4-SeccionIV

Manual de Microbiologa aplicada a las Industrias Farmacutica, Cosmtica y de Productos Mdicos

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ISBN 978-987-26716-3-1

Seccin IV. Mtodos de Control.

pgina

Captulo IV.1. Ensayo de Esterilidad 249 Antonia Petracca y Alejandra Vzquez

Captulo IV.2. Endotoxinas bacterianas 276 Beatriz Giampaolo y Nlida Mondelo

Captulo IV.3. Control microbiolgico de Medicamentos no obligatoriamente 305 estriles

Mara Cristina Fernndez

Captulo IV.4. Verificacin de la Aptitud de mtodos microbiolgicos 325 Sergio Iglesias

Captulo IV.5. Valoraciones de Antibiticos por mtodos microbiolgicos 343 Mirta Franco

Captulo IV.6. Valoracin microbiolgica de Vitaminas 364 Graciela Torno

Captulo IV.7. Control microbiolgico de Cosmticos 372 Esteban Zarankin

Captulo IV.8. Control microbiolgico de Aguas 379 Sergio Iglesias y Mnica Lagomarsino

Captulo IV.9. El complejo Burkholderia cepacia 388 Jos Degrossi

Captulo IV.10. Monitoreo ambiental 401 Alejandra Vzquez y Claudio Denoya

Captulo IV.11. Mtodos rpidos para el anlisis microbiolgico de 428 productos farmacuticos

Luis Jimnez


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Captulo IV.1.

Ensayo de esterilidad

Antonia Petracca y Alejandra Vzquez

Consideraciones generales

Muestreo

Mtodos

Medios de cultivo

Prueba de Validacin para Bacteriostasis y Fungistasis

rea de Siembra

Personal

Procedimiento

Observacin e interpretacin de los resultados

Tecnologas para el ensayo de esterilidad. Desde las tradicionales avanzando a las automatizadas.

Microbiologa rpida

Ensayo de esterilidad: Tecnologa de Aisladores

Liberaciones paramtricas

Consideraciones Generales

El ensayo de esterilidad tiene por objeto revelar las contaminaciones por microorganismos que pueden estar presentes en los productos medicinales, biomdicos, sustancias y todo aquel material que segn las farmacopeas tienen como requisito ser estriles, ya sea que hayan sido esterilizados o que hayan sido preparados aspticamente.

El ensayo aparece por primera vez en la Farmacopea Britnica del ao 1932. En la Farmacopea de Estados Unidos (USP) XI se public en el ao 1936 para soluciones estriles, utilizando un medio lquido de peptona de

carne, e incubando el medio durante 7 das a 37 C. La USP XII describa el ensayo para slidos y lquidos estriles, se mencionaba la inactivacin de algunos conservadores y se investigaba la presencia de microorganismos aerobios y anaerobios. La USP XIII introdujo el uso del caldo de tioglicolato para detectar microorganismos aerobios, anaerobios y microaerfilos con un tiempo y temperatura de incubabacin de 7 das

a 37 C, y el caldo glucosado para detectar hongos y levaduras, incubndose durante 15 das a 22 - 25 C. Adems se describa el rea en la cual se desarrollaba el ensayo. En la USP XIV, se cambi la temperatura de

incubacin del tioglicolato, la que pas de 37 C a 32 - 35 C, debido al crecimiento de bacterias saprfitas no patgenas que podan estar presentes como contaminantes de los productos farmacuticos. El caldo glucosado se cambi por el caldo de Sabouraud, pero como en realidad no era conveniente que se utilizara un medio de cultivo selectivo para un control, luego se lo reemplaz por un caldo de 2 peptonas, que es el actual digerido pancretico de casena y digerido papaico de soja.

Estas consideraciones demuestran que se han sucedido cambios constantes que llevaron a perfeccionar las


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tcnicas de deteccin de la contaminacin, as como tambin se ensayaron y estudiaron distintos medios de cultivo, ya sea por parte de laboratorios de control estatal como privados.

El ensayo tiene limitaciones que derivan de 2 problemas insolubles:

1) La muestra adecuada; y

2) La imposibilidad de los medios de cultivo de permitir el crecimiento de todos los microorganismos viables que puedan estar presentes en la muestra.

Segn la bibliografa, esterilidad es el estado libre de microorganismos vivos de todo tipo. Este concepto es fcil de enunciar pero en la prctica es irreal, ya que no se puede demostrar experimentalmente, y por lo tanto es esencialmente el resultado de una operacin estadstica. Es imposible afirmar la esterilidad de una partida o lote, a menos que se controlen una por una todas las unidades.

Muestreo

La OMS se bas en los principios estadsticos para realizar un muestreo adecuado, que sea representativo del lote a analizar y por el cual se pueda detectar una posible contaminacin.

La probabilidad de aceptar por el resultado de un ensayo, lotes que tengan un determinado porcentaje de contaminacin est directamente relacionado al tamao de la muestra ms que al tamao del lote.

Existe adems el riesgo de rechazar lotes del producto por contaminaciones accidentales durante el ensayo.

Tomando una cantidad razonable de muestras para realizar el ensayo de esterilidad, se detecta solamente una contaminacin grosera. Por ello se llega a una conclusin: En la manufactura de un producto se deben tomar todas las precauciones necesarias para asegurar que el mismo sea estril.

En el ensayo de esterilidad deben incluirse no slo muestras representativas de todo el lote sino tambin muestras tomadas de las partes del lote ms expuestas al riesgo de contaminacin, como ser:

Productos envasados en asepsia: Muestras de envases llenados al inicio y al final de cada ciclo de llenado y luego de alguna interrupcin del trabajo

Productos esterilizados en su envase final: Muestras de la parte potencialmente ms fra de la carga de cada ciclo de autoclave.

Mtodos

Existen dos mtodos para realizar este ensayo, el de Transferencia Directa y el de Filtracin por membrana. En lo posible, el mtodo de eleccin para el ensayo de esterilidad es el de Filtracin por membrana.

Para este ensayo es preciso emplear una tcnica que sea simple, eficiente, reproducible, que permita analizar un gran nmero de muestras, que permita el crecimiento de la mayora de los microorganismos y que sea de bajo costo.

El nmero de unidades que se deben someter al ensayo y la cantidad de muestra de cada unidad que se debe ensayar, se corresponden con las Tablas N 1 y 2 1.


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Tabla 1- Nmero mnimo de unidades a ensayar en relacin al tamao del lote

TAMAO DEL LOTE (N de unidades del lote) *

TAMAO DE LA MUESTRA (N mnimo de unidades para el ensayo)**

Productos Inyectables < de 100 unidades >de 100 y de 500 >de 500 solucin parenteral de gran volumen

10 % 4 (el que sea mayor) 10 2 % 20 (el que sea menor) 2 % 10 (el que sea menor)

Antibiticos Slidos Envases de < 5 gr Envases 5 gr Graneles y mezclas

20 6 Ver granel de productos slidos

Productos oftlmicos y no Inyectables 200 > 200 Si la presentacin es en envases unidosis aplicar el esquema para Productos Inyectables (2)

5 % 2 (el que sea mayor) 10

Dispositivos Mdicos 100 > 100 y 500 > 500

10 % 4 (el que sea mayor) 10 2 % 20 (el que sea menor)

Granel de Productos Slidos 4 envases > 4 y 50 > 50

Todos 20 % 4 (el que sea mayor) 2 % 10 (el que sea mayor)

Tabla 2- Cantidad de muestra a ensayar

CONTENIDO DE CADA ENVASE

CANTIDAD MNIMA TOMADA DE CADA ENVASE PARA CADA MEDIO DE CULTIVO

Lquidos < de 1 mL >1 y a 40 mL < a 40 mL y < a 100 mL >a 100 mL Antibiticos lquidos

Todo el contenido de cada envase Mitad del contenido, de cada envase pero no < a 1 mL 20 mL 10% del contenido del envase pero no < a 20 mL 1 mL

Slidos < de 50 mg > de 50 mg a < de 300 mg 300 mg a 5 gr > a 5 gr

Todo el contenido del envase Mitad del contenido, de cada envase pero no < a 50 mg 150 mg 500 mg

Antibiticos a granel 500 mg

Materiales quirrgicos, algodn, gasa 100 mg/ paquete

Suturas y otros materiales descartables Envase completo

Otros dispositivos medicos Dispositivo completo, cortado en piezas o desarmado


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Tabla N 3- Cantidades para artculos lquidos en relacin al volumen de los medios de cultivo

Contenido del envase (ml)

Volumen mnimo tomado de cada envase para cada medio

Volumen mnimo de cada medio Usado para transferencia directa del volumen tomado de cada envase (ml)

Usado para membrana o media membrana representando el total del volumen de un nmero apropiado de envases (ml)

Menos de 10 1 ml, o el contenido total si es menor de 1 ml

15 100

10 a menos de 50 5 ml 40 100

50 a menos de 100 10 ml 80 100

50 a menos de 100, para administracin intravenosa

Contenido completo - 100

100 a 500 Contenido completo - 100

Ms de 500 500 ml - 100

Medios de Cultivo

Los medios de cultivo empleados en este ensayo son dos caldos, el Medio fluido de tioglicolato y el Caldo de peptonas de soja y casena. Se debe controlar la fertilidad del medio, la posibilidad de detectar una contaminacin baja y la esterilidad del mismo. Los medios de cultivo pueden prepararse de acuerdo a las frmulas que se dan a continuacin o empleando mezclas deshidratadas comerciales de frmulas similares que, despus de reconstituidas siguiendo las recomendaciones dadas por el fabricante, cumplan con la Prueba de promocin del crecimiento. Tambin pueden adquirirse medios preparados listos para usar.

Medio Fluido de Tioglicolato

L-Cistina 0,5 g Agar 0,75 g Cloruro de sodio 2,5 g Glucosa (C6H12O6.H2O) / (C6H12O6) 5,5 g/ 5,0 g Extracto de levadura (soluble en agua) 5,0 g Digerido pancretico de casena 15,0 g Tioglicolato de sodio 0,5 g o Acido tiogliclico 0,3 ml Solucin de resazurina sdica (0,1 %), recin preparada 1,0 ml Agua purificada c.s.p 1 000 ml

pH despus de la esterilizacin: 7,1 0,2.

Mezclar y calentar hasta disolucin completa. Ajustar el pH del medio con hidrxido de sodio 1 N de modo que, despus de la esterilizacin, tenga un pH de 7,1 0,2. Si fuera necesario, filtrar en caliente a travs de un papel de filtro humedecido. Distribuir el medio en recipientes de vidrio que ofrezcan una relacin entre la superficie expuesta y la profundidad de medio, tal que no ms de la mitad superior experimente un cambio de color al final del perodo de incubacin, indicativo de la fijacin de oxgeno. Esterilizar usando un proceso validado. Si ms del tercio superior ha tomado una coloracin rosada, el medio podr recuperarse por una sola vez, calentndolo en un bao de agua o con vapor fluente, hasta que desaparezca el color. Cuando el medio est listo para usar, no ms del dcimo superior debe tener un color rosado.


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Usar el Medio Tioglicolato para incubacin en condiciones aerbicas a una temperatura de 30 - 35 C. Para productos que contengan sustancias mercuriales puede usarse este medio de cultivo en el Mtodo directo, como reemplazo del Caldo de peptonas de soja y casena, incubndolo a 20 - 25 C. Incubar ambos medios durante 14 das, observndose a intervalos regulares.

Caldo Tioglicolato Alternativo

L-Cistina 0,5 g Cloruro de sodio 2,5 g Glucosa (C6H12O6.H2O) / (C6H12O6) 5,5 g/5,0 g Extracto de levadura (soluble en agua) 5,0 g Digerido pancretico de casena 15,0 g Tioglicolato de sodio 0,5 g o Acido tiogliclico 0,3 ml Agua purificada c.s.p 1000 ml


Disolver los componentes slidos en el agua, calentando suavemente si es necesario hasta obtener una solucin. Ajustar la solucin con hidrxido de sodio 1 N de manera que, despus de la esterilizacin, tenga un pH de 7,1 0,2. Filtrar si fuera necesario, colocar en recipientes adecuados y esterilizar por autoclave. El medio debe ser recientemente preparado o calentado en un bao de vapor y enfriado rpidamente antes de su uso. No se debe recalentar. Usar el Caldo Tioglicolato Alternativo para incubacin en condiciones anaerbicas a una temperatura de 30 - 35 C

Caldo Digerido de Casena - Soja

Digerido pancretico de casena 17,0 g Digerido papanico de harina de soja 3,0 g Glucosa (C6H12O6.H2O) / (C6H12O6) 2,5 g/2,3 g Fosfato dibsico de potasio. 2,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Agua purificada c.s.p 1 000 ml


Disolver los componentes slidos en el agua, calentando suavemente. Enfriar la solucin a temperatura ambiente y ajustar con hidrxido de sodio 1 N, si fuera necesario, para obtener un pH de 7,3 0,2 despus de la esterilizacin. Filtrar si fuera necesario y envasar en recipientes adecuados. Esterilizar por un proceso validado. Usar el Caldo Digerido de Casena - Soja para incubacin en condiciones aerbicas a una temperatura de 20 - 25 C.

Medios para penicilinas y cefalosporinas

Cuando el Medio Fluido de Tioglicolato y el Caldo de Peptonas de Soja y Casena se emplean en el Procedimiento de transferencia directa para penicilinas o cefalosporinas, transferir en forma asptica a cada tubo de medio, una cantidad de penicilinasa suficiente para inactivar la cantidad de antibitico presente en la muestra. Determinar la cantidad apropiada de penicilinasa a usar para este propsito utilizando una preparacin de penicilinasa, cuya actividad haya sido determinada previamente o confirmar que la cantidad de penicilinasa transferida es la apropiada efectuando el Ensayo de validacin para bacteriostasis y fungistasis, usando menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) y observando desarrollo microbiano tpico. [NOTA: en los medios utilizados para la prueba de esterilidad por filtracin por membrana, tambin puede ser necesario el agregado de penicilinasa].


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Esterilidad de los medios de cultivo

Confirmar la esterilidad de cada lote de medio de cultivo, a travs de la incubacin de al menos una porcin del lote a la temperatura especificada y durante no menos de 14 das, o incubando un recipiente con medio no inoculado como control negativo durante la realizacin de cada prueba de esterilidad.

Prueba de promocin del crecimiento

Examinar cada carga esterilizada de cada lote de medio de cultivo para determinar su capacidad de promover el crecimiento microbiano, a travs de la inoculacin por duplicado, en envases separados de cada medio, de menos de 100 microorganismos viables de cada una de las cepas descriptas en la Tabla 3, e incubando en las condiciones especificadas.

Los medios de cultivo son aceptables si existen evidencias de crecimiento en todos los envases inoculados dentro de los 3 das de incubacin para bacterias y 5 das de incubacin para hongos. Las pruebas pueden ser llevadas a cabo simultneamente con las pruebas de esterilidad. La prueba de esterilidad no se considera vlida si el medio de cultivo muestra una respuesta inadecuada al crecimiento microbiano.

Las cepas de microorganismos deben mantenerse con procedimientos y medios adecuados y se deben utilizar con no ms de 5 pasajes de la cepa patrn.

Almacenamiento

Si los medios recientemente preparados no van a usarse en el trmino de 2 das, se deben almacenar a una temperatura entre 2 C y 25 C.

Los medios preparados, que han sido almacenados en envases no perfectamente sellados, pueden ser usados por el trmino de un mes, siempre que se comprueben su esterilidad y su capacidad de promover el crecimiento dentro del periodo en que se van a utilizar, y si se cumplen los requisitos correspondientes al color del indicador. Si se almacenan en envases adecuadamente sellados, los medios pueden ser usados por un plazo que no sobrepase el ao, pero se deben llevar a cabo las pruebas de promocin del crecimiento cada tres meses y adems confirmar si se cumplen los requisitos correspondientes al color del indicador.

Soluciones de Lavado y Dilucin

Solucin A - Disolver 1 g de digerido pptico de tejido animal en agua hasta obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para obtener una solucin transparente. Ajustar a pH 7,1 0,2, envasar en recipientes adecuados y esterilizar empleando un procedimiento validado. [NOTA: cuando la Solucin A deba ser usada para realizar la prueba de esterilidad de una muestra de antibiticos del tipo penicilina o cefalosporina, agregar aspticamente una cantidad de penicilinasa estril a la Solucin A, a ser usada para lavar la membrana o membranas, suficiente para inactivar el antibitico residual en las membranas despus que la solucin de la muestra haya sido filtrada].

Solucin D - Si la muestra contiene lecitina o aceite, o en las pruebas para determinar la esterilidad de las partes internas de dispositivos estriles, por filtracin a travs de membrana, usar la Solucin A, a la cual se le ha agregado 1 ml de polisorbato 80 por cada litro. Ajustar a pH 7,1 0,2. Transferir a los envases y esterilizar empleando un proceso validado.

Solucin K

Digerido pptico de tejido animal 5,0 g Extracto de carne 3,0 g Polisorbato 80 10,0 g Agua purificada c.s.p. 1000 ml


Distribuir en recipientes adecuados y esterilizar utilizando un proceso validado.


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NOTA: la solucin de lavado y la dilucin utilizada, no debern presentar propiedades antibacterianas o antifngicas. Esto se comprueba efectuando la Prueba de validacin para bacteriostasis y fungistasis.

Ensayos de Aptitud del Mtodo

Antes de efectuar un ensayo de esterilidad de un producto o material, se determinar el nivel de actividad bacteriosttica y fungisttica del producto a travs de los procedimientos que se explican a continuacin. Estos procedimientos se efectan al menos cada vez que se cambia alguna condicin de la prueba o la composicin del producto.

Para efectuar los ensayos, preparar cultivos diluidos de bacterias y hongos de al menos los microorganismos indicados en la Tabla 4 de manera de obtener una concentracin final de cada uno de los microorganismos usados de menos de 100 ufc por ml.

Ensayo de aptitud del mtodo de filtracin por membrana

Filtrar la cantidad de muestra que se usar para realizar la prueba de esterilidad. Si es necesario lavar la membrana con tres porciones de 100 mL de la Solucin de lavado y dilucin adecuada, inoculando el envase del lavado final con menos de 100 ufc. Repetir el lavado en otro filtro en el que no hubo pasaje de muestra (control positivo). Colocar la membrana o la mitad de la membrana en 100 mL del medio de cultivo especificado, o agregar el medio al embudo o canister que contiene la membrana. Repetir el procedimiento para los microorganismos y los medios especificados en la Tabla 3, e incubar los envases a la temperatura apropiada y bajo las condiciones sealadas por un perodo no mayor de 5 das.

Si el crecimiento de los organismos en la mezcla de producto y medio de cultivo fuera visualmente comparable al observado en los frascos del control positivo, se usar la misma cantidad de producto y de medio de cultivo cuando se realice la prueba de esterilidad.

Si el desarrollo microbiano del medio de cultivo con producto no es visualmente comparable al observado en el control positivo, el producto posee propiedades bacteriostticas y/o fungistticas. Repetir el ensayo aumentando el nmero de lavados, o cambiando el tipo de membrana, o usando un agente neutralizante.

Ensayo de aptitud del mtodo de transferencia directa

Inocular dos recipientes de cada medio de cultivo con menos de 100 ufc de los microorganismos especificados en la Tabla 4, usando los volmenes de cada medio especificados en la Tabla 3. Agregar la cantidad de muestra especificada a uno de los recipientes. El restante ser el control positivo. Repetir el procedimiento para cada cepa e incubar durante no ms de 5 das.

Si el crecimiento de los microorganismos en la mezcla de producto y medio de cultivo fuera visualmente comparable al observado en los frascos de control positivo, se usa la misma cantidad de producto y de medio de cultivo cuando se efecta la prueba de esterilidad.

Si el desarrollo microbiano del medio de cultivo con producto no es visualmente comparable al observado en el control positivo, el producto posee propiedades bacteriostticas y/o fungistticas. Repetir la prueba utilizando agentes neutralizantes estriles, como polisorbato 80, lecitina o penicilinasa, o incrementar el volumen de medio. Si la cantidad de producto especificada fuese bacteriosttica o fungisttica en 250 mL de medio de cultivo, reducir la cantidad del producto hasta encontrar la cantidad mxima que no afecta adversamente el crecimiento de microorganismos en 250 mL de medio. En el caso de soluciones y suspensiones, si la cantidad fuese menor de 1 mL, aumentar la cantidad del medio hasta que 1 mL quede lo suficientemente diluido para evitar la inhibicin del crecimiento. En el caso de slidos que no son fcilmente solubles o dispersables, si la cantidad es menor de 50 mg, aumentar la cantidad de medio hasta que los 50 mg del producto resulten lo suficientemente solubles para evitar la inhibicin del crecimiento. En ambos casos, usar la relacin de producto y medio de cultivo establecida de esta manera para la prueba de esterilidad.


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Tabla 4- Microorganismos para las pruebas de promocin de crecimiento y bacteriostasis y fungistasis

Bacterias aerbicas

Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276

Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134)(1)

Pseudomonas aeruginosa

Kocuria rhizophila

ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275

ATCC 9371

Bacteria anaerobia

Clostridium sporogenes

Bacteroides vulgatus

ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 ATCC 11437, NBRC 14293

ATCC 8482

Hongos

Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594

Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455

rea de siembra

El rea de control debe estar construida con materiales fcilmente lavables y sanitizables, poseer esclusa para personal y materiales, presin positiva y aire filtrado por HEPA para mantener el ambiente controlado en cuanto a partculas y la presin, regulando la direccin de las corrientes del aire. Se pueden utilizar aerosoles germicidas y lmparas de UV previo al ensayo. Todas las superficies (paredes, pisos, mesadas, muebles) y utensilios deben estar limpios y desinfectados con una solucin germicida y los materiales que estn en contacto con las muestras y el procedimiento de ensayo deben estar esterilizados.

Los sanitizantes/desinfectantes usados deben estar validados utilizando microorganismos de cepas de coleccin y de cepas salvajes.

Se deben monitorear microbiolgicamente las superficies y el ambiente, as como el personal involucrado en los ensayos. 4

Personal

Los operadores, deben estar equipados con ropas adecuadas y estriles, similares a las utilizadas en reas de trabajo asptico. El personal que realice el ensayo debe poseer suficiente experiencia y la interpretacin de los resultados deber hacerlo una persona con estudios de microbiologa o se haya adiestrado en ello.

Durante el ensayo deben desinfectarse las manos enguantadas regularmente, no deben realizar movimientos bruscos, ni realizar el ensayo impidiendo el libre flujo de aire de la cabina de flujo laminar. 4

Procedimiento

El ensayo debe ser realizado bajo campana de flujo laminar, el cual debe estar sometido a controles peridicos.

Antes de comenzar el ensayo se deben identificar las muestras, limpiar la superficie exterior de los envases con un agente descontaminante adecuado sumergindolas en un recipiente con la solucin del agente. Si esto no fuera posible se deben rociar con el agente descontaminante. Todos los envases deben abrirse siguiendo tcnicas aspticas.


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Si el contenido de los viales fuera envasado al vaco, se introducir en ellos aire estril por medio de un dispositivo adecuado, por ejemplo: una aguja hipodrmica estril a la cual se adosa un filtro esterilizante.

Se deben incubar, juntamente con los frascos/tubos sembrados con las muestras, para ambos medios de cultivo, controles negativos y un blanco del ensayo utilizando los mismos materiales, utensilios, membranas y lquidos de disolucin y lavado que los empleados con las muestras.

Mtodo directo

Se utiliza para:

Lquidos no filtrables

Lquidos oleosos

Semislidos (cremas, ungentos)

Slidos no filtrables (que no se pueden disolver o suspender)

Algodn purificado, gasa, apsitos quirrgicos, material para suturas y productos relacionados.

Dispositivos mdicos esterilizados.

Jeringas estriles vacas

Se inocula o agrega la muestra directamente en ambos medios de cultivo tal que el volumen de la muestra no sea mayor al 10% del volumen del medio de cultivo, a menos que lo indique la monografa del producto. Se emplea cuando el producto en s no posee inhibidores que alteren la efectividad del mismo.

Si el producto a ser ensayado posee actividad antimicrobiana, se puede llevar a cabo, colocando en el medio de cultivo un agente neutralizante o diluyendo en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando hay que utilizar un volumen grande de muestra se puede preparar el medio de cultivo ms concentrado.

Lquidos no filtrables Transferir aspticamente, a partir de los envases originales, el volumen de muestra especificado en la Tabla 2, utilizando pipetas o jeringas con agujas estriles, a los frascos o tubos con ambos medios de cultivo. Mezclar el lquido con el medio sin airear excesivamente. Examinar el medio visualmente para comprobar si hay crecimiento bacteriano al tercer, cuarto o quinto da; luego al sptimo u octavo da y el ltimo da del perodo de prueba.

Lquidos oleosos Para realizar el ensayo, preparar los medios de cultivo con el agente emulsificante apropiado segn el producto a ensayar como por ejemplo una concentracin de 10g/L de Polisorbato 80, determinando que, a la concentracin usada, no posea efectos antimicrobianos significativos. Proceder como en Lquidos no filtrables.

Semislidos (cremas, ungentos) Para realizar el ensayo, preparar una suspensin del producto en una solucin estril con el agente emulsificante apropiado segn el producto a ensayar en una concentracin de 1/10, determinando que a la concentracin usada no posea efectos antimicrobianos significativos. Transferir la muestra diluida en los medios de cultivo y proceder como en Lquidos no filtrables.

Slidos no filtrables (que no se pueden disolver o suspender) A partir de los envases originales, transferir aspticamente la cantidad de muestra especificada en la Tabla 2, (o preparar una suspensin del producto agregando un diluyente estril). Transferir el material as obtenido a 200 mL del Medio fluido de tioglicolato y mezclar suavemente. De la misma manera transferir la misma cantidad a 200 mL de Caldo de peptonas de soja y casena y mezclar. Proceder como en Lquidos no filtrables.

Algodn purificado, gasa, materiales quirrgicos y artculos relacionados De cada paquete de algodn, gasa en rollos o vendas de gasa se tomarn con pinzas y tijeras estriles dos o ms porciones de 100 mg a 500 mg de las partes internas de la muestra. Si son telas o hilos se deben usar uno


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o ms trozos de 5 cm cuadrados o lineales. En el caso de materiales envueltos individualmente, extraer aspticamente una sola porcin de 250 mg a 500 mg o la muestra entera en el caso de artculos pequeos. Se siembran en medio suficiente que cubra las muestras. Proceder como en Lquidos no filtrables.

Dispositivos biomdicos esterilizados Para dispositivos que, por su tamao y forma, permitan la completa inmersin en no ms de 1000 ml del medio de cultivo, puede utilizarse el mtodo de transferencia directa sumergiendo el dispositivo completo en el medio apropiado siempre que el lumen, o el interior del material est lleno con medio de cultivo. Cuando a causa del tamao y forma de un artculo no pueda llevarse a cabo la prueba de esterilidad por inmersin en no ms de 1000 ml del medio de cultivo, tomar la parte ms difcil de esterilizar y probar esa porcin o, si fuera posible, tomar dos o ms partes de las porciones ms internas del artculo. Transferir en forma asptica estas porciones al nmero adecuado de recipientes con no ms de 1000 ml de medio e incubar. Proceder segn se indica en Lquidos no filtrables.

Jeringas estriles vacas Se debe demostrar fehacientemente que la superficie externa de la aguja (que toma contacto con el tejido del paciente) es estril. En el caso de jeringas vacas con aguja, proceder segn se indica en Dispositivos biomdicos esterilizados o succionar el medio de cultivo o el diluyente a travs de la aguja, si la jeringa no tiene aguja realizar la operacin colocando una aguja estril para este propsito y vaciar posteriormente el contenido en el medio adecuado o utilizar el Mtodo de filtracin por membrana, continuar con el ensayo como en Lquidos miscibles en vehculos acuosos.

Gasa con vaselina Para este tipo de producto preparar el Medio fluido de tioglicolato y agregar 1 gramo de agar y 5 gramos de gelatina por litro de medio de cultivo. Transferir 300 mL del medio de cultivo a un frasco estril con tapa, colocar en un bao a 52C, luego inocular las muestras, agitar durante 10 minutos, enfriar, sacudir el frasco suavemente, rompiendo la capa de vaselina, incubar durante 10 das de 20 - 25C. Al trmino de la incubacin, agitar durante 10 minutos, tomar alcuotas de 0,5 mL e inocular tubos con Medio fluido de Tioglicolato y Caldo de peptonas de soja y casena, como se observa en la Figura 1, incubar durante 4 das a 30 - 32 C.

Figura 1: Procedimiento para el ensayo de esterilidad de gasa con vaselina.

1000 ml Tio +Agar+Gelatina 300 ml

aluminio

a 52C

paquete + gasa

Agitador

10 min

se enfra

vaselina

se sacude

se rompe el

sello de

vaselinaIncubacin

20-25C

10 das

Agitador

10 min

Tio TSB

Tubos con

15 ml de medio

0.5 ml

0.5 ml30-32C

4 das


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Mtodo de Filtracin por Membrana

Se utiliza para:

Lquidos miscibles en vehculos acuosos

Lquidos inmiscibles en vehculos acuosos

Slidos filtrables

Aceites y soluciones oleosas

Semislidos

Aerosoles estriles

Dispositivos biomdicos esterilizados

Jeringas prellenadas/vacas

En este mtodo se emplea una unidad de membrana filtrante que consiste en un sistema que posibilita el manipuleo asptico de las muestras a analizar, permitiendo la remocin asptica de la membrana y su incorporacin al medio de cultivo, o un sistema donde el medio pueda ser agregado y la membrana incubada in situ. (Figuras 2, 3 y 4).

Una membrana adecuada para las pruebas de esterilidad posee un tamao de poro de 0,45 m, un dimetro aproximado de 47 - 50 mm, y tiene un borde hidrofbico o de baja retencin de producto para minimizar la inhibicin microbiana de los residuos que puedan quedar retenidos en la membrana. Si el producto no tiene sustancias inhibidoras puede usarse una membrana sin borde hidrofbico, pero debe humedecerse antes de agregar la solucin con el producto. Las membranas de nitrato de celulosa se usan para lquidos acuosos, aceites, y soluciones acuosas dbiles; las membranas de acetato de celulosa, por ejemplo, se usan para soluciones alcohlicas fuertes. Hay membranas filtrantes especialmente adaptadas para ciertos productos como por ejemplo antibiticos. La unidad entera puede ser montada y esterilizada con la membrana colocada antes de su uso. Cuando el producto o material a ser ensayado es oleoso, la membrana debe estar completamente seca antes de efectuar la prueba.

Figura 2. Fotografa Cortesa de MerckMillipore Figura 3. Fotografa Cortesa de MerckMillipore


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Figura 4. Fotografa Cortesa de MerckMillipore

Lquidos miscibles en vehculos acuosos Transferir aspticamente los volmenes requeridos para ambos medios, segn la Tabla N 2, directamente a uno o dos embudos con membrana filtrante o a un frasco colector estril cuyo contenido total se vuelca en la unidad filtrante. Si los lquidos son viscosos y difciles de filtrar, se pueden emplear ms de dos equipos y en tales circunstancias se incuba en cada medio, la mitad del nmero de membranas empleadas, cuidando que los volmenes y el nmero de envases se ajusten a las condiciones indicadas. Si el producto tiene propiedades bacteriostticas o fungistticas, lavar la membrana o membranas con tres porciones de 100 ml de la Solucin A. Retirar aspticamente la membrana o membranas de sus respectivos soportes (si se ha usado una sola membrana, cortarla por la mitad). Sumergir cada mitad, o cada membrana entera segn corresponda en los medios de cultivo correspondientes e incubar.

Lquidos inmiscibles en vehculos acuosos Transferir aspticamente el volumen requerido para ambos medios segn se indica en la Tabla 2, directamente a uno o dos embudos con membrana filtrante o en frascos colectores estriles cuyo contenido se vuelca en la unidad filtrante. De esta manera, la membrana representa el contenido de los 20 envases filtrados. Puede incubarse media membrana en cada medio. Inmediatamente, filtrar con ayuda de vaco o presin. Si la sustancia es un lquido viscoso o una suspensin que no se adapta a la filtracin rpida, agregar aspticamente suficiente diluyente al lquido recolectado de todos los envases para aumentar la velocidad de filtracin. Si la muestra a ensayar tiene propiedades bacteriostticas o fungistticas o posee algn conservador, lavar el filtro de 1 a 3 veces con 100 ml de Solucin A. Si la sustancia de prueba contiene lecitina, reemplazar la Solucin A por Solucin D. Al finalizar la filtracin y el lavado, proceder con la membrana o membranas segn se indica en Lquidos miscibles en vehculos acuosos, comenzando donde dice: "Retirar aspticamente la membrana".


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Slidos filtrables Tomar una cantidad del producto slido (o una solucin o suspensin del producto, preparada con diluyente estril agregado al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en la Tabla 2. A menos que se especifique otra cosa en la monografa respectiva, el nmero de envases a analizar es el mismo

especificado en Lquidos miscibles en vehculos acuosos. Transferir la muestra en forma asptica a un recipiente que contenga 200 ml de Solucin A y agitar hasta disolucin. Si la muestra no se disuelve totalmente, usar 400 ml de la Solucin A o dividirla en 2 porciones iguales y disolver cada una en 200 ml de la mencionada solucin. Transferir aspticamente la solucin o soluciones a uno o dos sistemas filtrantes y filtrar con la ayuda de vaco o presin. Proceder segn lo indicado en Lquidos miscibles en vehculos acuosos comenzando donde dice: "Si el producto tiene propiedades bacteriostticas".

Aceites y lquidos oleosos Utilizar la cantidad de muestra indicada en las Tablas 2 y 3 para cada medio de cultico. Filtrar los aceites y soluciones oleosas de baja viscosidad sin diluir por una membrana (o dos) perfectamente seca. Filtrar los aceites viscosos diluyendo, si es necesario, con un diluyente estril apropiado como el miristato de isopropilo, demostrando que no tiene propiedades antimicrobianas. Permitir que el aceite penetre la membrana por su propio peso y filtrar aplicando presin o vaco. Mantener la membrana filtrante cubierta con lquido para una mxima eficiencia de filtracin.Lavar la membrana con un diluyente apropiado tal como la Solucin K, al menos tres veces con alcuotas de100 mL cada vez. La solucin de lavado puede contener un emulsificante como Polisorbato 80 en una concentracin de 10gr/L. Proceder con la membrana o membranas segn se indica en Lquidos miscibles en vehculos acuosos, comenzando donde dice: "Retirar aspticamente la membrana".

Semislidos (cremas, ungentos) Utilizar la cantidad de muestra indicada en las Tablas 2 y 3 para cada medio de cultivo. Los productos semislidos con una base grasa y las emulsiones agua/aceite pueden ser diluidas con una solucin al 1 % de miristato de isopropilo calentando hasta 40C en casos especiales se puede llegar a calentar hasta 44C. Filtrar tan rpido como sea posible y proceder como en aceites y soluciones oleosas.

Aerosoles estriles Para aerosoles lquidos, colocar los envases en una mezcla de alcohol y hielo seco a una temperatura no mayor de -20 C durante una hora aproximadamente. Si es posible, dejar escapar el propelente antes de abrir aspticamente los envases, y transferir el contenido a un frasco estril. Agregar al frasco 100 ml de Solucin D y mezclar suavemente. Proceder segn se indica en Lquidos miscibles en vehculos acuosos o Lquidos inmiscibles en vehculos acuosos segn corresponda.

Dispositivos mdicos esterilizados Los dispositivos que tienen pasos o conductos estriles se ensayan mediante filtracin por membrana segn se describe a continuacin: Pasar aspticamente un volumen suficiente de Solucin D a travs de no menos de 20 dispositivos, de manera de recuperar no menos de 100 ml de cada dispositivo. Recoger la solucin en recipientes estriles y filtrar el total del volumen recogido a travs de embudo(s) con membrana filtrante, segn se indica en Lquidos miscibles en vehculos acuosos, comenzando donde dice: "Retirar aspticamente la membrana". Si el dispositivo es grande y los lotes estn formados por un nmero pequeo de unidades, la prueba se realizar con un nmero apropiado de unidades como se describe para casos similares en la seccin Dispositivos mdicos esterilizados en Mtodo de transferencia directa.

Jeringas prellenadas Drenar el contenido de cada jeringa a travs de la aguja, si est colocada; o directamente si no tiene aguja colocada. Proceder segn lo indicado en Lquidos miscibles en vehculos acuosos.


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Observacin e interpretacin de resultados 1,2

Los envases sembrados se observan a intervalos regulares, con el fin de detectar crecimiento microbiano por evidencia macroscpica.

Cuando el material analizado produce turbidez en el medio y la observacin visual del crecimiento o ausencia de bacterias u hongos es dificultosa, a los 14 das de la incubacin, transferir porciones adecuadas (al menos 1mL) de la mezcla que contiene la muestra y el medio a envases con medio de cultivo nuevo, incubar no menos de 4 das y observar los envases sembrados.

Conclusin:

Si no se observa desarrollo, el producto cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad.

Si se observa desarrollo microbiano, pero si los monitoreos de las instalaciones donde se lleva a cabo el ensayo, de los materiales empleados, la tcnica empleada y los controles negativos indican que el procedimiento del anlisis fue inapropiado, el ensayo se declara nulo y debe repetirse. Si se observa desarrollo microbiano confirmado microscpicamente y no existen evidencias suficientes para anular el ensayo, el producto no cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad.

El ensayo no es vlido cuando se demuestra que:

a) Los registros del monitoreo microbiolgico de la sala y equipo que se utilizaron en la ejecucin del ensayo presentan una falla

b) La revisin del procedimiento del ensayo presenta una falla.

c) Se observa crecimiento microbiano en los controles negativos (uno o ambos).

d) Puede comprobarse que el microorganismo aislado en el ensayo, es inequvocamente producto de una falla en los materiales o en las tcnicas empleadas.

Si el ensayo se declara invlido, se puede repetir con la misma cantidad de muestras. Si no se observa desarrollo, el producto cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad. Si se observa desarrollo microbiano, el producto no cumple con el ensayo de esterilidad.

En aisladores - Cuando el ensayo de esterilidad se realiza en aislador, el producto cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad cuando no se observa desarrollo microbiano. Cuando se observa desarrollo microbiano y es confirmado microscpicamente, el producto no cumple con los requisitos del ensayo de esterilidad. El ensayo no se considera vlido cuando se demuestra prdida de integridad fsica del aislador, por falla en la tcnica asptica o por materiales no estriles dentro del aislador. En estos casos se debe repetir el ensayo.

La ausencia de contaminacin microbiana, evidenciada por el procedimiento descripto, confirma que el producto satisface los requisitos de la prueba, lo cual no es razn suficiente, para suponer la total esterilidad del lote, dadas las limitaciones inherentes a la estadstica del muestreo. Por esta razn deben efectuarse las validaciones de los procesos de esterilizacin y de llenado asptico y un continuo entrenamiento del personal que efecta tanto las tareas de produccin como de control.3

Tecnologas para el ensayo de esterilidad. Desde las tradicionales avanzando a las automatizadas.

No fue hasta 1936 en que la dcimo primera edicin de la farmacopea americana USP instaur el mtodo de inoculacin directa como prueba vlida para el control de esterilidad. Pese a las distintas dificultades que este mtodo incorporaba, fue reemplazado recin en la dcimo octava edicin en 1970. Este mtodo ms moderno trajo consigo una serie de ventajas muy aceptadas por la industria; entre ellas mayor sensibilidad, menor medios de cultivo y tiempos de incubacin. Pese a estas ventajas, el mtodo por membrana filtrante o embudo abierto tiene algunos defectos. Es un mtodo susceptible a errores por manipulacin o contaminacin en los procesos de filtracin de la muestra, enjuague, transferencia de la membrana y/o divisin de la misma. Una manera efectiva de reducir estos falsos positivos es eliminar la transferencia abierta del producto y la manipulacin de la membrana, dando origen a diseos ms cerrados y automatizados.5

El ensayo de esterilidad es uno de los pasos ms importantes en la comercializacin de un producto


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farmacutico. Los falsos positivos y negativos, fallas del equipo y los errores humanos pueden costar tiempo, dinero, y finalmente la continuidad del producto farmacutico en el mercado.

Existen sistemas semiautomticos que ofrecen ventajas respecto a los mtodos tradicionales de test de esterilidad por filtracin manual recin comentados.

Entre los sistemas ms automatizados, podemos citar a aquellos que constan de una bomba peristltica controlada por un software que se utiliza para la transferencia segura y uniforme de muestras de productos farmacuticos estriles, en sus diferentes presentaciones y tipos de envase, a las unidades de filtracin.6 Ver Figura 5.

Figura 5: La barra soporte para las muestras es desmontable y puede sostener viales o bolsas de plstico desde 100 ml a 1,5 l.

Fotografa Cortesa de MerckMillipore

La bomba y las unidades (canisters) ofrecen fiabilidad y uniformidad para el ensayo de esterilidad. Los equipos ms modernos basados en esta tecnologa, permite desde una computadora desarrollar procedimientos operativos estndar (SOP) que pueden ser incluidos en el programa de la bomba. El analista de un modo automtico slo necesita seleccionar en el panel de control el SOP apropiado para la muestra de producto a analizar. El sistema guiar al analista en cada paso, actuando como una gua formativa, y respaldando de este modo las buenas prcticas de anlisis en el laboratorio. Los diversos pasos del procedimiento, la velocidad correspondiente de la bomba y la informacin relacionada se muestran en el panel de control, mejorando la repetibilidad y fiabilidad. Los analistas pueden seleccionar el modo manual o automtico. En el modo manual, la bomba pedir al analista que introduzca datos en cada paso del procedimiento.

Ensayo de esterilidad controlado.

Esta bomba avanzada y automtica, acelera y facilita el ensayo de esterilidad. Un procedimiento dirigido de 5 pasos garantiza un rendimiento uniforme y preciso al mismo tiempo que reduce el tiempo total del ensayo. Diseada ergonmicamente para un funcionamiento y limpieza sencillos, la bomba se ajusta al aislador o bien para su uso en la campana de flujo laminar del rea estril. Su diseo asegura la descontaminacin perfecta


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dentro de los aisladores o campanas, eliminando el riesgo de falsos positivos por este motivo. Es posible montarlo y desmontarlo fcilmente durante las tareas de mantenimiento. La bandeja de drenaje, as como las superficies de acero inoxidable pulido 316L, el cabezal de la bomba y la barra soporte pueden limpiarse fcilmente con la mayora de los agentes sanitizantes. Ver Figuras 6 y 6: pasos 1 al 5.

Figura 6: Pasos 1, 2, 3 y 4

-Fotografas cortesa de MerckMillipore-

Paso 1- Coloque los tubos de la unidad de filtracin en el cabezal de la bomba y pulse el botn para cerrarlo

Paso 2- Filtre cantidades equivalentes de producto por ambos canisters sin exponer el frmaco al ambiente.

Paso 3-Lave las membranas de filtracin.

Paso 4- Aada por separado los medios de cultivo en cada canister.


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Figura 6: Paso 5 -Fotografa Cortesa de MerckMillipore-

Microbiologa rpida

Las tecnologas de microbiologa rpida cada vez tienen ms inters y aceptacin en la industria farmacutica, ya sea en etapas de desarrollo, produccin o anlisis; as lo muestra la bsqueda de un ensayo de esterilidad alternativo al convencional, que permita ganar versatilidad, rapidez y disminuir los costos.

Han surgido nuevas tecnologas como la Bioluminiscencia que aparece como una alternativa de control microbiolgico que proporciona resultados rpidos y sensibles basados en la reaccin por ATP con la enzima luciferasa presente en todos los organismos vivos.

Las autoridades sanitarias tambin estn tomando participacin en el tema, buscando reglamentar la validacin de estos mtodos rpidos. A modo de ejemplo,se cita el documento de la FDA sobre validacin de test de esterilidad por mtodo rpido para productos de terapia celular y gentica. 7

Ensayo de Esterilidad: Tecnologa de Aisladores

En los ltimos aos la tecnologa de aisladores est siendo aplicada con muy buenos resultados en la Industria Farmacutica. sto se debe principalmente, al notable desarrollo tecnolgico alcanzado por varias firmas constructoras y a las innegables ventajas que esta tecnologa proporciona en la manipulacin de materiales estriles, o para la proteccin del hombre durante la manipulacin de sustancias txicas. Los aisladores pertenecen a la tecnologa de barreras. Estas pueden ser cualquier objeto material que separe o sirva de barricada, o cualquier obstculo fsico de contencin. En los procesos farmacuticos se considera barrera cualquier medio de proteccin incluyendo cortinas en las salas limpias, guantes, anteojos, mscaras faciales, cabinas de seguridad biolgicas, etctera.

Dentro de esta tecnologa los aisladores no son un nuevo concepto sino un nuevo potencial, dado por logros en su diseo, como es el desarrollo de sistemas de transferencia capaces de mantener las condiciones de aislamiento, equipamiento adecuado para el intercambio del aire y capacidad para la esterilizacin automtica.

Aunque los aisladores pertenecen a la tecnologa de barreras, no necesariamente toda barrera es un aislador. Estos son recintos hermticos en los cuales no hay contacto directo entre el medio interno y el externo. Las transferencias de materiales se realizan a travs de sistemas que mantienen el aislamiento, y actan como una barrera efectiva entre el operador y el rea de trabajo efectundose las operaciones de forma tal que se evite el

Paso 5- Incube y examine los canisters para

detectar si hay contaminacin segn

las farmacopeas adecuadas.


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contacto directo entre el hombre y el material manipulado. El aire es suministrado a travs de filtros de alta eficiencia, pudindose filtrar, de ser necesario, el aire que es expulsado al exterior. Son sistemas esterilizables con un alto nivel de aseguramiento de la esterilidad y por sus caractersticas son capaces de mantenerla por perodos prolongados de tiempo.8

Por las caractersticas de esta tecnologa se han logrado muy buenos resultados con su aplicacin en diferentes industrias. En la Industria Farmacutica, y especialmente en la manipulacin de materiales estriles, se han logrado significativos beneficios por la mejora del ambiente de trabajo, as como una eficiente contencin de materiales txicos.

Todas estas aplicaciones tienen un objetivo comn. Esto puede resumirse en el deseo de alcanzar un microambiente seguro, proteger al hombre, al medio ambiente y/o al producto, para alcanzar ganancias de energa y de otros costos, y para minimizar los ambientes protegidos.

Descripcin del aislador

Aunque se comercializan aisladores especficos para algunas aplicaciones generalmente se disean a solicitud del cliente. Estos son adaptados a los requerimientos de la aplicacin que estar en dependencia de la actividad realizada, del equipo al cual se adaptar, de la cantidad de operarios o analistas, de los accesos necesarios para la manipulacin, de las intervenciones necesarias durante el proceso de manufactura o anlisis, o de los materiales que se manipularn.

En su construccin pueden emplearse materiales con diferentes grados de resistencia tanto qumica como mecnica. Por lo antes expuesto se debe hacer un anlisis profundo de los requerimientos que deber satisfacer el aislador a fin de que se realice un diseo que cumpla con las expectativas, sin incurrir en costos innecesarios.8

Los aisladores estarn constituidos por 4 partes fundamentales:

Sistema de tratamiento de aire.

Sistemas para la manipulacin.

Sistemas para la transferencia de materiales.

Paredes y mesa de trabajo.

Sistema de tratamiento de aire. Est constituido por ventilador, conductos y filtros. Este sistema permite el suministro de aire a travs de prefiltros y filtros de alta eficiencia como los filtros HEPA y ULPA. El flujo de aire puede ser mediante flujo turbulento o unidireccional. El aire podr ser recirculado o expulsado totalmente pudindose encontrar filtracin terminal en casos donde se manipulan materiales peligrosos. Este sistema permite el acople a equipos que suministran agentes qumicos para la sanitizacin automtica del rea interna del aislador.8, 9

Sistemas para la manipulacin. Permite la ejecucin de las operaciones sin que el operario est en contacto directo con el producto; esto se logra mediante mangas-guantes, medias escafandras o escafandras. La seleccin de una u otra variante estar en dependencia de las caractersticas de la operacin y la necesidad de que sta se realice de forma confortable8 ,9.

Sistemas para la transferencia de materiales. A travs de estos sistemas se realiza la transferencia de materiales. Estos pueden ser desde un sistema SAS constituido por 2 puertas con juntas hermticas, hasta RTPs (sistemas de transferencia rpidos). Estos ltimos son sistemas ms sofisticados y eficientes, los cuales permiten efectuar la transferencia de forma ms segura minimizando el contacto del medio interno y externo. Los RTPs tambin permiten el acople entre aisladores.

En la prctica se encuentran ambas variantes con buenos resultados y su utilizacin est determinada por las caractersticas de la operacin, las exigencias de aislamiento y los costos particulares de estos 2 sistemas, siendo el RTPs el ms costoso. En las lneas automticas de llenado, para el suministro de materiales pueden encontrarse aberturas utilizadas como sistemas de transferencias para grandes volmenes de materiales; en estos casos el diferencial de presin y el medio circundante deben permitir


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mantener el aislamiento8, 9

Paredes y mesa de trabajo. stas pueden ser de diferentes materiales como plsticos rgidos o flexibles, cristal y acero inoxidable.8, 9 Estos materiales poseen diferentes grados de resistencia qumica y fsica, as como diferentes costos. Un anlisis de los requerimientos de la aplicacin permitir satisfacer las necesidades sin incurrir en costos innecesarios.10

Aplicaciones en la Industria Farmacutica

Pruebas de esterilidad. La utilizacin de aisladores para esta prueba resulta ventajosa ya que incrementa el aseguramiento de la esterilidad del ambiente de trabajo, por tal motivo se reducen los falsos positivos. Las repruebas pueden ser reducidas desde 0,1 a 0,01 % comparado con su ejecucin en un rea convencional para esta prueba. Si se utiliza un sistema correctamente diseado para la "sanitizacin" del aislador, muestras y materiales, las posibilidades de falsos positivos deben tender a cero y por tanto la ejecucin de las repruebas en estas condiciones debe ser cuestionada.

Algunos autores, principalmente fabricantes de aisladores, plantean que no se requieren reas clasificadas, y por ello se elimina la utilizacin de ropa estril lo que disminuye los costos de inversin.8

El sistema para la ejecucin de esta prueba consta de un aislador de trabajo, el cual puede estar acoplado directamente a un autoclave de doble puerta a travs de un aislador de interfase, o puede no estar acoplado y recibir los materiales estriles a travs de aisladores de transporte. Algunos autores plantean que la segunda variante simplifica el sistema y es ms fcilmente validable.11

Algunas firmas comercializan aisladores para pruebas de esterilidad, estas ofertan variantes que van desde aisladores flexibles y con flujos turbulentos hasta aisladores rgidos y flujos unidireccionales.2 Se plantea que la segunda alternativa no proporciona ventajas tcnicas adicionales y es menos econmica, aunque en la primera variante no se debe perder de vista la renovacin de la folia cada 3-5 aos y la consiguiente calificacin del equipo.8, 9, 12

Ventajas: 13

Eliminacin del personal del rea de procesamiento asptico. Una de las ventajas ms significativas de esta tecnologa es la eliminacin de la intervencin directa del hombre en el rea de trabajo, el cual es el mayor vector de contaminacin.

Esterilizacin en lugar de "sanitizacin". La utilizacin de sistemas automticos permite lograr un ambiente estril dentro del aislador de forma ms eficiente y segura a diferencia de la "sanitizacin" que se realiza en las reas limpias convencionales.

Reduccin del monitoreo ambiental. Al lograrse condiciones de aislamiento y conservarlas durante la manipulacin se logra mantener la esterilidad por perodos de tiempo mayores que en las reas limpias convencionales, con esto, puede reducirse la frecuencia del control ambiental.

Simplificacin de las instalaciones. En muchas aplicaciones se logra reducir o prescindir de reas clasificadas o disminuir la complejidad de estas para la manipulacin de productos de alto riesgo.

Simplificacin del vestuario. La simplificacin de las instalaciones deriva una simplificacin del vestuario, ya que este deber tener caractersticas acordes con la clasificacin del local y en muchos casos se logra prescindir de la ropa estril. Esto simplifica, adems, el tratamiento previo de la ropa y el tiempo requerido por el personal para efectuar los cambios de vestuario.

Reduccin de los costos. Aunque los aisladores pueden tener una incidencia marcada en el presupuesto de la inversin, los costos se reducen al permitir la simplificacin de la instalacin, permitiendo adems, una significativa reduccin de los costos de explotacin y la puesta en marcha puede ejecutarse en un perodo breve. Esta tecnologa puede adaptarse a instalaciones ya existentes dada su flexibilidad.

Contenedor de productos txicos. Al actuar como un recinto hermtico permite una eficiente proteccin del hombre y del medio ambiente, adems se logra una sensible disminucin de las reas crticas y de la


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generacin de residuales por concepto de limpieza de dichas reas.

Con esta tecnologa se logra conciliar convenientemente requerimientos de proteccin y contencin, especficamente en el caso de manipulacin de productos estriles txicos.

Desventajas:

A pesar de lo ventajosa que resulta esta tecnologa su aplicacin no se ha generalizado todo lo rpido que se podra esperar. A continuacin relacionamos algunos aspectos que impiden su total aceptacin.

Inquietudes y conflictos en las afirmaciones del vendedor. Al ser esta una tecnologa en desarrollo no se dispone an de estndar y se encuentran significativas contradicciones entre los fabricantes, como es el dilema de utilizar flujo unidireccional o turbulento, utilizar aisladores rgidos o no para algunas aplicaciones y seleccin del agente esterilizante.

Aparicin de aisladores no industriales. En una industria tan conservadora como la Farmacutica donde es comn encontrar superficies de acero inoxidable, con pulido espejo y construccin de apariencia slida, resulta contradictorio encontrar aisladores con apariencia casi de juguete, donde algunos la cambian al variar la presin. Las construcciones plsticas y de fibra de vidrio pueden presentar cortaduras o rasguos.

Dificultades relacionadas con la esterilizacin. Es importante tener en cuenta el agente esterilizante a utilizar, as como su compatibilidad con los materiales empleados en su construccin y con equipamiento que se ubicar dentro del aislador a fin de evitar que sean atacados. Otra dificultad radica en la necesidad de remover el agente esterilizante hasta niveles aceptables luego de la esterilizacin y la frecuente retencin que se produce de este por parte de algunos materiales utilizados, principalmente en mangas-guantes y escafandras.

Diseo de los sistemas de facilidades auxiliares existentes para las reas de procesamiento asptico convencionales. La Industria de Parenterales tiene un gran cmulo de inversiones en las reas de procesamiento asptico convencionales. Un cambio radical en los conceptos de estas instalaciones podra dar lugar a un gran nmero de estas instalaciones obsoletas. Las modificaciones necesarias para adaptar el equipamiento existente y sistemas soportes a las operaciones del aislador deben ser consideradas, as como la extensin de las inversiones en equipos nuevos que pudieran ser necesarios para introducir los cambios. La recuperacin de la inversin tiene un gran peso para el cambio a la tecnologa de aisladores.

Escepticismo de las agencias reguladoras. A pesar de ser claras las ventajas de esta tecnologa, por su naturaleza, esta industria, tiende a preocuparse por cmo puedan reaccionar las Agencias Reguladoras. La novedad del concepto de barrera, controversias sobre el ambiente que rodea al aislador y la ausencia de algunos estndares para la validacin y uso, estn entre las razones ms firmes que han frenado en algunos casos la adopcin de esta tecnologa por temor a posible criticismo de las agencias reguladoras.

Cambios necesarios en la filosofa y metodologa operacional.

El uso de aisladores sugiere cambios en la forma de operar, algunos cambios presentan ventajas simples y claras como la ausencia de ropa estril en algunos casos, pero otros son ms problemticos. Las dificultades para la transferencia de materiales al aislador son significativas, as como la necesidad de esterilizar ms que "sanitizar" los materiales a ser introducidos en el aislador, por lo que es muy importante la compatibilidad de este con los agentes esterilizantes.

Los mtodos de monitoreo ambiental y la frecuencia pueden requerir alteracin. Se requerir la validacin de la esterilizacin en materiales donde antes slo se requera "sanitizacin". Muchos de estos cambios son debidos a la sustitucin de un ambiente limpio por uno estril.12, 14

Esterilizacin.

Para lograr y mantener el ambiente estril dentro del aislador se debe esterilizar el espacio interno y todos los materiales que se transfieren. Una vez esterilizados los materiales estos no deben salir del ambiente estril de


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los aisladores. Para lograrlo se acoplan aisladores a la salida de las autoclaves y hornos, o de lo contrario, se utilizan aisladores de esterilizacin donde se esteriliza el exterior de los materiales ya esterilizados previamente. Para mantener estas condiciones de esterilidad no debe perderse de vista la integridad del aislador, y como parte de este, la de los sistemas de transferencia.

Para la esterilizacin de los aisladores se utiliza cido peractico, formaldehdo, xido de etileno, perxido de hidrgeno, entre otros. La seleccin de uno u otro estar determinada por la compatibilidad del agente esterilizante con los materiales con los que se pondr en contacto. Es determinante la validacin del mtodo empleado, hacindose hincapi en la remocin del agente esterilizante hasta niveles permisibles. En el mercado se dispone de sistemas automticos que permiten ejecutar la esterilizacin de forma validable y segura8, 10, 15

Limpieza.

En los aisladores debe lograrse el acceso a todas las partes, en caso de reas de difcil acceso, deben establecerse los procedimientos de desmontaje y la frecuencia para su limpieza. Esta puede realizarse de forma manual o automtica. La limpieza de forma automtica puede provocar algunos inconvenientes como la necesidad de proteger los filtros y la ubicacin de drenajes, lo cual en zonas crticas debe ser debidamente justificado as como la acumulacin de agua en zonas de difcil acceso. Un sistema de limpieza automtico (CIP) no puede justificarse por la existencia de zonas de difcil acceso y debe valorarse la efectividad de remocin de la contaminacin por la atomizacin comparada con un proceso manual8, 10, 16

Requerimientos del rea en que se ubica el aislador.

Los aisladores pueden ubicarse en reas desde grado B hasta D.

Los requerimientos del medio circundante estarn dados por las caractersticas del aislador, como diseo, tipo de sistema de transferencia, mtodos de limpieza y "sanitizacin", diferenciales de presin, requerimientos de mantenimientos entre otros. La seleccin correcta del medio circundante deber demostrarse con la validacin de los procesos, teniendo particular importancia los controles ambientales11, 17

Ensayo de esterilidad de productos estriles citostticos.

La utilizacin de aisladores en estas producciones en esta situacin permite aprovechar dos de sus principales ventajas: aumentar los niveles de esterilidad y con ello la garanta de calidad de los productos, y lograr una efectiva proteccin del operario y del medio ambiente ya que permite aislar el txico en un rea ms reducida, con un diseo eficiente y adecuado, permitiendo simplificar la instalacin en su conjunto.

Para esta aplicacin es de vital importancia lograr una adecuada seleccin de los guantes a fin de evitar la "permeacin del citosttico". Se reporta que los guantes de ltex ofrecen la mejor proteccin aunque son permeables para algunos de ellos. El tiempo de exposicin y la cantidad de frmaco influyen en el nivel de "permeacin". Se recomienda no utilizar guantes de PVC para su manipulacin.18, 19

La adecuada limpieza e inactivacin de los residuales generados, integrado un correcto diseo de las reas de trabajo, complementan la eficiente proteccin que proporciona el aislador 8

Liberaciones paramtricas.20, 21, 22, 23, 24 y 25

Las autoridades sanitarias de los distintos pases requieren que los productos estriles renan ciertos requerimientos de esterilidad antes de ser liberados al mercado. En muchos casos, los requerimientos para la liberacin del lote estn basados en el ensayo de esterilidad realizado sobre unidades del producto terminado, retiradas representativamente del lote en cuestin. Esta metodologa de liberacin es la tradicional y la que se ha venido utilizando durante muchos aos. Ms recientemente, aparecieron otros criterios posibles a tener en cuenta para la liberacin al mercado de productos estriles. Estas son las Liberaciones paramtricas.


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Algunas definiciones

La liberacin paramtrica, segn FDA en Guidance for Industry de Febrero 2010, es definida como un programa de liberacin que ofrece la garanta sobre la esterilidad de un producto basndose en el control demostrado sobre puntos crticos definidos del proceso de esterilizacin para poder cumplir con CFR 21. 211.165 (a) y 211.167(a). Bajo esta estrategia, las liberaciones al mercado de productos esterilizados terminalmente pueden ser basadas en el cumplimiento de parmetros de esterilizacin definidos y no en el aprobado del test de esterilidad. Reunir los requerimientos del proceso de liberacin paramtrica puede proveer mayor garanta de que un lote rena los requisitos para liberarse que la garanta lograda con el anlisis de un nmero de unidades de producto final sometidas al ensayo de esterilidad.

Otra definicin de EU Anexo 17 de 2001, indica que es un sistema de liberacin que ofrece la garanta de que el producto es de la calidad deseada basndose en la informacin recogida durante el proceso de manufactura y el cumplimiento de las Buenas Prcticas de Manufactura relacionadas con la liberacin paramtrica.

Segn PDA, en su Reporte tcnico N 30 de 2010, la liberacin paramtrica es un programa de liberacin de la esterilidad basado en el control, monitoreo y documentacin de un proceso validado de manufactura de un producto estril, en donde la aprobacin de la esterilidad est basada en el cumplimiento demostrado de parmetros de operacin crticos en lugar de la realizacin del ensayo de esterilidad sobre el producto final.

Antecedentes

El testeo de esterilidad por cultivo microbiolgico de las unidades del lote est limitado en su habilidad por detectar la contaminacin debido a:

El nmero pequeo de muestras requeridas para el testeo, la cual est restringida a la habilidad por capturar aquello microorganismos dispersos en un gran volumen.

La habilidad limitada del medio de cultivo a estimular el crecimiento de todos los potenciales microorganismos.

Estos ensayos detectarn slo errores mayores en los procesos de manufactura que resultan en una contaminacin de un nmero grande de unidades de producto. Sin embargo, los datos derivados de los controles en proceso de un proceso de esterilizacin terminal pueden proveer informacin ms exacta acerca de la esterilidad de un producto debido a que la probabilidad de que la carga microbiolgica sobreviva al proceso de esterilizacin en alguna unidad puede ser calculada como menor a 1 en 1.000.000.

La liberacin paramtrica permite a los manufacturadores reemplazar el ensayo de esterilidad de las muestras de producto final del lote por una liberacin basada en criterios de aceptacin de controles de parmetros de proceso identificados.

Estos parmetros, llamados parmetros crticos, son crticos para el satisfactorio proceso de esterilizacin y estn basados en el conocimiento profundo de: el proceso, el producto, el efecto de la esterilizacin en el producto, y los microorganismos asociados con el producto durante la manufactura. La liberacin paramtrica del lote est basada en la evidencia documentada de control de los parmetros crticos, removiendo la necesidad de testeo del producto final.

Un monitoreo de la carga a esterilizar ya sea de forma fsica, qumica o mediante indicadores biolgicos en cada carga, debe estar incluida para satisfacer los requerimientos del test del laboratorio. En adicin, el monitoreo de la carga de esterilizacin es siempre considerado un parmetro crtico del proceso. Un resultado del monitoreo de la carga esterilizada satisfactorio, el cumplimiento de los criterios de aceptacin de los parmetros crticos y el tener un programa de garanta de la esterilidad bien validado, demuestra que existe un estado de control del proceso de manufactura del producto. El o los monitores de la carga debern estar ubicados en apropiadas posiciones de modo de indicar que la carga fue expuesta al proceso de esterilizacin, que fue medida y registrada, cumpliendo con los criterios definidos para la liberacin paramtrica. Esta o estas posiciones estn determinadas basadas en la evaluacin del desarrollo y calificacin de los datos. La distribucin y nmero de monitores debe ser descripta y justificada. Procesos alternativos para demostrar que la carga o parte de ella fue expuesta a la esterilizacin debe ser discutido con la autoridad sanitaria antes de implementar la liberacin


271

paramtrica.

PDA ha aceptado la prctica de liberaciones paramtricas para drogas esterilizadas terminalmente por calor hmedo desde 1985. Liberaciones paramtricas descriptas en la Conferencia Internacional de Armonizacin (ICH) Q6A (ICH 2000) fueron tomadas por grupos de manufactura y regulatorios de distintos pases tales como USA (PDA 1999, USP 2009), EU (PIC/S 207), EMEA 2001) y Japn (Sasaki 2002).

Evaluacin del material para la aceptacin de la prctica de liberacin paramtrica.

El aprobado de la prctica de liberaciones paramtricas est basado en la evaluacin de los parmetros crticos del proceso propuestos y en la forma en que los mismos sern controlados. Entre lo requerido se encuentra contar con ciclos de esterilizacin terminal de produccin que demuestren ser confiables, controles microbiolgicos, monitoreo de los parmetros de los ciclos de produccin y control de que los mismos den resultados dentro de los lmites validados establecidos.

Otro punto a considerar es la evaluacin de riesgo que se haya hecho. Una evaluacin de riesgo segn ICH Q9 (ICH 2006), debe proveer:

A. Estrategia corriente para el control del programa de esterilizacin terminal.

B. Riesgo que las estrategias de rutina puedan fallar

C. Mostrar cmo las experiencias de manufactura y el conocimiento fueron incorporados en la evaluacin de riesgo. Herramientas de Gerenciamiento del Conocimiento y Riesgo de la Calidad pueden ser usadas en forma continua para mejor la capacidad a travs del ciclo de vida del proceso de esterilizacin.

A. Estrategia de control para el Programa de Esterilizacin terminal.

Una estrategia de control debe ser usada para asegurar que los criterios de aceptacin del proceso de liberacin paramtrica y el ciclo de esterilizacin terminal son reunidos de modo de garantizar la esterilidad del producto.

La estrategia de control debe incluir:

Racional para justificar los mtodos empleados para el monitoreo y control del proceso de esterilizacin terminal usado en la liberacin del producto (parmetros de proceso crtico).

Racional para justificar la seleccin del parmetro crtico del proceso.

Descripcin del criterio de aceptacin para la liberacin paramtrica.

Descripcin del producto droga y el sistema de cierre del contenedor (incluyendo el empaque secundario, si aplicara) que ser parte del programa de liberacin paramtrica.

Descripcin de los patrones de carga de produccin propuestos y verificacin de que estn dentro de lmites validados para el ciclo de esterilizacin terminal, o una declaracin de que ellos no han sido cambiados desde la ltima validacin y aprobacin, si aplicara.

Descripcin del plan de monitoreo microbiolgico para el producto y componentes antes de la esterilizacin terminal o una declaracin de que el plan no ha sido cambiado desde la ltima validacin. Estudios de resistencia al calor y deteccin de esporas debe ser enfatizado para el estudio de la biocarga.

B. Evaluacin de riego, entendimiento del proceso y conocimiento previo.

Los sistemas de liberaciones paramtricas exitosos estn basados en la confiabilidad de la estrategia de control del programa de aseguramiento de la esterilidad. Es recomendable que la evaluacin de riego haga foco en el riesgo de falla de modo de lograr la probabilidad mnima de obtener una unidad no estril para cada unidad del lote.

La evaluacin de riesgo debe incluir:

Consistencia en el funcionamiento del ciclo de esterilizacin terminal dentro de los lmites validados.

Una discusin del riesgo de esterilidad de los productos relativo a lo siguiente: Ciclo de esterilizacin terminal de produccin. Patrones de carga de la produccin.


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Sistema de cierre de los contenedores, incluyendo empaque secundario, si aplicara.

Riesgo de contaminacin proveniente del ambiente. Para un programa de liberacin paramtrico ya autorizado si ocurrieran cambios en los tems arriba mencionado deberan ser informados a la autoridad competente junto con una evaluacin de riesgo de la esterilidad de los productos alcanzados por este cambio. Por ejemplo, un aumento de tiempo en la esterilizacin, aunque el tiempo mnimo de esterilizacin establecido no puede ser bajado, el tiempo mximo de esterilizacin puede ser aumentado si los datos de estabilidad entregados justifican el cambio.

Experiencias sobre el producto y su sistema de cierre, sobre el proceso de esterilizacin, riesgos de la esterilizacin y etapas que han sido evaluadas y controladas en su riesgo. Para un producto nuevo puede llegar a ser suficiente trabajar con el conocimiento sobre los datos de los lotes usados para el desarrollo y registro del producto.

Una discusin previa general sobre el conocimiento, produccin y experiencias de testeo de la esterilidad del producto que va a ser objeto de la liberacin paramtrica.

C. Documentacin para el proceso de liberacin paramtrica.

La siguiente informacin especfica es requerida:

Descripcin detallada y completa de los ciclos de esterilizacin terminal actuales ms relevantes.

Identificacin de los parmetros crticos de proceso para los productos propuestos para la liberacin paramtrica, incluyendo los lmites mximos y mnimos para dichos parmetros. Los parmetros crticos deben mostrar que caen dentro de los lmites que han sido validados y aprobados.

Reconocimiento que la adherencia a los parmetros crticos al programa de liberacin paramtrica sustituir a la realizacin del test de esterilidad como criterio de liberacin del producto final, no pudindose volver a l en caso que no se cumplan los criterios de liberacin paramtricas. Dado este caso la carga esterilizada debe ser rechazada.

Una descripcin del monitoreo de la carga del esterilizador indicando: tipo de monitor propuesto, cmo el monitor de la carga ser usado y analizado, qu funciones se van a medir y el racional para la ubicacin del monitor.

Documentacin del sistema de control para verificar la exposicin de la carga al proceso de esterilizacin.

Revisin de los certificados de anlisis o documentos de liberacin del lote de cada producto sujeto a liberacin paramtrica para indicar que el test de esterilidad es reemplazado por la liberacin paramtrica.

Las liberaciones paramtricas en Argentina

Una de las normativas argentinas es la Disposicin ANMAT N 2819/2004, basada en las recomendaciones de la OMS. Esta norma incluye:

BPF para Elaboradores, Importadores / Exportadores de Medicamentos Consideraciones Generales, Gestin de Calidad, 18 Captulos y 11 Anexos.

En el Anexo III de la disposicin ANMAT 2819/2004 se trabaja el tema Liberacin Paramtrica que se trata a continuacin. Definicin y exigencias en Argentina

Es un sistema de liberacin que ofrece la garanta de que el producto es de la calidad deseada basndose en la informacin recogida durante el proceso de fabricacin y en el cumplimiento de exigencias especficas de las Buenas Prcticas de Fabricacin.

Para practicar la liberacin paramtrica se debe cumplir con las exigencias bsicas de las Buenas Prcticas de Fabricacin, un sistema de Anlisis de Peligro y Puntos Crticos de Control (HACCP) implementado, los anexos aplicables y las directrices que se incluyen a continuacin; y los laboratorios deben ser autorizados por la ANMAT para tal fin.


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Las liberaciones paramtricas en general

Se acepta que un conjunto completo de ensayos y controles durante el proceso podra garantizar que el producto terminado cumple las especificaciones. La liberacin paramtrica puede ser autorizada para determinados parmetros especficos como alternativa a los ensayos rutinarios de los productos terminados.

La autorizacin de la liberacin paramtrica debe ser concedida, denegada o retirada por la Autoridad Sanitaria Nacional. La liberacin paramtrica se debe practicar en presencia, supervisin y aprobacin de una comisin de inspectores de las Buenas Prcticas de Fabricacin.

Liberaciones paramtricas para productos estriles en Argentina

Solamente trata la parte de la liberacin paramtrica relacionada con la aprobacin rutinaria de productos terminados sin llevar a cabo un ensayo de esterilidad. La eliminacin del ensayo de esterilidad solamente ser vlida si se demuestra satisfactoriamente que se han alcanzado las condiciones predeterminadas y validadas de esterilizacin. El laboratorio debe contar con un sistema de garanta de la esterilidad.

La liberacin paramtrica se podr autorizar si los datos que demuestran la correcta elaboracin del lote aportan, por s solos, la garanta suficiente de que el proceso fue diseado y validado para garantizar la esterilidad del producto.

La liberacin paramtrica solamente es aceptable para productos esterilizados mediante esterilizacin terminal por calor hmedo, en su envase final.

El fabricante debe contar con un historial de cumplimiento adecuado de las normas de Buenas Prcticas de Fabricacin. Al evaluar el cumplimiento de las Buenas Prcticas de Fabricacin, deben tenerse en cuenta el historial de no esterilidad de los productos y los resultados de los ensayos de esterilidad, llevados a cabo sobre el producto en cuestin, junto con los productos procesados mediante el mismo sistema de garanta de la esterilidad.

Es poco probable que un producto completamente nuevo se considere adecuado para la liberacin paramtrica, ya que los criterios de aceptacin incluirn un perodo de resultados satisfactorios del ensayo de esterilidad. Sin embargo, puede darse el caso de que un producto nuevo no sea ms que una variacin menor, desde el punto de vista de garanta de la esterilidad, y que se puedan considerar aplicables por tanto, los datos existentes sobre el ensayo de esterilidad de otros productos.

El diseo y la validacin original del producto deben garantizar que se mantiene su integridad en todas las condiciones operativas.

El sistema de control de cambios debe exigir la revisin de los cambios por parte del personal de garanta de la esterilidad.

Debe estar implementado un sistema de Anlisis de Riesgo y Puntos Crticos de Control (HACCP) en el sistema de garanta de la esterilidad centrado en una evaluacin de la aprobacin como si se tratara de productos no esterilizados.

La limpieza y sanitizacin de las partes de los equipos, utensilios y todo el material que est contacto directo con el producto deben estar validadas.

Las reas de elaboracin del producto deben estar calificadas como indica la legislacin vigente para la exigencia del producto.

En los lugares de la elaboracin y de la esterilizacin debe estar presente un profesional calificado en microbiologa con experiencia en la garanta de la esterilidad y la persona autorizada.

Debe existir un sistema para controlar la posible contaminacin microbiolgica en el producto antes de la esterilizacin.

No debe existir la posibilidad de que se mezclen productos esterilizados con productos no esterilizados, lo cual se debe garantizar mediante barreras fsicas o sistemas electrnicos validados.

Se debe verificar que los protocolos de esterilizacin cumplan con las especificaciones mediante dos sistemas independientes, como mnimo. Estos sistemas pueden ser dos personas o un sistema informtico validado ms una persona.


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Antes de la aprobacin de cada lote de producto se deben confirmar los siguientes puntos adicionales:

En el equipo de esterilizacin utilizado se han realizado todas las tareas de mantenimiento planificadas y las verificaciones rutinarias.

Todas las reparaciones y modificaciones han sido aprobadas por el responsable de garanta de la esterilidad y la persona autorizada.

Todo el instrumental debe estar calibrado.

El procedimiento de esterilizacin posee una validacin actualizada para la carga de producto procesado.

La descripcin del proceso de esterilizacin incluyendo el tipo de ciclo, plantilla de registro, especificaciones de los parmetros del ciclo (tiempo, temperatura, presin, Fo) e indicadores qumicos.

Las especificaciones y mtodos o procedimientos aplicados para los controles en proceso por ejemplo pre-esterilizacin, carga microbiana inicial, monitoreo de los parmetros del ciclo de esterilizacin y verificacin del registro de esterilizacin.

Una vez concedida la liberacin paramtrica, las decisiones sobre aprobacin o rechazo de un lote se basarn en las especificaciones aprobadas. El incumplimiento de las especificaciones para la liberacin paramtrica no podr compensarse por haber superado un ensayo de esterilidad


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21. Code of Federal Regulations: Title 21- Chapter I- Part 211

22. Disposicin ANMAT N2819/2004- ANEXO III

23. Farmacopea Argentina 7ma. Ed. It: 370

24. PIC/S- PI 005-2

25. EMEA-Guidance of Parametric Release


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Captulo IV.2.

Endotoxinas bacterianas

Beatriz Giampaolo y Nlida Mondelo

Endotoxins possess an intrinsic fascination that is nothing less than fabulous. They seem to

have been endowed by nature with virtues and vices in the exact and glamorous proportions needed to render

them irresistible to any investigator who comes to know them Ivan L Bennet Jr-John Hopkins University (1)

1. Introduccin

2. Sustancias piretognicas

3. Endotoxinas Bacterianas: estructura, propiedades biolgicas y fisicoqumicas

4. Despirogenizacin

5. Endotoxinas Bacterianas: Fuentes de contaminacin y su prevencin

6. Ensayo de Endotoxinas Bacterianas

6.1. Surgimiento y fundamentos

6.2. Metodologas de Ensayo de Endotoxinas Bacterianas

6.3. Aspectos Prcticos

6.3.1. El Lisado Reactivo

6.3.2. La Endotoxina Estndar

6.3.3. El Agua Reactivo

6.3.4. Los Equipos e Instrumentos

6.4. Establecimiento de Lmites de Endotoxinas

6.5. Mxima Dilucin Vlida

6.6. Prueba preliminar de interferencias (inhibicin/activacin)

6.6.1. Posibles causas de interferencias

6.6.2. Bsqueda de soluciones para superar interferencias

6.7. Prueba definitiva de interferencias (inhibicin/activacin)

6.8. Ensayo de rutina

6.8.1. Muestra

6.8.2. Soluciones

6.8.3. Ensayo

6.9. Interpretacin de los resultados

6.10. Aplicaciones

7. Seleccin de mtodos

7.1. Reemplazo del Ensayo de Piretgenos en conejos por mtodos LAL

7.2. Distintas tcnicas de Ensayo de Endotoxinas Bacterianas (ensayo LAL)

7.3. Ensayos de piretgenos in vitro

8. Enfoques novedosos para la deteccin de Endo

4-SeccionIV

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