Fermentación Alcohólica Laboratorio de Ingeniería de Fermentaciones

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INTRODUCCION La fermentación alcohólica es una biorreacción que permite degradar azúcares en alcohol y dióxido de carbono. La conversión se representa mediante la ecuación:

Las principales responsables de esta transformación son las levaduras. La Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con más frecuencia. Por supuesto que existen estudios para producir alcohol con otros hongos y bacterias, como la Zymomonas mobilis, pero la explotación a nivel industrial es mínima. A pesar de parecer, a nivel estequiométrico, una transformación simple, la secuencia de transformaciones para degradar la glucosa hasta dos moléculas de alcohol y dos moléculas de bióxido de carbono es un proceso muy complejo, pues al mismo tiempo la levadura utiliza la glucosa y nutrientes adi cionales para reproducirse. Para evaluar esta transformación, se usa el rendimiento biomasa/producto y el rendimiento producto/ substrato. El rendimiento teórico estequiométrico para la transformación de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este valor fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difícil lograr este rendimiento, porque como se señaló anteriormente, la levadura utiliza la glucosa para la producción de otros metabolitos.

Con el fin de obtener altos rendimientos en la fermentación alcohólica es necesario considerar ciertos parámetros y realizar un estudio sobre los efectos que en mayor o menor grado alteren la buena marcha del proceso.

Variables de la fermentación alcohólica y sus efectos sobre el proceso

Clase de microorganismo: Los microorganismos más empleados para la producción de etanol a partir de azúcares son las levaduras del género Saccharomyces y Kluyveromyces y las bacterias Zymomonas mobilis. Concentración del sustrato: El carbono es suministrado por los azúcares contenidos en la materia prima, siendo la concentración de azúcar un valor que se debe considerar ya que afecta la velocidad de la fermentación, el comportamiento y el desarrollo de las células de la levadura. Suele ser satisfactoria una concentración de azúcar del 10 al 18%, el valor más corriente es del 12%. Cuando se trabaja con concentraciones de azúcar muy altas, del orden de 22%, se observa una deficiencia respiratoria en la levadura y un descenso de la velocidad de fermentación; por el contrario, al trabajar con concentraciones muy bajas, el proceso resulta antieconómico ya que requiere un mayor volumen para la fermentación. Concentración de Etanol: La levadura es afectada en alto grado por la concentración de alcohol, una concentración alcohólica del 3% ya influye sobre el crecimiento; una concentración de un 5% influye

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tanto sobre el crecimiento como en la fermentación. Cuando la concentración es del 10%, en algunas levaduras el crecimiento sufre la paralización total. Temperatura: La selección de esta variable es influenciada tanto por factores fisiológicos como por problemas físicos (pérdidas debidas a la evaporación de etanol al trabajar con temperatura elevada). Se debe tener en cuenta que para cada levadura existe una temperatura óptima de desarrollo, en la cual se muestra activa. Además, se tiene una zona independiente de la temperatura óptima en la cual la levadura aún presenta actividad; a medida que se aleja de la temperatura óptima su actividad disminuye notablemente. Por debajo de la temperatura señalada como mínima y por encima de la máxima, las levaduras continúan viviendo en estado latente, sin embargo, al exponer cualquier levadura a una temperatura de 55 ºC por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. En el caso de la Saccharomyces cerevisae se tiene un desarrollo óptimo entre 28-35 ºC, recomendable 30 ºC. pH: Este es un factor importante en la fermentación, debido a su importancia en el control de la contaminación bacterial como también al efecto en el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentación y en la formación de alcohol. Durante la fermentación la levadura toma el nitrógeno de los aminoácidos orgánicos, perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos, lo cual origina una disminución del pH del medio. Cuanto más bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infección, pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentación es muy lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente. Según estudios se halló que el pH más favorable para el crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5 para su crecimiento óptimo. Concentración de nutrientes: Como ya se dijo, la presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una condición necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentración un factor primordial en la actividad vital de la levadura. Las principales sustancias nutritivas y las más influyentes son el nitrógeno, fósforo, azufre, vitaminas y trazas de algunos elementos.

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Cinética de Producción de Etanol

Muestra t (horas) °G.L. g/L 0 0 0 0 1 5.68 6 47.34 2 22.83 8 63.12 3 31.67 8.5 67.065 4 93.45 9.5 74.955 5 99.28 9.5 74.955 6 120.66 9.5 74.955

El cálculo para convertir de °G.L. a g/L se muestra a continuación, tomando en cuenta que el resto será análogo a este:

𝑔 𝐸𝑡𝑂𝐻𝐿

= �°𝐺. 𝐿.100

� ∗ 𝜌𝐸𝑡𝑂𝐻 ∗ 1000

�6 °𝐺. 𝐿.

100� ∗ �

0.789𝑔𝑚𝐿

� ∗ 1000 = 𝟒𝟕.𝟑𝟒 𝒈𝑬𝒕𝑶𝑯/𝑳

Gráfica 1. Cinética de Producción de Etanol

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120 140

Conc

entr

ació

EtO

H (g

/L)

t (horas)

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Rendimiento El rendimiento teórico reportado en la bibliografía es de 0.51 g de Etanol por cada gramo de disacárido usado. La concentración de sólidos en el mosto se ajustó a 25 °Bx, sin embargo no todos los sólidos disueltos corresponden a azúcares, se consideró entonces que la concentración de azúcar se encontraba alrededor de 18 °Bx. Si teníamos 5 L de jarabe de 18°Bx, tenemos en total 900 gramos de azúcar, por lo que el rendimiento total esperado es de 637.5 gramos de etanol.

18°𝐵𝑥(5𝐿)�10 𝑔 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟

𝐿1 °Bx

� = 900 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟

Se obtuvieron 374.775 gramos de etanol totales (obtenido de multiplicar la concentración final de Etanol por el volumen total de mosto), por lo que el rendimiento que tenemos es:

0.41 g de Etanol por cada gramo de disacárido usado. La gráfica 1 muestra la producción de etanol a lo largo de la fermentación, como se puede observar la producción de etanol es significativamente mayor durante las primeras horas de la fermentación, esto es debido a la alta disponibilidad de sustrato en el medio y a medida que éste se va agotando las velocidad de producción disminuye hasta alcanzar un estado estacionario. Por otro lado, existen algunas variables que afectan de forma importante el desarrollo de la fermentación y con ello el red el rendimiento como son el tipo de microorganismo, la concentración de sustrato, temperatura, pH, concentración de nutrientes, entre otros. Todos los factores antes mencionados fueron medido y ajustados en el medio de cultivo al inicio de la fermentación con la finalidad de establecer las condiciones óptimas para llevar a cabo el proceso. El rendimiento obtenido

fue de 0.41 𝑔 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙𝑔 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑖𝑑𝑜

el cual, al ser comparado con el rendimiento teórico �0.51 𝑔 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙𝑔 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑖𝑑𝑜

� es

muy bueno. Más aun, industrialmente se obtienen rendimientos de 0.46 a 0.48 𝑔 𝑑𝑒 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙𝑔 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑖𝑑𝑜

y

considerando que industrialmente las condiciones de fermentación se encuentran perfectamente controladas, el rendimiento obtenido a nivel laboratorio resulta bastante satisfactorio.

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CONSUMO DE SUSTRATO Los azúcares que la levadura no ha consumido, azúcares residuales, se miden al emplear el método de Fehling. Se tomaron 5 mL de muestra de cada tiempo tomado de la fermentación y se colocaron en un matraz aforado de 100 mL, al cual se le agregó 20 mL de agua y 5 mL de ácido clorhídrico concentrado. El siguiente paso es calentar la muestra a ebullición durante 5 minutos, pasado ese tiempo se añaden 1.5 mL de hidróxido de amonio y se lleva a 100 mL con agua destilada. Con esta solución se titula el reactivo de Fehling, el cual se prepara con 5 mL de Fehling A y 5 mL del Reactivo de Fehling B, con una gota de azul de metileno. De las determinaciones anteriores se obtuvieron los siguientes datos:

Muestra Gasto de la titulación 0 7.9 1 8.6 2 10.8 3 11.1 4 15.0 5 15.0 6 15.8

El contenido de azúcares reductores se calcula con la siguiente expresión matemática:

%Azúcares reductores =F x Vm x g

x 100

Donde: F = Factor de Fehling = 0.05 g de dextrosa (glucosa) equivalentes a 10 ml de la mezcla de reactivos de Fehling. V = Volumen del aforo = 100 ml m = Masa de la muestra = 5 ml g = Gasto de la titulación. Ejemplo de cálculo: Tomemos el último tiempo para ejemplificar el cálculo de los azúcares en el medio de cultivo:

% 𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 =0.05 𝑔

100 𝑚𝐿

5 𝑔 15.8 𝑚𝐿

𝑥 100

% 𝐴𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠 𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 = 6.33 %

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De la manera anterior se calculan todos los demás datos de azúcares reductores, tales resultados se concentran en el siguiente cuadro: Muestra Tiempo de fermentación

(horas) Gasto de la titulación

(mL) % Azúcares Reductores

0 0 7.9 12.65 1 5.68 8.6 11.62 2 22.83 10.8 9.26 3 31.67 11.1 9.009 4 93.45 15.0 6.66 5 99.28 15.0 6.66 6 120.66 15.8 6.33

Gráfico 2.- Cinética de consumo de sustrato

Interpretación de resultados Al inicio de la fermentación los azúcares se espera que sean altos ya que la levadura aún no consume el sustrato y el metabolismo es lento. En las horas siguientes, el metabolismo se acelera y el consumo de sustrato por la levadura aumenta, este consumo lo hace principalmente para mantenimiento celular y

0

2

4

6

8

10

12

14

0 20 40 60 80 100 120 140

% A

zúca

res R

Educ

tore

s

Tiiempo de fermentación (hrs)

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para generación de biomasa, además de que la levadura al no contar con oxígeno en el medio tiene que fermentar, por lo tanto genera un metabolito que utiliza como último aceptor de electrones (acetaldehído) para formar el etanol. Esto se observa en el gráfico de consumo de sustrato perfectamente ya que en los primeros tiempos de fermentación el consumo es elevado y se incrementa a una velocidad elevada; conforme transcurre la fermentación el consumo va disminuyendo, se puede observar que en los últimos tiempos los azúcares reductores no cambian, esto indica un cese del crecimiento de levaduras, ya no hay consumo de sustrato, muy posiblemente las levaduras han alcanzado una fase de muerte celular y no consumen el sustrato.

CONCENTRACIÓN CELULAR

Método de la Cámara de Neubauer.

Muestra Promedio de células contadas por cuadro

Células por celda

(𝒄𝒆𝒍������ x 25) 0 2.00 50 1 2.52 63 2 3.12 78 3 7.68 192 4 9.60 240 5 3.20 80 6 1.00 25

Cálculo de células en (g/L) Las células que se contabilizaron por celda se encuentran en 0.1 mm3 , por lo que se procede a realizar los siguientes cálculos: Para la muestra inicial

50 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 0.1𝑚𝑚3

1 𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 20𝑥109 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

1𝑥106𝑚𝑚3

1𝐿𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (20)

= 0.5𝑔 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎

𝐿

Muestra g de levadura/L Hora de toma de la muestra

0 0.50 0 1 0.63 5.68 2 0.78 22.83 3 1.92 31.67

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8

4 2.40 93.45 5 0.80 99.28 6 0.25 120.66

Gráfico 3.- Cinética de crecimiento de biomasa

Discusión Es posible observar en la grafica de la cinética de crecimiento microbiano que el punto en que se presento la mayor cantidad de levaduras en la fermentación fue a las 90 horas aproximadamente, el tiempo anterior a este se llevo a cabo el crecimiento de las levaduras mientras que posterior a las 90 horas se observa una disminución de los gramos de levadura que contienen cada litro de la muestra. Esta reducción en la cantidad celular se puede atribuir a que la levadura es capaz de fermentar un mosto hasta niveles de etanol que van de un rango entre 4 a12% (v/v), por tal motivo si se llega a estos niveles de etanol las levaduras dejan ce crecer y es por ello que observamos una disminución de la cinética de crecimiento.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 20 40 60 80 100 120 140

g le

vadu

ra/L

Tiempo (h)

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Gráfico 4.- Cinéticas de crecimiento, consumo de sustrato y generación de biomasa

DISCUSIÓN GENERAL Podemos ver en el gráfico 4 que el crecimiento de biomasa es una típica cinética de crecimiento, donde al inicio se puede ver la fase de adaptación de la levadura al medio de cultivo donde se realiza la síntesis de la maquinaria metabólica para poder degradar la solución de piloncillo. Si vemos los azúcares reductores podemos ver que han sido consumidos por las levaduras para poder mantener sus funciones metabólicas, generación de biomasa y producción de etanol. Se puede observar que el etanol se produce desde las primeras horas de fermentación, por lo que podemos decir que es un metabolito asociado al crecimiento. Al seguir el tiempo de fermentación, se observa una fase de crecimiento logarítmico al tiempo 22.63 y 31.67 horas en la cual existe una gran producción de alcohol. Posteriormente, por el comportamiento de las tres gráficas puede deducirse que existe una fase de mantenimiento donde el crecimiento microbiano desacelera y éste aumenta muy poco; de igual forma la producción de alcohol disminuye. Por último, en los últimos tres tiempos de fermentación (desde 93.45 a 120.66 horas) los valores de concentración de etanol son exactamente iguales, es decir, no hubo síntesis de etanol durante este tiempo, lo que puede significar que la levadura ha muerto y no produce más metabolito. Lo anterior lo podemos comprobar con las otras cinéticas; los azúcares reductores no variaron durante ese tiempo, por lo que se deduce que no existió consumo de sustrato; la biomasa disminuyó, así que presumiblemente hay muerte microbiana y las células hubieron floculado y precipitado al fondo del reactor, eso pudo haber disminuido el conteo celular tan drásticamente en este lapso de tiempo.

0

10

20

30

40

50

60

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0.5

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1.5

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0 20 40 60 80 100 120 140

g le

vadu

ra/

mL

Tiempo de Fermentación

g de levadura/L % Azúcares Reductores g/L

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Las condiciones de operación no fueron las más óptimas, además de que la temperatura varió durante todo el tiempo de fermentación, disminuyendo el crecimiento por la noche y favoreciéndolo en el día. Las condiciones asépticas no fueron cuidadosamente manejadas debido a que éste tipo de fermentación y por sus características no permite el crecimiento de otros organismos: al inicio existe un pH bastante ácido y la concentración de azúcares es muy alta lo que limita el crecimiento de bacterias. Posteriormente durante la fermentación se vuelve anaerobia, eliminando así las bacterias aerobias presentes en el medio. Por último la concentración de alcohol en la última fase de la fermentación es lo bastante alta como para limitar el crecimiento de otros organismos. Lo anterior permite establecer que la fermentación alcohólica aparte de ser un proceso relativamente barato para la obtención de alcohol, es poco susceptible a contaminación y posee altos rendimientos, lo que se busca industrialmente es buscar un sustrato más barato proveniente de algún desecho o residuo para evitar gastar mucho en sacarosa. Cabe señalar que muchos productos de gran calidad como vinos, cervezas, tequila y otras bebidas alcohólicas se obtienen por este tipo de fermentación, en muchos de los casos el metabolito no se separa totalmente del producto (no se purifica), ya que perdería propiedades sensoriales, como en el caso de la cerveza que no sufre proceso de destilado.

CONCLUSIONES

La levadura es capaz de fermentar mosto en un período de tiempo aceptable para producir niveles de etanol con un rango entre 4 a 12 % (v/v).

La levadura redujo la cantidad de azúcares de 12.65% a 6.33%, en las 120.66 horas de fermentación.

La biomasa máxima obtenida fue de 2.4 g de levadura/ L a las 93 horas, la mínima fue de 0.25 g de levadura/ L lo que pudo deberse a floculación

El etanol alcanzó una concentración máxima de 74.9 g de alcohol/ L

La producción de etanol está relacionada directamente con el crecimiento de la levadura.

Las condiciones ambientales no controladas pudieron haber afectado el crecimiento de la levadura y por lo tanto la producción de alcohol

BIBLIOGRAFÍA

http://docencia.izt.uam.mx/mleh/alimentos_fermentados/otros_sitios/Contenido.htm http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap5_mi.pdf