México D.F, 2013.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS

Metabolitos secundarios de especies de Clusia y su actividad sobre la enzima transcriptasa reversa y proteasa del VIH-1.

Tesis que para obtener el grado de Licenciada en Biología

Presenta

Aura Montemayor Lara

Tutor: Dr. Ricardo Reyes Chilpa

1

Agradecimientos

A la Universidad Nacional Autónoma de México por ser parte fundamental en mi formación y en la de muchos otros mexicanos que estamos comprometidos con la sociedad y creemos en un mejor país. Porque, es un honor inigualable ser azul y oro.

A la facultad de Ciencias, por las eternas horas de clases que me hicieron ver mucho más allá de los límites del tiempo, de lo visible, de lo perceptible. Por ayudarme a ver y descubrir el mundo, (mí mundo) de una manera que jamás imaginé.

Al Instituto de Química por el préstamo de sus instalaciones y sus laboratorios.

Al proyecto ‘’Fitofármacos antivirales VIH-1 de árboles tropicales de México’’ (PICSA 10-55 ) financiado por el Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal (ICyTDF ) por la beca otorgada para la realización del presente trabajo.

A mis sinodales: Dra.Gúzman, Dr.Rodríguez, Dr.Lara, Dr.Reyes y al M.C Lozada por su apoyo, paciencia y buenos consejos para la conclusión de mi trabajo.

Agradecimientos personales

A la mujer que me dio la vida, mi mamá “MALU” Por sus hermosos ojos verdes llenos de amor que me mantuvieron en el camino, me dieron de comer, me regañaron, me hicieron llorar, reír a carcajada, por todos los años invertidos en mí. No puedo expresar con palabras como te amo y lo agradecida que estoy. En gran parte, todo esto fue posible gracias a tí.

A mi papá por su eterno optimismo con el que ve la vida. Por encontrar un rayito de sol en donde nadie más lo ve. Por su buen humor y su inagotable curiosidad.

A mi pequeña hermana “LU” por su serenidad y sinceridad en cada paso de su vida, por siempre ver las cosas desde un punto de vista intermedió. Te amo.

A mis amigas-hermanas compañeras de vida, ilusiones, fiestas, desamores pero sobre todo buenos momentos: Ale, Ana, Bárbara, Bk, Eynel, Lucia, Marina,Marian, Nurí, Paula, Romy, Sofía’s, Sandra, Vale, Vero. Sin ustedes, la vida, simplemente no tendría sabor.

A mis amigos Jero, Islas, Tona, Basi, Daniel,Sergio. Por tantos buenos momentos.

A mis primos, cómplices siempre de tanta fechorías, en especial a Mariano, Miguel,Recio, Teté, Maricarmen y Eugenía. No solo son familia, son amigos y son incondicionales. Los adoro con toda la fuerza de mi corazón.

2

A mis tíos y tías por su cariño interminable pero en especial: Mary, Maci, Migue, Lulú, Hector, Vicky , Rod. Arturo e Irma.

A mis sobrinas Rebeca y Julieta que deslumbran mi mundo. Nunca pensé que dos seres humanos tan pequeños, pudiera hacer girar el universo.

A toda la gente del laboratorio 2-5 en especial a Sandra, Rocio, Laura, Ximena y Edgar. Interminables pláticas, risas, comida y aún así, pude terminar la tesis. Los voy a extrañar.

Por último, pero definitivamente no menos importante, al Doctor Ricardo Reyes Chilpa. Por las horas invertidas, las excelentes pláticas, el conocimiento compartido, su amor a las plantas, por su buen humor, buena disposición y su nobleza. Gracias, tampoco tengo palabras suficientes..

3

Índice

Índice de abreviaciones 4

Introducción 5

Antecedentes 6

1.1 El VIH-1 6

1.2 Ciclo replicativo del VIH-1 6

1.3 Terapia antiretroviral 9

2.1 Compuestos naturales con actividad anti VIH-1 de la familia Clusiaceae

10

2.1.1 Compuestos natural del género Calophyllum 10

2.1.2 Compuestos aislados del género Garcini, Symphonia y Vismia 11

2.1.3 Compuestos aislados del género Clusia 14

2.2. Clasificación taxonómica del género Clusia 16

2.2.1

Clusia L 16

2.2.2

Distribución y diversidad 17

2.2.3

Hábitats y formas de vida 18

2.2.4

Diversidad morfológica 19

Clusia guatemalensis 19

4

2.2.5

2.2.6

Clusia quadrangula 20

2.2.7

Clusia lundellii 22

3.1 Justificación 22

3.2 Planteamiento del problema 22

4.1 Objetivo general 22

4.2 Objetivos particulares 22

5.1 Hipótesis 23

6.0 Materiales y Método 23

6.1.2

Estudio Químico 24

6.1.3

Clusia guatemalensis 24

6.1.4

Clusia lundellii 27

6.1.5

Clusia quadrangula 27

6.1.6

Actividad inhibitoria de los extractos sobre la enzima TR 28

6.1.7

Actividad inhibitoria de los extractos sobre le enzima proteasa 29

7.0 Resultados 30

7.1.1

Clusia guatemalensis 30

7.1.2

Fracciones B y C 32

7.1.3

Triterpenos de las fracciones F y G 35

5

8.1 Clusia lundellii 38

9.1.2 Porcentaje de inhibición de la RT de los extractos de especies de Clusia

40

10.1 Discusión 42

11.1 Conclusión 44

11.2 Perspectivas 45

12.1 Bibliografía 46

13.1 Anexos 51

6

Índice de abreviaciones

SIDA: Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida

VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana

ADN: Ácido Desoxirribonucleico

IC50: Concentración inhibitoria 50

μM : Micro molar

PT: Proteasa

RT: Transcriptasa Reversa

RNAm: Ácido Ribonucleico mensajero

CC-FN: Cromatografía en columna fase normal.

CCF: Cromatografía en capa fina

CCP: Cromatografía en capa preparativa

RMN: Resonancia Magnética Nuclear

RMN H: Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno. 1H

RMN C: Resonancia Magnética Nuclear de Carbón 13C

CG-EM: Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas.

mL: Mililitros

NIST: National Institute of Standards and Tecnology

7

INTRODUCCIÓN

A principios de la década de 1980 se reportó una nueva enfermedad que altera el sistema

inmunológico humano. A este padecimiento, se le asignó el nombre de Síndrome de la

Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). En 1982 se identificó el agente etiológico

denominado Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). El VIH infecta células T

conocidas también como linfocitos CD4, volviendo al portador vulnerable a diferentes

agentes patógenos (Tandon et al, 2005). Desde su descubrimiento, el VIH ha causado la

muerte de más de 25 millones de personas. Para el 2010 se estimó que un total de 33

millones de personas viven con SIDA y que cada año, 1.8 millones de personas son

infectadas (ONUSIDA, 2010). En México, se diagnosticaron y registraron 159,411 casos

acumulados de SIDA para el 2012, de los cuales 130,895 (82%) eran hombres y 28,516

(18%) de mujeres (CENSIDA, 2012). Actualmente, no existe una vacuna efectiva contra el

VIH, las estrategias para enfrentar la epidemia están enfocadas hacia la prevención de

nuevas infecciones y el desarrollo de fármacos dirigidos contra el virus. Estos fármacos,

han permitido prolongar la esperanza de vida de los pacientes con SIDA. Sin embargo, su

alto costo, su escasa disponibilidad y efectos adversos, han motivado la búsqueda de

nuevos compuestos, entre ellos los de origen natural, con actividad anti-VIH que no

resulten nocivos, sean accesibles y de bajo costo. Así, la búsqueda de nuevos fármacos

contra el VIH, han incluido a las plantas, debido a su disponibilidad y a su contenido de

metabolitos secundarios con actividad biológica (Perera et al, 2007).

Una de las familias de plantas más importantes para la búsqueda de compuestos con

actividad antiviral VIH, es Clusiaceae. Diversos compuestos aislados de especies de éste

taxón, como las cumarinas tetracíclicas, calanólidos e inofilums se encuentran entre los

compuestos más promisorios para el desarrollo de fármacos (Kashman et al, 1992). En un

estudio realizado por (Huerta-Reyes et al, 2004), se probó la actividad inhibitoria contra la

transcriptasa reversa del VIH-1 de 21 extractos de especies mexicanas de Clusiaceae.

Cinco mostraron actividad inhibitoria mayor al 70%; los extractos de las hojas de Clusia

guatemalensis, colectadas en Chiapas, inhibieron en un 70% dicha enzima, mientras que

los de Clusia quadrangula colectada en Oaxaca inhibieron esta enzima en 65.6%. En la

8

presente tesis se continuó con los estudios químicos y biológicos de estas dos especies,

con la finalidad de evaluar los extractos y la caracterización de sus compuestos activos.

1. ANTECEDENTES

1.1 EL VIH

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es un miembro de la subfamilia

Lentiviridae de la familia Retroviridae. Se trata de un retrovirus con un diámetro de 100 a

120 nm, con cápside cónica. El virus se puede alojar en un segmento del cromosoma del

hospedero y permanecer latente durante muchos años (Sierra et al, 2005). Existen dos

tipos de VIH. Los estudios filogenéticos sobre el VIH -1 indican que está muy relacionado

con el virus que infecta a los chimpancés mientras que el VIH-2 está más emparentado

con el virus que produce la inmunodeficiencia en monos mangabey (Weiis et al, 2000). En

la presente tesis nos enfocamos solo al VIH-1.

La primera cepa se distribuye ampliamente alrededor del mundo pero con una alta

prevalencia en África Central, Europa, Asia y Estados Unidos. El VIH-2 se localiza en el

oeste de África (Evans et al, 1993). La ultraestructura de ambos virus es muy similar ya

que infectan a las mismas células hospederas. No obstante, los estudios moleculares

muestran una homología de nucleótidos de solo el 40% (Guyader et al, 1987).

1.2 Ciclo replicativo del VIH-1

I. Acoplamiento y fusión de las membranas viral-celula r. El primer paso dentro

del ciclo de vida del VIH-1 involucra la fusión del virus a la célula hospedera a

través de la glucoproteina gp120 y los receptores de los linfocitos CD4.

Posteriormente, la proteína gp120 interactúa con los quimioreceptores CCR5 o

CXCR4. El RNA viral es liberado al citoplasma de la célula hospedera.

II. Retrotranscripción. La enzima RT transcribe el ARN a DNA. El nuevo DNA viral,

migra al núcleo de la célula hospedera donde es incorporado al genoma. La RT es

la principal responsable de la diversidad antigénica del virus, ya que presenta una

tasa de mutación muy superior a la que se registra en células eucariotas. Se

9

estima que el genoma viral experimenta de una a tres mutaciones por ciclo de

replicación (Lecoin et al, 2007).

III. Integración. El ADN es incorporado al genoma del hospedador, mediante la

acción de la integrasa que realiza cortes escalados en el genoma celular y viral,

uniéndolos y rellenando los espacios dejados por las bases no pareadas (Cann,

2001).

IV. Transcripción y Traducción. Las primeras transcripciones son llevadas a cabo

por la RNA polimerasa II celular sobre el ADN viral integrado, generan varios

transcritos que migran al citoplasma. Durante esta fase de replicación temprana se

producen múltiples cortes y empalmes de los RNAm y sólo las proteínas

regulatorias Tat, Nef y Rev se expresan. Al alcanzar niveles suficientes, Tat se une

a Tar y controla la transcripción de los genes virales. Cuando Rev alcanza niveles

adecuados, se une a una estructura de los transcritos denominada elemento de

respuesta a Rev (RRE) facilitando su paso a través de la membrana nuclear

(Sierra et al, 2005). El gen env, codifica para las proteínas de unión a CD4 (gp120)

y para las proteínas virales transmembranales (gp41), que se expresa inicialmente

como una poliproteína precursora denominada gp160. Ésta es glicosilada dentro

del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, en donde una endoproteasa

escinde la proteína para generar gp120 y gp41 (Luciw et al, 1996). Estas proteínas

son transportadas por vesículas celulares hasta la membrana plasmática. Los

genes gag-pol se traducen para generar la poliproteínas Gag y Gag-pol que son

las precursoras de las 6 proteínas estructurales codificadas por gag y las

proteasas, integrasas y retrotranscriptasas codificadas por pol.

V. Ensamblaje: Durante el ensamblaje de las partículas virales se asocian las

enzimas virales, el genoma viral, el cebador celular RNAtlys y otros compuestos

celulares. Los viriones inmaduros geman a través de la membrana plasmática, lo

que activa la proteasa viral que escinde las poliproteínas Gag y Gag-pol, liberando

las proteínas estructurales y las enzimas (Sierra et al, 2005). Todas ellas

interactúan con las proteínas de la cápside (CA) y de la nucleocápside (NC) para

generar los viriones maduros. El proceso de ensamblaje y gemación requiere de la

10

disminución del número de linfocitos CD4 para evitar su interacción con las

proteínas gp120 recién sintetizadas. En este proceso intervienen las proteínas

Env, Nef y Vpu. La primera se une a las moléculas CD4 que pasan por el retículo

endoplásmico durante su maduración, mientras que la segunda acelera la

endocitosis y la degradación subsecuente de CD4 (Luciw, 1996 ;Sierra et al,

2005).

VI. El virus maduro: En la fase final, dos copias del RNA viral junto con otras

proteínas se incorporarán al virus inmaduro para salir al plasma sanguíneo y por

acción de la proteína Gag madurarán para infectar otras células. El virus del VIH-1

se replica billones de veces al día en una sola célula, causando la lisis y por

consecuencia la muerte del linaje celular CD4 (Singh, Bodiwala et al, 2010).

Esquema 1. Donde se muestra el ciclo replicativo de l VIH-1. 1. Acoplamiento y fusión de las

membranas viral-celulares, 2.Retrotranscripción, 3. Integración, 4.Transcripción y Traducción,

5.Ensamblaje, 6.El virus maduro.

11

1.3. Terapia antiretroviral

Desde el reconocimiento en 1983 del virus del VIH-1 se han aprobado más de 25

fármacos para tratar esta enfermedad. La Food and Drug Administration (FDA)

actualmente, aprueba 36 fármacos: 13 Inhibidores nucleosídicos, 6 inhibidores no

nucleósidicos, 11 inhibidores de la proteasa, un inhibidor de la integrasa, un inhibidor de la

fusión, un inhibidor de los receptores CCR5 y tres fármacos con actividad dual citados a

continuación (FDA, 2013).

Fármaco Función

Combivir Emtriva Epivir Epzicom Hivid Retrovir Trizivir Truvada Videx Ec Videx Zerit Ziagen Edurant Intelence Rescriptor Sustiva Viramune Viramune XR

Inhibidores nucleosídicos de la RT

Inhibidores no nucleosídicos de la RT

Isentress Fuzeon

Inhibidor de la Integrasa

Inhibidores de la fusión

Selzentry Atripla Compleva Stribild

Inhibidores de los receptores CCR5

Fármacos combinados

Cuadro 1: Fármacos aprobados por la FDA anti VIH-1

12

A pesar de los avances en la elaboración de fármacos, el alto costo, los efectos

secundarios como toxicidad hepática, neurológica, y el rápido desarrollo de resistencia a

los mismos, representan una gran desventaja en el tratamiento del VIH-1 (Raulin, 2002)

(De Clercq, 2000). Los productos naturales derivados de plantas, podrían constituir una

alternativa para el tratamiento de este padecimiento, ya que son menos tóxicos, igual de

eficaces y tienen un costo menos elevado (Kostova, 2005).

2.1 Compuestos naturales con actividad anti VIH-1 d e la familia Clusiaceae

La familia Clusiaceae está compuesta por 36 géneros y más de 1600 especies. Los

géneros con mayor número de especie: Neotatea, Caraipa, Mahurea, Calophyllum,

Vismia, Hypericum, Marila, Clusiella, Symphonia, Lorostemon, Moronobea, Platonia,

Garcinia, Tovomita, Chrysochlamys y Clusia. Su distribución es pantropical y se

caracteriza por ser árboles o arbustos (rara vez lianas) perennifolios. Las flores son

actinomórficas, por lo general son blancas o amarillas y ofrecen resina como recompensa

a sus polinizadores (Kearns et al, 2013). A continuación se revisa los compuestos

aislados con actividad antiviral (VIH) de especies de esta familia con énfasis en Clusia,

Calophyllum.

2.1.1 Compuestos con actividad anti VIH-1 del géner o Calophyllum

En 1992 Kashman y colaboradores aislaron compuestos naturales de importancia

farmacológica para el eventual tratamiento del VIH-SIDA. Las dipiranocoumarinas

tetracíclicas (+)-calanólido A (Fig.1), calanólido B (Fig.1) y calanólido C (Fig.1), fueron

extraídas del árbol tropical Calophyllum lanigerum de la familia Clusiaceae. Dichos

compuestos mostraron ser potentes inhibidores de la TR del VIH-1 (Kashman et al.,

1992).

Patil et al. aislaron en 1993 del árbol Calophyllum inophyllum de Malasia coumarinas de

tipo inofilum B (Fig.1) y P la cual inhibe la replicación del VIH. De Calophyllum teysmannii

se aislaron los calanolidos B y sulatrolidos.

13

De Calophyllum cordato-oblongum especie endémica de Sri Lanka, se obtuvieron dos

moléculas exclusivas de este árbol; los cordatolidos A y B. Dichos compuestos mostraron

una actividad anti RT con un IC50 de 19.3 y 11.7 μM respectivamente (Dharmaratne,

2002).

Figura 1: Calanólidos e Inofilum obtenidos del espe cies del género Calophyllum.

2.1.2 Compuestos con actividad anti VIH-1 de los gé neros Garcinia, Symphonia y

Vismia

En 1996 se probó el extracto etanólico de Garcinia mangostán mostrando una alta tasa de

inhibición de la proteasa VIH-1. Se aislaron y caracterizaron dos nuevas moléculas la

alpha- mangostina (Fig.2) y la gamma-mangostina (Fig.2) con un IC50 = 5.12 +/- 0.41 µM y

14

4.81 +/- 0.32 µM respectivamente. La inhibición de ambos compuestos fue no alostérica

(Chen et al, 1996).

Rukadraisirikulv y colaboradores (2003) obtuvieron de los extractos metanólicos crudos

del tronco y del tallo de Garcinia speciosa tres nuevos compuestos que denominaron

garciniaterpenos A, B y C. Los compuestos A y C mostraron actividad inhibitoria contra la

RT con un IC50 de 15.5 y 12.2 μg/ mL respectivamente. Otro compuesto aislado fue la

digeranilbenzofenona de tipo garciosafenona A, también mostró actividad con un IC50 de

23.9 μg/mL.

En el 2009, Masullo y colaboradores obtuvieron de Garcinia indica y Garcinia cambogia

gutiferonas A, B, E, C, y D, las últimas dos mostraron actividad anti VIH-1. En otro estudio

realizado por los mismos investigadores y con las mismas especies, se probó la

gutiferona F la cual inhibió el virus del VIH-1.

En el 2010 Magadula y Tewtrakul probaron la actividad anti proteasa, de los extractos

etanólicos de diferentes especies africanas de Garcinia. La raíz, fruto y tallo de Garcinia

ferrea presentaron un IC50 de 45.5, 47.6 y 27.3 μg/mL respectivamente. Los extractos de

Garcinia edulis, disminuyeron la actividad enzimática en un 84.8% y los extractos de tallo

un 85% a una concentración de 100 μg/mL. De Garcinia semseii se probaron los extractos

de tallos, semillas, raíces y cáscara de la fruta mostrando una media de inhibición del

88%. Los tallos de Garcinia volkensis y Garcinia kingaensis mostraron un IC50 de 58.3 y

15.2 μg/mL respectivamente. Los tallos y raíces de Garcinia livingstoneii mostraron un

IC50 de 37.2 y 32.2 μg/mL respectivamente. Los compuestos fenólicos y los esteroides

fueron los metabolitos más abundantes (Magadula et al, 2010).

De Garcinia hanburyii, y de Garcinia mangostana se encontraron compuestos derivados

de las xantonas con actividad inhibitoria de la proteasa y de la RT (Kaur, 2011).

15

Figuras 2: alpha-mangostina y gamma-mangostina obte nidas de Garcinia mangostan .

De Symphonia globulifera se obtuvo la benzofenona gutiferona A (Fig.3) (Gustafson,

1992)

Figura 3: Gutiferona aislada de Symphonia globulifera.

De Vismia cayennensis se obtuvieron benzofenonas preniladas denominadas

vismiafenonanas D-G. La vismiafenona D (Fig.4) mostro actividad inhibitoria anti VIH-1

con un IC50 de 11(μg/mL) (Fuller et al, 1999).

Figura 4: Vismiafenona aislada de Vismia cayennensis.

16

2.1.3 Compuestos naturales con actividad anti VIH-1 del género Clusia

El interés por encontrar fármacos anti VIH, ha estimulado los estudios fitoquímicos del

género Clusia. En un estudio realizado por Huerta-Reyes et al en el 2004, se probó la

actividad inhibitoria del VIH-1 en 21 especies mexicanas de Clusiáceas. Cinco mostraron

actividad inhibitoria de la transcriptasa reversa del VIH-1 mayor al 70%. Los extractos de

las hojas de Clusia guatemalensis, colectadas en el Estado de Chiapas, inhibieron en un

70% dicha enzima, mientras que los extractos de hoja de Clusia quadrangula inhibieron

esta enzima en 65.6%, la corteza de la fruta en un 51.9%, las semillas un 56.6% y los

extractos de tallo en un 59.7% (Huerta-Reyes et al, 2004).

De los frutos de Clusia torresii especie endémica de Costa Rica, se aislaron benzofenonas

poli isopreniladas la 7-epi-clusianona, 18,19-dihydroxiclusianona, propolona A y

nemorosona (Fig.6), mostraron actividad anti HIV con un IC50 de 0.02, 2.0, 7.1, 0.32 y 0.8

mM, respectivamente y con índices de seguridad (IS = IC50/DL50) de 5.0, 10.0, 2.2, 15.6 y

6.2, correspondientemente (Singh et al, 2010). Este mismo compuesto fue aislado de las

resinas de Clusia burchellii, Clusia fluminensis, Clusia grandiflora, Clusia hilariana, Clusia

insignis, Clusia lanceolata, Clusia nemorosa, Clusia pana-panari, Clusia paralicola, Clusia

pernambucensis, Clusia rosea, Clusia spiritu-sanctensis, Clusia weddelliana (Porto et al,

2000). La benzofenona Gutiferona A (Fig.6) extraída de Clusia globulifera y Clusia rosea

mostró actividad inhibitoria de la transcriptasa reversa del VIH-1 (Tandon, 2005). De Clusia

congestiflora, Clusia spiritu-santensis y Clusia sandinensis se aislaron benzofenonas de

tipo clusianonas, 7-epi-clusianona además de propolona A y nemorosona (Fig.6). La

actividad anti-VIH y la toxicidad de los compuestos, fueron probados en linfocitos

infectados con VIH (Piccinelli, 2005). La propolona A fue la que presentó un mayor

porcentaje de inhibición.

17

Figura 6 : Compuestos aislados de Clusia torresii

18

2.2 Clasificación taxonómica de l género Clusia

Reino: Plantae

Phylum: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Theales

Subfamilia: Clusioideae

2.2.1 Clusia

Árboles o arbustos sin espinas generalmente epífitos, la sabia amarilla con

textura viscosa y resinosa que se torna negra cuando se seca; dioicas o

polígamodioicas. Las hojas son opuestas, enteras y sin estípulas.,

generalmente coriáceas con nervaduras laterales paralelas. Las

infloresecencias ternadas, rara vez presenta una sola flor, articulada en los

nodos. Las flores pueden ser pequeñas o grandes casi siempre unisexuales y

rara vez perfectas. Las brácteas son numerosas y decusadas dispuestas por

debajo de la flor, con 4 a 6 sépalos redondeados. Los pétalos pueden estar

libres o connados que diferentes formas y número, regularmente están

acompañados de estaminodios cubiertos de una resina viscosa. Las flores

femeninas, contienen estaminodios vestigiales. El ovario tiene entre 4 a 15

cavidades con un estigma sésil o subsesil; los óvulos son anátropos y

numerosos. La fruta o drupa tiene paredes delgadas con múltiples dehiscencia

(Standley et al, 1946).

19

2.2.2 Distribución y diversidad:

El género Clusia comprende un estimado de 250 a 300 especies, todas de distribución

tropical (Huerta-Reyes et al, 2004). Su distribución comprende desde el centro de México

hasta Brasil incluyendo las islas del Caribe.

Mapa 1: Distribución del género Clusia (tomado de Gustafsson et al, 2007)

20

2.2.3 Hábitats y formas de vida

Los hábitats donde se desarrolla son muy contrastantes, desde bosque mesófilo de

montaña, selva baja y dunas costeras. Se distribuyen desde el nivel del mar, hasta los

3500 msnm de altitud. Se consideran especies colonizadoras por la capacidad que tienen

de establecerse en suelos pobres en materia orgánica y en suelos muy salinos; por lo

tanto, es un género con alta plasticidad. En los bosques templados, la mayoría de las

especies son hemiepífitas. En etapas tempranas del desarrollo, son verdaderas epífitas

hasta que desarrollan raíces adventicias que les permiten anclarse al suelo.

Posteriormente, son capaces de rodear al árbol donde crecieron causando la muerte de

éste. Las formas arbustivas también son comunes en el género (Gustafsson, 2007). La

mayoría de las especies son dioicas, con crecimiento secundario y son polinizadas por

insectos generalistas (Matallana; et al, 2005). Una característica casi exclusiva del género

es la secreción de látex o resina que ofrecen como recompensa a sus polinizadores.

Diversos estudios, han observado que los himenópteros construyen sus nidos con las

resinas ofrecidas por la flor de estos árboles tropicales (Hochwallner et al, 2011).

La familia tiene metabolismo ácido de las crasuláceas por sus siglas en inglés CAM;

donde el intercambio gaseoso ocurre en la noche cuando se abren los estomas con el fin

de evitar la pérdida de agua durante el día. El CO2 se fija vía la fosfoenolpiruvato

carboxilasa y se almacenan en la vacuola como ácido málico. En el día, los estomas se

cierran y el CO2 resultante de la descarboxilación del malato es usado por la enzima

ribulosa bifosfato carboxilasa (Rubisco). Cuando el medio es lo suficientemente húmedo,

también pueden intercambiar CO2 durante el día. El género Clusia presenta una enorme

flexibilidad de metabolismo ya que cuando las condiciones ambientales así lo requieran

puede cambiar de CAM a C3 (Vaasen et al, 2001).

21

2.2.4 El Género Clusia en México

En México se localizan 10 especies de Clusia. (Cuadro 2). A continuación se describen

en la tabla

Cuadro 2: Especies de Clusia presentes en México

Género # especies Nombre

Clusia 10 C.flava, C.guatemalensis

C,lundelli,C.massoniana,C.minor,

C,pringlei, C.quadrangula,

C.rosea,C.salvinii,

C.tetratrianthera

2.2.5 Clusia guatemalensis Hemsl.

Sinonimia: Clusia mexicana Vesque , Epharm. 3 :9, tt. 24, 25. 1892.

Es una planta leñosa terrestre de 2 a 10 metros de altura. Las hojas son coriáceas de

forma angosta y elíptica de 8 a 11 centímetros de largo. Carecen de estípulas y su

venación es paralela con venas intersecundarias (Gentry, 1993). Las inflorescencias son

globosas con varias flores amarillas con polipétalos y simetría radial, los numerosos

estambres están fusionados. El fruto es una drupa es ovoide de 1.7-3.5 cm de largo, con

una tonalidad rojiza y secretan látex amarillo. Los estomas se distribuyen en la cara

adaxial. Común en nebliselvas, zonas atlántica y norcentral, a una altura de 100 hasta

1500 msnm. Se distribuye en México en los estados de Chiapas, Oaxaca, Tabasco y

Veracruz, en Centroamérica, en Belice, Guatemala, El Salvador, Honduras y Nicaragua.

22

Figura 7: Clusia guatemalensis con drupa y flor

2.2.6 Clusia quadrangula Bartlett, Proc. Amer. Acad. 43:55. 1907.

Sinonimia: Clusia cooperi Standl.

Crece como arbusto epífito o árbol de 7 a 9 metros de altura. Las hojas son elípticas,

acuminadas de 7 a 12 cm de largo y de 3 a 6 cm de ancho. Las venas laterales son muy

numerosas y prominentes tanto en el haz como en el envés. Las flores tienen 4 pétalos de

color blanco del doble de largo de los sépalos, los estambres son muy numerosos y los

filamentos muy cortos o ausente y de menor tamaño que las anteras. El fruto es globoso u

oval de 2 centímetros de largo con hasta 9 carpelos. Se distribuye de Belice, Guatemala,

Honduras, México, Nicaragua, Panamá.

23

Figura 7 A: Flor y fruto de Clusia quadrangula

2.2.7 Clusia lundellii Standl Carnegie Inst. Wash.Publ.461:72.1935.

Sinonimia: Clusia chanekiana Lundell.

Árbol de hasta 10 metros de altura. Las hojas son coriáceas de forma cunada-oblonga de

13 a 22 cm de largo y de 4.5 a 9 de ancho. Las venas laterales son numerosas de hasta

26 pares. La drupa es elíptica-oblonga de 12 cm de largo por 4.5 cm de diámetro. Tiene

seis carpelos, la pulpa es roja-naranja. Se distribuye desde México, Belice, Guatemala.

Honduras.

Figura 7 C: Drupa y hoja de Clusia lundellii

24

3.1 JUSTIFICACIÓN

El presente trabajo, tiene como finalidad aportar información sobre la química de Clusia

guatemalensis y Clusia quadrangula con el fin de contribuir a la identificación de

compuestos y extractos que puedan ser utilizados como fármacos contra las enzimas RT

y Proteasa del VIH-1. Además de contribuir con los estudios de este género de plantas

escasamente estudiado en nuestro país.

3.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En México, se estima que solo la mitad de la población infectada con el VIH-1, recibe

tratamiento antirretroviral gratuito dejando a más de 100,000 pacientes sin acceso a la

terapia combinada. Por concepto de atención y tratamiento, el gobierno mexicano gastó

$1, 024, 685,714 de pesos para el 2009 (Villalobos et al, 2009). Los productos naturales,

en especial los derivados de plantas pueden ser utilizados como una alternativa, ya que

son menos costosos, menos tóxicos e igual de eficientes. Por otro lado, la familia

Clusiaceae ha sido poco estudiada en nuestro país a pesar de tener especies de

importancia económica por usarse como recursos maderables y farmacológicos.

4.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar ciertos compuestos químicos presentes en los extractos de Clusia

guatemalensis ,Clusia lundellii, Clusia quadrangula al igual que su actividad inhibitoria de

la RT y Proteasa del VIH-1.

4.1.2 Objetivos particulares

I. Aislar e identificar algunos compuestos químicos presentes en los extractos orgánicos

de las hojas de Clusia guatemalensis.

II. Identificar los principales compuestos volátiles presentes en la drupa de Clusia

lundellii.

III. Determinar la actividad inhibitoria de los extractos de hoja de Clusia guatemalensis

25

sobre la enzima RT y Proteasa del VIH-1.

IV. Determinar la actividad inhibitoria de los extractos de hoja y drupa de Clusia

quadrangula sobre la enzima RT y Proteasa del VIH-1.

V. Contribuir al estudio químico del género Clusia.

5.1 Hipótesis

Ya que Clusia guatemalensis y Clusia quadrangula pertenecen a la familia Clusiaceae, es

factible que contengan compuestos con actividad anti VIH-1.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Colecta de los ejemplares

Clusia guatemalensis: Se colectó en el Municipio de Santiago Comaltepec, localidad La

Esperanza, kilómetro 5 entre el tramo carretero la Esperanza y Metates de la Carretera

Federal Oaxaca-Tuxtepec en México. Georreferencia: 17° 42´43.0 N, 96° 19´57.8 W. El

ejemplar fue depositado en el herbario de la Facultad de Ciencias FCME con el número

de registro 134795.

Clusia quadrangula: Se colectó en el Municipio de Santiago Comaltepec localidad la

Esperanza kilómetro 2.5 entre el tramo carretero la Esperanza y Metates de la Carretera

Federal Oaxaca-Tuxtepec País: México. Estado o provincia: Oaxaca. A una elevación de

1528 msnm. La georreferencia: 17° 42´45.0 N, 96° 18´77.8 W. Dos ejemplares fueron

depositados en el herbario de la Facultad de ciencias (FCME) con el número de

registro134789 y134790.

Clusia lundellii: Se colectó en el Municipio de Santiago Comaltepec localidad La

Esperanza entre el tramo carretero Mirador-Esperanza sobre la Carretera Federal

Oaxaca-Tuxtepec País: México. Estado o provincia: Oaxaca. A una elevación de 1996

msnm. La georreferencia 17° 35´09.0 N, 96° 26´34.8 W. Tres ejemplares fueron

depositados en el herbario de la Facultad de Ciencias (FCME) con el número de registro

136723, 136704,136732.

26

6.1.2 Estudio químico

6.1.3. Clusia guatemalensis

Las hojas se secaron a temperatura ambiente y se maceraron por 48 horas en dicloro-

metano-metanol 1:1. Para la obtención de los extractos crudos, la mezcla de disolventes

fueron evaporados a presión reducida en rotavapor y el residuo se dejó en el vacio por 5

días. A continuación, el extracto seco fue fraccionado por cromatografía en columna fase

normal (CC-FN). Para ello, el extracto se resuspendió en hexano y se agregó celita (5

gramos por cada gramo de extracto). Una vez que el extracto se adsorbió y secó en la

celita, esta fue colocada en una columna de vidrio que contenía como adsorbente silica

gel (malla 70-230, Merck; 25g x g de extracto). La columna se eluyó con disolventes de

polaridad creciente.

Las fracciones 1 a 8 fueron eluídas con la mezcla 50:50 hexano-diclorometano. La

fracción 9 fue eluída con diclorometano-hexano (75:25) y se obtuvieron cristales en forma

de aguja. Las fracciones de la 10 a la 15 fueron eluídas con la mezcla hexano-

diclorometano 25:75. Las fracciones de la 16-19 se obtuvieron usando como fase móvil

diclorometano. Las fracciones 20-28 se eluyeron con diclorometano-acetato de etilo

(75:25). Las fracciones 29-35 con la mezcla (50:50) y las fracciones 36 -42 con (25:75).

Las fracciones 43-49 se obtuvieron con acetato de etilo y por último se lavó la columna

con metanol (Fig. 8).

En total, se obtuvieron 50 fracciones, las cuales después de analizarlas en cromatografía

en capa fina se reunieron aquellas similares y se nombraron como fracciones secundarias

(A-N). Algunos compuestos y algunas fracciones, se analizaron por Resonancia

Magnética Nuclear de Protón y Carbono empleando espectrómetros marca Varian, 200

MHz y Bruker, Avance 300 MHz, empleando cloroformo o metanol deuterado y como

referencia interna tetrametilsilano (TMS).

27

Figura 8. Cromatografía en columna del extracto de Clusia guatemalensis

De la fracción secundaria A (1-8), se obtuvo un aceite de color verde. Este material se

analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) por

inyección directa. El equipo utilizado fue un cromatografo de gases acoplado a un

espectrómetro de masas Jeol GCMate II. La temperatura del inyector fue de 310°C y la

columna utilizada fue HP-5 de 30 metros de longitud. La temperatura inicial del horno fue

de 30°C grados y por cada minuto fue aumentando 8°C grados hasta alcanzar los 310°C

grado por 6 minutos.

El análisis por CG-EM determinó que contiene tres compuestos principales (Anexos figura

19, 20,21.). Los espectros de masas experimentales se compararon con los almacenados

en la base de datos NIST.

De las Fracciones B y C precipitó un sólido cristalino (1.1 mg) en forma de agujas que se

analizó por RMN de hidrogeno, resultando ser una mezcla de compuestos que se trata en

la sección de resultados (7.1.2).

De las fracciones reunidas F (9-10) y G (11-14) al analizarlas por CCF (Silica Gel 60,

hexano-acetato de etilo 85:15) se observó en un compuesto mayoritario que reveló con

vainillina como una mancha de color morado y presentó un R.F de 0.46 (Fig. 9).

75:25

Hexano CH2Cl2 50:50

25:75

CH2Cl2

100

CH2Cl2 AcOEt

75:25

50:50

25:75

AcOEt

100

MeOH

100

C.guatemalensis

1-8 9

10-15

16-19

20-28

29-35

36-42

43-49

50

28

Figura 9: Compuestos mayoritarios de las fracciones 9-10 y 11-14 en CCF.

Para aislar el compuesto mayoritario, las fracciones F (9-10) se sometieron a cromatogra-

fía en capa fina preparativa. Se utilizaron placas de Silica Gel 60, de 20 x 20 cm y 2.0 mm

de espesor, como fase móvil se empleó hexano-acetato de etilo (85:15). La sílica gel que

contenía el compuesto se raspó y se eluyó con diclorometano y el disolvente se eliminó a

presión reducida en un rotavapor, obteniendo un sólido amorfo. Este material se analizó

por CCF como previamente se ha señalado y se observó una sola mancha de color

morado (Fig. 10). El compuesto aislado se analizó por resonancia magnética de carbono 13C (Fig.16) e 1H (Fig.17) identificándolo como una mezcla de triterpenos tratada en la

sección de resultados (7.1.3)

Figura 10: Producto aislado de la fracción 9-10 y 1 1-14 en CCF.

29

6.1.4 Clusia lundellii

Los compuestos volátiles de la drupa fresca de Clusia lundellii fueron extraídos por la

técnica de microextracción en fase sólida en la fase gaseosa. Dicha técnica, se realiza de

la siguiente forma: Un muestra de la drupa (2 g) se coloca en un vial, el cual se somete a

baño maría por 15 minutos a una temperatura constante de 47° C grados, de tal manera,

que los compuestos volátiles se liberen a la fase gaseosa del vial. Posteriormente se

inserta la fibra que adsorbe los compuestos volátiles desprendidos del fruto. Se usó una

fibra 2cm-50/30 um DVB/Carboxen/PDMS, Marca Supelco, lote P340030 y el equipo

LECO Pegasus 4D. El cromatógrafo de gases acoplado al espectrómetro de masas

utilizado fue el Agilent 6890N. Se lograron separar 12 compuestos de los cuales, 4 fueron

identificados por comparación de sus espectros de masas con los almacenados en la

base de datos NIST (Anexos FIG. 25-28).

6.1.5 Clusia quadrangula

Las hojas se secaron a temperatura ambiente y se maceraron por 48 horas en

diclorometano-metanol 1:1. Para la obtención del extracto crudo, la mezcla de disolventes

fue evaporada a presión reducida en rotavapor y el residuo se dejó en el vacío por 5 días.

La drupa fresca fue macerada por 48 horas en diclorometano-metanol 1:1.Posteriormente,

la mezcla de disolventes fue evaporada a presión reducida en rotavapor y se colocó en el

vacío. Del extracto se obtuvo una emulsión y se formó una fase líquida y una fase

aceitosa que se probaron por separado en los ensayos de RT y PT. Los resultados se

discuten en la sección 9.1.

30

6.1.6 Actividad inhibitoria de los extractos sobre la enzima transcriptasa reversa

La actividad anti-RT se evaluó mediante el ensayo Lenti-RT® Activity Assays (Cavidi

Tech) (Huerta-Reyes et al,2004), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante, a fin de

determinar el porcentaje de inhibición de los extractos de Clusia guatemalensis y Clusia

quadrangula diclorometano metanol 1:1. Las placas contienen un molde de poliadenina o

poli A, a la cual se le agrega el compuesto de prueba (extracto), la enzima TR y Bromo

desoxiuridina trifosfato (BrdUTP) de tal manera que se construya la cadena

complementaria PoliU (paso1). A continuación, se adiciona un anticuerpo monoclonal

unido a fosfatasa alcalina el cual reconoce la cadena de Poli U (paso 2) y finalmente se

adiciona paranitrofenilfosfato (pNPP), el cual es el sustrato de la fosfatasa alcalina que

hidroliza al grupo fosfato del pNPP produciendo una reacción colorida (paso 3). Si el

compuesto presenta actividad inhibitoria de la TR del VIH-1, no se construye la cadena

complementaria y por lo tanto no se observa la reacción colorida. Los extractos fueron

probados a una concentración de 50 µg/mL y la determinación colorimétrica se hizo

mediante un lector ELISA a 405nm.

Figura 11: Esquema de evaluación de la actividad an ti RT del kit Lenti-RT® Activity Assays

31

6.1.7 Actividad inhibitoria de los extractos sobre la enzima proteasa

El ensayo de la proteasa fue realizado con el kit HIV Protease Assay Kit de marca

ProteinOne para una placa de 96 pozos. Este kit tiene como fundamento, la liberación de

fluorescencia que desprende un péptido al ser cortado por la proteasa en un sitio

específico Prgag. Para probar la actividad de los compuestos, se preparó una solución

buffer. La preparación de la mezcla maestra, se lleva a cabo, con la adición de substrato

para la enzima y la proteasa aislada del VIH-1 al buffer previamente preparada.

Posteriormente, el extracto crudo de Clusia quadrangula y Clusia guatemalensis se

disolvió en una solución de dimetilsulfóxido (DMSO) al 0.5% para lograr una

concentración final de 10mg/mL (Paris et al, 1993). Se colocan 4 µL en un pozo (por

triplicado) lleva a 100 μl con la mezcla maestra. En el momento que se adiciona la mezcla

maestra se inicia la reacción. La solución control se preparó con Pepstatina A, que es un

inhibidor de la proteasa, a diferentes concentraciones. Por último, fue llevado a 100 μl/mL

con la mezcla maestra. Para las lecturas de los cambios de fluorescencia, se utilizó un

fluorómetro marca Gemini XPS a una amplitud de onda de 485-525 nm. Se tomaron

lecturas cada 60 minutos.

La lectura de fluorescencia de fondo tiene que ser restada a las lecturas en los otros

pozos. Esta lectura es de unidades de fluorescencia relativa (UFR). La ecuación es la

siguiente: Frelativa = Fmuestra – F

Figura 12: Esquema de evaluación de la actividad an ti PT el kit HIV Protease Assay

32

7. RESULTADOS

7.1. Clusia guatemalensis

El extracto de (CH2Cl2-MeOH) de las hojas de Clusia guatemalensis sometido a

cromatografía en columna permitió obtener varias fracciones e identificar algunos

compuestos. De la fracción secundaria A (1-8), se obtuvo un aceite de color verde. Este

material se analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-

EM). El cromatograma (Figura 13) muestra 9 picos entre los 18-37 minutos

aproximadamente, de los cuales se pudieron identificar 3 compuestos. El pico 1

corresponde al ácido palmítico, el 2 al 9-hexacoseno y el 3 a la α-amirina. El compuesto

más abundante fue el 9-hexacoseno con tiempo de retención de 32.12 mins (cuadro 3).

Otro pico abundante presentó tiempo de retención de 33.68 minutos. El cual de acuerdo a

la base datos también fue identificado como 9-hexacoseno, pero su factor de similitud fue

menor (5.8%), lo cual sugiere que se puede tratar también de un alqueno C26H52, pero con

la doble ligadura en otra posición diferente al compuesto mayoritario. Los picos restantes

fueron identificados como contaminantes de los disolventes (ftalatos) y del sangrado de la

columna (siloxanos).

33

Figura 13: Cromatograma de la fracción A. 1: ácido palmítico, 2: 9-hexacoseno, 3: α-amirina, 4:

C26H52

34

Cuadro 3: Compuestos identificados en la fracción A determinados por cromatografía de

gases acoplada a espectrometría de masas

Pico No. Compuestos TR (m.)

Área de picos (%)

Estructuras

1 Ácido palmítico 20.97 0.4

2 9-hexacoseno 32.12, 26 CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)15-CH3

3 α- Amirina 34.07 11

7.1.2. Fracciones B y C.

De las fracciones B y C precipitó un sólido cristalino (en forma de agujas las cuales fueron

analizadas por RMN de hidrogeno y CG-EM resultando ser una mezcla de compuestos.

En el CG-EM se observaron 3 picos entre los 29-37 minutos (Figura 14). El pico 1

corresponde al ácido hexanoico, 2-etil-anhidrido, el pico 2 al triterpeno 3-β friedelanol y el

pico 3 al 2, 6, 10, 14,18-pentametil-2, 6, 10, 14, eicosapentaeno. El derivado del ácido

hexanoico fue el más abundante seguido del 3-β friedelanol (20.8%) (Cuadro 4). El

espectro de RMNP (Figura 15) mostró señales en 0.85 a 1.17 ppm para los metilos de un

triterpeno, así como 3.73 d para el H sobre el C-3 que soporta el hidroxilo. Estas señales

fueron semejantes a las reportadas en la literatura para el 3-β-friedelanol (Kim et al,

2004).También se observó una señal simple en 1.25 ppm para los hidrógenos de una

cadena alifática (CH2)n en verde, y señales para protones vínilicos en 5.34 (t) y 5.26 (t)

ppm marcados en guinda, así como en 4.29 y 4.14 dd, 3.64 t y 2.30 t.

35

Figura 14: Cromatografía de la fracción B y C. 1: á cido hexanoico, 2-etil-anhidrido, 2:3- β

friedelanol y 3: 2,6,10,14,18-pentametil-2,6,10,14, eicosapentaeno.

1

2

3

36

Cuadro 4 . Compuestos identificados en la fracción B y C determinados por cromatografía

de gases acoplada a espectrometría de masas

Pico

No. Compuestos TR m

Área

de

picos

(%)

Estructuras

1 ÁcidoHexanoico,2-etil-

anhidrido 29.23 63.3

2 3-β-friedelanol 37.36 20.8

3

2,6,10,14,18-pentametil-

2,6,10,14,eicosapentaeno

37.54 4.5

37

Figura 15: Resonancia Magnética de Hidrógeno de la Fracción B y C

7.1.3 Triterpenos de las fracciones F

Las fracciones F (9-10) se sometieron a cromatografía en capa fina preparativa

obteniendo un sólido amorfo. El espectro de RMN 13C sugirió que se trataba de una

mezcla de triterpenos en cuya estructura se presentan enlaces C=C de acuerdo a las

señales de 119 al 160 ppm (en verde). También se observaron dos señales en 79.2 y 79.0

ppm para carbonos base de oxígeno (en morado) y finalmente los carbonos alifáticos CH3,

CH2, CH y C se observaron de 15 a 60 ppm (en azul). (Fig.16). El espectro de RMN 1H

(Fig.17) mostró 8 señales que van desde 0.74 a 1.68 ppm, para los metilos de triterpeno

(en rosa), de 3.18 a 3.28 ppm se observaron hidrógenos de carbono unido a oxígeno. Por

último se observaron señales para 9 hidrógenos vinílicos que van de 5.09 a 5.27 ppm (en

amarillo).

CH2

H=H H-C-OH

38

Figura 16: Espectro RMN de 13C del aceite obtenido de la fracción F (9-10)

C Alifáticos Carbono de

Alquenos

Carbonos unidos

a oxígeno

39

Figura17: Espectro RMN de 1H del sólido obtenido de la fracción F (9-10).

Metilos

O-CH

Hidrógenos

vinílicos

40

8.1 Clusia lundellii

Se analizaron por CG-EM los compuestos volátiles de la drupa fresca de Clusia lundellii

extraídos por la técnica de microextracción en fase sólida en la fase gaseosa. Se

identificaron 4 compuestos, siendo el cariofileno el compuesto más abundante (20.67%)

con un tiempo de retención de 8.41 minutos. El sesquiterpeno cicloisolongifoleno fue el

segundo en abundancia (5.5%). El 1-metil-4-(1,2,2-trimetilciclopentil)-benceno y el

Aromadendreno presentaron la menor abundancia (Cuadro 5).

41

Cuadro 5 Compuestos identificados en la drupa de Clusia lundellii por Cromatografía de

Gases acoplada a Espectrometría de Masa

Pico No.

Compuestos TR m Área de picos (%)

Estructura

1 Aromadendreno 8.35

2.34

2 Cariofileno 8.41 20.67

3

1-metil-4-(1,2,2-trimetilciclopentil)- benceno

8.8 4.4

4 Cicloisolongifoleno 8.8 5.5

42

9.1 ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LOS EXTRACTOS

Se evaluó la capacidad de los extractos de diclorometano-metanol (50 mg/mL) de dos

especies de Clusia colectadas en Oaxaca para inhibir la enzima transcriptasa reversa del

VIH, mediante un ensayo inmunocolorimétrico. Los extractos de las hojas de Clusia

quadrangula presentaron un porcentaje de inhibición de la transcriptasa reversa del VIH- 1

(RT) del 52%, al igual que el extracto acuoso de la drupa. Dichos porcentajes son

similares a los previamente reportados para las hojas (65%) y fruto (51.9%) de C.

quadrangula colectados en la misma zona, esto empleando la misma concentración y el

mismo método (Huerta-Reyes et al, 2004). La fase aceitosa del extracto de la drupa de

dicha especie tuvo un porcentaje de inhibición del 41%. El látex extraído de la drupa no

presentó actividad contra la enzima.

En el caso de Clusia guatemalensis, el extracto de las hojas inhibió la RT en un 32%. Este

valor es inferior al previamente reportado para dicho extracto pero de un ejemplar

colectado en el Estado de Chiapas (Huerta-Reyes et al, 2004).

43

9.1.2 Cuadro 6: Porcentaje* de inhibición de la RT de los extractos de

especies de Clusia quadrangula y Clusia guatemalensis

Especie # de registro % de inhibición

Clusia quadrangula

Hoja

Látex

Fruto fase aceitosa

Fruto fase líquido

134789

52.45± 8.6

sin actividad

52.79± 10.53

41.8± 18.47

Clusia guatemalensis

Hoja

134795

32.8

*Promedio de tres réplicas ± desviación estándar.

Los extractos de hoja Clusia quadrangula presentaron un porcentaje de inhibición de la

PT del 19.18%. Los extractos de hoja Clusia guatemalensis inhibieron la enzima en un

9.4%.

9.1.3 Cuadro 7: Porcentaje* de inhibición de los ex tractos de Clusia quadrangula

y Clusia guatemalensis sobre la proteasa del VIH-1

Especie

Hoja

# de registro

% de inhibición

Clusia quadrangula

134789

17.1± .8

Clusia guatemalensis

134795

16.34±. 2

*Promedio de tres réplicas ± desviación estándar

44

10.1 Discusión

Nuestros resultados muestran que la fracción A del extracto de Clusia guatemalensis

contiene tres compuestos principales el triterpeno α-Amirina, el alqueno 9-hexacoseno y

el ácido palmítico. El primer compuesto α-Amirina se aisló de la cutícula de Clusia

multiflora tanto de ejemplares masculinos como femeninos (Medina et al, 2004).También

se ha encontrado en Clusia eugenioides (Gonzaléz et al, 1988). Se ha reportado que la

α-Amirina aislada de Coleus parvifolius posee propiedades anti VIH-1 inhibiendo a la

integrasa viral con un IC50 de 100 μM (Tewtrakul et al, 2003).Los triterpenos son

compuestos químicos que atraen mucha atención debido a sus actividades biológicas. Se

encuentran ampliamente distribuidos en todo el reino vegetal, con más de 40,000 mil

moléculas aisladas. Su importancia ecológica radica en que son los responsables del olor

y sabor de las plantas; ambas características son esenciales para la polinización y

dispersión de semillas (Ávalos et al, 2009).

Con relación al 9-hexacoseno (C26H52), en el 2004 Boom y colaboradores obtuvieron de

las cutículas de las hojas de Clusia rosea y de Clusia multiflora una gran cantidad de

alcanos y alquenos, con un número total de carbonos que va desde los 7 hasta los 33. La

presencia de estos compuestos en la cutícula, puede deberse, a la adaptación de estas

especies a climas secos y al metabolismo CAM. Para Clusia guatemalensis no se han

realizado estudios de esta índole.

Por último, se encontró, el ácido palmítico el cual es un metabolito abundante en plantas y

animales. Se ha reportado en las flores del género Clusia, como componente mayoritario

(Porto et al, 2000). Es el principal componente de la membrana celular además de ser

precursor de la Acetil Coenzima A clave en la biosíntesis de ácidos grasos y de

aminoácidos (Marks et al, 2009).

De las fracciones B y C de Clusia guatemalensis se obtuvo el triterpeno 3-β-friedelanol

que ya se ha reportado para Clusia minor y Clusia ellipticifolia Cuatr. de Colombia

(Salama, 1993). El 2,6,10,14,18-pentametil-2,6,10,14,18-eicosapentaeno ha sido aislados

del extracto metanólico de la especie vegetal Labisia pumila de la familia Primulaceae

(Karimia et al , 2011) para Clusiaceae no ha sido reportado.

45

De los compuestos volátiles de la drupa de Clusia lundellii se aisló aromadendreno un

sesquiterpeno previamente aislado de las flores de Clusia pernambucensis, Clusia

hilariana y Clusia lanceolata (Nogueira, 1999). También ha sido reportado para Garcinia

buchanni y Garcinia eugenifolia especies pertenecientes a la familia Clusiaceae (Salama,

1993). Éste mismo triterpeno se encontró en el aceite esencial de Eucalyptus globulus de

la familia Myrtaceae, como compuesto mayoritario y presento actividad antibacterial

contra Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis (Mulyaningsih et al, 2010).

El isoprenoide cariofileno obtenido de la drupa de Clusia lundellii también fue aislado de

las flores de Clusia grandiflora, Clusia renggerioides, Clusia burchelli,Clusia

pernambucensis,Clusia weddelliana,Clusia parviflora,Clusia flava, Clusia hilariana y Clusia

lanceolata. En otro estudio, se encontró en Clusia octopetala de Colombia (Fárfan et al,

1998). El cariofileno, ha sido probado contra el protozoario Leishmania amazonensis con

un IC50 de 2.9  µg/mL (Soares et al, 2013).

El 1-metil-4-(1,2,2-trimetilciclopentil)- benceno se reportó en el aceite esencial de

Euphorbia macrorrhiza de la familia Euphorbiaceae, dicho extracto tiene propiedades

antitumorales y antimicrobiales (Lin et al, 2012).

Por último, se encontró un sesquiterpeno cicloisolongifoleno, previamente aislado de

Eucalyptus meliodora (Ntalli, 2010). También se ha aislado de Passiflora galbana y

Passiflora mucronata. Se encontró como componente mayoritario del aceite esencial de

Curcuma aeruginosa de la familia Zingiberaceae con una actividad antibacterial menor al

50% de inhibición (Kamazeri et al, 2012).Dicho compuesto no ha sido reportado para el

género Clusia (Galarda et al, 2001).

Los porcentajes de inhibición de la RT obtenidos en el presente trabajo para Clusia

guatemalensis y Clusia quadrangula del 32% y del 52% respectivamente, no coinciden

con los reportados por Huerta-Reyes en el 2004 donde la enzima se inhibió en más del

70%. Dichas diferencias podrían deberse a diferencias químicas entre zonas y fechas de

colecta. En nuestro caso Clusia guatemalensis fue colectada en Oaxaca, mientras que

Huerta Reyes et al, obtuvieron su material de Chiapas. En el caso de Clusia quadrangula

ambas fueron colectadas en la Sierra Juárez, Oaxaca, pero en fechas diferentes. Cabe

señalar que Huerta Reyes et al encontraron que la actividad inhibitoria del extracto de

Clusia quadrangula disminuyó notablemente al remover del extracto los taninos y otros

46

polifenoles, mediante una columna de poliamida (Huerta-Reyes et al, 2004) (Huerta-

Reyes et al,2004).

Los porcentajes de inhibición obtenidos para la proteasa del VIH en este estudio fueron

del 19.18% para el extracto de las hojas de Clusia quadrangula y de 9.34% para Clusia

guatemalensis. Estos porcentajes son bajos comparados con los resultados obtenido por

Magadula y Tewtrakul 2004 para otra especie de Clusiaceae, Garcinia semseii, donde

encontraron una reducción enzimática del 84.8% para el extracto de hoja y del 85% para

los extractos de tallo, ambos a una concentración de 100 μg/mL.

11. 1 CONCLUSIONES

- De las hojas de Clusia guatemalensis se identificaron los metabolitos secundarios: 3-β-

friedelanol, el 2,6,10,14,18-Pentametil-2,6,10,14,18-eicosapentaeno y el ácido palmítico.

-También se identificó: el triterpeno α-Amirina, el alqueno 9-hexacoseno y por último el

ácido palmítico. Concluyendo que el ácido palmítico es el metabolito más abundante para

esta especie.

- Los compuestos volátiles identificados de la drupa de Clusia lundellii fueron los

sesquiterpeno aromadendreno y cicloisolongifoleno y el isoprenoide cariofileno

-El extracto de hoja Clusia guatemalensis presentó una actividad inhibitoria moderada, del

32% sobre la enzima RT.

-Los extractos de la hoja de Clusia quadrangula presentaron un porcentaje de inhibición

de la RT del 52% al igual que el extracto acuoso de la drupa. La fase líquida del extracto

de la drupa tuvo un porcentaje de inhibición del (41%). El látex extraído de la drupa no

presentó actividad contra la RT.

-Los extractos de hoja de Clusia quadrangula presentaron un porcentaje de inhibición

contra la enzima proteasa del 19.18%, mientras que el extracto de Clusia guatemalensis

inhibió la enzima en un 9.4%.

-La moderada actividad inhibitoria de los extractos de Clusia guatemalensis y Clusia

quadrangula contra la enzima transcriptasa reversa, apoyan la hipótesis acerca de que la

familia Clusiaceae contiene metabolitos secundarios que pueden servir como una fuente

de productos naturales con actividad anti VIH-1.

47

-Los extractos presentaron baja actividad inhibitoria para la enzima proteasa del VIH-1.

11.2 Perspectivas

-Por su gran similitud morfológica, por su cercana distribución ecológica y por su escaso

estudio, es necesaria una revisión taxonómica del género con el fin de resolver problemas

de identificación.

- Impulsar la conservación y propagación de la familia Clusiaceae como fuentes de

antiretrovirales.

-Los estudios con la familia Clusiaceae deben de continuar ya que su actividad

farmacológica contra las tres enzimas del VIH-1 se ha demostrado en diversos estudios.

48

12. 1 BIBLIOGRAFÍA

1. Akihisa, T. et al.1999.; Nihon Yukagakkaishi, 48, 1303-1306; CA, 132,178041w.

2. Ávalos,Garcia, A.Pérez Urria E. 2009.Metabolismo secundario de plantas. Reduca (Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2 (3): 119-145

3. Boom,J,S. Sinninge Damsté,J.W de Leeuw.2004. Cutan a common aliphatic

biopolymer in cuticles of drought-adapted plants, En: A. Boom; Geochemical study of lacustrine sediments: towards palaeo-climatic reconstructions of high Andean biomes in Colombia. University of Van Amsterdam-IBED, 2004, p-p 103-113.

4. CENSIDA/Secretaría de Salud, El VIH SIDA en México 2011

5. Chen SX, Wan M, Loh BN.1996.Active constituents against HIV-1 protease

from Garcinia mangostana. Planta Med.62:381-2.

6. De Clercq E.1993.Anti-HIV agents interfering with the initial stages of the HIV replicative cycle. En: Morrow WJW, Haigwood NL, eds. HIV. Molecular Organization, Pathogenicity and Treatment. The Netherlands. Elsevier: 267-292.

7. Dharmaratne HRW, Tan GT, Marasinghe GPK, Pezzuto JM.2002. Ihibition of HIV-1 reverse transcriptase and HIV-1 replication by Callophylum coumarins and xanthones. Planta Med, 68:86-87.

8. Farfan M, Martinéz E, Monache F.1998.Nota breve: Metabolitos secundarios presentes en los frutos de Clusia octopetala.Cuatr. Revista Colombiana de Química,Volumen 27. No.2, 87-89.

9. Fricke, C. et al.1995. ((+)-β-Caryophyllene),Phytochemistry, 39, 1119

10. FullerR,Westergaard,C,Collins,J,Cardellina,II,Michael,R.1999.Boyd.Vismiaphenones D-G, New Prenylated Benzophenones from VismiaCayennensis, J. Nat. Prod. 62, 67-69.

11. Galarda I, Trigo J, Sazima M.2001.The role of nectar production, flower pigments

and odour in thepollination of four species of Passiflora (Passifloraceae) in south-easter Brazil. Botanical Journal of the Linnean Society ,136: 139–152

12. Gentry, A. H. 1993. A Field Guide to the Families and Genera of Woody Plants of Northwest South America (Colombia, Ecuador, Peru) with supplementary notes on herbaceous taxa. The University of Chicago Press, Chicago.

49

13. Gustafsson H.G, Klaus Winter, Volker Bittrich.2007. Diversity,Phylogeny and Classification of Clusia. En: U.Lüttge (Ed.) Clusia:A Woody Neotropical Genus of Remarkable Plasticity and Diversity Ecological Studies,Vol. 194, Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

14. Hochwallner H,Vogel S, Huber W, Hammel E., Weber A.2011.Aspects of reproductive ecology of Clusia valerioi Standl.and Clusia peninsulae Hammel (sp. nov.), two Central American species of Clusiaceae with resin flowers.Plant Biology ISSN 1435-8603.

15. Huerta-Reyes M, Basualdo M del C, Abe F, Jimenez-Estrada M, Soler C, Reyes Chilpa R. 2004.HIV-1 inhibitory compounds from Calophyllum brasiliense leaves. Biol Pharm Bull. Sep; 27(9):1471-5.

16. Huerta-Reyes M, Basualdo M del C, Lozada L, Jimenez-Estrada M, Soler C, Reyes C R. 2004.HIV-1 inhibition by extracts of Clusiaceae species from Mexico.

Biol Pharm Bull. Jun; 27(6):916-20 Huerta-Reyes M.2004.Evaluación de la actividad inhibitoria de metabolitos secundarios de Clusiaceae mexicanas sobre el VIH-1. Tesis,UNAM. Kamazeri TS, Samah OA, Taher M, Susanti D, Qaralleh H.2012. Antimicrobial activity and essential oils of Curcuma aeruginosa, Curcuma mangga, and Zingiber cassumunar from Malaysia.Asian Pac J Trop Med.Mar;5(3):202-9. Karimi E, Jaafar H. 2011. HPLC and GC-MS, determination of bioactive compounds in microwave obtained extracts of three varieties of Labisia pumila Benth. Molecules. Kashman Y, Gustafson K.R; Fuller R, W; Cardellina J H; McMahon J,B; Currens M.J. Buckheit R. W; Hughes S, H; Cragg G. m. and Boyd M. R. 1992. The calanolides , a novel HIV-inhibitory class of coumarin derivates from the tropical rainforest tree, Calophyllum lanigerum. J Med Chem. Jul 24; 35(15):2735-43.

17. Kostova I, Raleva, P. Genova, R. Argirova.2005.Recent advances in the discovery

and development of plant-derived natural coumarins and their analogues as anti-human immunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) agents. Biotechnol. & Biotechnol.

18. Krishnaveni M. 2012.Medicinal plants -A boon for HIV/AIDS.Journal of Pharmacy Research, 5 (12), 5367-5379.

50

19. Laure F, Butard JF, Gaydou EM.2008.Screening of anti HIV-1 inophyllums by HPLC-DAD of Calophyllum inophyllum leaf extracts from French Polynesia islands. Anal Chim Acta, 624 (1): 147-153.

20. Luciw, P. A.1996. Human Immunodeficiency Viruses and their replication. En: Virology (eds.B.N. Fields, D.M. Knipe & P.M. Howley), Vol. Two. USA: Lippincott-Raven Publishers.

21. Magadula Joseph J., Tewtrakul Supinya .2010. Anti-HIV-1 protease activities of

crude extracts of some Garcinia species growing in Tanzania. African Journal of Biotechnology Vol. 9 (12), pp. 1848-1852.

22. Maguire B.1979 .On the Genus Clusia (Clusiaceae) in Mexico.Taxon; 28(1,2/3):13-18.

23. Marks A, Lieberman M.2009.Mark’s Basic Medical Biochemistry. Lippincott

Williams & Wilkins,2°edición, Baltimore.

24. Masullo M, Bassarello C, Bifulco G,.2009.Piacente S.Polyisoprenylated benzophenone derivatives from the fruits of Garcinia cambogia and their absolute configuration by quantum chemical circular dichroism calculations.

25. Matallana G,2 Wendt, Dorothy S, Araujo D, Scarano.2005.High abundance of dioecious plants in tropical coastal vegetation. American Journal of Botany 92(9): 1513–1519.

26. Medina E, Aguiar G, Gómez M, Medina D.2004.Patterns of Leaf epicuticular waxes

in species of Clusia taxonomical implications.Interciencia, octubre, año/vol.29, 10, pp.579-582.

27. Mulyaningsih S, Sporer F, Zimmermann S, Reichling J, Wink M.2010. Synergistic

properties of the terpenoids aromadendrene and 1, 8-cineole from the essential oil of Eucalyptus globulus against antibiotic-susceptible and antibiotic-resistant pathogens. Phytomedicine.Nov; 17(13):1061-6.

28. Nogueira P, V.Bittrich, G.Sheperd, A.Lopes, A.Marsaioli.1999.The ecological and

taxonomic importance of flower volatiles of Clusia species (Guttiferae), Phytochemistry 56, (2001), 443-452.

51

29. Ntalli N, Ferrari F, Giannakou I,Menkissoglu-Spiroudi Urania.2010.Synergistic and antagonistic interactions of terpenes against Meloidogyne incognita and the nematicidal activity of essential oils from seven plants indigenous to Greece. Pest Manag Sci 2011; 67: 341–351

30. P a t i l , A D , F r e y e r , A . J , E g g l e s t o n , D . S , H a l t i w a n g e r , R . C , B e a n ,M . F , T a y l o r , P . B , Caranfa, M. J,Breen, A. L,Bartus, H. R. 1993 The inophyllums, novel inhibitors of HIV-1reverse transcriptase isolated from the Malaysian tree,Calophyllum inophyllum Linn. J. Med. Chem., 36 :4131–4138.

31. Pirrone V, Thakkar N, Jeffrey M. Wigdahl B, Krebs. F.2011 Combinatorial Approaches to the Prevention and Treatment of HIV-1 Infection. Antimicrob, Agents Chemother.55 (5):1831.

32. Porto A, Machado , Oliveira C,Bittrich V, Amaral M, Marsaioli A. Polyisoprenylated

benzophenones from Clusia floral resins. Phytochemistry,Volume 55, Issue 7, December 2000, Pages 755–768.

33. Raulin J. 2002. Human immunodeficiency virus and host cell lipids. Interesting

pathways in research for a new HIV therapy. Prog Lipid Res 41:27-65.

34. Rajandeep Kaur and Rajeev Kharb. 2011. Anti-hiv potential of medicinally important plants. International Journal of Pharma and Bio Sciences; 2(3): 387-398.

35. Reyes R, Huerta-Reyes M, 2009.Compuestos naturales de plantas de la familia Clusaciaceae: Inhibidores del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1.Interciencia vol.34, N°6.

36. Rukachaisirikul V, Pailee P, Hiranrat A, Tuchinda P, Yoosook C, Kasisit J, Taylor WC,Reutrakul,V.2003.Anti-HIV-1protostane,trirterpenesand digeranylbenzophenone from trunk bark and stems of Garcinia speciosa.Planta Med, 69, 1141-1146.

37. Salama, A.1993. Aislamiento de Friedelina y Friedelinol de la corteza de Clusia ellipticifolia Cuatr.Universidad de Colombia.

38. Sierra S, Kupfer B, Kaiser R.2005. Basics of the virology of HIV-1 and its

replication. J.Clin.Virol.34:233-244.

52

39. Sigh IP y Bodiwala HS. 2010. Recent Advances in anti-HIV natural products. Nat.

Prod. Rep.27:1781-1800.

40. Soares DC, Portella NA, Ramos MF, Siani AC, Saraiva EM.2013.Trans- β -

Caryophyllene: An Effective Antileishmanial Compound Found in Commercial Copaiba Oil (Copaifera spp.) Evid Based Complement Alternat Med:761323.

41. Stanley, P, Steyermark J.1946.Flora of Guatemala, University of Illinois Urbana-

Champaign.

42. Perera, LM. 2007. Mecanismos de acción de compuestos antivirales aislados en plantas: el Virus de la Inmunodeficiencia Humana como modelo. Academia biomédica digital. Julio-Septiembre,N°51.

43. Piccinelli A, 2005. Structural revision of clusianone and 7-epi-clusianone and anti-HIV activity of polyisoprenylated benzophenones.Elsevier:8206-8211.

44. Porto, A. L. M.; Machado, S. M. F.; Oliveira, C. M. A. de; Bittrich, V.; Amaral, M. do C. E.; Marsaioli, A. J.2000.Polyisoprenylated benzophenones from Clusia floral, Phytochemistry Vol. 55 No. 7 pp. 755-768

45. Tandon, V.K.2005.Current status of Anti-HIV agents.Curr.Med.Chem.-Anti-Infective Agents, 3-28.

46. T.B. Ng, B. Huang, W.P. Fong, H. W. Yeung.1997. Anti-human immunodeficiency virus (anti-hiv) natural products with special emphasis on HIV reverse transcriptase inhibitors, Life Sciences, Vol. 61, No. 10, 933-949.

47. Tewtraku, S.Miyashiro, H, Nakamura, N.2003.HIV-1integrase inhibitory substance

from Coleus parvifolius. Phytotherapy Research, Vol 17, Issue 3, pages 232-239, March.

47. Vaasen A, Begerow D, Lüttge U, Hampp R.2001. The Genus Clusia L: Molecular

Evidence for Independent Evolution of Photosynthetic Flexibility. Plant biol. 4

53

Anexos

Figura 19a: Espectro de Masas (Experimental) del co mpuesto con TR de 20.97 la fracción A correspondiente al ácido palmítico

54

Figura 19 b: Espectro de Masas (Base de Datos) del ácido palmít ico

Figura20a: Espectro de Masas (Experimental) del com puesto con TR de 34.07 la fracción 1-8 la alfa-amirina

Figura20b: Espectro de Masas (Base de Datos) de la alfa-amiri na

55

Figura21 a: Espectro de Masas (Experimental) del co mpuesto con TR de 33.08 la fracción 1-8 el 9-hexacoseno

Figura 21b:Espectro de Masas (Base de Datos) del 9 - hexacoseno

56

Fig.22a: Espectro de Masas (Experimental) del compu esto con TR de 29.23 fracción B y C

Fig.22 b: Espectro de Masas (base de datos) del com puesto con TR de 29.23

57

Fig.23 a: Espectro de Masas (Experimental) del comp uesto con TR de 37.36 correspondiente al 3- β-friedelanol.

Fig.23 b: Espectro de Masas (base de datos) del com puesto con TR de 37.36 correspondiente al 3- β-friedelanol.

58

Figura 24a: Espectro de Masas (Experimental) del co mpuesto con TR de 37.54

correspondiente al 2,6,10,14,18-Pentamethyl-2,6,10, 14,18-eicosapentaene

Figura 24b: Espectro de Masas (Base de datos) del c ompuesto con TR de 37.54

correspondiente al 2, 6, 10, 14,18-Pentamethyl-2, 6, 10, 14,18-eicosapentaene

59

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 91

69 133 161

189

Peak True - sample "OT8110-CLUSIA-SP:1", peak 1, at 501.478 s

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 41

91

67 161 133 204 175

Library Hit - similarity 919, "Aromadendrene"

Fig.25.Espectro de masas experimental y teórico con un RT de 501.478 perteneciente al

Aromadendreno.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 91

133 69

161 189

Peak True - sample "OT8110-CLUSIA-SP:1", peak 2, at 509.078 s

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 93 133

41 69

120 55 161 189 27

Library Hit - similarity 970, "á-Caryophyllen"

Figura26:Espectro de masas experimental y teórico c on un RT de 509.078 perteneciente al Cariofileno

60

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 91 133

189 79

55 119 204

161

Peak True - sample "OT8110-CLUSIA-SP:1", peak 5, at 528.328 s

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 91

189 105

133 41 161 204 77

Library Hit - similarity 857, "Cycloisolongifolene"

Figura27: Espectro de masas experimental y teórico con RT de 528.328 perteneciente al Cicloisolongifolene

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 132

105 55

145 202

Peak True - sample "OT8110-CLUSIA-SP:1", peak 8, at 532.428 s

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

1000 119

41 105 202 145 69

Library Hit - similarity 906, "Benzene, 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl-"

Figura28: Espectro de masas experimental y teórico con RT de 532.428 perteneciente al 1-metil-4-(1,2,2-trimetilciclopentil)- benceno