INFORME DE LABORATORIOPRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN DE BENZODIACEPINAS – TRANQUILIZANTES MENORES

Cristian Alexander Guzmán Santofimio.

Cristian Alberto Triana Basabe.

Andrea Vivian Ortegón Vergara

Liseth Katherine Velásquez Martínez

Docente

Edgar Hernán Beltrán

UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCAFACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICOTOXICOLOGIA LABORATORIO

BOGOTÁ D.C2010

OBJETIVOS

Determinar la presencia de tranquilizantes menores, específicamente de Benzodiacepinas (Lorazepam) en la muestra biológica adecuada para esta prueba.

Objetivos específicos

1. Comprender la estructura química de las Benzodiacepinas y el efecto causante en el organismo, después de su administración, su mecanismo de acción, metabolización y forma de excreción.

2. Describir el uso farmacológico y terapéutico de las benzodiacepinas.

3. Conocer el fundamento y aplicar la técnica de Cromatografía en Capa Fina para la determinación de benzodiacepinas (Lorazepam) en Orina.

MARCO TEÓRICO – PRE-LABORATORIO

FARMACOCINETICA DE LAS BENZODIACEPINASABSORCIÓN Se absorben rápido y completamente por vía oral, salvo el clorazepato que es una

BENZODIACEPINAS

MECANISMOS DE ACCION

El GABA es el neurotransmisor inhibitorio más importante del SNC

de los mamíferos y se estima que entre el 30 y 50% de las sinapsis del

cerebro son gabaérgicas.

EFECTOS FARMACOLOGICOS

Las BZ son agentes GABA agonistas indirectos (GABA: ácido gamma amino butírico)

es decir que potencian o amplifican la neurotransmisión

gabaérgica inhibitoria.

Grupo de fármacos que producen enlentecimiento de las funciones nerviosas, por lo que producen relajación o sensación de calma. Se utilizan para tratar cuadros de pánico, contracturas musculares,

síntomas de nerviosismo, insomnio, ansiedad, y convulsiones.

ESTRUCTURA: Las benzodiacepinas

están compuestas por un anillo

bencénico (A) unido a un anillo

diazepinico (B).

Que las BZ necesitan una transmisión gabaérgica (sin

inhibidores) intacta para producir sus acciones

farmacológicas

están mediados por la activación de subtipos de receptores tipo A del GABA, requiriéndose la activación de receptores que contengan la subunidad α1 para conseguir el efecto sedante, mientras que la acción ansiolítica estará mediada por receptores que contengan la subunidad α2, pero no por receptores que contengan la subunidad 3.

Las BZD clásicas interaccionan de forma indiscriminada con todos los

tipos de receptores, por lo que cabe esperar de ellas todo el

abanico de efectos.

prodroga y se descarboxila rápidamente en el jugo gástrico a Ndesmetildiazepam (o nordiazepam) y luego se absorbe por completo. El midazolam es el compuesto más liposoluble y el flumazenil el menos liposoluble. La absorción por vía i.m. es irregular, en caso de ser necesaria la vía parenteral, la de elección es la i.v. Generalmente, el solvente que poseen es el polietilenglicol, es un polialcohol muy irritante que hace precipitar la BZ en el tejido muscular y por lo tanto se absorbe mal la droga.Cuando se administran por vía oral a los 30minutos aparecen los efectos ansiolíticos o hipnóticos.

DISTRIBUCIÓN

Las BZ son transportadas por la circulación sistémica a la circulación cerebral capilar, estos agentes tienen alto grado de unión a proteínas plasmáticas 80-95%, albúmina principalmente y debido a su escasa fracción libre pasan poco al líquido cefalorraquídeo.

Son muy lipofílicas, el comienzo de acción después de una dosis oral refleja el grado de absorción gastrointestinal (aproximadamente 30 min.); la duración de acción demuestra el porcentaje de distribución en tejidos periféricos, el grado de unión a proteínas plasmáticas y el porcentaje de aclaramiento y eliminación.

Solo la fracción libre es farmacológicamente activa y es la que difunde a través de las membranas biológicas. La alta unión a proteínas plasmáticas también influencia en la cantidad de droga captada por el cerebro, así la concentración de droga libre en plasma refleja la concentración cerebral. El volumen de distribución aparente es amplio (1-2 litros/kg), debido a que estas drogas luego de concentrarse en el cerebro sufren una redistribución tisular periférica sobre todo en lípidos y músculo.

BIOTRANS-FORMACIÓN

En general las BZ son metabolizadas primariamente por enzimas microsomales hepáticas, sufriendo oxidación microsomal (fase I) y luego glucuronoconjugación (fase II). A diferencia de los barbitúricos no son potentes inductores enzimáticos hepáticos. La mayoría de las BZ deben ser primero oxidadas (metabolitos activos, fase I) y luego conjugadas (metabolitos inactivos, fase II). Los metabolitos oxidados son activos y pueden ligarse o unirse al receptor de BZ (aunque en general poseen menos actividad que la droga madre).

ELIMINACIÓN

La eliminación se realiza por filtración y secreción tubular principalmente metabolitos glucuronoconjugados y en menor cantidad los oxidados.

EFECTOS SECUNDARIOS El perfil toxicológico de las benzodiacepinas ansiolíticas es muy parecido, aunque la frecuencia y gravedad de las reacciones puede variar de unas a otras. En la mayor parte de los casos, las reacciones adversas son una prolongación de la acción farmacológica y afecta al SNC. Aproximadamente la mitad de los pacientes presentan en mayor o menor grado somnolencia durante los primeros días de tratamiento. Frecuentemente aparece: sedación, somnolencia, ataxia. Ocasionalmente: mareos, sedación, cefalea, depresión, desorientación, disfasia o disartria (alteración del lenguaje), temblor, cambios en la libido, alteraciones urinarias, diarrea o estreñimiento. Excepcionalmente: hepatitis, ictericia, dermatitis, urticaria, prurito, discrasias sanguíneas, alteraciones de la visión y audición. Pueden producir incoordinación motora con riesgo de caída, amnesia anterógrada (dificultad para recordar hechos recientes) y dificultad de concentración. La intensidad de los efectos depende de las dosis utilizadas y son más importantes en personas con alteraciones hepáticas y en ancianos porque al disminuir su metabolismo aumenta mucho su semivida plasmática.

CONTRAINDICACIONES: están contraindicadas (teratogénicas, pueden producir síndrome de abstinencia neonatal) en el embarazo y lactancia (pasan por la leche materna). También en la hipersensibilidad a la droga, en el glaucoma de ángulo estrecho (medicado o no) y en pacientes con glaucoma en ángulo abierto no medicado. En los ancianos debe disminuirse la dosis a la mitad. Los ancianos, son más susceptibles a los efectos depresores y pueden presentar además síndrome paradojal y síndrome confusional. Puede prolongarse la vida media y producirse acumulación. En la insuficiencia hepática, puede haber acumulación de BZ. Los pacientes con insuficiencia renal son más sensibles a los efectos depresores del SNC. En el asma severa, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, debido al peligro de producir apneas nocturnas y por la relajación muscular que producen las BZ podría disminuirse la capacidad ventilatoria. -En

pacientes con porfiria se puede producir un ataque agudo. La miastenia es otra contraindicación de las BZ, debido al efecto miorrelajante que producen.

TOXICOLOGIA Las BZ poseen amplio margen terapéutico es decir que la dosis efectiva 50 y la dosis letal 50 están muy distanciadas una de otra. Es por eso que una sobredosis de Bz (pura, no con otros depresores) como intento de suicidio, por ejemplo, raramente es mortal y cuando lo es seguramente la BZ se asoció a otra droga (ejemplo: alcohol). En casos de intoxicación aguda mantener libres las vías aéreas, monitorear signos vitales y administrar el antagonista flumazenil.

USOS TERAPEUTICOS Las BZ son agentes sintomáticos y solos son útiles en tratamientos a corto plazo debido al desarrollo de tolerancia de sus acciones farmacológicas (EJ: efecto hipnotico). Están indicadas en enfermedades orgánicas donde la ansiedad es un componente (úlcera, neurodermitis) o importante factor etiológico como las alteraciones psiconeuróticas que cursan con ansiedad, insomnio, tensión emocional. En alteraciones neuromusculares se comprobó que el diazepam es superior a cualquier otro relajante muscular como por ejemplo cari soprodol, clormezanona, baclofeno. También alivia las contracturas musculares, el dolor discal de las lesiones de la columna y también el tétanos. En la abstinencia alcohólica aguda, el diazepam es el agente de elección ya que controla el insomnio y la agitación. También son útiles para evitar o controlar el síndrome de abstinencia alcohólica (delirium tremens). Las BZ son útiles en todo tipo de convulsiones, en la medicación preanestésica y en anestesiología combinadas con otros agentes (midazolam+ fentanilo por ejemplo). Están indicadas en el insomnio sobre todo cuando es debido a mioclonos, o secundario a otra medicación o en el insomnio por dolor o stress (cambio de trabajo, fallecimiento de un ser querido, etc). El triazolam se prefiere en pacientes que les cuesta conciliar el sueño, por su acción rápida y vida media corta (5 horas) evitando el efecto residual matinal. El flunitrazepam, flurazepam y nitrazepam poseen acción prolongada, producen sedación matinal, pero no insomnio rebote.

TECNICAS DE DETERMINACIONExisten tres grandes grupos de técnicas analíticas: las inmunológicas, las cromatográficas y las colorimétricas. Estas últimas comprenden un gran número de reacciones químicas llevadas a cabo sobre la muestra con reactivos relativamente asequibles (por ejemplo la de Trinder para salicilatos, Fujiwara para hidrocarburos halogenados) y si bien han prestado y prestan un gran servicio a la toxicología de urgencia y de recursos limitados su baja especifidad y sensibilidad no permite recomendarlas para esta determinación.

Las técnicas inmunológicas se basan en la reacción antígeno-anticuerpo y comprenden el mismo conjunto de técnicas empleadas en química clínica, especialmente los enzimoinmunoensayos competitivos. Muchos psicofármacos pueden realizarse por polarización de fluorescencia (FPIA) y multiplicación enzimática (EMIT) y existen “casettes” con anticuerpos para los grupos de drogas usualmente encontrados en comas o accidentes (benzodiacepinas, antidepresivos tricíclicos, opiodes, cannabinoides, cocaína...). Las técnicas cromatográficas, por otra parte, se basan en la distinta solubilidad de los componentes de una muestra frente a una fase móvil y permiten la separación de todos esos componentes para su posterior identificación. Contrariamente a las técnicas anteriores el primer paso es una preparación o “clean up” de la muestra, que tiene por objeto a la vez concentrar las sustancias buscadas y eliminar las interferencias producidas por otros componentes de la orina

PROCEDIMIENTO

Se falseó la Muestra, se realizó una hidrólisis ácida, una extracción líquido-líquido y finalmente se procedió a realizar la cromatografía en capa fina para determinar benzodiacepinas en una muestra de Orina

delinear los Llenar por capilaridad el

Marcar la placa de

Tomar con un capilar el

Colocar el Eluyente

EXTRACCIÓN LIQUIDO-

Preparar la cámara

CROMATOGRAFIA EN

Pasar la fase orgánica a la

cápsula y

Redisolver en 1ml de éter de

petróleo y

Dejar 10 min. Se separan las

2 capas

Agregar 10 ml de éter de petróleo

RESULTADOS

Para la determinación de benzodiacepinas en orina, se utilizó el método de cromatografía en capa fina. Allí la muestra de orina se falseó con la adición de 8 gotas de Ativán. Este procedimiento, se realizó con el fin de que nuestra muestra sea positiva para benzodiacepinas partiendo del supuesto de que era completamente libre de estas inicialmente.

Después de la adición del Ativán, se realiza el protocolo de la cromatografía en capa fina con sus correspondientes reactivos. La última parte de este método, requiere de un eluyente compuesto por tolueno 20: 1 acetona.

Finalmente, se adicionan a la placa por medio de un frasco aspersor, nitrito de sodio (NaNO2) más NEDA (Neftilendiamina) con el fin de observar manchas o complejos de color morado-rosado, lo que indica que es positivo para benzodiacepinas. El resultado que obtuvimos fue negativo a pesar de que se falseo la muestra.

para que el eluyente suba por capilaridad

Sembrar patrón y Muestras (5

Colocar la placa de

silicagel en la

RESULTADO POSITIVO

Rociar con aspersor

Manchas de color morado

REVELAR

Dejar secar

Sacar la placa de la cámara y

Rociar con aspersor

RF= Distancia recorrida por la muestra RF=___1___ = 0.14285714 Distancia recorrida por el solvente 7

ANÁLISIS DE RESULTADOS

En la obtención de resultados se tuvieron algunos problemas. Las muestras mayormente no mostraron resultados positivos o no de manera muy clara, como se debía esperar y para esto se determinaron dos posibles causas:

Es factible que se agregara muy baja proporción de ativán (benzodiacepina patrón) a la muestra inicial, por lo que los resultados no fueron muy claros.

También es factible que el problema estuviera en el revelado de la placa, sea por que los reactivos (NEDA y Nitrito de Sodio) estuvieran contaminados o alterados de alguna manera; o porque la cantidad dispersada sobre la placa no fue la adecuada.

El resultado del RF se tomó en base a los resultados de la mesa 3, en la cual el frente de corrido fue igual a 7 cm y la distancia recorrida por el analito fue de 1 cm. El RF es específico para cada analito y para la fase móvil.

CONCLUSIONES

Los medicamentos benzodiacepinas poseen importantes acciones farmacológicas, propiedades toxicológicas y aplicaciones terapéuticas como anestésicos, anticonvulsivantes, sedantes, ansiolítico, hipnóticos y relajantes musculares. Actuando en gran medida sobre el sistema nervioso central.

La cromatografía de capa delgada corresponde a un sistema analítico que permite separar los diferentes componentes de una muestra problema, con el fin de identificarlos y/o cuantificarlos.

Debido a las propiedades toxicológicas de las benzodiacepinas, es de gran importancia saber realizar las técnicas para la determinación de esta en la muestra biológica mas adecuada, en este caso la orina, debido a su metabolización; ya que en toxicología de urgencias se reportan casos de intoxicación por este fármaco cuando es administrado en uso delictivo.

AUTOEVALUACIÓN

1 2 3 4

LOGRO-Objetivos cumplidos

FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD.

SI NO Dominio de los conceptos básicos utilizados en toxicología y diferenciación entre los tranquilizantes menores y tranquilizantes mayores.

Mala distribución del tiempo durante la práctica al procesar la muestra para determinación de benzodiacepinas.

Reorganización del material de trabajo aplicando el adecuado procedimiento para cualquier determinación.

X

BIBLIOGRAFÍA

Documentos web disponibles en:o http://www.minsa.gob.ni/enfermeria/doc_inter/benzodiacepinas.pdf o http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000042.nsf/

voDocumentos/66FD0F16FCE04F02C125725D003A8CC8/$File/DOSSIER%20BENZODIAZEPINAS.pdf

o http://med.unne.edu.ar/catedras/farmacologia/temas_farma/ volumen5/2_benzodiaz.pdf

o http://bernirey80.files.wordpress.com/2007/05/benzodiazepinas.pdf o http://www.sertox.com.ar/retel/n04/004.pdf