HOSPITAL PEDIÁTRICO UNIVERSITARIO

“OCTAVIO DE LA CONCEPCIÓN Y DE LA PEDRAJA” LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Holguín

Guía para la Identificación de las Bacterias

más frecuentes en el Laboratorio de Microbiología Clínica

Autor: Dra. Deysi Marrero Carralero

Coautores: Ing. Doralvis Colomé Rodríguez Dr. Leonel Rodríguez Rodríguez

Año 2006

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INDICE

1. Introducción

2. Aislamiento e identificación de las bacterias más frecuentes aisladas en el

laboratorio.

3. Identificación de cocos Grampositivos

4. Identificación de cocos Gramnegativos

5. Identificación de Bacilos Gramnegativos

6. Anexos

7. Bibliografía

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Introducción AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA. El aislamiento de los microorganismos, presentes en las muestras biológicas, suele indicar que se trate del agente causal de la enfermedad infecciosa que se está investigando y se lleva a cabo, utilizando medios de cultivo sólido contenido en una placa de Petri, siguiendo la técnica de la siembra por estría en la superficie. Los medios de cultivo que se van a usar dependen del tipo de muestra y de los microorganismos presentes en ella. De esta manera pueden emplearse medios nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios enriquecidos. Los medios más usados en el laboratorio, comprenden el de agar sangre de carnero 5%, agar MacConkey, agar nutritivo. Otro de los medios de cultivo recomendados a utilizar con este fin es el agar CLED, se trata de un medio diferencial que contiene lactosa y un indicador de pH (azul de bromotimol) que permite observar la fermentación ácida del azúcar, por el viraje del indicador de pH, de color verde a amarillo. Su déficit en electrolitos impide la invasión de la placa por microorganismos móviles, como son las especies del género Proteus, facilitando así su aislamiento y posterior identificación. Para la identificación de los distintos microorganismos aislados se realizarán pruebas bioquímicas, fisiológicas y serológicas. Estos procedimientos nos permiten aplicar técnicas de siembra por estría en el medio, obtener cultivos puros del microorganismo y luego proceder a la identificación de cada uno de los aislados clínicos. Material. Asa bacteriológica, cultivo mixto de bacterias, placas de agar CLED, agar sangre de carnero 5%, agar MacConkey y agar nutritivo. Dependiendo del microorganismo a identificar, se necesitarán otros medios de cultivo y reactivos, que se indican en cada procedimiento. Procedimiento. Si después de efectuar la inoculación de las muestras obtenemos cultivos mixtos tenemos que realizar subcultivos, con el objetivo de obtener la bacteria en cultivo puro. Seleccionamos colonias características y la inoculamos mediante estrías, en la superficie del medio, como el CLED o de otros medios, como agar sangre de carnero 5%, agar MacConkey, de acuerdo a cada caso. Posteriormente se colocan las placas en la incubadora, en posición invertida a 37º C durante 24-48 horas. Al cabo de este tiempo, se observarán en las placas los tipos de colonias que han crecido en la superficie del medio y se anotarán las características más importantes que puedan ser útiles en una identificación preliminar, en el libro de trabajo.

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Para estudiar la pureza de los cultivos se realizará la coloración de Gram de los distintos tipos de colonias aisladas, y luego se podrá efectuar un nuevo aislamiento en placas de agar nutritivo con cada una de las colonias crecidas en las placas primarias. Después de incubar 24 horas a 37º C, se procederá a la identificación de cada uno de los cultivos puros que se hayan obtenido. Los cultivos puros se verificarán mediante coloración de Gram y se procederá de acuerdo al resultado y a la. Finalmente se procederá a la realización de las pruebas de sensibilidad a los diferentes antimicrobianos (antibiograma) en agar Müeller-Hinton. 1. COCOS GRAMPOSITIVOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS FACULTATIVOS. Con los cultivos donde se observen cocos Grampositivos, los que pueden estar presentes en casi todas las muestras clínicas con una poblacion mixta de bacterias, debemos considerar con claridad, si se trata de estafilococos o estreptococos, éstos crecen bien en los medios comunes del laboratorio, especialmente en agar sangre. Para diferenciarlos podemos realizar distintas pruebas, pero primero debemos observar como son las colonias en el cultivo y el resultado de la coloración de Gram. Observar el crecimiento de colonias en agar sangre de carnero y ausencia

de colonias en agar de MacConkey. Coloración de Gram: se puede realizar de una colonia sospechosa en cultivo

de agar e inocular en caldo de BHI. En medios líquidos se observan los estafilococos en forma de racimos y los estreptococos en forma de cadenas. Tener en cuenta que los estreptococos aislados de colonias en medios sólidos pueden presentar formas elongadas o “difteroides”.

Diferenciaciar Micrococos de Estafilococos y Estreptococos. Los Micrococos, Estafilococos y Estreptococos se diferencian sobre la base de la prueba de la catalasa. Prueba de la catalasa. Esta prueba detecta la presencia de enzimas catalasa capaces de convertir el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aeróbicos y anaeróbicos facultativos que contienen citocromo, excluyendo los estreptococos. Material Peróxido de Hidrógeno 3%, cultivo bacteriano y portaobjetos. Procedimiento Tomar de la superficie de una colonia con un aplicador de madera y transferirla a una lámina portaobjetos, depositar sobre ella una o dos gotas de Peróxido de Hidrógeno al 3%. Interpretación La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con desprendimiento de burbujas, la enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar

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los géneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo). Si se trata de cocos Grampositivos, catalasa positiva, entonces se utiliza la prueba de Oxidación Fermentación de la glucosa para diferenciar los géneros Micrococcus y Staphylococcus. Utilización de la glucosa (O/F). Es una prueba útil para distinguir aquellos microorganismos que son incapaces de utilizar la glucosa anaeróbicamente de aquellos que lo pueden hacer. Material Cultivo bacteriano en estudio, dos tubos con medio Hugh-Leifson para estafilococos, aceite mineral estéril. Procedimiento Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que se hierven brevemente antes de

utilizarlos para eliminar el oxígeno disuelto. Una vez atemperados, se inoculan por punción, llegando al fondo y ascendiendo hacia la superficie. Dejar solidificar ambos tubos y recubrir uno de ellos con aceite mineral estéril (Tubo cerrado), el otro se deja expuesto al oxígeno ambiental (Tubo abierto). Incubar a 37 ºC durante 48 horas. Interpretación

La producción de ácido se evidencia por un cambio de coloración del medio, de púrpura a amarillo. Los Micrococcus acidifican el medio en el extremo del tubo abierto solamente, ésto indica que la bacteria utiliza la glucosa en forma oxidativa. Los Staphylococcus acidifican los dos tubos, por tanto, los dos tubos cambian a amarillo (+/+) y significa que el microorganismo utiliza la glucosa en forma oxidativa y fermentativa. Para la posterior identificación de las especies del género Staphylococcus se realizan otras pruebas como la coagulasa, que se exponen en el diagnóstico por especies (ver Guía para Staphylococcus). Si son cocos Grampositivos, catalasa negativa, se consideran del género Streptococcus se observarán las características morfológicas y tintoriales así como las pruebas bioquímicas, para tener un agrupamiento preliminar e identificación presuntiva, las que se describen en el diagnóstico de especies (Ver Guía para Streptococcus y Enterococcus(Ver Guía para Streptococcus) ) y se relacionan a continuación: Reacciones hemolíticas en agar sangre de carnero: alfa, beta o gamma

hemólisis. Prueba de Bacitracina. Prueba de CAMP. Reacción a la Bilis Esculina. Tolerancia de crecimiento en 6.5% de Cloruro de Sodio. Solubilidad en Bilis. Susceptibilidad a la Optoquina. Hidrólisis del Hipurato.

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Prueba PYR. 2. IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAMNEGATIVOS. Si tenemos un cultivo que corresponda con cocos Gramnegativos se realizará la prueba de la catalasa y oxidasa; ambas son positivas en el caso del género Neisseria (Ver Guía para Neisseria) y Moraxella. La identificación se completaría entonces mediante pruebas bioquímicas, principalmente de fermentación de azúcares. Prueba de la oxidasa (citocromo oxidasa). Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de electrones en la respiración aeróbica, transfiriendo electrones al oxígeno, con la formación final de agua. Material Tiras de papel de filtro, reactivo de oxidasa, aplicadores de madera y cultivo microbiano. Procedimiento Con un aplicador de madera, se toca la cúpula de una colonia, se frota sobre una tira de papel de filtro impregnada en solución acuosa al 1% de tetrametil para-fenilen-diamina (Reactivo de Kovacs). Interpretación En caso positivo el papel cambia de color, pasando de rosado a marrón y a negro finalmente, en 10-20 segundos, como consecuencia de que el reactivo se oxida en presencia de citocromo oxidasa. En caso negativo la tira de papel no cambia de color. 3.IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS. Los bacilos gramnegativos se aislan con mucha frecuencia en los laboratorios de Microbiología Clínica. Los más comunes pertenecen a Enterobacterias, Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes y Vibrios. La identificación de los bacilos Gramnegativos puede iniciarse con la prueba de la oxidasa (ya descrita). Cualquier organismo que resulte positivo en esta prueba queda excluido de la familia Enterobacteriaceae, cuyos miembros no poseen la enzima citocromo oxidasa. Estudio de la familia Enterobacteriaceae. Estos microorganismos son oxidasa negativa, y se van a identificar mediante las características de las colonias en los medios de cultivo y de una serie de pruebas bioquímicas que comienzan con la siembra en medio Kligler. Según los resultados obtenidos, se continuará con otras pruebas de identificación como: Producción de indol, movilidad, crecimiento en citrato, producción de ureasa, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer, descarboxilación de la lisina, malonato, acetato y desaminación de la fenilalanina. Prueba de fermentación de la glucosa. ( O/F de glucosa, ya

descrito).

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Prueba de fermentación de glucosa y lactosa en medio de Kligler.

Esta prueba se usa en la identificación inicial de bacilos Gramnegativos, especialmente de enterobacterias. En este estudio se observa la fermentación de glucosa y/o lactosa con producción de ácido y/o gas y la producción de SH2. Material Asa de siembra (aguja), tubos de Kligler y cultivo bacteriano. Procedimiento Los tubos de Kligler se inoculan con la aguja de siembra, con microorganismos de la colonia que se va a identificar y se hacen picadura del mismo sin llegar hasta el fondo del tubo, continuando la siembra por estría en la superficie. Incubar a 37ºC durante 24 horas. Interpretación La interpretación de los resultados se hará de la forma siguiente: Fermentación de glucosa. Se aprecia en el cambio a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol) únicamente en la parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequeña proporción de glucosa que existe en el medio (0,1%), que al ser fermentada en el fondo del tubo, donde existen condiciones de anaerobiosis, produce suficiente ácido para que cambie el indicador, pero no a medida que nos aproximemos a la superficie, donde las condiciones son más aeróbicas, allí la bacteria respira y la producción de ácido es menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo sembrado no fermenta la glucosa con producción de ácidos, todo el tubo toma una coloración roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la bacteria comienza a utilizar los aminoácidos, liberándose aminas, que elevan el pH, por lo que el color rojo puede ser más intenso. Fermentación de lactosa. Se pone de manifiesto por el cambio a amarillo del indicador, tanto en el fondo del tubo como en la superficie. La concentración de lactosa es diez veces mayor que la de glucosa, con lo que la producción de ácido formado es tan elevada que hace cambiar el indicador en todo el tubo. El hecho de que la fermentación de lactosa enmascare la de la glucosa no tiene importancia, ya que para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa. Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido degradada, como ya se ha comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminoácidos, liberándose aminas, que neutralizan la pequeña cantidad de ácidos presentes en la porción inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo aparecerá de color rojo intenso y el fondo de color amarillo debido a la fermentación previa de la glucosa. Producción de gas. La producción de gas en la fermentación se manifiesta por la aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo. Producción de SH2.

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Para detectar la producción de SH2 a partir de tiosulfato sódico debe incorporarse al medio de cultivo un indicador, dado que el SH2 es incoloro. Para tal fin se utiliza una sal de hierro que reacciona con el SH2, para producir un precipitado negro de sulfuro de hierro. La producción de SH2 tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a partir de la glucosa. Así, un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro. Reducción de nitratos. La reducción de nitratos a nitritos es una característica propia de varios microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de electrones en la respiración anaeróbica. Esta prueba es útil en la identificación de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias aunque también sirve para identificar otros microorganismos. Material Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solución de - naftilamina (A) y solución de ácido sulfanílico (B). Procedimiento Inocular el medio líquido de nitrato con un asa de cultivo puro del microorganismo, e incubar a 37ºC durante 18-24 horas. Pasado ese tiempo, añadir al cultivo 1 ml de solución de - naftilamina (reactivo A) y un ml de ácido sulfanílico (Reactivo B). Interpretación El desarrollo de una coloración roja en el medio de cultivo, tras la adición de los reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de reducción de nitratos se considera positiva. Si no se desarrolla color, la prueba puede considerarse negativa (no se han reducido los nitratos) o bien se han reducido originando otros compuestos (amoníaco, nitrógeno molecular, σxido nítrico u σxido nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso negativo. En este caso se puede añadir al medio de cultivo una pequeña cantidad de polvo de zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El desarrollo de un color rojo, indica la existencia de nitratos en el medio y confirma que la reacción es negativa. Producción de indol/movilidad. El indol es uno de los productos de degradación del metabolismo del aminoácido triptófano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrólisis del triptófano y su desaminación, produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco. Material Medio de cultivo para producción de indol/movilidad, cultivo bacteriano y reactivo de Ehrlich. Procedimiento

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Inocular el medio con el microorganismo e incubar a 37ºC durante 24-48 horas. Transcurrido ese tiempo, añadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlich (para-dimetilamino benzaldehido en etanol), por la pared del tubo sin agitar. Interpretación La aparición, transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto, la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído del reactivo originando un complejo de color rojo. Movilidad. Es otra característica útil en la identificación de los microorganismos. Se puede llevar a cabo observando el crecimiento en el medio semisólido. Material Aguja de siembra, medio semisólido (agar movilidad/indol), y cultivo bacteriano. Procedimiento Sembrar, por picadura, con la aguja de siembra en medio semisólido, incubando a 37ºC durante 48 horas. Interpretación La baja concentración de agar de este medio permite que las bacterias se desplacen, si son móviles. Por ello, observando si el crecimiento está sólo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmóvil o móvil. Citrato. Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como única fuente de carbono, esta característica es importante en la identificación de microorganismos pertenecientes a las enterobacterias. Material Un tubo con medio de Citrato de Simmons y cultivo bacteriano. Procedimiento Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37ºC durante 24-48 horas. Interpretación En caso positivo, el medio de cultivo cambia de color verde a azul. Si el microorganismo utiliza el citrato como fuente de carbono, también utiliza las sales de amonio como fuente de nitrógeno, con producción de amoníaco, lo que da lugar a una alcalinización del medio. Esto se pone de manifiesto por un viraje del indicador de pH azul de bromotimol, de verde a azul intenso, a la vez que se observa crecimiento en la superficie. Producción de Ureasa. La ureasa es una enzima presente en algunos microorganismos como Klebsiella, Enterobacter y Proteus. Esta enzima es capaz dehidrolisar la urea, con producción de dióxido de carbono y amonio, lo que causa una alcalinización del medio.

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Material Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano. Procedimiento Inocular el medio de cultivo mediante estría en superficie e incubar a 37ºC durante 24 horas. Interpretación Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome color fucsia, debido a la alcalinización del mismo por producción de amonio a partir de la urea, que se pone de manifiesto por un cambio del indicador de pH (rojo de fenol). Prueba del rojo de metilo ( Modificación de Barry). Esta prueba consiste en comprobar si el microorganismo en estudio fermenta la glucosa con producción de ácidos (succínico, láctico, acético, etc.) o vía ácido mixta. Material Un tubo de medio de caldo RM-VP, cultivo bacteriano y reactivo rojo de metilo. Procedimiento Inocular el medio líquido e incubar a 37ºC durante 18-24 horas. Transcurrido ese tiempo añadir, 1 ó 2 gotas de la solución de rojo de metilo y agitar ligeramente. Interpretación En caso positivo aparece un color rojo estable, lo que indica una producción de ácidos elevada que disminuye el pH del medio. Un color anaranjado no indica que la prueba sea positiva, ya que otros microorganismos pueden producir pequeñas cantidades de ácidos. Prueba de Voges-Proskauer. Consiste en comprobar si el microorganismo estudiado fermenta la glucosa siguiendo la vía butilénglicólica, detectando un producto intermedio en la reacción que es el acetil-metil-carbinol o acetoína. Material Un tubo de medio de caldo de RM-VP, cultivo bacteriano, solución de α-naftol e Hidróxido de Potasio (o Hidróxido de sodio al 40%) . Procedimiento Inocular el medio líquido con el cultivo puro del microorganismo e incubar a 37ºC durante 24-48 horas. Después de la incubación, transferir 1 ml del cultivo a un tubo estéril y se añade 0,6 ml de α-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Es necesario adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. Interpretación El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcurridos 10 a15 minutos desde la adición de los reactivos, indica que la prueba es positiva, es decir, que la acetoína se ha oxidado pasando a diacetilo. No debe leerse después de 1 hora,

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ya que los cultivos negativos pueden mostrar un color cobrizo y dar un falso positivo. Desaminación de la fenilalanina. Esta prueba es útil para la diferenciación inicial de las especies de Proteus y Providencia de otros bacilos Granmnegativos (Enterobacterias). Sólo los miembros de estos géneros poseen la enzima responsable de la desaminación oxidativa de la fenilalanina. La fenilalanina es un aminoácido cuya desaminación por medio de una desaminasa, da lugar a la formación de amoníaco y de ácido fenilpirúvico, el cual puede detectarse por la adición de un reactivo. Material Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacteriano y solución de cloruro férrico al 10%. Procedimiento Sembrar el microorganismo en la superficie del medio agar fenilalanina inclinado e incubar a 37ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo añadir 4 ó 5 gotas de la solución de cloruro férrico directamente sobre la superficie del agar, rotar el tubo para desprender el cultivo de la superficie. Interpretación La prueba se considera positiva cuando aparece una coloración verde intensa. Esto se debe a que las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa, transforman el aminoácido en ácido fenilpirúvico, que da reacción coloreada con el cloruro férrico. Descarboxilación de los aminoácidos (Lisina, Ornitina y Arginina). Las descarboxilasas son un grupo de enzimas, específicas para un aminoácido, que actúan sobre el grupo carboxilo de los aminoácidos con la formación de aminas de reacción alcalina, conocida como descarboxilación. Se usan para determinar la descarboxilación de los aminoácidos (lisina, ornitina y arginina) en la identificación de enterobacterias. Aminas específicas: Lisina ……Cadaverina Ornitina …Putrescina Arginina…Citrulina Material Tubo de cultivo con el medio base para aminoácidos, con el aminoácido a ensayar, un tubo de control del medio base sin aminoácido, cultivo bacteriano y aceite mineral. Procedimiento Inocular con material de una colonia dos tubos con caldo descarboxilasa de Moeller, uno con el aminoácido a ensayar y el otro sin aminoácido (control).

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Cubrir ambos tubos con aceite mineral estéril (1cm de espesor) e incubar a 35 C por 18 a 24 horas. Interpretación El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el organismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente como para activar las descarboxilasas. El retorno al color azul púrpura del tubo que contiene el aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por descarboxilación. Descarboxilación de la Lisina. (LIA) Material Un tubo con Agar Hierro Lisina (LIA), cultivo bacteriano. Interpretación Descarboxilación de la lisina: descarboxila la lisina --- fondo y tendido púrpura (K/K) no descarboxila la lisina --- fondo amarillo (A) y tendido púrpura (K/K) Desaminación de la lisina: Desamina la lisina - fondo amarillo (A) y tendido rojo (R) No desamina la lisina- fondo amarillo (A) y tendido púrpura (K) Producción de H2S Produce H2S ---- Ennegrecimiento del medio No produce H2S- sin cambios Producción de gas Produce gas - Ruptura o desplazamiento del agar No produce gas - sin cambios Los bacilos oxidasa positiva pueden clasificarse en fermentadores de glucosa y no fermentadores; por ello, estos dos grupos de microorganismos se identifican mediante la prueba de utilización de la glucosa (oxidativa o fermentativa). Utilización de la glucosa Oxidativa: (Pseudomonas utiliza la glucosa por vía oxidativa) (ver Guía para BNF). Fermentativa: ( Vibrio por vía fermentativa (ver Guía para Vibrionáceas). Incapacidad de utilizar glucosa por las dos vías: es una característica importante de Alcaligenes, alcaliniza el medio (ver Guía para BNF). Interpretación de las pruebas de identificación de bacilos Gram negativos fermentadores o no de la glucosa. Una vez realizadas todas las pruebas determinar el género con ayuda de los flujogramas: Estafilococos. Flujograma 1 Estreptococo. Flujograma 2 Enterococo. Flujograma 3 Enterobacterias. Flujograma 4

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BNF (Bacilos no fermentadores). Flujograma 5 (Anexos). Vibrionáceas. Flujograma 6 (Anexos). Haemophilus. Flujograma 7 Neisserias. Flujograma 8 Gardnerella vaginalis. A continuación describimos los aspectos más importantes de los microorganismos teniendo en cuenta: Microorganismo. Especies de mayor relevancia en el hombre (respetando la

correcta ortografía y nomenclatura actual). Características generales. Morfología, agrupación, coloración. Cultivo: Medio, temperatura, tiempo de incubación. Diagnóstico de Laboratorio: Muestras biológicas. Examen directo. Serología.

Antibiograma.

Sthaphylococcus. Los estafilococos son cocos grampositivos que se agrupan en racimos. La especie S. aureus es la de mayor patogenicidad reconocida por su capacidad de producir enzimas extracelulares y toxinas. La enzima coagulasa permite diferenciar esta especie del resto de estafilococos de interés médico, como S. epidermidis y S. saprophyticus. ( Ver flujograma1). Especies: Existen 30 especies, las tres de más importancia clínica son S.

aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus. Clasificación: Staphylococcus coagulasa positiva: Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulasa negativos (SCN): Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus schleiferi Staphylococcus intermedius Staphylococcus hycus Staphylococcus capitis Características generales. Son células esféricas (cocos) grampositivas, que se agrupan de forma irregular, formando racimos de uva. También pueden observarse aislados, en cadenas cortas y en pares. No son móviles, ni forman esporas. Son anaerobios facultativos y catalasa positiva. Cultivo: Crecen bien en los medios no selectivos como agar sangre de carnero, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 ºC, en 18 a 24 horas, formando colonias redondas, lisas, elevadas, algunas son beta hemolíticas y otras son pigmentadas, con variaciones desde color gris, blanco hasta amarillo intenso.

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Los estafilococos pueden producir enfermedades por su capacidad de multiplicarse en los tejidos o por la producción de sustancias extracelulares, como enzimas o toxinas. Entre las más significativas se encuentran las enzimas catalasa, coagulasa que provoca la formación de un coagulo visible al coagular el plasma oxalatado o citratado en presencia de un factor contenido en muchos sueros. Además produce otras enzimas como hialuronidasa, estafilocinasa, proteinasa, lipasa, ß lactamasa y otras. Entre las toxinas están las exotoxinas que producen necrosis de la piel, leucocidinas, toxina exfoliativa, toxina del shock tóxico y enterotoxinas. Entre las lesiones más frecuentes encontramos celulitis, impétigo, infección de heridas quirúrgicas, forúnculos, Muestras biológicas: Los estafilococos pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, pus de abscesos, LCR, Catéter, exudados de oído, ojos, piel, orina, forúnculos, en general aparecen en infecciones tanto adquiridas en el hospital como en la comunidad. Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 ºC. Asas bacteriológicas. Juego

de coloración de Gram. Agar sangre de carnero 5%, Agar Soya Tripticasa, H2O2, Agar Müeller-Hinton para antibiograma, plasma citratado (preferentemente de conejo), discos de Novobiocina de 5 µg, caldo BHI o Müeller-Hinton, tioglicolato. Se incuban por 18 a 24 horas entre 35 a 37 ºC. Se obtienen colonias redondas, lisas, pigmentadas o no, algunas con β hemólisis.

Examen directo: se realizan extensiones de las muestras útiles y se colorean con Gram, observándose cocos grampositivos en racimos, característicos. Identificación: Se utilizan diferentes técnicas y observación de los cultivos como: morfología de las colonias, pruebas fisiológicas o reacciones bioquímicas que incluyen la prueba de catalasa, coagulasa en tubo, prueba de novobiocina y otras. Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en discos con la técnica de Kirby y Bauer

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Streptococcus. Los estreptococos son cocos grampositivos que se disponen en cadenas o parejas. Al cultivarlos en agar sangre producen una serie de colonias con diferentes tipos de hemólisis lo que permite unido a su estructura antigénica, sus propiedades fenotípicas y nutricionales establecer una clasificación. Las especies de mayor significación en enfermedad en el hombre son: S pyogenes, relacionado con faringoamigdalitis, sinusitis, otitis media, fiebre escarlatina, impétigo, erisipela, celulitis y secuelas tardías, inmunológicas; S. agalactiae que produce infecciones neonatales y S. pneumoniae que causa neumonía y meningitis. El grupo viridans con importancia en patología bucal. Los estreptococos forman parte de la flora normal y otros se relacionan con diferentes enfermedades. La identificación precisa de estas infecciones es muy importante tanto para erradicarlas como para prevenir sus secuelas. (Ver flujograma 2). Clasificación: Streptococcus pyogenes (Estreptococo β hemolítico del grupo A). Son β

hemolíticos y susceptibles a la Bacitracina y producen hidrólisis del1Lpirrolidonil- β -naftilamida (PYR positivos).

Streptococcus agalactiae (Estreptococo β hemolítico del grupo B). Son β hemolíticos y susceptibles a la optoquina, hidrolizan el hipurato de sodio, factor CAMP positivos y la mayoría Bacitracina negativos.

Streptococcus equisimilis (Estreptococo β hemolítico del grupo C). Estreptococo β hemolítico del grupo C y G. Son β hemolíticos, sensibles al

disco de trimethoprim-sulfametoxazol (SXT), resistentes a Bacitracina, CAMP negativos.

Streptococcus pneumoniae (Neumococo). Son α hemolíticos, sensibles a la optoquina, solubles en bilis y en sales biliares.

Streptococcus viridans.son α hemolíticos. Características generales. (Ver flujograma 2)

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Son células esféricas (cocos) grampositivas, que se agrupan en pares o en cadenas. También pueden observarse aislados, en cadenas cortas y en pares. Son inmóviles, no forman esporas. Algunas especies elaboran cápsulas, de polisacárido en neumococos y de ácido hialurónico en los grupos A, B y C. Son anaerobios facultativos, catalasa negativa y oxidasa negativa. Cultivo: Crecen bien en los medios no selectivos como agar sangre de carnero, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 ºC, en 18 a 24 horas, formando colonias discoidales, grises, opalescentes, de bordes lisos o arrugados, pueden ser, α, β o γ hemolíticas lo que permite su identificación. En los estreptococos del grupo A las colonias suelen ser mucoides, mates o brillantes. Algunas especies requieren de un 5 a un 10% de CO2. Los estreptococos pueden producir enfermedades por su capacidad de multiplicarse en los tejidos e invadirlos o por la producción de sustancias extracelulares, como enzimas o toxinas. En los del grupo A se encuentran las enzimas como hialuronidasa, estreptocinasa, estreptodornasa y otras. Entre las toxinas está la toxina eritrogénica, estreptolisina O y S. Muestras biológicas: Los estreptococos pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, LCR, exudado faríngeo, esputos, exudados de oído, lesiones de piel y tejidos blandos, orina, heridas quirúrgicas y otras heridas. Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 ºC. Asas bacteriológicas. Juego

de coloración de Gram. Agar sangre de carnero 5%, Agar Soya Tripticasa, Agar Müeller-Hinton para antibiograma, discos de Bacitracina diferencial de 0,04 Ud, discos de optoquina de 5 µg, discos de SXT, caldo BHI o Müeller-Hinton, útil para ver la formación de cadenas en la coloración de Gram, tioglicolato. Se incuban por 18 a 24 horas entre 35 a 37 ºC. Se obtienen colonias algunas con β hemólisis o no.

Examen directo: se realizan extensiones de las muestras útiles y se colorean con Gram, observándose cocos grampositivos en cadenas cortas, sueltos o en pares, característicos. En la especie Neumococo se ven diplococos lanceolados, encapsulados y grampositivos. Identificación: se realiza por pruebas presuntivas o fisiológicas y por pruebas serológicas. Para ello se utilizan diferentes técnicas y observación de los cultivos como: morfología de las colonias, las pruebas fisiológicas o reacciones bioquímicas incluyen la prueba de catalasa, Bacitracina, Optoquina, SXT, solubilidad en Bilis, test de CAMP, Hidrólisis del Hipurato de Sodio, prueba de PYR y otras. La identificación definitiva se realiza mediante la serología (para determinar grupos de Lancefield A, B, C, F, G ). Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en discos con la técnica de Kirby y Bauer.

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Enterococcus. Los enterococos anteriormente pertenecían a los estreptococos, desde el año 1984 han sido clasificados dentro del género Enterococcus. Constituyen un numeroso grupo bacteriano que forma parte de la flora normal del intestino del hombre y de animales, de las vías respiratorias superiores, cavidad oral, tracto genitourinario. Hoy en día es considerado como un patógeno emergente y se ha relacionado con infecciones nosocomiales, bacteriemias, infecciones de heridas quirúrgicas y del tracto urinario. (Ver flujograma 3). Clasificación: Enterococcus faecalis. Es la especie tipo. Enterococcus faecium. E. avium E. gallinarum y otros. Características generales. (Ver flujograma 3) Son cocos grampositivos que se disponen de forma irregular, sueltos, en cadenas o parejas, en medios líquidos. No poseen cápsulas ni forman esporas. Son inmóviles, anaerobios facultativos y catalasa negativa. Cultivo: Crecen bien en medios como agar sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 ºC en 18 a 24 horas, forman colonias más grandes que las de estreptococos del grupo A, menos opacas y a veces blanca brillantes como las de estafilococos, pueden ser, α o γ hemolíticos con excepción de algunas especies que pueden ser β hemolíticos. Pueden crecer a temperaturas entre 10 y 45 ºC y tolerar hasta 60 ºC, y a un pH 9,6. Además crecen en presencia de 6,5% de cloruro de sodio e hidrolizan la Bilis-Esculina y producen hidrólisis del L-pirrolidonil- β -naftilamida (PYR positivos). (ver flujograma para clasificar en género y especie). Muestras biológicas: Pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, LCR, punta de catéter, lesiones de piel y tejidos blandos, orina, exudado vaginal y vulvar en niñas, exudado ótico, heridas quirúrgicas y otras heridas, úlceras.

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Materiales y medios de cultivo: Agar sangre de carnero 5%, Agar Soya Tripticasa, Agar Müeller-Hinton para antibiograma, caldo BHI o Müeller-Hinton, útil para ver la formación de cadenas en la coloración de Gram, tioglicolato. Se incuban por 18 a 24 horas entre 35 a 37 ºC. Examen directo: Se realizan extensiones de las muestras y se colorean con Gram, observándose cocos grampositivos en cadenas cortas, sueltos o en pares. Identificación: se utilizan pruebas para identificación de género y de especies. Pruebas de género: Hidrólisis de la Bilis-Esculina, tolerancia a 6,5% de ClNa, catalasa negativa, crecimiento a 42 ºC y a pH 9,6, prueba de PYR y otras. Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en discos con la técnica de Kirby y Bauer, según las normas NCCLS (actualmente CLSI).

Enterobacterias. Las enterobacterias son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, oxidasa negativos, no esporulados, que fermentan y oxidan la glucosa y reducen los nitratos a nitritos. Forman parte de la flora normal del intestino del hombre y de animales y se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Pueden ser móviles, aunque hay especies inmóviles como Klebsiella y Shigella. Estas bacterias se relacionan con infecciones nosocomiales y de la comunidad, son causa de infecciones intestinales y extraintestinales como bacteriemias, infecciones de heridas quirúrgicas y del tracto urinario, neumonía. (Ver flujograma 4). Clasificación: comprende más de 25 géneros y cada uno está conformado por una o más especies bacterianas, de ellas sólo unas 25 especies han sido relacionadas con enfermedad infecciosa en el hombre. Las más frecuentes en nuestro medio son: Salmonella entérica (aqui se encuentran todos los serotipos, más de 2300). Shigella (S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii y S. flexneri) Escherichia coli Yersinia enteroclítica Hafnia alvei Citrobacter (C. diversus, C. amalonaticus, C. freundii) Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans, E. cloacae) Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris) Edwarsiella tarda Klebsiella (K. pneumoniae, K. oxytoca) Morganella (M. morganii) Providencia (P. rettgeri, P. stuartii) Serratia (S. marcescens)

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El resto de las enterobacterias son de poca importancia en enfermedad extraintestinal en el hombre.

Características generales. Son bacilos gramnegativos. Oxidasa negativos. Fermentadores de la glucosa. Klebsiella posee cápsula. No forman esporas. Son aerobios o anaerobios facultativos. Cultivo: Crecen bien en la mayoría de los medios que se utilizan como agar sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 ºC en 18 a 24 horas, forman colonias más grandes, de color grisáceo, y de bordes definidos. Otros medios de cultivos utilizados son agar Mac Conkey, Agar SS, agar XLD y para la diferenciación bioquímica se emplean: LIA, MIO (motilidad, indol, ornitina), Citrato de Simmons, Urea de Christensen. Fenilalanina, malonato de sodio, Voges Proskauer. De acuerdo a las reacciones bioquímicas y siguiendo el flujograma de trabajo se puede llegar al diagnóstico de la mayoría de las especies. Muestras biológicas: Heces fecales, sangre para hemocultivos, LCR, pus de heridas quirúrgicas, esputo, medulocultivo, orina, exudados de oido. Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 ºC. Asas bacteriológicas y agujas.

Juego de coloración de Gram. Placas para serología. Láminas portaobjetos. Placas de agar sangre de carnero 5%, agar Mac Conkey, agar SS, agar XLD, agar nutritivo, agar Müeller-Hinton para antibiograma, los que se usaran dependiendo del tipo de muestra, si se trata de infecciones intestinales o extraintestinales. Reactivo de oxidasa. Pruebas para la identificación bioquimica: Kligler, LIA, MIO, Citrato de Simmons, Urea de Christensen. Fenilalanina, malonato de sodio, Voges Proskauer, Sorbitol. Antisueros polivalentes de Salmonella, Citrobacter. Antisueros de Salmonella de grupos A, B, C1, C2, D, E, F y flagelar y vi de Salmonella. Antisueros somáticos de grupo de Shigella A, B, C y D. Recipiente con tapa con solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5%, para el depósito del material de descarte de la pruebas serológicas.

Examen directo: Se realizan extensiones de las muestras útiles, a investigar y se colorean con Gram, observándose los bacilos gramnegativos, característicos.

Identificación: se utilizan pruebas bioquímicas para identificación de género y de especies, según las tablas adjuntas y flujogramas. Pruebas serológicas: las cepas aisladas de Salmonella y Shigella se confrman por serología a partir del cultivo. Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en discos con la técnica de Kirby y Bauer, según las normas NCCLS (actualmente CLSI).

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Haemophilus Este género esta conformado por varias especies, algunas forman parte de la flora normal de la nasofaringe y otras son patógenas para el hombre y se caracteriza por su morfología, es un cocobacilo gramnegativo, pleomórfico, anaerobio facultativo que requiere para su crecimiento de los factores V (NAD) y X (hemina) de la sangre. La especie tipo es Haemophilus influenzae que puede estar en la flora normal del tracto respiratorio superior, pero es patógeno y responsable de infecciones como otitis media aguda supurada (OMA), sinusitis, conjuntivitis, meningitis purulenta, celulitis, artritis. Presenta una cápsula de polisacárido que permite la clasificación en 6 serotipos: a, b, c, d, e y f. Es más frecuente en niños pequeños. Características generales. Su identificación depende de la necesidad de los factores de crecimiento X y V, Los que requieren solo de factor V no crecen en agar sangre, por lo que si se utiliza este medio hay que inocular un microorganismo como el estafilococo y segrega gran cantidad del factor V, entonces las colonias crecerán alrededor de la estría de éste (fenómeno de satelitismo). Cultivo: Crecen en los medios agar sangre de carnero 5% (alrededor de la estría de estafilococo), agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate, Crecen en atmósfera de un 5 a 10% de CO2 y temperatura de 35 a 37 ºC en 18 a 24 horas. Forman colonias redondas, convexas, pequeñas, iridiscentes y con aspecto de rocío sin pigmento y sin hemolisis, con olor característico. De acuerdo a las reacciones encontradas y siguiendo el flujograma de trabajo se puede llegar al diagnóstico de las especies. Muestras biológicas: Exudados nasofaríngeos, sangre, LCR, líquido articular, ótico, exudado conjuntival, La recolección de las muestras debe realizarse con cuidado y enviarse de inmediato al laboratorio.

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Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 ºC. Asas bacteriológicas. Juego

de coloración de Gram. Placas para serología. Láminas portaobjetos. Aplicadores de madera. Placas de agar sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate, agar y caldo Mueller-Hinton, medio de transporte de Stuart. Discos de papel con factores de crecimiento X, V, y X+V. Antisueros específicos y Látex para detección de antígeno. Recipiente con tapa con solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5%, para el depósito del material de descarte de las pruebas serológicas.

Examen directo: la coloración de Gram en muestras de LCR es muy útil para observar los cocobacilos gramnegativos, característicos.

También se puede hacer detección de antígenos capsulares en el LCR, mediante aglutinación con partículas de Látex. Identificación: Las muestras que se cultivan en agar sangre de carnero 5%, con estría de estafilococo deben observarse en el microscopio estereoscópico para buscar las colonias típicas, con olor característico, así como en agar chocolate. Se identifican por la coloración de Gram. Finalmente se realiza la prueba de estudio de los factores de crecimiento, impregnados en discos de papel. Serotipificación con antisueros específicos de grupo. (Ver flujograma 5 y tablas) Antibiograma. Se realiza la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en discos con la técnica de Kirby y Bauer, en medio Haemophilus test medium (HTM), según las normas NCCLS (actualmente CLSI). Conservar las cepas aisladas para enviar al centro de referencia (CPHE).

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Neisserias. Las Neisserias son cocos gramnegativos que se agrupan en pares (diplococos), arriñonados, aerobios, oxidasa y catalasa positiva, no esporulados. Forman parte de la flora normal de as vías respiratorias del hombre. Dentro del género Neisseria se encuentran dos especies patógenas: Clasificación: Neisseria meningitidis (Meningococo). Agente causal de meningitis y

septicemia. Neisseria gonorrhoeae (Gonococo). Agente causal de Blenorragia o

gonorrea, enfermedad de transmisión sexual (ITS). Características generales. Son bacterias muy exigentes, sólo se cultivan en medios enriquecidos, en humedad elevada, atmósfera de un 5 a 10% de CO2 y temperatura de 35 a 37 ºC en 24 a 72 horas. Cultivo: Crecen en los medios agar Mueller-Hinton, agar Thayer-Martin, agar sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate. Forman colonias mucoides, convexas, elevadas, de aspecto transparente u opaco, sin pigmento y no son hemolíticas. Algunas especies producen pigmento amarillo verdoso. Los patrones para la diferenciación en especies se realiza mediante la fermentación de carbohidratos. De acuerdo a las reacciones encontradas y siguiendo el flujograma de trabajo (6) se puede llegar al diagnóstico de las especies. Muestras biológicas: La recolección de las muestras debe realizarse con cuidado y enviarse de inmediato al laboratorio. Para gonococo: exudados de uretra, endocérvix, faringe, conjuntiva, recto, líquido sinovial y sangre. Para meningococo: sangre, LCR, aspirado de petequias, nasofaríngeo (en portadores) y esputo.

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Materiales y medios de cultivo: Incubadora de cultivo graduada de 35 a 37 ºC. Asas bacteriológicas. Juego

de coloración de Gram. Placas para serología. Láminas portaobjetos. Aplicadores de madera. Placas de agar sangre de carnero 5%, agar Thayer-Martin, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar chocolate, agar y caldo Mueller-Hinton, medio de transporte de Stuart. Reactivo de oxidasa. Medio CTA (agar cistina-tripticasa). Carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa. Antisueros específicos de grupo de Neisseria meningitidis y Látex para detección de antígeno. Recipiente con tapa con solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5%, para el depósito del material de descarte de las pruebas serológicas.

Examen directo: Se realizan extensiones de las muestras útiles, a investigar y se colorean con Gram, observándose los diplococos gramnegativos, arriñonados, dentro de los leucocitos polimorfonucleares (LPMNs), característicos. En caso de sospecha de gonorrea, el examen directo de las secreciones genitales es útil para el diagnóstico presuntivo, de mayor especificidad en el hombre, por lo que para obtener buenos resultados debe realizarse de inmediato y el apicador se recomienda que se frote suavemente sobre la superficie de la lámina, en una sola dirección para preservar los LPMNs.

Identificación: Neisseria gonorrhoeae: Los gonococos se identifican por su aspecto en la coloración de Gram, colonias de aspecto mucoide, convexas, brillantes, cremosas de bordes enteros y color blanco grisáceo, la reacción positiva a la oxidasa y a la catalasa y los resultados de la producción de ácido de los carbohidratos en CTA (Produce ácido de la glucosa). Neisseria meningitidis: Identificación presuntiva: prueba de látex positiva y observación de diplococos arriñonados gramnegativos dentro de los LPMNs. Si en el cultivo crecen colonias de aspecto transparente, mucoides, convexas, oxidasa y catalasa positivas, que a la coloración de gram correspondan con diplococos gramnegativos, arriñonados, pertenecen al género Neisseria. Posteriormente se realizan las pruebas de identificación con la producción de ácido de los carbohidratos (glucosa y maltosa positivas). Finalmente se realiza la serotipificación con antisueros específicos de grupo. Conservar las cepas aisladas para enviar al centro de referencia (CPHE).

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