20150522200524 (1)

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

1 Actividades de Prctica P.Ch.M.

AC

TIV

ID

AD

ES D

E

PR

C

TIC

A

Biologa

2015-10

Ms. Pablo Chuna Mogolln



UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GUA DE PRCTICA DE

BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

CICLO ACADMICO 2015-10

Trujillo Per

2015

Pablo Chuna Mogolln. Gua de Prcticas de Biologa Celular y Molecular 2015-10 1 ed. Trujillo. 50p. Ninguna parte o la totalidad de esta publicacin, puede ser reproducida, almacenada transmitida por ningn medio, ya sea electrnico, mecnico, ptico, de grabacin o por fotocopia, sin autorizacin escrita del autor. Derechos reservados 2015 Primera edicin: Enero 2015 Impresa en Trujillo



1. OBJETIVOS

1. Identificar mutaciones como polimorfismos de un solo nucletido (SNPs)

2. Navegar en herramientas bioinformticas online para traducir el ADN en una secuencia

polipeptdica y, comparar y contrastar secuencias polipeptdicas silvestre y variantes.

3. Determinar si las secuencias aminoacdicas obtenidas presentan mutacin silenciosa,

mutacin de cambio de sentido o sin sentido.

4. Hipotetizar si los SNP obtenidos podran causar resistencia a rimfapicina.

2. INTRODUCCIN

Tuberculosis (Tb) es una infeccin bacteriana mortal, que afecta principalmente los

pulmones, y es causada por Mycobacterium tuberculosis (MTb). La transmisin de Tb ocurre

cuando una persona afectada con tuberculosis tose, estornuda o aerosoliza la bacteria y luego

sta es inhalada por otra persona.

En todo el mundo, 8.8 millones de nuevos casos de Tb fueron diagnosticados y 1.5 millones

de personas murieron de Tb en el ao 2010, la mayora de nuevos casos y muertes ocurren en

pases en desarrollo. Se estima que para el ao 2020 cerca de 100 millones de personas

puedan contraer la infeccin, 200 millones desarrollar la enfermedad y 50 millones podran morir

a causa de sta. Se cree que un tercio de la poblacin mundial est infectada con M.

tuberculosis. Sin embargo, 90% de estos infectados no desarrollaran un caso activo de Tb. Para

aquellos que desarrollan Tb activa, los sntomas incluyen dolor en el pecho, tos prolongada,

sangre en el esputo, fiebre, sudor nocturno y, prdida de peso. Sin un tratamiento efectivo, 66%

de personas con Tb activa morirn.

Debido a que es causada por una bacteria, la Tb puede ser tratada usando antibiticos, y en

la actualidad existen 8 clases de drogas disponibles para tratar Tb. Dos antibiticos que son

comnmente usados para tratar la Tb son isoniazida y rifampicina. Sin embargo, hay una

creciente prevalencia de cepas multidrogorresistente (MDR) con ~650,000 casos en el 2010.

Infecciones MDR-Tb son resistentes tanto a isoniazida como rifampicina. Las cepas

extradrogorresistentes y totalmente drogorresistentes (XDR, TDR) muestran resistencia a

isoniacida, rifampicina, a una fluoroquinolona y a una o ms de las 3 siguientes drogas anti-

tuberculosas inyectables: capreomicina, kanamicina y amikicina.

Las colonias de M. tuberculosis son de muy lento crecimiento, por lo que el tratamiento

recomendado para un nuevo caso de Tb es 6 meses de una combinacin de 2-4 diferentes tipos

de antibiticos. Para MDR-Tb, el tratamiento con al menos 4 efectivos antibiticos tomara de 18

a 24 meses. Es importante cumplir el tratamiento mdico, una interrupcin del tratamiento por

parte de las personas afectadas, puede conducir a la aparicin de cepas resistentes. Algunas

mutaciones aleatorias podran permitir a estas cepas de MTb sobrevivir, reproducirse y generar

una segunda infeccin que es resistente a los antibiticos usados para tratar la primera

infeccin.

El genoma de M. tuberculosis es aproximadamente de 4 millones de pares de bases con

4,000 genes. Una cepa tipo silvestre de M. tuberculosis no tiene algn gen que confiera

resistencia a antibiticos, hacindola susceptible a todas las 8 clases de antibiticos para

tuberculosis. Otras cepas de M. tuberculosis, sin embargo, podran tener mutaciones tales como

ANLISIS GENTICO USANDO HERRAMIENTAS

BIOINFORMTICAS

TUBERCULOSIS DROGORRESISTENTE

12



polimorfismos de un solo nucletidos (SNPs) lo cual podra generar resistencia a ciertos

antibiticos. Una vez, que una bacteria es resistente a un antibitico particular, aquel antibitico

no es ms efectivo en matar la bacteria o curar la infeccin.

Un SNP es una sustitucin de un nico par de bases que puede observarse cuando se

comparan secuencias de ADN similares del mismo gen bien entre organismos, cepas o

cromosomas homlogos (Fig. 1.) Un SNP que puede codificar para la misma secuencia

aminoacdica como su homlogo es llamado un polimorfismo sinnimo, o una mutacin

silenciosa. Un SNP que codifica para una diferente secuencia de aminocidos es llamado

polimorfismo no sinnimo. Un polimorfismo no sinnimo puede o bien causar cambio de sentido,

el cual resulta en un cambio de aminocido, o sin sentido, que resulta en un codn stop. (Fig. 2.)

Alelo 1 A G G T C T A T T

Alelo 2 A G G T G T A T T

Fig. 1. Ejemplo de un polimorfismo de simple nucletido (SNP)

Alelo tipo silvestre A G G T C T A T T

ARNm transcrito U C C A G A U A A

Secuencia de aminocidos (original) Serina Arginina Stop Original

Polimorfismo sinnimo A G G T C C A T T

ARNm transcrito U C C A G G U A A

Secuencia de aminocidos (original) Serina Arginina Stop Mutacin silenciosa

Polimorfismo no sinnimo A G G T G T A T T

ARNm transcrito U C C A C A U A A

Secuencia de aminocidos (original) Serina Treonina Stop M. cambio de sentido

Polimorfismo no sinnimo A G G A C T A T T

ARNm transcrito U C C U G A U A A

Secuencia de aminocidos (original) Serina Stop M. sin sentido

Fig. 2 Posibles consecuencias de SNPs

Recuerde que el orden de aminocidos en un polipptido determina la forma tridimensional

del polipptido y, consecuentemente la estructura y funcin de la protena.

Los antibiticos actan sobre sitios de unin particulares en una protena diana que afectan la

funcin de la protena. Debido a que la protena deja de trabajar, la bacteria no podra llevar a

cabo sus funciones normales y morir. Por ejemplo, rifampicina un antibitico contra Tb- se

une e inhibe a la subunidad beta (rpoB) de la enzima RNA polimerasa.

Las bacterias que son resistentes a rifampicina pueden tener una mutacin en el gen que

codifica rpoB lo que altera el sitio donde se une la rifampicina a la RNA polimerasa. Por lo tanto,

la rifampicina no es capaz de unirse a la polimerasa, por lo que puede continuar trabajando, y la

bacteria vive!

En esta prctica, a usted se le asignarn la secuencias de ADN del gen de rpoB de una cepa

silvestre de Mycobacterium tuberculosis (wild-type MTb) y la secuencias del rpoB de cepas

variantees de MTb (VariantX MTb). Su trabajo es identificar algn SNPs en la secuencia gnica

variante, determinar la secuencia de aminocidos tanto de los alelos wild-type MTb y variantX

Mtb y si el polimorfismo es sinnimo o no sinnimo. Usted luego debe evaluar crticamente que

efecto podra tener el SNP sobre el hecho de conferir resistencia a antibiticos a las cepas

variantes de M. tuberculosis.



3. MATERIALES Y EQUIPOS

Laptop con acceso a internet

Secuencia gnica de rpoB de Wild-type MTb (alelo tipo silvestre)

Secuencia gnica de rpoB de variant MTb (alelo variante)

Cdigo gentico y propiedades de aminocidos

4. PROCEDIMIENTO

A cada pareja de estudiantes se le asignar un documento digital conteniendo un segmento

(nucletidos 1168-1429) de los 3519 nucletidos de la secuencia de ADN del gen rpoB

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000962.3) de una cepa de Mycobacterium tuberculosis

silvestre (wild-type MTb strain), con 3 de las 8 posibles variantes de M. tuberculosis (variant Mtb

strains). La secuencia de ADN del gen rpoB de MT silvestre (MTb H37Rv) fue obtenida de

tubercuList (http://tuberculist.epfl.ch) y las secuencias variantes fueron creadas usando

polimorfismos reportados en TB Drug Resistance Mutation Database (Sandgren et al., 2009)

http://www.plosmedicine.org/article/fetchObject.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.p

med.1000002&representation=PDF

Parte A: Identificando SNPs

1) Abra el documento digital que ha sido asignado a su grupo.

2) Utilizaremos los programas bioinformticos, para hacer la tarea ms fcil y rpida.

3) El ClustalW se puede correr on-line en muchos sitios y tambin se puede descargar uno,

cualquiera de ellos:

http://www.genome.jp/tools/clustalw/ http://www.pedb.org/scripts/clustalw.php

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ http://www.es.embnet.org/cgi-bin/clustalw.cgi

a. Ingrese a Internet y, vaya al ClustalW en http://www.genome.jp/tools/clustalw/

b. En el ClustalW, ubquese en Enter your sequences haga click en DNA.

c. Copia y pega las secuencias de ADN asignadas en el gran recuadro vaco. Asegrese

que incluya las etiquetas de las secuencias (sequence labels). Ej. >wild-type_Tb para la

secuencia del Mtb silvestre; >VariantA_Tb para la secuencia variante A de MTb.

d. Haga click en Execute Multiple Alignment.

e. En la pgina que aparece, seleccione en el encabezado superior clustalw.aln

f. Observe el alineamiento de las cuatro secuencias. Estrellas (***) indican bases que son

idnticas. Un espacio vaco indica un SNP.

4) Imprima la hoja de los SNPs y coloque sus resultados en el Cuadro de la parte E.

Parte B: Traduciendo DNA en aminocidos

Existen websites que los cientficos usan para traducir una secuencia de DNA en una secuencia

de aminocidos, entre ellos:

http://exon.gatech.edu/genemark/genemarks.cgi http://linux1.softberry.com/berry.phtml

Gene MarkS

1) Ingrese a GeneMarkS en http://exon.gatech.edu/genemark/genemarks.cgi

a. Ubique los datos originales de tus secuencias de ADN: wild-type Tb y variantes.

b. Copia y pega las secuencia wild-type Tb y variantes en el recuadro grande. Asegrese

de incluir la etiqueta de la secuencia (sequence label). Ej. >wild-type_Tb para la

secuencia del Mtb silvestre; >VariantA_Tb para la secuencia variante A de MTb.

c. Debajo de Output options marque los recuadros Protein sequence and Gene

nucleotide sequence

d. Haga click en Start GeneMarkS.



e. En la pgina que aparece, haga click en gms.out.faa para obtener la secuencia del

polipptido.

f. Usted obtendr un resultado similar al recuadro de abajo.

La secuencia de aminocidos es dada con el cdigo de una sola letra para los 20

aminocidos. Ej. H = His = Histidina; K = Lis = Lisina; M = Met = Metionina.

2) Luego, usted debe copiar y pegar las secuencias de aminocidos en un documento Word.

a. Abra un documento en Word.

b. En GeneMarkS, copie las secuencias de aminocidos wild-type y variantes (Ctrl-C)

c. Pegue las secuencias en el documento Word (Ctrl-V)

d. Dele una etiqueta como: >WT_rpoB_polypeptide para la secuencia polipeptdica wild-

type, >X_rpoB_polypeptide. (Sustituye X con la letras variantes asignadas) para las

secuencias polipeptdicas de las cepas variantes

3) Imprima la hoja de las secuencias de aminocidos.

Softberry

a. Vaya a Softberry en http://linux1.softberry.com/berry.phtml

b. En la columna de la izquierda, ubique Operon and Gene Finding in Bacteria.

c. Haga click en FGENESB Gene Finding in Bacteria.

d. Retorne a los datos originales asignados por su profesor.

e. Copia y pega la secuencia gnica wild-type TB en el recuadro vaco. Asegrese de

incluir la etiqueta de la secuencia (sequence label). Ej. >wild-type_TB.

f. En el campo Choose closest organism, seleccione con el mouse BACTERIAL generic.

g. Haga click en Process.

h. Usted conseguir un resultado similar al recuadro de abajo.

i. Abra un documento en Word. Copia y pega la secuencia de aminocidos en este

documento. Dale una etiqueta como:: >WT_rpoB_protein.

j. Repita los mismos pasos para las protenas variantes.

k. Retorne a Softberry, click en back arrow, y borre la secuencia WT (Ctrl-A seleccione all,

luego presione delete).

l. Pega la secuencia variante. Dale una etiqueta como: >X_rpoB_protein. (Sustituya X

con las letras variantes asignadas)



Parte C: Identificando Polimorfismos Sinnimos y No Sinnimos

1) A fin de determinar si el SNP de las secuencias variantes podran afectar la estructura y la

funcin de la protena. Usted necesitar alinear las secuencias de aminocidos, y

determinar si el SNP causa un polimorfismo sinnimo o no sinnimo en la protena variante.

a. Ingrese a ClustalW at http://www.genome.jp/tools/clustalw/

b. En Enter your sequences haga click en Protein.

c. Copia y pega la secuencia aminoacdica de wild-type TB y variantes del documento

Word obtenidos en la parte B. Asegrese que cada secuencia tenga una etiqueta como:

> y un nombre.

d. Haga click en Execute Multiple Alignment

e. En la pgina que aparece, seleccione en el encabezado superior clustalw.aln

f. Observe el alineamiento de las cuatro secuencias. Estrellas (***) indican aminocidos

que son idnticos. Dos puntos(:), un punto (.) y un espacio vaco indican un cambio de

aminocido. Una serie de guiones (----) indican prdida de aminocido.

2) Imprima la hoja de los SNPs y coloque sus resultados en cuadro de la parte E.

Parte D: Hipotetizando Resistencia a Antibiticos

Un SNP en la regin del gen que codifica el sitio de unin de la rifampicina en la protena

target (rpoB) podra cambiar la estructura de la protena (enzima RNA polimerasa) de tal manera

que la rimfapicina no puede unirse a la subunidad beta de la enzima. Si esto sucede, la bacteria

con la mutacin podra considerarse ser resistente a rifampicina.

Su tarea ahora es hipotetizar si los alelos de las bacterias variantes de Tb que trabaj son o

no resistentes a rifampicina.

Pero, primero usted necesita informacin adicional para realizar su tarea

El sitio de unin para rifampicina est localizado entre los aminocidos 36 y 67.

Aminocidos con las mismas propiedades podran causar que la protena se pliegue en su

forma original.

Aminocidos con propiedades diferentes u opuestas podran causar cambio de forma de la

protena.

Fig 1. Rifampicina. a. Presentacin del frmaco rifampicina 300mg. b. Unin de rifampicina

(rojo y amarillo) por unin cercana al centro activo (rosado) de la RNA polimerasa. c. Frmula

estructural de rifampicina,

Parte E: Comparando todas las variantes de los genes rpoB MTb de los grupos de Clase

Llene la tabla 1 con los resultados obtenidos de los dos grupos de clase.

c b a



5. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

1. Ingrese al NCBI books (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books), coloque en el recuadro Genes

and Disease haga click en Search, en la parte inferior presione next, en esa segunda

pgina, ubique el libro N26: Genes and Disease.

2. Haga click sobre el libro y busque en la parte inferior el captulo 19, haga click all.

3. En la nueva ventana ubique Blood and Lymph Diseases, y se abre una nueva pgina, deber

ubicar debajo del texto Anemia, sickle cell, haga click all.

4. En la parte derecha de la pgina abierta, haga click en Genome view para visualizar donde

est localizado el gen en el cromosoma. Ir a Homo sapiens Annotation release 106 y haga

click en . En la ventana que se abre, ubique en el lado izquierdo, el cromosoma 11, haga

click all, busque en que sitio se ubica el gen de globina beta (HBB gene).

5. A los estudiantes se le asignar un documento digital conteniendo la secuencia de ADN del

gen de globina humana (hemoglobin subunit beta - Homo sapiens), adems 10 de las 662

variantes mapeadas de protena NP_000509 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4504349).

La secuencia completa de ADN de la globina (HBB) se obtuvo de:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000011.8 y las secuencias variantes se obtuvieron

de dbSNP Short Variations: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp3D.cgi?rsnum=11549405

6. La secuencia del ARNm se obtuvo de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000518 . A

mitad de la pgina abierta busque CD y haga click en NP_000509.1 para obtener la protena

codificada. Arriba de esa secuenciase encuentra CDS, ubique CCDS7753.1 para conocer la

localizacin en el cromosoma del CCDS sequence data, adems puede ver la localizacin

exacta de los 3 exones y la secuencia traducida. Muevan el mouse sobre la secuencia de

aminocidos y observe que sucede en la secuencia de nucletidos.

7. La actividad consiste en realizar las 5 partes (A-E) que se desarrollaron para el caso de

resistencia de M. tuberculosis. Llene la tabla 2 con los resultados obtenidos .

6. BIBLIOGRAFA

Castillejos M. de J. et al. Implicaciones de los polimorfismos de un solo nucletido en

Mycobacterium tuberculosis y humanos en el manejo clnico de la tuberculosis. Rev. Inst.

Nal. Enf. Resp. Mex. 2006: 19 (1): 38-46.

http://www.medigraphic.com/pdfs/iner/in-2006/in061e.pdf

Koch A., et al. The impact of drug resistance on Mycobacterium tuberculosis physiology:

what can we learn from rifampicin ?. Emerging Microbes and Infections (2014) 3:1-11.

http://www.nature.com/emi/journal/v3/n3/pdf/emi201417a.pdf

Machado P. et al. La contribucin de los polimorfismos humanos del eritrocito en la

proteccin contra la malaria. Rev Pan-Amaz Saude 2010; 1(4):85-96.

http://scielo.iec.pa.gov.br/pdf/rpas/v1n4/es_v1n4a13.pdf

Peuea O.A. Hemoglobina: una molcula modelo para el investigador. Vol. 36 N 3, 2005

(Julio-Septiembre). http://www.scielo.org.co/pdf/cm/v36n3/v36n3a12

Cuevas V., Zenteno R. Tuberculosis drogorresistente: mecanismos moleculares y mtodos

diagnsticos. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2010;28(9):621628.

http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=13184027&pident_usua

rio=0&pcontactid=&pident_revista=28&ty=98&accion=L&origen=elsevier&web=www.elsevie

r.es&lan=es&fichero=28v28n09a13184027pdf001.pdf

From sequence to protein:

http://www.tok.ro/toksite/downloads/Bioinformatika/Konyvek/feherje%20konyvek/Protein%20

Structure%20and%20Function.pdf



ANEXOS

SECUENCIAS DE ADN DEL GRUPO 1: Secuencias del gen de la subunidad (rpoB)

de la RNA Polymerasa de Mycobacterium tuberculosis

>wild type rpob gene sequence of Mtb H37Rv

ATGGAGCGGGTGGTCCGGGAGCGGATGACCACCCAGGACGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT

GATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTC

ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGC

GGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGAT

GTGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTGTCGGT

>VariantA rpoB gene sequence


GATCAACATCCGGCCGGTGGTCACCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTC




>VariantB rpoB gene sequence



ATGTACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGC



>VariantC rpoB gene sequence



ATGGACCAGAACAACCCGGTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGG

CGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGAT


SECUENCIAS DE ADN DEL GRUPO 2: Secuencias del gen de la subunidad (rpoB)

de la RNA Polymerasa de Mycobacterium tuberculosis

>wild type rpob gene sequence of Mtb H37Rv






>VariantD rpoB gene sequence



ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCGACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGG

CGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGGGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGAT




>VariantE rpoB gene sequence




GGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGTGCTGGAGGTCCGCGACGTGCACCCGTCGCACTACGGCCGGATG

TGCCCGATCGAAACCCCTGAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTGTCGGT

>VariantF rpoB gene sequence


GATCAACATCCGGCCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCTAATTC




SECUENCIAS DE ADN, ARN Y PROTENA DE LA GLOBINA HUMANA (HBB)

ADN: Secuencia completa del gen de HBB en formato FASTA

La secuencia completa de nucletidos del gen de globina humana (5 3). Las letras maysculas

en negro corresponden a la secuencia que va a codificar una ARNm maduro (exones). Las letras

minsculas de color celeste indican los intrones. Las letras de color rojo corresponden a ATG el

codn de inicio (AUG en el ARNm) y TAA el codn stop (UAA en el ARNm). Las secuencias de color

morado: ATAAAA y AATAAA corresponden a la caja tata y seal de poliadenilacin. Las letras de

color marrn son secuencias no codificantes (De: Lawn RM . Efstratiadis A., OConell C., et al.

[1980]. The nucleotide sequence of the human -globin gene. Cell 21: 647651.)

>ref|NC_000011.8|NC_000011:c5204877-5203272 Homo sapiens chromosome 11, (1606 nt)

5 cataaaagtcagggcagagccatctattgcttACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC

ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGT

GGTGAGGCCCTGGGCAGgttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactctt

gggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttagGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCT

TTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT

GCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCAC

TGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGgtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagtt

catgtcataggaaggggataagtaacagggtacagtttagaatgggaaacagacgaatgattgcatcagtgtggaagtctcaggatcgttttagtttc

ttttatttgctgttcataacaattgttttcttttgtttaattcttgctttctttttttttcttctccgcaatttttactattatacttaatgccttaacattgtgataa

caaaaggaaatatctctgagatacattaagtaacttaaaaaaaaactttacacagtctgcctagtacattactatttggaatatatgtgtgcttatttgc

atattcataatctccctactttattttcttttatttttaattgatacataatcattatacatatttatgggttaaagtgtaatgttttaatatgtgtacacatat

tgaccaaatcagggtaattttgcatttgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaatactttccctaatctctttctt

tcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatctctgcatat

aaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggttgggata

aggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacagCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCT

GTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTG

TGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCC

CTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTA

TTTTCATTGC aatgatgtatttaaattatttctgaattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatttaaaacataaagaaatgatga 3



ARN: Secuencia del ARNm de HBB en formato FASTA

>gi|28302128|ref|NM_000518.4| Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB), mRNA (444 nt)

ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAA

GTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGG

TGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCT

AAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGC

ACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTCCTGGGCAAC

GTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAAAGTGG

TGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTT

CCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAA

AAACATTTATTTTCATTGC

Protena: Secuencia de la cadena polipeptdica de HBB en formato FASTA

>gi|4504349|ref|NP_000509.1| beta globin [Homo sapiens], (147 aa)

MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGL

AHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKY

Secuencias del gen de la de la globina (HBB) humana y sus variantes

>normal HBB human sequence

ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG

GTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACT

CCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGG

CTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAG

AACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTCACCCCACCAGTGCA

GGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAA

>VariantA HBB gene sequence

ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAAAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG






>VariantB HBB gene sequence

ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGAAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG








>VariantC HBB gene sequence

ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAAAGTGGATGAAGTTGGTG






>VariantD HBB gene sequence


GTGAGGCCATGGGCAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACT





>VariantE HBB gene sequence


GTGAGGCCCTGGGCAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACC





>VariantF HBB gene sequence



CCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAACGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGG




>VariantG HBB gene sequence




CTCAACTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAG



>VariantH HBB gene sequence




CTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCAAGTGGATCCTGAG





>VariantI HBB gene sequence





AACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTAACCCCACCAGTGCA


>VariantJ HBB gene sequence






GGCTGCCTATCAGAAAGTGGTGGCTGGTGTGGCTAAAGCCCTGGCCCACAAGTATCACTAA

Tabla 1 Comparacin de todas las variantes de los genes rpoB MTb

MTb Variantes

Mutacin Silenciosa, cambio de

sentido, Sin sentido en la secuencia de aminocidos

Cambio de aminocido entre tipo silvestre y

variante (De __ a ___ o no cambia)

Polimorfismo sinnimo o

no sinnimo

Propiedades qumicas del aminocido que cambia

Est el cambio de aminocido en el sitio de unin de la rimfapicina

(entre 36-67 aa)

Inferencia: podra esta variante ser resistente a rifampicina ?

A

B

C

D

E

F

Observaciones: ...

..



Tabla 2. Comparacin de todas las variantes de los genes HBB

HBB

Variantes

Mutacin silenciosa,

cambio de sentido, sin

sentido en la secuen-

cia de aminocidos

Cambio de

aminocido entre tipo

silvestre y variante (De

__ a ___ o no cambia)

Polimorfismo

sinnimo o no

sinnimo

Propiedades

qumicas del

aminocido que

cambia

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

Observaciones: ...

..

20150522200524 (1)

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