23-08-2002 PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE · PDF fileFecha emisión: 23-08-2002...

Fecha emisin: 23-08-2002 Revisin: 5
PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR
MTODO CONVENCIONAL Fecha revisin: 30-03-2009
Seccin Microbiologa de Alimentos
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1. OBJETIVO Detectar la presencia de Salmonella en los alimentos mediante mtodo cualitativo recomendados por organismos internacionales 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos que de acuerdo a las normativas vigentes en el pas requieran este anlisis. 3. FUNDAMENTO De acuerdo con las normas internacionales y al reglamento sanitario de los alimentos la sola presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo.
La tcnica permite realizar compsitos de muestras y segn el nmero de unidades que componen el compsito agregar el caldo de preenriquecimiento manteniendo la proporcin 1:9 a no ser que no est indicado. Para muestras no analizadas sobre una base de peso exacto, referirse a instrucciones para el mtodo especfico.
El fundamento del mtodo para la deteccin en alimentos se basa en que la presencia de Salmonella est en menor nmero que el de la flora acompaante especialmente en alimentos sin tratamiento previo o bien que los microorganismos se encuentran estresados por los procesos tecnolgicos a que son sometidos (calor, radiacin, congelacin etc.)
En el laboratorio los mtodos convencionales para su recuperacin consideran todos estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de preenriquecimiento y enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realizacin de pruebas bioqumicas y Serotipificacin.

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La etapa de preenriquecimiento recomendada en alimentos para el aislamiento de Salmonella difiere del mtodo empleado en muestras clnicas debido a varios factores entre los cuales estaran:
a) El N de clulas es usualmente ms bajo que en muestras clnicas. b) Los procesos tecnolgicos que se aplican a los alimentos debilitan a la bacteria. c) La constitucin propia del alimento: nutrientes, pH, aw, etc. influye en la sobrevivencia o en
su multiplicacin.
La presencia de substancias txicas para las bacterias presentes en el alimento
4. REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Methods On line, Diciembre 2007. 4.2 A.P.H.A. Asociacin Americana de Salud Pblica.-1992. Formules antigeniques des
serovars de Salmonella. WHO colaborating centre for reference and research on Salmonella.-Michel y. Popoff and Leon le Minor, Institute Pasteur.28 rue du Dr.Roux 75724. Paris cedex 15, France.1992.
4.3 Tablas T.L.M. Instituto de Salud Pblica de Chile. 1991. M.E.Valenzuela y J. Astorga. 4.4 AOAC International. 2000. Official methods of analysis, 18th ed., Methods 967.25,
967.26, 967.27, 967.28, 978.24, 989.12, 991.13, 994.04, and 995.20. A.O.A.C, md. International, Gaithersburg.
5. TERMINOLOGA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS
6.1.1 Bao termoregulado a 42 y 43 0,2C. 6.1.2 Incubadora a 35C +/- 2C. 6.1.3 Vortex mixer
6.2 MATERIAL DE LABORATORIO

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6.2.1 Placas Petri de 15x100mm 6.2.2 Pipetas estriles de 5m con 0.1vol, 1mL con 0.01 vol L 6.2.3 Asa de nicrn (aprox. de 3mm de dimetro). 6.2.4 Tubos estriles de 16x160 mm. 6.2.5 Mondadientes de madera o asa de vidrio 6.2.6 Mecheros Bunsen
6.2.7 Frascos de capacidad 300 mL.
6.3 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS 6.3.1 Caldo Rappaport Vassiliadis (RV) 6.3.2 Caldo base Tetrationato (T.T) 6.3.3 Agar Xilosa Lisina-Desoxicolato (XLD agar) 6.3.4 Agar Bismuto Sulfito(B.S.) 6.3.5 Agar Hektoen (HK) 6.3.6 Agar Triple azcar (TSI) 6.3.7 Lisina Iron Agar (LIA) 6.3.8 Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) 6.3.9 Agar citrato Simmon's 6.3.10 Caldo Urea 6.3.11 Caldo malonato 6.3.12 Caldo con indicador para carbohidratos (Glucosado ,Lactosado Sacarosado) 6.3.13 Solucin de verde brillante al 1% 6.3.14 Solucin de yodo yodurada 6.3.15 Etanol 70% 6.3.16 Novobiocina al 1% esterilizada por filtracin 6.3.17 Reactivo Kovac's 6.3.18 Control positivo: Cepa Salmonella enteritidis ATCC 13076 6.3.19 Control atpico: Cepa Salmonella typhimurium H2S negativa
Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H2S positiva.

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6.3.20 Cepa Control negativo: S. aureus
6.4 DISTRIBUCIN DEL ENVASADO DE LOS MEDIOS 6.4.1 CALDO DE ENRIQUECIMIENTO 6.4.1.1 Caldo Base Tetrationato (T.T) que se prepara a partir del medio base comercial en
tubos tapa rosca (10ml) al que se le agrega por tubo al momento de ser usado 0,2 mL de solucin de yodo yodurado y 0,1 mL de solucin de verde brillante al 1%.
6.4.1.2 Caldo Rappaport Vassiliadis Modificado (CRV.) Se prepara a partir del medio comercial en tubos tapa rosca (10 mL).
6.4.2 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS SLIDOS 6.4.2.1 Agar Hektoen 6.4.2.2 Agar Xilosa Lisina Dexocicolato (X.L.D) (1,2 mL de novobiocina al 1% x litro). 6.4.2.3 Agar Bismuto Sulfito comercial y distribuido en 20 mL en placas Petri.
6.4.3 MEDIOS DIFERENCIALES SLIDOS 6.4.3.1 Triple Sugar Agar (TSI) distribuir 4 mL en tubos tapa rosca. 6.4.3.2 Lisina Iron Agar (LIA) distribuir 4,5 mL en tubos tapa rosca. 6.4.3.3 Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) distribuir 3 a 4 mL en tubos tapa rosca. 6.4.3.4 Agar Citrato Simmon's distribuir 3 mL en tubos semitendido.
6.4.4 MEDIOS DIFERENCIALES LQUIDOS 6.4.4.1 Caldo malonato de Na, distribuir 2,5 ml en tubo tapa rosca. 6.4.4.2 Caldos base para carbohidratos: distribuir 5 ml en tubos y agregar el carbohidrato
mantenido en soluciones al 10 %: glucosa, lactosa, sacarosa, y eventualmente otros azcares como sorbitol.
6.4.4.3 Caldo Urea, distribuir 1,5 a 3,0 mL en tubos tapa rosca de 13 x 10 mm.
6.4.5 SUEROS 6.4.5.1 Suero Polivalente Somtico para Salmonella Poly A-I (DIFCO) 6.4.5.2 Suero polivalente flagelar.

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7. DESARROLLO 7.1 En el laboratorio Enterobacteriaceae se reciben las muestras homogeneizadas desde el
laboratorio Recepcin de muestras.
7.1.1 Anotar en cuaderno de Inscripcin del laboratorio de Enterobacteriaceae la clave y nmero de las muestras.
7.1.2 Someter a incubacin la muestra en caldo de preenriquecimiento a 35 C por 18-24 horas para continuar con el proceso.
* Nota: En el caso de las muestras que deben traspasarse a caldo de enriquecimiento previo a un da feriado, el caldo de preenriquecimiento incubado se guarda en refrigeracin hasta por 72 horas.
7.1.3 Despus de la incubacin por 18 horas a 35C sembrar el caldo de preenrequecimiento en los medios lquidos de enriquecimiento distribuidos en cantidades de 10 mL en tubos de 16x160mm con tapa rosca e identificados con el nmero y la clave correspondiente antes de ser inoculados.
7.1.4 Sellar la bolsa con calor. Eliminar para su incineracin en bolsas rojas. 7.1.5 Inocular 1 mL en caldo Tetrationato reconstituido al momento de usarse agregando 0,2
por 10 mL de solucin de yodo y 0,1 por 10 mL de verde brillante al 1%.
7.1.6 Inocular 0,1 mL en caldo Rappaport Vassiliadis (C.R.V.)
7.2 INCUBACIN DE LOS MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO 7.2.1 Alimentos con una carga microbiana alta. Incubar el caldo RV 24 2 horas a 42
0,2 C en bao de agua con agitacin. Incubar el caldo TT 24 2 horas a 43 0,2 C, en bao de agua con agitacin.
7.2.2 Alimentos con una carga microbiana baja. Incubar el medio RV 24 2 horas a 42 0,2 C en bao de agua con agitacin. Incubar el caldo TT 24 2 horas a 35 2C.
7.3 SIEMBRA EN AGARES SELECTIVOS 7.3.1 Con lpiz azul, marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Tetrationato y con
lpiz negro marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Rappaport.

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7.3.2 Sembrar cada uno de los caldos con los cultivos en: una placa de Agar X.L.D/N
(xilosa-lisina-dexocicolato/novobiocina); una placa de Agar Bismuto Sulfito (plaqueado el da antes y guardadas en oscuro a la temperatura ambiente) y una placa de Agar Hektoen.
7.3.3 Cada tubo de caldo de enriquecimiento se debe vortear y con asa de 3 mm (inculo10 l) extraer una asada e inocular las placas identificadas con negro y azul segn caldo a sembrar.
7.3.4 Inocular el Agar Hecktoen en forma de estras y sin flamear el asa, agotar el inculo en el agar X.L.D./N; extraer otro inculo con el asa y sembrar el Agar Bismuto sulfito.
7.3.5 Incubar las placas invertidas con la parte inferior hacia arriba a 35C .0,5 por 24 horas y realizar la lectura.
7.3.6 Si las placas de agar Bismuto sulfito no presentan desarrollo o este es escaso incubar por 24 horas ms.
7.

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