH entre la población estudiada condiciona losvalores predictivos. A menor prevalencia, el VPPdisminuye o, dicho de otra manera, mayor es laprobabilidad de que se produzcan resultados falsospositivos en una población con bajas tasas deinfección por el VIH. En muchos centros en los quese realizan las pruebas de detección del VIH elporcentaje de sueros positivos ha descendido en losúltimos años hasta 10 veces respecto a losencontrados hace 15 ó 20 años cuando se inició eldiagnóstico de este virus. Las causas de estefenómeno son variadas y cabría citar entre ellas: elaumento de la sensibilidad hacia la infección por elVIH por parte de los sanitarios, la existencia deprotocolos específicos de cribado serológico en losenfermos renales, hemodializados, exposiciónaccidental, control de las mujeres gestantes e,incluso, en las pruebas analíticas preoperatorias,

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estrategia esta última de cuestionable utilidad. Todasestas situaciones clínicas han propiciado un aumentosustancial de la demanda analítica de pruebas paradiagnosticar la infección por el VIH y un descenso enla tasa de positividad total, por lo que el riesgo detener resultados falsos positivos en el escalónprimario del diagnóstico es más elevado que antes.Por ello cualquier laboratorio que ponga en marchaeste tipo de técnicas deberá contar entre susprocedimientos de laboratorio con una estrategia oestrategias de confirmación.

2.4.- PRUEBAS DE CRIBADO DE ANTICUERPOSFRENTE AL VIH

Las pruebas de detección habituales deanticuerpos frente al VIH han experimentado un

considerable desarrollo y mejoras desde su aparicióninicial. Básicamente las mejoras han afectado,principalmente, al antígeno o antígenos utilizados enel ensayo y al principio técnico en el que sefundamentan dichas reacciones.

La mayoría de las primeras técnicas utilizaronantígenos víricos crudos más o menos purificadosdenominados “lisados víricos“. Estos antígenoscontenían gran cantidad de proteínas procedentesdel sistema celular en el que se había cultivado elvirus. La posibilidad de una reacción inespecífica delsuero con algunos de estos componentes constituyóun problema que hizo obligado el empleo de pruebasde confirmación. En la Tabla 1 aparece la evoluciónde los antígenos que se han ido incorporando a losequipos de detección de anticuerpos frente al VIH.

Tabla 1. Antígenos empleados en las pruebas de detección primaria de anticuerpos frente al VIH

Técnica AntígenoEIA 1ª generaciónEIA 2ª generaciónEIA/ELFA 3ª generación

EIA/ELFA 4ª generación

Lisado vírico VIH-1Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y antígeno VIH-1del grupo “O” (outlayer o marginal)Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y VIH-1 “O” yanticuerpos para detectar el antígeno p24

EIA: enzimoinmunoanálisis; ELFA: enzime-linked fluorescent assay

La evolución de los antígenos incluidos en laspruebas de detección de anticuerpos frente al VIH hapermitido por una parte incrementar la sensibilidadsin merma de la especificidad y por otra ha hechoposible la detección de anticuerpos frente tipos ysubtipos del VIH que escapaban a los equipos dediagnóstico habituales. A pesar de las mejorasintroducidas en los equipos actuales, debe tenerseen cuenta la posibilidad real de encontrar sueros depacientes infectados por subtipos inusuales del VIH,sobre todo en pacientes africanos o en personas conestancias prolongadas en ese continente.

Respecto al principio técnico que emplean, cabemencionar que la gran mayoría están basados en elenzimoinmunoanálisis (EIA): indirecto, en sandwich yde captura. Existen EIA competitivos que tienen unagran especificidad aunque adolecen de cierta falta desensibilidad en algunos momentos de la infecciónpor el VIH, como al inicio de la seroconversión y enlos pacientes en estadíos terminales. Sin embargo,combinadas con otras pruebas de mayor sensibilidaden forma secuencial, pueden proporcionarexcelentes resultados en la estrategia diagnóstica.Estos tipos de pruebas han sufrido tambiénvariaciones tecnológicas, siendo una de ellas lautilización de substratos fluorescentes que han dadolugar a las pruebas denominadas ELFA (enzime-linked fluorescent assay). La última aportación a laspruebas inmunoenzimáticas ha sido la detecciónsimultánea de antígeno p24 y anticuerpos frente alVIH, lo que acorta el período ventana. Diversostrabajos publicados y experiencias realizadas ennuestro laboratorio ponen de manifiesto un adelanto

entre una a dos semanas en la detección serológicade la infección por el VIH, aspecto a considerar sitenemos en cuenta que en el período ventana lainfectividad de un individuo es más elevada.

Existen pruebas basadas en la técnica deaglutinación pasiva que ofrecen ventajas por susencillez y simplicidad de ejecución así como por laposibilidad de realizar titulaciones de forma sencilla.La dificultad de automatización las hace pocoadecuadas para procesar gran número de sueros yestán menos extendidas. Estas técnicas estándiseñadas para detectar tanto anticuerpos de laclase IgG como IgM y en la actualidad son pocoutilizadas.

Entre las pruebas de cribado de anticuerpos VIH,las denominadas pruebas rápidas hanexperimentado un desarrollo importante; losantígenos que emplean son similares a los EIA yELFA y el tiempo en el que se puede obtener unresultado oscila entre 5 y 20 minutos. Aunque lascaracterísticas operacionales son inferiores a los EIAy ELFA deben tenerse en cuenta para situaciones deurgencia. Combinadas con otras pruebas dedetección de anticuerpos constituyen una estrategiaque mejora la especificidad de los resultados deforma asequible en términos de costes laborales y detiempo. En la Tabla 2 se exponen algunas de lasmás utilizadas; son preferibles aquellas que permitendetectar anticuerpos frente al VIH-1 y VIH-2 de formaseparada. Su mayor inconveniente reside en lalectura que siempre es subjetiva y con algunossueros pueden producirse reactividades que generendudas de interpretación.

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Tabla 2. Pruebas rápidas para la detección de anticuerpos frente al VIH

Técnica AntígenoDot-EIA 1ªgeneración Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 en un único “spot”.

Dot-EIA 2ªgeneración Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y VIH-1”O” en “spots”

diferenciados para VIH-1 y VIH-2

Látex/Aglutinaciónpasiva Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y VIH-1”O”.

Inmunocromatografíacapilar Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y VIH-1”O”.

En los últimos años, han aparecido pruebasrápidas basadas en el principio de lainmunocromatografía capilar que han mejorado deforma importante la sensibilidad y la especificidad deéstas respecto a las de Dot-EIA. Se deben elegiraquellas que tengan controles internos queverifiquen el correcto funcionamiento de la reacción.

2.5.- PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN DE LAPRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIH

La trascendencia de la infección por el VIH hacenecesaria la confirmación de los resultados positivosobtenidos en las pruebas de detección primaria deanticuerpos; este paso es inexcusable cuando elobjetivo de las pruebas sea el diagnóstico ypuede ser obviado cuando aquellas se realicen paraseguridad biológica. Sin embargo en el ámbitohospitalario es cada vez más frecuente que seconfirmen todos los resultados positivos de sueros uotras muestras, incluidas aquellas en las que elobjetivo principal no es el diagnóstico. Existen

diferentes pruebas de confirmación; entre ellas cabecitar las basadas en los principios deinmunoelectrotrasferencia o western blot (WB), deinmunofluorescencia indirecta (IFI), deradioinmunoprecipitación (RIPA) y de inmunoblot conantígenos recombinantes (LIA).

La técnica más ampliamente utilizada paraconfirmación es el WB. Las técnicas de IFI y RIPApor razones distintas (subjetividad de la lectura,requerimientos de laboratorio, etc.) se emplean cadavez menos, de tal forma que los resultados deconfirmación por WB son considerados el estándar opatrón para confirmar la presencia de anticuerposfrente al VIH. Existen distintos criterios de positividademitidos o recomendados por organismos osociedades involucrados en el diagnóstico de lainfección por el VIH (Tabla 3), de ellos el de la OMSes el más específico cuando se manejan sueros deprocedencia poblacional muy diversa.

Tabla 3. Criterios de positividad en WB para confirmación de infección por el VIH-1.

CRITERIO REACTIVIDAD FRENTE A

Organización Mundial de la Salud Dos glicoproteinas cualquiera de: gp160, gp120, gp41

Cruz Roja Americana Una proteína de cada gen estructural (env, pol y gag)

Food and Drug Administration p24 + p32 + (gp41o gp120 o gp160)

CRSS* p24 + (gp41o gp120 o gp160) o p32 + (gp41o gp120 o gp160)

CDC/ASTPHLD** p24 + (gp41o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160)

*Consortium for Retrovirus Serology and Standardization. **Centers for Disease Control/Association of State andTerritorial Public Health Laboratory Directors

El WB contiene los antígenos del propio VIH,algunas de sus proteínas precursoras y antígenos deorigen celular. Existen modalidades que incorporanen un extremo diferenciado de la tira un péptidosintético específico del VIH-2 (gp36), que facilita lasospecha de infección por VIH-2 en coinfecciones yen WB indeterminados para el VIH-1. Debido a quelas tiras de nitrocelulosa en las que se depositan los

antígenos del VIH contienen, en mayor o menorcantidad, proteínas de la célula huésped en la que seha cultivado el virus, a menudo se observan bandasde reactividad contra dichas proteínas, de ahí lanecesidad de adiestramiento en la lectura einterpretación de las bandas de origen vírico. Esconveniente adoptar una disciplina metodológica enla lectura e interpretación de bandas de reactividad

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del WB (Tabla 4); que deberá ser uniforme ysistematizada para cada laboratorio.Los sueros se consideran positivos cuando cumplenel criterio de positividad adoptado por el laboratorio,

negativos cuando no se observa ninguna banda dereactividad, e indeterminados cuando se observanreactividades distintas a las del criterio depositividad.

Tabla 4. Pautas de lectura del Western Blot

1º-Identificación de bandas específicas víricas de reactividad.2º-Valoración de la reactividad de cada banda (0, 1, 2, etc.)3º-Anotación individualizada de resultados en cada muestra.4º-Aplicación del criterio de positividad.5º-Emisión de resultados e informe.

Los resultados indeterminados de la prueba WBson la mayor fuente de ansiedad en pacientes y losque pueden llegar a generar desconcierto en losresponsables del diagnóstico. Las causas dereactividades anormales en WB son muy variadas yno están totalmente explicadas. Se han descritoresultados indeterminados en personas con factorreumatoide en el suero, lupus eritematoso,hiperbilirrubinemias, infección por otros retrovirus,parasitosis y por otras causas. En la membrana deenvoltura del VIH pueden estar presentes antígenosHLA que produzcan reactividades en el WB hasta en

el 30% de los individuos multitransfundidos queoriginen falsas reactividades.

En la Tabla 5 se reflejan algunas de lasreactividades más frecuentemente observadas en laspruebas de confirmación mediante WB. La conductaa seguir en estos casos, tenderá a limitar yminimizar la ansiedad en el paciente sin descartarla posibilidad de una seroconversión u otra infecciónpor retrovirus (HTLV-I y HTLV-II), alertando al clínicosobre dicha eventualidad.

Tabla 5. Reactividades frecuentes en resultados indeterminados de Western Blot

Bandas de reactividadobservadas

Posible causa y seguimiento

Una glicoproteina aislada(gp160, gp120 o gp41)

Inicio de la seroconversión, infección por otros tipos de VIH, frecuente en laserorreversión pediátrica (hijos de madres infectadas)Repetir WB en otro suero 7 días más tarde en adultos. En niños PCR yseguimiento.Descartar VIH-2 u otros tipos VIH según procedencia geográfica

P24 aislada Frecuente en resultados indeterminados de embarazadas, multitrasfundidos ypacientes africanos.Descartar VIH-2 u otros tipos de VIH. Otros retrovirus (HTLV-I/II)Puede persistir años en pacientes VIH-seronegativos

P17 aislada Causa desconocidaNo es necesario el seguimiento

Otras bandas del core aisladas Inespecificidades muy variadas (ver tabla 8)Anamnesis para posibles factores de riesgo o de WB indeterminadoSeguimiento a los 7-15 días si hay factores de riesgo

Más de una banda del core obandas no víricas

Frecuente en multitrasfundidos, enfermedades autoinmunes, etc.Anamnesis para posibles factores de riesgo.Seguimiento hasta 3-6 meses para ver evolución.

Para minimizar los problemas debidos aresultados indeterminados observados en el WB sehan desarrollado técnicas de inmunoblot conpéptidos recombinantes o pruebas de LIA. Estastienen una lectura más estructurada, que se puedehacer por densitometría en algunos casos, obviandolos problemas de subjetividad en la apreciación de laintensidad de las bandas. En nuestra opinión puedenser empleados por laboratorios que precisenconfirmar un gran número de muestras(automatización) y en los que importe menos elconocimiento de las causas de falsa positividadobtenidas en las pruebas de cribado de anticuerpos.

Por lo general estas pautas se utilizan paraconfirmar sueros positivos pero, en determinadoscasos, pueden usarse para confirmar suerosnegativos, debido al amplio contenido de antígenosdel VIH respecto a las pruebas de detección primariade anticuerpos. Los informes clínicos de losresultados de estas pruebas deben expresar deforma clara si la persona es positiva o negativa paraanticuerpos frente al VIH o si se aconsejaseguimiento o pruebas adicionales; cualquier cambioque haga el laboratorio respecto a los criterios depositividad adoptados deberá comunicarse a losclínicos que atienden a los pacientes infectados porel VIH.

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2.6. ESTRATEGIAS DE CRIBADO YCONFIRMACIÓN

La OMS hizo unas recomendaciones hace añosque pueden servir de base para establecer laestrategia de confirmación, siempre teniendo encuenta el objetivo para el que se realiza la prueba dedetección de anticuerpos frente al VIH y laprevalencia de éstos observada o estimada en unapoblación dada (Tabla 6).

La estrategia I de seguridad biológica, queconstituye el proceder actual en la mayor parte decentros de hemoderivados, se basa además de lastécnicas de cribado de anticuerpos frente al VIH enla detección por PCR del VIH en lotes de sueros. Deesta forma se acorta el periodo ventana que precedea la aparición de anticuerpos y se confiere mayorseguridad a las donaciones. La estrategia II se basaen la realización de dos pruebas que emplean unprincipio técnico diferente y sólo sería de aplicaciónpara estudios de serovigilancia cuando laprevalencia sospechada de infección por el VIH fuerainferior al 10%.

Finalmente la estrategia III es la másrecomendable en el entorno español con altademanda de solicitudes y una baja prevalencia(<10%) de diagnósticos positivos. En esta estrategia,las muestras reactivas por dos técnicas de cribadoson analizadas por una tercera prueba deconfirmación (W. Blot, LIPA,…). En este sentidocabría fácilmente implementarse en el laboratorio unalgoritmo que combinara una prueba de EIA paradetectar anticuerpos frente al VIH de 3ª, o mejor de4ª generación y otra de las denominadas rápidas,preferiblemente basada en el principio técnico deinmunocromatografía capilar (ICC). De esta forma lasmuestras inicialmente reactivas por un EIA o ELFAde 3ª o 4ª generación se pueden informar y solicitar

una nueva muestra para prueba de confirmaciónbasada preferentemente en el principio delinmunoblot (Western Blot o similares).

Cuando el objetivo de la prueba de detección deanticuerpos frente al VIH es el diagnóstico y laprevalencia de positivos es <10% se recomienda eluso de tres técnicas con un principio o antígenodistinto y parece obligado que figure entre aquéllas elWB u otra técnica que identifique de formaindividualizada las distintas reactividades de losantígenos del VIH. Para diagnosticar a una personacomo positiva e infectada por el VIH las tres pruebasdeben ser positivas. Es probable que en muchoslaboratorios sólo se disponga de una prueba dedetección de anticuerpos (EIA o ELFA) y unasegunda de confirmación (WB, LIA o IFI) en estecaso pueden producirse por las razonesmencionadas previamente, situacionesproblemáticas respecto al diagnóstico de la infecciónpor el VIH sobre todo en individuos asintomáticos.Por ello es altamente recomendable que en ellaboratorio o en el hospital al menos, se disponga dedos pruebas primarias de detección de anticuerposfrente al VIH de distinto fabricante o que empleen unprincipio técnico distinto. Esta precaución permitefácilmente cumplir con la recomendaciónmencionada en la estrategia III y aumenta nuestrafiabilidad diagnóstica. Además de poner antes demanifiesto la existencia de posibles discrepancias, laadopción de esta medida permite no tener quedepender del mismo proveedor, lo cual soslaya losfallos temporales con lotes concretos de reactivos.En todo caso, la técnica utilizada en primer lugar, encualquiera de las estrategias debe ser la que poseala máxima sensibilidad y las siguientes deben ser lasde mayor especificidad.

Tabla 6. Estrategias de determinación de la presencia de anticuerpos frente al VIH

OBJETIVO PREVALENCIA ESTRATEGIA

Seguridad biológica Cualquiera I

Paciente sintomático Cualquiera II

> 10% IIDiagnósticoAsintomático

< 10% III

> 10% ISerovigilancia

< 10% II

2.7. PROBLEMAS EN EL CRIBADO YCONFIRMACIÓN. ALGORITMO DE DECISIÓN.Los problemas que se presentan en el cribado yconfirmación de la detección de anticuerpos frente alVIH son similares a los de otras pruebas dediagnóstico serológico aunque, en este caso,adquieren una importancia mayor por las posibles

consecuencias y la trascendencia clínica de lainfección.

Desde el punto de vista serológico, en la infecciónpor el VIH ocurren cambios en la dinámica deproducción de anticuerpos desde el momento de laseroconversión. El periodo ventana de dos a cuatrosemanas de duración se caracteriza por la ausenciade anticuerpos y la presencia de antígeno p24,

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proteína mayoritaria del core del VIH y ARN vírico.En estadíos finales de la infección desaparecen losanticuerpos frente a algunas de las proteínasestructurales internas del virus (p24, p17, p55, etc.) yen algunos individuos se ha comunicado la ausenciade criterios diagnósticos de positividad por WB en losmeses finales de la enfermedad, como consecuenciadel intenso deterioro inmunitario.

En el laboratorio de virología tienden a preocuparmás los resultados falsos positivos, tanto en laspruebas de cribado como en las de confirmación(menos frecuente), sobre todo cuando éstos seproducen en personas sin ningún factor de riesgocomo ocurre generalmente. Las causas de falsospositivos son variadas (Tabla 7) y dependenbásicamente de dos elementos, la técnica (antígenosy principio técnico empleado) y las condicionesderivadas del paciente. La evolución de las técnicasy antígenos utilizados ha reducido la aparición defalsos positivos que en las primeras pruebas podíallegar en algunas situaciones particulares hasta el

5% y que en la actualidad es inferior al 1%. A pesarde ello hay causas de falsos positivos relativas a laextracción, conservación y procesamiento del sueroque pueden minimizarse con las precaucionescomentadas al principio de este procedimiento.

Entre las causas debidas a condiciones delpaciente se indican repetidamente en la literatura lasreactividades por autoanticuerpos; a este respectocabe señalar la presencia en la envoltura del VIH deantígenos del sistema HLA procedentes de la célulahuésped que explican en parte las falsasreactividades observadas en sueros de individuostrasplantados, multitransfundidos y otros conenfermedades autoinmunes. Por último existen otrascondiciones que se han señalado como causa defalsas positividades listadas en la Tabla 7; lapeculiaridad y complejidad de las mismas ilustransobre la necesidad de realizar una anamnesis paraidentificar la existencia de esas condiciones ante uncaso de falsa positividad en la determinación deanticuerpos frente al VIH.

Tabla 7. Causas de falsos positivos en pruebas séricas de detección de anticuerpos frente al VIH

Relativas al suero Relativas a autoanticuerpos Relativas a otras condiciones

• Congelación y descongelaciónrepetida

• Almacenamiento a temperaturasubóptima

• Aspecto lipídico o turbio delsuero

• Contaminación microbiana• Sueros tratados con calor (≥60ºC)

• Errores de extracción oidentificación

• Personas con anticuerposanti-HLA-DR4, DQw3

• Enfermedadesreumatoideas Polimiositis

• Lupus eritematoso• Multitrasfundidos• Trasplantados renales• Multíparas

• Hemodializados, fracaso renal crónico• Síndrome de Stevens-Johnson• Administración previa de inmunoglobulinas• Sueros postvacunales (gripe, hepatitis B)• Infecciones agudas por virus ADN• Enfermedad hepática alcohólica grave• Cirrosis primaria biliar, colangitisesclerosante

• Pacientes con parasitosis (sanguíneas otisulares)

• Pacientes con discrasias sanguíneascongénitas

• Usuarios de drogas por vía parenteral

Los criterios de confirmación están basados en laexperiencia y conocimientos de los expertos pero noson infalibles. El laboratorio deberá evaluar el criteriode positividad empleado para el WB (si es la técnicaque se utiliza para confirmar) ya que algunos de loscriterios recogidos en la Tabla 3 son menosrestrictivos que otros y pueden propiciar falsasconfirmaciones. En nuestra experiencia el criteriopropuesto por la OMS es el que se adapta mejor a larealidad hospitalaria y las pruebas LIA que utilizandicho criterio son las que dan menos errores en laconfirmación.

Finalmente es necesario alertar sobre laposibilidad de falsos negativos en el diagnóstico y enla determinación de anticuerpos frente al VIH,circunstancia que probablemente se percibe conmenos frecuencia debido al principio, generalmenteadmitido, por el que los resultados negativos noson reconfirmados si no existe una indicaciónclínica precisa al respecto. Las causas de falsa

negatividad son también variadas (Tabla 8). Losfalsos negativos pueden constituir sólo una rareza oexcepción entre los infectados por el VIH, pudiendoexistir pacientes infectados por el VIH peroseronegativos, debido a causas orgánicas derivadasde una respuesta aberrante o anormal a la infecciónpor el VIH. En el pasado se han producido falsosnegativos causados por fallos de los equipos dedetección de anticuerpos frente al VIH o incapacidadde detección y confirmación en individuos infectadospor algunos tipos o subtipos marginales del VIH(distintos del B).

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Tabla 8. Causas de falsos negativos en pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH

• Periodo ventana que precede a la aparición de anticuerpos• Infección por tipos de VIH no detectables por los antígenos incluidos en la prueba• Terapia inmunosupresora prolongada• Trasplante de médula ósea• Disfunciones de linfocitos B• Plasmaféresis, exanguinotrasfusión• Neoplasias• Errores de extracción o identificación• Fallos en el principio técnico o proceso de fabricación del equipo diagnóstico• Respuestas anómalas ante la infección por el VIH

Algunas de estas situaciones provocan la alarmacuando el objetivo perseguido en la determinaciónde anticuerpos frente al VIH es la seguridadbiológica (bancos de sangre, hemoderivados,donaciones). Por ello la adopción de técnicas deEIA/ELFA de cuarta generación debe utilizarse paraminimizar al máximo el periodo ventana; por otraparte, aunque el valor predictivo negativo seaelevado, se debe insistir en descartar el diagnósticode infección por el VIH mediante pruebascomplementarias cuando la anamnesis revelefactores de riesgo, síntomas u otros datos delaboratorio o indicaciones clínicas sugestivas deinfección por el VIH. El algoritmo de decisionespropuesto para la serología VIH (Figura 1) pretendetener en cuenta las diferentes situaciones y contextoclínico en los que se produce generalmente lademanda de una prueba de detección deanticuerpos frente al VIH y las consecuencias quelos resultados y el informe de la misma deben teneren la manera de proceder.

El cribado de anticuerpos frente al VIH desbordaen el momento actual por su transcendencia la meraoferta diagnóstica. Las aplicaciones hospitalarias deesta prueba han hecho que en la mayoría de loshospitales las peticiones de esta analítica hayancrecido de forma exponencial en los últimos años.Como consecuencia del aumento de peticiones ydel descenso consiguiente de los porcentajes depositividad se producen resultados falsos positivosen situaciones de difícil manejo clínico (candidatos atrasplantes, pacientes hemodializados, mujeresembarazadas) que obligan a una diversificación delas estrategias diagnósticas y de los métodos decribado. En este contexto es aconsejable disponeral menos de dos técnicas de cribado de anticuerposfrente al VIH que empleen un principio técnicodistinto de detección (por ejemplo un EIA o ELFA yuna prueba rápida de inmunocromatografía) yutilizar cuando ello sea posible un método deconfirmación con muestras del mismo pacientetomadas en momentos diferentes.

La colaboración entre laboratorios de un mismohospital que realicen pruebas de detección deanticuerpos frente al VIH con distintos objetivos (porejemplo, Virología y Hematología) o de una mismoárea sanitaria puede minimizar el coste y facilitar laimplantación de estas recomendaciones, coordinando

las técnicas que cada laboratorio asume yorganizándose en protocolos de actuación concretos.

En el momento actual pueden producirsesituaciones clínicas que den lugar a la necesidad deseguimiento serológico del paciente al menosdurante dos o tres semanas y a la utilización deotros marcadores serológicos de infección por elVIH (antígeno p24, detección de ARN vírico). Apesar de la sensibilidad de estas pruebas, eldiagnóstico definitivo deberá confirmarse con elsuero cuando tenga lugar la seroconversión; por esoes altamente recomendable la adopción de pruebasEIA/ELFA para detección simultánea de anticuerposy antígeno p24 del VIH cuando se trabaje ensituaciones clínicas que prevean un alto riesgo dedetectar seroconversiones (clínicas dedesintoxicación, centros de metadona, etc.) o enaquellos casos en los que exista riesgo de donar unórgano de un paciente en el período deseroconversión. Finalmente, cuando el objetivo de las pruebassea el diagnóstico, se debe tener en cuenta que lospacientes rara vez entienden, como lo hacen losprofesionales, expresiones tales como: “falsopositivo”, “indeterminado”, “positivo dudoso”, etc. yen consecuencia, se debe extremar el cuidado alemitir los informes del laboratorio, estableciendoinformes claros. Del conjunto de pruebas realizadasdeberá resultar un diagnóstico claro y concluyente obien la formulación de recomendaciones precisaspara el seguimiento y el diagnóstico definitivo.

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Figura 7. Algoritmo de decisión en serología del VIH

1er sueroELFA ó EIA 3ª/4ª generación

POSITIVO > 3 Cut-off POSITIVO < 3 Cut-off NEGATIVO Informar NEGATIVO

2º EIA NEGATIVO Repetir o hacer otras pruebas (p24, WB etc.) si hay información clínica relevante

Informe previo y petición de nuevo suerosi precisan confirmación diagnóstica.

2º suero ELFA ó EIA 3ª/4ª generación NEGATIVO Reclamar nuevo suero y repetir analítica con el suero anterior (descartar posible confusión del suero)

POSITIVO

Confirmación con WB (preferible con péptido gp36 de VIH-2)

POSITIVO INDETERMINADO NEGATIVO Informar NEGATIVO y recomendar nuevo análisis si persiste indicación clínica.

Una glicoproteína gp160, 120, 41 Bandas Core p17, 31, 24, 55 u otras aisladasInformar con o sin bandas CorePOSITIVO

Informar INDETERMINADO y solicitar nuevosuero urgente para descartar seroconversión(excepto en niños < 18 meses). Valorar pruebascomplementarias (p24, PCR, etc.)

Informar INDETERMINADO; informe final paraanticuerpos frente al VIH NEGATIVO yrecomendación de seguimiento entre 0,5-1 y 3meses. Si hay reactividad de gp36 de VIH-2descartar infección mediante pruebas de péptidossintéticos para VIH-1 y VIH-2.

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3. DETECCIÓN DE LA VIREMIA PLASMÁTICADEL VIH (CARGA VÍRICA PLASMÁTICA – CVP – )3.1. TÉCNICAS DISPONIBLES

Todas las técnicas para la determinación de CVPdel VIH-1 están aprobadas para su uso en la UniónEuropea (marcado CE) y permiten la detección hastaun nivel de 50 copias de VIH por mililitro de plasmautilizando entre 500 µL y 1 mL de plasma (Tabla 9).Las diferencias técnicas fundamentales radican enlos formatos, tiempos y capacidad de procesamiento.Las nuevas técnicas de RT-PCR en tiempo realbasadas en sondas fluorescentes son en generalmás rápidas y permiten rangos dinámicos másamplios (40-107 copias/mL). La reciente introducción

de la extracción automática de ácidos nucleicossupone un considerable ahorro de trabajo manual yreduce las posibilidades de variabilidad relacionadascon una de las fases más críticas del procedimiento.Todas las técnicas detectan y cuantifican elmayoritario subtipo B y algunos otros subtiposcirculantes (A, C, D, F, G) aunque se hancomunicado diferencias entre técnicas para algunosde estos subtipos no-B. El procedimiento de Abbottes el que tiene el rango más amplio de detección desubtipos y es el único que cuantifica el grupo O.Ninguna de las técnicas licenciadas detecta el VIH-2.

Tabla 9. Técnicas disponibles para la detección de la carga vírica plasmática

Nombre (Compañía) Técnica ComentariosMonitor (Roche) RT-PCR Extracción automática disponible

Subtipos A-GTaqman (Roche) RT-PCR tiempo

realExtracción automática disponibleSubtipos A-G

Abbott Real Time (Abbott) RT-PCR tiemporeal

Extracción automática disponibleSubtipos A-K y grupo O

Versant (Bayer) bADN Subtipos A-GNucliSens (BioMerieux) NASBA Extracción automática disponible

Subtipos A-G

3.2. INDICACIONES3.2.1. Monitorización del tratamientoantirretroviral (ARV)Es el uso más habitual que se le da a ladeterminación de la CVP. Una vez instaurado eltratamiento antirretroviral la CVP disminuyerápidamente en las primeras semanas y algo máslentamente a partir del primer mes de tratamiento. Serecomienda una determinación basal y al menos unaevaluación en las semanas 4, 12 y 24 de tratamiento,para continuar posteriormente el seguimiento cada 3-4 meses. En general se espera una reducción de unlog10 en la primera semana, 2 log10 en la semana 4 ydependiendo del nivel basal la CVP debería serindetectable (<50 copias/mL) entre las 16-24semanas del inicio de tratamiento. Los cambiosmayores de 0,3 log10 entre dos determinaciones(cambios mayores del doble o la mitad) seconsideran como significativos.3.2.2. Predicción de progresión en pacientescrónicamente infectados e inicio del tratamiento.La recomendación actual para el inicio deltratamiento ARV se establece según la clínica y elnivel de CD4. Se inicia tratamiento en todos lospacientes sintomáticos y en aquellos con CD4 <200/µL; en pacientes con CD4 entre 200 y 350/µL serecomienda en general iniciar tratamiento aunque enaquellos con cifras más cercanas a 350 y CVP bajas(<20.000 cp/mL) podría diferirse la iniciación, asímismo por encima de 350 CD4/µL podríaconsiderarse el inicio de tratamiento ARV enaquellos pacientes con CD4 más bajos y CVP>100.000 cp/mL por su riesgo de progresión másrápida.

3.2.3. Valoración del riesgo de transmisiónLa CVP se correlaciona con riesgo de transmisióndel VIH por cualquiera de las vías por las que setransmite el virus. De esta manera, cuanto mayor esla CVP mayor es el riesgo de transmisión. Aunque nopuede excluirse completamente, la transmisión delVIH tanto por contacto sexual como por puncionesaccidentales con agujas, es poco probable pordebajo de 1500 cp/mL y esta cifra, junto con lascaracterísticas de la exposición forma parte de loscondicionantes que establecen diferentes pautas deprofilaxis post-exposición.3.2.4. Diagnóstico de infección agudaDurante las primeras semanas de infección losanticuerpos específicos anti-VIH no son detectablespor las técnicas diagnósticas rutinarias. Sin embargola replicación del virus es muy activa en esemomento y alcanza su máximo alrededor de los 10días post-infección, lo que a menudo coincide con lafase sintomática. Para cubrir este periodo algunatécnica de cribado combina la detección conjunta deanticuerpos y antígeno (p24) específicos. En laactualidad no existe ninguna técnica comercialdisponible para detección cualitativa del VIHasociado a células (ADN provírico). Aunqueformalmente las técnicas para la determinación deCVP del VIH no tienen un diseño cualitativo (positivo-negativo), dada su sensibilidad se utilizanfrecuentemente para cubrir el diagnóstico de unaposible infección aguda por el VIH. Si bien lasensibilidad de la técnica para este propósito esexcelente, conviene tener en cuenta la eventualidadde resultados falsamente positivos. Generalmente laviremia durante las primeras semanas de la infección

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es muy elevada, en general >100.000 cp/mL, por loque deben interpretarse con muchas reservas losresultados con valores bajos (<10.000 cp/mL).

3.3. OBTENCIÓN Y MANEJO DE LAS MUESTRASLa muestra necesaria para la determinación de la

CVP es un tubo de sangre anticoagulada con EDTAo citrato (ACD) de 5-10 mL. No son aceptables lostubos con heparina, que interfiere con algunastécnicas moleculares, ni el suero porque losresultados son menos consistentes. Los tubos conEDTA son los más ampliamente recomendados yaunque el ACD es también aceptable presenta elinconveniente de contener un mayor volumen desustancia en el tubo de tal forma que puede ser unfactor de dilución en tubos solo parcialmente llenos.El plasma se separa por centrifugación a 1000-1500g (2000-2500 rpm en las centrífugas más habituales)

durante 10 minutos a temperatura ambiente. Existeun tubo especial para técnicas de biología molecular(Vacutainer PPT) con un gel que una vezcentrifugado separa el plasma de la parte celular.Este tubo PPT es práctico para transportar el plasmasin manipular la muestra, sin embargo no se debecongelar porque aumenta artefactualmente elnúmero de muestras con viremia de bajo nivel. Esimportante considerar la estabilidad de la sangretotal y el plasma separado para las determinacionesde CVP del VIH. En general la sangre completa sedebe centrifugar y separar el plasma dentro de lasprimeras 4-6 horas inmediatas a la extracción. En laTabla 10 se muestra la estabilidad del VIH-1 para ladeterminación de la CVP según su forma dealmacenamiento.

Tabla 10.- Estabilidad del VIH-1 para la determinación de la carga vírica plasmática

Sangre completa 6 horasPlasma separado temperatura ambiente 24 horasPlasma separado 4º C 6 días

Plasma separado -20ºC Variable (no recomendado paraalmacenamiento a largo plazo)

Plasma separado -80ºC Meses

3.4. CARGA VÍRICA EN LCR, SEMEN Y OTROSFLUIDOS

Aunque la determinación de la CVP del VIH enestas muestras no esta estandarizada, en ocasioneses necesaria su realización en el contexto deestudios de investigación o bajo petición expresa ypuntual del clínico responsable.

El LCR se puede procesar por la mayoría de losprocedimientos de manera similar al plasma,conviene centrifugarlo en las mismas condicionesque la sangre total para separar células inflamatoriasy hematíes. El VIH es un agente con marcadoneurotropismo, su presencia en LCR es frecuente ynunca se produce de manera aislada. Laconcentración de virus en el SNC se correlacionasolo indirectamente con daño neurológico y sudeterminación raramente tiene interés diagnóstico.Respecto al semen y otros fluidos es posible adaptarlas técnicas para la determinación de la CVP tantoen el propio semen como en muestras cervico-vaginales e incluso tejidos. En estos casos esnecesario realizar la extracción previa de ácidosnucleicos ya que la viscosidad de las muestrasimpide el procesamiento automático por algunos delos sistemas. Se trata igualmente de procedimientosexperimentales que se realizan en estudios deinvestigación y la interpretación de los resultadosadquiere significado únicamente para el contexto enel que se realiza.

3.5. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS3.5.1. Resultados y variabilidadEn virología es tradicional utilizar escalaslogarítmicas para expresar información cuantitativa

tal como concentraciones de virus o potenciainfectiva de inóculos. El rango dinámico en el que seproduce la replicación de la mayoría de los virus setraduce en resultados que generalmentecomprenden varios órdenes de magnitud por lo quelas escalas logarítmicas se utilizan con frecuencia.La mayoría de las técnicas expresan los datos enescala lineal y logarítmica. La variabilidad de lastécnicas para la determinación de la CVP es menorde 0,3 log10, por tanto cualquier resultado con unadiferencia mayor se considera significativo. Lamayoría de los pacientes infectados que no recibentratamiento tienen una CPV detectable en rango muyamplio que puede llegar a más de 10 millones decopias/mL. Por el contrario los pacientes entratamiento antirretroviral y después de las primeras16-24 semanas, se espera que tengan una CVPmenor de 50 cp/mL. Si la CVP es detectable duranteel seguimiento obliga a considerar falta deadherencia al tratamiento o desarrollo de mutacionesde resistencias a los fármacos ARV.3.5.2. Factores que aumentan la CVPAparte de la progresión natural de la infección, laCVP puede aumentar rápidamente en situaciones enlas que se produce un estímulo inmunológico queaumenta la producción de partículas víricas por loslinfocitos infectados. Estos episodios se han descritoen infecciones activas (tales como tuberculosis,neumonía por Pneumocystis jiroveci, etc.) y tras laadministración de vacunas.3.5.3. Episodios cortos de aumento de la CVP(Blips)Un 10-15% de pacientes con tratamiento ARV ybuen control virológico, que mantienen CVP

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indetectable por periodos prolongados de tiempo,presentan ocasionalmente viremia detectable de bajonivel. Estos episodios conocidos como blips, queaparecen en determinaciones aisladas y parecenlimitarse sin cambios en el tratamiento, han sidomotivo de intenso estudio. Los blips no parecenrelacionados con falta de cumplimiento ni peorpronóstico a largo plazo. La opinión actual másamplia es que se trata de pequeñas fluctuaciones dela viremia e incluso de errores en el procesamientode las muestras que resultan en CVP de bajo nivel.Esta consideración está apoyada por el hecho deque muchos de estos blips no son reproducibles enlaboratorios diferentes. Para que un incremento noesperado de la CVP pueda ser considerado comoblip debería ser inferior a 500-1.000 cp/mL y en lasiguiente determinación debería producirse de nuevola indetectabilidad.3.5.4. CVP indetectable en pacientes infectadospero sin tratamientoUn porcentaje pequeño (5-7%) de pacientesinfectados, después del pico de viremia intensacorrespondiente a la infección aguda, puedenmantener la replicación del virus controlada porperiodos prolongados en ausencia de tratamientoantirretroviral. En estos casos, la CVP puede serindetectable durante meses. Esta situación, aunquepoco frecuente, es normal y suele ocurrir enpacientes con diagnóstico de certeza de infección,que se encuentren asintomáticos y con cifras delinfocitos CD4 normales. En un paciente coninfección por el VIH diagnosticada por ELISA, queestá sintomático o tiene las cifras de linfocitos CD4disminuidas y que no recibe tratamientoantirretroviral, una CVP indetectable debe hacersospechar una variante no detectada por la técnicageneralmente frente al VIH-1 grupo O ó VIH-2; estasituación se debe resolver por técnicas serológicasespecíficas y por técnicas moleculares.3.5.5. Viremia detectable por debajo del umbralde 50 copias/mLEn una proporción importante de pacientes contratamiento ARV y buen control virológico quemantienen CVP < 50 cp/mL de forma estable, esposible detectar viremia de muy bajo nivel (2-40cp/mL) utilizando modificaciones de las técnicasconvencionales que consisten generalmente enconcentrar por centrifugación partículas víricas apartir de mayores volúmenes de plasma (2-10 mL).La evidencia de esta viremia de bajo nivel por debajodel umbral de 50 cp/mL ha sido objeto de intensodebate. Actualmente la mayoría de los estudiossugieren que estas partículas no son producto dereplicación de bajo nivel del VIH que no se suprimecompletamente por las drogas ARV, más bien setiende a considerar que representan virus liberadospor el reservorio celular latente bajo estímulos deactivación que no son bien conocidos por elmomento y por tanto no suponen, en la mayoría delos casos, una indicación de fracaso terapéutico.

4. DETECCIÓN DE RESISTENCIASLas pruebas para la detección de resistencias a

antirretrovirales pueden clasificarse en dos tipos:genotípicas o fenotípicas. Las resistenciasgenotípicas determinan las mutaciones en lasecuencia primaria de nucleótidos de la transcriptasainversa (TI) y de la proteasa (PR) y, recientemente,de la envoltura, comparándola con la secuencia deuna cepa salvaje. La resistencia fenotípica seexpresa en términos de concentración de droganecesaria para inhibir la replicación vírica en cultivocelular. Generalmente se expresa en términos deCI50, indicando la concentración de fármacorequerida para reducir al 50% la producción vírica invitro. La interpretación de estos valores es diferentedependiendo del fármaco implicado.

4.1. TÉCNICAS GENOTÍPICAS4.1.1. Secuenciación de ácidos nucleicosEs el método genotípico de referencia para ladeterminación de la resistencia del VIH a losfármacos antirretrovirales. Se obtiene informacióncompleta de la secuencia de la región del genomavírico amplificada previamente por PCR, empleandoprimers o dideoxinucleótidos marcados de formadiferente para poder distinguirlos entre sí. Para ello,el método más utilizado es el método enzimático,también llamado de síntesis abortiva o de losdideoxinucleótidos. En él se emplea una ADN-polimerasa para sintetizar cadenas complementariasde una de las hebras del ADN problema en cuatroreacciones enzimáticas diferentes. En cada una deellas junto con el oligonucleótido usado comocebador y la mezcla de los cuatro nucleótidos (dATP+ dCTP + dGTP + dTTP) hay una concentraciónlimitante del 2´-3´dideoxinucleótido (ddNTPs), que alno tener radical hidroxilo en la posición 3´ no permitela adición de otro nucleótido parando la extensión dela cadena de ADN. La polimerización a partir delcebador ocurre en sentido 5´-3´ hasta que laincorporación de uno de los ddNTPs induce laterminación de la cadena en ese nucleótido. Debecalcularse bien tanto la cantidad de dNTP como ladel ddNTP correspondiente para que puedanobtenerse todos los posibles fragmentos queterminan en un nucleótido determinado, queposteriormente se separarán mediante electroforesis.Junto con la aparición de las polimerasastermoestables, se han desarrollado tambiénmoléculas químicas que muestran fluorescenciainducida por láser y al unirse a los ddNTPsfinalizadores de la reacción permiten la detección delfragmento mediante la emisión de fluorescencia auna cierta longitud de onda. Actualmente se handiseñado cuatro de estas moléculas con emisión defluorescencia a longitudes de onda diferentes, y asíunidas a cada uno de los cuatro ddNTPs, permitenrealizar las cuatro reacciones de secuencia en unmismo tubo y pueden cargarse en el mismo pocillodel gel, ya que las bandas de cada nucleótido podránreconocerse por su color de fluorescencia. Estemétodo se denomina secuenciación unidireccional.Del mismo modo pueden marcarse los cebadores o

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primers y hablamos entonces de secuenciaciónbidireccional.

Los productos de las reacciones desecuenciación se someten a electroforesis (en gel oen capilares) y las bandas que se obtienen (cadauna representando uno de los cuatro nucleótidos A,T, G o C) se leen por el secuenciador. El resultadoes una secuencia de nucleótidos que, una vezeditada, se traduce en una secuencia deaminoácidos. Esta secuencia de aminoácidos secompara entonces con la de una cepa de referenciadel VIH (llamada cepa consenso) con el fin dedeterminar si existen mutaciones. Así se analizan lassecuencias de la TI y la PR (recientemente, tambiéngp41) en busca de mutaciones que confieranresistencia al tratamiento. En la actualidad hayequipos de secuenciación asistidos por ordenador,que automatizan los pasos de electroforesis,detección y análisis de las bandas de secuenciación(patrones de picos llamados electroferogramas), y elensamblaje de los fragmentos secuenciados. Dichaautomatización ha permitido:

- Obtener una mayor sensibilidad de detección- Secuenciar fragmentos de hasta 700-800 pares

de bases (en el caso que nos ocupa esto esinsuficiente y hay que recurrir a variasreacciones de secuenciación para poder estudiartodas las posiciones del gen pol relacionadascon resistencia)

- Menor cantidad de paradas inespecíficas de laADN polimerasa por las estructuras secundariasen el ADN molde.

- Análisis de los resultados más rápido y menortiempo de procesamiento de las muestras.

Todo ello ha contribuido a generalizar el uso de latécnica en concreto para la detección de mutacionesde resistencia a fármacos, en éste caso frente aantirretrovirales.

Los ensayos de secuenciación comerciales másutilizados son TRUGENETM HIV-1 Genotyping Test(Bayer NAD) y ViroSeqTM HIV genotyping system(Abbott Diagnostics). El primero utiliza lasecuenciación bidireccional y la electroforesis en gel;el segundo emplea el método unidireccional y laelectroforesis capilar. Ambos sistemas ofrecen unsoftware para la edición de las secuencias y unalgoritmo propio de interpretación. Se han realizadovarios estudios comparativos que no establecengrandes diferencias en cuanto a ambas técnicas.

Además de los protocolos “in house”, tambiénexisten otros ensayos de secuenciación disponibles.Algunos de ellos (Virco GEN II, Virco; HIV-1GenotypR PLUS, Specialty Laboratories; GeneSeq,Virologic; GenoSure, LabCorp) sólo estándisponibles para su realización en los laboratorios delas casas comerciales que los ofrecen. Otrosensayos comercializados son HIV-1 MutationAnalysis, Focus Technologies; HIV ViroTYPE,Rheumatology Diagnostics Laboratory; y HIV-1Genotype, Quest Diagnostics.

4.1.2. Otros ensayos genotípicosComo consecuencia de que sólo una parteminoritaria de los codones que se amplifican porPCR son posiciones de resistencia y que la granmayoría son polimorfismos, se han diseñado unaserie de alternativas a la secuenciación en las que sedetectan codones específicos, aunque ninguna deellas aporta grandes ventajas con respecto a esta.Las que más se han utilizado (1) son: VERSANT®HIV-1 RT Resistance Assay y VERSANT® HIV-1Protease Resistance Assay (LIPA), que se basan enla hibridación de productos amplificados mediantePCR con sondas específicas distribuidas a lo largode una tira de nitrocelulosa; el método Affimetrix® ,que se basa en la hibridación de productos de RT-PCR utilizando oligonucleótidos inmovilizados sobreuna microplaca o chip, que permiten la identificacióndel nucleótido presente en cada posición; la PCRselectiva, mediante la cual se detectan mutacionesde resistencia concretas asociadas condeterminados codones de la transcriptasa inversa ola proteasa del VIH; y la hibridación diferencial,también denominada “Point mutation assay”.4.1.3 Interpretación del genotipoDebido a que es difícil tener un profundoconocimiento de la significación clínica de todas lasmutaciones, los ensayos genotípicos se suelenacompañar de una interpretación de las mutacionesencontradas. Es en este punto, en la interpretación,cuando se acaba la reproducibilidad interlaboratorio.El elevado número de mutaciones de resistencia y laexistencia de interacciones entre ellas son algunasde las causas responsables de los problemas en lainterpretación. Afortunadamente, el modelo para lainterpretación de las mutaciones de resistencia essusceptible de ser informatizado, porque losresultados de las pruebas genotípicas se obtienen enformato de texto (una lista de nucleótidos) y porquelas reglas de interpretación son fácilmentecomputarizables. Por esto, hoy en día lainterpretación de las mutaciones de resistencia sehace principalmente sobre la base de algoritmosinformáticos, en los que se introduce la secuencianucleotídica de la proteasa y retrotranscriptasa delVIH y se compara con la secuencia de una cepapatrón sin ninguna mutación (cepa salvaje o “wildtype), reconociendo entonces las mutaciones deresistencia. De hecho, el genotipo del VIH-1interpretado por un conjunto de normas delsoftware, predice la evolución virológica cuando secomplementa con la información clínica como basepara realizar un cambio de tratamiento. Existennumerosos sistemas para interpretar el genotipoobtenido mediante secuenciación: se handesarrollado más de 25 sistemas de interpretacióncon amplias diferencias entre ellos en cuanto a basecientífica, validación clínica etc... Algunos de ellosson listados de mutaciones asociadas conresistencia a modo de tablas y otros estándisponibles en Internet, como la página de laSociedad Internacional de SIDA de los EEUU(http://www.iasusa.org/), o la base de datos parasecuencias de proteasa y transcriptasa inversa de la

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Universidad de Stanford (http://hivdb.stanford.edu/).Todos son fácilmente accesibles, y presentansistemas de interpretación sencillos para todas lasdrogas disponibles. Sin embargo, en ninguno de losdocumentos de consenso o paneles de expertos seemiten normas sobre cuál debe ser la forma deinterpretar los resultados de las pruebas genotípicas.Es más, cuando se comparan los algoritmos entre síexisten serias discrepancias entre ellos, en especialpara algunos análogos de nucleósidos comoestavudina, abacavir, tenofovir y didanosina.

La realidad es que no todos los sistemas aportanla misma calidad a la interpretación. Para la eleccióndel que vayamos a utilizar debemos valorar, entreotros, la fecha de la última actualización (en estesentido, los de la Red de Investigación en SIDA deEspaña y los de la ANRS francesa–Julio 2005- sonlos de una actualización más reciente) y existendatos clínicos que avalan que ese algoritmo escapaz de predecir la eficacia virológica. La tendenciaactual es la elaboración de reglas de interpretación apartir de series de pacientes en los que se incluye elfármaco a estudiar en el régimen terapéutico,relacionando las mutaciones basales con la eficaciavirológica en términos de descenso de carga vírica alos tres meses. En este sentido existen datospublicados para tenofovir, didanosina, abacavir,saquinavir, atazanavir, fosamprenavir, lopinavir, ytipranavir. Además parece claro que la interpretacióndel genotipo debe estar avalada por un experto en lamateria.

Finalmente, hay que destacar que es importanteinterpretar el resultado de las pruebas de resistenciateniendo en cuenta la historia previa de tratamientoantirretroviral y, en su caso, estudios previos deresistencias que se hayan realizado al mismopaciente.

4.2. TÉCNICAS FENOTÍPICASLos estudios fenotípicos tienen la ventaja de valorarcon mayor fidelidad la sensibilidad del virus frente acada fármaco, y según este grado de sensibilidad sepodría valorar en un futuro la posibilidad desobrepasar la resistencia aumentando los nivelesplasmáticos del fármaco. Sin embargo, los estudiosfenotípicos deben considerarse por el momentocomo poco viables, principalmente por lacomplejidad, laboriosidad de la técnica, y el tiemponecesario para la emisión de resultados.4.2.1. Método de sensibilidad del virus en célulasmononucleadas de sangre periférica (CMSP).El análisis de resistencias fenotípicas puede hacersea partir del aislamiento del virus del pacienteprocedente de CMSP. Para ello se estimulan lasCMSP del paciente con fitohemaglutinina (PHA) y seco-cultivan en presencia de CMSP de donantes noinfectados también estimuladas con PHA, todo elloen presencia de distintas concentraciones delantirretroviral. Semanalmente se renuevan lasCMSPs de los donantes y en un tiempo aproximadode 4 semanas se evalúa la producción de nuevosvirus. Como ventaja frente a la tecnología de virusrecombinantes que veremos a continuación, hay que

destacar que se estima la sensibilidad del viruscompleto, pudiéndose reflejar el efecto de partes delgenoma que se pueden subestimar al estudiar sóloel gen pol.4.2.2. Técnicas con virus recombinantesEn 1994 Kellam y Larder publicaron un ensayo en elque se amplificaban mediante PCR la transcriptasainversa y la proteasa (fragmento PR-TI) directamentea partir de muestras de plasma del enfermo y setransfectan en células huésped conjuntamente a unplásmido linearizado que codifica para una cepa deVIH de laboratorio en la que se ha eliminado estasecuencia. En la célula huésped tiene lugar unproceso de recombinación homóloga cuyo resultadoes un VIH recombinante que porta las secuencias delgen pol del paciente y que además se puede cultivarcon facilidad en el laboratorio. Este ensayo inicial secaracterizaba por una mayor rapidez y una mayorreproducibilidad en los resultados que el cultivo deCMSPs. Las posteriores modificaciones a esteensayo inicial han contribuido a mejorar aún másestos aspectos y han dado lugar a los tres ensayosde virus recombinantes que podemos solicitar a lascasas que los comercializan: Antivirogram (Tibotec-Virco), PhenosenseTM (Virologic) y PhenoscriptTM

(Viralliance-SAS).En el método Antivirogram® (Virco) los virus

recombinantes se preparan mediante transfección decélulas MT-4 con el producto amplificado PR-TI y conun plásmido que contiene el genoma completo delVIH salvo la región gag-pro-RT. La CI50 del virusrecombinante se determina en cultivos, midiendo laviabilidad de células MT4 infectadas con el virusrecombinante en presencia de diluciones de cadaantirretroviral.

El método Phenosense (ViroLogic), a diferenciadel antivirograma, es un ensayo de un solo ciclo dereplicación vírica, lo que reduce el tiempo para losresultados. Utiliza un proceso de ligación, más quede recombinación homóloga, para introducir elfragmento amplificado mediante RT-PCR en elgenoma de una partícula de VIH en la que el gen envha sido sustituido por un gen productor de luciferasa.En un ciclo de replicación este virus es capaz deproducir todas las proteínas del VIH a excepción delas de envoltura y, en su lugar, se expresa el gen dela luciferasa. La CI50 del virus recombinante sedetermina cuantificando la expresión del gen de laluciferasa en cultivos de células infectadas con elvirus recombinante en presencia de antirretrovirales.

El método Phenoscript (Viralliance), combinaaspectos de los dos anteriores: un proceso derecombinación homóloga, como en el antivirograma,con un sólo ciclo de replicación vírica, como en elPhenosense. Las células diana (P4) contienen el gende la beta-galactosidasa controlado por la LTR delVIH de modo que cuando se acumulan suficientesproductos del gen tat en la célula infectada, seexpresa el gen de la beta-galactosidasa y suproducto se puede medir mediante colorimetría ofluorimetría. La Figura 1 resume las característicasde estos tres ensayos.

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4.2.3. Interpretación del fenotipoLas técnicas fenotípicas se basan en la capacidad delos virus aislados del paciente de infectar célulasfrescas en presencia de varias diluciones delantirretroviral a ensayar. La producción de nuevosvirus se monitoriza mediante diversos métodos(cuantificando la generación de antígeno p24 o laactividad de la TI) y se puede calcular la cantidad defármaco necesaria para que el crecimiento de virusse inhiba en un 50% o en un 90% (CI50 y CI90respectivamente). El mismo procedimiento realizadoen cepas sin mutaciones de resistencia (cepas dereferencia o cepas salvajes), permitirá conocer elnúmero de veces que la CI50 de la cepa en estudioestá aumentada con respecto a la de referencia paraasí poder estimar la sensibilidad o resistencia a esadroga. Para ello se definirá un punto de corte (cut-off), que es distinto para cada antirretroviral enestudio. Existen distintos puntos de corte: técnico,biológico y clínico.

El punto de corte técnico se establece en basea la reproducibilidad del ensayo: sólo informa si laCI50 de la cepa en estudio difiere significativamentede la de la cepa patrón; por lo tanto no proporcionainformación sobre la relación existente con laposibilidad o no de una respuesta clínica alantiretroviral en estudio. El punto de cortebiológico se basa en la media de la CI50 de cepasaisladas de pacientes naive y para cadaantirretroviral, este punto de corte se estableció endos desviaciones estándar por encima de la mediade CI50 de dichas cepas; este punto de corte es unabuena medida de la sensibilidad del virus a losantivíricos en estudio con respecto a los que circulanen la población no tratada e infectada por el VIH perotampoco proporciona ninguna medida en relacióncon si un tratamiento será efectivo o no. Por último,el punto de corte clínico se establece en base a lacorrelación de la CI50 a un antirretroviral con larespuesta clínica medida en términos de descensode la carga vírica en un determinado período detiempo; es el punto de corte ideal, pero la realidad esque no siempre existe una relación binariaresistencia-falta de respuesta, si no que esto másbien es un fenómeno continuo, por lo que se hacenecesario definir intervalos que definan variasposibilidades de respuesta. En esta línea estántrabajando los laboratorios que ofertan los ensayosfentotípicos.

La dificultad de la interpretación de las pruebasfenotípicas radica en la dificultad de diseñar ensayosclínicos que avalen los puntos de corte clínicos decada antirretroviral. Además, un problema añadidopuede ser la variabilidad que a esto pueda aportar eltipo de ensayo fenotípico que se realice.

4.3. PREDICCIÓN DEL FENOTIPO A PARTIR DELGENOTIPO: FENOTIPO VIRTUAL

El fenotipo virtual es la principal herramienta eneste campo. Ha sido diseñado por Virco, que hadesarrollado una base de datos con informaciónalrededor de 100.000 genotipos y fenotipos. En suversión inicial, existían unos 30.000

emparejamientos genotipo-fenotipo de las mismasmuestras clínicas, que se utilizaban para generar unfenotipo virtual: cuando se obtiene el genotipo de lamuestra de un paciente, el código genético de lasregiones de la proteasa y TI es analizado por elsoftware propio del sistema, que identifica todas lasmutaciones que pueden afectar a la resistencia decada droga y busca en la base de datos de Vircogenotipos de muestras previas que presentan elmismo patrón de mutaciones. Cuando ya se hanidentificado todas ellas, el software recupera losfenotipos de esas muestras y para cadaantiretroviral, hace un promedio de los datos. Estoproduce el fenotipo virtual, con los cambios en la CI50para cada antirretroviral, basado en los datos decientos o miles de fenotipos reales con el mismopatrón de mutaciones.

Esta técnica ha sufrido diversasmodificaciones/actualizaciones. En Julio 2004 seincorporó información importante sobre tenofovir y apartir de 2005 se ha redefinido, recibiendo la nuevaactualización el nombre de vircoType HIV-1. Sumayor novedad es que incorpora nuevos puntos decorte, que en esta versión son clínicos, y ademásdefine la resistencia a un fármaco de un modocontinuo, en vez de hacer una interpretación dual.Asimismo, incorpora información sobre la resistenciaa inhibidores de la proteasa potenciados con ritonaviry, en determinados casos, incluye el consejo deexpertos en la interpretación final. La potencia deesta herramienta para la interpretación viene avaladapor el número de series genotipo-fenotipo-respuestavirológica de que dispone.

El fenotipo virtual de Virco no es el únicodisponible y existen otras herramientas que predicenel fenotipo a partir del genotipo, como geno2pheno(http//www.geno2pheno.de).

4.4. INDICACIONES DE LAS PRUEBAS DERESISTENCIA

En este apartado se expondrán lasrecomendaciones más recientes a nivel nacional(Gesida/Plan Nacional del SIDA, Octubre 2004) einternacional (Department of Health and HumanServices, DHHS, Octubre 2005) que estos gruposde expertos realizan para conseguir una optimautilización de las pruebas de resistencia. Losescenarios para la utilización de las pruebas deresistencia son:

a) Pacientes sin tratamiento previo:a. Infección aguda por el VIH: ambas guías

recomiendan su empleo (DHHS, BIII) si sedecide iniciar tratamiento, con el objeto dedetectar la posible transmisión de cepasresistentes y modificar el régimen antes de queeste fracase, evitando de este modo la terapiasubóptima y una consecuente acumulación deresistencias. Las guías de la DHHSrecomiendan (CIII) extender este período hasta1-3 años de la seroconversión, debido a quedeterminadas mutaciones pueden llegar adetectarse durante este tiempo incluso enausencia de presión farmacológica.

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b. Infección crónica por el VIH: según la DHHS,debe considerarse (CIII) su empleo antes deiniciar tratamiento sólo en aquellos pacientesen los que exista una elevada sospecha dehaber sido infectados por una persona entratamiento antirretroviral. Estas guíascomentan un estudio en que la detección deresistencias en pacientes naïve es coste-eficazcuando la prevalencia de resistencia en estapoblación es superior al 5%. Recientemente seha publicado un nuevo estudio en que sedemuestra que es coste-eficaz por encima del1%.

c. Embarazo: la guía nacional las recomiendapara todas las mujeres embarazadas. Las dela DHHS consideran que para las mujeresembarazadas se deben hacer las mismasrecomendaciones que para el resto depacientes.

d. Profilaxis postexposición (PPE) ocupacional:Gesida/PNS recomiendan considerar suutilización en el caso fuente.

b) Paciente con tratamiento antirretroviral:recomendar en todo fracaso al TAR (DHHS, BII),para determinar el papel de la resistencia en elfracaso y diseñar un nuevo régimen con el mayornúmero de fármacos activos.

Las guías de la DHHS recomiendan además larealización de las pruebas de determinación deresistencias en los casos en los que la supresiónvirológica tras iniciar tratamiento es subóptima (BIII).Finalmente desaconsejan su empleo en pacientescon carga vírica <1000 copias/ml (DIIII), por elescaso rendimiento de la prueba, y después desuspender un tratamiento (DIIII), por la reversión dela mayoría de las mutaciones que no se detectaríanal ser subpoblaciones minoritarias.

4.5. LIMITACIONES DE LAS PRUEBAS DERESISTENCIA

En la actualidad, la mayoría de las pruebasgenotípicas o fenotípicas incluyen durante surealización la extracción del ARN vírico y su posteriorretrotranscripción en ADN. De este ADN se amplificala región genómica que se desea investigar mediantereacción en cadena de la polimerasa (PCR). Losprocedimientos de extracción y amplificación soncruciales para el posterior análisis del amplificado yla calidad de los resultados dependerá directamentede la calidad de estas dos etapas del proceso. Entodos los ensayos descritos hasta la fecha seamplifican el gen de la proteasa y parte de la TI delVIH y, en algunos se amplifica también un fragmentodel gen gag. Las técnicas de las que disponemosaseguran un 98-100 % de éxito en la amplificaciónen muestras con una carga vírica superior a 500-1000 copias/ml. No obstante, con las adecuadasmodificaciones es posible amplificar prácticamentecualquier muestra con carga vírica detectable, esdecir, con más de 50 copias/ml. Por otra parte,ninguno de los métodos genotípicos o fenotípicosasegura la detección de todas las variantes ocuasiespecies víricas que infectan al paciente. La

mayoría de las técnicas sólo detectan una variante siesta representa más del 20% del total de lapoblación. Para asegurar la detección de lasvariantes que representan menos del 20%, tambiénllamadas variantes minoritarias, es necesario recurrira técnicas especiales (clonación de los productos deamplificación, PCR mediante diluciones al límite, oPCR a tiempo real) que no son aplicables hoy porhoy a la rutina del laboratorio de secuenciación delVIH. Este hecho explica por qué los métodos que seutilizan predicen el fracaso de un fármaco pero noaseguran el éxito ya que las variantes minoritariaspueden ser portadoras de mutaciones de resistenciay seleccionarse mediante el empleo de ese fármacoen concreto. Finalmente, los ensayos de quedisponemos están por lo general bien diseñados ypara la PCR inicial se utilizan regiones dentro de losgenes gag-pol altamente conservadas entre lossubtipos distintos del B, ya sean URFs (UniqueRecombinant Forms ) o CRFs (CirculatingRecombinant Forms).

En la Tabla 11 (después de Bibliografía) serecogen las principales ventajas e inconvenientes delos métodos genotípicos y fenotípicos.

5. BIBLIOGRAFÍA:1. Ortiz de Lejarazu R, Ortega M, Hernández B,Eiros JM, Labayru C, Rodríguez-Torres A.Detection of primary HIV infection with a fourthgeneration test. AIDS 2000; 14 (S-4): 108-112.2. WHO. AIDS. Proposed WHO criteria forinterpreting results from Western blot assays forHIV-1, HIV-2 and HTLV-I/HTLV-II. Weekly EpidemRec 1990; 65:281-283.3. CDC. US Public Health Service guidelines fortesting and counselling blood donors and plasmadonors for HIV type 1. MMWR 1996; 45:3-8.4. Sullivan PS, Schable Ch, Koch W, et al.Persistently negative HIV-1 antibody enzymeimmunoassay screening results for patients withHIV-1 infection and AIDS: serologic, clinical, andvirologic results. AIDS 1999; 13:89-96.5. Preiser W, Brink NS, Hayman A, et al. False-negative HIV antibody test results. J Med Virol2000; 60:43- 47.6. Bartlett JG, Gallart JE. Medical management of HIVinfection. Johns Hopkins University 2003. Baltimore, MD7. Simon V, Ho DD. HIV-1 dynamics in vivo: implicationsfor therapy. Nat Rev Microbiol 2003; 1:181-190.8. Nettles RE, Kieffer TL, Kwon P, et al. Intermittent HIV-1viremia (Blips) and drug resistance in patients receivingHAART. JAMA 2005; 293:817-8299. Fiscus SA, Brambilla D, Coombs RW, et al. Multicenterevaluation of methods to quantitate humanimmunodeficiency virus type 1 RNA in seminal plasma. JClin Microbiol 2000; 38: 2348-2353.10. Pilcher C D, Fiscus S A, Nguyen T Q, et al. Detection ofacute infections during HIV testing in North Carolina. NEngl J Med 2005; 352:1873-1883.11. García F, Aguilera A. Pruebas de resistencia. En:“Resistencia a los antirretrovirales 2005”. Ed. Soriano V.Publicaciones Pernmayer.12. Shafer RW. Genotypic testing for humanimmunodefficiency virus type 1 drug resistance. ClinMicrobiol Rev 2002; 15:247-277.13. Garcia F, Palomares JC, Martinez NM, et al. Study ofdifferent system for interpreting results of genotypic

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antiretroviral drug resistance tests. Antiviral Therapy 2003;8:251-252.14. Iribaren JA, et al. Recomendaciones de GESIDA/PlanNacional sobre el SIDA respecto al tratamientoantirretroviral en pacientes adultos infectados por el VIH(octubre 2004). Enferm Infecc Microbiol Clin 2004; 22: 564-642.

15. Panel on clinical practices for treatment of HIV infection.Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1infected adults and adolescents. Disponible enhttp://aidsinfo.nih.gov. Octubre, 2005.

Tabla 11. Principales ventajas e inconvenientes de los métodos genotípicos y fenotípicos

Métodos genotípicos: ventajas

• Rapidez• Dificultad técnica media: realizable en laboratorios hospitalarios• Menor coste económico• Las mutaciones pueden preceder a las resistencias fenotípicas

Métodos genotípicos: desventajas

• Algunos no detectan variantes minoritarias (han de constituir al menos un 20% de la poblaciónvírica)

• Puede no existir correlación con el análisis fenotípico• Desconocimiento de mutaciones que ofrecen resistencia a diferentes inhibidores• Desconocimiento del efecto de las resistencias cruzadas• Respuesta variable de los pacientes a un fármaco• Marcador indirecto de la sensibilidad del VIH a los antirretrovirales• Requieren la interpretación por un experto• No son válidos para nuevas drogas hasta que se diseñan los algoritmos de interpretación y se

validan clínicamente.

Métodos fenotípicos: ventajas

• Reflejan el efecto de todas las mutaciones presentes, incluso las que no se han descrito• Medida directa de la sensibilidad del VIH a los antirretrovirales• Se puede utilizar para cualquier tipo de fármaco• Información útil acerca de las resistencias cruzadas• Los resultados son fáciles de interpretar• Potencial medida de “fitness” vírico y tropismo

Métodos fenotípicos: desventajas

• No detecta variantes minoritarias• Lento, laborioso y de elevado coste• Falta de estandarización

• No están validados o no se han descrito todos los puntos de corte clínicos

• Medidas de contención biológica

• Posible selección de variantes víricas mejor adaptadas al cultivo celular

PNT-VIH-01 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR EL VIH

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

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01 Edición inicial

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DOCUMENTO TÉCNICO

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Diagnóstico serológico de la infección porel VIH

Edición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología básica para la determinación demarcadores serológicos del VIH en muestras de sueromediante métodos de cribado y confirmación.Este procedimiento es aplicable a todos loslaboratorios de microbiología clínica que realicenseguimiento de pacientes infectados por el VIH oenvíen muestras a laboratorios de referencia.

2. FUNDAMENTOLas pruebas de determinación de marcadores deinfección por el VIH deben adaptarse a los objetivosque se persigan. En este documento se denominanpruebas diagnósticas a las que se emplean de formaindividualizada en el suero de una persona de acuerdocon los principios clínicos del consentimientoinformado. Su utilidad deriva de su capacidad paradetectar o descartar la infección por el VIH. Cuandolas pruebas se aplican en virtud de criterios deseguridad biológica o vigilancia epidemiológica lasestrategias de empleo difieren. Las característicasoperacionales de las mismas deben valorarse enfunción del contexto de aplicación y en función de losobjetivos que se pretenden se establecerá la elecciónde la técnica apropiada.Las técnicas de detección primaria de marcadoreshan evolucionado en cuatro generaciones:

- Enzimoinmunoanálisis de primera generación,que detectan anticuerpos empleando comosoporte antigénico lisado vírico del VIH-1.

- Enzimoinmunoanálisis de segunda generación.En ellas se detectan anticuerpos empleandocomo antígenos péptidos recombinantes del VIH-1 y VIH-2.

- Enzimoinmunoanálisis/ELFA de tercerageneración. Para detectar anticuerpos empleancomo soporte péptidos recombinantes/sintéticosdel VIH-1 y VIH-2 y antígenos del VIH-1 del grupoO (outlayer o marginal).

- Enzimoinmunoanálisis/ELFA de cuartageneración. Se emplean como soporte tantopéptidos recombinantes/sintéticos del VIH-1(incluyendo al grupo O) como anticuerpos paradetectar antígeno p24.

La técnica de confirmación de anticuerpos frente alVIH más empleada es el Western Blot (WB).Básicamente utiliza como soporte en tiras denitrocelulosa antígenos del propio VIH, algunas desus proteínas precursoras y antígenos de origencelular. Existen sistemas que incorporan en unextremo diferenciado de la tira un péptido sintéticoespecífico del VIH-2. Mediante un sistema derevelado se identifican bandas de reactividadespecífica que conducen a la interpretación delresultado.

3. MUESTRASLa muestra adecuada para la determinación demarcadores de infección por el VIH es el suero.También pueden utilizarse con fines de cribado otras

muestras biológicas. Las condiciones para la para larecogida y el transporte de suero deben contemplar:

• Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500g(generalmente equivale a 2000-2500 rpm)durante 10 minutos.

• En condiciones habituales se debe transferir elsuero a tubos con tapón de rosca de 5 ml decapacidad y evitar mantenerlos a temperaturaambiente durante más de 24 horas.

• Identificar correctamente el tubo (códigoempleado, referencia en origen y fecha deextracción).

• Para minimizar las contaminaciones microbianasque podrían alterar las muestras se recomiendano prolongar la conservación a 4ºC más allá de72 h. Si la determinación se difiere a fechasposteriores o se almacenan las muestras paraarchivo se recomienda congelación que debe sera –70ºC para períodos prolongados.

4. PROCESAMIENTOExisten diversos métodos comerciales para ladeterminación de marcadores de infección por el VIHque han sido aprobados por la OMS y la UE para estaaplicación. Recomendamos por tanto seguir elprotocolo y las indicaciones que proporcionan lascompañías fabricantes.Las estrategias de cribado y confirmación aconsejan elseguimiento de protocolos que se pueden consultar enla versión desarrollada en el documento científico deeste procedimiento. En todo caso la técnica utilizadaen primera instancia debe ser la que posea la máximasensibilidad y las siguientes deben optimizar laespecificidad.

5. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓNDE LOS RESULTADOSLos resultados se expresan en términos cualitativos depositivo o negativo. Es aconsejable disponer de almenos dos técnicas de cribado de anticuerpos frenteal VIH y utilizar un método de confirmación conmuestras del mismo paciente tomadas en momentosdiferentes.Del conjunto de pruebas realizadas deberá resultar laemisión de un diagnóstico claro y concluyente, o bienla formulación de recomendaciones precisas para elseguimiento y diagnóstico definitivo.

6. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general deorganización del Laboratorio de Microbiología y enlas fichas de descripción de los puestos de trabajo.El procedimiento deberá llevarse a cabo por personaltécnico cualificado con un entrenamiento específico.La supervisión de la técnica y de los resultadosemitidos deberá realizarla el Facultativo EspecialistaResponsable del Laboratorio de Microbiología quelos emite.

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Diagnóstico serológico de la infección porel VIH

Edición Nº 01 Página 3 de 3

7. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiologíadeberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.Las pruebas están basadas en distintos principiostécnicos que han ido evolucionando con el tiempo, laexperiencia adquirida y las recomendacionesnacionales e internacionales. A pesar de los avanceslogrados en el desarrollo de las mismas se siguenproduciendo casos de falsos positivos, y con menorfrecuencia, de falsos negativos. Estos errores debenser minimizados y son atribuibles en parte alprogresivo crecimiento de la demanda analítica enlos ámbitos comunitario y hospitalario y puedenprovocar situaciones que generan ansiedad en lospacientes y desconcierto en los profesionalesresponsables de la misma. La adopción deprotocolos viables adaptados a la realidad de cadalaboratorio pueden minimizar los errores delprocedimiento.

8. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLas limitaciones que se presentan con estas pruebasson similares a los de otras pruebas de diagnósticoserológico, aunque en este caso adquieren unaimportancia mayor por las posibles consecuencias yla trascendencia clínica de la infección.Desde el punto de vista serológico en la infección porel VIH ocurren cambios en la dinámica de producciónde anticuerpos desde el momento de laseroconversión. El período ventana de dos a cuatrosemanas de duración se caracteriza por la ausenciade anticuerpos y la presencia de antígeno p24. Enlos estadíos finales de la infección puedendesaparecer los anticuerpos frente a algunas de lasproteínas estructurales internas del VIH (p17, p24,p55) lo cual condiciona la ausencia de criterios depositividad en el WB, a pesar de existir una infección.

9. BIBLIOGRAFÍA1. World Health Organization. HIV assays: operationalcharacteristics (Phase 1) report 15 antigen/antibody ELISAs.Geneva, 2004. Disponible en http://www.Who.int/diagnostics_laboratory/evaluations/hiv/en.2. Ortiz de Lejarazu R, Cisterna R, Eiros JM, González A,Maroto MC, Pumarola T, Romero J. DiagnósticoMicrobiológico de la infección por el VIH. En: Picazo JJ, ed.Procedimientos en Microbiología Clínica. Sociedad Españolade Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica,Madrid, 1998, número 6.

PNT-VIH-02 DETECCIÓN DE LA CARGA VÍRICA PLASMÁTICA (CVP) DEL VIH

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DOCUMENTO TÉCNICO

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Determinación de la carga vírica plasmática(CVP) del VIH-1

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1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología básica para la determinación decarga vírica plasmática (CVP) del VIH-1 en muestrasde sangre mediante amplificación de ácidos nucleicos.Este procedimiento es aplicable a todos loslaboratorios de microbiología clínica que realicenseguimiento de pacientes infectados por el VIH oenvíen muestras a laboratorios de referencia.

2. FUNDAMENTOUna vez purificado el ARN de las partículas víricascirculantes en plasma, las diferentes técnicas utilizanRT-PCR, u otro procedimiento de biología molecularcomo bADN o NASBA, para amplificar una regiónconservada de HIV-1. La purificación y amplificaciónse realizan simultáneamente con una cantidadprefijada de un control cuya señal puede diferenciarsecon sondas específicas de tal forma que permite unacuantificación precisa.La técnica de determinación de la CVP consta de lassiguientes fases:

- Fase de extracción de ácidos nucleicos, a partirde muestras de plasma.

- Fase de retro-transcripción y amplificación. En lastécnicas basadas en RT-PCR el ARN liberado delas muestras es transcrito en cADN yposteriormente se amplifica mediante el uso deprimers específicos. La técnica de bADN consisteen una hibridación de este ARN a pocillos consondas homólogas para detectarseposteriormente con sondas ramificadas marcadascon un enzima que actúa sobre un sustratoluminiscente. La técnica de NASBA amplificadirectamente a partir del ARN por unprocedimiento isotermo.

3. MUESTRASLa muestra adecuada para la determinación de laCVP del VIH-1 es plasma obtenido a partir sangreanticoagulada con EDTA o citrato (ACD). Lascondiciones para la recogida y el transporte, cuandosea necesario desde otros laboratorios al laboratoriode referencia son:

- Centrifugar el tubo de sangre a 1000-1500g(generalmente equivale a 2000-2500 rpm)durante 10 minutos a temperatura ambiente antesde las 6 horas siguientes a su obtención.

- En condiciones asépticas (se recomiendanpipetas Pasteur estériles), transferir 1 mL deplasma a criotubos con tapón de rosca de 1,5 mLde capacidad (3 ó 4 dependiendo del volumen demuestra y de las necesidades de archivo)

- Identificar correctamente (iniciales del paciente,referencia en origen y fecha de extracción) loscriotubos.

- La CVP del VIH-1 del plasma separado es establedurante 24 horas a temperatura ambiente ydurante 6 días a 4ºC. Si la determinación sedifiere a fechas posteriores o se almacenan lasmuestras para archivo se recomiendacongelación.

- Congelar inmediatamente a –70ºC o en hieloseco para trasporte. Mantener a -70ºC paraalmacenamiento a largo plazo.

4. PROCESAMIENTOExisten diversos métodos comerciales para ladeterminación de la CVP del VIH-1 que han sidoaprobadas por la UE para esta aplicación.Recomendamos por tanto seguir el protocolo yrecomendaciones que proporcionan los fabricantes.Para la extracción del ARN vírico también sepropone emplear alguno de los métodos que losfabricantes recomiendan, ya que son los que hansido validados para el uso con dichos protocolos.

5. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓNDE LOS RESULTADOS.

Los resultados se expresan como copias del VIH-1 pormililitro de plasma. Es recomendable ofrecersimultáneamente el equivalente en logaritmo decimalde la CVP por la frecuencia de recomendaciones queestán basadas en esta escala.

6. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general deorganización del Laboratorio de MicrobiologíaMolecular y en las fichas de descripción de lospuestos de trabajo.El procedimiento deberá llevarse a cabo por personaltécnico cualificado con un entrenamiento específico.La supervisión de la técnica y de los resultadosemitidos deberá realizarla el Facultativo EspecialistaResponsable del Laboratorio de MicrobiologíaMolecular.

7. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiologíadeberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de microbiología.La exigencia tradicional de división de áreas para lastécnicas de amplificación es mucho menos críticapara algunas de las técnicas actuales,fundamentalmente las basadas en PCR en tiemporeal, ya que no es necesario manipular el productoamplificado al realizarse la detección en el mismotubo de amplificación mientras se lleva a cabo elprocedimiento.

8. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOEn situaciones, como extracciones de neonatos, enlas que es imposible disponer de la cantidad deplasma establecida por la técnica se puede recurrir aprocesar una cantidad menor con la consiguientemodificación del umbral de detección: por ejmplo, sise procesan 200 µL en lugar de 1 mL y el resultadoes negativo debemos interpretar < 250 cp/mL enlugar de <50. De la misma manera se debemultiplicar cualquier resultado positivo por el factor

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Determinación de la carga vírica plasmática(CVP) del VIH-1

Edición Nº 01 Página 3 de 3

de dilución, 5 en este caso, para normalizar la CVP a1 mL.

9. BIBLIOGRAFÍA1. Bartlett J.G., Gallart J.E. Medical management of HIVinfection. Johns Hopkins University 2003. Baltimore, MD.

PNT-VIH-03 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA LA DETECCIÓN DE RESISTENCIAS A

ANTIRRETROVIRALES

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DOCUMENTO TÉCNICO

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Secuenciación de ácidos nucleicos para ladetección de resistencias a antirretrovirales

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1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología básica de las fasespreanalíticas y postanalíticas para la determinación deresistencias a antirretrovirales en muestras clínicasmediante secuenciación de ácidos nucleicos.Este procedimiento es aplicable a todos loslaboratorios de microbiología clínica que realicen ladetección de resistencias a antirretrovirales mediantetécnicas genotípicas y a aquellos que envíen muestrasa laboratorios de referencia.

2. FUNDAMENTOLas técnicas de secuenciación de ácidos nucleicospermiten conocer la secuencia de bases del gen pol(proteasa y transcriptasa reversa) y localizar loscambios de aminoácidos relacionados con laresistencia a los fármacos antirretrovirales.En la técnica de secuenciación, el proceso completoconsta de cuatro fases:

- Fase de extracción de ácidos nucleicos, a partirde muestras de plasma/suero.

- Fase de retro-transcripción y amplificación. ElARN liberado de las muestras es transcrito encADN y posteriormente se amplifica mediante eluso de primers específicos el gen pol del VIH-1.

- Fase de secuenciación: El producto amplificadose somete a una nueva amplificación conconcentraciones limitantes de dideoxinucleótidos(ddNTPs) marcados (secuenciaciónunidireccional) y con primers específicos (si estosson los que están marcados, entoncessecuenciación bidireccional).

- Fase de revelado: Mediante el empleo de unsecuenciador automático los amplificados seresuelven mediante electroforesis capilar overtical, obteniéndose un electroferograma con lasecuencia de bases.

Finalmente, la secuencia de ácidos nucleicos seedita y se compara, mediante el empleo de unsoftware específico o de programas dealineamiento de secuencias, con una secuencia dereferencia y sin mutaciones.

3. MUESTRASLas muestras adecuadas para el estudio genotípicode resistencias son plasma o suero. Las condicionespara la recogida y el transporte, cuando seanecesario desde otros laboratorios al laboratorio desecuenciación son:

- Centrifugar el tubo Vacutainer a 2500 rpm.durante 10 minutos.

- En condiciones asépticas (se recomiendanpipetas Pasteur estériles), transferir 1 ml deplasma a criotubos con tapón de rosca de 2 ml decapacidad (3 ó 4 dependiendo del volumen demuestra).

- Identificar correctamente (iniciales del paciente,referencia en origen y fecha de extracción) loscriotubos.

- Congelar inmediatamente a –70ºC o en sudefecto a –20ºC.

- Enviar al laboratorio de secuenciación dosalícuotas de cada paciente junto al volante depetición. El resto de alícuotas se conservan en ellaboratorio de origen.

- En el momento de la recogida por la empresa detransportes, introducir dos alícuotas de cadapaciente en un recipiente de seguridad biológica(SARSTEDT o similar), y este en un contenedorde poliestireno para envío refrigerado con hieloseco. Precintar y enviar.

Nota.- Debe efectuarse la separación del plasma enlas 2-3 horas desde el momento de la extracción. Lamuestra se puede enviar sin congelar siempre quela recepción en el laboratorio de secuenciación sevaya a realizar en el mismo día de la extracción. Encaso contrario es necesario congelarla en ellaboratorio de origen.

4. PROCESAMIENTOExisten diversos métodos comerciales para larealización de la técnica, que no se van a describir eneste procedimiento. Se recomienda ceñirseestrictamente al protocolo que proporcionan losfabricantes. Para la extracción del ARN vírico tambiénse propone emplear alguno de los métodos que losfabricantes recomiendan, ya que son los que han sidovalidados para el uso con dichos protocolos.Además, existen métodos caseros o “in house” para lasecuenciación de la proteasa y de la transcriptasainversa (TI) del VIH-1.En ambos casos, y en especial cuando se empleenmétodos caseros, se recomienda la suscripción aalgún programa de control de calidad externo.

5. OBTENCIÓN, INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓNDE LOS RESULTADOS.

Para la obtención de resultados se deben seguir,entre otras, las siguientes recomendaciones:

- Se necesita una secuencia bidireccional al menosdesde los codones 10 a 94 de la proteasa y 41 a236 de la TI.

- Al editar la secuencia, es necesario revisar almenos todos los codones de resistencia. Esrecomendable revisar también todos los cambioscon respecto a la cepa salvaje elegida, y todas lasposiciones en que existan diferencias entre lasecuencia 5´ y la 3´. Prestar especial atención alas mezclas (heterocigotos) y valorarlasespecialmente cuando se presenten en ambasdirecciones.

- La calidad de la secuencia se puede determinaren programas de libre acceso en internet (ejemplo:http://hivdb.stanford.edu/).

- Controlar las posibles contaminaciones entremuestras a la hora de la secuenciación, medianteel empleo de alguna herramienta que permitaalinear la secuencia en estudio con todas las quese hayan realizado en el laboratorio(fingerprinting). Diferencias entre secuencias pordebajo de 20 bases indican una posiblecontaminación. Este procedimiento permitirá

PNT-VIH-03Servicio de MicrobiologíaHospital……………………………………………..

Secuenciación de ácidos nucleicos para ladetección de resistencias a antirretrovirales

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además establecer vínculos epidemiológicos en latransmisión de cepas entre distintos pacientes.

- En el informe de resultados se debe proporcionarla lista de mutaciones en la transcriptasa inversay en la proteasa, y un informe comprensible de laresistencia esperada a los distintosantirretrovirales, con indicación expresa de lafuente utilizada para la interpretación de lasmutaciones de resistencia y su fecha deactualización. Para ello, se debe utilizar unalgoritmo de reciente actualización.

- Se recomienda no tener una demora en laemisión de resultados superior a 10 días.

6. RESPONSABILIDADESDeben estar descritas en el manual general deorganización del Laboratorio de MicrobiologíaMolecular y en las fichas de descripción de lospuestos de trabajo.El procedimiento deberá llevarse a cabo por personaltécnico cualificado con un entrenamiento específico.La supervisión de la técnica y de los resultadosemitidos deberá realizarla el Facultativo EspecialistaResponsable del Laboratorio de MicrobiologíaMolecular.

7. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiologíadeberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de microbiología.Para la realización de la técnica que se describe sedeben tener en cuenta diversos aspectosestructurales, aplicables en general a todas lastécnicas de amplificación. Para la secuenciación dede ácidos nucleicos en general se precisan al menostres zonas o áreas diferentes dentro del laboratorio:1) La denominada “zona limpia” donde se prepararánlos reactivos; 2) La zona para la preparación de lamuestra (fase de extracción) y preparación de lasmezclas de amplificación y de secuenciación; 3) elárea para el manejo del material amplificado y/osecuenciado (fase de detección). En cada zona detrabajo debe existir un material (pipetas, puntas,batas de laboratorio, marcadores, etc.) específico decada zona. Nunca se debe trasladar material entrezonas, salvo el estrictamente necesario y siempre endirección 1 a 3. Como recomendación general,deberán evitarse, en lo posible las manipulacionesinnecesarias y extremarse las precauciones tanto enlo referente al manejo de las muestras como a ladispensación de los reactivos.

8. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLa sensibilidad de la técnica se ve disminuida engran medida cuando se emplean muestras con cargavírica <500-1000 copias/mL. Se pueden emplearmétodos de concentración del ácido nucleico en elplasma y entonces se consiguen amplificar muestrascon <500 copias/mL.El objetivo de esta determinación es proporcionaruna herramienta útil al clínico para diseñar unrégimen de tratamiento antirretroviral: en este sentidohay que destacar que estos métodos no detectanvariantes minoritarias y que por lo tanto no aseguranel éxito de un antirretroviral, sino que más bienpredicen el fracaso.El diseño del nuevo régimen mejora si lainterpretación va acompañada del consejo deexpertos, o si se ha realizado con un sistema expertoque haya sido validado clínicamente.Estos métodos no son válidos para nuevas drogashasta que se diseñen los algoritmos de interpretacióny se validen clínicamente.

9. BIBLIOGRAFÍA1. García F, Aguilera A. Pruebas de resistencia. En:“Resistencia a los antirretrovirales 2005”. Ed. Soriano V.Publicaciones Pernmayer. 2005.2. Kwok J, Higiçuchi R. Avoiding false positives with PCR.Nature 1989; 339:237-238.3. Panel on clinical practices for treatment of HIV infection.Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1infected adults and adolescents. Disponible enhttp://aidsinfo.nih.gov. Octubre, 2005.4. Shafer RW. Genotypic testing for humanimmunodefficiency virus type 1 drug resistance. ClinMicrobiol Rev 2002; 15:247-277.