2004_Biomedica_244

ISSN 0120-4157

BiomédicaRevista del Instituto Nacional de Salud

Volumen 24, No. 4 - Diciembre, 2004

Bogotá, D. C., Colombia, S. A.

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Portada: Reloj de flores, Instituto Nacional de SaludBogotá, D. C., Colombia

Carlos Arturo Hernández,Grupo de Publicaciones, Instituto Nacional de Salud

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Biomédica Instituto Nacional de Salud

LEONARD MUNSTERMANN

Yale University School of MedicineNew Haven, CN, Estados Unidos

LUIS ALBERTO GÓMEZ

Instituto Nacional de SaludBogotá, D.C., Colombia

ANGELA RESTREPO

Corporación para Investigaciones BiológicasMedellín, Colombia

GUSTAVO VALBUENA

Universidad de los AndesBogotá, D.C., Colombia

EDITORES ASOCIADOS

ELIZABETH CASTAÑEDA, editora jefeInstituto Nacional de SaludBogotá, D.C., Colombia

RUBÉN SANTIAGO NICHOLLS, coeditorInstituto Nacional de SaludBogotá, D.C., Colombia

CARLOS ARTURO HERNÁNDEZ, editor ejecutivoInstituto Nacional de SaludBogotá, D.C., Colombia

COMITÉ EDITORIAL

Volumen 24, No. 4 - Bogotá, D.C., Colombia - Diciembre, 2004

RICARDO SÁNCHEZ

Universidad Nacional de ColombiaBogotá, D.C., Colombia

ÁLVARO SANABRIA

Pontificia Universidad JaverianaBogotá, D.C., Colombia

SECRETARIA DEL COMITÉ LINDA GRACE MOLANO

COMITÉ CIENTÍFICO

JUAN MANUEL ANAYA

Corporación para InvestigacionesBiológicasMedellín, Colombia

ANTONIO BERMÚDEZ


JORGE H. BOTERO

Universidad de AntioquiaMedellín, Colombia

VÍCTOR CÁRDENAS

University of TexasEl Paso, TX, Estados Unidos

ALBERTO CONCHA-EASTMAN

Organización Panamericanade la SaludWashington, D.C., Estados Unidos

ZOILO CUÉLLAR

Academia Nacional de MedicinaBogotá, D.C., Colombia

PATRICIA DEL PORTILLO

CorpogénBogotá, D.C., Colombia

FERNANDO DE LA HOZ

ColcienciasBogotá, D.C., Colombia

JORGE HERNANDO DONADO

Universidad Pontificia BolivarianaMedellín, Colombia

MARÍA CRISTINA FERRO


LUIS FERNANDO GARCÍA

Universidad de AntioquiaMedelín, Colombia

ALBERTO GÓMEZ


JOHN MARIO GONZÁLEZ

University of Southern CaliforniaLos Ángeles, CA, Estados Unidos

FELIPE GUHL


ANTONIO IGLESIAS


JORGE JARA

BID/Secretaría de SaludTegucigalpa, Honduras

ERNESTO JARAMILLO

Organización Mundial de la SaludGinebra, Suiza

JAIRO LIZARAZO

Hospital UniversitarioErasmo MeozCúcuta, Colombia

FIDIAS E. LEÓN-SARMIENTO

National Institutes of HealthBethesda, MD, Estados Unidos

JUAN GUILLERMO MCEWEN

Corporación para InvestigacionesBiológicasMedellín, Colombia

ALVARO MONCAYO


MARÍA TERESA OCHOA

University of California Los ÁngelesLos Ángeles, CA, Estados Unidos

BLANCA RESTREPO

University of TexasSan Antonio, TX, Estados Unidos

GERZAÍN RODRÍGUEZ


GUSTAVO ROMÁN

University of TexasHouston, TX, Estados Unidos

ALVARO RUIZ


NANCY GORE SARAVIA

CideimCali, Colombia

338

Instituto Nacional de Salud

La revista Biomédica del Instituto Nacional de Salud es una publicación trimestral, eminentemente científica. Estáamparada por la resolución número 003768 de 1981, emanada del Ministerio de Gobierno, y con tarifa postal reducidasegún resolución número 1128 del 5 de mayo de 1982.

Ninguna publicación, nacional o extranjera, podrá reproducir ni traducir sus artículos ni sus resúmenes sin previaautorización escrita del editor. Ni la revista, ni el Instituto asumen responsabilidad alguna por los puntos de vistaexpresados por los autores. La revista no publicará ningún tipo de propaganda comercial. Los nombres de equipos,materiales y productos manufacturados que eventualmente puedan mencionarse, no implican recomendación nipropaganda para su uso y sólo se mencionan como identificación genérica.

La revista Biomédica aparece reseñada en Index Medicus/Medline de la National Library of Medicine, en el índice dela Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), en el Sistema de Información Bibliográfica RegionalAndina (SIBRA), en CAB Abstracts, Review of Medical and Veterinary Entomology, y forma parte del Índice Nacionalde Publicaciones Seriadas Científicas y Tecnológicas Colombianas de Colciencias y del Índice Latinoamericano deRevistas Científicas y Tecnológicas (LATINDEX).

INSTITUTO NACIONAL DE SALUDAvenida Calle 26 No. 51-60Apartado aéreo 80334 y 80080Bogotá, D.C., Colombia, S.A.

URL: http://[email protected]

ROBERT TESH

University of TexasGalveston, TX, Estados Unidos

ORLANDO TORRES-FERNÁNDEZ


BRUNO TRAVI


JUAN MIGUEL VILLALOBOS

Universidade Federal de RondôniaPorto Velho, Brasil

JOHN WALKER


MOISÉS WASSERMAN


ENRIQUE WINOGRAD

University of CaliforniaIrvine, CA, Estados Unidos

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EditorialUna nueva reforma al sistema de servicios para la saludMauricio Restrepo ......................................................... 341

Imágenes en biomedicinaUn método cuantitativo para analizar redes neuronalesmarcadas por histoquímica para acetilcolinesterasaLuz H. Camargo, Manuel G. Forero,Ladys Sarmiento, María L. Caldas ................................ 345

Presentación de casosConidiobolomicosis: hallazgos histopatológicosJesús A. Pérez, Álvaro Correa, Jairo Fuentes,Esperanza Meléndez ..................................................... 350

Reseña históricaRaíces históricas, sociales y epidemiológicas de latuberculosis en Bogotá, ColombiaAlvaro Javier Idrovo ....................................................... 356

Artículos originalesImpacto de la enfermedad cardiovascular en los costosde hospitalización de pacientes con artritis reumatoideaRicardo Pineda-Tamayo, Giovanna Arcila,Patricia Restrepo, Juan Manuel Anaya ......................... 366

Frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientespositivos para VIH determinada por las técnicas deGram cromotropo rápido y PCRJorge H. Botero, Martha Nelly Montoya, Adriana LucíaVanegas, Abel Díaz, Luis Navarro-i-Martínez, FernandoJorge Bornay, Fernando Izquierdo, Carmen del Águila,Sonia del Pilar Agudelo ................................................... 375

Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826(Diptera: Culicidae) bajo condiciones no controladas enBogotáMyriam Janeth Salazar, Ligia Inés Moncada ................ 385

Contenido

Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes(Glucantime® y Pentostam®) en un modelo animal deleishmaniasis cutánea americana:aplicación de la luminometríaHéctor Hernán Henao, Yaneth Osorio, Nancy GoreSaravia, Arlen Gómez, Bruno Travi ............................... 393

La desnutrición proteica estimula la expresión dereceptores de la hormona del crecimiento en linfocitos Besplénicos de rataWilson Mejía-Naranjo, Myriam Sánchez-Gómez ......... 403

Comunicación breveEfecto del lipopolisacárido en cultivos de célulasdendríticas humanas y su inhibicion por la polimixina BAdriana Cuéllar, Ángela Fonseca, Alberto Gómez ....... 413

Revisión de temaTerapia combinada como estrategia en la prevención dela resistencia a los antimaláricosPamela Orjuela, Iveth González, Lyda Osorio ............. 423

Manipulación genética y el estudio del parásitoprotozoario LeishmaniaTania M. Cortázar, John Walker .................................... 438

Nota técnicaCultivos primarios de células endoteliales aisladasde cordón umbilical humano:un modelo biológico para el estudio de los mecanismosde infección por enterococosCarlos Andrés Chiriboga, Marta Raquel Fontanilla ....... 456

Carta al editor ................................................................ 464Fe de erratas

Índices ............................................................................ 465

Instrucciones para los autores

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EditorialA new reform of the national health systemMauricio Restrepo .......................................................... 341

Images en biomedicineA quantitative method for analysing neuron networksmarked by acetylcholinesterase histochemistryLuz H. Camargo, Manuel G. Forero,Ladys Sarmiento, María L. Caldas ................................. 345

Case presentationConidiobolomycosis: a case report withhistophathologic findingsJesús A. Pérez, Álvaro Correa, Jairo Fuentes,Esperanza Meléndez ...................................................... 350

HistoryHistorical, social and epidemiological roots oftuberculosis in Bogota, ColombiaAlvaro Javier Idrovo ........................................................356

Original articlesImpact of cardiovascular illness on hospitalizationcosts in patients with rheumatoid arthritisRicardo Pineda-Tamayo, Giovanna Arcila,Patricia Restrepo, Juan-Manuel Anaya .........................366

Frequency of intestinal microsporidian infections in HIV-positive patients, as diagnosis by quick hot Gramchromothrope staining and PCRJorge H. Botero, Martha Nelly Montoya, Adriana LucíaVanegas, Abel Díaz, Luis Navarro-i-Martínez, FernandoJorge Bornay, Fernando Izquierdo, Carmen del Águila,Sonia del Pilar Agudelo ....................................................375

Life cycle of Culex quinquefasciatus Say (Diptera:Culicidae) under uncontrolled conditionsMyriam Janeth Salazar, Ligia Inés Moncada .................385

Contents

Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials(Glucantime® and Pentostam®) in an Americancutaneous leishmaniasis animal model:luminometry applicationHéctor Hernán Henao, Yaneth Osorio, Nancy GoreSaravia, Arlen Gómez, Bruno Travi ................................393

Protein malnutrition up-regulates growth hormonereceptor expression in rat splenic B lymphocitesWilson Mejia-Naranjo, Myriam Sánchez-Gómez ...........403

Brief communicationEffect of lipopolysaccharides on human dentriticcell cultures and its inhibition by polymyxin BAdriana Cuéllar, Ángela Fonseca, Alberto Gómez ........ 413

Topic reviewCombination therapy as a strategy to preventantimalarial drug resistancePamela Orjuela, Iveth González, Lyda Osorio ..............423

Genetic manipulation of the protozoan parasiteLeishmaniaTania M. Cortázar, John Walker .....................................438

Technical notePrimary cultures of human vein endothelial cells: abiological model for studying enterococcal infectionmechanismsCarlos Andrés Chiriboga, Marta Raquel Fontanilla ........456

Letters to the editor ........................................................464Erratum

Indexes ............................................................................ 465

Author's instructions

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Biomédica Instituto Nacional de SaludVolumen 24, No. 4 - Bogotá, D.C., Colombia - Diciembre, 2004

Editorial

Una nueva reforma al sistema de servicios para la salud

Al menos tres preguntas básicas resultan pertinentes en relación con el proceso legislativo queactualmente se adelanta en el Congreso Nacional para reformar la Ley 100 de 1993. La primera, si esnecesaria una reforma. La segunda, que implica una respuesta positiva a la anterior, si es necesariauna reforma a la ley, o si las modificaciones que se requieren se pueden llevar a cabo mediantemandatos de menor jerarquía jurídica como decretos u otras reglamentaciones expedidas por el Ejecutivo.En caso de una respuesta positiva a la pregunta anterior, la tercera es si las propuestas de modificaciónsignifican avances teóricos y operativos frente a la legislación y al modelo vigente.

En relación con la primera pregunta, la respuesta parece ser positiva; diversos actores del sistema hanpresentado proyectos de ley para modificar el modelo vigente y con esta actuación están demostrandosu insatisfacción y su interés en que las cosas cambien. Se han presentado una serie de hechos quetienen como consecuencia un descontento, que parece generalizado, con el funcionamiento y losresultados que ha ofrecido el modelo de la Ley 100. Los diagnósticos que se ofrecen en las exposicionesde motivos de los distintos proyectos de reforma son poco precisos y no existe, para la mayoría de losproblemas argumentados, información sólida que permita identificar con exactitud los males que sevan a remediar. Como en todo proyecto, hay preocupaciones sectoriales que, pese a su legitimidad,pueden no coincidir con el bien público. Lo que se quiere poner de presente es que todavía estápendiente un proceso de evaluación, serio y objetivo, de los resultados de la Ley 100, y que la decisiónde modificar la ley debe obedecer a una identificación clara de los problemas que se deben corregir.

Las evidencias disponibles indican que existen problemas claros con la Ley 100 y sus resultados, unode los cuales es su insuficiente nivel de implementación. Los datos que existen indican que esteproceso anda por la mitad del camino. La segunda pregunta, entonces, plantea si se persevera en elproceso y se adoptan las disposiciones legales y operativas necesarias para acelerarlo, sin necesidadde modificar el marco legal vigente, o si, por el contrario, se da por fracasado el modelo y se busca unonuevo, o si se regresa al modelo anterior. Los proyectos de ley en discusión ofrecen una respuesta alsegundo interrogante, y las respuestas son diferentes en cada uno de ellos. Las modificaciones que seformulan van desde ajustes - más o menos sustantivos -, pasan por modificaciones que tienden a unregreso al pasado y llegan a propuestas de modelos completamente nuevos. En este punto, la diversidadde posturas, acorde con la proliferación de proyectos que, finalmente, se han reducido a dos ponencias,alude nuevamente a la falta de claridad en el diagnóstico y a la consecuente confusión en las propuestasde solución.

Dado que existe el sentimiento de la necesidad de modificar el modelo y de un cambio de índolelegislativo de la más alta jerarquía, quedaría por analizar si las propuestas de reforma ofrecen mejoresalternativas que la situación actual. Infortunadamente, la respuesta parece ser negativa; para sustentarla anterior afirmación es necesario recordar cuáles son los elementos básicos del modelo actual,ordenado por la Ley 100. Son dos los mecanismos que propuso la Ley 100 para generar unos atributosque son indiscutibles para un sistema de servicios de salud; en primer lugar, se propuso un sistema deseguro - seguro público en el caso del régimen subsidiado y seguro social en el caso del régimencontributivo - para financiar los servicios y para generar equidad. En segundo lugar, para generar eficienciay calidad, se propuso un mercado regulado de provisión de servicios, con competencia por precio entrelos distintos proveedores.

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Al estudiar los diversos proyectos de ley, en la mayoría de ellos no está claro si se pretende en formaexpresa y deliberada modificar estas columnas dorsales del modelo vigente; al proceder de esta manera,en algunos casos se desvirtúan los mecanismos mencionados y se da origen a propuestas absurdasdesde el punto de vista conceptual que, necesariamente, resultarán en operaciones inadecuadas y enel incumplimiento de los atributos deseables. En los otros casos, es decir, en los que se expresa y sepropone deliberadamente abandonar el seguro y la competencia, la alternativa propuesta no garantizaconceptualmente una mejor solución a los problemas actuales y tales conceptos desembocanineludiblemente en operaciones del sistema de salud que son reconocidamente inconvenientes. Lodicho hasta ahora no se debe interpretar como si fuera de los conceptos y la forma de operar delmodelo vigente no hay alternativas; sí hay alternativas, pero las ofrecidas en los proyectos de ley endiscusión no son ni teórica ni operativamente superiores a las vigentes. Esto es explicable dada ladeficiencia en el diagnóstico y los sesgos sectoriales que inspiran los diferentes proyectos de reforma.

Teniendo en cuenta las tres preguntas anteriormente enunciadas y las respuestas que les han dadodiferentes y muy importantes actores del sistema, parece válido plantear respuestas diferentes. Antesde hacerlo, vale la pena llamar la atención sobre el hecho de que el actor más importante del sistema,su razón de ser, que son los usuarios, está completamente ausente tanto en las propuestas como desu discusión. La primera respuesta diferente sería que no es necesaria ninguna modificación, ni legislativa,ni operativa; obviamente, tal respuesta resulta inadecuada dados los problemas y las percepcionesque de ellos tienen los diferentes actores del sistema. Si se acepta que se requieren modificaciones,¿sería posible lograrlas sin modificar la ley y, por tanto, el modelo? Habría razones de peso paracontemplar tal posibilidad: una de ellas es la inconveniencia de modificar el sistema de salud de unpaís cada década. A juicio de los expertos la implementación de una reforma es un proceso demoradoy costoso - se habla de diez a quince años- y no parece juicioso dar por fracasado un modelo cuandoni siquiera se ha implementado completamente. Otra razón es que resulta peligroso hacer modificacionesparciales que pueden surgir de presiones atadas a intereses sectoriales, entre ellas, la puja política,sacrificando la coherencia del modelo original.

Al revisar las exposiciones de los motivos de los diversos proyectos se pueden identificar, en formamás o menos precisa, ciertos problemas que justificarían las diversas modificaciones propuestas: losproblemas de cobertura - tanto en el aseguramiento como en los servicios de los planes debeneficios -, la crisis de los programas de salud pública, el papel dominante de los aseguradores, elproblema de la intermediación financiera, las limitaciones de información y la debilidad de los mecanismosde vigilancia y control; fenómenos de corrupción, de clientelismo, de ganancias excesivas por parte delos aseguradores y de crisis en el financiamiento de los hospitales públicos, de desmedro y envilecimientoen el ejercicio de las profesiones de la salud.

Al examinar los anteriores problemas, resulta claro que algunos obedecen al escenario social en dondeopera el modelo y no al modelo mismo, y que difícilmente podrían remediarse con su modificación; seestá apuntando a fenómenos como la corrupción, el clientelismo, los bajos niveles de capital social, lalenidad del sistema jurisdiccional con su secuela de impunidad, la incapacidad de gestión de ciertosactores. Problemas todos reales y graves que sólo pueden solucionarse con abordajes diferentes a unareforma al sistema de salud; problemas que afectarán por igual la operación de cualquier modelo. Amanera de ejemplo, si la corrupción, como infortunadamente ocurre en la realidad, es un problemaaltamente prevaleciente y difundido, de nada vale cambiar su sitio de posible acción.

Otros de los problemas mencionados no tienen como etiología el modelo de la Ley 100 sino que sonproblemas que la anteceden y que fueron en su momento motivos para cambiar de modelo; hay dosfenómenos que ejemplifican este tipo de problema: la mal llamada “crisis hospitalaria” y la crisis en lasacciones de salud pública. Según el diccionario, la palabra “crisis” se refiere a una mutación considerablee inconveniente de cierta circunstancia; así las cosas, resulta impropio hablar de crisis hospitalaria yaque el término trata de aludir a la situación financiera de los hospitales públicos que es un problema

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crónico y, además, una forma de funcionar las cosas que tiende a premiar la ineficiencia de algunos. Elproblema de fondo de los hospitales públicos - de algunos de ellos, porque existen los que funcionanbien - está por resolverse; hay algo erróneo en su naturaleza y en su funcionamiento que debe sermodificado. Y aunque este problema está mucho más relacionado con los diferentes posibles diseñosdel sistema de salud que los problemas que se mencionaron en el párrafo anterior, se debe aceptar queno existe ningún sistema de salud que funcione bien con hospitales mal concebidos y mal administrados,como lo son muchos de los hospitales de Colombia, cuya situación no se resuelve solamente conmayores apropiaciones presupuestales. De todas maneras, habrá hospitales que siempre deben serprotegidos en forma sistemática por el Estado, pero la protección a cualquier precio y como principioestá demostrado que no lleva a buenos resultados, que son los que requiere cualquier sistema desalud.

En cuanto a la crisis de las acciones de la llamada salud pública debe decirse algo análogo a lo que seha dicho de los hospitales. En primer lugar, debe aclararse el concepto para no caer en confusiones. Eltérmino apunta a políticas y acciones orientadas a prevenir la incidencia de enfermedades - presentaciónde casos nuevos - y a mejorar los niveles de la salud individual y colectiva. Así concebida, la saludpública en Colombia está en crisis, y es menester poner de presente que es un país con antecedentesilustres en este tema. ¿Será que esta desafortunada y grave situación obedece a un marco legislativoinadecuado y a un modelo de prestación de servicios no idóneo? O, ¿será que ha habido una grandebilidad en la formación de políticas e irresponsabilidad, incapacidad y negligencia en algunos de losactores encargados de tales acciones? Un ejemplo que ayudaría a contestar los anteriores interroganteses el de las acciones de inmunización, incluida la producción de los biológicos, tema en el cual hajugado un papel muy importante el Instituto Nacional de Salud.

A diferencia de lo que suele argumentarse en este momento, la verdad es que Colombia nunca hadisfrutado de un sistema para inmunizar a sus niños que sea satisfactorio; este hecho motivó en losaños ochenta la famosa estrategia de las jornadas de vacunación que, por su naturaleza, es remedial.Para mantener una adecuada cobertura de inmunización no debe ser necesario que las primeras damasu otros actores sociales desplieguen acciones espasmódicas que no garantizan la sistemática aplicaciónde una acción que debe ser permanente y automática. Dentro del modelo de la Ley 100 es perfectamenteposible lograr niveles de inmunización adecuados y cada vez mejores si hubiera claridad y liderazgofuerte por parte del rector del sistema. ¿Quién puede garantizar que al cambiar la ley pero con lapermanencia de los mismos entes rectores e igual capacidad de liderazgo se logre una solución a esteproblema?

Se mencionó al Instituto Nacional de Salud y, de nuevo, vale preguntarse si un cambio de ley modificaríasu capacidad para cumplir con sus delicadas funciones, entre las cuales está la de producir vacunas yotros biológicos. Algún día, alguien con suficiente capacidad tendrá la oportunidad de revisar, de nuevoa manera de ejemplo, la historia de la producción de la vacuna antiamarílica de la cual conocemosepisodios aislados; es una historia de un propósito nacional que se logró con el mejor de los éxitos yque luego se abandonó, y fue víctima de los malos administradores del Instituto y de la miopía degobiernos e instituciones como el ministerio de Salud y Planeación Nacional. ¿Será que una nueva leysalva los anteriores problemas?, o ¿será que con la ley vigente y una nueva visión y diligencia podríanconseguirse los logros deseados?

También, a propósito del Instituto, es interesante anotar cómo algunos proponentes de reformas hancaído en la cuenta de su existencia y de su importancia. Ojalá este renacido interés, lastimosamenteun poco a destiempo, sirva para brindarle al Instituto y a sus trabajadores el apoyo y el estímulo que através del tiempo se ha ido perdiendo, entre otras cosas porque han aparecido sabios que para medraren sus propósitos han acudido al expediente de desprestigiar a entidades y personas meritorias. Creoque el Instituto no necesita de nuevas leyes para cumplir con sus funciones; necesita con urgenciaenriquecer la condición sine qua non para su existencia y adecuado desempeño que son personas

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capacitadas y con motivación; necesita también recursos financieros y, para conseguir lo anterior, nose requieren nuevas leyes.

Finalmente, hay en las exposiciones de motivos de los proyectos de reforma los problemas que atañenal modelo mismo y, muy particularmente, al régimen subsidiado. En este punto se detecta un problemacrucial: la existencia o no de un seguro de salud para los más pobres. Es uno de los puntos donde másimpera la confusión conceptual a la que se aludió en el principio de este escrito y que puede llevar asoluciones que representan un retroceso social importante. Si se acepta el mecanismo de seguro, quepuede considerarse como uno de los progresos importantes que implica el modelo de la Ley 100, esindispensable la existencia de una instancia aseguradora que, entre otras funciones, desempeñe lasde asumir y administrar el riesgo, y la otra muy importante de organizar la demanda de servicios porparte de sus afiliados. Las ARS son las instancias encargadas de estas importantes funciones queson nuevas en el país y cuyo cumplimiento cabal significaría una modificación sustancial en el estadode salud de los colombianos y en la calidad y eficiencia de los servicios.

Hay una clara tendencia en los proyectos de reforma para eliminar las ARS, por el hecho de quemuchas de ellas no cumplen con sus funciones o porque las desempeñan mal. ¿Por qué no se mira alas que han sido exitosas? Y, ¿por qué en lugar de desaparecerlas no se las controla como es el deberdel Estado? Lo que podría suceder es que los pobres de Colombia pierdan un mecanismo que lesgarantiza, como ciudadanos, el acceso a los servicios de salud y que, además, les provee el bieninestimable de la seguridad; en este punto crucial, tal vez sin darse cuenta y por motivos diferentes,están coincidiendo peligrosamente los extremos del espectro político colombiano para echar haciaatrás una ganancia social del país.

En resumen, esta exposición aspira a llamar a una reflexión muy cuidadosa de quienes son responsablesde cambiar y expedir nuevas leyes y de quienes tienen la capacidad de presionar e influir este proceso.Este llamado es especial a la burocracia del ejecutivo que es, en teoría, la personera del bien común yde los usuarios. El llamado es a pensar si una nueva ley es necesaria, si es conveniente el cambio delmodelo o, por el contrario, unos ajustes precisos pero parciales y, sobre todo, si una mejor gestión yliderazgo serían el mejor remedio a los males que están claramente establecidos. Y otro llamado quequiere interpelar especialmente a la Academia: es indispensable un mejor diagnóstico y para ello esnecesaria más investigación. El precisar mejor los problemas hará mucho más fácil y segura su solución.

La visión hasta aquí expuesta no quiere atribuirle a la Ley 100 de 1993 un carácter sagrado e inmutable.Los sistemas de salud son cuerpos conceptuales que tienen que adaptarse permanentemente asituaciones complejas y dinámicas y que requieren continuas readecuaciones. Hay, sin duda, cambiosque se deben hacer, pero consideramos que, en este momento, no requieren una discusión y modificacióndel modelo, sino mutaciones de menor jerarquía. Decía el sabio Aristóteles, hace ya mucho tiempo,que más vale una mala ley estable que leyes buenas que están cambiándose. Y dice la sabiduríapopular que toda situación por mala que sea es susceptible de empeorar. Es la esperanza de quien estoescribe que el proceso al que se ha venido refiriendo no vaya a ser causa de nuevos problemas y queno surja de él un esperpento conceptual; el temor de que esto suceda tiene sus fundamentos y estarámuy feliz de que en el futuro los hechos demuestren que se equivocó en sus argumentaciones actuales.

Mauricio Restrepo Trujillo

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Biomédica 2004;24:345-9 NEURON NETWORKS MARKED BY ACETYLCHOLINESTERASE

Correspondencia:María Leonor Caldas, Avenida calle 26 N° 51-60, Bogotá,D.C., Colombia.Teléfono: 220 7700, extensión 453; fax: 220 1093mcaldas@ ins.gov.co

Recibido: 08/08/03; aceptado: 11/08/04

IMAGES IN BIOMEDICINE

A quantitative method for analysing neuron networksmarked by acetylcholinesterase histochemistry

Luz H. Camargo 1, Manuel G. Forero 2, Ladys Sarmiento 1, María L. Caldas 1

1 Unidad de Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.2 Grupo Ohwaha, Departamento de Ingeniería de Sistemas, Universidad Nacional, Bogotá, D.C., Colombia.

Enzyme histochemistry is frequently used in classical morphological studies for the qualitativeanalysis of neuronal networks. However, this procedure does not readily provide quantitativeresults. Two new alternative approaches based on digital image processing techniques wereexplored and the data quality compared. The preliminary results explored the feasibility ofthese approaches in the applied setting.

Key words: image analysis, morphometry, composition, histochemistry, neuronal networks.

Un método cuantitativo para analizar redes neuronales marcadas por histoquímica paraacetilcolinesterasa

El análisis cualitativo de las redes neuronales por histoquímica enzimática se usa comúnmenteen los estudios morfológicos tradicionales. Una limitante de este tipo de estudios consiste enla dificultad de obtener resultados cuantitativos. Este artículo presenta dos técnicas originalesde procesamiento de imágenes para realizar estudios cuantitativos y un análisis comparativoentre ellas. Los resultados preliminares presentados permiten verificar la utilidad de lametodología aplicada.

Palabras clave: análisis de imágenes, morfometría, composición, histoquímica, redesneuronales.

Quantitative morphological studies are currentlybeing carried out in biological sciences. However,they are time-consuming and need a fair level ofexper tise in handling them. Digital imageprocessing techniques have been employed whenanalysing biomedical samples in an attempt tosolve this kind of problem; they also enableimproving characteristics of images of interest,more information thus being obtained from them.

The difficulty of obtaining morphometric data fromtissue samples from different focal planes appearswhen analysing enzymatic histochemistry multi-focal images. Immunohistochemical andcytochemical techniques are par ticularlyemployed in neuron network studies. Samples are

analysed by observing a sample's first plane andverifying whether it is positive for the marker used.In the case of enzyme histochemistry, a sample'sneurons of interest are stained for identifying theirramifications (1-3), thus obtaining morphologicalinformation about stained neurons and thedistribution of their ramifications.

One of the greatest difficulties regarding thisprocedure is tracing the ramifications' pathwaythrough the different planes. This is because aramification's position may change considerablybetween each plane and reference points cannotbe established for following them. It thus becomesdifficult to obtain morphometric data from theregions of interest, such as their area and numberof ramifications. Image processing can be usedfor solving this kind of problem; this paper presentsa new procedure aimed at doing so, which employsimage superimposition and colour equalisationtechniques. The method is applied on imagescaptured from different focal planes for obtaining

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Biomédica 2004;24:345-9CAMARGO L.H., FORERO M.G., SARMIENTO L., CALDAS M.L.

a complete image of the microscopic field wherethe object of interest is present.

A 50 to 100 µm thick rat brain vibratome slicewas used for developing the proposed method.The section was positive for an acetyl-cholinesterase (Ach) reaction. This reaction wasdemonstrated by the presence of dark-brownstained neuron ramifications as can be seen infigure 1. Four of the slide's fields were observedby light-microscope (Zeiss Axiophot) and threeimages from each field were captured,corresponding to three different focal planes. ACCO Iris/RGB video camera, coupled to themicroscope and connected to a personal computer,was used for image acquisition. Ramifications oftheir pathways were drawn with Microsoft Paintsoftware. KS300 (Kontron Elektronik System) (4)and Ohwahalmagen (Universidad Nacional deColombia's Ohwaha Research Group) (5) softwarewere used for developing the methodology. Figure 1

presents the original images employed indeveloping the technique.

Two techniques were developed for tracing neuronramifications through different planes. Their maindifference consisted of the original imageremaining unmodified in the first whilst colourinformation was modified for emphasising thestructures in the images in the second.

First technique

This technique was developed using KS300software. A composite operation was initiallycarried out for following the path through differentimages (6). Composition techniques allowedimages to be superimposed for integrating theminto just one where transparencies and differentdispositions from each image could be observed(7). The composite image technique allows acomposite image of several images to be formedby giving a new value to each pixel (i.e., piece of

Figure 1. Three different focal planes from the same ratbrain field were stained using acetylcholinesterasehistochemistry; bar length = 50 µm.Dark brown neuron ramifications demonstrate that tissuewas positive for an acetylcholinesterase reaction.

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information). This value (denominated alpha ortransparency channel) changes from zero (0) toone (1), where zero indicates a totally transparentimage and one an image which is totally opaque.The opacity of each image thus becomes modifiedby giving its transparency channel a value ofa=0.5; an OVER composite image operation is thencarried out. The result is shown in figure 2A. Thestained neuron ramifications were then manuallydelineated in black, using the mouse and a lightpen as shown in figure 2B. The colour image thusbecame monochromatic once it had beenbinarised. Thresholding methods binarise an imagewithin regions according to a grey level used asthreshold (7); in this case, the low and highthreshold values were 0.0 (red), 2.255 (green) and0.255 (blue) according to the channels of the RGBcamera used. Pixels below the threshold(belonging to the background) thus became whiteand pixels above the threshold (belonging to the

Figure 2. Sequence of images resulting from applying thefirst image processing technique. A. Composition of threeimages on figure 1 by using KS300 software's AND function.B. Manual delineation. C. Final binarised image.Bar length = 50 µm

region of interest) became black. The resultingneuron ramifications are presented in figure 2C.

Second technique

Figure 2A shows that the resulting compositeimage has a lower definition respecting the originalones. Some ramifications have therefore becomelost and others are difficult to define. This isbecause the composite operation includes animplicit contrast reduction producing a loss ofinformation.

Automatic colour equalisation is applied to theoriginal images for reducing loss of contrast. Asthe human eye is more sensitive to contrast thanto an image's complete intensity, it perceives lessinformation when the image has poor intensitydistribution. Histogram equalisation is an imagetransformation technique that redistributes itsintensities in trying to equalise a histogram (7).

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Equalisation allows original image contrast to beimproved before carrying out the composite imageoperation. Once the composite image has beenconstructed, network paths are easier to follow.Six colour equalisation techniques were tested(RGB, CMY, CMYK, VIO, HSV and CIELAB) toobtain the best contrast. Each equalisationtechnique corresponded to a different pixel colourrange. The best results were obtained with the YIQcolour model, agreeing with previous work doneon digital image processing (8).

This technique's first step therefore consisted ofequalising each original image by using the YIQrange; the result is presented in figure 3A. Thefirst technique was then applied; figures 3B and3C show the resulting images.

Positive neuron ramification areas were obtainedin each binarised image for comparing the resultsobtained with both techniques. The composition

image technique allowed regions of interest to bedefined; the second technique made this easier.Figure 4 shows that the second technique alloweda larger area of stained neuron networks to berecognised; best sensitivity and precision was thusshown with respect to the former.

Conclusions

Two new techniques for identifying neuron networkpathways using thick rat brain slices have beenpresented in this paper. The second techniqueallowed better definition of neuron ramificationsto be identified. This technique enables highaccuracy to be used when identifying neuronpathways and areas to be measured reproducibly.It can be used in quantitative enzyme histo-chemistry tissue studies, but it could be furtherextended to other fields. Quantitative studies canthus complement classical qualitativemorphological techniques.

Figure 3. Sequence of results when using the second imageprocessing technique. A. Ohwahaimagen software was usedfor producing a composition of the three equalised images infigure 1 using the YIO colour range. B. Manual delineation. C.Final binarised image.Bar length = 50 µm

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Figure 4. Histogram showing positive neuron ramificationarea within the evaluated microscopic fields.

Acknowledgements

We would like to thank the Instituto Nacional deSalud's Neuroscience Laboratory and HernánHurtado for supplying us with the histological slidesemployed in the research. We are also grateful tothe Universidad Nacional de Colombia's OhwahaImage Processing and Computer GraphicsResearch Group for helping us use theOhwahalmagen software.

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Biomédica 2004;24:350-5PÉREZ J.A., CORREA A., FUENTES J., MELÉNDEZ E.

Correspondencia:Jesús A. Pérez, Carrera 57 N° 91-24, Apartamento 401.Barranquilla, Colombia.Teléfono: (575) 357 5229; fax: (575) 345 [email protected]


PRESENTACIÓN DE CASOS

Conidiobolomicosis: hallazgos histopatológicosJesús A. Pérez 1, Álvaro Correa 2, Jairo Fuentes 2, Esperanza Meléndez 3

1 Departamento de Patología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Libre, Barranquilla, Colombia.2 Departamento de Dermatología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Libre, Barranquilla, Colombia.3 Servicio de Dermatología, Hospital General, Barranquilla, Colombia.

La conidiobolomicosis es una micosis subcutánea que se localiza generalmente en la líneamedia facial; es causada por un hongo saprófito de suelos y vegetales secos, propio de regionesintertropicales, que afecta principalmente a hombres adultos. El agente etiológico Conidioboluscoronatus pertenece a la clase de los Zigomicetos, orden Entomoftorales; se caracteriza porhifas cortas y gruesas, generalmente aseptadas, que crece entre 30°C y 37°C y producegranulomas nasales. Se informan a continuación los hallazgos histológicos de un caso deconidiobolomicosis en un paciente de 31 años de raza negra, natural y procedente de laregión de Urabá, quien presentaba deformidad mediofacial con edema de nariz, labio superiore imágenes polipoides en senos maxilares con destrucción del tabique nasal. La biopsiademostró inflamación granulomatosa necrosante difusa en la dermis profunda e hipodermisasociada con eosinófilos y fenómeno de Splendore-Hoeppli, en cuya zona central se ubicabanespacios aparentemente vacíos que contenían el hongo que no se tiñó con HE, pero que sí lohizo con las coloraciones de PAS y Grocott lo cual permitió la observación de hifas de paredesgruesas y rígidas, con torsión central y extremos cónicos.

Palabras clave: conidiobolomicosis, Conidiobolus coronatus, micosis subcutáneas,entomoftoromicosis, rinoentomoftoromicosis, cigomicosis.

Conidiobolomycosis: a case report with histophathologic findings

Conidiobolomycosis is a subcutaneous mycosis of the facial midline affecting primarily adultmales. It is caused by the saprophytic fungus, Conodiobolus coronatus, present in soils anddried vegetables, characteristic of intertropical regions. C. coronatus belongs to the classZygomycetes, order Entomophthorales; it is a fungus composed of thick, short hyphae thatgrows at temperatures between 30°C and 37°C and causes nasal granulomas. The histologicfindings are described of a case of conidiobolomycosis in a 31-year-old male, born and residentin the Urabá region of Colombia. He presented with a mid-facial deformity of the nose andupper lip edema, and polypoid images in the maxillary sinuses with destruction of the nasalseptum. The biopsy revealed a diffuse inflammatory lesion located in the deep dermis and inthe hypodermis corresponding to a necrotizing granuloma. Associated eosinophils and thepresence of the Splendore-Hoeppli phenomenon were noted in the vacant central zone whichapparently corresponded to location of the fungal hyphae. They did not stain with HE stain, butreacted to the PAS and Grocott staining techniques and appeared as rigid, thick-walled hyphae,centrally twisted and with cone-shaped endings.

Key words: zygomycosis, entomophthoromycosis, subcutaneous mycoses, rhino-entomophthoromycosis, conibiolomycosis, Conidiobolus coronatus.

Las entomoftoromicosis son micosis subcutáneascausadas por dos tipos de hongos saprófitos enla naturaleza, que son similares histológicamentepero que producen entidades clínicas distintas.Las dos especies de agentes etiológicos,

Biomédica 2004;24:350-5

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Biomédica 2004;24:350-5 CONIDIOBOLOMICOSIS: HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS

micológicamente distintas, causan infeccióncrónica granulomatosa: una predominantementefacial, producida por Conidiobolus coronatus queafecta la población adulta y tiene francapredilección por el sexo masculino (relación 10:1),y otra con afección predominante de lasextremidades que se observa, generalmente, enniños y adolescentes y es causada porBasidiobolus ranarum. Estas especies representanhongos saprófitos de vegetaciones secas y suelosy, también, del tracto intestinal de reptiles yanfibios (1-5).

La infección por C. coronatus se conoce comoconidiobolomicosis y se ha designado con diversosnombres, entre ellos, rinoentomoftoromicosis,rinoficomicosis y entomoftoromicosis conidiobolae.Representa una infección inicial de la submucosanasal desde donde se extiende al tejidosubcutáneo del rostro con predominio mediofacial,región en la que produce lesión necrosante conreacción inflamatoria granulomatosa, rica eneosinófilos (1,3).

En los animales, la enfermedad se conoce desde1961 cuando Emmons y Bridges documentaronen Texas la presencia del hongo en pólipos nasalesde caballos (6). El primer caso de conidiobolo-micosis en humanos fue informado en 1965 porBras et al. en un paciente de las Islas Caimán (7).En Colombia, el primer caso fue informado porRestrepo et al. en 1967 (8) y, posteriormente, en1991, Ochoa et al. informaron dos casos enhombres negros procedentes de la Costa Pacífica(9). Esencialmente, es una enfermedad deregiones intertropicales que se ha documentadoen Congo, Nigeria, India, México, Costa Rica,República Dominicana, Puerto Rico, Panamá yBrasil (1,3,10-17) y, además en Jamaica yColombia.

Presentación del caso

En el presente artículo se informan los hallazgospatológicos de un caso de conidiobolomicosis enun paciente de raza negra de 31 años, procedentede la región de Urabá en el noroccidentecolombiano. Presentó un cuadro de rinorrea de seismeses de evolución, inicialmente acuosa. Elproceso se acompañaba de fiebre y edema nasal,que progresó a rinorrea con secreción muco-

amarillenta fétida y a edema del labio superior,alas y puentes nasales, área intercelar y regionesgenianas, y por compromiso de las mucosas nasaly del paladar blando (figura 1).

El estudio radiológico de los huesos de la cara ylos senos paranasales mostró importante edemade los tejidos blandos faciales y de la mucosanasal, sin daño óseo. En la tomografía se observógran incremento del volumen de los tejidosblandos nasales y del labio superior, aspectodestructivo del tabique nasal y engrosamiento dela mucosa con oclusión casi completa de la fosaderecha. El seno etmoidal estaba ocupado pormaterial con densidad de tejidos blandos, y enambos senos maxilares había imágenesmamelonadas con apariencia polipoide sesil y conobstrucción del meato derecho (figura 2).

Se practicó biopsia incisional en el surconasogeniano derecho y se obtuvo una muestraelipsoidal de piel de 1,6 cm x 0,8 cm con 1,2 cmde espesor, la cual se procesó con fijación enformalina neutra, inclusión en parafina y obtenciónde cortes histológicos de 5 micras que secolorearon con HE, PAS y Grocott.

Figura 1. Hombre de 31 años con edema del labio superior,alas y puente nasales, área intercelar, regiones genianas ycompromiso de mucosas nasal, labial y de paladar blando.

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Figura 2. Imágenes de la tomografía: A. Gran incremento del volumen de los tejidos blandos mediofaciales con engrosamientode la mucosa nasal que ocluye la fosa derecha. B. Ocupación del seno etmoidal por material con densidad de tejidos blandosy, en ambos senos maxilares, imágenes polipoides sésiles con obstrucción del meato derecho.

Resultados

En los cortes histológicos se observó piel conhiperplasia moderada de las glándulas sebáceasasociada con presencia de Demodex folliculorumen los orificios foliculares y los conductossebáceos, con moderado infiltrado linfocitarioperianexial pilosebáceo superficial (figura 3).

La profundidad de la muestra evidenció densoinfiltrado inflamatorio mixto con numerososeosinófilos, frecuentes células gigantesmultinucleadas y zonas de necrosis granulareosinófilica en llama, rodeadas por granulomasepitelioides en empalizada y centradas porespacios aparentemente vacíos a manera decanales y túbulos rodeadas por un depósitoeosinofílico tipo fenómeno de Splendore-Hoeppli(figura 4). Las coloraciones de PAS (figura 5) yGrocott (figura 6) permitieron identificar hifascortas y gruesas de apariencia enroscada, conparedes rígidas, escleróticas y plegadas deextremos cónicos, que ocupaban los espacioscentrales de las zonas necróticas.

Discusión

La conidiobolomicosis es una enfermedadendémica de regiones localizadas entre los

Figura 3. Piel con moderado infiltrado linfocitario perianexialpilosebáceo y denso infiltrado inflamatorio mixto profundo,HE, 40X.

trópicos de Cáncer y de Capricornio. La literaturainforma una amplia distribución de la enfermedadque afecta, principalmente, la mucosa nasal yorofaríngea de donde se extiende al tejidosubcutáneo; recientemente, también se ha

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Figura 4. A. Infiltrado inflamatorio profundo con numerosos eosinófilos, frecuentes células gigantes multinucleadas y zonasde necrosis granular eosinofílica en llama, centrados por espacios aparentemente vacíos a manera de túbulos y canales,HE, 200X. B. Granulomas epitelioides en empalizada que rodean los depósitos eosinofílicos a manera de fenómeno deSplendore-Hoeppli con espacios en su zona central, HE 400X.

Figura 5. Granuloma con células gigantes multinucleadas que rodean la necrosis y el espacio centrado por hifa quereacciona positivamente. A. Cortes transversales; B. Cortes longitudinales, PAS, 400X.

Figura 6. En las zonas de necrosis se observan hifas cortas y gruesas de apariencia retorcida, paredes rígidas, escleróticasy plegadas, que ocupan los espacios centrales de las zonas necróticas. A. Corte transversal, B. longitudinal. Grocott,1.000X.

A

A

B

B

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reportado en infección orofaríngea (18). El agenteque se suele demostrar en este tipo de infecciónes C. coronatus. Regularmente, las publicacionescomunican la presentación de casos y destacansu diagnóstico al demostrar la presencia del hongopor cultivo aunque se han desarrollado pruebasdiagnósticas de inmunodifusión, las cuales se hanrecomendado en veterinaria para el seguimientode la respuesta al tratamiento (19). El presentetrabajo resalta los hallazgos histológicoscaracterísticos de la afección en la dermis profunday el tejido subcutáneo de un caso de infecciónpor C. coronatus.

En la biopsia de piel se documentó como hallazgocaracterístico, a bajo aumento, un cuadrohistológico de un infiltrado inflamatorio denso ybien definido, profundo, de tipo granulomatosoepitelioide necrosante con empalizada periféricay necrosis en llama. En dicho infiltrado sedestacaba un importante número de eosinófilos.La necrosis aparecía, a manera de fenómeno deSplendore-Hoeppli, alrededor de un vacío centralque contenía las hifas del microorganismo. Lashifas no se teñían con HE, pero sí se revelabancomo túbulos o canales, según el cor tetransversal o longitudinal, hallazgo que escaracterístico en esta tinción y puede apoyar eldiagnóstico. Las coloraciones de PAS y Grocotttiñen las hifas que aparecen con paredes rígidasescleróticas de espesor ligeramente variable, contendencia al estrechamiento y a torsionescentrales, con extremos cónicos cuando se incidenlongitudinalmente.

El hongo expresa baja virulencia para loshumanos, quienes presentan resistencia naturala la infección (20); ésta se adquiere por laimplantación nasal mediada por insectos o porinoculación accidental de tierra contaminada confragmentos vegetales, por dedos contaminadoscon el hongo o, incluso, por inhalación. Enpacientes diabéticos y en personas coninmunosupresión existe predisposición a laenfermedad, que se puede diseminar y ser fatal(21-23). En el manejo de la enfermedad se hanempleado diversos agentes con resultadossatisfactorios, entre ellos, yoduro de potasio,sulfas, ketoconazol, fluconazol e itraconazol (1,9-12,14,19,24).

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Biomédica 2004;24:356-65IDROVO A.J.

Correspondencia:Alvaro J. Idrovo, Centro de Investigación en Salud Poblacional,Instituto Nacional de Salud Pública, Avenida Universidad655, CP 62508, Colonia Santa María Ahuacatitlán,Cuernavaca, Morelos, Mé[email protected]; [email protected]

Recibido:12/04/04; aceptado: 07/10/04

HISTORIA

Raíces históricas, sociales y epidemiológicasde la tuberculosis en Bogotá, Colombia

Alvaro Javier Idrovo

Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca, México.

El entendimiento completo de la dinámica epidemiológica actual de la tuberculosis en unasociedad requiere una aproximación holística. En este artículo se resume el comportamientode la tuberculosis en Bogotá, Colombia, a través del tiempo. En periodos prehispánicos, lafrecuencia de la enfermedad fue baja. Durante la Conquista y la Colonia se observó unincremento moderado de la tuberculosis pulmonar y abdominal. Hacia 1870 se inició unacentuado incremento de los casos de tuberculosis pulmonar, asociado con el procesoacelerado de la urbanización de la ciudad. Desde la segunda década del siglo XX, latuberculosis pulmonar se convirtió en una enfermedad endémica. Después de 1920, lafrecuencia fue relativamente estable hasta la década del 70, cuando se presentó un descenso;sin embargo, en los últimos años volvió a aparecer un aumento en el número de casos. Lapresencia de la tuberculosis en cada periodo se asocia con eventos sociales y ambientales.

Palabras clave: tuberculosis, agricultura, urbanización, industria, Colombia.

Historical, social and epidemiological roots of tuberculosis in Bogotá, Colombia

Understanding the current epidemiologic dynamic of tuberculosis (TB) in any society requiresa holistic approach. In the current paper, the history and behavior of the TB is summarized forBogotá, Colombia. In prehispanic periods the occurrence of TB was low. During the Conquestand the Colony periods, a moderate increase of pulmonary and abdominal TB was observed. Inthe 1870s, a great increase in cases of pulmonary TB was associated with the acceleratedurbanization process. Since the 1920s, the occurrence of pulmonary TB shifted to the status ofan endemic disease. After 1920, its occurrence was relatively steady until the 1970s, when itsoccurence greatly decreased. More recently, however, an increase in case numbers has beenobserved. The occurrence of TB in each period is associated with clearly defined social andenvironmental phenomena.

Key words: tuberculosis, agriculture, urbanization, industry, Colombia.

La tuberculosis es una enfermedad que haacompañado al hombre, probablemente, desde suaparición, y que ha servido como trazadora delas cada vez más complejas relaciones entre elambiente, las sociedades y la salud humana. Puedeser causada por Mycobacterium tuberculosis,Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum,Mycobacterium microti y Mycobacterium canettii

(1), denominados en conjunto como "complejo M.tuberculosis”. Diversos trabajos en todo el mundohan mostrado que el estudio histórico de latuberculosis puede proveer un mejor marcoanalítico para entender la dinámica epidemiológicade la enfermedad que únicamente el enfoqueindividualista propio de las disciplinas biomédicasy conductuales (2). En el presente artículo serevisa cómo ha sido el comportamiento de latuberculosis en Bogotá a través de la historia yse señalan algunas posibles líneas futuras deinvestigación sobre el tema. Si bien el trabajoenfoca la enfermedad en la capital colombiana,sus hallazgos pueden servir como punto de partidapara mejorar el entendimiento de la epidemiología

Biomédica 2004;24:356-65

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Biomédica 2004;24:356-65 TUBERCULOSIS EN BOGOTÁ

social e histórica de la tuberculosis en todo elterritorio nacional.

La historia de Bogotá se divide en cuatro grandesperiodos, que corresponden con los cambios mássignificativos de la frecuencia de tuberculosis. Seinicia con las evidencias arqueológicas yantropológicas que permiten hacer unaaproximación a la presentación de la tuberculosisen las poblaciones prehispánicas; luego, se analizacómo ocurrió la mezcla de los patronesepidemiológicos de la tuberculosis de origenamericano y europeo durante la Conquista y laColonia; posteriormente, se señalan los procesossociales involucrados en el inicio de la epidemiade tuberculosis en Bogotá hacia finales del sigloXIX y las primeras dos décadas del siglo XX, yse finaliza con una descripción del comportamientode la enfermedad desde aquellos tiempos hastala actualidad. En el cuadro 1 se presenta unresumen de los perfiles epidemiológicos de latuberculosis en los periodos estudiados.

El presente análisis pretende no caer en unenfoque nihilista ni pragmático radical (3), sinomás bien presentar un equilibrio entre éstos, demanera que se logre entender mejor lamulticausalidad de la enfermedad. Es decir, nose tiene a priori una postura que apoye lanecesidad de cambios sociales profundos(enfoque nihilista), ni una postura que señale lasacciones médicas individuales relacionadas conel diagnóstico y el tratamiento (enfoquepragmático radical) como las responsables de ladisminución de la frecuencia de la tuberculosis.La aproximación usada en este trabajo parte dela tesis de McKeown (4) e incorpora elementosde las críticas posteriores resultantes de losestudios empíricos que la refutaban (5), buscandoidentificar las particularidades del fenómeno enla capital colombiana.

Tuberculosis prehispánica

Existen evidencias irrefutables de la existenciade la tuberculosis en el Nuevo Mundo desde antesdel descubrimiento de América. Se han encontradolesiones compatibles con tuberculosis en Canadá(6), Estados Unidos (7-11), Colombia (12-15), Perúy Chile (16). Sin embargo, la prueba reina fue laidentificación de segmentos de ADN de M.tuberculosis en lesiones de restos humanosencontrados en el norte de Chile y Perú (17,18).En Colombia, los hallazgos de lesionescompatibles con tuberculosis en un individuoproveniente de La Mesa de los Santos, Santander,con imágenes radiológicas de dos lesionescalcificadas en la región superoanterior de lacavidad torácica izquierda (12), en la querecientemente se identificó ADN de M.tuberculosis (13), los encontrados en siete sujetosde un cementerio prehispánico muisca en Soacha(14) y los observados en los restos óseos deindividuos del departamento del Cauca sugestivosde tuberculosis (15) constituyen las evidenciashasta ahora disponibles. Estos pocos casos noindican necesariamente una baja frecuencia entrelas poblaciones aborígenes colombianas; más bienseñalan las dificultades de estudiar “muestrassesgadas” en los estudios paleopatológicos(19,20).

De acuerdo con un análisis previo (21), losposibles determinantes de la presencia de latuberculosis en la población prehispánica deBogotá se encuentran estrechamente relacionadoscon la aparición de la agricultura. La relación entrela agricultura y las enfermedades infecciosas esel patrón más frecuentemente observado en laspoblaciones prehistóricas (22). Sin embargo, esposible que esta asociación no se haya observadoen otras regiones del país con importantedesarrollo agrícola, como la zona del Sinú donde

Cuadro 1. Probable comportamiento de la tuberculosis en Bogotá a través de su historia.

Periodo Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis

Prehispánico Frecuencia baja AusenteConquista y Colonia Incremento Incremento1870-1920 Incremento acentuado Decremento1921 en adelante Decremento/reemergencia Notorio decremento

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se combinaba el cultivo de tubérculos,principalmente yuca, con la pesca como susactividades de subsistencia (23,24). Existenevidencias en el territorio panameño, dondehabitaron pueblos íntimamente relacionados conla cultura del Sinú, que indican que el desarrolloagrícola no favoreció el incremento de la frecuenciade enfermedades infecciosas (25).

El territorio de la actual Bogotá fue habitado porlos grupos agroalfareros de la llamada CulturaHerrera, hasta que fueron desplazados oabsorbidos por los muiscas hacia los siglos IX oX d.C. Éstos provenían de la Costa Atlánticavenezolana o de las tierras bajas del orientesuramericano; eran pequeños agricultoresasociados en poblaciones nucleadas que nollegaban a conformar grandes urbes. Sus cultivosprincipales eran de maíz, papa, cubios, fríjol,batata, yuca, arracacha, ají, maní, piña y algunosfrutales (26). Es bien conocido que no sólo esnecesario que exista un suficiente número deindividuos para que la enfermedad se mantengaprevalente en una población; se requieren otrascondiciones como las malas condicioneshigiénicas, la convivencia con animalesportadores de Mycobacterium, algunos factoresdebilitantes y la inmunosupresión para que sedesarrolle la tuberculosis.

Los muiscas eran un pueblo con muy buenascostumbres de aseo personal, entre quienes seobservaban algunas veces alcantarilladosrudimentarios (27), relacionados con el culto quele tenían al agua. La fauna asociada con susasentamientos estaba constituida por curíes(Cavia porcellus), venados, guaguas, comadrejas,cusumbos, palomas, ratones, conejos, zorros ypecaríes (26,28); el primero era el más importantepor ser el principal animal doméstico. Los curíespueden infectarse con Mycobacterium porinhalación o ingestión de esputos e, incluso,desarrollar la enfermedad. Los procesosinvolucrados en esta transmisión, estudiadoshacia finales del siglo XIX y comienzos del sigloXX, fueron descritos por diversos investigadores,entre los que sobresalen Flügge, Calmette, Guérin,Koch, Strauss, Rothe, Raymond, Römer yFeyerabend (29,30). Infortunadamente, es muydifícil corroborar el papel que jugaron los curíes

en la transmisión de la tuberculosis en laspoblaciones prehispánicas, ya que de habersucedido es posible que las lesiones en loshumanos hubieran sido en órganos blandos querara vez se conservan hasta nuestros días.

Con respecto a los factores debilitantes y lainmunosupresión, la desnutrición es la condiciónque pudo haber estado relacionada. Laalimentación muisca estaba fundamentada en elmaíz, los fríjoles, las raíces, las papas, las frutasy la carne de venados, tórtolas, conejos, curíes,palomas y perdices (31). Clásicamente, un elevadonúmero de dientes cariados y los trastornos delhueso cortical se asocian con una alta ingestiónde carbohidratos; estos signos se observanfrecuentemente en los restos de las mujeresmuiscas (14). Este hecho permite suponer que ladieta con proteína animal era privilegio de loshombres, principalmente, de posiciones socialessuperiores. Sin embargo, los estudios con losisótopos δ13C de colágeno y apatita, y δ15N delcolágeno que permiten determinar el consumodiferencial de vegetales y animales, identificaronque también existía un consumo alto de proteínaanimal entre las madres y los niños en edades deamamantamiento (31).

Por estas razones, si bien la infección porMycobacterium pudo tener una alta prevalenciaentre los muiscas, la enfermedad posiblementese presentó con mayor frecuencia entre lasmujeres. Esto pudo deberse a las condicionesinapropiadas para presentar una morbimortalidadelevada asociada con la enfermedad. Futurosestudios podrían incluir la amplificación delfragmento IS6110 del ADN y la subunidad ß de laARN polimerasa para identificar la infección pormicroorganismos del complejo M. tuberculosis(32), tal como se hizo con el individuo guane,proveniente de Santander, recientementeestudiado por Sotomayor et al. (13).

La tuberculosis oculta (1538-1870)

No hay dudas de la presencia de la tuberculosisen territorio bogotano durante los periodos de laConquista y la Colonia, aunque existen grandesdificultades para conocer su comportamientodebido a la ausencia de evidencia empírica y alas escasas y limitadas descripciones de los

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cronistas y médicos de la época. El fenómenosocial más sobresaliente de la Conquista fue elencuentro, a veces amistoso y muchas otrasveces bélico, de individuos europeos conaborígenes americanos. El resultado de esteencuentro, en términos de la presencia de latuberculosis, fue el choque de dos patronesepidemiológicos que con el paso del tiempoterminó en el predominio del perfil europeo durantela Colonia y la primera República. El año quemarca el encuentro de los dos perfilesepidemiológicos en Bogotá fue 1538, el año desu fundación. Para entender mejor este encuentroes necesario revisar la presencia de la tuberculosisen los lugares de origen de los conquistadores ylos colonizadores.

Durante gran par te de los periodos de laConquista, la Colonia y la primera República, latuberculosis en España y otros países de Europaera considerada como una enfermedad endémicaque afectaba a buena parte de la población (33).Diversos análisis históricos señalan que lasinfecciones fueron causadas por M. tuberculosisy M. bovis; la primera era predominante en lasciudades y la segunda en las zonas rurales. Lasevidencias también indican que la primera seasociaba con lesiones pulmonares, mientras lasegunda con lesiones extrapulmonares, y que losmás afectados por M. bovis eran los niños (3).

La tuberculosis bovina ha estado presente enEuropa con frecuencias nada despreciables hastahace pocas décadas (34,35). La enfermedad,reconocida o no por los médicos veterinarios dela época, debió ser tan importante que fue tratadaen varios libros especializados de comienzos delsiglo XIX (36). Dado que la historia general de laenfermedad indica que la tuberculosis bovinaprecedió a la tuberculosis causada por M.tuberculosis (37), es posible pensar que muchosde los conquistadores tuvieron la infección e,incluso, la enfermedad establecida al llegar atierras americanas. Sin embargo, es mucho másprobable que M. bovis hubiese llegado a Américacon el ganado bovino que fue introducido al NuevoMundo en los primeros años de la Conquista.

Para tener evidencia empírica que apoye lapresencia de tuberculosis bovina durante este

periodo y los siguientes, se podría realizar laespoligotipificación de diferentes razas bovinasactuales (38), que incluya descendientes delorejinegro andaluz traído a América desde losinicios de la Conquista (39). Esta técnica hapermitido identificar las relaciones del ganado deInglaterra y Australia, Canadá, Irán y Argentina, eidentificar diferencias con el procedente de Francia(38). Para confirmar esta hipótesis, es de esperarque los resultados hallados en Colombia muestrenrelación principalmente con el perfil español,caracterizado por una alta frecuencia (46%) delespoligotipo Sp7 (40).

De otro lado, en España la tuberculosis causadapor M. tuberculosis debió seguir los patronesencontrados en países vecinos como Francia,donde la agricultura, la urbanización des-controlada, la industrialización y otros factoresrelacionados fueron factores que favorecieron supropagación (35). Sin embargo, algunascaracterísticas de la España de aquella épocapudieron darle especificidad al comportamientode la enfermedad. El crecimiento demográfico dela población española fue más lento que elocurrido en otros países europeos (41); lasciudades, hasta más allá de la segunda mitad delsiglo XIX, no tenían una adecuada planificación,especialmente las amuralladas, lo cual permitíaque fueran prevalentes el hacinamiento y las malascondiciones sanitarias (42).

Por todo esto, si bien la tuberculosis empezó adisminuir de manera generalizada en Europaoccidental desde la segunda mitad del siglo XIX(3), en España este proceso pudo ser más lento.La verificación de esta hipótesis será posiblerealizarla si se analizan los restos humanos deindividuos de aquel periodo que se encuentran enlos cementerios conservados hasta la actualidadmediante pruebas genéticas como la amplificacióndel fragmento IS6110 del ADN y la subunidad ßde la ARN polimerasa (32). Son varias laspreguntas que surgen en relación con este periodopara los investigadores de la historia social de latuberculosis en Colombia, entre las que se puedenseñalar: 1) ¿cuál es el efecto que tuvieron lasguerra de independencia y, posteriormente, losconflictos bélicos internos durante el resto del sigloXIX sobre la frecuencia de la tuberculosis? y 2)

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¿será que tuvieron impactos similares a losobservados en otros conflictos armados, como elfranco-pruso de finales del siglo XIX (35)?

La epidemia de tuberculosis pulmonar(1870-1920)

Los hechos relacionados con el inicio de laepidemia de tuberculosis pulmonar en Bogotá yase han estudiado previamente (43). Brevemente,a comienzos del siglo XIX Bogotá era una ciudadde una relativa gran extensión, aunque con unapoblación de apenas 21.464 habitantes. Eranfrecuentes las casas amplias, los templos y losconventos, por lo que el hacinamiento no erahabitual en aquel tiempo. La población fueaumentando durante todo ese siglo, primerolentamente debido a la alta mortalidad ocasionadapor las epidemias de viruela y las guerras civiles,y hacia las décadas finales del siglo de manerarápida. Para 1905, la población bogotana eracercana a los 100.000 habitantes (44), y ya seencuentra evidencia que señala el hacinamientoen que vivían las clases más pobres; mientras enel segundo piso de las casas vivían cómodamentelas clases más adineradas, los primeros pisoseran utilizados como locales de chicherías otiendas que, también, funcionaban como cocina,comedor y habitación de humanos y animales (45).Además, las condiciones de trabajo en la épocapodían tener efectos adversos sobre la salud; sibien la mayoría de los habitantes se dedicaba alabores no industriales, era frecuente el trabajofísico arduo y las largas jornadas laborales, inclusopara la población infantil y de mujeresembarazadas (30).

Según los cronistas de la época, las condicionessanitarias de la ciudad eran lamentables, debidoa la inexistencia de adecuados servicios públicosde acueducto, alcantarillado y aseo (46,47). Lanutrición de los bogotanos era deficiente; sebasaba en alimentos como chicha, caldos deagua-sal, mazamorra de harina de maíz conhabas o coles y vísceras de animales, chorizos ylonganizas (45). Estas últimas muchas veces eranconsumidas en estado de descomposición, lo cualpudo favorecer la transmisión de M. bovis. Elganado bovino traído desde los primeros años dela Conquista pudo traer esta micobacteria desdeEuropa, y permitir su permanencia. No hay que

olvidar que la carne para consumo humano notuvo control sanitario en Bogotá hasta 1886 (48).

Al respecto existen algunas dudas generadas porel hallazgo de lesiones de Oesophagostomumradiatum en las vísceras animales (49), quepodrían haber sido confundidas con las detuberculosis bovina. Sin embargo, esta observaciónsólo se logró hacia 1915 y no es posible extrapolarlaa los periodos previos. Un punto a favor de laexistencia de la tuberculosis bovina en Bogotáes el hallazgo patológico de tubérculosabdominales en los habitantes de la ciudad; estollamó en gran medida la atención de los médicosde la época, ya que observaban un patrón contrarioal europeo: “En Europa la peritonitis sigue confrecuencia a una pleuresía; en Bogotá se observalo contrario” (45). Debido a esto es posible pensarque la tuberculosis bovina sí existió en Bogotá yque, incluso, confirió protección cruzada contrala tuberculosis pulmonar (50).

Con base en los registros del Hospital San Juande Dios que para la época atendía a cerca de50% de los casos de tuberculosis de la ciudad(49), se puede conocer que entre 1875 y 1914 seinició la epidemia de tuberculosis pulmonar enBogotá (43). La mortalidad por tuberculosispulmonar se convirtió en la primera causa demuerte al pasar de ser cercana a 5% y llegar atener proporciones de hasta 30% en sólo unospocos años (49). La anatomía patológica de laépoca permitió identificar que cada vez con mayorfrecuencia se seguía la teoría unicista de Bayle,Laennec y Louis, en la cual la infección inicialocurría en los campos pulmonares inferiores;luego, los bacilos se ubicaban en los ápices y deallí se diseminaban hacia el resto del cuerpo. Estaalarmante situación propició que se crearan, encumplimiento de la Ley 66 de 1916, pabellonesespeciales para tuberculosos en los hospitalesmás importantes del país (51).

La endemia de tuberculosis pulmonardel siglo XX

Después del rápido incremento de la frecuenciade tuberculosis antes descrito, la enfermedad seasentó de manera definitiva en la ciudad. Es asíque para la segunda década del siglo XX ya seconsideraba una enfermedad endémica; en 1920,

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Pablo García Medina afirmaba que la tuberculosisse había extendido por todo el territorio nacional,especialmente de las costas hacia las regionesde clima templado y frío (52), entre las que seencontraba Bogotá. La situación llegó a ser tanalarmante que, desde 1924, los hospitales querecibían auxilios estatales estuvieron obligados aatender a los tuberculosos (53); debido a estadisposición, durante este tiempo el Hospital SanJuan de Dios fue la principal institución prestadorade servicios a los tuberculosos capitalinos.

Sin embargo, los servicios allí ofrecidos eranlimitados por lo que, entre 1930 y 1950, se crearondiversas instituciones encargadas de la atencióny beneficencia a los enfermos que, obviamente,tuvieron acciones en los tuberculosos de Bogotá.En 1932 se creó la sección de lucha contra latuberculosis que, en 1936, se convirtió enDepartamento Nacional; en 1937 se organizó laCampaña Antituberculosa Nacional y se originaronlos comités voluntarios contra la tuberculosis; en1938 se fundó el Comité Femenino Antituberculosode la Cruz Roja Nacional que el año siguientecambió su nombre a Liga AntituberculosaColombiana y, luego, se crearon los primeroshospitales antituberculosos en Bogotá, el de SantaClara y el de San Carlos (51).

El primer hospital fue creado en 1942 con dinerospúblicos y fue donde se practicó un gran númerode cirugías para el tratamiento de la tuberculosisdurante las décadas siguientes (54). El Hospitalde San Carlos, creado en 1948, era de carácterprivado y tenía características excepcionales parasu época; fue dotado con la mejor tecnologíamédica y construido con un arquitectura que seguíaestrictamente los conocimientos científicos(53,55). El tratamiento allí practicado consistía enhospitalización prolongada, reposo absoluto,alimentación regulada y el consumo de ácido p-aminosalicílico, hidracida del ácido isonicotínicoy estreptomicina. Este tratamiento tuvo dosimportantes modificaciones; en la década del 60se introdujeron la rifampicina, el etambutol y lapiracinamida, y en la década del 70, después deldescubrimiento de Madras, se estandarizó eltratamiento ambulatorio supervisado de cortaduración (seis a nueve meses) lo cual propicióque los sanatorios fueran desapareciendo (51).

Éste es el fundamento del tratamiento,denominado DOTS que persiste en la actualidad(56).

Hasta el momento no se ha hecho un análisiscuantitativo de los registros de morbilidad ymortalidad por tuberculosis en Bogotá duranteeste periodo; sin embargo, es consistente en losdocumentos de la época que la enfermedad tuvouna alta frecuencia (González G. Estado de lasalud pública en Colombia. Primer CongresoColombiano de Salud Pública. Medellín, 1962. p.23-159 y Serpa F. Enfermedades transmisibles enColombia. Primer Congreso Colombiano de SaludPública. Medellín, 1962. p.184-91). Las condicionesque precipitaron la epidemia de tuberculosis enlas décadas anteriores fueron las que facilitaronque la enfermedad se mantuviese con un carácterendémico en la ciudad durante cinco décadas,aproximadamente, y posteriormente empezara adisminuir. De esta manera, los fenómenos socialesrelacionados fueron la urbanización no planificaday sin adecuados servicios públicos y, posterior-mente, el desarrollo industrial. Los patronesobservados en Bogotá no fueron, entonces, muydiferentes de los presentados en los paíseseuropeos y americanos (35,57-60). Es decir, quela frecuencia tendió a disminuir de manera acordecon el mejoramiento de las condiciones de vidade las clases trabajadoras (61).

En la segunda década del siglo XX se dieronimportantes conquistas entre los trabajadores delas empresas más grandes de la ciudad. Graciasa la Ley 46 de 1918, y en respuesta a la epidemiade gripa que ese año azotó el país, se comenzarona hacer mejoras a las viviendas de los proletarios;también se empezaron a observar los primerosservicios médicos empresariales (53), germen dela medicina del trabajo en Colombia. Hechos comoéstos pueden considerarse los determinantesprincipales de la disminución de la frecuencia,junto a las acciones de vacunación y tratamientomédico, observado desde 1970 a 1997. Sinembargo, estas cifras son motivo de discusión,debido a que paralelamente también se disminuyóla detección de casos (62).

Actualmente, en Colombia el control de latuberculosis se fundamenta en la detección decasos, el diagnóstico mediante técnicas de

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laboratorio y el tratamiento acortado supervisadogratuito para los enfermos. Este modelo, objetode muchas críticas, ha permitido señalar quedespués de 1997 hay una tendencia al incrementode la frecuencia de sintomáticos respiratorios,baciloscopias positivas y mor talidad portuberculosis (63). Durante estos años, la capitalcolombiana ha sido una de las regiones másafectadas por la tuberculosis en el país (64).

Las causas de estos cambios recientes en elcomportamiento de la tuberculosis no han sidoestudiadas ampliamente. Sin embargo, algunosestudios han empezado a explorar varios posiblesdeterminantes:

1. La asociación tuberculosis-sida. Unargumento frecuente es el asociar latuberculosis, principalmente extrapulmonar, conla infección con el VIH y el sida; en Colombiaya se tiene evidencia epidemiológica alrespecto (65). Además, se ha observado que,en Bogotá, los pacientes con sida presentanuna prevalencia de infección por M. tuberculosisque está entre 1,4% y 8% (66).

2. Resistencia a los medicamentos. Es bienconocido que, desde 1970, ha habido unincremento de micobacterias resistentes aalgunos medicamentos, como la isoniacida,mientras se disminuye la resistencia a otrosfármacos antituberculosos (67). Si bien estoscambios son ambivalentes, no pueden dejarsepasar desapercibidos dada la importancia quetienen para definir el tipo de tratamiento.

3. Efectos del nuevo sistema de salud. Ayala yKroeger han sugerido que la implantación dela Ley 100 de 1993 pudo favorecer ladisminución de la detección de tuberculosos,y que esto pudo ser debido, principalmente, ala falta de preparación en los municipios paralos cambios (68).

4. Estigmatización de los tuberculosos . Losestudios realizados en Cali, quizá extrapolablesen cierta medida a Bogotá, señalan que losindividuos enfermos de tuberculosis sonestigmatizados por la sociedad, y que elprincipal predictor de dicha conducta son lascreencias sin fundamento científico sobre latransmisión de la tuberculosis (69).

5. Sistemas de conocimiento sobre laenfermedad . Otros estudios cualitativos hanpermitido identificar los pasos y las barrerasque presentan los enfermos de tuberculosis enCali, hasta acceder a los servicios de salud; entrelos obstáculos, son de especial importancia lasdiferencias de los conocimientos de losprofesionales de la salud y los pacientes (70).

6. Desplazados. La migración interna debida alconflicto armado en el país es un fenómenosocial que, sin duda, tiene repercusiones sobrela salud de las poblaciones desplazadas, asícomo de las receptoras. Hasta ahora, no hayestudios específicos sobre los efectos deldesplazamiento sobre la presencia de latuberculosis en Bogotá, pero sí hay evidenciasen otras ciudades que muestran que lascondiciones de saneamiento y, en general, devida de estas poblaciones son muy precarias(71); por tal razón, no es incoherente señalarque podría estar resurgiendo entre estos gruposuna frecuencia elevada de tuberculosis.

Conclusión

Si bien es posible entender los cambiostemporales en la frecuencia de tuberculosismediante el número promedio de individuos“efectivamente contactados” por cada personaenferma (72), puede ser mucho más importanteconocer el cómo y el porqué ocurrieron dichoscontactos. Para ello, la única forma decomprenderlo es mediante abordajes amplios,como el presente, que permitan interpretar lacompleja red causal involucrada en este proceso(73,74); es decir, se debe tener en cuenta tantolos procesos biológicos como los sociales queocurren en diferentes niveles de agregación yrequieren aproximaciones diversas. El análisis delos estudios arqueológicos, históricos, sociales yepidemiológicos de los determinantes de lapresencia de tuberculosis en Bogotá permiteseñalar que los determinantes han cambiado conel paso del tiempo. Mientras más se avanza en lahistoria, más complejas se tornan las relacionessociales de las poblaciones humanas, lo cual hacemás difícil entender las redes causales.

En los periodos prehispánicos, cuando la vida erarelativamente sencilla, la explicación es muy

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simple: las actividades humanas asociadas conla agricultura permitieron que la tuberculosis semantuviera dentro de la población aunque con unabaja frecuencia. El encuentro de dos mundosdurante la Conquista, la Colonia y los primerosaños de la República ocasionó una mezcla de lospatrones de comportamiento epidemiológico dela tuberculosis que, al final, llevó a un dominio delpatrón europeo de infección por M. tuberculosis yM. bovis. Hacia finales del siglo XIX, la situacióncambió radicalmente; probablemente, descendióla presencia de manifestaciones abdominales porM. bovis y se configuró una epidemia detuberculosis pulmonar asociada con el procesoacelerado de urbanización de comienzos del sigloXX. Entre la tercera y la séptima década del sigloXX, las precarias condiciones de las clasestrabajadoras permitieron que se mantuviera unafrecuencia relativamente constante; la mejoríapaulatina de las condiciones de vida de lostrabajadores durante el siglo XX y las accionesde aislamiento y tratamiento antimicrobiano de losenfermos fomentaron un descenso de lafrecuencia de tuberculosis que se inició hacia 1970.En los últimos años, este perfil nuevamenteparece cambiar y muestra un nuevo incrementode la frecuencia de la tuberculosis en la capitalcolombiana, de manera similar a lo observado enmuchas regiones del mundo.

Como se puede apreciar, el tener sociedades cadavez más complejas en el territorio bogotano hizoque las redes causales hayan aumentandotambién su complejidad. Es por esto que resultailógico que haya quienes pretendan entender elcomportamiento de la tuberculosis simplementecon aproximaciones biológicas (enfoquepragmático radical); para un entendimiento másreal se requieren abordajes muchos másholísticos, sin llegar necesariamente al nihilismo,que involucren los diferentes puntos de vista delas disciplinas sociales. Un reto para los futurosinvestigadores de la historia social de latuberculosis en Bogotá es la determinación delimpacto de los posibles nuevos determinantes dela frecuencia actual y futura de la enfermedad,sin dejarse cegar por los importantes avances enla genómica que, sin duda, impregnarán ydominarán el conocimiento científico.

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Biomédica 2004;24:366-74PINEDA-TAMAYO R., ARCILA G., RESTREPO P., ANAYA J.M.

ARTÍCULO ORIGINAL

Impacto de la enfermedad cardiovascular en los costos dehospitalización de pacientes con artritis reumatoidea

Ricardo Pineda-Tamayo 1,2, Giovanna Arcila 1,3, Patricia Restrepo 1,3, Juan Manuel Anaya 1,2

1 Unidad de Reumatología, Clínica Universitaria Bolivariana, Facultad de Medicina, Universidad PontificiaBolivariana, Medellín, Colombia.

2 Unidad de Biología Celular e Inmunogenética, Corporación para Investigaciones Biológicas, Medellín,Colombia.

3 Facultad de Enfermería, Universidad Pontificia Bolivariana, Medellín, Colombia.

El objetivo del presente estudio fue analizar las causas y los costos directos de hospitalizaciónde pacientes con artritis reumatoidea, establecer la morbilidad asociada y evaluar su impactosobre los costos de la hospitalización. Para tal fin, se revisaron las historias clínicas y losregistros del Departamento de Estadística y Contabilidad de todos los pacientes con artritisreumatoidea admitidos a la Clínica Universitaria Bolivariana en Medellín, en el periodocomprendido entre enero de 1999 y junio de 2003. Se hospitalizaron 41 pacientes en 62oportunidades (0,34 hospitalizaciones por paciente por año). La principal causa dehospitalización fue la actividad de la enfermedad (60%), seguida de cirugía (18%) e infección(10%). En 30 casos hospitalizados (48,4%) se observó, al menos, una morbilidad asociada; lamás frecuente fue la enfermedad cardiovascular (32%). El promedio de estancia fue de 5±6días. El promedio de los costos totales fue de US$1.277, y el costo promedio del día dehospitalización fue de US$235. Los medicamentos representaron el 54% de los costos totales,mientras que los de asistencia médica representaron apenas el 3%. La enfermedadcardiovascular fue el determinante más importante de altos costos de hospitalización (p<0,01).En conclusión, los costos directos de hospitalización de pacientes con artritis reumatoidea sonconsiderables y surgen principalmente del compromiso orgánico de la enfermedad. Laprevención y el tratamiento de la enfermedad cardiovascular son indispensables no sólo parareducir el impacto económico de la artritis reumatoidea, sino también para disminuir el riesgode mortalidad que la misma acarrea. Estos resultados pueden ser útiles en la definición de laspolíticas de salud en nuestra población.

Palabras clave: artritis reumatoidea, morbilidad asociada, enfermedad cardiovascular, costosdirectos, hospitalización, infección, mortalidad.

Impact of cardiovascular illness on hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis

The causes of admission and the distribution of direct medical costs were examined to establishthe clinical predictors of high hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis. Thisretrospective study included all rheumatoid arthritis patients who were hospitalized in theClínica Universitaria Bolivariana in Medellín, Colombia, between January 1999 and June 2003.Data were obtained from the medical records and from the hospital statistical section using acost-analysis spreadsheet. A total of 41 patients were hospitalized 62 times (0.34 hospitalizationper patient per year). Disease activity was the most important cause of admission (60%), followedby surgery (18%), and infection (10%). In 30 (48%) hospitalizations, at least one comorbiditywas recorded, with cardiovascular disease being the most frequent (32%). The mean length ofstay per patient was 5±6 days. The mean total cost was US$1,277, and the mean cost per dayof hospitalization was US$235. Medications represented 54% of the total cost, whereas thatrepresenting medical care was only 3%. Variance analysis disclosed cardiovascular diseaseas the most important determinant of high costs (p<0.01). In conclusion, the direct costs for in-patients with rheumatoid arthritis were considerable, and arose mainly from organiccomplications. Prevention and treatment of cardiovascular disease are indispensable not only

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Biomédica 2004;24:366-74 COSTOS DE HOSPITALIZACIÓN EN ARTRITIS REUMATOIDEA

to reduce the economic burden of rheumatoid arthitis, but also to diminish the risk of mortality.These data assist in the estimation of health care resources and in the selection of public healthpolicies for the improvement of patient outcomes.

Key words: rheumatoid arthritis, comorbidity, cardiovascular disease, directs costs,hospitalization, infection, mortality.

La artritis reumatoidea es la enfermedad crónicainflamatoria más frecuente ya que afecta,aproximadamente, al 1% de la población general(1) con una mayor prevalencia en mujeres que enhombres (2). El tratamiento de la ar tr itisreumatoidea precisa el uso de múltiplesmedicamentos, intervención de diversosespecialistas y personal paramédico y, enocasiones, intervenciones quirúrgicas que generanaltos costos a los sistemas de salud, a lospacientes y a sus familias (3). El impactoeconómico de la ar tr itis reumatoidea esconsiderable; se ha estimado que los costos porpaciente en Estados Unidos oscilan entreUS$4.300 y US$5.700 al año (4). Algunos estudioshan revelado que los costos indirectos de laenfermedad pueden ser aún mayores si seconsidera que muchos pacientes pueden tener unadiscapacidad laboral en los 10 primeros años dela enfermedad (5). Sin embargo, los costos indirectosse suelen subestimar por ausencia de estudiosque los hayan evaluado sistemáticamente (6).

El mayor impacto sobre los costos directos de laar tr itis reumatoidea está dado por lashospitalizaciones, que representan entre el 40%y el 60% del total (5,7,8). Sin embargo, en añosrecientes, la introducción de la terapia biológica ylos elevados costos de ésta han hecho que loscostos de hospitalización parezcan menores entérminos porcentuales. En tal sentido, un estudioreciente de Michaud et al. (9) evidenció que loscostos de hospitalización representaban apenasel 17% de los costos totales de la artr itisreumatoidea.

Los pacientes con artritis reumatoidea tienenmayor morbilidad asociada que la población

Correspondencia:Ricardo Pineda, Corporación para InvestigacionesBiológicas, Carrera 72-A No. 78-B-141, Medellín, Colombia.Teléfono: 441 0855, 441 8846; fax: 441 [email protected]


general (10). La hiper tensión ar terial, laarteriosclerosis, la enfermedad coronaria, lostrastornos respiratorios y los cutáneos sonmorbilidades asociadas frecuentes en la artritisreumatoidea, y tienen un importante impacto enla morbimortalidad; por consiguiente, sonresponsables de los elevados costos de atenciónde estos pacientes (10-13).

El propósito del presente estudio fue analizar lascausas y los costos directos de hospitalizaciónen pacientes con artritis reumatoidea, establecerla morbilidad asociada y evaluar el impacto deésta sobre los costos de la hospitalización. Esteestudio constituye la segunda fase para elentendimiento de los costos del tratamiento de laartritis reumatoidea en Colombia. Previamente,habíamos reportado los costos directos de laartritis reumatoidea temprana (14).

Materiales y métodos

Pacientes

Se revisaron las historias clínicas de todos lospacientes con diagnóstico de artritis reumatoideaadmitidos a la Unidad de Reumatología de laClínica Universitaria Bolivariana (CUB), en elperiodo comprendido entre enero de 1999 y juniode 2003. En todos los casos, los pacientesincluidos satisfacían los criterios de clasificacióndel Colegio Americano de Reumatología (15).

Fuentes de información

Se utilizaron los datos del Departamento deEstadística y el Departamento de Costos de laCUB utilizando un registro previamente validadopara tal fin (coeficiente κ>0,9), en el que serecopiló la información pertinente.

Datos clínicos y demográficos

Toda la información sobre las característicasclínicas y demográficas de los pacientes seextractó de la historia clínica y los datos faltantesse obtuvieron por medio de entrevista telefónica,

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personal o ambas con los pacientes. Se establecióla fuente de pago de la siguiente manera:

1. EPS, si el pagador principal era una empresapromotora de salud.

2. Sisbén, si el pagador principal era el régimende subsidiado. De acuerdo con el Sistema Generalde Seguridad Social en Colombia, el Sisbén esun sistema para focalizar recursos estatales y deempleados de mayores recursos para la atencióna personas que no pueden atender el pago en elrégimen de contribución activa al sistema de salud.

3. Particular, si los costos eran asumidos por elpaciente o sus familiares.

El estrato socioeconómico se estableció a partirdel sistema de estratificación para el pago deservicios públicos en Colombia, entre 1 y 6, elcual se ha utilizado previamente (16).

Causas de hospitalización y comorbilidad

Se definió como causa de hospitalización todacondición aguda o crónica que motivara en formadirecta la hospitalización. Se incluyeron lassiguientes causas: infección, exacerbaciones(actividad de la enfermedad), eventos vasculares(accidente cerebrovascular isquémico ohemorrágico, angina de pecho o infarto demiocardio, isquemia mesentérica), reacciónmedicamentosa, cirugía de urgencia, cirugíaelectiva y otras (causas no incluidas en las seiscategorías previas).

Se estableció que una condición mórbida asociadaera toda aquella patología crónica que acompañabala artritis reumatoidea que por sí misma podríamotivar la hospitalización o no hacerlo. Se evaluóla presencia de las siguientes: hipertensiónar ter ial, enfermedad coronara, diabetes,enfermedad pulmonar crónica, fibromialgia,osteoporosis, anemia, hipotiroidismo y enfermedadcutánea crónica. Las patologías no incluidas enla lista anterior se consideraron como "otras",incluso depresión, enfermedad ácido péptica ysíntomas oculares inespecíficos.

Patrón de evaluación de costos

Previa evaluación de los costos totales a partirde la factura elaborada para el pagador principal

al egreso del paciente, se establecieron los costostotales de la admisión y se determinaron, en formacategórica, los siguientes tipos de costosdirectos:

1. De asistencia médica, representados por todoslos costos por evaluaciones de personalmédico general y todas las especialidades quehubiesen intervenido en el tratamiento delpaciente durante su hospitalización.

2. De la cama, los cuales representaron todoslos costos de hotelería, alimentación ycuidados básicos de enfermería.

3. De pruebas de laboratorio, es decir, aquelloscostos generados por los perfiles de laboratoriobásico no intervencionista, incluidos losestudios de imágenes.

4. De los medicamentos, aquéllos generados porel suministro y la aplicación de medicamentosdurante el período de estancia.

5. De procedimientos quirúrgicos.

6. De otros procedimientos diagnósticos, en estacategoría se incluyeron aquellos procedimientosdiagnósticos que hubiesen requerido algún tipode intervencionismo, tales como arteriografías,artrocentesis diagnósticas y terapéuticas, asícomo biopsias.

7. De material médico-quirúrgico, correspondientea todos los materiales necesarios para laprestación del servicio médico o quirúrgico,tales como los utilizados en instrumentaciónquirúrgica, uso de monitores, ventiladores ymáquinas de anestesia.

Ajuste de costos

Los datos se obtuvieron inicialmente en pesos,se ajustaron de acuerdo con el índice de preciosal consumidor (IPC) y, posteriormente, seconvirtieron a dólares de Estados Unidos aseptiembre de 2003.

Análisis estadístico

Se utilizaron porcentajes y medidas de tendenciacentral para describir todas las variables clínicasy demográficas, así como para la categorizaciónde los costos generados durante la hospitalización.

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Cuadro 2. Costos directos por tipo, en dólares de Estados Unidos.

Tipo de costo Suma Media ± DE IC %

Asistencia médica 2.392,8 41,2 ± 66,7 23,7-58,8 3,0Ocupación de la cama 10.055,2 176,4 ± 288,8 99,8-253,0 12,6Laboratorio 3.937,4 75,7 ± 107,6 45,7-105,7 4,9Medicamentos 42.706,5 723,8 ± 2.145,3 164,7-1.282,9 53,9Procedimientos quirúrgicos 4.938,4 379,8 ± 435,9 116,4-643,3 7,2Otros procedimientos diagnósticos 1.652,7 38,4 ± 32,4 28,4-48,4 2,1Materiales médico-quirúrgicos 13.265,8 224,8 ± 766,3 25,2-424,6 16,7Total 79.203,6 1277,4 ± 2.541,2 632,1-1.922,8 100

DE: desviaciones estándar; IC: intervalo de confianza

Cuadro 1. Características clínicas y demográficas de 41pacientes con artrit is reumatoidea que requirieronhospitalización.

Variable

Edad (años) 45,2 ± 14,70

Mujer (%) 71

Duración de la enfermedad (años) 9,80 ± 9,01

Estrato socioeconómico (%)1 1,62 32,33 54,84 6,55 4,8

Procedencia (%)Rural 11,3Urbana 88,7

Pagador principal (%)*EPS 95,2Particular 4,8

Motivo de ingreso (%)*Infección 9,7Actividad de la enfermedad 59,7Evento vascular 1,6Reacción adversa a medicamentos 1,6Cirugía electiva 12,9Cirugía de urgencia 4,8Otras 9,7

* Corresponde a 62 hospitalizaciones.

Se realizó un análisis de varianzas entre lasdiversas variables categóricas y los costos totales.El valor de p<0,05 se consideró significativo.

Resultados

Características clínicas y demográficas

Durante el período de estudio se hospitalizaron41 pacientes en 62 opor tunidades (0,34hospitalizaciones por paciente por año). La

principal causa de hospitalización fue la actividadde la enfermedad (cuadro 1). En 30 de las 62hospitalizaciones (48,4%) se observó, al menos,una morbilidad asociada, de las cuales lahipertensión arterial representó el 24,2% y laenfermedad coronaria el 8,2%. El promedio deestancia fue de 4,95±6 días. El cuadro 1 resumeotras características clínicas y demográficas delos pacientes que participaron en el estudio.

Análisis de costos

En 95,2% de las hospitalizaciones, las EPS fueronlos pagadores principales (cuadro 1). Los costosajustados totales de hospitalización para las 62hospitalizaciones sumaron US$79.203. Elpromedio de los costos totales fue de US $1.277,y el costo promedio del día de hospitalización fuede US$235.

En el cuadro 2 se muestran los costos porcategorías. Los costos de las medicacionesrepresentaron más de la mitad de los costostotales, mientras que los costos de asistenciamédica representaron apenas el 3%.

En el análisis de varianza (cuadro 3), elcomportamiento de los costos permaneció muyestable con respecto al tiempo de evolución de laartritis reumatoidea y al número de morbilidadesasociadas; sin embargo, al analizar éstas en formaindividual, se observó un incremento substancialde los costos cuando existía enfermedadcoronaria. La presencia de enfermedad cutáneacrónica mostró un costo elevado; sin embargo, elincremento desproporcionado de los costos conrespecto a esta morbilidad se debió al caso deuna sola paciente, cuyos costos totales de

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Cuadro 3. Análisis de varianza mediante la prueba de Kruskal Wallis para comparaciones entre grupos para loscostos totales de 62 hospitalizaciones en 41 pacientes con artritis reumatoidea.

Variables N RM Media ± DE P

Número de morbilidades asociadas0 32 26,11 663,42 ± 1.150,35 0,091 26 37,44 2.119,44 ± 3.573,902 2 29,50 315,18 ± 55,933 2 42,50 1.119,30 ± 1.086,26

Morbilidades asociadasHipertensión arterial 15 14,80 394,94 ± 381,68 0,004Enfermedad coronaria 9 31,94 3.881,93 ± 3.173,41Enfermedad cutánea 7 25,43 2.516,41 ± 5.405,41Otras 10 17,35 1.375,24 ± 1.871,58

Días de estancia1-2 17 16,24 245,46 ± 48,65 <0,0013-7 21 29,00 1.398,28 ± 528,91>8 19 40,42 2.157,57 ± 827,10

Duración de la enfermedad (años)0-3 16 23,78 463,42 ± 815,74 0,094-6 14 40,00 3563,82 ± 4.486,177-15 17 29,76 694,87 ± 1.025,48>16 15 33,77 672,18 ± 863,11

RM: rango medio; DE: desviacion estándar

hospitalización fueron de US$14.770 y su estanciahospitalaria fue de 44 días.

Discusión

El impacto económico de las enfermedadesreumáticas es enorme. No obstante, aunque suprevalencia e incidencia es alta, la disponibilidadde recursos para atender tales pacientes eslimitada (17,18). En el presente estudio seexaminaron las causas, los costos y el impactode la morbilidad asociada en pacienteshospitalizados en un centro universitario dereferencia de Medellín, lo que permite obtenerdatos confiables.

Los resultados señalan que el daño orgánico dela artritis reumatoidea es causa de hospitalizaciónen 60% de los casos, y que la cirugía y lainfección representan el 18% y el 10%, respectiva-mente. Es importante señalar que varios pacientesfueron hospitalizados en diversas oportunidades(promedio 1,51 veces), y que el número dehospitalizaciones por paciente por año fue de 0,34.En el presente estudio no se calculó la frecuenciade pacientes con ar tritis reumatoidea querequirieron hospitalización; no obstante, otrosautores han señalado que ésta oscila entre el

6,5% y el 15,1% (19,20). El rango variable de estafrecuencia puede explicarse por la falta de criteriosdefinidos de hospitalización para los pacientes conartritis reumatoidea y por las diferencias endisponibilidad de recursos de cada sistema desalud.

El tiempo promedio de estancia hospitalaria fuede 5±6 días y el costo promedio de día hospitalariofue de US$235. Otros estudios han señaladoestancias promedio más prolongadas (19)mientras que algunos autores estiman que el usode hospitales de día y la atención domiciliariapudieran ser un recurso para el tratamiento de lospacientes con artritis reumatoidea que requieranhospitalización (20).

En términos porcentuales, el costo de losmedicamentos fue el principal rubro seguido porel costo del material médico-quirúrgico (utilizadoen monitoría, asistencia y procedimientos),mientras que los costos de los honorarios médicosrepresentaron sólo 3%. El número de morbilidadesasociadas per se no mostró tener impactosignificativo sobre los costos. Por el contrario, laenfermedad cardiovascular fue un determinanteimportante en los costos de la hospitalización.

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De manera similar, pero no sorprendente, el númerode días de estancia fue proporcional al incrementode los costos (cuadro 3).

Es frecuente que los pacientes con artritisreumatoidea tengan condiciones asociadas quepueden incrementar su morbimortalidad. Kroot etal. (21) mostraron que el 27% de los pacientescon artritis reumatoidea tuvieron, al menos, unacomorbilidad y que la hipertensión arterial y laangina de pecho fueron las más frecuentes. En elmismo estudio, las enfermedades cardio-vasculares fueron las responsables del 29% detoda la morbilidad asociada (21). En el presenteestudio se registró hipertensión arterial en el 24%de las hospitalizaciones (cuadro 3). Cifra muysimilar (21%) se registró en 168 pacientesambulatorios tratados en nuestra Unidad (22).

La enfermedad cardiovascular es una causaimportante de mortalidad en los pacientes conartritis reumatoidea (23-25). A pesar de que eltabaquismo ha sido implicado como un factor desusceptibilidad y gravedad de la ar tr itisreumatoidea (26-28), no se asocia significativa-mente con la morbilidad asociada ni con el riesgode enfermedad cardiovascular en estos pacientes(22,27,29). Si bien algunos factores de riesgotradicionales podrían estar implicados en eldesarrollo de la enfermedad cardiovascular en laartritis reumatoidea (23-26), es la inflamaciónpropia de la enfermedad el principal factor dedisfunción endotelial y génesis de arteriosclerosis(12,31-33). Se han estudiado varios marcadoresen la enfermedad cardiovascular asociada con laartritis reumatoidea, entre los cuales están lavelocidad de sedimentación globular y la proteínaC reactiva, así como niveles elevados deanticuerpos contra lipoproteínas de baja densidadoxidadas, aumento en la expresión de moléculasde adhesión endotelial, niveles elevados de homo-cisteína, algunos marcadores de trombosis comoel fibrinógeno, alteración de la fibrinólisis y otrosestados de hipercoagulabilidad (31-34).

El evento inicial en el desarrollo de la enfermedadcardiovascular en la artritis reumatoidea es ladisfunción endotelial cuyas vías efectoras puedenestar dirigidas desde la misma articulación através de la producción elevada de citocinas como

el FNTα e IL-6 que tienen la capacidad de interferiren diferentes niveles del metabolismo (35), ya queproducen alteraciones en el perfil lipídico y en laresistencia periférica a la insulina, promueven laexpresión de moléculas de adhesión, incrementanel estrés oxidativo, estimulan la síntesis de óxidonítrico por parte de los monocitos y las célulasendoteliales, e incrementan la oxidación de lasLDL, todo lo cual acelera el proceso deaterogénesis (36).

En el presente estudio las infecciones motivaronla hospitalización en cerca del 10% de los casos(cuadro 1). Éstas pueden ser causa de morbilidady mortalidad en los pacientes con artritisreumatoidea (12). No obstante, es difícil diferenciarentre el peso que tiene la enfermedad en sí mismay el efecto del tratamiento de la enfermedad en eldesarrollo de las mismas. Por un lado, lospacientes con ar tr itis reumatoidea tienenalteraciones en la inmunidad celular que incluyendisminución en el número y la función de loslinfocitos T supresores y de las células NK y, porotro, es conocido el efecto inmunosupresor de losfármacos, tales como los esteroides y elmetotrexato (37). La incidencia de infecciones enpacientes con artritis reumatoidea se ha reportadode 0,17 nuevas infecciones por paciente-año,principalmente del tracto respiratorio superior, lapiel y el tracto urinario, y favorecidas por elmetotrexato y los esteroides (38). La recienteaparición de medicamentos biológicosbloqueadores del FNTα, en especial el Infliximab,se ha asociado al desarrollo de tuberculosis (39).

Otras morbilidades asociadas como la enfermedadácido péptica y la osteoporosis no tuvieron un granimpacto sobre los costos directos dehospitalización en el presente estudio; noobstante, ambas deben ser evaluadas en lospacientes con artritis reumatoidea, dado quetienen impacto, no sólo en la calidad de vida delos mismos, sino también sobre los costosgenerados por la enfermedad (11,12).

En resumen, el presente estudio evaluó las causasy los costos de la hospitalización de los pacientescon artritis reumatoidea, señalando la enfermedadcardiovascular como la principal morbilidadasociada, con un significativo impacto en el

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incremento de los costos directos de ésta. Por lotanto, su manejo eficaz así como la prevención yel control de la hipertensión arterial, deben serconsiderados en el tratamiento de los pacientescon artritis reumatoidea, no sólo para reducir loscostos que ella genera sino también para prevenirel riesgo de mortalidad que la enfermedadcardiovascular acarrea (23-25,40). A la luz deestos resultados consideramos pertinentemencionar algunas estrategias a fin de mejorar elestado funcional e impacto económico de estaenfermedad:

1. Intervención temprana y adecuada. La terapiacon medicamentos modificadoras de laenfermedad debe iniciarse tan temprano comosea posible dentro de los tres primeros mesesde inicio de los síntomas con el fin de buscarla remisión de la enfermedad y disminuir laposibilidad de aparición de erosiones ydeformidades articulares. Cuando la respuestaa las dosis adecuadas de metotrexato essubóptima, debe considerarse la combinaciónde varios fármacos modificadores de laenfermedad o el uso de terapia biológica conanti-FNTα (41-43). La intervención temprana yla terapia combinada con fármacosmodificadores de la enfermedad han mostradoser más eficaces en el control de laenfermedad y en la reducción de los costosen comparación con el uso de terapia única(14,45). El tratamiento antiinflamatorio eficazpuede evitar el desarrollo de arterioesclerosisy enfermedad cardiovascular y, por tanto,disminuir la mortalidad y el elevado costo dela artritis reumatoidea (32,45).

2. Hospitales de día. Diversas formas de atenciónde los pacientes durante el día, así comootros mecanismos de cuidado ambulatorio porpersonal de enfermería cualificado hademostrado ser una estrategia efectiva en eltratamiento de la artritis reumatoidea queamerita su pronta implantación y regulaciónpor parte de los actores del sistema de salud(46-48).

3. Consideración y reducción de los costosindirectos. Los costos indirectos de unaenfermedad están representados por la pérdidade productividad. Desde la perspectiva social,

en la que se evalúan todos los costosgenerados por la enfermedad, tanto parapagadores principales como para el aparatoproductivo de una nación, los costos indirectoshan sido subestimados en la mayoría de losestudios económicos; no obstante, se hamencionado que éstos pueden superar entredos y tres veces el valor de los costos directos(49,50). Por lo tanto, es necesario limitar lasausencias laborales y las jubilacionesprematuras por medio de intervencionestempranas y adecuadas en el curso de laartritis reumatoidea, tal como se mencionóanteriormente.

Agradecimientos

Los autores expresan su gratitud a los tresrevisores anónimos del presente trabajo por susimportantes opiniones; a José Humberto Duquepor su apoyo al desarrollo del presente trabajo, aGabriel J. Tobón y José F. Camargo por sucolaboración en la consulta de pacientes, y a ÁngelaRestrepo por su lectura crítica del manuscrito.

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Biomédica 2004;24:375-84 MICROSPORIDIOSIS INTESTINAL EN PACIENTES POSITIVOS PARA VIH

ARTÍCULO ORIGINAL

Frecuencia de microsporidiosis intestinal enpacientes positivos para VIH mediante las técnicas de

Gram cromotropo rápido y PCRJorge H. Botero 1,3, Martha Nelly Montoya 1,3, Adriana Lucía Vanegas 3,

Abel Díaz 2, Luis Navarro-i-Martínez 4, Fernando Jorge Bornay 4, Fernando Izquierdo 5,Carmen del Águila 5, Sonia del Pilar Agudelo 1,3

1 Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín,Colombia.

2 Centro de Investigaciones Médicas, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.3 Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales, Corporación Académica para el

Estudio de las Patologías Tropicales, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.4 División de Parasitología, Universidad Miguel Hernández, Elche (Alicante), España.5 Sección de Biología Animal y Parasitología, Universidad de San Pablo, Madrid, España.

Los microsporidios son protozoos intracelulares obligados, implicados en procesos de diarreapersistente en pacientes con sida, aunque no son exclusivos de este grupo de pacientes. Laprevalencia de microsporidios en diferentes países varía entre 8% y 52%. En nuestro medio nose conoce su frecuencia, por lo que este trabajo se propuso determinar la frecuencia demicrosporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH, mediante la prueba del Gramcromotropo rápido (quick hot Gram) y la PCR; para esto se realizó un estudio prospectivo,descriptivo, con una población intencional de todos los pacientes positivos para VIH remitidosal Laboratorio del Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinales porlas diferentes instituciones de atención de pacientes positivos para VIH de Medellín en elperiodo comprendido entre agosto de 2001 y septiembre de 2002. Se hizo una encuestaclínico-epidemiológica y se practicaron análisis coprológicos seriados que incluían examendirecto, por concentración y tinciones especiales para coccidias y microsporidios intestinales;además, se solicitó recuento de linfocitos TCD4+ y carga viral.Se estudiaron 103 pacientes en edades comprendidas entre 2 y 74 años; el 70% (72/103)presentaba diarrea al ingreso al estudio; la mayoría (83,5%) fueron hombres. La frecuenciaglobal de microsporidiosis intestinal fue de 3,9% (4/103); se encontraron tres pacientes positivospara Enterocytozoon bieneusi y uno con Encephalitozoon intestinalis; otras parasitosisintestinales representaron el 39,8%. La frecuencia de microsporidiosis en este estudio fuerelativamente baja; además, como era de esperarse, la mayoría de los casos de microsporidiosestuvieron asociados con diarrea prolongada y recuentos de LTCD4+ menores de 100 cél/µl ycargas virales superiores a 100.000 copias (3/4).

Palabras clave: VIH, microsporidiosis/epidemiología, diagnóstico, coloración quick hot Gramcromotropo, PCR.

Frequency of intestinal microsporidian infections in HIV-positive patients, as diagnosis byquick hot Gram chromotrope staining and PCR

Microsporidia are intracellular obligate parasites, today mainly associated with diarrhea inAIDS patients. Microsporidia prevalence ranges from 8% to 52% in different countries, asevaluated by several diagnostic methods, such as the stain test and PCR. In Medellin, Colombia,its frequency is unknown, and hence, a study was undertaken to determine the frequency ofintestinal microsporidiosis in HIV patients, by means of the quick-hot Gram chromotrope testand the PCR. A prospective and descriptive study of an intentional population of all HIV-positivepatients was sent to the Grupo Interdisciplinario para el Estudio de las Parasitosis Intestinaleslaboratory by institutions treating the HIV-positive patients of Medellín between August 2001

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Biomédica 2004;24:375-84BOTERO J.H., MONTOYA M.N., VANEGAS A.L. et al.

and September 2002. The clinical-epidemiological survey included a serial stool test with directconcentration and special stains for coccidiae and intestinal microsporidia. In addition, countsof lymphocytes TCD4+ and viral load were requested. One hundred and three patients withages ranging from 2-74 years were evaluated. Seventy percent presented with diarrhea -mostly in men (83.5%). The overall frequency of intestinal microsporidiosis was 3.9% and thatof other intestinal parasitic infections was 39.8%. Three of the four patients positive formicrosporida were infected with Enterocytozoon bieneusi and one with Encephalitozoonintestinalis. The microsporidiosis frequency was relatively low with 3 of the 4 cases associatedwith protracted diarrhea, counts of LTCD4+ below 100 cel/µl and viral loads up to 100.000copies.

Key words: human immunodeficiency viruses, microsporidiosis/epidemiology, diagnostic, quick-hot Gram chromotrope staining, PCR.

En la actualidad, la microsporidiosis se considerade distribución cosmopolita; el número de casosreportados se ha incrementado notoriamente y sehan documentado casos en individuos de los cincocontinentes, la mayoría de éstos, enfermosinfectados con el virus de la inmunodeficienciahumana (VIH) (1,2).

Existen diferentes series clínicas en las que sereportan frecuencias variables de microsporidiosis(3-5); sin ser una infección exclusiva del hospederoinmunocomprometido grave (6), la mayorprevalencia se observa en estos pacientes. Losestudios de Europa y Estados Unidos han reveladocifras entre el 6% y el 60% en este mismo grupode pacientes (2).

Aunque en Colombia se han diagnosticado casosaislados, no se conoce la prevalencia real de estaenfermedad; hasta la fecha, sólo existe un estudiosistematizado realizado en Bogotá en el que seencontró una prevalencia de microsporidiosisintestinal de 3,5% en pacientes positivos para VIH,utilizando técnicas de tinción (7). Quizá laausencia de un método diagnóstico efectivo parala identificación de los microsporidios limita labúsqueda, lo que dificulta establecer diagnósticosetiológicos en infecciones subclínicas y clínicas,además de no permitir un manejo adecuado yracional de los pacientes, especialmente, lospositivos para VIH que consultan por procesosdiarreicos prolongados a los cuales no se lesreconoce la causa de su proceso y, por tanto,

su tratamiento y manejo no son los másconvenientes.

Debido a que las esporas de los microsporidiosson muy pequeñas, 1 a 2 µm, el diagnóstico porlaboratorio inicialmente se basó en su detecciónen las biopsias intestinales por medio del uso dela microscopía electrónica. Sin embargo, estatécnica es invasiva, poco sensible y costosa.Posteriormente, se emplearon diferentes métodosde tinción como la tricrómica modificada por Weber(8,9), pruebas fluorescentes con fluorocromoscomo el uvitex o el blanco de calcoflúor (10,11) y,más recientemente, la prueba del Gramcromotropo rápido (quick-hot Gram) (11,12) conresultados comparables en cuanto a sensibilidad,especificidad y valores predictivos entre estasdiferentes pruebas, las cuales son muy útiles enel diagnóstico inicial de la microsporidiosisintestinal. Sin embargo, es importante resaltar quelas pruebas por tinción son incapaces de realizardiferenciación de especie, la cual sólo es posiblemediante la microscopía electrónica, la inmuno-fluorescencia con anticuerpos monoclonales o lareacción en cadena de la polimerasa (PCR) (9,13-29).

La diferenciación de especie constituye un hechodeseable para un mejor abordaje terapéutico delos pacientes, al igual que permite un manejo másracional. Además, se debe establecer la especiecon el propósito de conocer la epidemiología realde cada uno de los microsporidios implicados eninfecciones del tracto gastrointestinal, lo cualredunda en un mejor conocimiento de estainfección parasitaria; por estas razones, se haceindispensable realizar el diagnóstico general de

Correspondencia:Jorge H. [email protected]


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la microsporidiosis intestinal y, posteriormente, laidentificación de la especie implicada.

La microsporidiosis puede ser más frecuente delo estimado hasta el momento, por lo cual se hizonecesario en nuestro medio desarrollar un trabajocoordinado para establecer la frecuencia demicrosporidiosis intestinal en pacientes positivospara VIH e implementar la técnica por coloracióndenominada Gram cromotropo rápido (quick hotGram) y PCR para el diagnóstico global demicrosporidiosis e identificación de especie,respectivamente (11,12).

Metodología

El estudio fue prospectivo, descriptivo, deprevalencia o corte transversal.

Población y muestra

La población fue intencional de todos lospacientes de Medellín positivos para VIH remitidosal Laboratorio del Grupo Interdisciplinario para elEstudio de las Parasitosis Intestinales por lasdiferentes instituciones de atención de pacientespositivos para VIH en el período comprendido entreagosto de 2001 y septiembre de 2002, la cualincluyó 103 pacientes remitidos.

A cada paciente se le aplicó una encuesta clínico-epidemiológica que incluía las variables de edad,sexo, ocupación, grado de escolaridad,procedencia, nivel socioeconómico, condicioneshigiénico-sanitarias, convivencia con animales,presencia o ausencia de diarrea, número deevacuaciones y sintomatología gastrointestinalasociada; se anotaron en esta encuesta losresultados del recuento de CD4/µl y la carga viralrealizados en la Empresa Prestadora de Serviciosde cada uno de los pacientes.

Además, se solicitaron tres muestras de materiafecal con un intervalo interdiario entre cada unade ellas, a las cuales se les realizó examendirecto, por concentración, tinciones especialespara coccidias y microsporidios intestinales yPCR.

Tinción de Gram cromotropo rápido (quick-hot Gram)

Una vez recolectada la muestra de materia fecal,se hizo un extendido fino en placas que se dejaron

secar al aire y se fijaron con metanol absoluto(Analyticals, código 414854) durante 5 minutos;luego, se tiñeron con violeta de genciana (Merck,código 32041300) durante 1 minuto y se lavó elexceso de colorante con agua del chorro; lasplacas se sumergieron en solución de lugol (KI al0,66%, Merck código 551761, y yodo metálico al0,33%, Baker analyzed código 3162-1) durante 1minuto. El exceso de lugol se retiró por arrastrecon una solución decolorante (50 ml de etanol al95%, Merck, código k28410083, y 50 ml deacetona al 5%, Sigma, código 53406-4).

Posteriormente, se lavaron con agua del chorropara retirar el residuo de solución decolorante e,inmediatamente, se tiñeron así: se sumergieronlas placas en solución de cromotropo (cromotropo2R al 6%, Sigma, código c-3143; fast green FCFal 0,15% (Sigma, código F7258), ácidofosfotúngstico al 0,7% (Sigma, código P4006), yácido acético glacial al 3%, vol/vol (Sigma, códigoF6005) durante 5 minutos; se decolorararon conalcohol ácido (ácido acético glacial al 4,5%, vol/vol, y etanol al 90% a una concentración final del95,5%, vol/vol) durante 3 segundos; luego, sedeshidrataron con etanol al 95% durante 1 minuto;se repitió este paso dos veces, empleando alcoholetílico puro y, finalmente, se dejaron secar y semontaron las placas con EntellanMR (Merck,6302603); se leyeron en microscopio de luz a milaumentos.

Reacción en cadena de la polimerasa

Hasta la extracción, las muestras de materia fecalse conservaron congeladas a -20°C en etanol puro.

La extracción se realizó siguiendo el método deDa Silva et al. (14,16), utilizando el estuchecomercial FastDNA (BIO 101, Inc., Vista,California); para la purificación del ADN eluido seempleó el estuche QIAquick PCR purification(Quiagen Inc., Santa Clarita, California); por mediode este método se optimizó la recuperación deADN, se minimizó la presencia de inhibidores dela PCR y se redujo significativamente el tiempoempleado en cada muestra procesada.

Las regiones SSU-ARNr (subunidad pequeña delARN ribosómico) de los microsporidios seamplificaron utilizando cebadores específicos paraEncephalitozoon intestinalis, SINTF 5'TTTCGAG

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TGTAAGGAGTCGA3', cuya posición en lasecuencia es de 362 a 382 y SINTR5'CCGTCCTCGTTCTCCTGCCCG3', posición 861a 881, que amplifican un producto de 520 pb (númerode acceso al GeneBank UD9929); y paraEnterocytozoon bieneusi, EBIEF1 5'GAAACTTGTCCACTCCTTACG3', cuya posición en la secuencia es295 a 315 y EBIER1 5'CCATGCACCACTCCTGCCATT3', posición 881-901, con un producto deamplificación de 607 pb (número de acceso alGeneBank L16868)(15). Para la mezcla de lareacción se utilizaron 28,75 µl de agua desionizadaestéril, 5 µl de tampón 10X (Perkin Elmer, 100mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, gelatina0,01%), 4 µl de desoxinucleótidos trifosfatados(Perkin Elmer) a una concentración final de 1,25mM cada uno, 1 µl de cada uno de los iniciadores(F y R), 0,25 µl de AmpliTAQ polimerasa (PerkinElmer), 10 µl de ADN extraído, para un volumenfinal de 50 µl.

Las reacciones se llevaron a cabo en untermociclador GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conneticut, U.S.A.)en sistema de microplaca. Las condiciones dereacción de la PCR fueron: desnaturalización a94°C durante 30 segundos en todos los casos,anillado a 45°C para los iniciadores de E.intestinalis, y para E. bieneusi, a 55°C durante 30segundos y la extensión a 72°C durante 90segundos. En todos los casos se realizaron 35ciclos. Se añadió un control positivo en todas lasreacciones realizadas, que consistió en ADN deE. intestinalis o E. bieneusi en la PCR corres-pondiente, para cada uno de estos microsporidiosy como control negativo se agregó agua destilada.

El ADN amplificado se separó medianteelectroforesis con gel de agarosa al 2% en untampón tris 0,01 M, ácido bórico 0,09 M y EDTA0,001 M, a pH de 8,4 (Sigma), teñido con bromurode etidio y se visualizó mediante luz UV.

Los datos se tabularon en el programa Excel y elanálisis estadístico se realizó en Epi-Info 6.0. Seanalizaron variables demográficas (edad, sexo,ocupación, grado de escolaridad, procedencia,nivel socioeconómico, condiciones higiénico-sanitarias y convivencia con animales), clínicasy de laboratorio.

Aunque este estudio no presentaba ningún riesgopara el paciente, a cada uno se le sometió aconsideración el consentimiento informado parasu firma, en el cual se le daba a conocer entérminos entendibles, los fines, la pertinencia yla naturaleza del estudio, acogiéndose a lasnormas acerca de aspectos éticos deinvestigación en humanos de la Resolución008430 del Ministerio de Salud.

Resultados

Se estudiaron 103 pacientes positivos para VIH,con edades comprendidas entre 2 y 74 años, lamayoría (74,8%), como era de esperarse, en edadreproductiva. Del total de pacientes incluidos, el70% presentaba diarrea al ingreso al estudio; lamayoría (83,5%) fueron hombres (cuadro 1).

Tinción de Gram cromotropo rápido (quick-hot Gram) y PCR

De los pacientes evaluados por la tinción de Gramcromotropo rápido y PCR, cuatro fueron positivospara microsporidiosis intestinal (3,9%), con

Cuadro 1. Distribución de los pacientes positivos para VIH por rangos de edad y sexo de acuerdo con la presencia oausencia de diarrea.

Edad Mujeres Hombres N (%)(años) Diarrea (%) Diarrea (%)

+ - + -

0-4 2 (1,9) 0 1 (0,9) 0 3 (2,9)5-14 0 0 2 (1,9) 0 2 (1,9)15-44 12 (11,7) 1 (0,9) 43 (41,8) 21 (20,4) 77 (74,8)45-60 1 (0,9) 1 (0,9) 9 ((8,8) 2 (1,9) 13 (12,6)>60 0 0 2(1,9) 6 (5,8) 8 (7,7)Total 15 (14,6) 2 (1,9) 57 (55,4) 29 (28,1) 103 (100)

N: número absoluto de casos; +: pacientes con diarrea; -: pacientes sin diarrea

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edades de 24, 29, 33 y 35 años. Los cuatropacientes positivos se detectaron por PCR,aunque por tinción sólo fue positivo uno de ellos(figura 1). Del total de casos de microsporidiosisintestinal, el 75% (3/4) amplificó con los iniciadoresespecíficos para E. bieneusi (figura 2A) y el 25%(1/4) con los de E. intestinalis (figura 2B). Todoslos pacientes con E. bieneusi presentaronprocesos diarreicos persistentes (>14 días),cargas virales superiores a 100.000 copias yrecuentos de LTCD4+ inferiores a 100 células/µl,a diferencia del paciente positivo para E.intestinalis que no presentó diarrea y tenía unacarga viral de sólo 20.400 copias y un recuentode LTCD4+ de 396 células/µl.

Dado el reducido número de pacientes positivospara microsporidiosis intestinal no se pudieronrealizar comparaciones estadísticas entre lasvariables demográficas. Sin embargo, todos lospacientes positivos para microsporidios fueron delsexo masculino y el 50% (2/4) relató convivenciacon animales.

Otras parasitosis intestinales

En los 103 pacientes evaluados se obtuvo unafrecuencia global de parásitos intestinales de39,8%, con multiparasitismo de 6,8% (7/103),distribuidos de la siguiente manera: Cryptosporidiumsp. (18,4%), Entamoeba histolytica/dispar (9,7%),

Figura 1. Coloración de Gram cromotropo rápido (quick-hot Gram) para microsporidios intestinales. Se observa unamuestra positiva para microsporidios intestinales. La flechaseñala una espora que toma la coloración violeta pálido;nótese la vacuola posterior y el túbulo polar. Cámara NikonSDX, optiphot-2, objetivo 100X.

Figura 2. PCR para microsporidios intestinales. A.Amplificación de ADN mediante PCR para E. bieneusi. Carril1: marcadores de peso molecular; carril 2 y 6: control negativoy positivo, respectivamente; carriles 3, 4 y 7 al 12: pacientes.

B. Amplificación de ADN mediante PCR para E. intestinalis.Carril 1: marcadores de peso molecular; carril 2 al 5:pacientes; carril 6 y 7: control positivo y negativo,respectivamente.

Giardia duodenalis (4,0%), Strongyloidesstercoralis (3,9%), uncinarias (2,9%) e Isosporabelli, Ascaris lumbricoides y Trichuris trichiura,1,9,% cada uno.

Los pacientes con microsporidiosis nopresentaban otros parásitos intestinales, aexcepción de un paciente con E. bieneusi en elque se encontró coinfección con Cryptosporidiumsp.

Discusión

A par tir de los primeros informes demicrosporidiosis como agentes de infecciónhumana, el número de casos informados se haincrementado notoriamente hasta el punto que ala infección por microsporidios se le considera dedistribución cosmopolita. Hasta la fecha se handocumentado casos en individuos de los cincocontinentes y la inmensa mayoría son enfermoscon sida (9,30-33).

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Existen diferentes series clínicas de Europa,Norteamérica y Latinoamérica, en las que seinforman frecuencias variables de microsporidiosisen pacientes con sida y diarrea crónica (1,9,34-44). La frecuencia de microsporidiosis intestinalencontrada en este estudio (3,9%) en un períodode un año fue relativamente baja, semejante a lade 3,5% reportada por Flórez et al., cifrascomparables con los estudios realizados enpaíses en donde la prevalencia de sida es similara la de Colombia (32,45-51). En Brasil (48) yVenezuela (52) que son países que presentantasas más altas de pacientes positivos para VIH,se han informado prevalencias de microsporidiosisde 27,5% y 50%, respectivamente; porconsiguiente, se debe tener en cuenta que amedida que aumenten los casos de sidaincrementará, probablemente, la microsporidiosisintestinal en estos pacientes.

E. bieneusi ha sido identificado recientemente enmuestras fecales de perros, gatos y cerdos(53,54). Además, E. intestinalis se ha encontradoen diferentes mamíferos (30,55), inclusivehospederos humanos inmunocompetentes (56,57),lo que ha sugerido un origen zoonótico de lasinfecciones por esta especie; aunque el 50% delos pacientes positivos para microsporidiosisintestinal en este estudio (2/4) relató convivenciacon mascotas, debido al bajo número de casosencontrados no es posible hacer asociacionesestadísticas con respecto a variables clínico-epidemiológicas.

Dada la falta de disponibilidad de pruebas parainmunodiagnóstico, la detección de la infecciónpor microsporidios se basa actualmente en lademostración directa del parásito por medio delas técnicas de coloración (8-13,26,58,59); sinembargo, la sensibilidad y la especificidad sonbajas y variables, como se evidenció en estetrabajo, en el cual sólo fue posible diagnosticarun paciente por el Gram rápido.

Por otro lado, con las técnicas por tinción no esposible realizar la diferenciación de especie, lacual adquiere importancia clínica dado que eltratamiento varía según se encuentre infecciónpor E. intestinalis o E. bieneusi. En la actualidad,la diferenciación de especie sólo es posible pormedio de las técnicas de inmunofluorescencia

indirecta que emplean anticuerpos policlonales omonoclonales dirigidos contra cada una de lasespecies de microsporidios (8,9,13,60,61), o porel uso de la PCR (9,13-29).

La PCR es una técnica rápida, sensible yespecífica comparada con las técnicas inmuno-fluorescentes y el Gram rápido (13,25); detectaun umbral de 102 esporas por ml de materia fecal,mientras que la técnica de la coloración del Gramrápido requiere 104-106 esporas/ml (8), lo que podríaexplicar el resultado obtenido en este estudio enel que se encontraron 4 pacientes positivos porPCR y sólo 1 de ellos por la técnica de coloracióndescrita. Por esta razón, la PCR se constituye enuna herramienta diagnóstica atractiva para suempleo bajo condiciones de laboratorio en su usocotidiano, ya que, a la vez, permite hacerdiagnóstico y diferenciación de especie demicrosporidios intestinales.

Al analizar los resultados del recuento de LT CD4+y las cargas virales de los pacientes positivospara microsporidiosis intestinal se encontró quelos tres pacientes con E. bieneusi presentabandiarrea, tenían un recuento de LTCD4+ menor de100 células/µl y una carga viral mayor de 100.000copias, mientras que el paciente con E. intestinalisera asintomático, tenía un recuento de LTCD4+superior a 100 células/µl y una carga viral de20.400; estos resultados están de acuerdo con loreportado por diferentes autores con respecto ala asociación entre el proceso diarreico y ladisminución de LTCD4+ y el aumento de la cargaviral (9,62), lo que debe llamar la atención de losmédicos para el seguimiento de los pacientespositivos para VIH con diarrea o sin ella.

Además, es impor tante destacar que lamicrosporidiosis en este trabajo fue la cuartaparasitosis en orden de frecuencia, sólo superadapor criptosporidiosis, amibiosis y giardiosis, lo cualaunque está de acuerdo con los diferentesestudios en los que la criptosporidiosis es laprincipal causa de diarrea persistente en pacientespositivos para VIH (35,38,43,63,64), dejavislumbrar la importancia que va adquiriendo lamicros-poridiosis en este tipo de pacientes.

Con respecto a otros parásitos intestinales, eneste estudio se encontró una frecuencia de 18,4%

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de Cryptosporidium sp., que concuerda con losdiferentes estudios realizados en grupos depacientes positivos para VIH de Norteamérica,Latinoamérica y Colombia que informanfrecuencias entre el 10% y el 50% (7,40,42-44,52,65), contrario a lo descrito en individuosinmunocompetentes cuyas frecuencias son unpoco menores, del 3% al 8% (52,66-68).

Por otro lado, se observó una gran variabilidadcon relación a la frecuencia de parásitosintestinales en pacientes positivos para VIH,informados por autores latinoamericanos ycolombianos. La frecuencia de 9,7% para E.histolytica/dispar, reportada en este estudio, fuetres y media veces mayor que la encontrada porLópez et al. (69); sin embargo, estuvo por debajode la notificada por Flórez et al., del 13% (7), yotros estudios como el de India de 14,9% (70). Lafrecuencia de G. duodenalis de 4,0% fueligeramente superior a la encontrada en el estudiode Flórez et al. (7), 1,8%, semejante a la de Lópezet al. (69), 4,7%, pero relativamente bajacomparada con otros estudios como el de India,8,3% (70), y Brasil, 16% (71). En el caso de S.stercoralis la frecuencia de 3,9% reportada fuemucho mayor a la del estudio de López et al.,0,9% (69), pero similar a la de Flórez et al., 3,5%(7). Además, es importante señalar que lasuncinarias, A. lumbricoides, T. trichiura e I. bellifueron los parásitos con el menor número de casosencontrados, 2,9% para las uncinarias y 1,9%para los restantes.

Esta variabilidad en la frecuencia de parásitosintestinales en este grupo de pacientes es deesperar debido a que los estudios se realizaronen áreas geográficas diferentes, en donde lascondiciones higiénico-sanitarias son hetero-géneas; por tanto, la prevalencia de las parasitosisintestinales en cada uno de estos lugares no esigual. De otro lado, estos trabajos se hicieron enépocas distintas y, además, no se sabe si fueronprescritas terapias profilácticas contra parásitosintestinales por los médicos tratantes o productode la automedicación por parte del paciente.

En conclusión, la microsporidiosis intestinal estápresente en nuestro medio y se podría pensar quepuede ser más frecuente a la notificada en esteestudio. Hay que considerarla no sólo en

hospederos inmunocomprometidos graves, sinotambién en pacientes asintomáticos positivos paraVIH, o con recuentos de LTCD4+ mayores de 100células/µl, al igual que en pacientes sometidos atrasplantes de órganos (72,73) e, incluso, enindividuos inmunocompetentes (74). Por lo tanto,se debe continuar con la búsqueda activa decasos utilizando, además de la prueba del Gramrápido, la PCR la cual nos permite captar un mayornúmero de casos y, a la vez, determinar la especieinvolucrada del parásito (E. intestinalis o E.bieneusi).

Agradecimientos

Al Comité para el Desarrollo de la Investigaciónde la Universidad de Antioquia, por la financiaciónde este proyecto. A la Dirección General deRelaciones Externas y Cooperación de laGeneralitat Valenciana de España por lafinanciación de las pruebas moleculares. A todoslos centros de atención en salud de pacientespositivos para VIH, a la Fundación Positivos porla Vida y la Fundación Eudes y a todos lospacientes que gentilmente participaron en esteestudio.

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Biomédica 2004;24:385-92 CICLO DE VIDA DE CULEX QUINQUEFASCIATUS

ARTÍCULO ORIGINAL

Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera:Culicidae) bajo condiciones no controladas en Bogotá

Myriam Janeth Salazar, Ligia Inés Moncada

Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

El objetivo de este trabajo fue estudiar varios aspectos del crecimiento y el desarrollo de losestadios inmaduros de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae), especieantropofílica frecuentemente encontrada en Bogotá. Con este fin, se realizaron dos experimentosen diferentes épocas del año 2001 (enero-febrero y septiembre-octubre), bajo condiciones nocontroladas (luz, temperatura y humedad relativa). Se colocaron recipientes plásticostransparentes con agua de charca a la que se le adicionó concentrado para perro; se tomaroncuatro balsas al azar para estudiar el ciclo de vida utilizando los parámetros de la tabla devida: mortalidad y supervivencia. Las hembras ovipositaron entre cinco y ocho días despuésde la ingestión de sangre. El número de huevos por balsa varió entre 152 y 203. La eclosiónde larvas L1 fue de 50% en el primer experimento y de 75% en el segundo. Se destacó lanaturaleza no sincrónica de la eclosión de las L1, la menor duración proporcional del estadiode pupa (11% del tiempo del desarrollo total) y la eficiencia del cambio pupa-adulto (98,61%).Se reporta una menor duración del ciclo de lo informado previamente. Además, los altosporcentajes de eclosión (83,58%), pupación (86,63%) y emergencia (98,61%) con lascondiciones presentes para estos experimentos (temperatura media 14,8°C y 15,1°C yhumedad relativa del 72,5% y 74,1%, respectivamente) indican el alto grado de adaptación deC. quinquefasciatus al ambiente bogotano. Estas características, más la capacidad vectorialy la resistencia a los insecticidas, hacen de esta especie un problema de salud pública.

Palabras clave: Culex quinquefasciatus/crecimiento&desarrollo, mortalidad.

Life cycle of Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) under uncontrolled conditions

Aspects of the growth and development were described for immature stages of Culexquinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae), an antropophilic mosquito species foundfrequently in Bogotá, Colombia. Two experiments were carried out during January-Februaryand September-October of 2001 under ambient environmental conditions. Oviposition occured5-8 days after blood ingestion. Females laid eggs in plastic containers filled with pooled waterwith high organic material content. The number of eggs per raft varied between 152 and 203.For the 2 trials, the hatch rate was 50% and 75%. The asynchronous egg hatch, the shortduration of the pupal stage (11% of the total development time, and the high efficiency of adultemergence from the pupal stage (98.6%) were noted. In general, these development timeswere shorter compared to those reported by other authors. Moreover, the high percentages ofhatch (83.6%), pupation (86.6%) and emergence (98.6%) under the average temperatureconditions of 14.8°C and 15.1°C, and average relative humidity of 72.5% and 74.1%, respectively)demonstrated adaptation of C. quinquefasciatus to Bogotá’s cool, high altitude environment.These characteristics, together with its vectorial capacity and the resistance to chemical controlmethods, could make this species become a risk for the health of human populations.

Key words: Culex quinquefasciatus/growth&development, mortality.

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Biomédica 2004;24:385-92SALAZAR M.J., MONCADA L.I.

Los mosquitos son los artrópodos hematófagosmás comunes y de mayor importancia médica yveterinaria porque causan molestias y transmitenagentes productores de enfermedades a granvariedad de especies de aves y mamíferos, inclusolos seres humanos. Hasta el momento se handescrito cerca de 3.000 especies de mosquitosy, aunque las especies vectoras constituyen unabaja proporción, los problemas ocasionados porlas enfermedades producidas por los agentestransmitidos por estos insectos son serios (1).

Los mosquitos del grupo Culex pipiens Linnaeus,1758 (Diptera: Culicidae) son vectores de algunosarbovirus y nemátodos que afectan al hombre ylos animales (2-4). Los miembros de este grupose distribuyen a lo largo y ancho del planeta,principalmente con dos especies: Culex pipiens,presente en zonas templadas y Culexquinquefasciatus, Say, 1823, que habita enregiones tropicales y subtropicales y abarca hastalas isotermas de 20°C (5); abunda principalmenteen América y África tropical, Medio y LejanoOriente, sur de Asia, Nueva Guinea, Australia yel sur de Estados Unidos, aunque existen zonasde intergradación (Norteamérica, norte del Japón,suroriente de Australia, Medio Oriente, área centralde Argentina, entre los 30° y los 33° de latitudsur, y África) donde se han reportado híbridos (6-7). Las dos especies se diferencian por caracteresmorfológicos y morfométricos, y tambiénpresentan comportamientos y característicasfisiológicas diferentes (7-11).

La posición taxonómica de ambas especiespermanece aún indefinida en las áreas geográficasdonde sus rangos de distribución se superponen;para distinguirlas se han utilizado característicasde tipo morfométrico (relación dv/d; dv: distanciaentre las extremidades de los brazos dorsales yventrales del mesosoma y d, distancia entre lasextremidades de los brazos dorsales del

mesosoma; de la genitalia masculina), fisiológico(mecanismos de hibernación y diapausa, desarrollode etapas inmaduras) etológico (búsqueda dehospedero) y ecológico (distribución geográfica)(7). Según Forattini (1965) (10,11), las dosespecies se pueden diferenciar a partir de larelación dv/d; para C. pipiens esta relación va de0 a 0,5, mientras que para C. quinquefasciatusestá entre 0,5 y 1,4. En un estudio llevado a cabopor Humeres et al. en 1998 (9) en la región centralde Argentina, donde hay intergradación de las dosespecies, los autores, basados en la divergenciay flujo genético, sugieren nuevamente que sondos subespecies ya que el entrecruzamiento deC. pipiens y C. quinquefasciatus es estable yocurre en los sitios en donde la temperatura esfavorable para el crecimiento de las dos (7).

C. quinquefasciatus es considerada una especieacentuadamente antropofílica (12) y es el mosquitodel género Culex que se encuentra asociado conmayor frecuencia al hábitat humano tanto urbanocomo rural en Colombia. Esta especie se harelacionado con la transmisión de filarias comoWuchereria bancrofti y Dirofilaria immitis, del virusdel Nilo occidental y de los virus causantes de laencefalitis de San Luis y la encefalitis equinavenezolana, entre otros (2,13). En áreas dondeno existe riesgo de transmisión de agentespatógenos por parte de esta especie, constituyeun problema de salud pública debido a la alergiaocasionada por su picadura y a las molestiascausadas por las altas densidades de poblaciónque alcanzan, como ocurre en el municipio deSibaté en la sabana de Bogotá (14).

Los estadios inmaduros se desarrollanpreferiblemente en depósitos de agua y loscriaderos son variados, constituidos por aguas conun alto grado de contaminación, abundantecontenido de materia orgánica, con detritos enproceso de fermentación, en ambientessombreados, lénticos o semilóticos, cercanos alambiente domiciliario (6).

Debido a su antropofilia acentuada, la resistenciaa los insecticidas, su capacidad vectorial y a lasaltas densidades que puede llegar a alcanzar, C.quinquefasciatus es un factor de riesgo para laspoblaciones urbanas (14-17). Por tanto, elconocimiento de los aspectos biológicos,

Correspondencia:Ligia Inés Moncada, Oficina 314F, Laboratorio deParasitología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional,Ciudad Universitaria, Bogotá, D.C., Colombia.Teléfono: (571) 316 5505 y (571) 316 5000, extensión 15032;fax: (571) 316 [email protected]


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fisiológicos y bioquímicos de la especie seconstituyen en el primer paso que conlleva a laimplementación de medidas que conduzcan alcontrol de las poblaciones de mosquitos en lasáreas urbanas.

En este estudio se determinó la duración deldesarrollo de las etapas inmaduras del mosquitoC. quinquefasciatus proveniente de la sabana deBogotá en condiciones de laboratorio, mediantedos experimentos realizados durante el 2001.

Metodología

Captura y mantenimiento de los mosquitos

Los mosquitos adultos fueron capturados en lafinca Marengo localizada a 4°42´ latitud norte y74°14´ longitud oeste a 2.543 msnm, eninmediaciones de la sabana de Bogotá, municipiode Mosquera (Cundinamarca) y se transportaronhasta el Laboratorio de Parasitología de la Facultadde Medicina de la Universidad Nacional paraestablecer el criadero y para su identificación. Losparentales fueron transferidos a una jaula (1 m x1 m x 1 m) y se mantuvieron con una dieta desacarosa al 10%. Como fuente sanguínea paralas hembras, se introdujo en la jaula un ratóninmovilizado, previamente anestesiado según elprotocolo del Bioterio Central de la UniversidadNacional de Colombia, el cual se acoge a la Ley84 de 1989. Se dispusieron recipientes de barrocolor natural y pintados de negro, y recipientesplásticos transparentes y blancos, a los cualesse les agregó agua de diferentes procedencias:charca, grifo y agua destilada, para que la hembradepositara sus huevos. Las balsas de huevos (setransfirieron a un recipiente con agua destilada yse transportaron a otra jaula (50 cm x 50 cm x 50cm) en donde las larvas se alimentaron conconcentrado para perros. El criadero se mantuvobajo condiciones no controladas de luz,temperatura y humedad relativa durante todo elexperimento. Las ventanas del recinto semantuvieron cerradas para evitar el escape de losmosquitos lo que, a su vez, evitaba mayoresvariaciones climáticas en el criadero.

Ciclo de vida

Se seleccionaron aleatoriamente 4 balsas dehuevos que fueron examinadas bajo estereoscopio

para determinar el número de huevos en cada unade ellas y se midió la longitud y el ancho.Posteriormente, se escogieron otras 4 balsas deun tamaño similar a las observadas y sedepositaron individualmente en recipientes conagua destilada, los cuales se revisarondiariamente. A medida que las larvas emergían ocambiaban de estadio, se trasladaron a recipientesrotulados con la fecha y el número de larvasdepositadas. De igual manera, cuando las larvasmudaron a pupas se trasladaron a nuevosrecipientes debidamente identificados con el finde establecer el número de pupas y la duracióndel estadio de pupa. Para establecer el númerode adultos, se contabilizó el número de exuviaspupales que quedaron en los recipientes. Se registróel número de individuos que pasó exitosamentede un estadio a otro y los que no lo lograron.

Los datos se utilizaron para hacer una tabla devida vertical, donde, x = etapa de desarrollo; lx =proporción de sobrevivientes en la etapa x (Nx/No); dx = número de individuos que mueren entrelas etapas (x-1) y x (Nx-1 - Nx); qx = probabilidad demorir entre x-1 y x (dx/Nx-1) y Lx = media de laprobabilidad de supervivencia entre x-1 y x (lx +lx+1)/2 (18). También se consignaron el porcentajede eclosión, el porcentaje de huevos que pasan alarvas LI; el de pupación, porcentaje de larvas L1que culminan exitosamente la pupación y el deemergencia, porcentaje de pupas que terminansu desarrollo e inician la vida adulta.

Para determinar la duración del desarrollo de lasetapas inmaduras de C. quinquefasciatus sellevaron a cabo dos experimentos, el primerodurante el periodo seco (28 de enero-28 de febrero)y el segundo durante la época de lluvia (13 deseptiembre-15 de octubre) de 2001. Los datos detemperatura media y humedad relativa diariasfueron registrados en la Estación Meteorológicade la Universidad Nacional durante los dosperiodos del experimento.


Los datos se analizaron mediante el programaestadístico SPSS 7.5. Se realizó la prueba F parahomogeneidad de varianzas entre losexperimentos realizados en las dos épocasdiferentes del año (18-20).

388


Resultados

La identificación de los ejemplares se realizómediante el uso de las descripciones y claves(11,12). La relación dv/d media encontrada en losejemplares fue de 0,67, relación que como ya hasido descrita por varios autores corresponde a C.quinquefasciatus (10-11,21,22) (figura 1).

El día inicial del ciclo correspondió al momentoen el que las hembras ingirieron sangre y el díafinal fue aquel en el cual emergió el último adulto.Entre los dos experimentos no hubo diferenciaestadísticamente significativa (p>0,05) en laduración de cada una de las etapas. Los mosquitosse mantuvieron en condiciones naturales de luz,temperatura y humedad relativa durante ambosperiodos. La temperatura promedio durante el

primer periodo fue de 14,8°C y de 15,1°C duranteel segundo, mientras que la humedad relativapromedio fue 72,5% y 74,1%, respectivamente.

En el cuadro 1 se consignan los datoscorrespondientes a la duración promedio de cadaetapa de desarrollo para los experimentos bajolas condiciones enunciadas anteriormente. Parala oviposición, las hembras mostraron unapreferencia marcada por los recipientes de plásticotransparente que contenían agua de charca. Eltiempo que tardaron las hembras en depositar loshuevos, una vez habían ingerido sangre, varióentre 5 y 8 días; la mayor variación en cuanto a laduración de cada etapa se presentó en losestadios larvarios III y IV. La duración mínima delciclo entre el periodo de huevo a adulto fue de 13días y la máxima de 24 días. La etapa de desarrolloque presentó menor duración fue la de pupa, conun 11% del tiempo de desarrollo total; el tercer yel cuarto estadio larvarios tuvieron la duraciónpromedio mayor (18% y 29% del tiempo dedesarrollo total, respectivamente), mientras quelas otras etapas tuvieron la misma duración, cadauna con el 14%.

En el cuadro 2 se consignan los resultados desupervivencia y mortalidad para cada estadio dedesarrollo en las condiciones estudiadas y losdatos concernientes a los porcentajes de eclosión,pupación y emergencia para C. quinquefasciatus.En el primer experimento sólo emergieron larvasa partir de dos balsas de huevos (50%), mientrasque en el segundo eclosionaron huevos de tresbalsas (75%). El número de huevos por balsa varióentre 152 y 203. En el primer experimento losparámetros para la tabla de vida se empezaron a

Figura 1. Terminalia del macho; se observan las distanciasentre los brazos ventrales y dorsales del mesosoma.Convenciones: dv: distancia entre los brazos ventrales ydorsales; d: distancia entre los brazos dorsales.

Cuadro 1. Duración en días de las etapas de desarrollo de C. quinquefasciatus (E1: experimento 1, enero-febrero de2001; E2: experimento 2, septiembre-octubre de 2001).

Ingestión - Huevo Larva I Larva II Larva III Larva IV Pupa huevo

E1 Promedio 7,0 1,5 2,2 2,2 3,0 5,0 1,5(días)IC 95% 5,05-8,95 0,52-2,48 2.09-2,31 2,08-2,32 76-3,24 4,75-5,25 1,37-1,63

E2 Promedio 5,5 2,7 2,7 2,7 3,5 5,3 2,0(días)IC 95% 3,38-7,62 1,9-3,5 1,9-3,5 1,9-3,5 1,38-5,62 3,18-7,42 1,05-2,95

389


considerar desde el segundo estadio larval,mientras que en el segundo se inició desde elmomento mismo de la oviposición. No se encontródiferencia significativa entre los experimentos paralas variables proporción de supervivientes (l

x)

(f=5,81, F=9,01; alfa=0,05), probabilidad de morirentre dos etapas (q

x) (f=5,81, F=9,01; alfa=0,05)

y probabilidad media de supervivencia entre dosetapas (Lx) (f=2,5; F=19,25; alfa=0,05). Aunque laproporción de supervivientes fue alta en todas lasetapas, la mayor probabilidad de morir se presentódurante el paso de huevo a larva (0,1642); a partirde este momento, la mortalidad se redujoconsiderablemente.

Discusión

La amplia distribución de C. quinquefasciatustanto en el hemisferio norte como en el sur exponea esta especie a una variedad de climas ycondiciones que son un reto para susupervivencia. En Colombia, C. quinquefasciatusse distribuye por casi todo el territorio nacionalen alturas que van desde los 0 hasta los 3000msnm (Becerra J. Proyecto: Estudio de loszancudos picadores que se encuentran en el

Distrito Capital de Santafé de Bogotá. SecretaríaDistrital de Salud, Subdirección de VigilanciaEpidemiológica. Santafé de Bogotá, 1992). Muchosde los estudios acerca del ciclo de vida de estaespecie, se han realizado bajo condicionescontroladas en laboratorio (22-24). Por el contrario,los datos presentados en este estudio ofrecen unaidea aproximada de la dinámica de poblacionesen esta especie de mosquito en Bogotá, puestoque los individuos a los cuales se les hizo elseguimiento se mantuvieron bajo condiciones nocontroladas de luz, temperatura y humedadrelativa.

En su ambiente natural, las larvas se desarrollanen aguas contaminadas, ricas en materia orgánicay, al parecer, tal preferencia está condicionadapor estímulos de naturaleza química y olfatoria(24). Tal comportamiento también fue observadoen este caso, ya que las hembras prefirieronrealizar la oviposición en recipientes de plásticocon agua de charca con alto contenido de materiaorgánica y evitaban aquéllos que contenían aguade grifo o agua destilada. Los recipientes de barroque les proporcionan ambientes sombreados

Cuadro 2. Tabla de vida Culex quinquefasciatus.

Etapa N° promedio lx1 dx

2 qx

3 Lx

4

contabilizado

Experimento 1 Huevo(enero a Larva Ifebrero de 2001) Larva II 152

Larva III 139 0,9174 13 0,0825 0,9299Larva IV 131 0,9424 8 0,0575 0,9559Pupa 127 0,9694 4 0,0305 0,9709Adulto 124 0,9724 4 0,0275

Experimento 2 Huevo 203(septiembre a Larva I 170 0,8357 33 0,1642 0,9090octubre de 2001) Larva II 167 0,9823 3 0,0176 0,9871

Larva III 165 0,9920 1 0,0080 0,9647Larva IV 155 0,9375 10 0,0625 0,9622Pupa 153 0,9870 2 0,0129 0,9913Adulto 152 0,9956 1 0,0043Eclosión 76,1 – 91,1 %Pupación (larva-pupa) 79,1 – 92,9 %Emergencia (pupa-adulto) 91,1 – 99,9 %

1lx: proporción de sobrevivientes en la etapa x2dx: número de individuos que mueren entre las etapas (x-1) y x3qx: probabilidad de morir entre (x-1) y x (dx/Nx-1-NX)4lx: media de la probabilidad de supervivencia entre (x-1) y x (lx + lx+1)/2

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también pueden ser utilizados con buenosresultados, ya que esta especie muestraacentuada preferencia por sitios oscuros parareposar (25).

La temperatura media ambiental durante los dosexperimentos fue de 14,8°C y 15,1°C, respectiva-mente y no hubo diferencia significativa entre losensayos realizados en diferentes épocas del año.Cabe anotar, sin embargo, que la duración mediade cada etapa fue ligeramente superior durante elsegundo experimento (septiembre-octubre), lapsoen el que también se presentaron valores detemperatura media y humedad relativa un pocomayores. Los tiempos de desarrollo estimadospara C. quinquefasciatus en este estudio fueronmás cortos que los reportados para esta especiepor Rueda et al. (22) para una temperaturaconstante de 15°C; estos mismos autoresencontraron que el número de días requerido paracompletar el desarrollo de huevo a adulto en unrango de temperaturas entre 15°C y 27°C es menorque a temperaturas mayores. Oda et al. (24)reportaron que no hubo un descenso en laactividad reproductora o en la tasa desupervivencia de C. quinquefasciatus en un rangode temperaturas entre 21°C y 30°C, lo quedemuestra la gran capacidad de adaptación deesta especie a diversas condiciones.

Oda et al. (24) reportaron que una de lasdiferencias fisiológicas entre C. pipiens y C.quinquefasciatus de Japón era la incapacidad deesta última especie de pasar por periodos dediapausa. Sin embargo, en el criadero dellaboratorio se ha observado la resistencia de loshuevos de C. quinquefasciatus a la desecación yse ha producido la eclosión de larvas, incluso unmes después de la ovipostura, cuando los huevosse humedecen nuevamente.

Los porcentajes de eclosión de las balsas a partirde las cuales emergieron larvas, al igual que losporcentajes de pupación y emergencia de adultosfueron altos; todos estos parámetros estuvieronpor encima del 80%; se destaca que el porcentajede emergencia fue cercano al 100% pero no fuesincrónico, lo que quiere decir que no emergieronlarvas de todas las balsas que se estabanobservando y que el índice de supervivencia fue

muy alto en las últimas etapas del desarrollo larvalEsto sugiere que las etapas más críticas en elciclo de vida se ubican en la etapa de huevo y losdos primeros estadios larvales que son justamenteen los cuales estos individuos pasan el menorporcentaje de tiempo de su desarrollo.

Teniendo en cuenta que los esfuerzos dirigidos alcontrol de las poblaciones de mosquitos se hanenfocado principalmente a la aplicación deinsecticidas y que C. quinquefasciatus hadesarrollado resistencia múltiple rápidamente (15-17) se ha venido implementando el controlbiológico de las etapas larvales por medio denemátodos como Romanomernis culicivorax obacterias como Bacillus sphaericus (23). Segúnlos datos de este estudio, la etapa más vulnerablees la de huevo porque la eclosión a L1 estuvoentre 50% y 75%, pero debido a la naturalezaasincrónica de eclosión este porcentaje puedevariar al hacer un seguimiento más prolongado alas balsas en las que no se observó eclosióndurante el período del estudio, a diferencia de losporcentajes de supervivencia en las demás etapasque son superiores al 80%.

Los resultados indican la gran adaptación de C.quinquefasciatus a las condiciones establecidasen la sabana de Bogotá que se ve favorecida,además, por las alteraciones producidas por elhombre en el ambiente a medida que establecenuevos asentamientos fomentando la apariciónde nuevos criaderos o la eutroficación de lasfuentes de agua existentes. Además, la rapidezcon la que C. quinquefasciatus alcanza el estadoadulto es una característica importante de estaespecie, ya que aumenta la capacidad vectorialde este mosquito.

Aunque en el área donde fueron capturados losparentales no existen estudios de resistencia, elhecho de que tal fenómeno se haya reportado paraorganofosforados en cepas colombianas (26), laresistencia al control biológico con B. thuringiensisen otras partes del mundo (27), aunados al cortoperiodo en el que se completa el ciclo de vida deC. quinquefasciatus, pueden hacer pensar que lasmedidas de control deben ser integrales utilizandocontrol físico, químico y biológico y de carácterpermanente. Por el rápido desarrollo del ciclo de

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vida, las medidas deben tener un alto impacto enla población de mosquitos igualmente en un lapsode tiempo muy corto para lograr la reducción delas densidades de población a niveles en que noconstituyan problema para las poblacioneshumanas. Para el caso de la cepa estudiada ycon el fin de tener más herramientas para sucontrol, se deben hacer estudios de resistencia ainsecticidas químicos y biológicos.

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Biomédica 2004;24:393-402 ANTIMONIALES PENTAVALENTES EN EL MODELO HÁMSTER- L. (VIANNIA)

ARTÍCULO ORIGINAL

Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes(Glucantime® y Pentostam®) en

un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana:aplicación de la luminometría

Héctor Hernán Henao 1, Yaneth Osorio 1, Nancy Gore Saravia 1, Arlen Gómez 2, Bruno Travi 1

1 Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas, CIDEIM, Cali, Colombia.2 Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Los antimoniales pentavalentes Glucantime® y Pentostam® son los medicamentos de primeralínea usados en el tratamiento anti-Leishmania; sin embargo, no hay estudios in vivo quecomparen su eficacia y toxicidad controlando variables del hospedero. Los estudios bioquímicosen Leishmania detectaron diferencias entre los dos medicamentos en la inhibición de latopoisomerasa I, que podrían reflejarse en diferencias en su efectividad. Para evaluar la eficaciaclínica se infectaron hámsteres en la pata trasera derecha con 106 promastigotes de Leishmaniapanamensis silvestre y transfectada con el gen de la luciferasa. Para evaluar la eficaciaparasitológica se estandarizó la cuantificación de parásitos en los tejidos por luminometría.Tres semanas después de la inoculación, los animales se trataron intramuscularmente conGlucantime® o Pentostam® (30, 60 o 120 mg de SbV/kg por día por 20 días). La toxicidad seevaluó en hámsteres tratados intramuscularmente con 120, 160 o 240 mg de SbV/kg por díapor 20 días de Glucantime® o Pentostam®. La resolución de las lesiones en los animalesinoculados con ambas cepas fue similar con ambos medicamentos. La carga parasitariadisminuyó de forma equivalente con ambos medicamentos en todas las dosis, y resultó endiferencias significativas con respecto a los controles (p<0,01). Los niveles séricos de creatinina,aspartato aminotransferasa, alanino aminotransferasa y amilasa no evidenciaron alteracioneshepáticas o renales. Los animales tratados con dosis iguales o mayores de 120 mg de SbV/kgpor día por 20 días de Pentostam® presentaron alteraciones inflamatorias micro ymacroscópicas en el sitio de la inyección que no se observaron en los tratados con Glucantime®.Estos resultados confirman observaciones clínicas sobre la eficacia similar de ambos productose indican una toxicidad local mayor del Pentostam®.

Palabras clave: hámster, Leishmania panamensis, leishmaniasis/tratamiento, antimoniopentavalente, Glucantime®, Pentostam®, transfección, luminometría.

Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime® and Pentostam®) in anAmerican cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application

The pentavalent antimonial compounds Glucantime® and Pentostam® are the first line drugsused in anti-Leishmania treatment. However, no in vivo studies have compared the efficacy andtoxicity of these drugs where host variability has been controlled. Biochemical studies ofLeishmania have detected differences between the two drugs with regard to DNA topoisomeraseI inhibition, a phenomenon that possibly impacts treatment efficacy. To evaluate the clinicalefficacy, hamsters were infected intradermally in the right hind foot with 106 promastigotes of awild type or luciferase-transfected Leishmania panamensis. At three weeks post-inoculation,the animals were treated intramuscularly with either Glucantime® or Pentostam® (30, 60 or120 mg SbV/kg per day for 20 days). To evaluate parasitological efficacy a luminometry assaywas standardized for quantitation of amastigotes in hamster tissues. To evaluate toxicity, hamsterswere treated intramuscularly with Glucantime® or Pentostam® (120, 160 or 240 mg SbV/kg perday for 20 days). Animals inoculated with either of the parasite strains and treated with eitherdrug, showed a similar rate of lesion reduction, as compared to untreated controls (p<0.01).

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Biomédica 2004;24:393-402HENAO H.H., OSORIO Y., SARAVIA N.G. et al.

Parasite burden was also comparable, and no significant differences were found in the curerate. No renal or hepatic alterations occurred as evidenced by normal serum levels of creatinine,aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and amylase. Hamsters treated with120 mg SbV/kg per day for 20 days or higher doses of Pentostam® showed macro- andmicroscopic signs of inflammation at the site of injection. These effects were absent in theanimals treated with Glucantime®. The results confirmed clinical observations regarding thesimilar efficacy of the two drugs, as well as the higher local toxicity of Pentostam®.

Key words: hamster, Leishmania panamensis, leishmaniasis/treatment, pentavalentantimonials, Glucantime®, Pentostam®, luminometry, transfection.

Correspondencia:Bruno Travi, Centro Internacional de Entrenamiento eInvestigaciones Médicas (CIDEIM), Avenida 1N No. 3-03,Cali, Colombia.Teléfono: 668 2164; fax: 667 [email protected]

Recibido:13/07/04; aceptado: 22/09/04

Los antimoniales pentavalentes (SbV) durantemedio siglo han sido la principal herramienta enel tratamiento de las diferentes formas clínicasde la leishmaniasis (1). Actualmente, se disponecomercialmente de dos formulaciones con SbV, elantimoniato de meglumina (Glucantime®) y elestibogluconato de sodio (Pentostam®) que seconsideran equivalentes en términos de eficaciaclínica, efectos secundarios, farmacocinética ymecanismos de acción (2-4).

Hasta el presente se han realizado pocos ensayosclínicos comparativos. Sáenz et al. (5) encontraronuna eficacia clínica similar del Pentostam® y elGlucantime® en pacientes con leishmaniasiscutánea producida por Leishmania panamensisusando una dosis diaria máxima de 850 mg deSbV por vía intramuscular.

En otro estudio, Saldanha et al. (6) evaluaron laeficacia de los antimoniales pentavalentesGlucantime® y BP88® (versión de fabricaciónchina del estibogluconato de sodio) en pacientesinfectados con Leishmania braziliensis, usandouna dosis de 20 mg SbV/kg pordía por 20 días porvía intramuscular o intravenosa de acuerdo conlas posibilidades de aplicación. En ese trabajo, elporcentaje de curación para el Glucantime® fuede 62% y para el BP88® de 55%, pero lospacientes tratados con Glucantime® resolvieronlas lesiones más rápidamente. Infortunadamente,estos ensayos clínicos fueron de tipo abierto yrealizados en una población heterogénea de

pacientes, lo cual complica la interpretación delos resultados.

Los estudios de sensibilidad in vitro de cepasaisladas de pacientes sugieren que losmedicamentos antimoniales pentavalentes tienenpotencias distintas (3,7). Sin embargo, debido aque los estudios comparativos se realizaron concepas aisladas después del tratamiento, no eraclaro si las diferencias en la eficacia de loscompuestos se debieron a una sensibilidadincrementada de algunos de los parásitospreviamente expuestos a las drogas.

Grogl et al. (3) reportaron que en la mayoría delos casos los promastigotes aislados de pacientesque fallaron al tratamiento con antimoniato demeglumina tuvieron una concentración inhibitoria50 (IC

50) mayor a este principio activo que al

estibogluconato de sodio. Actualmente, se sabeque los promastigotes de Leishmania sonaltamente resistentes a los antimonialespentavalentes (15), lo que en consecuencia resultaen una baja confiabilidad de las pruebas que usanSbV en promastigotes (8).

Otros factores como la variabilidad entre los lotesde medicamentos, los efectos citotóxicos de losaditivos, la diferente sensibilidad al SbV de lascepas de Leishmania y la respuesta inmune delhospedero han hecho difícil la comparación delos productos (7). Los estudios recientes sobrelos mecanismos de acción anti-Leishmania delSbV, enfocados a evaluar la inhibición de enzimascomo las tirosín-fosfatasas (pTpasas) (9) y ADNtopoisomerasa (10) han descrito diferencias enlos efectos inhibitorios in vitro e in vivo entre losprincipios activos. La información bioquímicaexistente indica que el Pentostam® y elGlucantime® inhiben un rango distinto de pTpasas(9) y la topoisomerasa I sólo es inhibida por

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Pentostam® y no por Glucantime® (10), pero sedesconoce en qué medida estas diferenciasinfluyen en la respuesta clínica al tratamiento.

Debido a la dificultad para controlar las variablesrelacionadas con el control del parásito por partedel hospedero en los estudios clínicos, el uso demodelos animales que aporten una respuestahomogénea es un recurso importante. El modelohámster-L. panamensis ha sido usado conanterioridad para evaluar la respuesta altratamiento con antimoniales en diferentesesquemas terapéuticos (11). En este modelo deleishmaniasis cutánea del Nuevo mundo, adiferencia del ratón, se obtienen lesiones crónicassimilares a las observadas en humanos queresponden al tratamiento con antimoniales (11).

La carga parasitaria es uno de los parámetrosesenciales para evaluar la eficacia del tratamiento.Ésta se ha determinado hasta el presente pormétodos laboriosos y poco sensibles como elcultivo por diluciones limitantes y el conteo deparásitos en frotis coloreados. Por esta razón, eneste estudio se estandarizó y utilizó un métodoluminométrico para cuantificar los parásitospresentes en los tejidos después del tratamiento.La enzima luciferasa de la luciérnaga (Photynuspyralis) se está utilizando en forma creciente comogen reportero en distintas cuantificacionesbiológicas a nivel celular (12). L. panamensistransfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUCexpresa la luciferasa constitutivamente, lo cualpermite cuantificar los parásitos en una muestrautilizando un luminómetro (13).

En este estudio se evaluaron comparativamentela eficacia clínica y el efecto leishmanicida dedos presentaciones comerciales de SbV, usandoel modelo hámster infectado con una cepa de L.panamensis transfectada con el gen reportero dela luciferasa. Además, se determinaron los efectostóxicos de ambos productos.


Parásitos

Se realizaron dos ensayos preclínicosindependientes para evaluar la eficacia de losantimoniales. El inóculo consistió en pro-mastigotes de fase estacionaria (día 6) de L.

panamensis (MHOM/Col/84/1099) cultivados enmedio de Schneider (Sigma) con 10% de suerofetal bovino, 10.000 U/ml de penicilina/10.000 mg/ml de estreptomicina y 200 mM de L-glutamina(Schneider completo). Esta cepa silvestre fuetransfectada por electroporación con el vectorepisomal pGL2-aNEO-aLUC, construido en laUniversidad de Laval, Canadá (13). Este vector lepermite a la leishmania expresar constitutiva-mente el gen que codifica para la enzima luciferasade la luciérnaga P. pyralis.

Los promastigotes transfectados se seleccionaronen medio de cultivo de Schneider completo con80 µg/ml de geneticina G418 (Sigma) (13). Losparásitos que contenían el gen reportero seseleccionaron por su resistencia al antibióticoG418 y se inocularon en hámster para recuperarsu patogenicidad. Un mes después de la infecciónlos parásitos se recuperaron de las lesiones poraspirado y cultivo en medio de Seneckjie (agar-sangre) y se seleccionaron nuevamente en mediode cultivo de Schneider completo con 80 µg/mldel antibiótico selectivo G418, para ser usadoscomo inóculo.

Para determinar la carga parasitaria porluminometría se establecieron curvas decalibración con los parásitos recuperados de laslesiones 1 mes después de la infección como semuestra en la figura 1. Los estudios deestandarización anterior mostraron que losparásitos transfectados expresaron establementeel gen reportero de la luciferasa en los tejidos, sinpresión de antibiótico G418, por un periodo dehasta dos meses. Después de este tiempo lacorrelación de las curvas disminuye, pero aún selogra la recuperación exitosa de parásitostransfectados hasta 6 meses después de lainfección.

Animales e infección experimental

Se utilizaron hámsteres dorados (Mesocricetusauratus) exogámicos mantenidos en el bioterio delCideim en condiciones estándar de alojamiento ynutrición, siguiendo las regulaciones de la Ley 84de 1989 del Estatuto nacional de protección delos animales de Colombia y la Resolución 008430,del 4 de octubre de 1993. Los hámsteres hembrade 4-5 meses de edad, se inocularon intra-

396


dérmicamente en la pata derecha con 106

promastigotes de fase estacionaria de cultivo,empleando la cepa silvestre o transfectada conel gen de la luciferasa (MHOM/COL/84/1099pGL2-aNEO-aLUC). Se escogieron animales hembrabuscando disminuir la variación entre individuos,ya que son un modelo más homogéneo que losmachos en el desarrollo de la lesión (14).

La cepa 1099 de L. panamensis se escogió porser patogénica para este modelo animal y porquees relativamente resistente al tratamiento conSbV (EC

50 en amastigotes>128 µg/ml) comparada

con cepas sensibles (EC50

<10 µg/ml) (datos sinpublicarse, Cideim); estas dos característicaspermiten establecer la eficacia terapéuticacomparativa usando dosis bajas y altas de SbV.

Esquemas de tratamiento y evaluación de laeficacia clínica y toxicidad

Tres semanas después de la inoculación con lacepa silvestre o transfectada los hámsteres fuerontratados por vía intramuscular durante 20 días condosis de 30, 60 o 120 mg de SbV/kg por día deGlucantime (Rhodia Farma, S.P., Brasil, lote108558) o Pentostam (Glaxo Smith-Kline, loteA039752) (n=7 por grupo), mientras que a unnúmero similar de animales control se leadministró solución salina tamponada (PBS)estéril siguiendo el mismo esquema. La dosis de30 mg de SbV/kg por día de Glucantime oPentostam no se incluyó en los inoculados conla cepa silvestre.

El tamaño de la muestra se determinó con baseen los datos de patogenicidad y heterogeneidadde la lesión, obtenidos anteriormente para lascepas silvestre y transfectada (Cideim, datos sinpublicarse). El tamaño de la lesión se midió conun calibrador digital como se ha descrito (11).

La eficacia clínica del tratamiento se expresómediante un índice de evolución de la lesión: IE=tamaño de la lesión durante el tratamiento (mm)/tamaño de la lesión antes de iniciar el tratamiento(mm). Los registros se efectuaron en los días 0,5, 10 y 20 de tratamiento y a los 15 días despuésdel mismo. Para la evaluación de la toxicidadproducida por el tratamiento con los antimoniales,se usaron hámsteres (n=6) tratados intramuscular-

mente con 120, 160 o 240 mg de SbV/kg por díapor 20 días de Glucantime® o Pentostam®.

Se determinó el estado clínico general de losanimales por medio de la observación de signos(depilación, deshidratación, diarrea, poliuria) osíntomas (disminución de la ingesta, alteracionesdel comportamiento) que indicaran toxicidad delas drogas empleadas. Se determinaron lasconcentraciones séricas de creatinina, creatininacinasa (CK), aspartato aminotransferasa (AST),alanino aminotransferasa (ALT) y amilasa en elsuero de los animales; se tomaron muestras demúsculo esquelético en el sitio de la inyeccióndel grupo de hámsteres tratados con 160 mg deSbV/kg y se fijaron en formol tamponado al 10%para su posterior evaluación histopatológica. Loshámsteres se sacrificaron quince días despuésde completar el tratamiento.

Evaluación de la eficacia parasitológica

La eficacia de los SbV para eliminar el parásito sedeterminó en los hámsteres inoculados con lasleishmanias transfectadas, quince días despuésde finalizar los tratamientos. Los amastigotes deLeishmania en las lesiones y el ganglio de drenajedel sitio de infección se cuantificaron porluminometría, siguiendo un procedimiento similaral descrito por Roy et al. (13), con algunasmodificaciones en el método de lisis.

Se evaluaron diversos métodos de procesamientode tejido: 1) el método estándar de triturado ennitrógeno líquido; 2) el triturado de la muestra ensolución salina empleando mortero de vidrio concentrifugación a 6.000 rpm por 10 minutos yposterior resuspensión en solución tampón delisis, y 3) el triturado del tejido directamente ensolución tampón de lisis a temperatura ambiente.

El último método que demostró ser el máseficiente, se describe a continuación: las biopsiasde ganglio poplíteo y de piel del sitio de lainoculación se colocaron en 200 µl de solucióntampón de lisis (BL) (Tris-HCl 125 mM, pH 7,8,DTT 10 mM, glicerol al 50% y Tritón X-100 al 5%)y se homogenizaron con la ayuda de morterosplásticos para viales de 1,5 ml (ganglio) o medianteel raspado y triturado de la dermis con hojas debisturí.

397


Los tejidos homogenizados se incubaron en BLdurante 30 minutos a temperatura ambiente paraalmacenarlos a -70°C hasta su procesamiento. Lalectura de las muestras se realizó en unluminómetro (Lucy 1, Anthos-Labtec Instruments,Lagerhausstrasse, Austria), utilizando placasblancas de 96 pozos (Costar®) que contenían 25ml de lisado y 80 ml de solución tampón deensayo (25 mM Tris-HCl solución tampón, pH 7,8,2,67 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 0,53 mM ATP y33,3 mM DTT, 4,7 mM D-luciferina [MolecularProbes, Leiden, The Netherlands]).

Debido a la disminución progresiva en la actividadde luciferasa con respecto al tiempo, la solucióntampón de ensayo se agregó inmediatamenteantes de la lectura, evaluándose un máximo de24 muestras por prueba. El límite de detección dela prueba y el número de parásitos por miligramode tejido se determinó mediante la construcciónde curvas de calibración a partir de la diluciónseriada (1:10) de 106 amastigotes obtenidos de lalesión de hámsteres con un mes de infección conla cepa L. panamensis MHOM/Col/84/1099 pGL2-aNEO-aLUC, hasta obtener 1 parásito.

Las diluciones se mezclaron con 2,5 mg de tejido(piel sana) por pozo y se midió la actividad de laluciferasa con el luminómetro. Con estos valores,se obtuvo una curva de correlación, en escala

logarítmica (log10

), entre el número de parásitoscontados al microscopio de luz y la actividad deluciferasa de los mismos determinada en elluminómetro (figura 1).

El número de parásitos se despejó de la ecuaciónde la curva de calibración Y= mX + b; de dondeY=log

10 (actividad de la enzima luciferasa en la

muestra), X=log10 (número de parásitos), m=pendiente y b=constante de la ecuación(intercepto) (figura 1). El blanco del ensayo seestableció con base en la emisión de luz demuestras de tejido no infectadas (media + 3desviaciones estándar). El número mínimo deparásitos detectados se calculó restando el blancodel ensayo al valor de la actividad de luciferasa,utilizando la ecuación de la recta descrita en lafigura 1.


Para el análisis de los datos se utilizó el paqueteestadístico SPSS, versión 7,5 para Windows(SPSS Inc., Chicago). A los datos con distribuciónnormal se les aplicaron las pruebas t de Studenty ANOVA, y como indicador de tendencia se usóla media. Las comparaciones múltiples serealizaron mediante las pruebas de Duncan yTukey. Los datos cuya distribución no fue normalse analizaron mediante pruebas no paramétricascomo Mann-Whitney y Kruskal-Wallis y se usó la

Figura 1. Curva representativa de la correlación entre elnúmero de amastigotes de L. panamensis MHOM/COL/84/1099 transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC (13)contados en las lesiones de hámsteres al mes después dela infección (microscopía) y la actividad de la enzimaluciferasa (luminometría).

Figura 2. Aspecto clínico de la lesión en la pata trasera delhámster hembra un mes después de la infección producidapor 106 promastigotes de L. panamensis MHOM/COL/84/1099 transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC (13),que contiene el gen reportero de la luciferasa.

398


mediana como indicador de tendencia. En todoslos análisis se utilizó un intervalo de confianzadel 95%.

Resultados

Eficacia clínica del tratamiento

La infección con promastigotes de L. panamensisde ambas cepas (silvestre o transfectada con elgen de la luciferasa) produjeron lesioneseritematosas con signos locales de inflamación,descamación y alopecia en el sitio de la infección(figura 2). En algunos animales se observó laaparición de costras como signo de necrosisdérmica. El tamaño promedio de las lesiones alas tres semanas de la inoculación en loshámsteres hembra inoculados con la cepasilvestre fue de 1,5±0,5 mm y en las inoculadascon la cepa transfectada fue de 1,9±0,5 mm. Enlos inoculados con la cepa transfectada, la dosisde 30 mg de SbV/kg demoró más de 10 días enmostrar efectos terapéuticos con ambosproductos, pero al finalizar el tratamiento tanto el

Glucantime® como el Pentostam® mostrarondiferencias clínicas significativas con respecto algrupo no tratado (figura 3A). La disminución delas lesiones fue más rápida y acentuada con losesquemas de 60 y 120 mg de SbV/kg, lo cualdemuestra un efecto dosis-respuesta similar paraambos productos en los grupos inoculados con lacepa silvestre y transfectada (figura 3B y 3C).

Eficacia parasitológica del tratamiento

Correlación entre la actividad de luciferasa y elnúmero de parásitos y su límite de detección. Parapoder hacer las determinaciones del efecto anti-parasitario de los antimoniales fue necesarioestandarizar la técnica luminométrica paracuantificar los parásitos transfectados en lostejidos que serían evaluados (piel y ganglio). Enel proceso de estandarización se obtuvo unacorrelación lineal (R2=0,94) entre el número deamastigotes de las lesiones, (determinado pormicroscopía de luz al mes de la infección) y laactividad del gen reportero de luciferasa (cuentas

Figura 3. Índice de evolución de hámsteres infectados con106 promastigotes de Leishmania (V.) panamensis MHOM/COL/84/1099 transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC(13) que se trataron 3 semanas después con diferentesdosis de Glucantime®, Pentostam® o PBS (control). (A)Hámsteres tratados con 30 mg de SbV/kg por día por 20días.(B) Hámsteres tratados con 60 mg de SbV/kg por día por 20días. (C) Hámsteres tratados con 120 mg de SbV/kg por díapor 20 días. El índice de evolución se calcula al dividir eltamaño de la lesión en un tiempo determinado (Ti) sobre eltamaño de la lesión antes de iniciar el tratamiento (T0); IE=(Ti)/(T0).

399


Cuadro 1. Promedio de niveles séricos enzimáticos de hámsteres infectados con L. panamensis MHOM/COL/84/1099y tratados con Glucantime® o Pentostam®.

Niveles séricos enzimáticos

Dosis (cada 24 horas/20 días)

120 mg SbV/kg 160 mg SbV/kg 240 mg SbV/kgGlucantime Pentostam P Glucantime Pentostam P Glucantime Pentostam P

Creatinina (mg/dl)0,42 0,43 0,75 0,4 0,45 NS 0,41 0,46 0,09**AST 45,67 44,00 0,44 50 51 NS 38,67 59,33 0,18ALT 78,67 68,33 0,79 88,5 90,5 NS 46,33 77,67 0,14Amilasa 8253,33 9800 0,21 No se realizó No se realizó —— 8.323,33 8.046,67 0,80

El valor P se estableció en la prueba t de Student con una confiabilidad del 95%.NS: diferencia no significativa

240 mg de SbV/kg por día, o durante 20 días con160 mg de SbV/kg por día (cuadro 1). Solamenteen 1/3 de los hámsteres tratados con Pentostam®o Glucantime® se detectó un aumento en losniveles de ALT. La CK se encontró elevada en loshámsteres tratados con Pentostam® (160 mg deSbV/kg por día por 20 días). Los animales tratadoscon este producto mostraron mayores signos dedolor que con el Glucantime® durante laadministración del mismo. Esto se correlacionócon los hallazgos histopatológicos del músculoesquelético en 2/3 hámsteres tratados con 160mg de SbV/kg de Pentostam® que revelaron unainflamación mixta de predomino crónico, así comoalteraciones de tipo degenerativo. En todos los

de luz/segundo) (figura 1). En las muestras depiel se logró detectar la actividad de la enzimaluciferasa en 1 parásito/mg de piel, con un puntode corte de 38 cuentas de luz/segundo para pielde animales control no infectados. En lasmuestras de ganglio, se detectaron hasta 40parásitos/mg de tejido, con un punto de corte de54 cuentas de luz/segundo.

Carga parasitaria en la lesión y el ganglio poplíteodespués del tratamiento. La cantidad de parásitospersistentes en las lesiones de los hámsterestratados con la dosis de 60 y 120 mg de SbV/kgpor día por 20 días de ambos medicamentos fuesimilar. En los tratados con de 30 mg deantimoniato de meglumina el número de parásitosfue mayor que en los tratados con estibogluconatode antimonio, pero las diferencias no alcanzaronsignificancia estadística (p=0,114) (figura 4).

Ninguno de los esquemas de tratamiento eliminólos parásitos de la totalidad de los hámsteres(figura 4). Al final del tratamiento se detectaronparásitos en la piel de los animales tratados contodas las dosis, con excepción de 3/7 (43%)hámsteres tratados con Glucantime® y 2/7 (29%)con Pentostam® correspondientes al grupo de 120mg de SbV/kg por día por 20 días. En el gangliono se detectaron parásitos después deltratamiento (figura 4).

Toxicidad y efectos colaterales

No se encontraron diferencias entre los nivelesséricos de las enzimas ALT, AST o creatinina enlos hámsteres tratados con Pentostam® oGlucantime® durante 10 días a la dosis de 120 o

Figura 4. Carga parasitaria determinada por luminometríaen la lesión cutánea (L) y ganglio poplíteo (G) de hámsteresinfectados con L. panamensis transfectada con el genreportero de la luciferasa, determinada después deltratamiento diario de los animales por la vía intramuscularcon distintas dosis de SbV durante 20 días. Barras vacías,carga parasitaria en hámsteres control tratados con PBS.

6

5

4

3

2

1

0G L G L G LG L

Log

10 (

núm

ero

de p

arás

itos)

Dosis Sb (mg/kg/24h/20 días)v

GlucantimePentostam

400


animales tratados con Glucantime® se evidencióescaso infiltrado inflamatorio y ninguno presentóalteraciones evidentes en la estructura de lasfibras musculares.

Discusión

Los estudios realizados hasta ahora sobre larespuesta clínica al tratamiento con antimonialespentavalentes y su relación con la sensibilidad invitro de los aislamientos, no siempre demostraronuna buena correlación (3,7,15). En el presenteestudio, el empleo de un modelo animal, enconjunto con una cepa e inóculo definido deLeishmania eliminó algunos factores de confusióncomo: 1) la respuesta inmune variable delhospedero, 2) el tiempo posinfección, 3) el sitiode la lesión (4,16,17) y la heterogeneidad en lainfectividad/patogenicidad de Leishmania (18).

Además, la utilización de un único lote de cadauno de los medicamentos eliminó la comprobadavariabilidad en la capacidad leishmanicida y latoxicidad de estos compuestos, atribuida avariaciones en la polimerización de loscarbohidratos durante la síntesis de losantimoniales (7,19). Tanto el seguimiento clínicocomo el parasitológico de los hámsteres tratadoscon Pentostam® o Glucantime®, luego de serinfectados experimentalmente con L. panamensis,fueron similares para ambos compuestos yconcuerda con los resultados terapéuticos enhumanos a pesar de las variaciones entre losensayos clínicos ya mencionados (5,6).

La importancia de los ensayos preclínicos enanimales experimentales queda demostrada porla dicotomía entre las observaciones in vivo e invitro. Mientras que ambos medicamentosmuestran efectos clínicos similares, el análisisbioquímico sugiere que el estibogluconato de sodiopodría ser más activo contra Leishmania debidoa que, a diferencia del antimoniato de megluminay el tartrato de antimonil potásico (SbIII), tiene unmarcado poder inhibitorio sobre la ADNtopoisomerasa (10,20,21).

Además, los ensayos in vivo como en el estudiopresente, son esenciales para la evaluación delos antimoniales (y posiblemente son aplicablesa otros compuestos) debido a que los resultados

obtenidos in vitro carecen del componentefarmacocinético y farmacodinámico y losvehículos como el m-clorocresol (Pentostam®),el bisulfito de potasio y sulfito de sodio anhidro(Glucantime®) pueden modificar el efecto anti-Leishmania (15,22).

En nuestro estudio encontramos que a dosis bajasde SbV el estibogluconato de sodio tendió aeliminar más parásitos que el antimoniato demeglumina y que la toxicidad de los dos productos,determinada por los valores séricos de lasenzimas ALT, AST y de creatinina, que indicanalteraciones hepáticas o renales, no difiriósignificativamente de los controles sin tratamiento.

Otros estudios en roedores que usaron dosis de900 mg de SbV/kg por día por 30 días, mostraronun aumento significativo en los niveles séricosde ALT, AST y creatinina, pero los resultados aestas dosis altas son de cuestionableextrapolación a la población humana, en la quese emplean dosis mucho más bajas (20 mg deSbV/kg por día por 20 días) (23).

Cabe señalar que en el modelo hámster, elPentostam® demostró ser más tóxico que elGlucantime®, por las alteraciones macro ymicroscópicas producidas en el sitio de lainyección (músculo) y el aumento en los valoresde la enzima CK. Esto está de acuerdo con losestudios de Sampaio et al. (24) y Saldanha et al.(25) que encontraron al estibogluconato de sodiomás tóxico que el antimoniato de meglumina; sedestaca la mayor frecuencia de cefaleas(p=0,026) mialgias/artralgias (p=0,004) y dolorabdominal/anorexia (p= 0,004).

La pérdida de infectividad o patogenicidad de losparásitos es un fenómeno frecuente en losestudios de Leishmania que requieren unamanipulación prolongada in vitro. Sin embargo, eneste estudio la cepa transfectada se mantuvomediante el pase cíclico por hámster-cultivo enmedio selectivo-hámster, lo que finalmentepermitió obtener una patogenicidad similar de lascepas silvestre y transfectada.

Así mismo, la sensibilidad de la cepa al SbV nose vio afectada por el procedimiento detransfección con el plásmido que contenían el gen

401


reportero y el gen selectivo de resistencia alantibiótico G418, ya que las lesiones de losinfectados con la cepa silvestre y transfectadarespondieron de forma similar al tratamiento conSbV.

En el presente estudio se confirmó que laluminometría es una técnica cuantitativa, sensibley rápida para determinar la carga parasitaria enlos tejidos de animales infectados experimental-mente. Una posible limitación de este método esla necesidad de contar con organismos trans-fectados, que pueden perder la infectividad opatogenicidad durante la manipulación in vitro, porlo que requiere del pase continuo de los parásitosseleccionados por el hámster.

Las modificaciones metodológicas introducidas enel procesamiento de las muestras permitieronmejorar el sistema publicado para el modelo enratón (13) y determinar el límite de sensibilidadde la prueba en los tejidos. Encontramos que laluminometría es un método de sensibilidadcomparable a la PCR que resulta ser más sencillo,rápido y menos costoso. A diferencia de la PCR,la luminometría detecta exclusivamente parásitosviables debido a la corta vida (2-3 horas) de laproteína sintetizada por el parásito (26). Además,tiene ventajas sobre el método estándar de cultivo,debido a que cuantifica directamente la cantidadde parásitos presentes, evitando el sesgo queintroduce el éxito de replicación de los parásitosen cultivo.

En conclusión, nuestros resultados en el modelohámster no mostraron diferencias significativasen la eficacia clínica y parasitológica delPentostam® y el Glucantime® para tratar L.panamensis, pero indicaron que los efectostóxicos locales del Pentostam® son mayores quelos del Glucantime®. Queda por comprobar enestudios comparativos de campo si los menoresefectos tóxicos percibidos por los pacientestratados con Glucantime® podrían favorecer elcumplimiento del esquema terapéuticorecomendado.

Agradecimientos

Este trabajo se desarrolló con el apoyo financierode Wellcome Trust-Burroughs (Ref # 059056/Z/99),Colciencias (contrato 162-2002, código

22290411723) y el programa de jóvenesinvestigadores de Colciencias. Se agradece alInstituto Nacional de Salud de Colombia) por lagentil donación del Glucantime® y a P. Desjeux(TDR-OMS) por la donación del Pentostam®. Seagradece el apoyo de John Walter (Cideim) y MarcOuellette, Universidad de Laval (Canadá) por latransfección de la cepa MHOM/COL/84/1099.

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Biomédica 2004;24:403-12 PROTEIN MALNUTRITION AND GH RECEPTOR ON LYMPHOID CELLS

ARTÍCULO ORIGINAL

Protein malnutrition up-regulates growth hormone receptorexpression in rat splenic B lymphocytes

Wilson Mejía-Naranjo 1,2, Myriam Sánchez-Gomez1

1 Laboratorio de Hormonas, Departmento de Química, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.2 Departmento de Nutrición y Bioquímica, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

The reciprocal interaction between the endocrine and immune systems has been the subject ofactive research during the last decade, and an important body of evidence has accumulatedsupporting the role of the GH/IGF axis in immune function. More recently, the GH/IGF axis hasbeen postulated as playing an important role in the modulation of stress conditions, such ascatabolic stages, aging-related disorders, immunodeficient aids patients and malnutrition.Whether these effects are exerted through endocrine, autocrine or paracrine mechanismsremains to be determined for different immune cell types and tissues. The aim of the currentstudy was to define which specific subsets of lymphocytes are the primary targets for GH action.In addition, the regulatory role of stress induced by protein restriction was investigated withrespect to the relative distribution of GH receptor positive lymphoid cells. Normal growing ratswere fed isocaloric diets with variable protein content (0, 4, 8, 12 and 20%) for a period of 14days. The lymphoid cells were then separated from spleen, lymph nodes and peripheral bloodlymphocytes. Flow cytometry analysis measured the binding characteristics of Fluos-rrGH tolymphocytes together with specific PE-labelled mAbs defining CD4+ and CD8+ T cells and Blymphocytes. The pattern of expression of the GH receptor differed among the lymphoid tissuesand cell subsets. Spleen was the most responsive organ to protein deprivation with highestGH receptor expression in B lymphocytes, followed by CD4+ T cells. As the protein intake wasdecreased from 20% to 0%, the percentage of GHR positive cells increased from 12% to 52%in splenic B lymphocytes and from 8% to 17% in CD4+ T cells. In contrast, only 10%-13% oflymphocytes in lymph nodes and 2%-4% in circulation, showed binding sites to GH associatedwith protein deprivation. In conclusion, the increase in GH receptors on lymphocytes undercatabolic stress induced by protein malnutrition gives support to the hypothesis of a modulatoryrole of the GH/IGF axis in preserving the homeostasis of immune tissues.

Key words: growth hormone receptor, malnutrition, lymphocytes.

La desnutrición proteica estimula la expresión de receptores de la hormona del crecimientoen linfocitos B esplénicos de rata

La interacción recíproca entre los sistemas endocrino e immune ha sido objeto en la últimadécada de numerosas investigaciones que han aportado evidencia sustancial sobre el papeldel eje GH/IGF-I en el sistema inmune. Recientemente, se ha postulado que el eje GH/IGF-Iejerce una función importante en la modulación de condiciones de estrés, tales como estadoscatabólicos, trastornos asociados con el envejecimiento, síndrome de inmunodeficienciaadquirida y desnutrición. No se conoce aún si estos efectos son ejercidos a través demecanismos endocrinos, autocrinos o paracrinos en los diferentes tipos de tejidos del sistemainmune. El objetivo de este estudio fue establecer los principales subtipos celulares linfoidesque son blanco de la acción de la hormona de crecimiento. Además, se estudió el efectoregulador del estrés inducido por la desnutrición proteica sobre la distribución relativa decélulas linfoides positivas al receptor de GH (GHR). Ratas normales se sometieron a dietasisocalóricas de contenido variable de proteína (0, 4, 8, 12 y 20%) durante 14 días y se aislaronlos linfocitos de bazo, ganglios linfáticos y sangre periférica. Mediante citometría de flujo seanalizó la unión a Fluos-rrGH y los linfocitos CD4+, CD8+ y B se definieron empleandoanticuerpos monoclonales específicos marcados con PE. Se encontró que el patrón de

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Biomédica 2004;24:403-12MEJÍA-NARANJO W, SÁNCHEZ-GÓMEZ M.

expresión de GHR varía con el tejido y tipo celular linfoide. El bazo es el órgano más sensibleal déficit de proteína, y la mayor expresión de receptores para GH se presenta en las células Bseguidas por las células CD4+. Al reducir el contenido de proteína en la dieta de 20% a 0% seobservó un incremento del 12% al 52% en el número de células B positivas para el receptor deGH y del 8% al 17% en las células CD4+ positivas para GHR en el bazo. En contraste, sólo el10%-13% de linfocitos de los ganglios linfáticos y 2%-4% de la sangre periférica presentaronreceptores para GH en su superficie, los cuales no se vieron afectados significativamente porel déficit de proteína. En conclusión, el incremento en los receptores para GH en linfocitos bajoestrés catabólico inducido por la restricción en proteína, apoya la hipótesis del papel moduladordel eje GH/IGF-I en la preservación de la homeostasis del sistema inmune.

Palabras clave: receptor de hormona de crecimiento, malnutrición, linfocitos.

In recent years, it has become apparent that atight communication exists between the endocrineand immune systems. Of particular importanceis the role of growth hormone (GH)/insulin-likegrowth factor-I (IGF-I) axis in immune function.GH and IGF-I contribute to regulate, in concertwith cytokines, the development and function ofthe immune system. Whether these effects arebrought about through endocrine, autocrine orparacrine mechanisms remains to be conclusivelydetermined for different immune cell types andtissues (1,2).

Weigent et al. (3) first established the extra-pituitary production of GH in human lymphocytes.These researchers used fluorescent-labeled anti-GH antibodies to show that the number of GH-positive cells doubled in response to mitogenicstimulation. This result was extended to show thatGH messenger RNA (mRNA) is expressed inhuman lymphocytes and translated into a GH-immunoreactive protein with a molecular weightsimilar to that of pituitary GH (4). GH receptorshave been detected in normal lymphoid cells, aswell as in the transformed human lymphoblastoidcell line IM-9 (5,6). In the rat the GH receptor (GHR)has been shown to be widely expressed withcomparatively much lower levels of expression inlymphoid tissues (7).

Nutrition is an important determinant of immuneresponses; deficits in protein and calories have

deleterious effects on the host´s defense systems.Both protein and energy intake are critical in theregulation of serum levels of IGF-I, IGF bindingprotein-3 (IGFBP-3), IGF binding protein-1(IGFBP-1), GH and GH binding protein (GHBP),as well as the expression levels of the GHR andthe IGF-I receptor (IGF-IR) (8-10). It is known thata GH resistant state is induced during nutritionalstress, depending on the specific type and lengthof nutrient deprivation (11). In humans and inseveral other species, when food intake isreduced, serum GH levels are increased (exceptin the rat) and circulating levels of IGF-I, IGFBP-3 and GH-BP are reduced (11,13).

Despite the growing knowledge of the actions ofGH on cells of the immune system, further studiesare needed to understand which specific subsetsof lymphocytes are the primary targets for GHaction (2). One approach to this question is thequantitative analysis of the GH receptors onsubpopulations of lymphocytes using flowcytometry.

The aim of this work was to study the bindingcharacteristics of recombinant rat GH (rrGH),coupled to Fluos [5(6)-carboxyfluorescein-N-hydrosuccinimide ester], to lymphocytes and todetermine the relative distribution of growthhormone receptors on the cell subpopulations fromsome lymphoid tissues in normal growing ratsunder catabolic stress caused by proteinrestriction. In addition some elements associatedto the GH/IGF-I axis were also determined.

Materials and methods

Animals and dietary protocol

Male Wistar rats (Instituto Nacional de Salud,Bogotá, Colombia) weighing approximately 110 g

Correspondencia:Myriam Sánchez, Laboratorio de Hormonas, Departmentode Química, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá,Colombia.Tel: (571) 316 5000, extensió[email protected]


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were individually housed in steel metabolism cagesand were given a diet containing 12% protein (i.e.,12 g of crude protein per 100 g of food, ICNBiomedicals, Aurora, OH) for a 5-day pre-adaptation period. After this period, animals wererandomly assigned into five groups of six animalseach with diets including 0, 4, 8, 12 or 20% proteinfor a period of 14 days (ICN Biomedicals, AuroraOH). These five diets are isocaloric and eachprovides 3.7 kcal/g. Rats were subjected to a light-dark cycle of 12/12 h at a constant temperature of22±2°C. Animals were given their diets in apowdered form and had free access to tap water.Individual food rations for the whole experimentalperiod were weighed. At the end of the experimentthe non-consumed food was weighed and feedconsumption calculated. Body weight wasmeasured every third day.

Sampling of blood and tissues

On day 0 blood samples were taken from the orbitalplexus under diethyl ether anesthesia and serumsamples were stored at -20°C. At the end of theexperiment rats were anaesthetized intra-peritoneally with 0.4 ml/100 g body weight ofRompunTM (20 mg/ml)-KetalarTM (50 mg/ml)-saline(9 g NaCl/l) (1:2:3 v/v) and exsanguinated bycardiac puncture. A sample volume of 1 ml wasallowed to clot, the serum was separated andfrozen at -20°C until analysis, and 0.5 ml werecollected in heparinized tubes and processed fordeterminations on PBL (peripheral bloodlymphocytes) by flow cytometry. Spleen andmesenteric lymph nodes were removed quickly,rinsed and placed in cold Hank's balanced saltsolution until processed by flow cytometry on thesame day. The animal protocol was approved bythe Animal Care and Use Committee of the NationalUniversity of Colombia (Bogotá, Colombia).

Flow cytometric analysis

Flow cytometric analysis was used to determinethe percentage of cells that were reactive for GHR(GHR+) in rats fed various diets. Single cellsuspensions of splenocytes and from lymph nodeswere prepared in Hank's balanced salt solution.The cells were washed and red blood cells insplenocyte suspensions were lysed using PharMLyseTM lysis solution (BD Pharmingen San Diego,

CA). Cells were resuspended in PBS (phosphatebuffer saline) containing 0.3% BSA and 0.1%sodium azide. Cell viability was determined bytrypan blue exclusion using a hemocytometer.

The following monoclonal antibodies (mAb) werepurchased from BD Pharmingen: PE-conjugatedmouse anti-rat CD4, CD8, CD45RA andimmunoglobulin G1(IgG1) isotype control. The CD4mAb was used to identify helper T-cells, the CD8mAb was used to identify suppressor/cytotoxic Tcells, and the CD45RA mAb was used to identifyB cells.

Fluorescein labeling

Recombinant rat GH (rrGH) was obtained from theNational Hormone and Peptide Program, NIDDK(Torrance, CA). Recombinant rGH was conjugatedto Fluos [5(6)-carboxyfluorescein-N-hydro-succinimide ester] using a fluorescein labeling kit(Boehringer Mannheim). Briefly, 1 mg of hormonewas dissolved in 1 ml of 100 mM sodiumbicarbonate buffer at a pH of 8.5. Fluos wasdissolved in dimethylsulfoxide at 20 mg/ml, and10 µl of this solution was added to the dissolvedhormone. The resulting solution was gently stirredfor 2 h at room temperature in the dark. Free Fluoswas removed by gel filtration with Sephadex G-25(Pharmacia) in PBS with 0.1% sodium azide. Themolar ratio of Fluos:protein (F/P) wasapproximately 10:1. This ratio results in theincorporation of approximately 3 to 5 moleculesof Fluos per molecule of rhGH. BSA-Fluos wasused as a control with similar F/P molar ratio. Thehormone-Fluos conjugate was mixed 1:1 withglycerol and stored at -20 °C.

The first set of experiments was conducted toinvestigate whether Fluos-rrGH was able to bindto rat lymphocytes. The human IM-9 lympho-blastoid cell line obtained from ATCC (AmericanType Culture Collection) was used as a control.For time course and saturation studies, IM-9 cellsor splenocytes (1 x 106) were incubated withincreasing concentrations of fluos-rrGH (0.5 µg -20 µg) at different times (0.5 h - 4 h) and processedas indicated below for cytofluorometry. The bindingspecificity was performed on both, IM-9 cells andsplenocytes; briefly, 1 x 106 cells were incubatedfor 1 h with 1 µg of fluos-rrGH in the presence of

406


30 µg or 100 µg of unlabeled rrGH and processedas described previously (10). Fluos-BSA and FITC-anti-mouse IgM were used as controls.

Cells derived from the corresponding tissuesmentioned above (1 x 106 cells) and blood (50 µl)were co-labeled in a set of three tubes with Fluos-rrGH and either PE-anti CD4, PE-anti CD8, PE-anti CD45RA in PBS containing 0.3% BSA and0.1% sodium azide. Fluos-BSA and PE-IgG1 wereadded to a different tube as control. RecombinantrGH and BSA were used at a concentration of 1µg/tube. Cells were then washed twice andresuspended in PBS containing 1% paraformal-dehyde. Red blood cells from the PBL sampleswere lysed immediately after labeling using PharMLyseTM lysis solution (BD Pharmingen, San DiegoCA) washed and resuspended as indicated above.Cell acquisition was performed in a FACScanTM

flow cytometer, and a minimum of 50,000 eventswas acquired for each test. Data were analyzedusing Cell-QuestTM software (Becton Dickinson).

Hormone determinations

Serum IGF-I, prolactin and GH levels weremeasured by radioimmunoassay (RIA) (rat/mouseIGF-I assay system, rat prolactin assay systemand rat GH system, National Hormone andPituitary Program. Harbor-UCLA medical Center,Torrance, CA. Kindly provided by Dr. A. F. Parlow).Serum insulin levels were determined using ahighly sensitive rat insulin RIA kit (Linco ResearchInc., St.Charles, MO).

SDS-PAGE and Western ligand binding assay

Serum IGFBP levels were measured in serumcollected on day 15. Samples containing 2 µl ofserum were mixed with 2 µl of 2X nonreducingSDS protein gel loading solution (Quality BiologicalInc. Gaithersburg, MD). The resulting samples werethen subjected to SDS-PAGE on 4-20% gradientgels (Novex, San Diego, CA). Proteins were thentransferred to nitrocellulose membranes (0.2 µm)using standard electroblotting methods.Membranes were blocked with TBS (Tris BufferSaline) containing 1% BSA and incubated with1.5 x 106 cpm of [125I]-IGF-I (Amersham, Chicago,IL) overnight at 4°C in TBS with 0.1% tween-20.Membranes were washed three times with TBScontaining 0.1% tween-20 and exposed to

Phosphorimager screens (Fuji Photo Film Co.,Ltd., Kanagawa, Japan). Levels of IGFBP-3 andIGFBP-1 were determined by quantifying the levelsof [125I]-IGF-I incorporated into bandscorresponding to 40-45 kd and 25-28 kd,respectively.

Statistics

Statistical analyses were performed using the two-tailed t test (SAS Institute Inc., 1999). Protein levelwas considered the main source of variation andmean comparisons for each variable under studywere performed between groups receiving differentprotein diets. Values were considered to bestatistically different when P values were less than0.05.

Results

Food consumption and body weight

Animals fed 0% and 4% protein diets each lost40±5.1 g and 8.7±1.6 g of body weight,respectively. At 8%, 12% and 20% protein diets,rats gained 56.3±9.6 g, 64±9.6 g and 75±11.8 gof body weight, respectively. Cumulative foodintake in grams over the 14-day period was asfollows: animals fed 20% protein diet, 259±5 g;12%, 244±4 g; 8%, 240±14 g; 4%, 198±25 g and0%, 143±5 g. Rats fed a 0% or a 4% protein dietconsumed significantly less food than did animalsfed a 8%, 12% or 20% protein diets (table 1).However, the animals that received the 0% and4% protein diets ate significantly more food pergram of body weight than did animals that received8%, 12% and 20% protein diets (table 1). Thusthe 0% and 4% protein diets induced proteindeficiency, but not energy deficiency, since theseanimals consumed equal or greater number ofcalories that did rats on 8%, 12% and 20% proteindiets.

Relative distribution of lymphocytes inlymphoid organs

The cellular distribution of CD4+ T cells, CD8+ Tcells and B cells in the spleen, mesenteric lymphnodes and peripheral blood of male rats fed variousdiets is shown in table 2. The percentage of CD4+T cells in these tissues did not differ among ratsfed 4, 8, 12, or 20% protein diets; however a trendto increase was seen in the spleen of rats fed 0%

407


Table 1. Total food intake and food intake per body weight in rats fed the different protein diets.

Proteinin diet (%) 0 4 8 12 20

Total food* 10.2 ± 0.27† 14.1 ± 1.2§ 17.2 ± 0.63? 17.5 ± 0.21? 18.5 ± 0.07?

Food/BW** 1.75 ± 0.07† 1.62 ± 0.07† 1.39 ± 0.01§ 1.33 ± 0.07§ 1.29 ± 0.07§

All values expressed as mean ± s.e.m. from n=6 rats in each group. BW, body weight.* Food consumption [food (g) per animal per day]** Food consumption [food (g)/final body weight (g) per animal]Superscripts represent significant differences between treatment groups. Means not sharing the same superscripts aredifferent at P‹0.05.

protein diet. Conversely, the percentage of CD4+T cells was significantly diminished in lymphnodes in rats fed 0% protein diet. The percentageof CD8+ T cells in the spleen and peripheral bloodwas significantly (P<0.05) lower in rats fed 0%protein diet compared to animals fed with 12 or20% protein diets. In contrast, the percentage ofB cells tended to increase in spleen, mesentericlymph nodes and peripheral blood as the amountof dietary protein decreased. In rats fed 0 and 4%protein diets, the percentage of B cells in lymphnodes and peripheral blood was significantly higherthan in animals fed 8, 12 and 20% protein diets(P<0.05). The percentage of splenic B cells wassignificantly lower in rats fed 20% protein diet thanin animals fed 4 or 0% protein diets (P<0.05).

Binding characteristics of Fluos-rrGH to ratsplenocytes demonstrated by flowcytofluorometric analysis

Fluos-rrGH was able to bind specifically to GHRin rat splenocytes and the IM-9 cell line. The totalbinding of Fluos-rrGH saturation occurred with 1

µg of rrGH and 2 h of incubation at 4°C for bothcell types (data not shown). Competition analysiswith unlabeled rrGH showed that binding tosplenocytes and IM-9 cells was specific. Figure 1shows that a 75% inhibition of binding wasobtained with 100 µg of unlabeled hormone on IM-9 cells; similar results were obtained insplenocytes. No inhibition in both cases wasobserved using Fluos-BSA.

Relative distribution of growth hormonereceptors on lymphocytes from lymphoidtissues

Table 3 lists the relative distribution of GHR on thecorresponding tissues analyzed. Among thetissues analyzed, splenic lymphocytes were themost responsive to changes in the dietary proteincontent (figure 2). Rats fed 0 and 4% protein dietshad a 4 and 2-fold increase respectively in thepercentage of GHR+ B cells, as compared to ratsfed diets containing either 12 or 20% protein.Interestingly, dietary protein restriction did notaffect significantly the expression of GHR on both

Table 2. Relative lymphocyte distribution in rat lymphoid tissues according to the level of dietary protein.

Protein in diet (%) 0 4 8 12 20

Tissue Subpopulation (%)

Spleen CD4 38 ± 2.7 33.3 ± 4.1 28.6 ± 3.1 31.3 ± 2.7 32 ± 3.2CD8 19.7 ± 2.1† 26.3 ± 5.6†§ 21.3 ± 2.7† 21 ± 2.2† 29.7 ± 3.1§

CD45RA 28.3 ± 2.7† 25 ± 4.8† 31.3 ± 3.3† 26.7 ± 4.4† 22 ± 2.4§

Lymph CD4 55.3 ± 2.7† 59.7 ± 1.4§ 62.9 ± 0.4§ 61.3 ± 0.5§ 62 ± 1.4§

nodes CD8 26.7 ± 1.5 24.7 ± 0.6 24.2 ± 1.2 24.8 ± 0.8 28.3 ± 1.7CD45RA 16.2 ± 1.6† 12.7 ± 1.7† 11.7 ± 2.1§ 10.9 ± 1.8§ 8.2 ± 1.4§

PBL CD4 42.7 ± 2.3 38.7 ± 1.9 47.9 ± 2.7 51.9 ± 1.1 47.4 ± 3.6CD8 23.6 ± 1.4† 21.2 ± 0.2† 21 ± 0.9† 27.3 ± 1.2§ 29 ± 1.8§

CD45RA 26.5 ± 3.2† 28.1 ± 2.4† 22 ± 1.5§ 18.8 ± 0.8§ 18 ± 4.3§

The mean ± s.e.m. (n=6) is represented for each group. Superscripts represent significant differences between treatmentgroups. Means not sharing the same superscripts are different at P‹0.05. Means without superscripts are not different.

408


Figure 1. Specificity of Fluos-rrGH binding to GHR. Thetotal binding of Fluos-rrGH to the IM-9 lymphocyte cell line(black square) corresponded to 90%. A 100-fold excessof unlabeled rrGH inhibited the binding of Fluos-rrGH by75% to IM-9 cells. The total binding of Fluos-rrGH tosplenocytes (open square) corresponded to 23%. A 100-fold excess of unlabeled rrGH inhibited the binding of Fluos-rrGH by 70%.

mesenteric lymph nodes and peripheral bloodlymphocytes.

Serum growth hormone levels

Serum GH levels were markedly decreased inresponse to decreasing dietary protein content asshown in figure 3A. In the groups that received

Figure 2. Cytofluorometric detection of GHR on CD45RA splenocytes. Animals were fed diets consisting of either 0%(panel A), 4% (panel B), 8% (panel C), 12% (panel D) or 20% (panel E) protein for 14 days, as indicated. Splenocyteswere obtained as described and stained with fluos-rGH and anti-CD45RA-PE-conjugated antibody. The percentage ofimmunelabeled B cells for the GHR was determined by FACS. The percentage of GHR- (upper left) and GHR-bearing cells(upper right) is indicated in each panel. Panel F shows a representative negative control, fluos-BSA and mouse IgG1

isotype-PE antibody. One representative profile of n=6 rats in each group is presented.

20% and 12% protein diets, serum GH levels weresimilar, whereas in the groups that received 8%,4% and 0% protein diets were significantly lower(P<0.05) compared to animals fed 20% protein diet.

Serum prolactin levels

Serum prolactin levels increased in response todecreasing the dietary protein content as shownin figure 3B. Prolactin levels on day 0 were 12.5 ±3 ng/ml. On day 14, serum levels of animals fedwith 20% or 12% protein diet remained unchanged,whereas in rats fed 8% and 4% protein diet,prolactin levels showed an increase, 26.3 ± 3.8ng/ml and 18.6 ± 3.2 ng/ml respectively. Serumlevels in rats fed 0% protein diet were similar tothe control.

Serum insulin levels

Serum insulin levels progressively decreased inresponse to decreasing the dietary protein content,as shown in figure 3C. In rats fed 0 and 4% proteindiets, serum insulin levels were significantly lower(P<0.05) than those observed in rats fed 8, 12 or20% protein diets.

409


Table 3. Relative distribution of growth hormone receptors (GHR) on lymphocyte subpopulations in rat lymphoid tissuesaccording to the level of dietary protein.


Tissue Subpopulation (%)

Spleen CD4 17.4 ± 3.1† 9.2 ± 2.9§ 13.9 ± 2.5† 6.1 ± 1.3§ 8 ± 0.7§

CD8 22.2 ± 1.3† 10.4 ± 3.0§ 8.6 ± 1.6§ 5.9 ± 3.1§ 8.3 ± 2.2§

CD45RA 51.9 ± 4.4† 27.7± 7.6§ 16.9± 2.2§?| 12.6± 3.2? 12.2 ± 3.7?

Lymph CD4 3.9 ± 0.6† 2.3 ± 0.4† 1.8 ± 1.1† 4.9 ± 2.3† 3.1 ± 1.2§

nodes CD8 4.2 ± 0.5 3.9 ± 0.6 3.8 ± 1.1 4.2 ± 0.2 3.1 ± 1CD45RA 13.2 ± 1.3 12 ± 2.7 10 ± 1.6 12.8 ± 1.4 13.9 ± 5.4

PBL CD4 1 ± 0.2 0.7 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.5 ± 0.2CD8 1.1 ± 0.1 1 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.9 ± 0.2 0.5 ± 0.2CD45RA 1 ± 0.2 1.7 ± 0.4 0.9 ± 0.1 1 ± 0.1 1.5 ± 0.4

All values expressed as mean ± s.e.m. from n=6 rats in each group. Superscripts represent significant differencesbetween treatments groups; means not sharing the same superscripts are different at P‹0.05. Means without superscriptsare not different.

Figure 3. Effect of dietary proteinrestriction on serum GH levels (A),prolactin (B) and insulin (C) on day14. Rats were fed diets consistingof either 0, 4, 8, 12 or 20% proteinfor 14 days, as indicated. Datapoints indicate individual serum GHlevels in ng/ml from n=6 rats in eachgroup. Prolactin and insulin data areexpressed as average serumlevels ± s.e.m., in ng/ml, from n=6rats in each group. a P<0.05 vs.control fed 12% or 20% proteindiets.

0 4

8

12 20

% Protein in diet

4

3

2

1

0

Insu

lin (

ng

/ml)

a

a

160

120

80

40

00 10 20

% Protein in diet

Gro

wth

ho

rmo

ne

(ng

/ml)

40

30

20

10

0

0 4

8

12 20

Pro

lact

in (

ng

/ml)

410


Serum IGF-I levels

Table 4 lists the changes in serum IGF-Iconcentrations over the 14-days period. On day 0circulating levels were similar, but by day 14,similar to serum GH levels, circulating IGF-I levelsprogressively decreased in response to decreasingthe dietary protein content. On day 14 the levelswere significantly lower in the group fed 8% proteindiet, and further reduced in the groups thatreceived 4% and 0% protein diets compared toanimals fed 20% protein diet. Interestingly, in theanimals that received 12% protein diet the serumlevels remained unchanged over the experimentalperiod, whereas in the group that received 20%protein diet the levels increased significantly(P<0.05) compared to the serum concentrationson day 0.

Serum IGFBP-3 and IGFBP-1 levels

The effect of dietary protein restriction on the serumIGFBPs molecular distribution is shown in figure4. It is evident that serum IGFBP-3 levels (40-45kd) progressively decreased as the amount ofprotein intake was decreased. In rats fed 0 and4% protein diets, there was a significant reduction(P<0.01) in serum IGFBP-3 levels, 87 and 59%respectively compared to animals fed a 20%protein diet. In rats fed 8 and 12% protein diets anon-significant reduction of 25% was observed. Thewestern ligand blots show that IGFBP-1 levels (25-28 kd) did not change significantly among theanimals fed the various protein diets.

Discussion

The effects of hormones on the proliferation anddifferentiation of immune cells has been widelyappreciated and the importance of the GH/IGF-Iaxis in immune responsiveness is also understudy. A recent hypothesis has suggested that

the immunomodulatory effects of GH and IGF-I maybe explained in terms of their anabolic andsomatogenic actions (1, 2).

The purpose of this study was to determine therelative distribution of growth hormone receptorson lymphocytes from some lymphoid tissues aswell as some elements associated to the GH/IGF-I axis in rats under protein malnutrition. Thisinvestigation together with recent repor tsrepresents the original studies demonstrating up-regulation of the GHR population in lymphoidtissues after protein deprivation (9,10). Growthhormone receptor expression was assayed byflow cytofluorometric analysis using Fluos-rrGHto characterize the distribution of GHR togetherwith specific PE-labeled mAbs defining CD4+ andCD8+ T cells and B lymphocytes from lymphoidcell populations. The binding of Fluos-rrGH to itsreceptor in splenocytes and IM-9 cells showedsimilar characteristics; it was saturable andspecific. This finding makes this ligand a usefultool in flow cytometry studies of paracrine/autocrine actions of the GH.

It has been shown that GHR is expressed inmurine hematopoietic tissues, including primaryand secondary lymphoid organs (12). We foundthat the pattern of expression is different amongthe different lymphoid tissues studied, as well as,among the various cell subsets. It is well knownthat fasting or protein calorie malnutritiondecreases the GHR expression in the liver causinga resistance to the growth hormone action; lesssevere malnutrition such as a decreased proteinintake, does not affect the GH binding but somepost-receptors defects have been described (11,13). In this study of protein deprivation at variouslevels, an increase in the GHR binding has beenobserved. Among the secondary lymphoid organs

Table 4. Total serum IGF-I concentrations (ng/ml).


Day 0 478 ± 114 415 ± 92 449 ± 54 482 ± 80 493 ± 74 14 19 ± 15† 72 ± 39§ 281 ± 147? 472 ± 68± 870 ± 27¶

The mean ± s.e.m (n=6) is represented for serum collected on given days. Superscripts represent significant differencesbetween treatment groups; means not sharing the same superscripts are different at P‹0.05. Means without superscriptsare not different.

411


Figure 4. Effect of dietary protein restriction on serum IGFBP-3 and IGFBP-1 levels. Rats were fed diets consisting ofeither 0, 4, 8, 12 or 20% protein for 14 days, as indicated. Data are expressed as average IGFBP-3 levels (A) or IGFBP-1 levels (B) as fold increase over control fed 20% protein diet ± s.e.m., in ng/ml from n=6 rats in each group. A representativeligand blot asssay of serum from rats fed the various diets (2 lanes per group) is shown. Proteins were separated on 4-20% SDS-PAGE and IGFBPs were detected by incubation with 125 I-IGF-I. a P<0.01 vs control fed 12% or 20% protein diets.

analysed, the spleen was the most responsive tothis phenomenon with the B lymphocytesexpressing more GHR followed by CD4+ T cells.

According to our results, as the protein intakedecreases, the percentage of splenic CD4+ T cellsand B lymphocytes increases and more cells (2-4fold) become responsive to GH. Although thepercentage of CD8+ T cells decreased, up-regulation of the GHR was seen in the three spleniccell subsets in response to the nutritional insult.These results were also shown in mice underprotein malnutrition (10) and it was furtherdemonstrated that an increase in the matureCD4+CD8- thymocytes might explain the increasein the CD4+ T lymphocytes (14). In contrast,despite the increased percentage of B cellsinduced by the protein restriction in mesentericlymph nodes and peripheral blood, only 10-13%in the lymph nodes and 2-4% of the lymphocytesin circulation bind the GH and no significantchanges were induced by the protein deprivation.It is more likely that most cells bearing the GHRremain in the tissue due to the anabolic action in

order to preserve the homeostasis. The GHRexpression in the thymus is much reduced undernormal protein intake compared to the other tissuesanalyzed (<1%, data not shown). Our results arecoherent with those of Gagnerault et al. (12), whodetected higher levels of GHR expression in Bthan in T lymphocytes from mice hematopoietictissues. According to the current information andthese results, rat and mouse are very similar inthe pattern of GHR expression with higher positivecells in spleen than in mesenteric lymph nodes,peripheral blood lymphocytes and thymus.

The autocrine/paracrine mode of action of the GH/IGF-I axis in the immune system is currently understudy, but the regulatory effect of the dietaryprotein has not been clarified. In order to have asystemic approach to some elements of this axisserum IGF-I, GH, prolactin, insulin and IGFBP-1and -3 were determined. Nutritional status is knownto regulate these elements (8); as expected, serumIGF-I, GH, insulin and IGFBP-3 levels wereprogressively reduced in response to decreasingthe protein intake.

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Prolactin is a lactogenic hormone associated withthe response to stress (15). In this study, we foundthat a low protein intake regulates the serumconcentration of prolactin, with a markedincrement after 5 days of protein restriction. It hasbeen proposed that prolactin secretion is increasedin order to partially counteract the negativesuppressive effects on the immune system ofglucocorticoid response to stress (16).

In conclusion, among the lymphoid tissuesstudied, GH receptors in spleen-derivedlymphocytes showed to be more responsive tothe stress caused by a low or deficient proteinintake with a 2-4 fold increase and a highestexpression in B lymphocytes, followed by CD4+T cells. These results support the hypothesis ofan immunomodulatory role of the GH/IGF-I axisin preserving the homeostasis of the immunetissues.

Acknowledgements

We thank Leonardo Lareo and María FernandaGutiérrez at Pontificia Universidad Javeriana,Colombia, for their help with the animal facility.This study was supported by Colciencias, grant1101-05-100-68 Colombia and the InternationalProgram in the Chemical Sciences, IPICS;Uppsala University, Sweden, Project COL:01.

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Biomédica 2004;24:413-22 LPS Y POLIMIXINA B EN CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS

COMUNICACIÓN BREVE

Efecto del lipopolisacárido encultivos de células dendríticas humanas y

su inhibición por la polimixina BAdriana Cuéllar 1, Ángela Fonseca 1, Alberto Gómez 2

1 Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.2 Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina; Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias,

Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

Algunos estímulos de maduración utilizados en cultivos de células dendríticas, como lasproteínas recombinantes obtenidas en sistemas bacterianos o los extractos proteicos deectoparásitos, contienen lipopolisacáridos (LPS) y su presencia afecta el comportamiento delas células dendríticas en cultivo. En este trabajo se evaluó el efecto del LPS en un sistema decultivo de células dendríticas humanas y la actividad de la polimixina B como inhibidor delefecto del LPS. Para esto, los monocitos obtenidos a partir de sangre periférica humana sediferenciaron a células dendríticas con IL-4 y GM-CSF y como estímulo de maduración seutilizó LPS o PGE2/FNTα. La expresión de marcadores y la secreción de citocinas se evaluaronpor citometría de flujo. Los resultados mostraron que la preexposición a endotoxina disminuyóla expresión de CD83, inhibió la secreción de IL-12p70, FNTα e IL-10 y disminuyó la secreciónde IL-6 en células dendríticas. Además, la utilización de 10 mg/ml de polimixina B fue efectivaen la inhibición de la actividad de 1 mg/ml de LPS y la máxima concentración de polimixina Bque no afectó la morfología de las células fue de 50 mg/ml. En conclusión, la polimixina B esefectiva para inhibir la actividad del LPS en los cultivos de células dendríticas.

Palabras clave: células dendríticas, citocinas, LPS, linfocitos.

Effect of lipopolysaccharides on human dentritic cell cultures and its inhibition bypolymyxin B

Dendritic cells have been described as effective antigen presenting cells. Human dentritic cellsare highly susceptible to lipopolysaccharide (LPS) tolerance, consisting of a differentialdeactivation state in which some cellular functions are impaired. LPS tolerance can beexperimentally induced in vitro, in which the presence of LPS strongly affects the behavior ofcultured dendritic cells. Recombinant proteins obtained from bacterial systems or protein extractsof ectoparasites containing LPS can be used as stimuli to enhance maturation processes inthese cells. The present study evaluated the effect of LPS in human dendritic cell cultures, andthe activity of polymyxin B as an inhibitor of the LPS effect. Dendritic cells were obtained fromperipheral blood monocytes in the presence of IL-4 and GM-CSF, followed by exposure withLPS and PGE2/TNFα. Surface markers and cytokine levels were evaluated by flow cytometry.The dendritic cells pre-exposed to single doses of endotoxin demonstrated a reduced capacityto mature, reduced CD83 expression, inhibited secretion of IL-12, TNFα, IL-10 and diminishedsecretion of IL-6. Furthermore, polymyxin B at 10 mg/ml inhibits LPS activity at 1 mg/ml. Themaximum polymyxin B concentration with no effect on cellular morphology was 50 mg/ml.Consequently, polymyxin B was determined to be an effective LPS inhibitor in dendritic cellcultures.

Key words: dendritic cells, cytokines, LPS, lymphocytes.

Biomédica 2004;24:413-22

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Biomédica 2004;24:413-22CUÉLLAR A., FONSECA A., GÓMEZ A.

Las células dendríticas son las célulaspresentadoras de antígenos más potentes, no sólopor su capacidad para estimular la activación delos linfocitos T a través de la presentación deantígenos en el contexto del complejo mayor dehistocompatibilidad y la expresión de moléculascoestimuladoras (1-3), sino también por sucapacidad para secretar citocinas que regulan larespuesta efectora Th1 o Th2 del linfocito T (4-7).

En los tejidos, las células dendríticas seencuentran en un estado inmaduro, caracterizadopor una alta actividad fagocítica y su activacióninduce un proceso de migración a los órganoslinfoides secundarios. Durante la migración, lascélulas dendríticas entran en un proceso demaduración que involucra la pérdida de lacapacidad fagocítica y aumenta sus propiedadesestimuladoras para las células T CD4+ y CD8+vírgenes (8,9). La capacidad de migración de lascélulas dendríticas se ha demostrado in vitro (10).

Se ha reportado, también, que los monocitos sepueden diferenciar a células dendríticas in vivo(11). Este proceso ha sido reproducido in vitro,utilizando citocinas como IL-4 y GM-CSF comoinductores de diferenciación de monocitos acélulas dendríticas inmaduras y múltiples factoresde maduración para obtener células dendríticasmaduras como LPS, CpG, citocinas, complejosinmunes, proteínas de choque térmico y ARN dedoble cadena (2,12-16).

El lipopolisacárido (LPS) es un importantecomponente de la membrana externa de lasbacterias Gram negativas y actúa como unpotente activador de las células del sistemainmune. Sin embargo, se ha descrito unainsensibilidad temporal de las células humanasde la inmunidad innata a retos continuos con LPSen humanos. Este fenómeno conocido comodesensibilización a la endotoxina o tolerancia aLPS, se asocia con alteraciones funcionales decélulas del sistema monocito/macrófago y células

dendríticas in vivo y se puede demostrar encélulas aisladas in vitro (6,17-20).

En varios modelos de cultivo de células dendríticasse ha demostrado que dosis únicas de LPS desdeel inicio del cultivo inhiben de manera dosisdependiente, la producción de citocinasproinflamatorias y la expresión del marcador demaduración CD83+, lo cual se asocia con ladisminución de su actividad endocítica. De igualmanera, se encontró que estas células secomportan como fuertes estimuladores de laproliferación de linfocitos T, pero pobres inductoresde INFγ en una reacción mixta de leucocitos(21,22).

Teniendo en cuenta que muchos de los estímulosde maduración utilizados para evaluar la actividadfuncional de las células dendríticas, como lasproteínas recombinantes obtenidas en sistemasbacterianos o los extractos proteicos deectoparásitos contienen LPS y que la presenciade LPS puede afectar el comportamiento de lascélulas en cultivo, en este trabajo se buscóevaluar el efecto de LPS en un sistema de cultivode células dendríticas humanas y la actividad dela polimixina B como inhibidor del efecto del LPS.


Purificación de monocitos

Los monocitos de sangre periférica se obtuvieronde voluntarios humanos sanos, previoconsentimiento escrito, a partir de 40 ml de sangre.Se obtuvieron células mononucleares de sangreperiférica en gradientes de Ficoll y se realizó unaseparación de monocitos con anticuerposmonoclonales anti-CD14 acoplados a perlasmagnéticas, utilizando el sistema de MiniMaCs(Miltenyi). Las células obtenidas se lavaron enmedio base (RPMI 1640) con 2% de suero bovinofetal (SBF). La viabilidad se evaluó con azul tripanoy se realizó conteo celular. La pureza de lapoblación se evaluó por citometría de flujoutilizando un anticuerpo anti-CD14.

Diferenciación de monocitos acélulas dendríticas

Todos los reactivos fueron probados para lapresencia de LPS utilizando el sistema de lisadode amebocitos de Lymulus spp. (Bio Whittaker),

Correspondencia:Adriana Cuéllar, Carrera 7a No. 43-82, oficina 608, EdificioCarlos Ortiz, Bogotá, D.C.Teléfono: 320 8320, ext. 4020; fax: 320 8320, ext. [email protected]


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siguiendo las instrucciones del fabricante. Seincubaron células CD14+ en medio completo(RPMI 1640, antibióticos, aminoácidos noesenciales, piruvato de sodio y 10% SFB) enplacas de 24 pozos a una densidad de 8x105/mlen presencia de 500 U/ml de IL-4 y 50 ng/ml deGM-CSF (R&D system, USA) durante 5 días y severificó su morfología por microscopia de luz. Eldía 5 se adicionaron 5.000 U/ml de FNTα (R&DSystems) y 10 mM de PGE2 (Sigma ChemicalCompany) o 1 mg/ml de LPS de Escherichia coli(Sigma Chemical Company) durante 48 horas. Lossobrenadantes de los cultivos se congelaron a-70°C hasta la cuantificación de citocinas. Larecuperación de células dendríticas al final delcultivo se evaluó mediante conteo en cámara deNeubauer de las células no adherentes y elporcentaje de expresión de CD83 se evaluó porcitometría de flujo en las células no adherentes.

Para evaluar el efecto de LPS se realizaroncultivos de células dendríticas libres deendotoxina, utilizando como estímulo demaduración 1 mg/ml de LPS en ausencia opresencia de sulfato de polimixina B (Merck) endiferentes concentraciones (1, 10 y 100 mg/ml).

Se utilizaron varias condiciones de cultivo enRPMI completo, para obtener al día 7 de cultivodiferentes fenotipos: 1) para obtener monocitoscomo control de diferenciación: cultivo enausencia de citocinas y estímulos de maduración;2) para obtener células dendríticas inmaduras:adición de IL-4 y GM-CSF el día 0 en ausencia deestímulos de maduración, y 3) para obtenercélulas dendríticas maduras: cultivos en presenciade IL-4 y GM-CSF desde el día 0 con adición deLPS o PGE2 y FNTα el día 5 de cultivo comoestímulo de maduración. Para evaluar el efectodel LPS en los cultivos de células dendríticas, seadicionó 1 mg de LPS el día 0 de cultivo y,posteriormente, utilizando LPS (LPS/LPS) oPGE2 y FNTα LPS-PGE2/FNTα) como estímulosde maduración en el día 5. Para determinar lamáxima concentración de polimixina B que no afectala morfología celular, se utilizaron concentracionesde 10 a 100 mg/ml de polimixina B.

Teniendo en cuenta que una de las característicasde las células dendríticas diferenciadas a partirde monocitos es que pierden su capacidad de

adherencia, para evaluar el porcentaje derecuperación total de células al final del cultivo,se realizó un recuento de las células noadherentes con respecto al número de célulascultivadas al día 0 (8x105/ml) y para determinar elporcentaje de recuperación de células dendríticasmaduras se evaluó la expresión del marcador demaduración CD83+ en las células no adherentes.

Citometría de flujo

Para evaluar la expresión de marcadores desuperficie se utilizó citometría de flujo de cuatrocolores con anticuerpos anti CD14.APC (clonMfP9,BD Biosciences), anti HLA-DR.PerC (clonL243, BD Biosciences), anti CD86.PE (clon MO41726, Pharmingen) y anti CD83.FITC (clonHB15e, Pharmingen), con controles de isotipo paraHLA-DR (IgG2α.PerCP-BD Biosciences), CD86(IgG2β.PE-Pharmingen) y CD83 (IgG1.FITC-Pharmingen).

En total se colocaron 1x105 células en tubos decitometría y se incubaron por 30 minutos a 4°Cen oscuridad con las diferentes combinacionesde anticuerpos. Se realizaron tres lavados conPBS, pH 7,2 y azida de sodio 0,1% y seresuspendieron en solución de fijación (PBS 1x,paraformaldehído al 1%). La adquisición y elanálisis de los datos se realizó usando uncitómetro de flujo FACSCalibur (BD Immuno-cytometry Systems, USA).

La cuantificación de citocinas se realizó con unestuche comercial para detección de citocinas ensobrenadantes de cultivo por citometría de flujo(BD Biosciences), en el cual se utilizan perlas dediferentes intensidades de fluorescencia en FL3,cubiertas con anticuerpos de captura. El sistemase revela con anticuerpos anticitocinasconjugados con PE para IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10,FNTα e IL-12p70. El cálculo de la concentraciónse realizó utilizando patrones de las diferentescitocinas en concentraciones conocidas. Lasensibilidad del ensayo para cada una de lascitocinas fue para IL-8 3,6 pg/ml, IL-1b 7,2 pg/ml,IL-6 2,5 pg/ml, IL-10 3,3 pg/ml, TNFα 3,7 pg/ml eIL-12p70 1,9 pg/ml.

Regulaciones éticas

Este estudio se realizó teniendo en cuenta laresolución No. 008430 del Ministerio de Salud de

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la República de Colombia, como investigación conriesgo mínimo. Los individuos participaron en elproyecto previa firma del consentimiento escrito,y el manejo de muestras se realizó bajo las normasde seguridad (precauciones universales) en elLaboratorio de Inmunobiología y Biología Celulardel Departamento de Microbiología de la PontificiaUniversidad Javeriana. Además, este proyecto fueaprobado por el Comité de Ética de la Facultad deCiencias de la Pontificia Universidad Javeriana.

Análisis de los resultados

Los resultados se muestran como el promedio detres experimentos independientes para cadacondición con desviación estándar.

Resultados

Purificación de monocitos y obtención decélulas dendríticas

La separación de células CD14+ mediante lautilización de perlas magnéticas permitió obtener

entre el 6% y el 8% de las células mononuclearesde sangre periférica con viabilidad mayor del95%. En todos los casos, el porcentaje depureza de las células CD14+ fue mayor de 90%(figura 1A).

De acuerdo con el análisis de la expresión demarcadores, se obtuvieron células dendríticasinmaduras que fueron CD14-, CD86+, HLA-DR+y CD83- (figura 1B) y células dendríticas madurasque fueron CD14-, aumentaron su nivel deexpresión de CD86 y HLA-DR con respecto a lascélulas dendríticas inmaduras y fueron positivaspara el marcador de maduración CD83 (figura 1C).Además, la morfología celular evaluada pormicroscopía de luz permitió observar célulasgrandes y con prolongaciones de la membrana,características de células dendríticas.

Los resultados mostraron que la preexposición aLPS disminuyó el porcentaje de recuperación tantode células totales no adherentes como de células

Figura 1. Dispersograma representativo de las células obtenidas de un individuo, que muestra la pureza de las célulasCD14+ obtenida después de la separación con perlas magnéticas (A). El fenotipo de las células al final del cultivo (día 7) paracélulas dendríticas inmaduras (B) y células dendríticas maduras (C) evaluado mediante la expresión de CD14, HLA-DR,CD86 y CD83.

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Cuadro 1. Citocinas secretadas por células dendríticas inmaduras (pg/ml).

IL-12 p70 FNTααααα IL-10 IL-6 IL-1βββββ IL-8

PBS 0 0 0 0 <7,2 101 (41)LPS 0 <3,7 52,7 (18,1) 2.140 (289) 171 (28) 8,310 (1.036)

Cuantificación de citocinas en el sobrenadante del cultivo al día 5 sin PBS o con LPS preexposición a endotoxina el primerdía de cultivo. Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes; los valores en paréntesis correspondena la desviación estándar.

dendríticas CD83+, utilizando los dos estímulosde maduración (figura 2).

Efecto de LPS en la expresión de marcadoresy secreción de citocinas

El marcador CD14 fue negativo en célulasdendríticas inmaduras y maduras, y se mantuvopositivo en los monocitos. Los marcadores HLA-DR y CD86 fueron positivos en todos los casos ysu expresión no fue alterada por la preexposicióna LPS. La expresión de CD83 disminuyó en elcultivo que contenía LPS desde el día 0 y que fuemadurado con LPS al día 5. Este efecto no seobservó cuando se utilizó PGE2 y FNTα comoestímulo de maduración.

Utilizando citometría de flujo, se cuantificaron lascitocinas secretadas por las células al día 5 y 7de cultivo. Al día 5 de cultivo, en condiciones libresde endotoxina, las células dendríticas inmadurassecretaron bajas cantidades de IL-8, con la adición

de LPS en el día 0 de cultivo, se encontraron bajascantidades de IL-10 y altos niveles de IL-6, IL-1β e IL-8 (cuadro 1).

Utilizando LPS como estímulo de maduración encondiciones libres de LPS al día 0, se observóproducción de IL-12p70, FNTα, IL-10, IL-6, IL-8 ybaja secreción de IL-1β. La preexposición a LPSinhibió la secreción de IL-12p70, FNTα e IL-10 ydisminuyó la secreción de IL-6. Los niveles de IL-1b e IL-8 fueron mayores cuando se adicionó LPSal día 0 (figura 3).

Utilizando PGE2 y FNTα como estímulo demaduración en condiciones libres de LPS al día0, se observó producción de FNTα e IL-8. La pre-exposición a LPS no alteró la secreción de FNTα,se observó una baja secreción de IL-6 yconsiderable aumento de IL-1b e IL-8 (figura 3).

Actividad inhibidora de polimixina B

Los resultados se muestran como el porcentajede inhibición con respecto al control deestimulación con LPS, y se observa que lainhibición en la expresión del marcador demaduración CD83 aumenta de una manera dosisdependiente (figura 4). La expresión de CD86 yHLA-DR es inhibida con altas dosis de polimixina(figura 4).

Teniendo en cuenta que en condiciones libres deendotoxina se encuentra secreción de IL-12p70,FNTα, IL-10, IL-6 e IL-8 al utilizar como estímulode maduración LPS al día 5 de cultivo, se procedióa evaluar la secreción de estas citocinas enpresencia de polimixina B. La secreción de IL-10fue completamente inhibida en más del 98% encada una de las diferentes concentraciones depolimixina B. En presencia de 10 mg/ml depolimixina B, IL-12p70 e IL-6 mostraron unainhibición cercana al 80%; la secreción de IL-8 se

Figura 2. Porcentaje de recuperación total de células noadherentes y de células dendríticas maduras CD83+ al finaldel cultivo. La línea punteada muestra el porcentaje derecuperación de las células no adherentes al final del cultivoy las barras representan el porcentaje de recuperación decélulas dendríticas CD83+. Estos valores se obtuvieroncon respecto al número de células cultivadas al día 0 (8x105).

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Figura 3. Cuantificación de citocinas en sobrenadante de cultivo al día 7. Los datos representan el valor de citocinas enpg/ml, cuantificadas en sobrenadante de cultivo realizado en las diferentes condiciones.

inhibió en 50%, aproximadamente, y el FNTαmostró inhibición casi total. En presencia de 100mg/ml de polimixina B se observó una inhibicióncasi total de todas las citocinas (figura 5).

Al analizar la morfología de las células por tamaño(FSC) y complejidad interna (SSC) por citometríade flujo, se observó que la mayor concentraciónde polimixina B utilizada (100 mg/ml) alteró lamorfología de las células, por lo cual se utilizarondiferentes concentraciones de este inhibidor paradeterminar la máxima concentración que no afectala morfología de las células. Se encontró unadistribución normal de las células en FSC y SSChasta una concentración de 50 mg/ml. A mayoresconcentraciones, el dispersograma mostróevidentes alteraciones morfológicas.

Discusión

La principal respuesta de los linfocitos T CD4+ esla producción de citocinas, las cuales se encargan

de regular el tipo de mecanismo efector generadopara un tipo de agresión en particular. Sinembargo, no todas las células producen el mismopatrón de citocinas. En general, los linfocitos TCD4+ se pueden diferenciar hacia linfocitos Th1o Th2 dependiendo del microambienteencontrado en el momento de la activaciónlinfoide, el cual depende en gran medida de lasseñales generadas por la célula presentadora deantígenos.

Las células dendríticas han sido consideradas lascélulas presentadoras de antígenos porexcelencia; de ellas dependen las señales inicialesinducidas por la expresión de moléculascoestimuladoras y la secreción de citocinas. Losestudios sobre fenómenos inmunes encondiciones in vitro, no necesariamente reflejanlos eventos ocurridos in vivo, más aún cuando lapresencia de contaminantes como el LPS afectanel comportamiento de las células en cultivo.

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Aunque los modelos descritos para la obtenciónde células dendríticas varían en algunascondiciones de cultivo, en general, se han utilizadocitocinas como IL-4 y GM-CSF para ladiferenciación de monocitos a células dendríticascon diferentes estímulos de maduración para lascélulas, como LPS y la combinación de PGE2 yFNTα, entre otros (21,23-27).

Con el sistema de cultivo utilizado en el presenteestudio se obtuvieron cultivos de célulasdendríticas inmaduras y maduras, y se mostróque la preexposición a LPS disminuyó elporcentaje de recuperación de células dendríticasmaduras al final del cultivo. Datos similares sehan reportado previamente (22,28), aun cuandolas condiciones de cultivo se diferencian con elpresente estudio en cuanto a la adición decitocinas los días 2 y 5 de cultivo y en cuanto aque las concentraciones de LPS utilizadas fueronmenores (0,2 y 10 ng/ml).

En cuanto a la secreción de citocinas, en lascélulas dendríticas inmaduras obtenidas al día 5de cultivo que han estado preexpuestas aendotoxina no se encontró secreción de IL-12,aunque en otro estudio se reportó secreción debajos niveles de IL-12 (3 pg/ml) (28). Al final delcultivo, se observó que la preexposición a LPSinhibió la secreción de IL-12, FNTα, IL-10 ydisminuyó de IL-6 (22,29). A diferencia de lopreviamente reportado (21), no se encontróproducción de IL-12 en células maduradas conPGE2/FNTα. Teniendo en cuenta que existenalgunas diferencias en el sistema de cultivo, estopodría indicar que la adición de citocinas adiferentes días de cultivo afecta selectivamentela capacidad funcional de las células.

La polimixina B actúa como un inhibidor de losefectos de LPS como inducción de hemólisis (30),efectos tóxicos en ratón (31), respuestamitogénica de células de bazo de ratón (32),migración de macrófagos in vitro, liberación de IL-1 por monocitos y activación policlonal de linfocitosB (33).

De acuerdo con los resultados obtenidos con lautilización de polimixina B, se puede afirmar quehay un efecto inhibitorio de LPS dosis dependienteen la maduración de las células dendríticas.

Figura 4. Inhibición de la expresión de marcadores de célulasdendríticas en cultivos libres de endotoxina, al adicionar 1mg de LPS como estímulo de maduración al día 5 de cultivoen presencia o ausencia de polimixina B. Los resultados semuestran como el porcentaje de inhibición de la expresióndel marcador en presencia de polimixina B, con respecto alas células cultivadas en ausencia de polimixina B, en tresexperimentos independientes.

Utilizando 10 mg de polimixina B se logró unainhibición de 70% en la expresión de marcadoresy secreción de citocinas, cuando se utilizó 1 mg/ml de LPS. Además, se encontró que la máximaconcentración de polimixina B utilizada que noafectó la morfología de las células en cuanto atamaño y complejidad interna fue de 50 mg/ml. Laconcentración de 100 mg/ml de polimixina B seutilizó para evaluar el efecto de un exceso de dichocompuesto en la morfología de las células conrespecto a tamaño y complejidad interna, y seobservó una alteración en estos parámetros.

Los resultados obtenidos permiten concluir quela presencia de LPS en los cultivos de células

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dendríticas humanas afecta la capacidad demaduración de las mismas y de su actividadfuncional en términos de secreción de citocinas,y que este efecto varía dependiendo del sistemade cultivo utilizado de acuerdo con lo reportadoen la literatura. Además, la utilización de 10 mg/ml de polimixina B es efectiva en la inhibición dela actividad de 1 mg/mL de LPS. La utilización deproteínas recombinantes obtenidas en sistemasbacterianos o extractos proteicos de ectoparásitosque contienen LPS como estímulos demaduración requiere la estandarización de lacantidad de polimixina B, utilizando un máximode 50 mg/ml, de acuerdo con la cantidad de LPSque contengan dichos estímulos.

Los cultivos de células dendríticas utilizadas enestudios de maduración de las mismas o eninducción de respuesta linfoide T requieren ladefinición de las condiciones adecuadas para cadasistema de cultivo, ya que la presencia decontaminantes como el LPS que inducen la

Figura 5. Inhibición de la secreción de citocinas inducidas por LPS, en presencia de polimixina B. Los resultados semuestran como el porcentaje de inhibición de la concentración de citocinas, con respecto a las células cultivadas enausencia de polimixina B.

secreción de IL-12 podría desviar la respuestalinfoide hacia Th1. Éste ocasionaría elenmascaramiento de la respuesta que ocurre encondiciones naturales frente a diferentesestímulos. Así, en términos generales, ladeterminación de las condiciones de cultivolibres de LPS como la que se presenta en esteinforme será fundamental para evitar lossesgos en el análisis de la inmunidad innatay adquirida.

Agradecimientos

El presente trabajo fue realizado gracias al apoyofinanciero de la Vicerrectoría Académica de laPontificia Universidad Javeriana.

Un especial agradecimiento a Manuel Franco yJuanita Angel, profesores investigadores delInstituto de Genética Humana de la PontificiaUniversidad Javeriana, por su colaboración en eldesarrollo de este trabajo, y por su lectura críticadel manuscrito final.

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Biomédica 2004;24:423-37 TERAPIA COMBINADA CON ANTIMALÁRICOS

Correspondencia:Lyda Osorio, Centro Internacional de Entrenamiento eInvestigaciones Médicas, CIDEIM, Avenida 1N # 3-03, Cali,Colombia.Teléfono: (2) 668 2164; fax: (2) 667 [email protected].


REVISIÓN DE TEMA

Terapia combinada como estrategia enla prevención de la resistencia a los antimaláricos

Pamela Orjuela, Iveth González, Lyda Osorio

Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas, CIDEIM, Cali, Colombia.

La resistencia de Plasmodium falciparum a los antimaláricos es uno de los factores responsablesdel deterioro de la situación de la malaria en el mundo, que surge como resultado de laselección y posterior transmisión de mutantes espontáneos del parásito con susceptibilidadreducida a un fármaco. La terapia combinada es considerada como la principal estrategia parael control de la resistencia a los antimaláricos; actualmente, las terapias combinadas queincluyen derivados de la artemisinina son las más recomendadas. En Colombia se ha usadoterapia combinada antimalárica por más de 20 años pero se desconoce su impacto en prevenirla diseminación de la resistencia. En este artículo se revisan las bases teóricas y los estudiosclínicos que sustentan el uso de la terapia combinada y se discute su utilización en Colombia.

Palabras clave: malaria, Plasmodium falciparum, antimaláricos, resistencia, terapia combinada,artemisinina.

Combination therapy as a strategy to prevent antimalarial drug resistance

Resistance of Plasmodium falciparum to antimalarials is considered one of the factors responsiblefor the impairment of the malaria treatment and control worlwide. Resistance emerges as aresult of selection and then disemination of spontaneous mutant parasites with reduced drugsusceptibility. Combination therapy is considered as the main strategy to control antimalarialdrug resistance. Currently, combination therapies that include artemisinin derivatives are highlyrecommended. Combination therapy has been used in Colombia for more than 20 years;however, its impact on preventing the dissemination of drug resistance is unknown. This paperreviews the theoretical bases and clinical studies that support the use of combination therapy.

Key words: malaria, Plasmodium falciparum, antimalarials, resistance, combination therapy,artemisinin.

La malaria es la enfermedad parasitaria de mayormorbilidad y mortalidad en el mundo. En Américala transmisión se presenta en 21 países dondese estima que, aproximadamente, 201 millonesde personas viven en áreas con algún riesgo detransmisión (1). A pesar de la implementación deestrategias para su erradicación y control, en losúltimos años se ha presentado un incrementoprogresivo del número de casos de malaria e,incluso, su reaparición en áreas geográficas dondehabía sido erradicada (2).

Entre los factores que se han considerado comoresponsables del deterioro del control de laenfermedad a nivel mundial se incluye elsurgimiento y la dispersión de cepas dePlasmodium falciparum resistentes a losantimaláricos (2-4). Los primeros casos de fallaterapéutica a la cloroquina, el medicamento deuso más extendido, se informaron en la décadade 1950 en Suramérica y el sureste asiático (5,6).Desde entonces, se han reportado nivelesvariables de resistencia a este medicamento entodas las áreas endémicas para la malaria,excepto algunas regiones de Centroamérica, elCaribe y el Medio Oriente (2,4). Este problema noes exclusivo para la cloroquina, ya que tambiénse ha reportado resistencia a otros antimaláricosde primera y segunda línea, tales como lasulfadoxina-pirimetamina, la amodiaquina, la

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Biomédica 2004;24:423-37ORJUELA P., GONZÁLEZ I., OSORIO L.

mefloquina, la quinina y a la combinación fijaatovaquona-proguanil (Malarone®) (7-12).

Se han propuesto diferentes estrategias para elcontrol de la resistencia a los antimaláricos(7,13,14) entre las cuales figuran la vigilancia delsurgimiento y la dispersión de la resistencia, elfomento del uso adecuado de los medicamentos(óptima formulación y adherencia) y la terapiaantimalárica combinada (3,15,16).

La terapia combinada se ha utilizado para eltratamiento de la tuberculosis, la lepra, el cáncery, más recientemente, el VIH. En malaria el efectopreventivo del surgimiento de la resistencia a losantimaláricos mediante el uso combinado demedicamentos fue ampliamente demostrado enlos años 90 por Peters et al. en ensayos in vitro yen el modelo en ratones (17-21). Sin embargo, ladisponibilidad de opciones combinadas efectivases limitada y su uso se ve restringido aún másdebido a su alto costo relativo (3,15,22).

En Colombia, la terapia combinada antimaláricaha sido utilizada por varios años. No obstante, sedesconoce cuál ha sido su efecto en retardar elsurgimiento y la diseminación de la resistencia y,más aún, si es necesario considerar otrasalternativas combinadas de tratamiento a lasexistentes actualmente en el país. Esta revisiónexamina las bases teóricas que sustentan eluso de la terapia combinada como estrategiaclave en la prevención del surgimiento y ladiseminación de la resistencia de P. falciparum alos antimaláricos, se discuten las terapiascombinadas actuales y, finalmente, los factoresque se deben tener en cuenta en suimplementación.

Para la elaboración de esta revisión de tema serealizó una búsqueda de la literatura publicada queincluyó libros, artículos científicos, revisiones detema y reportes técnicos. La búsqueda de losdocumentos se realizó a través de la base de datosbibliográficos (PubMed) del National Center forBiotechnology Information de la National Libraryof Medicine. Las otras bases de datosbibliográficos que se consultaron fueron las de laOrganización Mundial de Salud, la OrganizaciónPanamericana de la Salud y la Biblioteca CientíficaElectrónica del Brasil (SciELO) (Scientific

Electronic Library Online). Los reportes publicadosse identificaron utilizando palabras clave en inglésy español, tales como: malaria y terapiacombinada, malaria y eficacia in vivo y terapiacombinada, malaria y ensayos in vitro ycombinaciones de drogas, malaria y artemisinina,malaria y resistencia a drogas, malaria yquimioterapia. También se consultaron lasbibliografías citadas en los artículos revisados.Los datos no publicados fueron generados dentrodel marco de estudios de eficacia terapéutica deantimaláricos realizados por el Grupo de Malariadel CIDEIM. La adquisición de los documentosse realizó a través de su acceso gratuito eninternet y en las bibliotecas del CIDEIM, el InstitutoNacional de Salud de Colombia y la Escuela deHigiene y Medicina Tropical de Londres.

Resistencia de Plasmodium falciparum a losantimaláricos

Definición y surgimiento de la resistencia

La resistencia a los antimaláricos se define comola habilidad de una cepa de un parásito parasobrevivir, multiplicarse o ambos a pesar de laadministración y la absorción de un fármaco endosis iguales o mayores a las recomendadas, perodentro de los límites de tolerancia del paciente(10). Esta resistencia surge como resultado demutaciones espontáneas del parásito que puedenafectar el acceso, la estructura o la actividad delblanco de un fármaco. Los parásitos mutantes sonseleccionados si la concentración del fármaco essuficiente para inhibir el crecimiento de parásitossensibles pero inadecuada para inhibir aquélloscon sensibilidad reducida o resistentes; estefenómeno se denomina presión de selección (10).Dentro de este contexto, las mutacionesespontáneas son eventos atípicos y, por tanto,su probabilidad de presentación es mayor segúnaumenta la biomasa de una infección (23). Lasinfecciones con altas densidades parasitarias soncomunes en pacientes no inmunes, en los cuales,un cuadro de malaria aguda puede presentar entre109 y 1013 formas asexuales del parásito,correspondientes a parasitemias del orden de0,001% a 10% (15,24). Si se asume unadistribución aleatoria de mutantes, un paciente conuna parasitemia del 1% presenta una probabilidad

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1.000 veces mayor de albergar un parásitomutante resistente que un paciente con unaparasitemia de tan sólo 0,001%. Del mismo modo,este paciente presenta una probabilidad menor dedesarrollar una inmunidad que elimine susparásitos (sensibles y resistentes) y al sersintomático recibe un tratamiento que generapresión de selección.

Varios factores influyen en la selección deparásitos resistentes, principalmente aquellosrelacionados con las interacciones medicamento-hospedero y medicamento-parásito como sedescribe a continuación.

El papel de la farmacocinética yla farmacodinamia de los antimaláricosen la resistencia

La farmacocinética se refiere al conjunto dinámicode procesos (absorción, distribución, metabolismoy eliminación) que permiten que un fármaco seencuentre en concentraciones terapéuticas en lasangre. La farmacodinamia tiene que ver con larelación entre la concentración de este fármaco ysu efecto en el parásito, así como la magnitudcon la que se alcanza este efecto (25). Ambosprocesos son clave en la selección de parásitosresistentes (24).

Entre los parámetros farmacocinéticos, el másimportante para la selección de parásitosresistentes es el tiempo de vida media (T1/2). ElT

1/2 se define como el tiempo que debe transcurrir

para que se reduzca a la mitad el nivel de unfármaco en la sangre (25). La mayoría de losantimaláricos tienen T

1/2 prolongado: cloroquina, 1

a 2 meses; mefloquina, 2 a 3 semanas;sulfadoxina, 10 días, y pirimetamina, 3 días,mientras que antimaláricos como la quinina, 16horas, o los derivados de la artemisinina, 45minutos, presentan T1/2 cor tos (26). Losantimaláricos con T

1/2 prolongados tienen una

mayor probabilidad de seleccionar parásitosresistentes que aquéllos con T1/2 cortas.

Cuando se administran fármacos con T1/2

prolongada, la presión de selección puede ocurrirdurante dos eventos: 1) cuando los parásitos deuna nueva infección se encuentran conconcentraciones subterapéuticas de los fármacosque se administraron en una infección primaria,

las cuales pueden llegar a inhibir parásitosaltamente sensibles pero no parásitos consensibilidad reducida o resistentes, y 2) cuandolos parásitos de una infección primaria logransobrevivir al tratamiento inicial, usualmente enbajas densidades, y, posteriormente, se venexpuestos a concentraciones subterapéuticas delmedicamento que ofrecen la oportunidad aaquellos parásitos con sensibilidad reducida oresistentes (pero no a aquéllos altamentesensibles) de multiplicarse (24). En contraste,cuando se usan fármacos de T

1/2 corta los

parásitos sobrevivientes o aquéllos procedentesde una nueva infección no se ven expuestos almedicamento y, por tanto, la presión de selecciónsobre los parásitos mutantes con baja sensibilidado resistentes es mínima.

De esta manera, los antimaláricos de T1/2

prolongada como la cloroquina, la sulfadoxina-pirimetamina o la mefloquina tienen una mayorprobabilidad de seleccionar parásitos resistentesque la quinina o los derivados de la artemisininacuya T1/2 es corta. Entre menor sea el T1/2, menores la probabilidad de seleccionar parásitosresistentes, como es el ejemplo del antimaláricode formulación fija clorproguanil-dapsona, que conun T1/2 de 2 días presenta una menor probabilidadde seleccionar parásitos resistentes que lasulfadoxina-pirimetamina (3,15).

Además de las características farmacocinéticasdel medicamento, otro factor que afecta elsurgimiento de la resistencia es su farmaco-dinamia. El principal objetivo de los antimaláricosconsiste en eliminar los parásitos de una infección;sin embargo, la diferencia en la farmacodinamiade los antimaláricos hace que no todos presentenla misma eficacia frente al parásito en susdiversos estadios. Cuando los fármacos ejercensu efecto máximo pueden disminuir la biomasaparasitaria en un rango que varía entre 100 y10.000 veces por ciclo asexual (15). La tasa dereducción parasitaria obtenida al dividir la biomasainicial de una infección por la biomasa de la mismaa las 48 horas de recibir tratamiento, es un buenestimador de la potencia de un antimalárico. Deesta manera, los derivados de la artemisinina quepresentan una tasa de reducción parasitaria de104 por ciclo asexual son considerablemente más

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potentes que otros medicamentos, como ladoxiciclina o la clindamicina, con una tasa dereducción parasitaria de tan sólo 10 (23).

El efecto selectivo sobre algunos estadiosespecíficos del parásito también influye de manerasignificativa en la respuesta clínica y parasito-lógica del paciente a su tratamiento. Por ejemplo,los medicamentos antifolatos, tales como lasulfadoxina-pirimetamina y el proguanil, actúanfrente a los estadios de trofozoíto maduro yesquizonte temprano, mientras que las quinoleínasy sus relacionados como la qiuinina, la mefloquina,la cloroquina y la amodiaquina, presentan unamayor eficacia sobre el estadio de trofozoíto joven.Así, la eliminación de los parásitos se alcanzacon mayor rapidez cuando se administranantimaláricos que actúan frente a estadiostempranos del parásito, como la cloroquina queactúa con mayor rapidez que la sulfadoxina-pirimetamina (15). Por su parte, los derivados dela artemisinina producen la respuesta terapéuticamás potente y rápida que cualquier otroantimalárico existente en la actualidad. Estoscompuestos presentan un amplio espectro deacción sobre los estadios asexuales de P.falciparum debido a que actúan desde losestadios de anillo joven hasta el esquizontemaduro. Las formas de esquizonte resultan serrelativamente resistentes a la mayoría de losantimaláricos, lo cual puede ocasionarrecrudescencias. Dentro de este contexto, lainfección de un paciente sólo se erradicará si lasconcentraciones de los fármacos que seadministraron exceden la concentración requeridapara mantener la multiplicación del parásito pordebajo de 1 hasta que el último parásito haya sidoeliminado (esta concentración equivale a laconcentración mínima inhibitoria - CMI - o aquéllanecesaria para inhibir el 99% de los parásitos enla infección - IC

99) o hasta que el número de

parásitos descienda a niveles tales que puedanser eliminados por el sistema inmunológico delpaciente (15).

La persistencia de parásitos de una infecciónprimaria puede evitarse con el uso demedicamentos potentes que actúen frente a variosestadios del parásito. Si esto no es posible ydespués de una infección primaria aún se

encuentran parásitos sobrevivientes, la selecciónde aquéllos resistentes podría reducirse al usarmedicamentos de T1/2 corta. Estos últimostambién reducen la probabilidad de seleccionarparásitos con sensibilidad reducida o resistentesprocedentes de una nueva infección. Sin embargo,una consideración impor tante es que losmedicamentos de T

1/2 corta usualmente requieren

dosis repetidas que afectan la adherencia delpaciente al tratamiento y, por tanto, su eficacia.

Diseminación de la resistencia

La resistencia a los antimaláricos sólo sedisemina e incrementa si los parásitos mutantesresistentes son transmitidos satisfactoriamentea nuevos hospederos. Así, en teoría, ladiseminación de la resistencia está dadaprincipalmente por: 1) la diversidad genética delas poblaciones de parásitos en el área endémica;2) el número de picaduras infectivas o tasa deinoculación entomológica como una medida de laintensidad de la transmisión, y 3) la estabilidadde la transmisión (23,27). En las áreas dondeexiste una amplia diversidad genética dePlasmodia y coexisten parásitos sensibles yresistentes, la recombinación de diferentesaislamientos, la cual ocurre en el intestino delmosquito infectado, disminuye la probabilidad dediseminación de la resistencia. Si la diversidadgenética es baja, la probabilidad de recombinacióngenética se disminuye y los clones resistentestienden a permanecer en las poblaciones, siemprey cuando el hecho de ser resistente no impliquecambios que alteren su probabilidad desupervivencia (fitness).

La velocidad con que ocurre la diseminación dela resistencia depende de la intensidad de latransmisión. La mayor intensidad de transmisiónen África podría explicar la rápida diseminaciónde resistencia a los antimaláricos en estecontinente. La intensidad de la transmisión, porsu parte, también determina otros factores queafectan la diseminación de la resistencia como eldesarrollo de la inmunidad clínica y, así, el númerode parásitos expuestos a medicamentos (presiónde selección) y la respuesta inmune de la población(premunición) capaz de eliminar bajos niveles deparásitos (27).

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Se ha observado que en las áreas donde latransmisión de la malaria es inestable(especialmente en epidemias), las biomasasparasitarias suelen ser altas y, por lo general, lasinfecciones son causadas por clones únicos(resistentes o sensibles) lo cual disminuye larecombinación y aumenta la probabilidad dediseminar clones resistentes (24). Por ejemplo, enla región fronteriza entre Tailandia y Myanmar, laresistencia a la mefloquina emergió rápidamente.Este fenómeno se presentó en una zona donde elpromedio de infecciones era bajo (2 a 3infecciones por persona en el año), existía uncontrol estricto sobre el uso de la mefloquina y enla ausencia presuntiva de automedicación (28).

En las diferentes áreas endémicas de malaria,los factores epidemiológicos, del hospedero, delmedicamento y del parásito interactúan parafavorecer el surgimiento y la diseminación de laresistencia o para no hacerlo. Mientras secomprende mejor este fenómeno y el peso relativode cada uno de estos factores en la evolución dela resistencia a los antimaláricos, se requiere laimplementación de medidas para su control. Lautilización de la terapia combinada es la estrategiamás recomendada.

Terapia combinada parala prevención de la resistencia

Definición de terapia combinada

Actualmente, la principal estrategia para laprevención de la resistencia a los antimaláricosha sido el uso de la terapia combinada. LaOrganización Mundial de la Salud (OMS) definecomo terapia antimalárica combinada: "el uso dedos o más medicamentos esquizonticidas conmodos independientes de acción y diferentesblancos bioquímicos en el parásito" (29). No seconsideran como terapias combinadas aquellascombinaciones que incluyen antibióticos (comoquinina-tetraciclina), medicamentos con eficaciaesquizonticida tisular o gametocitocida (como laprimaquina) o el uso de combinaciones fijasconsideradas como un solo producto cuyoscomponentes individuales no pueden ser utilizadoscomo monoterapia debido a su ineficacia osusceptibilidad a la resistencia (como lasulfadoxina-pirimetamina, la atovaquona-proguanil

y la clorproguanil-dapsona). Para efectos de estarevisión, se considera la definición de la OMS.

Raciocinio dela terapia combinada antimalárica

La resistencia resulta de mutaciones genéticasespontáneas del parásito y la probabilidad de quese desarrolle resistencia simultánea a dosfármacos con modos independientes de acciónes el producto entre la frecuencia individual demutaciones y la biomasa parasitaria total de lainfección. Por ejemplo, si 1 de 108 parásitos esresistente al fármaco A y 1 de 108 parásitos esresistente al fármaco B, entonces tan sólo 1 en1016 parásitos será resistente simultáneamente alos fármacos A y B. Teniendo en cuenta que labiomasa parasitaria de una infección varía entre108 y 1012, esta probabilidad se ve aún másreducida (23,30). De esta forma, mediante el usode la terapia combinada se reduce el número defallas al tratamiento por parásitos resistentes yse aumenta la eficacia terapéutica. La terapiacombinada también tiene un impacto en el controlde la resistencia al reducir la probabilidad de quese transmitan satisfactoriamente parásitosresistentes a nuevos hospederos (7).

En el éxito y el tiempo de vida útil de la terapiacombinada influyen principalmente dos factoresdiscutidos previamente: el T

1/2 y la tasa de

reducción parasitaria de los fármacos utilizadosen la combinación (15,23). Las monoterapias confármacos que presentan baja tasa de reducciónparasitaria y T

1/2 prolongados, tales como la

cloroquina, la sulfadoxina-pirimetamina y lamefloquina son potencialmente aptas paraseleccionar parásitos que presentan sensibilidadreducida a concentraciones subterapéuticas delfármaco (figura 1a) (22). Por el contrario, en laterapia combinada cuando se utilizanmedicamentos con tiempos disímiles deeliminación, como en el caso de mefloquina másartesunato, el artesunato que presenta un T

1/2 corto

y una alta tasa de reducción parasitaria eliminaun alto porcentaje de la biomasa inicial de lainfección dentro de las primeras horas de habercomenzado el tratamiento. Los parásitossobrevivientes a la acción del artesunato seráneliminados por la acción de la mefloquina que

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presenta un T1/2

mayor con un riesgo mínimo deseleccionar parásitos resistentes (22,23,31) (figura1b). Sin embargo, el inconveniente de estasterapias radica en que en las áreas de altatransmisión los parásitos resistentes provenientesde nuevas infecciones pueden ser seleccionadosal encontrarse con dosis subterapéuticas demefloquina en la sangre. Por este motivo,idealmente, en las terapias combinadas se debenutilizar medicamentos con propiedadesfarmacocinéticas similares. Por ejemplo, cuandose utiliza la combinación de amodiaquina mássulfadoxina-pirimetamina todos los parásitos son

Figura 1. Monoterapia vs. terapia antimalárica combinada.A. Monoterapia con mefloquina: a las dos semanas de recibirmefloquina la biomasa parasitaria se ha reducido 108 veces(A); los parásitos remanentes (B) se multiplican a medidaque disminuyen los niveles terapéuticos de mefloquina en lasangre y generan falla terapéutica. B. Terapia combinadacon mefloquina más artesunato. El artesunato, un derivadode la artemisinina, reduce la biomasa parasitaria (A) másrápidamente que cualquier otro antimalárico. Después de latercera dosis (3 días) el número de parásitos de la infecciónse ha reducido 108 veces. Aquellos parásitos remanentes,0,01% (B) estarán expuestos a una mayor concentraciónde mefloquina que la que se presenta cuando no se haadministrado el artesunato lo cual reduce la probabilidad desupervivencia de mutantes resistentes. C. Terapiacombinada con sulfadoxina-pirimetamina más amodiaquina.A las dos semanas de recibir la combinación, la biomasaparasitaria se ha reducido 108 veces. Sin embargo, comoambos fármacos se eliminan de manera similar ningunoejercerá presión de selección sobre los parásitos que nohayan sido eliminados por el fármaco con el menor T1/2.

Los gráficos presentados en esta figura fueron elaboradoscon base en los datos publicados en las referencias 23, 24y 26.

eliminados antes de que pueda presentarseresistencia simultánea a ambos medicamentos(figura 1c). Además, durante las reinfecciones,si ambos fármacos son eliminados de manerasimilar ninguno ejercerá presión de selecciónsobre los parásitos que no hayan sido eliminadospor la acción del fármaco que se eliminó primero,tal y como sucede cuando se utilizan terapiascombinadas con antimaláricos con T1/2 disímiles(32).

Derivados de la artemisinina enla terapia combinada antimalárica

Con base en los resultados de los ensayos desensibilidad in vitro y la eficacia clínica que handemostrado las combinaciones que incluyenderivados de la artemisinina, la OMS recomiendael uso de terapias combinadas que incluyan estoscompuestos (29). La importancia de los derivadosde la artemisinina radica en sus propiedades

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farmacológicas: 1) reducen en 98% la biomasaparasitaria de una infección dentro de las primeras4 horas de su administración y, debido a su cortoT1/2, la oportunidad de seleccionar parásitosresistentes por concentraciones subterapéuticases mínima; 2) han demostrado ser seguros yeficaces frente a cepas de P. falciparummultirresistentes (29,33,34); 3) reducen latransmisión de la enfermedad al disminuir lainfectividad postratamiento como consecuenciade la rápida y eficaz destrucción de los estadiossanguíneos jóvenes del parásito e impidir queéstos lleguen a diferenciarse en gametocitos(21,35,36), y 4) hasta el momento no se harepor tado resistencia a ninguno de estoscompuestos in vitro ni in vivo (29,35,37,38).

Debido a su seguridad y eficacia, los antimaláricosmás utilizados en combinación con los derivadosde la artemisinina han sido la mefloquina, laamodiaquina y la sulfadoxina-pirimetamina (37)(cuadro 1). Actualmente, algunas de estascombinaciones se utilizan en países del suresteasiático (10) y de Suramérica, tales como Perú yBolivia (1). En Colombia, los derivados de laartemisinina no se han introducido oficialmente alos esquemas de tratamiento para la malaria (39).

De las combinaciones mencionadas, la deartesunato más mefloquina ha sido la terapiacombinada más evaluada in vivo (40-44) y laexperiencia de su uso en Tailandia representa unbuen ejemplo del impacto positivo que ha tenidosu implementación. En este país, la cloroquinafue reemplazada por la sulfadoxina-pirimetaminacomo monoterapia de primera línea para eltratamiento de la malaria en 1973 (45). Debido alrápido surgimiento de la resistencia a estemedicamento, en 1984 se introdujo la mefloquinaa una dosis única de 15 mg/kg en combinacióncon la sulfadoxina-pirimetamina (44). Sin embargo,cuatro años más tarde, los ensayos desensibilidad in vitro y los estudios de eficaciaclínica demostraron una reducción del 75% en laeficacia de la combinación mefloquina mássulfadoxina-pirimetamina. Con base en estosresultados, el esquema de tratamiento sereemplazó por mefloquina como monoterapia auna dosis única de 25 mg/kg. Este tratamientoresultó ser muy eficaz durante su introducción en

1990; sin embargo, para 1994 el número de fallasya superaba el 50% (45). A partir de la eficacia invitro e in vivo que demostró la combinación demefloquina más artesunato sobre aislamientos deP. falciparum multirresistentes, a finales de 1994se instauró el uso de esta combinación enTailandia. Mediante la administración demefloquina (25 mg/kg), en dosis única, yartesunato (12 mg/kg en dosis total), en unesquema de tres días, para 1998 las tasas decuración ya habían aumentado a 100%; desdeentonces se ha presentado un descensoprogresivo en la incidencia de la malaria por P.falciparum (44).

Con base en la experiencia en Tailandia, lainformación generada por otros estudios deeficacia clínica y como respuesta a la situaciónactual de la resistencia a los antimaláricos, laOMS ha realizado un llamado a los países queusan monoterapias para que cambien sus políticasde tratamiento a terapias combinadas basadas,preferiblemente, en algún derivado de laartemisinina (cuadro 1).

Otras terapias combinadas

La única terapia combinada actual recomendadapor la OMS que no incluye derivados de laartemisinina es amodiaquina más sulfadoxina-pirimetamina. Esta combinación se ha reservadoestrictamente a regiones donde la eficacia aamodiaquina y a sulfadoxina-pirimetamina es altay para aquellos países en los cuales, por diversosfactores, no es posible la implementación deterapias combinadas que incluyan derivados dela artemisinina. Sin embargo, algunas desventajasque limitan el uso de amodiaquina mássulfadoxina-pirimetamina, incluyen:

• El número de países en los que se presentaeficacia a ambos medicamentos es limitado (enÁfrica se limita al occidente del continente) yes de esperase que aquellos países en dondesu eficacia está comprometida, el tiempo devida útil de la combinación sea corto.

• Aun en áreas donde la eficacia a amodiaquinay a sulfadoxina-pirimetamina es alta, el mal usode la combinación puede comprometer la vidaterapéutica de ambos medicamentos y, por lo

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tanto, atentar contra su uso potencial en unaterapia combinada que incluya derivados de laartemisinina.

• En África, en la actualidad no existe reemplazopara la sulfadoxina-pirimetamina comotratamiento preventivo intermitente, por tanto,antes de comprometer su tiempo de vida útilen una terapia combinada sin derivados de laartemisinina, su uso debe ser reservado parael tratamiento preventivo intermitente (46).

Cuadro 1. Terapias combinadas antimaláricas basadas en derivados de la artemisinina.

Combinación Uso como terapia combinada Referencia

AS + CQ Los estudios clínicos en Asia y África demuestran que su eficacia norepresenta una ventaja significativa frente a la monoterapia conCQ. Su uso es limitado en áreas con resistencia a CQ. 63-66

AS + SP Los estudios clínicos en África y Asia han comprobado una mayoreficacia de la combinación frente a la SP como monoterapia. Su usoconduce a una disminución rápida de la fiebre y del número degametocitos después de la infección. 37,45,58,59,67-69

AS + AQ Los estudios clínicos de la combinación en África y en Colombia(en curso) demuestran que su eficacia es superior a la obtenida conAQ como monoterapia. 37,64,69,70

AS + MQ Utilizada como primera línea de tratamiento en China, Tailandia, Vietnam,Camboya y Perú. Su uso es reservado para áreas de baja transmisióndebido al prolongado T1/2 de la MQ. 37,40,44,63,71-74

AS + QN Un estudio realizado en Vietnam en 268 pacientes con malaria nocomplicada por P. falciparum demostró que la combinación no es máseficaz que la QN como monoterapia. 73,75,76

Artemeter + Combinación comercialmente conocida como Riamet (en los paíseslumefantrina desarrollados; el costo aproximado por tratamiento es de US$40) o

Coartem (en los países en vía de desarrollo; el costo aproximado portratamiento es de US$2,64).Los ensayos clínicos han demostrado su seguridad y eficacia frente aP. falciparum multirresistente. Actualmente, es primera línea de tratamientoen Guyana Francesa. 29,77,78-80

Combinaciones en desarrollo

AS + pironaridina El amplio uso de la pironaridina como monoterapia en China ha demostradosu seguridad y eficacia frente a P. falciparum multirresistente. La adiciónde AS representa una medida preventiva ante el surgimiento de resistencia.Próximamente, la combinación será evaluada en pacientes con malaria nocomplicada por P. falciparum en países de Suramérica y África. 10,29,81-83

AS + clorproguanil/ La clorproguanil/dapsona (Lapdap) en combinación con AS representadapsona una nueva alternativa quimioterapéutica para África debido a su bajo costo

(US$0,50 por tratamiento) y corto T1/2. Para finales del 2003 se esperabacomenzar un estudio de fase II en Malawi para establecer el esquema dedosificación en pacientes con malaria no complicada por P. falciparum. 84-87

DHA + piperaquina Formulación fija (Artekin) y económica (US$1 por tratamiento) que hademostrado ser segura y eficaz frente a P. falciparum multirresistente.Sin embargo, los estudios de seguridad en grupos especiales son limitadosy se sabe muy poco sobre la farmacología de la combinación. 88-90

AS: artesunato; CQ: cloroquina; SP: sulfadoxina-pirimetamina; MQ: mefloquina; QN: quinina; DHA: dihidroartemisina

Debido a su ineficacia o al riesgo que representasu utilización en la selección de parásitosresistentes, la OMS no recomienda el uso dealgunas terapias combinadas (cuadro 2).

Terapia combinada antimalárica en Colombia

Aunque en Colombia la terapia combinadaantimalárica ha sido utilizada desde hace más de20 años, el país no es ajeno al problema de laresistencia y junto con el aumento progresivo enla incidencia de malaria, se ha informado también

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el aumento de la resistencia de P. falciparum alos antimaláricos. Seguramente si esta estrategiano se hubiera implementado en Colombia elproblema de la resistencia sería aún más seriode lo que ya es hoy.

Los primeros casos de P. falciparum resistentesa la cloroquina se informaron en Colombia en 1961(6) y en 1981 se introdujo su uso combinado consulfadoxina-pirimetamina. En los años 90, losestudios clínicos realizados en la Costa Pacíficay en el departamento de Antioquia (Urabá y BajoCauca) informaron niveles de falla terapéutica ala cloroquina entre el 40% y el 77% (47-51). Debidoa su ineficacia, el Misterio de Salud de Colombia,en el 2000, recomendó reemplazar la cloroquinapor la amodiaquina en combinación consulfadoxina-pirimetamina como primera línea detratamiento para la malaria no complicada por P.falciparum. Sin embargo, para ese entonces seconocía poco respecto a la eficacia de laamodiaquina y la sulfadoxina-pirimetamina y,actualmente, existen pocos estudios de la eficaciade esta combinación (González IJ, Murillo T.Evaluación de la eficacia terapéutica y de laseguridad de la combinación de amodiaquina consulfadoxina/pirimetamina en el tratamiento demalaria no complicada por Plasmodium falciparum

Cuadro 2. Terapias combinadas no recomendadas por la OMS.

Terapia combinada Motivo Referencia

Con CQ Actualmente, existe resistencia a la CQ en la mayoría de los países donde(CQ + SP o CQ + AS) la malaria es endémica. La situación es particularmente seria en África

donde la CQ continúa siendo la primera línea de tratamiento a pesar de queen el África subsahariana se hayan reportado altos porcentajes deresistencia a este medicamento. La resistencia a la SP está ampliamentedistribuida en todos los países del África subsahariana y se hademostrado disminución de su eficacia en Suramérica y en algunospaíses de África. Por tanto, el número de países en los que se presentaeficacia a ambos medicamentos es limitado. Cuando en una terapiacombinada se utilizan antimaláricos cuya eficacia está comprometida esde esperarse que su tiempo de vida útil sea corto. Con respecto aCQ + AS, diversos estudios in vitro e in vivo han demostrado que el usode la combinación no representa una ventaja frente a la monoterapiacon CQ. 3,46

Con MQ Debido al T1/2 prolongado de la MQ, cuando se utiliza en áreas de alta transmisiónen áreas de alta los parásitos de nuevas infecciones se ven expuestos a concentracionestransmisión subterapéuticas de MQ que ejercen presión de selección sobre parásitos(SP + MQ o AS + MQ) resistentes. Por este motivo, su uso en combinación está limitado a áreas

de transmisión baja y media. 3,10,29,

AS: artesunato; CQ: cloroquina; SP: sulfadoxina-pirimetamina; MQ: mefloquina

en el municipio de Tadó, Chocó, en la CostaPacífica colombiana. Informe final. OrganizaciónPanamericana de la Salud, 2002, y referencia 52).

En 1998, los estudios de eficacia de la amodia-quina realizados en Antioquia (donde estemedicamento se ha utilizado de maneracombinada y restringida desde la década de los90) demostraron niveles de fallas entre el 3% y el7% (48,49) mientras que los trabajos realizadospor el Cideim entre 1999 y 2002 reportaron lapresencia de 2/2 fallas en Leticia (Amazonas) yniveles de fallas en Tumaco (Nariño) del 50%(González IJ, Murillo T. Evaluación de la eficaciaterapéutica y de la seguridad de la combinaciónde amodiaquina con sulfadoxina/pirimetamina enel tratamiento de malaria no complicada porPlasmodium falciparum en el municipio de Tadó,Chocó, en la Costa Pacífica colombiana. Informefinal. Organización Panamericana de la Salud, 2002,y González IJ. Desarrollo de la capacidad dedetección de la resistencia in vivo a drogas anti-maláricas en Plasmodium falciparum de la CostaPacífica colombiana. Informe final de resultados aColciencias y el Ministerio de Salud, 2001).

Los niveles de falla a la amodiaquina mayoresdel 25%, nivel por encima del cual se recomienda

432


el cambio del medicamento (2,10), fueroninesperados en la Costa Pacífica debido al cortotiempo de introducción y a la restricción comercialque existe sobre este medicamento en el país.Sin embargo, los estudios de sensibilidad in vitrode aislamientos de campo de P. falciparum de laCosta Pacífica colombiana ya informaban nivelesde resistencia del 35,3% a este medicamento(Murillo C et al. Evaluación de la sensibilidad invitro de aislamientos de Plasmodium falciparumde la Costa Pacífica colombiana a cincoantimaláricos. Tercer encuentro nacional deinvestigaciones en enfermedades infecciosas.Popayán, 2002, y referencia 53). La presencia defallas a la amodiaquina en Colombia se podríaatribuir a la presión de selección por su uso previode manera inadecuada o por su resistenciacruzada con la cloroquina, ya que ambosmedicamentos pertenecen a la misma familia deantimaláricos (52). No obstante, la eficacia de laamodiaquina en zonas de moderada resistenciaa la cloroquina ha sido previamente demostrada(32,54).

La sulfadoxina-pirimetamina ha sido utilizada anivel mundial como segunda opción de tratamientopara la malaria después de la cloroquina y,actualmente, es la primera línea de tratamientopara la malaria no complicada por P. falciparumen algunos países de África. En Colombia, laresistencia a sulfadoxina-pirimetamina surgiórápidamente y poco después de su introducciónse demostró la presencia de fallas en la cuencaamazónica (55) y en otras regiones del país enniveles variables entre el 6% y el 13%(48,49,51,56). Dos estudios recientes realizadosen Tumaco y en Antioquia en los que se evaluó lasulfadoxina-pirimetamina como monoterapia,demostraron considerables niveles de falla a estemedicamento entre el 15% y el 26%, respectiva-mente (52,57). El aumento del número de fallascon respecto a estudios previos sugiere que suuso inadecuado como monoterapia ante laineficacia de la cloroquina, cuando ambosmedicamentos eran utilizados en combinación,probablemente permitió el surgimiento deresistencia a este medicamento. A pesar de losniveles moderados de resistencia a lasulfadoxina-pirimetamina, en la actualidad, su uso

sigue siendo recomendado en combinación conla amodiaquina (39).

En África, la combinación de amodiaquina mássulfadoxina-pirimetamina ha demostrado seraltamente eficaz frente a la monoterapia consulfadoxina-pirimetamina y frente a otras terapiascombinadas, tales como cloroquina mássulfadoxina-pirimetamina y sulfadoxina-pirimetamina más artesunato (32,58,59). Noobstante, en el 2002 un estudio de eficacia clínicade amodiaquina más sulfadoxina-pirimetaminarealizado en el municipio de Tadó, Costa Pacíficacolombiana, encontró niveles significativos de fallaterapéutica del 10,8%, a pesar de que estacombinación no había sido utilizada antes en laregión (González IJ, Murillo T. Evaluación de laeficacia terapéutica y de la seguridad de lacombinación de amodiaquina con sulfadoxina/pirimetamina en el tratamiento de malaria nocomplicada por Plasmodium falciparum en elmunicipio de Tadó, Chocó, en la Costa Pacificacolombiana. Informe final. OrganizaciónPanamericana de la Salud, 2002).

Los altos niveles de falla a tratamiento de laamodiaquina como monoterapia y la presencia defallas a la combinación amodiaquina mássulfadoxina-pirimetamina indican que la vida útilde esta combinación probablemente será cortabajo la dosificación actual (25 mg/kg deamodiaquina divididos en 3 días). Por lo tanto, esnecesario continuar vigilando la eficacia de lacombinación y de sus componentes en diferentesáreas del país, así como nuevas terapiascombinadas.

Consideraciones en la implementación de laterapia combinada

La terapia combinada, en teoría y según lodemostrado en Tailandia, es una estrategia útilpara la prevención de la resistencia, pero suutilidad en el campo depende de cómo se lleve acabo su implementación. Con el fin de conservarla eficacia de la terapia combinada y disminuir lapresión de selección sobre parásitos resistentes,su implementación se debe realizar siempredentro del marco de un sistema de farmaco-vigilancia (60). A través de la farmacovigilanciaes posible: 1) diseñar y ejecutar a nivel nacional y

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regional políticas de tratamiento acordes con lasituación particular de las zonas endémicas (61);2) velar por la disponibilidad y la calidad de losmedicamentos que le están siendo administradosa los pacientes, y 3) combatir la automedicación,la mala dosificación y la baja adherencia (1,3,7).Los factores contemplados en este último numeralson fundamentales para proteger la vida útil de laterapia combinada. Así, la adherencia del pacientea su tratamiento bajo los esquemas recomendadoses estrictamente necesaria (29,43). Tanto elincumplimiento del régimen prescrito como la maladosificación conducen a fallas terapéuticas debidoa las concentraciones subóptimas de losmedicamentos que, además, resultan propiciaspara seleccionar parásitos resistentes. A laadherencia contribuyen la eficacia y seguridad delos medicamentos que se están administrando paralo cual resulta indispensable la utilización deantimaláricos con la menor cantidad de efectosadversos posibles. El logro de tratamientos decorta duración y dosificaciones sencillas tambiéncontribuye de manera importante en la adherencia(29). Dentro de este contexto, idealmente, losmedicamentos deberían ser formulados en unatableta única que, además, presentara un aspectoagradable y un buen sabor. Sin embargo, debido alos altos costos a los que conlleva esta clasede formulaciones muchas veces estosmedicamentos no se encuentran disponiblespara los países donde la malaria es endémica(23,62).

Terapia combinada una inversión a largo plazo

El costo de los medicamentos antimaláricos esuno de los principales factores que determinansu uso y, por consiguiente, el uso de las terapiascombinadas (7,29). Sin embargo, el aumento enlos costos a corto plazo representa un ahorro haciael futuro. El uso de la monoterapia conduceinevitablemente al surgimiento de recrudescenciasy al aumento de los casos de malaria grave, locual incrementa los costos en términos dehospitalización y retratamientos con medica-mentos de segunda o tercera línea, como laquinima y la mefloquina que suelen ser máscostosos, sin contar, con el impacto en la saludpública del aumento en la morbilidad y mortalidad.Por ejemplo, en Colombia, el Ministerio de la

Protección Social encargado de proveer losmedicamentos de manera gratuita, pagaaproximadamente Col$740 por un tratamiento deprimera línea (amodiaquina más sulfadoxina-pirimetamina) para un episodio de malaria nocomplicada por P. falciparum en un paciente adulto.Si este paciente presenta falla en su tratamientorecibirá uno de segunda línea con quinina másclindamicina que le costará al Estado casi 10veces más (Col$7.000) que el tratamiento anterioro 7 veces más (Col$5.120) si le es administradala mefloquina como monoterapia. Así, eltratamiento de las recaídas es siempre máscostoso y, de ahí, la importancia de mantener laeficacia a través del uso combinado de los pocosantimaláricos económicos que existen en laactualidad. Por el contrario, mediante el uso deterapias combinadas eficaces se mejoran las tasasde curación y se reducen la morbilidad asociadacon fallas a tratamiento, la mortalidad y latransmisión, lo cual reduce, por consiguiente, loscostos asociados al control de la enfermedad(15,23).

Conclusión

Entre otros factores, puede afirmarse que el usoinadecuado de los antimaláricos ha contribuido ala ineficacia progresiva de la monoterapia demalaria. En el mejor de los casos, cuando unantimalárico falla, otro es introducido. No obstante,las alternativas quimioterapéuticas actuales sonreducidas y la evolución de la resistencia en P.falciparum sobrepasa el desarrollo de nuevosfármacos (7); la diseminación de la resistencia alos antimaláricos podría prevenirse especialmentemediante el uso de la terapia combinada. Sinembargo, debido a la existencia de barreraslogísticas y económicas, la implementación de laterapia combinada se ha visto limitada en lamayoría de los países donde la malaria esendémica. No obstante, deben realizarse losesfuerzos necesarios para la adopción de terapiascombinadas eficaces basadas preferiblemente enderivados de la artemisinina ya que, por elmomento, es la única herramienta que parececontribuir de manera significativa a reducir latransmisión de la malaria y a prevenir elsurgimiento y la dispersión de la resistencia a losantimaláricos.

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Agradecimientos

Esta revisión contó con el apoyo económico delPrograma Especial para la Investigación y elEntrenamiento en Enfermedades Tropicales delUNDP/World Bank /WHO (proyecto 981015). Lasautoras agradecen a Nancy Saravia, directoracientífica del CIDEIM, por su revisión crítica y aEnrique Pinzón del Ministerio de la ProtecciónSocial por la información suministrada. PamelaOrjuela es joven investigadora de Colciencias(contrato No. CT042-2001).

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Biomédica 2004;24:438-55CORTÁZAR T.M., WALKER J.

REVISIÓN DE TEMA

Manipulación genética y el estudiodel parásito protozoario Leishmania

Tania M. Cortázar, John Walker

Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas, CIDEIM, Cali, Colombia.

Durante los últimos 15 años se ha dado paso al entendimiento de muchos aspectos de lagenómica funcional de Leishmania gracias a los avances en la metodología de transfecciónde ADN dentro de la célula de este protozoario, la eliminación y la complementación de genespor medio de recombinación homóloga y las estrategias para la selección de célulastransfectadas. Estos acercamientos tienen el potencial de brindar información sobre laexpresión génica y la función de las proteínas en el contexto del parásito intacto. Dado que elgenoma de Leishmania muestra una carencia acentuada de los factores conocidos deiniciación de la transcripción y que la expresión génica está regulada casi completamente anivel postranscripcional (a través del empalme de los ARNm y los mecanismos que involucranel procesamiento diferencial de la región no traducida 3' del ARNm (3’UTR), la transfeccióngénica representa una herramienta útil para la identificación y el análisis funcional de losgenes de interés así como de los mecanismos que dirigen su regulación.El desarrollo de los sistemas de manipulación genética también ha abierto nuevos horizontespara la identificación de genes esenciales involucrados en la virulencia, la supervivenciaintracelular y la resistencia a drogas de Leishmania, así como para la validación de proteínasespecíficas del parásito como nuevos blancos quimio e inmunoterapéuticos. En esta revisiónpresentamos los avances más recientes en el campo de la manipulación genética enLeishmania, los cuales permiten análisis estructurales, funcionales y de fenotipo, por mediode la eliminación y complementación génica a través de la transfección transitoria o permanentede genes en este parásito.

Palabras clave: Leishmania, transfección de ADN, expresión génica, eliminación ycomplementación génica, genómica funcional.

Genetic manipulation and the study of the protozoan parasite Leishmania

During the last 15 years, many aspects of the functional genomics of Leishmania have beenrevealed due to advances in DNA transfection, gene disruption and complementation throughhomologous recombination, and efficient strategies for the selection of transfected cells. Thesestrategies have provided information about gene expression and protein function in the contextof the intact parasite. The genome of Leishmania shows a marked deficiency of knowntranscription initiation factors, and gene expression is regulated almost entirely at the post-transcriptional level through trans-splicing of mRNAs and novel control mechanisms involvingdifferential processing of 3' - untranslated regions (3'-UTRs) of mRNAs. Therefore, genetransfection represents a useful tool for the identification and functional analysis of genes ofinterest as well as the mechanisms that direct their regulation. The development of geneticmanipulation systems has provided opportunities for the study of genes involved in virulence,intracellular survival and drug resistance of Leishmania, as well as for the functional validationof specific parasite proteins as new chemo- and immunotherapeutic targets. The current reviewpresents recent advances in genetic manipulations that permit structural, functional andphenotypic analyses and by means of gene deletion and complementation using the methodsof gene transfection.

Key words: Leishmania, DNA transfection, gene expression, gene deletion andcomplementation, functional genomics.

Biomédica 2004;24:438-55

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Biomédica 2004;24:438-55 MANIPULACIÓN GENÉTICA EN LEISHMANIA

Leishmania es el parásito intracelular causantede la leishmaniosis, una de las enfermedades demayor impacto en salud pública, distribuidaalrededor del mundo con 15 millones de personasinfectadas y 350 millones más en riesgo (1). Estaenfermedad presenta un rango amplio de síntomasclínicos en el que se incluyen desde lesionescutáneas autocurables hasta lesiones mucosasy compromisos viscerales fatales, que dependende las interacciones entre la respuesta inmunedel hospedero y la especie de Leishmaniainvolucrada.

Leishmania infecta fagocitos mononucleares,componentes celulares claves del sistemainmune. La quimioterapia es el único medio parael control de leishmaniosis ya que no existe unavacuna efectiva. Sin embargo, la eficacia de lasdrogas en algunos casos es limitada debido alincremento de la falla clínica al tratamiento conlos agentes antimoniales (tratamiento estándarpara la leishmaniosis), y a la toxicidad de losmedicamentos de segunda línea (2-4). Lamiltefosina se presenta como una futura alternativapromisoria para el tratamiento de la leishmaniosisvisceral, y es el único tratamiento oral hasta con98% de efectividad en el control de estaenfermedad (3,4). Por ello se hace necesaria labúsqueda de nuevas estrategias que permitan unmayor conocimiento de la interacción del parásitocon la célula hospedera. Los avances en lastécnicas de manipulación genética junto con elproyecto genoma [www.ebi.ac.uk/parasites/leish.html] y el desarrollo de la genómica funcionalrepresentan herramientas útiles para enlazar elgenotipo y el fenotipo de Leishmania, lo cualpermite avances en la identificación y valoraciónde nuevos blancos quimio e inmunoterapéuticos.

El uso de la tecnología de transfección de ADNen Leishmania comenzó con la expresióntransitoria de genes luego de la electroporación

de parásitos con vectores circulares (5), y se hadesarrollado hasta incluir un espectro amplio demétodos para el análisis funcional de genes quehan permitido estudiar la expresión y la regulacióngénica del parásito (6-27), la identificación degenes esenciales para supervivencia (28-49), lainvestigación de los mecanismos de resistenciaa drogas y de virulencia (50-92), la producción deproteínas foráneas (91-107), la identificación y laexpresión de antígenos de superficie (108). En lapresente revisión se divulgan los avances yaplicaciones más recientes y notorias en el campode la manipulación genética en Leishmania.

Transfección

La introducción de fragmentos de ADN dentro deuna célula eucariota que inducen un cambio en laexpresión génica se denomina transfección. Latransfección de genes se logra luego de someterlas células a procedimientos mediante los cualeslas membranas celulares son permeabilizadastemporalmente y permiten la toma de ADN. Haydos tipos básicos de técnicas de transfección:los métodos químicos, basados en la formaciónde complejos de ADN con compuestos comofosfato de calcio, o N,N-dietilaminoetildextrano, loscuales son incorporados por las células mediantela ruta endocítica, o por afinidad con lasmembranas celulares (lipofección); y los métodosfísicos, basados en la introducción mecánica delas moléculas al interior de la célula (micro-inyección, electroporación, biolistic particledelivery) (109). La eficiencia de una transfecciónpuede variar entre y dentro de especies deprotozoarios, y las condiciones técnicas óptimasdeben ser determinadas para cada cepa y estadio.Entre los parámetros variables para lastransfecciones de Leishmania por medio deelectroporación, por ejemplo, se incluyen el voltajey el tiempo del pulso utilizado, la fuerza iónica deltampón, la densidad celular, la cantidad de ADNy las condiciones de selección de las célulastransfectadas (103-107,110).

Transfección transitoria y el estudio de laregulación de la expresión génica enLeishmania

El uso de la transfección transitoria de Leishmaniase ha dirigido principalmente al análisis rápido de

Correspondencia:John Walker, Centro Internacional de Entrenamiento eInvestigaciones Médicas, CIDEIM, Avenida 1 Norte No. 3-03, AA 5390, Cali, Colombia.Teléfono: (572) 668 2164; fax: (572) 667 [email protected]


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Figura 1. Diferencias entre la biogénesis del mARN en Leishmania y otros eucariotes (adaptada de 8). a. Durante labiogénesis del ARN en la mayoría de los organismos eucariotes se requiere de cis-empalme para remover las secuenciasno codificadoras (intrones) de los transcritos primarios. b. Los tripanosomátidos generan transcritos monocistrónicos apartir del trans-empalme de las unidades de transcripción policistrónicas. En los tripanosomátidos, la estructura cap esdonada por ME.I: intrón; cap: residuo de 7-metilguanosina; poli A: sitio para la poliadenilación en el extremo 3’ del transcrito; RI: regiónintergénica; ME: miniexón

la transcripción y la regulación postranscripcional,debido a que Leishmania (y otros miembros de lafamilia Trypanosomatidae) posee un genoma concaracterísticas poco ortodoxas en su organizacióny expresión, en comparación con la mayoría delos eucariotes (6-23). En Leishmania yTrypanosoma muchos genes se encuentranagrupados en unidades de transcripciónpolicistrónicas que hacen que cada transcritoprimario sea un ARNm precursor policistrónico(8) (figura 1). Los ARNm individuales sonescindidos del precursor por medio de unareacción de trans-empalme, durante la cual unasecuencia líder de 39 nucleótidos (miniexón, ME)se une a cada uno de los transcritos en el extremo5’-, donándoles la estructura cap (residuo 7-metilguanosina) al mismo tiempo que el extremo3’- de cada mARN es poliadenilado y generan asílos ARNm maduros (9,111). Las unidadespolicistrónicas pueden contener múltiples copias

de un gen en tandem, así como también genesrelacionados o no relacionados entre sí (8).

Durante los experimentos de transfección se haobservado que los requisitos para la expresióngénica en Leishmania no son rigurosos. En lamayoría de los eucariotes, los genes que codificanpara proteínas son transcritos por la ARNpolimerasa II (Pol II) (112,113). Sin embargo, enLeishmania no se ha identificado ningún promotorespecífico para Pol II y la transcripción de genesa partir de vectores tampoco requiere de estepromotor (104-107). Los genes tripanosomátidoscarecen de intrones, pero existe una dependenciaimportante de la presencia de las regionesintergénicas para la expresión de genes, lo cualindica que éstas contienen las señales necesariaspara la transcripción y la maduración del ARNm(6-23). Por ello, para la expresión transitoria degenes en Leishmania se usan vectores deexpresión circulares que contengan la secuencia

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de un gen reportero flanqueado por regionesintergénicas del parásito (figura 2a). En losestudios de transfección de células de Leishmaniareportados hasta la fecha, el producto génico semuestra activo y, en ocasiones, sólo un fragmentode la región intergénica es necesario para laexpresión del gen (cuadro 1).

El genoma de Leishmania contiene secuenciasde iniciación de la transcripción divergentes delas conocidas en otros eucariotes, y éstas hansido explotadas como herramientas en el diseñode vectores de transfección. Por ejemplo, unaexpresión más eficiente se logra al incluir en elvector secuencias promotoras para la Pol I, comoel promotor del ARN ribosómico (ARNr) o el deME (24-27) (figura 2a). El promotor de ARNr de lasubunidad 18S de L. chagasi ha dirigido la sobre-expresión de proteínas funcionales con distintosgrados de actividad entre las especies L. donovani,

L. major, L. mexicana y L. enriettii, y carece deactividad en T. cruzi, sustentando una actividadespecie-específica (27).

Se ha reportado la expresión de genes de especieshomólogas a partir de vectores de expresión. Porejemplo, la fosfatasa ácida de secreción (SAP) yla glicoproteína de membrana Gp46/M2 de L.mexicana han sido expresadas por células de L.major (108). Además, se ha observado queLeishmania puede expresar genes flanqueadoscon secuencias intergénicas de T. cruzi, y se hanconstruido vectores que pueden expresarproductos génicos en ambos parásitos. Sinembargo, no se han obtenido productos de latranscripción de estos vectores en otrostripanosomátidos como Trypanosoma bruceibrucei y Crithidia fasiculata (104,105), sugiriendola posible transición evolutiva desde una iniciaciónespecífica de la transcripción en tripanosomátidos

Figura 2. Vectores de expresión usados en la transfección de Leishmania. a. Vector de expresión con gen reportero ysecuencias 5’- y 3’-UTR de Leishmania para transfecciones transitorias. La 3’-UTR de los genes de Leishmania posee lassecuencias reguladoras de la expresión génica. b. Vector con marcador de selección para transfecciones permanentes. c.Plásmido lineal con promotor, útil en la transfección permanente por integración al genoma durante la recombinaciónhomóloga en ensayos de deleción y complementación. La presencia del promotor en a. y b. es opcional.

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Cuadro 1. Genes transfectados en Leishmania.

Gen transfectado Secuencias intergénicas Especie transfectada Referencias

hsv-tk A2 L. donovani 96hsv-tk A2 L. major 97cat α-tubulina L. brasiliensis 5

L. enriettiiL. major

cat α-tubulina L. enriettii 6neor dhr-ts L. major 29,107neor α-tubulina L. enriettii 103neor ptr1 L. major 106 neor gapdh de T. cruzi L. mexicana 102L. donovanihygr ptr1 L. major 106pacr ptr1 L. major 106phleor ptr1 L. major 106N-acetil glucosaminil transferasa ptr1 L. major 106A2 antisentido A2 L. donovani 843’nt/un A2 L. donovani 96gp46/M2 de L. amazonensis dhr-ts L. major 108tryA de T. cruzi - L. donovani 33luc gp63 L. chagasi 85luc α-tubulina L. donovani 100

L. majorluc promotor de rARN 18S L. chagasi 27

L. donovaniL. majorL. mexicana

luc α-tubulina L. infantum 99mos1 dhfr-ts L. major 98transposasa de MLE dhfr-ts L. major 98IFN-γ murino α-tubulina L. major 93P53 humana α-tubulina L. donovani 94

hsv-tk: timidina cinasa del virus herpes simples; cat: cloranfenicol acetil transferasa bacteriana; neor: neomicín transferasa;hygr: gen de resistencia a higromicina B; pacr: gen de resistencia a puromicina; phleor: gen de resistencia a fleomicina;3’nt/nu: 3’nucleotidasa/nucleasa; gp46/M2: glicoproteína de membrana; tryA: trypanotión reductasa; luc: luciferasa deluciérnaga; mos1: mariner, elemento transponible de Drosophila; MLE: elementos tipo mariner; IFN-γ: interferon gamma;A2: gen amastigote-específico; dhfr-ts: dihidrofolato reductasa timidilato sintasa; ptr1: pteridin reductasa; gapdh:gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

africanos, hacia una iniciación inespecífica comoen Leishmania (114). En apoyo a la idea anteriorse encuentra el hecho de que durante los ensayosde transfección es indispensable la presencia deun promotor de Pol I para la transcripción en T.brucei pero no en Leishmania (105).

Los procesos de trans-empalme y poliadenilaciónestán mecánicamente acoplados y poseenseñales reguladoras comunes ricas enpolipirimidinas dentro de las regiones intergénicas.La región intergénica 5’ (5’-RI) posee un sitio AGque actúa como aceptor del SL y se ha observadoexpresión génica al reemplazar la 5’-RI por un

tracto sintético de pirimidinas con uno o dos sitiosAG (6). Además, a pesar de la ausencia de lasseñales consenso específicas que aseguren lapoliadenilación del ARNm en Leishmania, elextremo 3’ de cada ARNm está poliadenilado auna distancia fija (100-400 nucleótidos) corrientearriba de las señales para el trans-empalme delME del siguiente gen (9).

Durante su ciclo de vida, Leishmania se mueveentre el tracto alimenticio de un insecto y losfagolisosomas ácidos de los macrófagos demamíferos (2). La habilidad de sobrevivir enambientes diferentes depende de la regulación de

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una variedad de genes. La regulación de los nivelesde ARNm durante el desarrollo en Leishmania estádeterminada de manera postranscripcional ydepende del procesamiento diferencial del ARNmen las 3’-UTR (6-23). Se han encontradosecuencias que regulan la expresión génica enlos diferentes estadios. Un elemento de 450nucleótidos altamente conservado en la 3’UTR de

varios ARNm expresados diferencialmente en elestadio intracelular del parásito (amastigote),promueve la traducción específica de éstos alhacer más fuerte su unión a los polisomas;además, el pH ácido es una señal importante paraeste control (9). Los ensayos con genes reporterosy los estudios de hibridación muestran unacorrelación alta entre la presencia de este elemento

Cuadro 2. Genes eliminados en Leishmania.

Categoría Gen eliminado Especie Referencia

Organización celular/biogénesis α-tubulina L. enriettii| 43pfr1 y pfr2 L. mexicana 45sherp/hasp L. major 64lmxmkk L. mexicana 39

Metabolismo lmxmbap L. mexicana 34dpms L. mexicana 81spt2 L. major 35odc L. donovani 47spdsyn L. donovani 46adometdc L. donovani 38dhfr-ts L. major 29,57ptr1 L. major 65

Transducción de señal lmpk L. mexicana 86lmxmkk L. mexicana 39crk3 L. mexicana 30

Transporte pgpA L. tarentolae 51bt1 L. donovani 40ldnt2 L. donovani 49

Destino de proteínas hsp100 L. major 91nmt L. major 28gim1 L. donovani 36sigma1-adaptina L. mexicana 87mu 1-adaptina L. mexicana 87

Factor de virulencia lmcpb L. mexicana 71,74,82gp63 L. amazonensis 75

L. major

A2 L. donovani 84gdpmp L. mexicana 79pmi L. mexicana 78lpg1 y lpg2 L. major 76,88

L. donovanipmm L. mexicana 81sigma1-adaptina L. mexicana 87mu 1-adaptina L. mexicana 87

pfr1 y pfr2: proteínas 1 y 2 de la vaina paraflagelar; sherp/hasp: proteína hidrofílica en membrana del retículo endoplásmicoy mitocondria/proteína de superficie hidrofílica acilada; lmxmbap: fosfatasa ácida de membrana; dpms: dolicolfosfatomanosa sintasa; spt2: subunidad 2 de la serina palmitoil-transferasa; odc: ornitina decarboxilasa; spdsyn: espermidinasintasa; adometdc: S-adenosil metionina decarboxilasa; dhr-ts: dihidrofolato reductasa timidilato sintasa; ptr1: pteridinareductasa 1; lmpk: protein cinasa activada por mitógeno; lmxmkk: protein cinasa activada por mitógeno; crk3: serinatreonina proteín cinasa relacionada con cdc2; pgpA: proteína de la familia de los transportadores ABC; bt1: transportadorde biopterina 1; ldnt2: transportador de nucleósidos 2; hsp100: proteína de choque térmico; nmt: N-miristoil transferasa;gim1: proteína de membrana glicosómica; gp63: metaloproteína de superficie; lmcpb: cisteín proteinasa b; lpg1:glicosiltransferasa; lpg2: transportador de GDP-manosa; pmm: fosfomanomutasa; gdpmp: GDP-manosa pirofosforilasa;pmi: fosfomanosa isomerasa

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corriente abajo del gen reportero y la regulaciónde la traducción diferencial del ARNm reportero.Aunque el mecanismo molecular por el cual dichoelemento regula la expresión amastigote-específicano está dilucidado, un análisis estructural revelóque éste se pliega en una estructura bipartita enforma de Y que podría facilitar la unión a un factorregulador común de la expresión amastigote-específica (9). Igualmente, el análisis deeliminación y el bloqueo llevaron a la identificacióndel elemento negativo de 10 nucleótidos en laregión 3’-UTR del ARNm de PFR2 (proteína 2 dela vaina paraflagelar) de L. mexicana quedesestabiliza el ARNm en amastigotes (20). Laregulación de los genes metacíclico-específicoscpb1 y cpb2 (cisteína proteinasas lisosómicas 1y 2) está dada por una secuencia de 120nucleótidos presente únicamente en la 3’-UTR deestos dos genes, mientras que los 17 isogenesrestantes se expresan predominantemente enamastigotes (16,23).

La metodología de transfección representa unaherramienta útil para la identificación y análisisfuncional de genes estadio-específicos oconstitutivos, y para el estudio de los mecanismosque dirigen su regulación. Esto contribuye alconocimiento de los mecanismos de super-vivencia intracelular del parásito y al futurodescubrimiento de otros elementos reguladorespositivos y negativos dentro de las regionesintergénicas y a la dilucidación de lasinteracciones entre ellos, así como a la búsquedade genes que puedan representar blancosterapéuticos.

Transfección estable en Leishmania

La creación de líneas celulares transfectadas demanera estable es la ruta preferida para la mayoríade los estudios cuantitativos y funcionales. En1990 se reportaron los primeros sistemas detransfección permanente en Leishmania. LosARNm transcritos a partir del ADN plasmídicocontenían el ME unido al gen a expresar en laposición correcta del sitio aceptor del empalme;además, estaban poliadenilados (28,103). Latransfección permanente se logra con laintroducción de episomas o por integración deADN al genoma.

Transfección estable con episomas. Losepisomas son vectores circulares de ADNautorreplicativos, que contienen un gen deresistencia a la droga (marcador de selección)además de las secuencias intergénicas y el gende interés o reportero (figura 2b). Las célulastransfectadas son seleccionadas basándose enla resistencia conferida por el marcador deselección, lo cual resulta en el aumento del númerode copias del vector y el nivel de la expresión delgen reportero. Entre los marcadores de selecciónmás usados se encuentran los genes neor, hygr ynagt, que codifican para las fosfotransferasas queconfieren resistencia a los aminoglicósidosgeneticina (G418), higromicina B y a latunicamicina, respectivamente. También losmarcadores sat, que codifica estreptomicinaacetiltransferasa, y pacr y phleor que confiereresistencia al antibiótico glicopéptido puromicinay fleomicina, respectivamente, han sido usadosen transfecciones de promastigotes de diferentesespecies de Leishmania (103-107).

Transfección permanente por integración algenoma. Para realizar una transfecciónpermanente por integración de ADN al genoma,el vector de expresión es linearizado con enzimasde restricción dentro de secuencias idénticas alas del sitio propuesto para la integración en elgenoma (28). El vector es integrado en una regiónmuda del genoma como los espaciadores delARNr y del ME, o en el sitio correspondiente algen a eliminar o complementar (figura 2c; véasesección eliminación de genes).

Dado que Leishmania es un organismo diploide,usualmente se requieren dos o más marcadoresdurante las transfecciones permanentes paraexpresar combinación de genes heterólogos ocomprobar la eliminación de dos genes o dosalelos simultáneamente. Durante la integración devectores en el genoma se deben tener en cuentafactores que influyen en la frecuencia derecombinación homóloga entre el vectorintroducido y las secuencias de ADN cromo-sómico, como son: la cantidad y naturaleza desecuencias homólogas, el locus genético, elnúmero de copias del blanco y el diseño del vector.

La divergencia entre las secuencias del ADNdonador y el blanco reduce la eficiencia de la

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integración de genes en Leishmania. La longitudde la homología entre el vector y las secuenciasblanco influye en la frecuencia de recombinacióncuando ésta es menor de 1 kb. El tamaño mínimopara una recombinación homóloga eficiente enLeishmania ha sido establecido entre 150-200 pb(110).

La transfección estable ha facilitado lacuantificación de células de Leishmania y hapermitido realizar ensayos para el desarrollo de laterapia con drogas. El gen bacteriano lacZ (β-galactosidasa) ha permitido la detección deparásitos en tejidos de ratón hasta 4 semanasdespués de la infección por medio de una reaccióncolorimétrica visualizada bajo el microscopio deluz (101). Por otro lado, existe una correlación linealentre el número de parásitos recombinantes queexpresan el gen reportero luc (luciferasa de laluciérnaga Photynus pyralis) y la actividadluciferasa; por ello, la transfección con luc resultamuy útil para vigilar la progresión de infeccionesdentro de macrófagos y tejidos hospederos, y lacuantificación rápida y sensible en pruebas decitotoxicidad de drogas por medio de luminometría(99,100).

Igualmente, el nivel de fluorescencia enpromastigotes transfectados con gfp (proteínaverde fluorescente de la medusa Aequoreavictoria) corresponde al número de célulasinoculadas (101-102). GFP se detecta en animalesvivos de una manera no invasiva y se puedevisualizar directamente bajo el microscopio defluorescencia; por ello se ha usado para el análisisen tiempo real de agentes antileishmaniásicos conpromastigotes vivos (101). GFP también se hausado como proteína de fusión (tag) en estudiosde localización de proteínas transportadoras enLeishmania y en estudios de interferencia deexpresión con ARN en este parásito (48,115).

La transfección estable en Leishmania hapermitido estudiar algunos aspectos de lainteracción del parásito con el sistema inmune.Los parásitos que expresan ovoalbúmina y β-galactosidasa fueron capaces de dirigir estasproteínas reporteras hacia el fagolisosoma, dondefueron procesadas para el reconocimiento porcélulas CD4+, lo cual sugiere que el estudio de

las vías procesadoras del complejo mayor dehistocompatibilidad clase II usando parásitos deLeishmania modificados podría ser unaaproximación valiosa para estudiar aspectos dela interacción parásito-hospedero (105).

Expresión de proteínas foráneas conmodificaciones postranscripcionales. Leishmaniapodría representar una célula útil en el desarrollode sistemas de expresión de proteínas foráneasbiológicamente activas (93-95). Las células deLeishmania fueron capaces de expresar lafosfoproteína humana P53 activa (94) y, por mediode inmunoprecipitación y autorradiografía, secomprobó que el parásito logró llevar a cabo lafosforilación de esta proteína. La P53 sintetizadaen Leishmania reconoció la secuencia de su ADNblanco y se comportó muy similarmente a la P53derivada de células humanas con respecto a launión con el anticuerpo MbPab 421, lo cual indicaque la P53 recombinante producida por lamaquinaria de expresión de Leishmania retuvo suhabilidad de plegamiento y produjo unaconformación nativa.

En otro estudio (93), se produjeron parásitos deL. major que expresan y secretan interferón γactivo de ratones (IFNγ) (véase el siguientesubtítulo). Dado que Leishmania es rica englicoproteínas (72,76-81,83,88,90) también poseeel potencial de glicosilar proteínas foráneas.Leishmania combina características atractivascomo sistema de expresión de proteínas tanto deorigen procariote como de origen eucariote, por lasimplicidad del sistema que incluye losrequerimientos de cultivo, la construcción deplásmidos, la facilidad de transfección y laselección de células, y al potencial de realizarmodificaciones postranscripcionales necesariasen el caso de algunas proteínas de origeneucariote.

Expresión de genes suicidas y creación de cepasatenuadas. La 3'-UTR del gen que codifica laproteína amastigote-específica A2 de L. donovaniha permitido obtener la expresión preferencial degenes en el estadio amastigote. Este elementoregulador ha sido útil en la generación de cepasde Leishmania recombinantes atenuadas. Laatenuación se regula al ocurrir la diferenciación

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de promastigote a amastigote. Este sistemapromovió la expresión de la timidina cinasa delvirus Herpes simplex (HSV-TK), e indujosensibilidad a la droga anti-herpes ganciclovir enamastigotes y afectó dramáticamente elcrecimiento durante la infección in vitro (96). Enotro estudio, ratones BALB/c, infectados con L.major transfectados con hsv-tk se trataron conganciclovir. La inhibición completa de la replicaciónde los parásitos intracelulares ocurrió a los 4 díasdespués de la infección, y se obtuvieron nivelesde protección, desde parcial a total, contra un retocon L. major virulento, según la dosis deganciclovir (97). Además, se han efectuadotransfecciones en Leishmania con versionesdeletéreas de genes que codifican enzimasimpor tantes para el metabolismo y lasupervivencia intracelular del parásito, como unaversión truncada de la 3’ nucleotidasa/nucleasacarente de secuencia señal lo que conllevó a unaacumulación de la enzima en el citoplasma dondees tóxica (96).

En otro estudio se efectuó la expresión heterólogade una versión mutada del gen tryA, que codificatripanotión reductasa de T. cruzi en L. donovani.La pérdida de actividad catalítica fue provocadapor un cambio efectuado por mutagénesis dirigidaen el sitio activo (33). Luego de la activación delos macrófagos con IFNγ y lipopolisacárido (LPS)se observó una disminución significativa en la tasade infección de los parásitos mutantes, encomparación con aquélla de los silvestres dadala participación de tryA en la protección de lascélulas contra radicales libres (33). Se inocularonratones deficientes en células T con L. majortransfectadas que expresan y secretan IFNγ activode ratones, el cual indujo actividad óxido nítricosintasa en una línea celular de macrófagos (93).En este caso, los episomas se mostraron establesluego del pase de los parásitos por los ratones enausencia de presión con droga, y se redujo laprogresión de la enfermedad. Puede estudiarse elpapel de otras citocinas usando estaaproximación.

La acumulación de productos génicos tóxicosdebida a la expresión inducida de genes deletéreoso de genes que promueven la actividadparasiticida de las células hospederas como

antígenos protectores o citocinas inmuno-estimuladoras, y la pérdida de actividad debida ala expresión de versiones de genes mutados quellevan a la producción de parásitos atenuados,representan herramientas útiles para el desarrollopotencial de vacunas atenuada efectivas.

Eliminación de genes en Leishmania

El número de genes de Leishmania sometido aanálisis, donde el gen es manipulado o eliminadopara probar su papel en el ciclo infectivo, crecerápidamente (cuadro 2). Para efectuar laeliminación de un gen completo, los segmentos3' y 5'-UTR del gen blanco se integran al vector aambos lados del marcador de selección. El vectores escindido en las uniones de estas secuenciasy la integración del marcador ocurre simultánea-mente con la eliminación del gen blanco por mediode reemplazo durante la recombinación homóloga.Un knockout de ambas copias del gen blancorequiere de dos rondas de eliminación, condiferentes marcadores de selección. La ausenciadel gen se comprueba por técnicas de hibridación.La reexpresión del producto del gen porcomplemento de los genes eliminados restaurasu actividad. La eliminación de genes enLeishmania ha permitido la caracterización devarias moléculas involucradas en el metabolismocelular y el transporte, así como de proteínastransductoras de señal, chaperonas y enzimasinvolucradas en la virulencia y resistencia a drogas(cuadro 2). También se han evaluado los efectosde la eliminación de dominios esenciales para laactividad enzimática (31,32).

Identificación de genes de virulencia. Muchos delos experimentos de eliminación de genes hanllevado a la identificación de genes de virulenciaimportantes para la supervivencia o la patogénesisdel parásito dentro del insecto vector o delhospedero mamífero, mas no para su crecimientoen los medios rutinarios de cultivo (73). Porejemplo, el gen A2 fue esencial para lasupervivencia de L. donovani en el macrófago, asícomo lo fueron la fosfomanomutasa (PMM) paraL. mexicana y la proteína de choque térmicoHSP100 para L. major (81,84,91).

En la categoría de virulentos entran genes queestán involucrados en la virulencia pero no la

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explican totalmente, cuya eliminación muestrapérdida cuantitativa pero no completa de virulenciay se puede retener la capacidad de producirlesiones aunque a una tasa más lenta que la delos parásitos de tipo silvestre (71,74). Por ejemplo,la eliminación del arreglo de genes de cisteínaproteinasa (LmCPb) en L. mexicana redujo lasupervivencia intracelular en 80% (71). Estosmutantes fueron tan eficientes en invadirmacrófagos como los de tipo silvestre perosobrevivieron en menor proporción; además,produjeron lesiones subcutáneas en ratones atasas más lentas.

En otro estudio observaron que las lesionesinducidas por parásitos mutantes lmcpb- se curanacompañadas de respuesta inmune Th1 adiferencia de las inducidas por parásitos de tiposilvestre lo que sugiere que las cisteínaproteinasas de L. mexicana suprimen la respuestainmune antileishmania (82). Además, cuando L.major fue transfectada con un cósmido queexpresa múltiples genes de CPB de L. mexicana,estos parásitos indujeron una respuesta IFNγsignificativamente inferior comparada con L. majorsilvestre. Estos datos indican que la inhibición deCPB podría probarse como estrategia inmuno-rreguladora para formas crónicas de leishmaniosis.

Durante los ensayos también ha habido sorpresas.Por ejemplo, la eliminación de GP63, la proteínade superficie más abundante en el promastigote,produjo un efecto pequeño en el fenotipo de L.major in vitro (afectó el depósito del complemento)pero no tuvo efecto en las infecciones al insecto,al macrófago o al ratón (75).

Igualmente, la eliminación de los genes quecodifican para las proteínas SHERP/HASP(proteína hidrofílica en membrana del retículoendoplásmico y mitocondria/proteína de superficiehidrofílica acilada) abundantes en estadiometacíclico infectivo (64), y la ausencia deproteínas que intervienen en la síntesis dediferentes glicoconjugados implicados en lavirulencia tuvieron un efecto pequeño en la pérdidade virulencia (76,77,80,81,90).

Uno de los hallazgos más importantes es que losgenes putativos de virulencia no son igualmente

activos en todas las especies de Leishmania. EnL. major, la eliminación de lpg1 (gen que codificapara galactofuranosil transferasa) produjopromastigotes específicamente deficientes en lasíntesis del mayor componente del glicocálixdenso de la superficie de los promastigotes deLeishmania, lipofosfoglicano (LPG) (77). Losmutantes de L. major fueron incapaces desobrevivir en el insecto o de establecer de maneraeficiente infecciones en macrófagos o ratón,mientras que la eliminación de lpg1 en L.mexicana no produjo ningún cambio de fenotipoen las infecciones a ratón o macrófago (76). Estoshallazgos muestran que las diferentes especiesde Leishmania hacen uso de su repertorio degenes y moléculas potenciales de virulencia adiferentes grados en su interacción con elhospedero.

Identificación de genes esenciales. Los estudiostambién han llevado a la identificación de genesesenciales cuya pérdida no es tolerable por elorganismo y, por ello, son blancos potencialespara el desarrollo de agentes anti-Leishmania (28-49). Por ejemplo, la eliminación de N-miristoil-transferasa (NMT) en L. major produjo parásitosno viables (28). Esta enzima cataliza lamodificación cotraduccional de proteínas por N-miristoilación, proceso importante para laorientación subcelular y las interacciones proteína-proteína. NMT es expresada constitutivamente entodos los estadios del parásito y podría ser blancoapropiado para el desarrollo de agentes anti-Leishmania.

La eliminación de genes esenciales puede producirorganismos auxótrofos que requieran factoresespecíficos de crecimiento. Por ejemplo, laeliminación de los genes de enzimas clave en lasíntesis de poliaminas, como la espermidinasintasa (SPDSYN) y la ornitina decarboxilasa(ODC), producen promastigotes auxótrofos parapoliaminas (37,46), los cuales deben importarespermidina exógena para sobrevivir. Además, elnivel de tripanotión, tiol único en tripanosomátidosque contiene espermidina y que, además, es elcomponente principal de la defensa antioxidante,también se reduce. Así, estas enzimas esencialesson blancos prometedores para la validaciónterapéutica.

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Creación de vacunas. Los defectos causados enparásitos de Leishmania atenuados por irradiaciónu obtenidos de cultivos por medio de pasesseriados probablemente son múltiples y aún noestán definidos; además, pueden revertir haciavirulencia o persistir por largos períodos. Laeliminación de genes hace posible la creación demutantes no reversibles, los cuales en algunos casospueden inducir protección contra Leishmania y enotros, controlar el desarrollo de la lesión durantemeses, o inducir altos niveles de inmunidad enratones vacunados con parásitos mutantes yretados luego con parásitos virulentos (29,42,74).

Ya que la secuencia del gen blanco es eliminada,el uso de estos mutantes vivos como vacuna esmás seguro. Por ejemplo, macrófagos peritonealesinfectados con promastigotes lmpk- de L.mexicana (carentes de LMPK, homóloga de laproteín cinasa activada por mitógeno) soncapaces de controlar la infección y erradicar losparásitos; además, los ratones BALB/c infectadoscon estos mutantes no mostraron desarrollo delesiones (86). Los promastigotes lmpk- son unavacuna viva potencial ya que infectan macrófagos,y se transforman a amastigotes promoviendo unarespuesta inmune sin causar enfermedad.

Transposones como inactivadores de laexpresión génica en Leishmania

La mutagénesis por medio de transposones serealiza por la introducción de elementostransponibles por inserción inactivando genescodificantes de enzimas esenciales. La maquinariaenzimática para el movimiento está dada por latransposasa. La reacción de transposición ocurremediante una escisión escalonada en la doblehélice en cada extremo del elemento que lo liberade la molécula donadora, seguida de la ligacióndel transposón dentro de un corte en el sitio blanco.

Gueiros-Filho y Beverley (98) realizaron lainactivación del gen que codifica para ladihidrofolatorreductasa timidilato sintasa (DHFR-TS). Esta enzima posee un papel crucial en elmetabolismo de los folatos y, además, catalizareacciones consecutivas en la síntesis de novode timidina monofosfato (dTMP). La inactivaciónse llevó a cabo por la inserción del elementotransponible mariner de Drosophila (Mos1), al

transfectar células de L. major con dos tipos deplásmidos; uno contenía Mos1, y el otro la regióncodificadora para la transposasa de los elementosmariner-like (MLE). Las pruebas de hibridizacióny análisis de secuencia mostraron que 23% delas células tenía a Mos1 integrado en el genomaal lado del dinucleótido TA en la posición 532dentro de la región codificadora de dhfr-ts ycarecían completamente de la actividad de DHFR-TS (98).

Silenciamiento de genes por ARN deinterferencia y por ARN antisentido

ARN de interferencia

El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismopostranscripcional de silenciamiento de genes enorganismos eucariotes a través del cual ARN gen-específico de doble cadena promueve ladegradación de transcritos celulares homólogos(116 ). El ARNi es considerado un mecanismo dedefensa contra transcritos aberrantes comoaquéllos producidos durante infecciones virales ymovilización de transposones. Al entrar en lacélula, el ARN de doble cadena es procesado poruna nucleasa para producir ARN pequeños de 21-25 nt que actúan como secuencias guía para ladegradación del ARN blanco y que se handenominado ARN de interferencia pequeños.

Hasta la fecha la interferencia por ARN (ARNi) hasido útil para la inhibición de la expresión génicaen especies de tripanosomas, pero no haproducido inhibición exitosa en Leishmania (115).Se ha reportado la activación del ARNi debida ala expresión regulada o a la transfección de ARNde doble cadena de actina (116 ) y de la 5’-UTRde α-tubulina (117) en T. brucei.

Ngo y colegas descubrieron que la expresión invivo de la 5’-UTR del ARNm de la α-tubulina llevaa la producción de células multinucleadas conalteraciones morfológicas y con bloqueoespecífico de la citocinesis. La transfección de la5’-UTR sintética de doble cadena causó el mismofenotipo. El ARNm fue degradado rápida yespecíficamente conllevando a un déficit en lasíntesis de tubulina (117).

También se ha reportado el descubrimiento demoléculas abundantes de ARN de interferencia

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de pequeños derivados de transcritos deretroposones en este organismo (116). El hechode que los ensayos de silenciamiento de genescon ARNi en Leishmania no hayan tenido éxitopodría sugerir que Leishmania es por naturalezadeficiente de actividad ARNi endógena.

ARN antisentido. En la naturaleza, el ARNantisentido promueve la formación de moléculashíbridas de ARN de doble cadena que puedenafectar la estabilidad o el procesamiento de lostranscritos (empalme, exportación nuclear y unióna ribosomas), interfiriendo con la expresión deproductos génicos específicos; por ello, el ARNantisentido transcrito a partir de plásmidos ha sidousado para regular la expresión de genesendógenos (112). En las pruebas de hibridizaciónno se observan trazas del transcrito antisentido,pero sí una disminución acentuada del transcritoendógeno. Se ha realizado la inhibición de laexpresión del ARNm de los genes A2 (84) y gp63(85) usando la expresión episómica de ARNantisentido que demuestra que estos genesrepresentan factores de virulencia. Sin embargo,en el caso de A2, un porcentaje de amastigotesdeficientes en ARNm de A2 sobrevivieron en ratóny restauraron la expresión de la proteína A2. Lacreación de líneas atenuadas de Leishmania parala creación de vacunas por medio de ARNantisentido no es posible ya que no asegura unfenotipo viable y estable.

Complementación y sobreexpresión de genes

Las aproximaciones genéticas también se hanrealizado por medio de complementación génica,en la que se empieza a partir de un fenotipomutante o variante para identificar el geninvolucrado (49,72,76-80,83,88). Los genesresponsables de los defectos son identificadospor una transfección en masa de los mutantescon una librería cósmida de ADN de la especiede Leishmania silvestre y se seleccionan porrecobrar la función a través de la complementación.

Una ventaja de este método es que se basa sóloen el fenotipo haciendo que los genes obtenidossean los directamente implicados en el procesobajo estudio, a menudo sin que la función hayasido detectada por el análisis de motivos ocomparaciones en bases de datos.

Biosíntesis de glicoconjugados. Los mutantes deLeishmania deficientes en LPG fueron el puntode par tida para desarrollar los primerosexperimentos de complementación génicarealizados en parásitos protozoarios. Se desarrollóun protocolo de selección para aislar mutantesdefectuosos en la biosíntesis del LPGaprovechando el hecho de que es la únicamolécula de superficie en L. donovani que terminaen β-galactosa, residuo reconocido por laaglutinina de ricino (83). Los genes identificadospor complementación fueron lpg1 y lpg2(transportador de la GDP-manosa a la luz delaparato de Golgi). Los mutantes carentes deambos genes no sobrevivieron en el ambientehidrolítico dentro del intestino medio del insecto;además, la unión del parásito al intestino mediodel insecto y el mantenimiento de la infección luegode la excreción de la sangre del infectado se vieroncomprometidas (83,88). Los estudios sub-secuentes han extendido esta aproximación parala identificación de más de 10 genes involucradosen la síntesis de LPG y glicoconjugadosrelacionados (72,76-81,90).

Mecanismos de resistencia a drogas. EnLeishmania, la resistencia se ha asociado con laamplificación génica y gran parte de los estudiosde transfección se han enfocado a aclarar losmecanismos de resistencia a drogas (50-70). Ellocus H, una región de 40 kb en el ADN genómico,se encuentra amplificado en forma de grandescírculos extracromosómicos, luego de laexposición de las células a varias drogas norelacionadas entre sí (62). Dado que los vectoresbrindan un método de simulación de laamplificación génica, ha sido posible disecar estaregión y localizar genes que confieren resistenciaa fármacos. Para identificar los genes queconfieren resistencia al arsénico y a losantimoniales, se clonaron fragmentos de la regiónH de L. major en un vector de expresión y, luego,se reintrodujeron en el parásito en un alto númerode copias confirmando la asociación entre lapresencia del gen lmpgp A en los constructos yel nivel de resistencia (51,52).

PgpA es un transportador del tipo ABC localizadoen la membrana de las vesículas intracelulares,que confiere resistencia a los antimoniales y los

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arsenicales por secuestro de conjugados metal-tripanotión (51,52,54). Gracias a la producción demutantes con deleción o con sobreexpresión seha podido observar que la resistencia a losantimoniales en Leishmania es multifactorial concontribuciones de varios componentes, queincluyen un sistema diferente de pgpA que permitela salida de metales conjugados con tripanotión ylas enzimas implicadas en su síntesis (γ-glutamilcisteína sintetasa y ornitina decarboxilasa)(52,55,57,66,67).

Se han identificado otros fenotipos asociados conla resistencia a metales y la resistencia cruzada(50,53,58-60,68,70). La localización de los genesresponsables de la resistencia a drogas tambiénha sido posible con mutaciones puntuales quellevan a pérdida (69) o ganancia de la función(57,58).

La pteridín reductasa (PTR1), responsable de laresistencia al metotrexato (MTX) en Leishmania,incrementa el nivel de folatos reducidos a travésde una vía alterna, la cual compensa la inhibiciónde la DHFR-TS por MTX. La actividad PTR1 esesencial para la supervivencia de los parásitos invitro en medios de cultivo definidos, pero no invivo debido a que el parásito puede obtenerpteridinas reducidas las cuales son sintetizadasde novo por el hospedero mamífero (65). Lapérdida de PTR1 lleva a un aumento en lapatogénesis en infecciones a ratón ya que elevala tasa de diferenciación a la forma metacíclicainfectiva. PTR1 podría ser blanco paraquimioterapia en combinación con inhibidores dela DHFR-TS. Es necesaria una aproximación conmúltiples blancos para crear agentes efectivosanti-Leishmania.

Muchas de las enzimas del parásito sonpotencialmente susceptibles a inhibidorespreviamente desarrollados en otros sistemas loque puede ser favorable para su identificacióncomo blancos a través de la selección por drogas.La complementacion y la sobreexpresión de genesson herramientas muy útiles para explorar lasrespuestas potenciales del parásito aquimioterapia, tanto en términos de losmecanismos principales de resistencia como delos mecanismos compensatorios asociados.

Conclusiones y perspectivas

Se ha entrado a la nueva era en la investigaciónde Leishmania. El desarrollo de técnicas demanipulación genética permite el análisisfuncional de genes en el contexto del parásito.Dada la importancia del uso de los sistemas deexpresión de proteínas para el conocimiento deeste parásito, se deben proponer modificacionesque incluyan el desarrollo de vectores de expresióninducibles de manera más eficiente, la definiciónmás rigurosa de los medios de cultivo y labúsqueda de cepas más eficientes para latransfección génica.

El conocimiento de los factores que controlan laexpresión génica en Leishmania también esnecesario para el desarrollo de herramientasmoleculares avanzadas que permitan el estudiode las bases genéticas de infectividad ypatogénesis. El campo emergente de la genómicafuncional está dedicado al desarrollo y laaplicación de métodos que permitan estudiar demanera eficiente la expresión de varios genessimultáneamente, por las tecnologías demicroarreglos y proteómica (119-121).

La genómica funcional y la manipulación genética,apoyadas por la bioinformática, ofrecenherramientas diferentes y complementarias parapriorizar los genes en que se deben enfocarestudios más profundos para la validaciónfuncional a la identificación y valoración de nuevosblancos quimio e inmunoterapéuticos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por Colciencias(contratos números 021-2000 y 437-99).

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456

Biomédica 2004;24:456-63CHIRIBOGA C.A., FONTANILLA M.R.

NOTA TÉCNICA

Cultivos primarios de células endotelialesaisladas de cordón umbilical humano:un modelo biológico para el estudio de

los mecanismos de infección por enterococosCarlos Andrés Chiriboga 1, Marta Raquel Fontanilla 2

1 Laboratorio de Biología Molecular, Universidad El Bosque; programa de posgrado interfacultades deMicrobiología, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

2 Instituto de Biología Molecular, Universidad El Bosque; Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Aunque las especies de enterococos son flora normal del tracto gastrointestinal humano, seencuentran entre los tres agentes patógenos microbianos que más se asocian con infeccionesintrahospitalarias. Tradicionalmente, los enterococos se han considerado bacteriasextracelulares. Sin embargo, es creciente la información que reporta su ingreso a través delíneas celulares epiteliales o macrófagos. A pesar de que estos microorganismos constituyenel tercer grupo de aislamientos obtenido de pacientes con bacteriemia o endocarditis, suinteracción con la célula endotelial no se ha descrito completamente. En el presente trabajoevaluamos si el aislamiento intrahospitalario de Enterococcus faecalis (Ef2880) podía penetraren células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) cultivadas in vitro.Nuestros resultados indican que los cultivos primarios HUVEC después de ser inoculados conEf2890, incubados y tratados con antibióticos bactericidas para las bacterias extracelulares yadheridas a la cara externa de la membrana celular, exhiben bacterias intracelulares quepueden ser recuperadas vivas cuatro horas después de la inoculación. El modelo biológicodesarrollado se puede constituir en una herramienta útil para el estudio de las interaccionesque establecen los enterococos con el endotelio.

Palabras clave: endotelio, cultivo celular, Enterococcus sp., infección enterocócica de cultivosde HUVEC

Primary cultures of human umbilical chord vein endothelial cells: a biological model forstudying enterococcal infection mechanisms

Although enterococcus bacteria are normal human intestinal flora, they rank as the third mostcommon pathogen involved in hospital acquired infections. Generally, these bacteria areconsidered extracellular pathogens; however, an increasing number of reports indicateinvasiveness to epithelial cell lines and macrophages. Despite their importance as nosocomialinfection agents in patients suffering bacteremias and endocarditis, their interaction withendothelial cells has not been fully described. Herein, the nosocomial Enterococcus faecalisisolate Ef2890 from a hospitalized patient was exposed to cultured human venous endothelialcells from the umbilical chord. When the primary cell cultures were inoculated with Ef2890 andtreated with bactericidal antibiotics to kill extracellular and adhered bacteria, intracellular bacteriawere recovered and plated 4 h post-infection. These observations indicate that cell culturesprovide a valuable biological model to study interactions between endothelium and enterococci.

Key words: Enterococcus sp., endothelium, cell culture, enterococcal infection, nosocomialinfections.

Biomédica 2004;24:456-63

457

Biomédica 2004;24:456-63 INFECCIÓN DE CULTIVOS HUVEC POR ENTEROCOCCUS SP

Los enterococos son parte de la flora normal deltracto gastrointestinal humano. Sin embargo, lasbacterias de este género son aislamientos denosocomios, principalmente de pacientes conendocarditis, bacteriemias e infecciones urinarias(1-3). Lo anterior se ve agravado por el incremento,incluso en Colombia, del número de aislamientosresistentes a los antibióticos comúnmenteempleados en el tratamiento de estas infecciones(4,5).

La endocarditis infecciosa es una patología delendotelio que afecta generalmente las válvulasnormales, protésicas o patológicas del corazón(6). La lesión característica, denominada"vegetación", es una biopelícula que se formacuando las bacterias circulantes se adhieren alendotelio lesionado y son cubiertas por una capade plaquetas y fibrina. El microambienteproporcionado por la biopelícula esconde elmicroorganismo, y le permite evitar la accióndefensiva del sistema inmune y sobrevivir (6).

Los estudios con bacterias Gram negativas yGram positivas han mostrado su efecto reguladoro de sus productos sobre la expresión por partede las células endoteliales de moléculas deadhesión, factores de crecimiento y citocinasendoteliales en las infecciones sistémicas (7-11).Sin embargo, la investigación sobre los procesosde penetración de cepas de enterococos encélulas endoteliales no está muy desarrollada, enparte, porque estos organismos se consideran floranormal (3).

La emergencia de enterococos con nivelesimportantes de resistencia a los antibióticos hahecho que aumente el interés por entender losmecanismos que estas bacterias usan paralesionar los tejidos de los sitios que colonizan.Ya se ha demostrado que las cepas deEnterococcus faecalis resistentes a losantibióticos son capaces de trasladarse a travésdel epitelio intestinal de ratones (12,13) y losestudios sobre los factores bacterianos

involucrados en las interacciones célula-patógenohan identificado sustancias que desempeñan unpapel importante en el ingreso de la bacteria enenterocitos y macrófagos cultivados (14-16).Como se cree que muchas infeccionesenterocócicas del torrente sanguíneo tienen origenentérico (17), los estudios in vitro se han enfocadoa entender los mecanismos empleados por losenterococos para superar la barrera epitelial ysobrevivir en los macrófagos. Recientemente, sereportó que los aislamientos nosocomiales de E.faecalis se adhieren e invaden células HeLa yque la endocitosis mediada por receptores puedeser uno de los mecanismos utilizados por labacteria para invadir este tipo de célula epitelial(17).

A pesar de que en las vegetaciones caracterís-ticas de la endocarditis los enterococos interactúanestrechamente con las células endoteliales, in vitrono se ha estudiado la relación que establecen lasdiferentes especies enterocócicas con las célulasendoteliales. Tampoco, si estas células en cultivointroducen enterococos ni el papel que esteproceso puede jugar en la recurrencia de lainfección.

El propósito de este trabajo fue establecer si unaislamiento intrahospitalario de enterococo,inoculado en cultivos primarios de célulasendoteliales aisladas de la vena del cordónumbilical humano (HUVEC) es capaz de invadirlas células endoteliales. Con este fin,estandarizamos los procedimientos que se debenseguir para infectar cultivos HUVEC conaislamientos nosocomiales de E. faecalis.Encontramos que al exponer las células a lasbacterias por dos horas y luego tratarlas conantibióticos para eliminar E. faecalisextracelulares o adheridos a la membrana, esposible encontrar bacterias en el interior de lasHUVEC cultivadas.


Aislamientos bacterianos ysus condiciones de cultivo

Para este trabajo se utilizó el aislamiento clínicoE. faecalis Ef 2890. La caracterización y lospatrones de susceptibilidad antimicrobiana de este

Correspondencia:Marta Raquel Fontanilla, Calle 52 B No 4-34, email:[email protected]


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aislamiento se describieron previamente por elInstituto de Genética Molecular Bacteriana de laUniversidad El Bosque (4). La cepa no invasivaEscherichia coli DH5a sirvió como controlnegativo en los experimentos de infección. Lasbacterias se mantuvieron y crecieron en caldo oagar infusión cerebro-corazón (BHI) (Biomedics,Madrid, España). Para preparar los inóculosutilizados en la infección, se inocularonsuspensiones de los aislamientos en agar BHI yse incubaron a 35°C por 24 horas. Luego de laincubación, se resuspendieron 4 o 5 colonias en20 ml de caldo BHI y se incubaron a 35°C por 18horas con agitación constante a 150 rpm en unbaño de María (Shaker Bath, Lab-line, USA).Posteriormente, se tomó 1 ml de este cultivo, seresuspendió en 9 ml de medio RPMI (Gibco,Invitrogen Corporation, Grand Island, NY) y seincubó hasta alcanzar una OD625 de 0,08 a 0,1,equivalente a 1x108 UFC/ml, aproximadamente.Los cultivos así obtenidos se utilizaron comoinóculos en los ensayos de invasión.

Aislamiento y cultivo de células endotelialesde vena umbilical humana

Las células endoteliales de vena umbilical humanase obtuvieron siguiendo el protocolo establecidopor Beekhuizen et al. (7) con algunasmodificaciones introducidas por nosotros.Después de obtener el consentimiento informadofirmado por las pacientes, se tomaron segmentosde cordón umbilical de 15 cm, aproximadamente,obtenidos de partos normales en el Servicio deObstetricia de la Clínica El Bosque. Lossegmentos de cordón se transportaron en solucióntampón salina de fosfatos (PBS, pH 7,4) consuplemento de penicilina/estreptomicina (100 UI-100mg) (GIBCO), se lavaron y se desinfectaronexternamente con etanol al 70%.

En los cordones limpios y desinfectados, selocalizaron y canularon ambos extremos de la venaumbilical con aguja roma 21 fr y se fijaron lasagujas con pinzas de Kelly. La vena umbilical selavó con PBS para eliminar rastros de sangre, sellenó con una solución de tripsina-EDTA (0,25%/0,02% p/v) (GIBCO) y se incubó por 15 minutos a37°C. Pasado este tiempo, las células endotelialesfueron desprendidas lavando la vena con 10 ml,aproximadamente, de medio DMEM (GIBCO) con

suplemento de 10% de suero fetal bovino (SFB)(GIBCO). La suspensión celular obtenida secentrifugó a 1.800g por 10 minutos; el sedimentose resuspendió en medio DMEM co suplementoal 20% de SFB, penicilina-estreptomicina (100 UI-100mg), vitaminas (ICN, Biomedicals Inc.),aminoácidos no esenciales (GIBCO, LifeTechnologies) y piruvato de sodio al 1% (GIBCO,Life Technologies).

La cantidad de células viables presentes en lasuspensión celular obtenida se determinó con unatinción vital (azul de tripano) y se escogieronsuspensiones con viabilidades superiores al 80%para realizar las siembras. El inóculo empleadopor frasco T de 12,5 cm2 (Falcon) fueron lascélulas endoteliales aisladas de venas umbilicalesde tres segmentos de 10 cm. Los cultivos seincubaron en atmósfera controlada con 5% de CO

2

y temperatura de 37°C hasta observar confluencia.Para los ensayos de invasión, se utilizaron cultivosde segundo pasaje.

Caracterización de los cultivos HUVECprimarios mediante deteccióninmunohistoquímica de la expresión delfactor von Willebrand

La expresión del factor VIII de la coagulación,factor von Willebrand (vW), en los cultivos HUVECse detectó utilizando como anticuerpo primario unanticuerpo monoclonal de ratón anti-vW humanoen dilución 1:25 (Dako, Dinamarca) y comoanticuerpo secundario, un anticuerpo policlonal decabra anti-ratón, conjugado con peroxidasa (Dako,Dinamarca) en dilución 1:100. Para la inmuno-tinción, se fijó el cultivo con metanol por 5 minutosy la placa sembrada se sometió a la siguienteserie descendente de baños con etanol paradeshidratarla: 100% por 15 minutos, 95% por 10minutos y 70% por 5 minutos. Después de lavarcon PBS por 10 minutos, se bloqueó con gelatinaal 1% por 1 hora, se volvió a lavar con PBS, seincubó con H

2O

2 por 5 minutos y se lavó con

PBS. Se agregó el anticuerpo mouse anti-humanvon Willebrand factor, se incubó por una hora y selavó varias veces con PBS. Luego, se incubó conel anticuerpo secundario peroxidase conjugatedgoat anti-mouse immunoglobulin por 30 minutos,se lavó con PBS y se incubó con el sustrato de laenzima por 5 minutos. Como tinción de contraste

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se empleó hematoxilina. Para controlar laespecificidad de la tinción se incluyeron doscontroles: un cultivo de células HUVEC al que nose le adicionó anticuerpo primario y un cultivo defibroblastos, que no expresan el factor, conanticuerpos primario y secundario.

Ensayos de detección de E. faecalisintracelular en células HUVEC

El ensayo utilizado para la detección intracelularde E. faecalis se adaptó del procedimiento seguidoen los experimentos de protección a antibióticos(10,11). Se incubaron frascos T de 12,5 cm2 concultivos HUVEC confluentes con tripsina 0,25%por 20 minutos a 37°C en atmósfera húmeda con5% de CO

2. Se adicionó DMEM con suplemento

de SFB al 10% para neutralizar la enzima; secentrifugó y el sedimento obtenido se resuspendióen 1 ml de medio DMEM con suplemento de SFBal 20% y se sembró en platos de cultivo de 24pozos (Falcon), utilizando una densidad desiembra de 5 x 104 células por pozo. Los cultivosse incubaron por 24 horas o hasta alcanzarconfluencia; luego, se lavaron tres veces con PBS;se adicionó medio RPMI sin suplemento y seincubaron por 3 horas en atmósfera húmeda con5% de CO2.

Transcurrido este tiempo, se agregó el inóculobacteriano en medio RPMI a los pozos, utilizandouna multiplicidad de infección de 2.000 bacteriaspor célula endotelial; se incubaron por 2 horas; seretiró el medio y las células se lavaron tres vecescon PBS. Luego, se adicionó medio RPMI consuplemento de gentamicina-penicilina (500 mg-500UI) y se incubaron por 2 horas (5% de CO2 ytemperatura de 37°C) con el fin de matar lasbacterias extracelulares y las adheridas a la caraexterna de la membrana celular. Después detrnascurrido tiempo, los cultivos se lavaron conPBS, se lisaron con una solución de Tritón X-100al 1% (Sigma) y se realizaron diluciones seriadasdel lisado que se sembraron por extensión encajas de agar BHI, se incubaron y se realizó elconteo de UFC.

Paralelamente, se llevó a cabo un experimentoen el cual la infección se hizo con E. coli DH5a,yse incluyó como control negativo. Los datos sepresentan como porcentaje de invasión = 100 x

(UFC recuperadas/UFC del inóculo inicial). Paracomprobar la muer te de las bacteriasextracelulares se sembraron 50 µl delsobrenadante de los cultivos tratados con lamezcla de antibióticos, se incubaron y seobservaron para establecer la aparición de UFCen el agar.

Microscopia óptica de la invasiónde E. faecalis a células HUVEC

Se hicieron pasajes de células HUVEC de cultivosconfluentes en frascos T 12,5 a láminas de vidrioestériles con una densidad de 2 x 104 células porlámina y se incubaron en ambiente húmedo con5% de CO

2 y temperatura de 37°C por 24 horas.

Después de la incubación, se lavaron tres vecescon PBS, se agregó medio RPMI sin suplementoy se incubaron por 3 horas en las mismascondiciones; se adicionó el inóculo bacteriano enmedio RPMI con una multiplicidad de infecciónde 2.000 y se incubaron por 2 horas. Después dela incubación, se retiró el medio, se lavaron tresveces las células con PBS, se adicionó medioRPMI con suplemento de gentamicina-penicilina(500 mg-500 UI) y se incubó por 2 horas en 5%de CO

2 y 37°C.

En este experimento se incluyeron cultivosinfectados con la cepa de E. coli DH5a, comocontrol negativo de la infección. Las láminas conlos cultivos infectados se fijaron en metanolabsoluto (Merck), se tiñeron con Gram o Giemsay se observaron al microscopio.

Microscopia electrónica de la invasión deE. faecalis a células HUVEC

Se prepararon e infectaron cultivos en láminas devidrio estériles de la forma descrita en los ensayosde microscopia óptica. Los cultivos infectados sefijaron en glutaraldehído al 3% en PBS (v/v)(Eufar), y se posfijaron con tetróxido de osmio;se sometieron a deshidratación en seriesascendentes de etanol, embebidos en Epón,cortados finamente con un ultramicrótomo (LKB-Pharmacia), teñidos con una solución acuosasaturada de acetato de uranilo y citrato de plomo.

Las observaciones de los cortes se hicieron enun microscopio electrónico Phillips CM10 a21.000 y 28.500 aumentos.

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Resultados

Aislamiento y cultivo de células endotelialesde vena umbilical humana (HUVEC)

En este trabajo encontramos que la digestiónenzimática con tripsina de la lámina endotelial querecubre la vena del cordón umbilical humano y laagrupación de los productos digeridos provenientesde tres cordones umbilicales cada uno conlongitudes aproximadas de 15 cm permitenestablecer cultivos primarios HUVEC. En estepaso, no se establece el número exacto de célulasendoteliales aisladas y sembradas por frasco T-25 debido a que se obtienen muchos agregadoscelulares lo cual hace muy inexacto el conteo.Establecido el cultivo, los subcultivos se hacen condensidades celulares de 5x104 células por cm2.

En el panel A de la figura 1 se muestra un cultivoincubado por una semana, en el que se destacala presencia de células con morfología poliédricasemejante a la reportada para el endotelio (18).El panel B corresponde a un cultivo con el mismotiempo de incubación que fue sometido a tincióninmunohistoquímica para detectar la expresión delfactor von Willebrand.

Interacción de las células HUVEC conEnterococcus faecalis

La presencia de bacterias viables dentro de lascélulas endoteliales se estableció mediante un

ensayo de protección a antibióticos. En éstos,después de infectar los cultivos con losaislamientos por dos horas, se adicionó unamezcla antibiótica de gentamicina y penicilina paramatar las bacterias extracelulares, cuya muertese comprobó mediante la siembra delsobranadante. Los tiempos de infección y eltamaño del inóculo utilizados se determinaron enexperimentos preliminares. Se escogió en 2 horasel tiempo de incubación con las bacterias, debidoa la excesiva acidificación del medio de cultivoobservada después de las 4 horas. Se observó lapresencia de UFC en el sembrado obtenido a partirdel lisado celular luego de 2 horas de incubaciónen medio sin suplemento y 2 horas más en mediocon suplemento con concentraciones bactericidasde gentamicina- penicilina. Los resultados de losconteos de UFC, expresados como porcentajesde invasión, fueron de 0,18% para el aislamientoenterocóccico Ef 2890 y de 0% para la cepa deE. coli DH5a, usada como control negativo de lainvasión.

Ensayos con microscopia de luz

El panel A de la figura 2 presenta cultivosendoteliales infectados con E. faecalis Ef 2890teñidos con la coloración de Gram; el panel B, loscultivos sometidos a la tinción de Giemsa. Entodos los casos se evidenció la asociación de losenterococos con las células HUVEC. Los

Figura 1. Cultivos confluentes de células HUVEC. A. Microscopía con contraste de fase; se observan células con unionesestrechas y morfología poliédrica que exhiben una organización en “empedrado”. B. Tinción inmunohistoquímica positivapara la expresión de factor de von Willebrand.

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resultados de los tres experimentos realizados portriplicado indican que el aislamiento de E. faecalisEf 2890 se asoció con 69,23% de las célulasendoteliales, mientras que la cepa de E. coli noestableció interacciones con éstas.

Ensayos con microscopía electrónica detransmisión

La microscopía electrónica de transmisión decélulas HUVEC inoculadas con E. faecalis 2890(figura 3) muestra cocos intracelulares, algunosen vacuolas espaciosas (A) otros en vacuolas

Figura 2. Microscopia óptica de la invasión de E. faecalis 2890 a células HUVEC. Los cultivos infectados se tiñeron con (A)Giemsa y (B) Gram y se observaron al microscopio. Las flechas señalan múltiples bacterias intracelulares (de acuerdo conlos resultados del ensayo de protección a antibióticos), algunas en cadenas. E. faecalis 2890, 100X.

Figura 3. Microscopia electrónica de transmisión de lainvasión de E. faecalis 2890 a células HUVEC. Se observancocos intracelulares, algunos en vacuolas espaciosas (A,21.000X) otros en vacuolas que se conforman al tamaño dela célula y en aparente división (B, 28.500X).

ajustadas al tamaño de la célula (B). En algunoscasos se observan bacterias en división (B) yformando tabiques.

Discusión

La investigación detallada de la interacción queestablecen las bacterias de la especie E. faecaliscon las células endoteliales se ve favorecida porla posibilidad de establecer cultivos primarios concélulas endoteliales provenientes de la vena delcordón umbilical humano. Éstos, al formar unamonocapa uniforme, proveen un buen sustrato para

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el estudio detallado de las interacciones bacteria-célula, y simulan la superficie encontrada in vivopor las bacterias que producen endocarditis (19).Aunque este sistema biológico ha sido utilizadopara estudiar la invasión-ingreso de Staphylococcusaureus por medio de la célula endotelial (19,21),no se ha aplicado para analizar las interaccionesE. faecalis-endotelio.

A pesar de que las células endoteliales no soncélulas fagocíticas profesionales, su capacidadpara fagocitar in vitro las bacterias de la especieS. aureus ya ha sido descrita (19-21). La novedadde nuestro trabajo radica en que muestra lapresencia intracelular de E. faecalis Ef 2890 enlos cultivos primarios de HUVEC inoculados conesta bacteria. Las bacterias se observaron dentrode vacuolas endocíticas, algunas empezando aformar tabiques. En los modelos similares deinfección con S. aureus se ha postulado que lapresencia intracelular de estas bacterias puedeser un elemento clave en la génesis de lasvegetaciones en las válvulas sanas (7,19-21). Unaposible inferencia surgida de relacionar nuestrosresultados con los obtenidos con S. aureus esque puede estar ocurriendo este mismo fenómenoin vivo con E. faecalis. Si éste es el caso, lasbacterias estarían entrando a un ambienteintracelular protegido, reproduciéndose y, tal vez,pasando a través de la barrera endotelial.

Un estudio reciente mostró la presencia en sangre,hígado, riñón, corazón y bazo de dos cepas de E.faecalis inoculadas endovenosamente en unmodelo en ratón (22). Los autores sugirieron quela gravedad de las lesiones histopatológicascausadas por la cepa más virulenta podía debersea su habilidad de cruzar la barrera endotelial. Lapresencia de bacterias en vesículas endocíticasintracelulares detectada por nosotros puede ayudara insinuar la hipótesis de que E. faecalis utilizaun mecanismo de transcitosis bacteriana paraatravesar la lámina endotelial y causar daño tisular.Aunque el promedio del porcentaje de invasión(0,18%) obtenido in vitro es bajo, puede tenersignificado biológico. Se ha reportado por otrosautores que los porcentajes de invasión menoresde 1 pueden llegar a ser importantes en unescenario in vivo (12).

Los resultados de este trabajo señalan que elmodelo desarrollado basado en cultivos primariosde HUVEC puede ser una herramienta útil en elestudio de los mecanismos de patogenicidad quesubyacen las patologías infecciosas del endoteliocausadas por E. faecalis. En nuestro grupo,actualmente se están llevando a caboexperimentos tendientes a establecer el papel quela célula endotelial y la bacteria tienen en lainvasión-ingreso descritos. Con ellos se esperaesclarecer si la presencia intracelular deenterococos es debida a procesos de fagocitosisexhibidos por la célula endotelial en respuesta alos factores inductores producidos por la bacteria.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado parcialmente por elInstituto Colombiano para el Desarrollo de laCiencia y la Tecnología Francisco José de Caldas,Colciencias, proyecto número 13080412635. Losautores quieren expresar su agradecimiento alInstituto de Genética Molecular Bacteriana de laUniversidad El Bosque por facilitarnos la cepa E.faecalis 2890 y a María Mercedes Posada por lalectura crítica del documento.

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Biomédica 2004;24:464

CARTAS AL EDITOR

Bogotá, 27 de septiembre de 2004

SeñoresEditores, revista BiomédicaLa ciudad

Apreciados señores:

En el primer número del volumen 24 de la revistaBiomédica (2004;24:97-103), se publicó el artículo“Differentiation of an adult neuron cell line increasessusceptibility to rabies infection”. Por un errorinvoluntario de parte nuestra, se omitieron en losagradecimientos los correspondientes créditos a

Colciencias, quien financió parcialmente lainvestigación, a través del proyecto 2104-04-11724,“Regulación por neurotrofinas de la trascripción yreplicación del virus de rabia en neuronassensoriales infectadas”, razón por la cual, deseohacer la respectiva aclaración.

Agradezco la atención prestada.

Cordialmente,

JAIME E. CASTELLANOSInvestigador principal

FE DE ERRATAS

Los créditos de la fotografía de la portada de la revista Biomédica, volumen 24, No. 3, 2004, deben decir:

Apophysomyces elegans: observación microscópicaAzul de lactofenol.

Corporación para Investigaciones BiológicasMedellín, Colombia.

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BiomédicaINSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Volumen 24, números 1, 2, 3, 4 y suplemento 1

Índice de autores

Acosta Claudia P., 153Agudelo Ángela, 56Agudelo Sonia del Pilar, 375Aguirre Beatriz, 56Ajzenberg Daniel, 282Alpuche Celia, 252Álvarez Tania, 79Anaya Juan Manuel, 140, S43, 366Angulo Esther Sofía, 33Aponte Samanda L., 97Arango Eliana, 79Arango Magnolia, S18Arango Myrtha, 239Arbeláez María Patricia, 56, S115Arcila Giovanna, 366Arcila Vivian, S65Arias Andrés Augusto, 262Arias Nhora L., S73Arrieta Germán, 89Averill Sharon, 183

Baquero Johanna, 97Barletta Raúl Gerardo, S165Barona Jacqueline, 42Barrera Gladys A., 97Barrera Lucía, S60Barrera Luis F., S228Bedoya Andrés, 56Bedoya Fernando, S65Bedoya Gabriel, 56Beltrán Magda Y., 97Bermúdez Antonio, 50, 174Bernardelli Amelia, S85Blair Silvia, 79Blank Abraham, 20Bornay Fernando Jorge, 375Botero Jorge H., 375Bravo María Mercedes, 163Burgos Javier, S18Burgos Marcos V., S188

Cabrera Gustavo Alonso, S138Cabrera Julio César, S138Cadena José, 140Caldas María Leonor, 345Calle Jorge Julián, 56Camacho Tania, 174Camargo José F., 140Camargo Luz H., 345

Caminero José A., S212Cano Juan Fernando, 56Cárdenas Víctor, 174Cardeño Carlos Alberto, 56Cardona-Castro Nora, 194Cardoso Leao Sylvia, S60Carmona Jaime, 79Carvajal Rocío, S138Castañeda Alexandra, 324Castañeda Elizabeth, 296, 324Castaño Jhon Carlos, 282Castaño Martha C., S73Castellanos Jaime E., 97Chacón Ofelia, S165Chaparro Pablo E., S102, S132Chávez Mónica, 20Chiriboga Carlos Andrés , 456Citera Gustavo, 140Correa Álvaro, 350Correa Ana Lucía, 239Correa Luz Saider, 239Correa Paula A., 140, S43Cortázar Tania M., 438Cortés Jorge Albert, 7Cuartas Jorge Mauricio, 207Cuartas Mónica Cecilia, 318Cuéllar Ávila Adriana, 413Cuervo Sonia Isabel, 7

Da Silva Telles María Alice, S60Dardé Marie-Laure, 282Davenport Silvana, S85David Bradley, 13De Calderón Laura, 174De la Hoz Fernando, 174, S124Del Águila Carmen, 375Díaz Abel, 375Díaz María Lilia, S92Díez Hugo, 200Dinauer Mary C., 262Ding Jiabin, 262Domínguez Martha C., 20Durango Johnny, 89

Echemendía Miguel, S80Eizuru Yoshito, 20Enciso Clara, 104Escobar Elmer, 231Espinal Paula Andrea, 252

Ferro Beatriz E., S73, 291Fiorentino Susana, 163Fonseca Ángela, 413Fontanilla Marta Raquel, 456Forero Manuel G., 345Fuentes Jairo, 350

Gallego Carolina, 282Garcés Isabel Cristina, 56García Felipe, 20García Ingrid, S102, S124, S132García Jenny, 56García Liz Betty, S92García Luis F., S5, S228García María Jesús, S60Giraldo Alejandra, 282Gómez Arlen, 393Gómez Alberto, 413Gómez Javier E., 63Gómez Jorge Enrique, 282Gómez Juliana, 56Gómez Luis M., S43González Alejandro, 56González Iveth, 423González Natalia, 56Gore Saravia Nancy, 393Groot de Restrepo Helena, 153Guerrero Martha Inírida, S102, S124Gutiérrez Patricia, 125

Hazbón Manzour Hernando, S149Henao Héctor Hernán, 393Hernández Héctor L., S73Hernández Luis Francisco, 7Hernández Mario, S27Herrera Claudia Patricia, 56Hidalgo Marylin, 324

Idrovo Álvaro Javier, 356Isaza Carlos Alberto, 273Izquierdo Fernando, 375

Jamil Hadad David, S60Jaramillo Ernesto, S5, S73Jaramillo Antonio C., 97Jaramillo Sergio, 318

Knudson Angélica, 123, 204

Laszlo Adalberto, S163Laverde Carlos, 133

466

Leal Aura Lucía, 252Lemus Dihadenys, S80León Clara Inés, S102, S124Lizarazo Jairo, 125, S34Llanes María J., S80Londoño Juan Guillermo, 207López Carlos Alberto, 56López Jaime Alberto, 318López Lilia Edith, S132López Manuel Carlos, 200López María Cecilia, 56Loureiro Julio, S85

Maldonado Héctor, S27Maldonado-Cocco José A., 140Mantilla José Ramón, 252Marrero Antonio, S80Martínez-Gutiérrez Marlén, 97Mattar Salim, 89Matute Juan David, 262Maya Claudia Yarely, 318Maya José, S65McEwen Juan, 324Mejía Ángela, S52Mejía Carlos Andrés, S52Mejía Gloria Isabel, S52Mejía-Naranjo Wilson, 403Meléndez Esperanza, 350Méndez Juan Camilo, S188Mendoza Nohora M., 123, 204Menendez Maria Carmen, S60Mercado Marcela, 104Merchán Adriana, S132Mesa Giovanny, 273Molina Olga Lucía, 318Moncada Juan Carlos, 273Moncada Ligia Inés, 385Montilla Marleny, 104, 200Montoro Ernesto, S80Montoya Gabriel Jaime, 56Montoya Martha Nelly, 375Montoya Pablo, S124Montoya Patricia, 56Mora Carlos, 125Morcillo Nora, S85Moreira César A., S73Moreno Jaime, 296Muñetón-Gómez Vilma, 183Muñoz Bernardo, S65Muñoz Sulma, S92Murcia Martha Isabel, S60

Navarro-i-Martínez Luis, 375Neira Marcela, 237Nicholls Rubén Santiago, 104,123, 204Nieto-Sanpedro Manuel, 183Núñez Vitelbina, 42

Ordóñez Leonardo Elías, 33Ordóñez Nelly, 133Orjuela Pamela, 423Orozco Oscar, 163Osorio Franciso Javier, 273Osorio Lyda, 13, 423Osorio Yaneth, 393Ospina Jorge, 56Otero Rafael, 42

Palacio Carlos Alberto, 56Palenque Elia, S60Paniagua Lizeth, S65Paniagua Marcela, S65Parra Edgar A., 125, 237Patiño Pablo Javier, 262Pérez Jesús A., 350Pérez Ligia, 174Phandanouvong Vienvilay, 296Pimienta Hernán J., 63Pineda-Tamayo Ricardo, 366Pinto Rafael, 133Piñeros Marion, 109Potdevin Guillermo, 7Priestley John V., 183Puerta Concepción, 104, 200

Quijano Sandra, 163Quintana Milton, 20Quse Viviana, S85

Realpe Teresa, S165Recio-Pinto Esperanza, 97Reniero Ana, S60Renza Marta, S13Restrepo Ana Cristina, 318Restrepo Ángela, 239Restrepo Blanca I., S202Restrepo Patricia, 366Restrepo Mauricio, 341Rey Juan José, S115Reyes Yolima, S124Ribón Wellman, S188Ritacco Viviana, S60Riveros Angélica, 133Roa Diana, 237

Robledo Jaime, S165Robledo Sara María, 302Rodríguez Adriana, 104Rodríguez Ana Lucía, 291Rodríguez Gerzaín, 133Ruiz Carmen Elena, 239

Saavedra Carlos, 163, 252Salazar Myriam Janeth, 385Sánchez Carmen, 174Sánchez-Gómez Myriam, 403Sánchez Miryan Margot, 194Sánchez Ricardo, 56Santacruz María M., 104Santafé Mauricio, 291Santander Paola, 200Sarmiento Ladys, 345Sarmiento Martha, 133Schneeberger Emilce, 140Scott Taylor Julián, 183Segura Angela María, S115Sicard Diana M., 153Siqueira de Oliveira Rosangela, S60Sotomayor Hugo, S18

Thomas María del Carmen, 200Tobón Ángela, S65Tobón Gabriel J., 140Todd Jim, 13Torres María M.,153Torres-Fernández Orlando, 63Travi Bruno, 393Trujillo Hugo, S52Trujillo Jaime, S52

Urdaneta Ana María, 7Urueña Claudia, 200

Valderrama Jessika, 133Valdivia José A., S80Valenzuela Emilia María, 252Vanegas Adriana Lucía, 375Vargas Juan, 125Varona María Ximena, 291Velandia Martha Patricia, 5Velásquez Germán, 115Villarreal Elsa, 50

Walker John, 438

Yepes Gloria E., 63

Zarante Ignacio, 200Zuluaga Milena, 302Zuluaga Nora Alejandra, 207

467

Biomédica

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Volumen 24, números 1, 2, 3, 4 y suplemento 1

Índice de artículos

Editorial

La fiebre amarilla y su control ............................................................................................................ 5

Los medicamentos: ¿un bien público mundial? ................................................................................ 115

La rabia transmitida por vampiros ...................................................................................................... 231

La tuberculosis: un reto que debemos enfrentar ............................................................................... S5

Una nueva reforma al sistema de servicios para la salud ................................................................ 341

Ensayo

La presencia asfixiante del cuerpo .................................................................................................... S13

Historia

Autopsia del cadáver del excelentísimo señor Libertador General Simón Bolívar ......................... S11

Demostración de tuberculosis en una momia prehispánica colombiana por la ribotipificacióndel ADN de Mycobacterium tuberculosis ........................................................................................... S18

Memorias de un sanatorio antituberculoso ....................................................................................... S27

Raíces históricas, sociales y epidemiológicas de la tuberculosis en Bogotá, Colombia ................ 356

Imágenes en biomedicina

Hallazgos hispatológicos en dos casos de rabia humana por virus tipo 3, Bajo Baudó, Chocó .... 237

Un método cuantitativo para analizar redes neuronales marcadas por histoquímicapara acetilcolinesterasa ..................................................................................................................... 345

Presentación de caso

Ojo de buey en tomografía hepática .................................................................................................. 7

Paquimeningitis craneal hipertrófica idiomática ............................................................................... 125

Fascitis necrosante por Apophysomyces elegans, moho de la familia Mucoraceae,en paciente inmunocompetente ......................................................................................................... 239

Aparición paradójica de tuberculomas encefálicos durante el tratamiento detuberculosis en pacientes inmunocompetentes ................................................................................ S34

Conidiobolomicosis: hallazgos histopatológicos .............................................................................. 350

Educación continua

Haga usted el diagnóstico, primera parte .......................................................................................... 123

Haga usted el diagnóstico, segunda parte ........................................................................................ 204

Artículos originales

Ausencia de malaria asintomática en escolares de Quibdó, Chocó ................................................ 13

Reconstrucción de la evolución molecular de la infección actual por el virus linfotrópicohumano tipo I en Colombia ................................................................................................................ 20

Eficacia de la ivermectina en el tratamiento de niños colombianos parasitados porStrongyloides stercoralis .................................................................................................................... 33

Aspectos toxinológicos e inmunoquímicos del veneno del escorpión Tityus pachyurus Pocockde Colombia: capacidad neutralizante de antivenenos producidos en Latinoamérica .................. 42

Análisis de polimorfismos APO-E en mujeres colombianas con osteoporosis ycorrelación con variables clínicas y sociales de riesgo .................................................................... 50

468

Validación de la entrevista diagnóstica para estudios genéticos (DIGS) en Colombia .................. 56

Efecto de la infección por el virus de la rabia sobre la expresión de parvoalbúmina,calbindina y calretinina en la corteza cerebral de ratones ............................................................... 63

Gametocitemia de Plasmodium falciparum según la respuesta terapéutica a sulfadoxina-pirimetamina y cloroquina en dos municipios de Antioquia, Colombia ........................................... 79

Presencia de Salmonella spp. en un área del Caribe colombiano:un riesgo para la salud pública .......................................................................................................... 89

Recidivas postratamiento de la lepra multibacilar ............................................................................ 133

Anticuerpos anti-CCP en artritis reumatoidea: relación con características clínicas,citocinas Th1/Th2 y HLA-DRB1 .......................................................................................................... 140

Susceptibilidad genética y riesgo de cáncer gástrico en una población del Cauca ....................... 153

Presencia del virus de Epstein-Barr en casos colombianos de linfoma de Hodgkin ysu relación con la respuesta al tratamiento ....................................................................................... 163

Vigilancia epidemiológica incompleta de la epidemia de dengue-2 en Ibagué,Colombia, 1995-1997 ......................................................................................................................... 174

Degeneración de los terminales aferentes primarios de rata luego de lesión extensapor avulsión del plexo braquial .......................................................................................................... 183

Epidemiología molecular de infección nosocomial por Klebsiella pneumoniae productora debeta-lactamasas de espectro extendido ............................................................................................ 252

Expresión y actividad de posibles polimorfismos provenientes de individuos normales en laproteína de 67 kd del sistema NADPH oxidasa utilizando el sistema COSphox ............................ 262

Efectividad del tratamiento antihipertensivo en una muestra de pacientes colombianos .............. 273

Caracterización biológica y molecular del aislamiento CIBMUQ/HDC, una cepa colombianade referencia para Toxoplasma gondii .............................................................................................. 282

Polimorfismo del FNTα en autoinmunidad y tuberculosis ................................................................ S43

Cinco años de experiencia con el agar de capa delgada para el diagnóstico rápidode tuberculosis .................................................................................................................................... S52

Distribución de patrones PRA en aislamientos clínicos del complejo Mycobacteriumavium procedentes de España y Suramérica .................................................................................... S60

Cirugía en tuberculosis pulmonar multirresistente ........................................................................... S65

Resistencia inicial a drogas antituberculosas en Buenaventura, Colombia ................................... S73

Vigilancia de la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a las drogas antituberculosasen Cuba, 1995-1998 ........................................................................................................................... S80

Susceptibilidad in vitro a los medicamentos antituberculosos de aislados de cepas delcomplejo Mycobacterium tuberculosis obtenidos a partir de lobos marinos ................................... S85

Tuberculosis en el Hospital Universitario San José, Popayán, 1998-2000 ..................................... S92

Situación de la tuberculosis en Colombia, 2002 ............................................................................... S102

Tendencia de la mortalidad y los egresos hospitalarios por tuberculosis, antes y durante laimplementación de la reforma del sector salud, Colombia, 1985-1999 .......................................... S115

Prevalencia de sintomáticos respiratorios, de infección y enfermedad tuberculosa yfactores asociados: estudio basado en población, Mitú, Vaupés, 2001 ........................................... S124

Panorama de la coinfección tuberculosis/VIH en Bogotá, 2001 ...................................................... S132

Efectos de la reforma en salud en las acciones de control de tuberculosis en elValle del Cauca, Colombia ................................................................................................................. S138

Impacto de la enfermedad cardiovascular en los costos de hospitalización de pacientescon artritis reumatoidea ...................................................................................................................... 366

469

Frecuencia de microsporidiosis intestinal en pacientes positivos para VIH mediantelas técnicas Gram cromotropo rápido y PCR .................................................................................... 375

Ciclo de vida de Culex quinquefasciatus Say, 1826 (Diptera: Culicidae) bajo condicionesno controladas en Bogotá .................................................................................................................. 385

Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime® y Pentostam®)en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana: aplicación de la luminometría .......... 393

La desnutrición proteica estimula la expresión de receptores de la hormona del crecimientoen linfocitos B esplénicos de rata ...................................................................................................... 403

Comunicación breve

La diferenciación de una línea celular de neuronas de adulto aumenta la susceptibilidada la infección por rabia ....................................................................................................................... 97

Desarrollo y evaluación de una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR),utilizando la secuencia del gen hilA para diagnóstico de fiebre entérica por Salmonella spp ...... 194

Localización cromosómica de los genes KMP-11 en cepas KP1(+) y KP1 (-) deTrypanosoma rangeli .......................................................................................................................... 200

Evidencia de exposición a Leptospira en perros callejeros de Cali ................................................ 291

Vigilancia molecular de aislamientos invasores de Streptococcus pneumoniae resistentes ala penicilina en niños colombianos menores de 5 años .................................................................. 296

Efecto del lipopolisacárido en cultivos de células dendríticas humanas y su inhibiciónpor la polimixina B .............................................................................................................................. 413

Revisión de tema

Genética de la preeclampsia: una aproximación a los estudios de ligamiento genético ............... 207

Las células de Langerhans en la inmunidad a leishmaniasis ......................................................... 302

Avances recientes en métodos moleculares para el diagnóstico precoz y tuberculosisresistente al tratamiento ..................................................................................................................... S149

Inactivación de genes de Mycobacterium tuberculosis y su potencial utilidad en la prevencióny el control de la tuberculosis ............................................................................................................. S165

Epidemiología molecular de la tuberculosis: métodos y aplicaciones ............................................. S188

Nuevas herramientas para la detección de la tuberculosis latente ................................................. S202

Manejo de los casos en retratamiento de tuberculosis con sospecha de resistenciaa fármacos ........................................................................................................................................... S212

Perspectivas para nuevas vacunas antituberculosas en la era posgenómica ................................ S228

Terapia combinada como estrategia en la prevención de la resistencia alos antimaláricos ................................................................................................................................. 423

Manipulación genética y el estudio del parásito protozoario Leishmania ....................................... 438

Comentario

The other face of Janus ...................................................................................................................... S163

Nota técnica

Comparación de la prueba de inmunofluorescencia indirecta, un inmunoensayo enzimáticoy la prueba comercial Chagatek® para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi ...... 104

Seguimiento microbiológico: estrategia para el mejoramiento del registro de la informaciónen los procesos microbiológicos ........................................................................................................ 318

Evaluación de varias técnicas de extracción de ADN de Cryptococcus spp. a partir de muestrasambientales ......................................................................................................................................... 324

Cultivos primarios de células endoteliales aisladas de cordón umbilical humano:un modelo biológico para el estudio de los mecanismos de infección por enterococos ................ 456

470

Biomédica

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Volume 24, numbers 1, 2, 3 y 4 and supplement 1

Articles' index

Editorial

Yellow fever and its control ................................................................................................................. 5

Drugs: ¿a world public good? ............................................................................................................ 115

Rabies transmitted by vampiros ......................................................................................................... 231

Tuberculosis: a chalenge we must face ............................................................................................. S5

A new reform of the national health system ....................................................................................... 341

Essay

The suffocating presence of the body ................................................................................................ S13

History

Autopsy of the corpse of his Excellency Libertador General Simón Bolívar .................................... S11

Demonstration of tuberculosis by DNA ribotyping of Mycobacterium tuberculosis in a

Colombian prehispanic mummy......................................................................................................... S18

Memories of an antituberculous sanatorium ..................................................................................... S27

Historical, social and epidemiological roots of tuberculosis in Bogotá, Colombia .......................... 356

Images en biomedicine

Type 3 virus neuropathological findings in two human rabies cases in Bajo Baudó,Chocó .................................................................................................................................................. 237

A quantitative method for analysing neuron networks marked by acetylcholinesterasehistochemistry ..................................................................................................................................... 345

Case presentation

The ‘bull’s eye’ pattern in hepatic tomography ................................................................................... 7

Idiopathic hypertrophic cranial pachymeningitis ............................................................................... 125

Necrotizing fasciitis in an immunocompetent patient caused by Apophysomyces elegans,a mold of the Mucoracea family ......................................................................................................... 239

Paradoxical appearance of encephalic tuberculomas during treatment for tuberculosis inimmunocompetent patients ................................................................................................................ S34

Conidiobolomycosis: a case report with histophathologic findings .................................................. 350

Continuing education

Make your own diagnosis, first part .................................................................................................... 123

Make your own diagnosis, second part ............................................................................................. 204

Original articles

Absence of asymptomatic malaria in schoolchildren of Quibdó, Chocó .......................................... 13

Evolutionary and geographic origins of human lymphotropic virus in Colombia detected byRFLP polymorphisms ......................................................................................................................... 20

Efficacy of ivermectin in the treatment of children parasitized by Strongyloides stercoralis ............ 33

Toxicological and immunological aspects of scorpion (Tytius pachyurus) venom: neutralizingcapacity of antivenoms produced in Latin America ........................................................................... 42

471

Polymorphismsof APO-E in Colombian women with osteoporosis: correlation among clinicaland social risk variables ..................................................................................................................... 50

Validation of the Diagnostic Interview for Genetic Studies (DIGS) in Colombia .............................. 56

Effect of rabies virus infection on the expression of parvalbumin, calbindin and calretininin mouse cerebral cortex .................................................................................................................... 63

Gametocyte levels in response to differing malaria treatments in two municipalities ofColombia ............................................................................................................................................. 79

Presence of Salmonella as a risk to public health in the Caribbean zone of Colombia .................. 89

Relapses after multibacillary leprosy treatment ................................................................................. 133

Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in rheumatoid arthritis: relation with clinicalfeatures, cytokines and HLA-DRB1 ................................................................................................... 140

Genetic susceptibility and risk of gastric cancer in a human population of Cauca, Colombia ........ 153

Epstein-Barr virus presence in Colombian Hodgkin lymphoma cases and its relation totreatment response ............................................................................................................................. 163

Incomplete surveillance of a Dengue-2 epidemic in Ibagué, Colombia, 1995-1997 ...................... 174

Degeneration of primary afferent terminals following brachial plexus extensive avulsioninjury in rats ......................................................................................................................................... 183

Molecular epidemiology of nosocomial infection by extended-spectrum beta-lactamasesproducing Klebsiella pneumoniae ..................................................................................................... 252

Expression and activity of possible polymorphisms from healthy humans in the 67-kd proteinof the NADPH oxidase system using the COSphox system .............................................................. 262

Effectiveness of treatments for hypertension in a sample of Colombian patients ............................ 273

Molecular and biological characterization of the CIBMUQ/HDC strain, a Colombian referencestrain for Toxoplasma gondii ............................................................................................................... 282

Polymorphism of TNF-α in autoimmunity and tuberculosis ............................................................... S43

Five year experience with thin layer agar medium for rapid diagnosis of tuberculosis ................... S52

Distribution of PRA patterns of clinical isolates of the Mycobacterium avium complex fromSpain and South America ................................................................................................................... S60

Surgical treatment of multiresistant lung tuberculosis ....................................................................... S65

Initial drug resistance as a threat for tuberculosis control: the case of Buenaventura,Colombia ............................................................................................................................................. S73

Surveillance of resistance of Mycobacterium tuberculosis to anti-TB drugs in Cuba,1995-1998 ........................................................................................................................................... S80

In vitro susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex strains isolated fromseals to antituberculous drugs ........................................................................................................... S85

Tuberculosis in the San José University Hospital in Popayán, Colombia, 1998-2000 .................... S92

Situation of tuberculosis in Colombia, 2002 ...................................................................................... S102

Trends of tuberculosis related mortality and hospital discharges before and after theimplementation of the health sector reform, Colombia, 1985-1999 ................................................. S11

Respiratory symptomatic prevalence, infection and tuberculosis disease and associatedfactors: population-based study ......................................................................................................... S124

Overview of the HIV/tuberculosis coinfection in Bogotá, Colombia, 2001 ....................................... S132

Effects of the health sector reform upon tuberculosis control interventions in Valle delCauca, Colombia ................................................................................................................................ S138

Impact of cardiovascular illness on hospitalization costs in patients with rheumatoid arthritis ....... 366

Frequency of intestinal microsporidian infections in HIV-positive patients, as diagnosisby quick hot Gram chromothrope staining and PCR ......................................................................... 375

472

Life cycle of Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) under uncontrolled conditions ....... 385

Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime® and Pentostam®) in anAmerican cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application .................................. 393

Protein malnutrition up-regulates growth hormone receptor expression in rat splenicB lymphocytes ..................................................................................................................................... 403

Brief communication

Differentiation of an adult neuron cell line increases susceptibility to rabies infection ................... 97

Development and evaluation of a PCR method for diagnosis of Salmonella enteric fever,based on DNA sequences of the hilA gene ....................................................................................... 194

Chromosomal localization of the KMP-11 genes in the KP1(+) and KP1(-) strains ofTrypanosoma rangeli .......................................................................................................................... 200

Evidence of exposure to Leptospira in stray dogs in Cali ................................................................. 291

Molecular surveillance of invasive penicillin resistant Streptococcus pneumoniae Colombianisolates recovered from children less than 5 years of age ................................................................ 296

Effect of lipopolysaccharides on human dentritic cell cultures and its inhibition bypolymyxin B ......................................................................................................................................... 413

Topic review

Genetics of preeclampsia: an approach to genetic linkage studies ................................................. 207

Role of Langerhans cells in the immunity of leishmaniasis .............................................................. 302

Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis anddrug-resistant tuberculosis ................................................................................................................. S149

Gene inactivation in Mycobacterium tuberculosis and its use in tuberculosis control andprevention ........................................................................................................................................... S165

Molecular epidemiology of tuberculosis: methodology and applications ......................................... S188

New tools for detection of latent tuberculosis .................................................................................... S202

Management of TB suspected cases of drug resistant tuberculosis requiring a secondtreatment ............................................................................................................................................. S212

Perspectives for new anti-tuberculous vaccines in the post-genomic era ....................................... S228

Combination therapy as a strategy to prevent antimalarial drug resistance .................................... 423

Genetic manipulation of the protozoan parasite Leishmania ........................................................... 438

Comentary

The other face of Janus ...................................................................................................................... S163

Technical note

Comparison of the immunofluorescent antibody (IFAT) and ELISA tests and the comercial ...........

Chagatek® test for detection of anti-Trypanosoma cruzi antibody ................................................... 104

Development of a record-keeping strategy for improvement of information retention inmicrobiological processing ................................................................................................................. 318

Cryptococcus spp. DNA extraction from environmental simples ...................................................... 324

Primary cultures of human vein endothelial cells: a biological model for studyingenterococcal infection mechanisms ................................................................................................... 456

473

Lista de evaluadores, 2004

El Comité Editorial desea expresar sus agradecimientos a todas las personas que nos colaboraronen la evaluación de los manuscritos sometidos para publicación en la revista Biomédica. Hacemospública nuestra gratitud y, en reconocimiento de su labor, nos permitimos publicar sus nombresen el último número de cada volumen.

Agudelo CarlosAgudelo Clara InésAguirre Camilo A.Alvis NelsonAnaya Juan ManuelArango Juan C.Arango MyrthaAraujo MarceloArbeláez María PatriciaArchila PauloArdila EnriqueAristiz DagnovarArteaga Herman J.

Balaguera HenryBayona JaimeBejarano María TeresaBeltrán MauricioBermúdez AntonioBlair SilviaBotero DavidBotero Jorge H.Botero PatriciaBrandileone María CristinaBravo María MercedesBrennan PatrickBrochero Helena

Cabello FelipeCarrasco StellaChaparro OrlandoClark GaryCollazos ConstanzaCorrea GonzaloCortés Esperanza

De la Hoz FernandoDel Corral ElenaDel Portillo PatriciaDíaz María LiliaDíaz-Granados Jesús

Echandía CarlosEslava Juan C.

Ferro María CristinaFlórez Astrid CarolinaFranco Marcelo

Galas MarceloGallego Juan F.García Luis FernandoGiraldo AlejandroGómez AlbertoGómez ArleyGómez CarlosGómez EfraínGómez Luis AlbertoGómez Rosa M.González GerardoGonzález John MarioGonzález JorgeGroot HernandoGuerrero Martha IníridaGuhl FelipeGutiérrez OscarGuzmán Renato

Hasbon ManzourHerdal EinarHortal María

Iglesias Antonio

Jaramillo ErnestoJiménez Beatriz

Kroeger Axel

Laszlo AdalbertoLeón Clara InésLeón-Sarmiento FidiasLorenzana PabloLuna Andrea

Maldonado HéctorMcEwen JuanMcMurray DavidMéndez JairoMogollón JoséMoncada Ligia InésMoncayo ÁlvaroMontoya JamesMontoya RobertoMoreno ErnestoMoreno JaimeMuñoz NélidaMuskus Carlos

Ocampo ClaraOchoa María TeresaOtero Rafael

Padilla Julio CésarPalma GloriaParra BeatrizParra CarlosParra Gabriel JaimePineda DanielPortillo PatriciaPosso HéctorPrieto FranklinPuccia RosanaPuerta Concepción

Quiñónez Martha

Radicce MarcelaRamírez JaimeRamón PilarRenza MarthaRestrepo ÁngelaRestrepo BlancaRestrepo MarcosReyes PatriciaRitacco VivianaRobledo JaimeRodríguez GerzaínRodríguez JairoRojas CarlosRomán GustavoRugeles María Teresa

Saavedra CarlosSalcedo EnriqueSánchez Gloria InésSánchez RicardoSaravia NancySarmiento Carlos A.Sarmiento Wilson J.Serrano NormaSiachoque HebertSierra EduardoSouza ValeriaSueli Maria

Takiff Howard

474

Talamás PatriciaTenorio AlfonsoTesh RobertTobón AlbertoTobón ÁngelaTorres Carlos A.Torres OrlandoTovar JairoTriana Omar

Valbuena GustavoValderrama RafaelVallejo GustavoVanegas NatashaVargas ManuelVatta MatteoVelandia Martha P.Velasco AndrésVélez Iván Darío

Vélez SebastiánVictoria JorgeVillar Luis ÁngelVillaveces José LuisVillegas María Virginia

Wasserman Moisés

Zambrano María MercedesZarante Ignacio

475

Instrucciones para los autores

Biomédica es la revista del Instituto Nacional deSalud de Colombia cuyo fin primordial es ladifusión de trabajos originales que contribuyan aampliar los conocimientos en biomedicina.

Información general

Biomédica publicará trabajos científicos, escritosen español o en inglés, en las siguientes categorías:

Artículo original: trabajo inédito derivado de unainvestigación biomédica que aporta informaciónnueva sobre aspectos específicos y contribuye demanera relevante al conocimiento científico.

Comunicación breve: es el informe de resultadosparciales o finales de una investigación cuyadivulgación rápida es de gran importancia o cuyocontenido no satisface los requisitos paraconsiderarlo como un artículo original.

Nota técnica: describe en detalle una técnica delaboratorio novedosa o modificaciones realizadasa una técnica ya establecida, enfatizando lasventajas que tiene el procedimiento o la innovacióndesarrollados.

Ensayo: es un manuscrito filosófico, literario ocientífico que presenta la opinión sustentada delautor sobre un tema específico o de actualidad.

Comentario: manuscrito sobre un artículopublicado en la revista.

Reseña histórica: es un manuscrito que destacapersonajes o sucesos y su contribución aldesarrollo de las ciencias biomédicas.

Revisión de tema: presenta el estado actual delconocimiento sobre un tema; incluye doscategorías:

· solicitado directamente por el Comité Editoriala personas expertas en el tema;

· presentado por profesionales interesados enun tema particular; en este caso, se debeenviar una propuesta en la que se indiqueporqué el tema escogido es pertinente paralos lectores de Biomédica, el cual debe incluir

una breve descripción del contenido, algunasreferencias claves, su probable extensión y elnúmero aproximado de ilustraciones.

· La revisión debe incluir un resumen con énfasisen el significado de los hallazgos recientes, unaintroducción al tema señalando hitos pasadosy desarrollos presentes, y los encabezamientosdel texto con el objeto de hacer más provechosasu lectura. La revisión debe incluir un análisisrítico de la literatura y datos propios de losautores. El desarrollo del tema queda adiscreción del autor pero se aconseja queincluya tablas, esquemas y figuras que haganágil el texto y ofrezcan una comprensión másrápida de su contenido.

Imágenes en biomedicina: es un trabajoilustrado con fotografías que muestran y explicande manera didáctica un concepto, una estructura,una enfermedad o un diagnóstico biomédico. Debeincluir un comentario corto que resalte laimportancia del tema ilustrado.

Haga usted el diagnóstico: pretende retar lacapacidad diagnóstica de los lectores, utilizandoilustraciones o fotografías de casos clínicos o dehallazgos microscópicos. Consta de dos partes,la presentación clínica y los hallazgos corres-pondientes y el diagnóstico correcto; este últimoaparece en página aparte y debe acompañarsede un comentario actualizado sobre la entidad quese pretende ilustrar.

Presentación de casos: son ejemplos de casosclínicos de enfermedades que destacan algunaparticularidad llamativa o señalan un hallazgo es-pecial de las mismas, con una revisión breve dela literatura pertinente.

Cartas al editor: los lectores pueden solicitaraclaraciones o presentar comentarios sobre elmaterial publicado en la revista. La decisión sobrela publicación de las cartas recibidas queda adiscreción del Comité Editorial.

Comentarios bibliográficos: son escritoscríticos breves sobre libros de biomedicina.

476

Todo material propuesto para publicación enBiomédica será revisado por el Comité Editorial yenviado para evaluación externa a dos evaluadoreso pares científicos; para facilitar este paso, losautores deben enviar el nombre y la dirección decuatro posibles evaluadores. Los editoresinformarán al autor principal que su trabajo ha sidorecibido; posteriormente, le harán llegar loscomentarios de los evaluadores y le harán conocerla decisión final sobre la publicación de sumanuscrito. Los autores deben incluir una cartaen la que expresen si existen conflictos de interéso si no los hay; de la misma forma, deben incluiruna nota sobre la fuente de financiación de lainvestigación adelantada.

La revista Biomédica se reserva el derecho deaceptar o rechazar los artículos y harásugerencias que tiendan a mejorar supresentación.

Una vez que el autor reciba los comentarios delos evaluadores, deberá proceder a contestarlospunto por punto y a incorporar las modificacionescorrespondientes en el texto. Si en el transcursode las 6 semanas siguientes, Biomédica no harecibido las respuestas de las evaluaciones, seretirará el manuscrito.

Los originales de los artículos aceptados parapublicación permanecerán en los archivos de larevista hasta por un año.

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Una vez realizada la publicación, el autor princi-pal recibirá, libre de costo, 5 ejemplares de larevista.

El manuscrito debe incluir las siguientessecciones:

Hoja de presentación: además del título deltrabajo y del título corto para los encabezamientosde las páginas, esta sección debe incluir losnombres completos de los autores, su afiliación yel nombre de la institución donde se llevó a caboel trabajo. Además, se debe anotar el nombre delautor responsable de la correspondencia con sudirección completa, número telefónico y de fax ydirección electrónica.

Resúmenes y palabras clave: el trabajo debepresentar un resumen estructurado (objetivo,métodos, resultados y conclusión) en español yotro en inglés, cada uno de no más de 250palabras. No se permite el uso de referencias nise recomienda la inclusión de siglas o acrónimos.Se requiere listar de 6 a 10 palabras clave en cadaidioma; consulte los Descriptores en Ciencias dela Salud (DeCS) del índice de la LiteraturaLatinoamericana y del Caribe en Ciencias de laSalud (LILACS) en la última versión publicada endisco compacto o en http://decs.bvs.br; paraverificar las de inglés, consulte los Medical SubjectHeadings (MeSH) del Index Medicus en http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.htm.

Texto: todo el manuscrito, incluso la página deltítulo, los resúmenes, las referencias, los cuadrosy las leyendas de figuras y cuadros, debe estarescrito a doble espacio, por un solo lado de lahoja, sin dejar espacios extras entre párrafo ypárrafo; deje un solo espacio después del puntoseguido o aparte. Use la fuente Arial de tamaño12 y no justifique el texto. Use letra bastardilla ocursiva para los términos científicos, por favor, nolos subraye.

Información general sobre los manuscritos

Preparación del manuscrito

Por favor, cíñase a las indicaciones del Interna-tional Committee of Medical Journal Editors quese encuentran publicadas como "Uniform require-ments for manuscripts submitted to biomedicaljournals" en Ann Intern Med 1997;126:36-47 o enhttp://www.icmje.org/index.html. La versión enespañol se puede consultar en el portal de larevista Acta Médica Colombiana (Acta MedColomb 1997;22:199-211) o en http://www.actamedica.com o en la RevistaPanamericana de Salud Pública (Rev PanamSalud Pública 2004;15:41-57).

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Formato electrónico: envíe el manuscrito enWord Perfect o MS Word como procesador depalabra.

Las gráficas elaboradas en PowerPoint, MS Wordo Word Perfect son de baja resolución; sirven parael proceso de impresión únicamente si sonimágenes de líneas, no tienen sombras, ni grisesni colores y se ha enviado una copia impresa enláser de alta calidad; por lo tanto, no incluya enformato electrónico este tipo de imágenes. Lasilustraciones se imprimen en una columna (75 mm)o en dos columnas (153 mm); por consiguiente,se deben enviar las ilustraciones del tamaño enque van a quedar impresas. Si las ilustracionesson en color y las remite en formato electrónico,se deben enviar en archivos CMYK en formato .eps(Encapsulated Postscript); la resolución óptimapara los archivos CMYK es de 300 dpi si la imagenno tiene texto incluido; si incluye texto, laresolución recomendada es de 600 dpi y si sonde blanco y negro, de 1.200 dpi. La fuente preferidapara las gráficas es Helvética. Si sus archivos sonde Macintosh, conviértalos a uno de los formatosmencionados. No olvide incluir una lista de losarchivos enviados y anotar el programa en quefueron hechos.

Referencias bibliográficas: por favor, observeestrictamente las indicaciones de los Requisitosuniformes para manuscritos del área biomédica.Asígnele un número a cada referencia citada deltexto, los cuadros y las figuras en ordenascendente. Anote los números de las referenciasentre paréntesis y no como índice (superscript).Las comunicaciones personales, los datos sinpublicar, los manuscritos en preparación osometidos para publicación y los resúmenes detrabajos presentados en congresos se deben citaren el cuerpo del artículo entre paréntesis. Consultela lista de publicaciones periódicas del IndexMedicus (http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html) para la abreviatura exacta de la revistacitada; si la revista no aparece, escriba el títulocompleto de la revista. Transcriba únicamente los

seis primeros autores del artículo, seguidos de etal. Se recomienda la inclusión de referenciasnacionales y latino-americanas para lo cual puedeconsultar Lilacs, Latindex, Sibra, el índice deColciencias y otras fuentes bibliográficaspertinentes.

Cuadros y figuras: elabore los cuadros usandoel programa del procesador de palabra queaparece como 'utilidad de cuadros'; absténgasede preparar archivos en columnas o tabulados enel texto mismo del manuscrito. Recuerde que debeenviar una página con los nombres de los archivos.Para las figuras (diagramas, dibujos o ilustraciones)en blanco y negro, envíe el original y dos copiasde la ilustración correspondiente. Si sonfotografías en blanco y negro, se deben enviar trescopias de excelente calidad; si son transparencias,envíe la diapositiva original y no una copia, juntocon dos impresiones en papel (fotocopia o porescáner) de la misma imagen para facilitar el envíode este material a los evaluadores del manuscrito.En las preparaciones de microscopio, recuerdeque debe mencionar la coloración y el aumentosegún el objetivo utilizado, pero no incluya el valordel ocular.

Remisión del manuscrito

El manuscrito debe ser remitido con una cartafirmada por todos los autores en la que consteque todos conocen y están de acuerdo con sucontenido. Se debe mencionar, igualmente, queel manuscrito no ha sido publicado anteriormenteni se ha sometido a publicación en otra revista. Eldocumento original y las dos copias exigidas debenser remitidos a los editores a la siguiente dirección:

Revista BiomédicaInstituto Nacional de SaludAvenida Calle 26 No.51-60Bogotá, D.C., Zona 6, Colombia, S.A.oApartado aéreo 80334 u 80080Bogotá, D.C., Zona 6, Colombia, S.A.

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BIOMEDICALista de verificación

Con el fin de comprobar que se hayan cumplido todas las instrucciones correspondientes a las normasde publicación de la revista Biomédica, le solicitamos que nos devuelva debidamente diligenciado estalista de verificación junto con su artículo.

1- Presentación:

· Texto escrito a doble espacio en fuente Arialde 12 puntos de tamaño, en una sola cara dehojas tamaño carta

· Páginas numeradas consecutivamente

· Se remiten 3 copias impresas del artículo yuna en disquete de 3 1/2 y se especifican losprogramas utilizados y las versiones, ademásde los nombres de archivo.

2- Título:

· Se incluye el título en español e inglés (máximo165 caracteres).

· Se incluye el título abreviado en español(máximo 50 caracteres).

· Los autores aparecen sólo con su afiliacióninstitucional, sin mencionar cargos ni títulosacadémicos.

3- Resumen:

· Se incluye el resumen estructurado en españole inglés, con una extensión máxima de 250palabras.

4- Palabras clave: (de 6 a 10 por artículo encada idioma)

· Se incluyen las palabras clave en español einglés (key words).

5- Estructura del artículo original:

Se incluyen los siguientes apartados:

· Introducción

· Materiales y métodos

· Resultados

· Discusión

· Agradecimientos

· Referencias

6- Figuras:

· Se incluye cada una en página aparte.

· Se incluyen las leyendas correspondientes enhoja aparte.

7- Cuadros:

· Se adjuntan en hoja aparte, elaborados en elmodelo más sencillo de tablas del programaWord y las copias en impresora láser.

· Se ordenan secuencialmente.

· Se incluye el título correspondiente.

8- Fotografías:

· Se adjuntan tres copias.

· Se señala la identificación de la misma y laorientación al respaldo.

· Se acompañan del correspondiente pie de fotoen hoja aparte.

9- Referencias:

· Las citas se numeran según orden de apariciónen el texto.

· Se han seguido las normas de Biomédica delas instrucciones a los autores

10-Abreviaturas:

· Se anota entre paréntesis después de laprimera vez cuando debe aparecer en formacompleta y en el idioma original.

11-Nomenclatura:

· Los nombres de género y especie estánescritos en letra cursiva.

· Los nombres de microorganismos se escribencompletos la primera vez que se citan, inclusoen el título y en el resumen, y luego se usa lasolamente inicial del género y permanece elnombre completo de la familia.

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