5’- ACCACTGGAACTGCGA -3’ · Las enzimas de restricción Secuencias específicas de...
9
A C G T 5’- ACCACTGGAACTGCGA -3’ M.R. + ddATP M.R. + ddCTP M.R. + ddGTP M.R. + ddTTP O O H H H H O H H P O O- P O O O - P O - O O - BASE ddNTP 1’ 2’ 3’ 4’ 5’
Transcript of 5’- ACCACTGGAACTGCGA -3’ · Las enzimas de restricción Secuencias específicas de...
A C G T5’- ACCACTGGAACTGCGA -3’
M.R.+
ddATP
M.R.+
ddCTP
M.R.+
ddGTP
M.R.+
ddTTP
OO
H
HH
H
O
HH
P
O
O-
P
O
O
O-
P
O
-O
O-
BASE
ddNTP
1’2’3’
4’
5’
El código genético
Gly
Arg
Ser
Arg
Trp
Cys
Glu
Asp
Lys
Asn
Gln
His
STOPSTOP
Tyr
Ala
Thr
Pro
Ser
Val
Met
Ile
Leu
Leu
Phe
GGG
GGA
GGC
GGU
AGG
AGA
AGC
AGU
CGG
CGA
CGC
CGU
UGG
UGA
UGC
UGU
GAG
GAA
GAC
GAU
AAG
AAA
AAC
AAU
CAG
CAA
CAC
CAU
UAG
UAA
UAC
UAU
GCG
GCA
GCC
GCU
ACG
ACA
ACC
ACU
CCG
CCA
CCC
CCU
UCG
UCA
UCC
UCU
GUG
GUA
GUC
GUU
AUG
AUA
AUC
AUU
CUG
CUA
CUC
CUU
UUG
UUA
UUC
UUU
G
A
C
U
GACU
GACUGACUGACUGACU
Segunda posiciónPr
imer
a pos
ición
(ext
rem
o 5’)
Terc
era p
osici
ón (e
xtre
mo 3
’)
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
hebra conductora
hebra retardada
dirección de la horquilla de
replicación
replisoma
5’
3’
5’
3’
la primasa sintetiza un cebador de RNA
5’
3’
5’
3’
fragmento de Okasaki
la DNA pol III extiende el fragmento de Okasaki
5’
3’
5’
3’
la DNA pol I elimina el cebador de RNA por
transcripción con mella
5’
3’
5’
3’
E P A
IF-2GTP
subunidad 30S
5’ 3’mRNA
IF-2GTP
f-Met
IF-1
IF-3
Complejo de iniciación 30S
E P A
Complejo de iniciación 70S
P A
E P A
P A
E P A
subunidad 50S
IF-1IF-3
Codón de iniciación
Secuencia Shine-Dalgarno
IF-1IF-3
f-Met
E P A
IF-2GDP
IF-3
f-Met
IF-1
© Gonzalo ClarosJosé L. Urdiales 2002
La hidrólisis de GTP y la interacción con la subunidad 50S permiten la liberación de los tres IF
Entre IF-1 e IF-3 provocan la disociación de las subunidades del ribosoma
Biosíntesis de proteínas.Iniciación en procariotas
EF-G
EF-G
E P A
3 4 5
Peptidil tRNA
5’ 3’2 6 7
El ribosoma está listo para comenzar otro ciclo después de haber terminado la iniciación, o bien después de haber terminado un ciclo de elongación
EF-Tu
aa5
GTP
3 4 55’ 3’2 6 7
EF-Tu
GDP
Formación del enlace peptídico entre aa4 y aa5
E P A
3 4 55’ 3’2 6 7
Complejo inestable puesto que el peptidil-tRNA se encuentra sobre el sitio A y no el P
E P A
Ubicación
Corrección
Transpeptidación
Translocación
Situación equivalente a la
original, pero con el péptido
más largo
E P A
GTP
GDP
GTP
EF-Ts
GDP
EF-Tu
EF-Ts
GTP
EF-Tu
GTPaa5
tRNA
© Gonzalo ClarosJosé L. Urdiales 2002
f-Met 234
f-Met 234
f-Met 2345
5
3 4 55’ 3’2 6 7
f-Met 2345
E P A
3 4 55’ 3’2 6 7
f-Met 2345
Biosíntesis de proteínas.Elongación en procariotas
UAA
RRF
Dependiendo del codón de terminación, intervendrá
RF1 o RF2
UAA5’ 3’
E P A
UAA
E P
RF1 o RF2 provocan la liberación del péptido
RF3
UAA
E P
La hidrólisis de GTP provoca la liberación
de RF1 o RF2
GTP
UAA
E P
La hidrólisis de GTP provoca la liberación de RF1 o RF2. RF3
ocupa el sitio A
RF3
GDP
RF1
GGQ
RF1
GGQ
RF1
GGQ RF3
GTP
Reciclaje del ribosoma
UAA
E P
RF3
GDPRRF
RRF
EF-G
EF-G
GTP
GDP
IF-3
UAAIF-3
Este complejo es lento de disociar.
Para acelerarlo se necesita IF-3
© Gonzalo ClarosJosé L. Urdiales 2002
RF1
GGQ
E P A
Complejo pre-30S listo para comenzar otra iniciación
Biosíntesis de proteínas.Terminación en procariotas
Principales pasos en la generación de moléculas de DNA recombinante
Aislamiento del DNA genómico
Generación de fragmentos con enzimas de restricción
linealización del vector con enz. de restricción
Ligación de los fragmentos con el vector
Introducción de las moleculas recombinantes en una célula hospedadora
Propagación de células individuales para producir clones
Vector
Moleculas de DNA recombinantes
DNA genómico
Célula
Vector linealizado
Fragmentos de DNA genómico
Las enzimas de restricciónSecuencias específicas de reconocimiento de algunas enzimas de restricción
C’TCGAGXhoIXanthomonas holcicolaT’CTAGAXbaIXanthomonas badriiCTGCA’GPstIProvidencia stuartii 164GGTAC’CKpnIKlebsiella pneumoniaeC’CGGHpaIIHaemophilus parainfluenzae
A’AGCTTHindIIIHaemophilus influenzae Rd
GG’CCHaeIIIHaemophilus aegyptius‘CCTGGEcoRIIEscherichia coli R245G’AATTCEcoRIEscherichia coli RY13G’GATCCBamHIBacilus amyloliquefaciens HGGGCC’CApaIAcetobacter pasterianus
SecuenciaEnzimaFuente
HindIII 0.87T7
BamHI 2.47
SP6
EcoRI 3,39EcoRVBstXINotIXhoIXbaIApaI
HindIII 0.87T7
BamHI 2.47
SP6
EcoRI 3,39EcoRVBstXINotIXhoIXbaIApaI
P CMV
HDC 1/512
MER
bGH pAP SV40 ori
Neo
SV40 pA
Amp
pJL-4.37.88 kb
Plasmid name: pJL-4.3Plasmid size: 7.88 kbConstructed by: José LuisConstruction date: Febrero 98Comments: HDC 1/512 fusionada al dominio de unión al ligando del receptor de estrógenos modificado (mutación de la Gly - 525 a Arg). Clonado en HindIII-EcoRI.
-5
0
5
10
15
-dF
luo
/dT
100
150
200
250
300
350
Flu
ore
sce
nci
a (
UA
)
70 75 80 85 90 95 100
Temperatura (°C)
Curva de desnaturalización
0
50
100
150
200
250F
luo
resc
en
cia
(U
A)
0 5 10 15 20 25 30
Ciclo
Curvas de amplificación
PCR en tiempo real
