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Tesis de Posgrado

Caracterización del proceso deCaracterización del proceso dedegradación de tejidos larvalesdegradación de tejidos larvalesdurante la metamorfosis en ladurante la metamorfosis en la

Mosca del Mediterráneo, CeratitisMosca del Mediterráneo, CeratitisCapitata (Wiedemann)Capitata (Wiedemann)

Rabossi, Alejandro

2000

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Rabossi, Alejandro. (2000). Caracterización del proceso de degradación de tejidos larvalesdurante la metamorfosis en la Mosca del Mediterráneo, Ceratitis Capitata (Wiedemann).Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3320_Rabossi.pdf

Cita tipo Chicago:Rabossi, Alejandro. "Caracterización del proceso de degradación de tejidos larvales durante lametamorfosis en la Mosca del Mediterráneo, Ceratitis Capitata (Wiedemann)". Tesis de Doctor.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2000.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3320_Rabossi.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRESFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

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Caracterización del proceso de degradación de tejidoslarvales durante la metamorfosis en la Mosca del

Mediterráneo, Ceratitis capitata (Wiedemann)

Autor: Alejandro Rabossí

Director: Dr. Luis A. Quesada-Allué

Lugar de Trabajo: Instituto de Investigaciones Bioquímicas,Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-UBA

Tesis presentada para optar al Título de Doctor de laUniversidad de Buenos Aires

¿‘- Año2000l

Resumen

Caracterización del proceso de degradación de teiidos larvales durante la

metamorfosis en la mosca del Mediterráneol Ceratitis cagitata (Eiedemann)

Se han estudiado en detalle, por primera vez, los eventos moleculares más importantes

responsables de la histolisis de tejidos larvales durante la transición larva-adulto de

dípteros. Se han descrípto, por primera vez en los insectos, proteínasas lisosomales

específicas de la histolisis y se ha correlacionado su actividad con la de otras enzimas

degradativas y con las imágenes de cambios anatómicos degenerativos en músculos y

cuerpo graso. Los principales resultados obtenidos son:

l. Se aisló una nueva aspartil-proteínasa de 43.000 daltons, específica de la

histolisis, denominada EMAP (Early metamorphosis aspartyl proteinase), con

características bioquímicas similares al grupo de las Catepsinas tipo D y cuya

secuencia amino terminal no presentó homología con este grupo. Usando la

secuencia correspondiente al N- terminal se obtuvo un transcripto que fue

clonado y secuenciado. La secuencia obtenida mostró homología del 59% con

catepsina D de porcino, 51% con una proteinasa aspártica de mosquito y 60%

con una proteinasa aspártica de arroz.

Se aislaron dos nuevas cisteín proteínasas lisosomales denominadas MCP I y

MCPII (metamorphosis cystein proteinase), de 32.000 y 67.000 daltons

respectivamente. Ambas enzimas fueron caracterizadas bioquímicamente y sus

extremos amino terminales secuenciados. MCP I mostró características

bioquímicas similares y alta homología N-tenninal con las Catepsinas B de

mamíferos (55.5%) y con una cisteín proteinasa de la mosca Sarcophaga (44%).

MCP II es una endoproteinasa de nuevo tipo, cuyo N-terminal no presentó

homología con ninguna cisteín proteinasa conocida en invenebrados, ni tampoco

en vertebrados.

El perfil de actividad de las nuevas endopeptidasas coincidió con el de fosfatasa

ácida, B-glucosidasa y B-galactosidasa lisosomales y correlacionó estrechamente

con un marcado descenso en el contenido de proteínas registrado durante las

etapas tempranas de la metamorfosis.

El incremento en la actividad de enzimas lisosomales coincidió temporalmente

(entre 20E y 48 h desde la inmovilización definitiva de la larva) con la aparición

de los primeros signos de muerte celular en los músculos y el cuerpo graso.

Es la primera vez que se describe en insectos el progreso temporal de la

hístolisis del cuerpo graso larva]. Se determinó que la degradación de éste es un

proceso gradual, que se inicia a las 2059h cuando las células que forman una red

se separan unas de otras y finaliza alrededor de las 120 h cuando gran parte de

las mismas se han fragmentado.

Se determinó que los músculos esqueléticos correspondientes a los segmentos

anteriores (l a 5) se fragrnentan a partir de las 22 h, mientras que los

correspondientes a la región abdominal, lo hacen recién a partir de las 72 h.

Se encontró una estrecha correlación entre la degradación del cuerpo graso

larval y la depleción en el contenido de las principales moléculas de reserva.

Cortes histológicos de cuerpo graso teñidos por PAS demostraron la completa

desaparición del glucógeno en horarios posteriores a las 20g) h. El glucógeno fue

consumido principalmente durante la etapa de salto y dispersión de la larva,

mientras que el remanente (14% del contenido original, de acuerdo a dosaje

directo) se consumió durante las primeras 203-Qh después de iniciada la

metamorfosis. Los lípidos se consumieron principalmente a partir del estadio

pupal (40 h), confirmando las imagenes histológicas obtenidas, donde se registró

la disminución en el número y tamaño de las vesículas de grasa a partir de este

horario

Los resultados alcanzados han permitido obtener un panorama integral de la progresión

de eventos degradativos durante la transición larva-adulto y mostraron por primera vez,

que con muy pequeñas variantes. los eventos de la metamorfosis tienen idéntica duración

relativa y representan etapas equivalentes del ciclo de vida en todos los insectos dípteros.

Palabras clave: Ceratitis capitata, insecto, metamorfosis, hístolisis larval, cuerpo graso,

cisteín proteinasa. aspartil proteinasa.

Abstract

Characterization of the larval tissue degradation process during the metamorphosis

of the Medflv, Cerarítis cagitata (Wiedemannl.

We have studied in detail for the first time the most important molecular events involved

in larval tissue degradation during dipteran larva to pupa transition. We have described

for the first time in insect, specific lysosomal proteinases of the hystolitic process. We

have also correlated these activities with other degradative enzymes and with the

anatomic changes in muscles and fat body registered during metamorphosís.

The most important results obtained are:

l. We isolated a novel aspartíc proteinase with a relative molecular weight of

43,000, called Early Metamorphosis Aspartic Proteinase, that is specific of

hystolisis. EMAP presented similar biochemícal characteristics to the Cathepsin D

group, but the amino terminal sequence did not present homology with this group.

Using the sequence corresponding to the N-terminal, we obtained a transcript

which was cloned and sequenced. The sequence obtained showed a 59%

homology to pork Cathepsin D, 51% to a mosquito aspartíc proteinase and 60% to

a rice aspartíc proteinase.

We isolated two novel lysosomal cysteine proteinases denominated MCP I and

MCP II (Metamorphosis Cysteíne Proteinases), with 32,000 and 67,000 daltons

respectively. The biochemícal characterization of the enzymes and the amino

terminal sequences were obtained. MCP I showed similar biochemícal

characteristics and high homology in the N-termínal sequence with mammalian

Cathepsin B group (55.5%) and with the fly Sarcophaga cystein proteinase

(44%).

MCP ll is a novel endopeptidase with an N-terminal sequence which neither

presented homology with any cysteine proteinase of invertebrate nor with

vertebrate.

The novel endopeptidase activity profile during metamorphosis was coincident

and correlated well with the acid phosphatase, B-glucosidase and B-galactosidase

activities profiles. Endopeptidase profile activity also correlated with the decrease

in the amount of proteins registered during pre-pupal and pupal stages.

The increment in lysosomal enzymes activities observed (from 2039 h to 48 h),

were coincident with the appearance of the first symptoms of cell death in

muscles and fat body.

4. As far as we know, this is the first time that larval fat body histolytic process was

described in insect. lt was determined that this is a gradual process, that begins at

ZOE h when larval fat body cells dissociate from the typical mesh structure and

ends 120 h after when most of the cells are fragmented.

Larval muscles from 1Slto 5lhsegment were fragmented 22 h from the beginning

of metamorphosis. Muscles from the abdominal region fragmented since 72 h.

5. Temporal larval fat body degradation agreed well with the depletion of storage

molecules. PAS histologic stain demonstrated the complete dísappearance of

glycogen in samples later than ZOE h. While the glycogen content decreased

during larva III jumpíng and dispersa] stage, the remaining 14 % remanent

glycogen disappeared during the first 20E h since the beginning of

metamorphosis.

Lipids were degradated since the beginning of the pupal stage (40 h), confirrning

the histologic images obtained, where a decrease in the number and size of lipids

vesicles were registered since 40 h.

The results reached in this Thesis have allowed us to obtain a complete view of the

degradation events during larva-adult transition and showed for the first time, that with

very little variations, the metamorphosis events have an ¡dentical relative duration and

represent equivalent stages of the life cycle in all the dipteran insects.

Key words: Ceralitis cupitata, insect metamorphosis, larva] hystolisis, fat body, cysteine

proteinase, aspartic proteinase

a Sandra, Dante y Luciano

a mispadres

a Roberto Couso

Agradecimientos

Al Dr Luis Quesada-Allué, Director de esta Tesis, por todo su apoyo enestos años y por la confianza que depositó en mí.

Al Consejo Directivo del Instituto de Investigaciones Bioquímicas"Fundación Campomar", por haberme permitido realizar este trabajo deTesis en sus instalaciones.

Al Consejo de Investigaciones Científicas y Técnicas por haberme otorgadolas becas que me permitieron realizar esta tesis.

A Fanny Manso por su constante disposición para ayudarme, por su estímuloy cariño.

A Marta Grinfeld por toda su desinteresada y enorme colaboración.

Al Dr. Turk y la Dra. Stoka por su hospitalidad y apoyo durante mi estadíaen el Instituto J. Stephan, Universidad de Lujbliana, Lujbliana, Eslovenia.

A P. Wappner y G. L. Bocaccio por los lindos años compartidos en estelaboratorio

A mis queridos amigos y compañeros del lab, Ariane Sonvico, DianaTolmasky, Martín Pérez y Lazaro Centanín, por todas las que pasamos.

A mis amigos Eduardo Cafferata, Fabián Leiman y Martín Radrizzani

Al personal técnico y administrativo del Instituto por su valiosacolaboración.

A mi familia por bancanne en todas.

Indice

IntroducciónA­

B­

E­

La metamorfosis en los insectos

El desarrollo postembrionario de los insectos es regulado por hormonasPrincipales eventos durante la metamorfosis de los insectos holometábolosLa muerte celular como parte normal del desarrolloMuerte celular programada (MCP)NecrosisEnzimas participante en la MCPMuerte celular programada en insectosa- MCP durante la embriogénesisb- MCP durante la metamorfosisLa mosca del Mediterráneo Ceratitis capitata (Wiedemann)Caracteristicas generales de C. capitataEl ciclo de vída de C. capitataObjetivos generales de esta Tesis

Materiales y Métodos1)

2)3)4)5)

6)7)

8)9)

10)ll)

12)13)14)15)l6)17)18)19)20)

Cn'a en el laboratorio de la mosca del Mediterráneo

Sincronización de los cultivos (“Tiempo Cero”)MaterialesPreparación de los extractos enzimáticosDeterminación de los cambios en el peso de los insectos durante lametamorfosisDeterminación de la variación de proteínas totales durante la metamorfosisPurificación y cuantificación del contenido del glucógeno durante lametamorfosisEnsayos enzimáticosDeterminación del tiempo de precipitación en el ensayo de actividadproteolítica generalEnsayo de inhibición de la actividad proteolítica generalReactivos empleados para la caracterización de la actividad proteolíticageneralPrecipitación con sulfato de amonio de los extractos totales de moscaAislamiento de las proteinasas involucradas en la histolisisColumna de afinidad: Concanavalina A-SepharosaColumna de afinidad: Pepstatina A-SepharosaEnsayos de actividad proteolítica empleados durante la purificaciónElectroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantesElectroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no disociantesElectrotransferencía a membranas de nitrocelulosaDetección de glicoproteínas por la técnica de “affinoblotting”

NMN'—‘

1214l41625262735

36383839

4040

4041

4545

46464749495051

515252

21) Determinación del punto isoelectrico22) Preparación de antisueros anti-EMAP, anti-MCPI y anti-MCPII23) Aislamiento de RNA total y mensajero24) Síntesis de cDNA25) Reacción de polimerizacíón en cadena mediante la Taq polimerasa (PCR)26) Elución del DNA proveniente de geles de agarosa27) Clonado de los productos de PCR en Vector T28) Bacterias, medios de cultivo y antibióticos29) Purificación de plásmidos de cultivos líquidos de E.coli30) Secuenciación directa del DNA y de los fragmentos clonados31) Análisis histológico

Resultados

Capítulo I: Análisis histológico del proceso de degradación de teiidoslarvales en la mosca del Mediterráneo

- Apolisis larval-pupal- Cuerpo graso- Hemocitos- Músculos

Capítulo II: Comparación de la metamorfosis en Ceratítís cagitatay Drosoghila melanogaster

- Ocurrencia de los principales eventos de la metamorfosis enC.capilata y D. melanogaster.

- Eventos moleculares tempranos en Ceratitis y Drosophila- Inferencia del momento de la metamorfosis en que se degradarían

los diferentes tejidos y órganos larvales en Ceratitis

Capítulo III: Variación de las principales reservas energéticas durantela metamorfosis

- Variaciones del peso durante la metamorfosis.- Cambios en el contenido de lípidos totales durante la metamorfosis- Cambios en el contenido de proteínas totales durante la metamorfosis.- Cambios en el contenido de carbohidrátos durantes la metamorfosis.

Capítulo IV: Degradación de tejidos larvales en Ceratítís: caracterizaciónde la actividad lisosomal

- Vaciado e inactivación de las actividades degradativas intestinales durante lasúltimas horas del tercer estadio larval.

- Actividad lisosomal durante la metamorfosis de C. capitata.- Actividad general de endopeptidasas ácidas- La actividad proteolítica durante la metamorfosis de Ceratitis- El pH óptimo para la proteólisis de proteínas enteras cambia durante la

5354545656585859595960

61

6971728486

92

9397

102

104104105106109

115

115119120123

metamorfosis.- Caracterizacion preliminar de las actividades proteolítica detectadas en lamosca del Mediterráneo.- Identificación de las principales proteinasas que actúan durante lametamorfosis, mediante el uso de inhibidores de proteinasas.

Capítulo V: Purificación y caracterización de las cisteín proteinasasidentificadas durante la metamorfosis temprana de Ceratítis

- Purificación de las cisteín-proteinasas de extractos de 40 h- Características principales de las cisteín-proteinasas purificadas en Ceratitís- Antisueros contra MCPI y MCPII- Análisis de los extremos N-terminales de MCPI y MCPII- Comparación entre las propiedades de MCPI de Ceratitis, Catepsina B demamíferos y la cisteín-proteinasa de 29 KDa de Sarcophaga

Capítulo VI: Purificación de la aspartil-proteinasa identificadadurante la metamorfosis temprana de Ceratítís

- Purificación de la aspartil-proteinasa de Ceratitís- Características principales de la aspartil-proteinasa de Ceratiti's (EMAP)- Comparación entre las propiedades bioquímicas de EMAP de Ceratitis,

y otras proteinasas aspárticas.- Detección de la actividad de aspanil-proteinasa en geles de poliacrilamidanativos.

Capítulo VII: Análisis de las secuencias codificantes de los genes de lasWWWde muerte celular en C. cagítata

-Comparación de la secuencia N-terminal deMCP I y MCP II de C.capítatacon otras de vertebrados e invertebrados- Comparación de la secuencia N-terminal EMAP de Ccapitata con otras devertebrados e invertebrados

-Activadores de la muerte celular en Ceratítis

Discusión y Conclusiones generales

Referencias

124

126

130

135137145152153

153

157159162

172

173

178

18l186

190

Abreviaturas

Axxx

ADN

ARN

BSA

CBB

Con A

DOC

E-64

EDTA

FPLC

Gno

HepesKDa

MC

MCP

PAGE

PAS

Phe

PMSF

SDS

SDS-PAGE

TBS

Tn's

absorbancia a xxx nm

ácido desoxirribonucleico

ácido ribonucleico

seroalbúmina bovina

Coomassie Bn'llant Blue

Concanavalina A

deoxicolato de sodio

l-trans-epoxisuccinil-leuci' "J -(4-Ü Wim)­

butano, N-[N-(L-3-transcarboxirano-Z-carbonil)-l­

leucyl]-agmatinaácido diamino-etilén-tetraacético

cromatografia líquida y rápida de proteínas

glucógeno

ácidoN-Z-hidroxi-etil-piperazin-N'-2-etanosulfónicoküodahons

muerte celular

muerte celular programada

electroforesis en geles de poliacrilamida

tinción de ácido peryódico-reactivo de Schifffenantrolina

fluoruro de fenil-metilsulfonilo

dodecilsulfato de sodio

electroforesis denaturalizante en geles de poliacrilamida

solución tampón 50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl

Tri(hidroximetil)-aminometano

INTR01)UCCIÓN

A-La metamorfosis en los insectos

El caracter extracelular y la naturaleza relativamente rígida de la cutícula

(exoesqueleto) ofrecen una limitación al tamaño y la forrna en los insectos. Por lo tanto,

el crecimiento en este grupo se produce en forma discontinua e implica el reemplazo

periódico de la cutícula por una más grande, a través del proceso que se denomina

muda.

Uno de los rasgos característicos de los insectos es el hecho de que siempre

emergen del huevo, donde desarrollan su periodo embrionario, en una condición

morfologicamente distinta a la del adulto. Para alcanzar esta última etapa del desarrollo

deben generar cambios de forma que en su conjunto se denominan metamorfosis. Estos

cambios de forma, generalmente, están acompañados de cambios fisiológicos y

bioquímicos muy importantes.

De acuerdo al grado o profundidad de los cambios que sufren los insectos

durante el desarrollo postembn'onan'o, se los ha clasificado en cuatro grupos principales

(Figura l):

a- Carentes de metamorfosis: se incluye en este grupo a los insectos Apterigotas y

Exopten'gotas ápteros (entre ellos, los que pertenecen a los ordenes Malófaga,

Sífunculada y Embióptera hembras) donde los insectos emergen del huevo en un estado

que difiere del ¡mago sólo en la falta de desarrollo de los órganos reproductores, de la

genitalia externa y de la segmentación de las antenas y cercos.

b- Metamorfosis simple o directa o incompleta: incluye a los Exopten'gotas

hemimetábolos (de los ordenes Grilloblatoidea, Ortóptera, Hemíptera, Dictióptera,

Isóptera, etc). Este grupo se caracteriza por una adquisición progresiva de los caracteres

del adulto. Las fases inmaduras, llamadas ninfas, presentan una anatomía parecida a la

del adulto, pero difieren primordialmente de estos por el tamaño y en el desarrollo

incompleto de las alas y la genitalia externa.

Generalmente, en el primer estadio ninfal no se distinguen los rudimentos de las

alas, posteriormente éstos se hacen visibles como esbozos alares, que aumentan

gradualmente de tamaño en cada muda.

Introducción

c- Metamorfosis completa o indirecta: incluye a los insectos holometábolos

Endopterigotas (por ejemplo: Coleóptera, Díptera, Lepidóptera, Hímenóptera,

Sifonáptera, etc). El ciclo de vida presenta una serie de estadios larvales, cuyas larvas

sucesivas se parecen mucho entre si, pero difieren completamente del adulto (Figura l).

Al último estadío larval le sigue un estadío estático llamado pupa, donde el insecto no

se alimenta, durante el cual se producen la mayoría de las transformaciones externas e

internas que conducen a la formación del adulto. A este último grupo, pertenece la

Mosca del Mediterráneo, Ceratítis capitata, que ha sido utilizada en esta Tesis

como modelo experimental para el estudio de la metamorfosis en general y del

proceso de histolisis de tejidos larvales en particular (se discute más adelante).

d- Hipermetamorfosis: incluye ciertas familias del orden Hímenóptera (especialmente a

aquellas especies que son parásitas de otros insectos), del orden Coleoptera (las familias

Carabidae y Staphylinidae) y del orden Díptera (familia Bombyliidae). En este grupo,

los insectos en desarrollo pasan por dos o varios estadios larvarios marcadamente

diferentes. Este proceso es acompañado usualmente por cambios notables en los hábitos

alimenticios y comportamentales.

El desarrollo postembrionarío de los insectos es regulado por hormonas

La muda de la cutícula involucra la sincronización de una serie de eventos

bioquímicos y moleculares merced a los cuales la vieja cutícula es parcialmente

degradada y desechada, sintetizándose una nueva cutícula. La coordinación de estos

eventos está regulada hormonalmente. La muda en los insectos se induce por un

aumento en la concentración circulante en hemolinfa de ecdisteroídes, dentro de los

cuales, en el caso de los dípteros, se considera que el más importante es 20-OH­

ecdisona, conocida como la principal hormona de la muda (Figura 2-A).

MOLTING

..d

EEG ADLLTS

INCOMPLETE METAMOHPHOSlS

W?__G

s.

COMPLETE NETAMOR PHOSIS

«’llL'Hlíïr'

Eric. bash'áE 4 'x ‘t W Fw» i " ‘ 'Aouu’

4. 1/,

' /‘ nncw-rai ' LaL—_____IWMA 1 LJFW'A FUP.‘ 1 , DUNA 3

Figura l: Principales formas en que se desarrollan los insectos. Tomado dePasteur (1994).

Introducción

Asi como la 20-OH-ecdisona es la que determina cuando va a mudar el insecto ,

existe otro grupo de hormonas, las hormonas juveniles que condicionan el tipo de

muda que se va a desencadenar (fig 2-B).

A

HO

Ecdysone I-l H Hy 20-0H Ecdysone OH H H- Makisterone A OH Me HO 20, 26-di-OH Ecdysone OH H OH

20-dooxy-mnkisterone A H Me H

HO

COOCH3

Figura 2: Estructura química de la ecdísona y sus derivados (A), entre ellos laprincipal honnona de la muda, 20-OH-ecdisona y de la hormona juvenil (B).Tomado de Ashbumer (1989)

En los insectos se demostró hace varios años que, cuando coinciden niveles altos

de ecdísona en hemolinfa, con niveles altos de hormona juvenil se produce la síntesis de

una nueva cutícula de tipo larva] y el animal permanece con los órganos larvarios,

Introducción

aumentando el tamaño celular. Pero si el máximo título de ecdisona se produce en

presencia de bajos niveles de hormona juvenil, se desencadenará el proceso de

metamorfosis, es decir de transición de larva a adulto y que entre otros eventos, en los

insectos holometábolos provoca la síntesis de sendas cutículas pupal y del adulto.bmw/WWComo se mencionó antes, la característica más importante del desarrollo de los

insectos holometábolos es que el genoma de un mismo individuo es capaz de dirigir la

existencia de dos sistemas anatómicos y funcionales completamente distintos, uno

larval, adaptado a la alimentación activa, y otro, correspondiente al imago, adaptado a la

locomoción; y en consecuencia, a la dispersión y la reproducción. Por lo tanto, el plan

general de organización corporal de una larva y un ¡mago difieren completamente,

y es durante la metamorfosis cuando se produce la reprogramación de la expresión

génica y la transformación de una forma en otra.

El aumento pronunciado del título de ecdisona hacia el final del último estadio

larval dispara la metamorfosis en la mayon’a de los insectos holometábolos; lo que, no

sólo lleva a la generación de una cutícula pupal, sino que además inicia la mayoría de

los programas y sub-programas que producen la transformación de la larva en adulto.

Los dipteros ciclorrafos, entre los que se encuentra la Mosca del Mediterráneo,

han desarrollado una adaptación única. Esta consiste en que la transformación larva­

adulto transcurre dentro de una envoltura (“sarcófago o cápsula”) que protege al insecto

durante ínmovilidad inherente a la metamorfosis. Esta envoltura protectora llamada

pupario es el producto de la transformación de la última cutícula larval, que es blanda y

flexible, en una estructura rígida (a través del proceso de esclerotización) y coloreada (a

través del concomitante proceso de tanificación). El programa que lleva a la formación

del pupario y que presenta a los procesos de esclerotización y tanifïcación como

subprogramas principales, se denomina pupariación. Por lo tanto, en los dipteros

ciclorráfos no se descarta la última cutícula larval, sino que ésta se mantiene,

modificada, hasta la emergencia del adulto.

Introducción

En el inten'or de este “cascarón” protector se produce la transformación de la

larva en adulto. Esta transformación se inicia con el proceso de pupación, que lleva ala

formación de la pupa e implica, entre otras cosas, un abrupto cambio en la forma del

individuo, pasando de una larva ápoda y acéfala a un individuo con cabeza y apéndices.

La formación de la pupa es un evento complejo que involucra a distintos

procesos como la síntesis y deposición de la cutícula pupal, e implica una gran

reorganización tisular. Esta reorganización tisular implica por un lado, la histolisis de

los tejidos larvales, es decir, la destrucción parcial o total de los órganos y tejidos

larvales que no son necesarios para el adulto, y por otro, la generación de los órganos y

tejidos del adulto que se denomina histogénesis.

La histolisis larval es un proceso fundamental en la metamorfosis que no sólo

pennite al individuo deshacerse de tejidos inútiles para el adulto, sino que además

provee el material para la construcción de los nuevos tejidos, ya que durante ésta etapa

del desamollo, los dípteros ciclorráfos no se alimentan. Si bien la degradación de

ciertos tejidos durante el desarrollo es un evento común dentro del reino animal (por

ejemplo la pérdida de la cola en los renacuajos, la desaparicón de tejido interdigital en

mamíferos, etc), la masividad con que se produce el proceso de histolisis larval en las

moscas ciclorráfas lo transforma en un ejemplo único. Practicamente todos los tejidos

larvales sufren este proceso de degradación, aunque la magnitud del mismo puede

variar desde la destrucción total hasta una pequeña remodelación. A modo de ejemplo

se puede citar que: los músculos esqueléticos, el intestino, el cuerpo graso y las

glándulas salivales se degradan totalmente; la glándula protorácica y el sistema nervioso

sufren una importante remodelación; la epidermis larval es reemplazada gradualmante;

etc. Curiosamente, a pesar su importancia, este proceso ha recibido una atención

discontinuada en el tiempo (se discute más adelante).

Durante la metamorfosis, las estructuras del adulto se generan a partir de grupos

de células que han permanecido sin diferenciarse durante los tres estadios larvales,

dividiendose muy poco. Las células a las que hacemos referencia, son los discos

imaginales y los histoblastos y, el proceso que lleva a la generación de los órganos y

tejidos del adulto a partir de los mismos, se denomina histogénesis. En la Figura 3, se

muestra, a modo de ejemplo para los dípteros en general, la localización de los discos

Introducción

imaginales en una larva madura de Drosoplu'la melanogaster (Figura 3, izquierda) y los

respectivos apéndices y tejidos que forman en la mosca adulta (Figura 3, derecha).

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‘n‘ \_/ "A ,¿J “ /=“r“ r‘r

Figura 3: Localización de los discos imaginales en la larva (izquierda) y de lasestructuras que éstos desarrollan en el adulto de Drosophila (derecha) (Tomadode Fristrom y Spieth, 1980).

B-La muerte celular como parte normal de desarrollo

El desarrollo y la homeostasis de la mayoría de los organismos plun'celulares es

críticamente dependiente de la división, la diferenciación y la muerte celular (White y

col, 1994). Si bien todas las células pueden morir por una gran variedad de eventos o

tratamientos nocivos (a este forma de muerte se la llama necrosis, ver más abajo), resulta

menos obvio que muchas células están determinadas al suicidio como resultado de un

Introducción

componente normal del desarrollo. Estas células sufren un proceso conocido como

muerte celular programada (MCP).

En los insectos, hay dos momentos del desarrollo en que se produce muerte

masiva de células, estos son, la embriogénesís y la metamorfosis

Muerte Celular Programada

El término muene celular programada (MCP) fue postulado en 1965 por Lockshín

y Williams para describir la muerte de determinados músculos larvales de las mariposas

luego de la emergencia del imago.

La MCP es inducida por señales fisiológicas como parte normal del desarrollo de

un organismo, y se refiere a la pérdida de células específicas de una manera predecible

tanto en una forma temporal como espacial.

La aparición o desaparición de una señal externa determina a las células a morir,

produciendo la activación del programa interno de muerte. Por si mismos, los factores

que disparan la muerte no son letales para las células. Por ejemplo, todas las células del

cuerpo de un renacuajo están expuestas al incremento de los niveles de la hormona

tiroidea; sin embargo, las células de cada tejido responden de una manera pre­

programada. Los primordios de las extremidades se diferencian para producir las patas,

mientras que las células musculares de la cola mueren.

Las células condenadas a sufrir MCP deben diferenciarse, en primer lugar, hasta

un estadio donde ellas resulten ser competentes para responder a la señal apropiada y

activar la maquinaria de muerte. Mediante el empleo de inhibidores de la síntesis de ARN

y proteínas se demostró hace varios años, que tanto en vertebrados como en

invertebrados, la MCP requiere de la expresión de nuevos genes.

La forma de muerte celular programada más estudiada hasta la actualidad es la

muerte por apoptosis. Esta ha sido descripta en una amplia variedad de sistemas

biológicos. Por ejemplo la muerte de los neutrófilos, la involución de células privadas de

los factores de crecimiento necesarios, la muerte de células durante el desarrollo

embrionario y postembrionario temprano, la eliminación de células autorreactivas, la

muerte de células que sirven como blanco para las células T, la muerte de las células

natural killer. etc.

Introducción

En todos los ejemplos citados anteriormente, la razón por la cual las células deben

morir es diferente, asi como tambien lo son los mecanismos que disparan la misma, pero

en todos los casos, los cambios morfológicos que acompañan la muerte celular son

similarres. Es decir, la muerte por apoptosis se caracteriza por una serie

estereotipada de alteraciones morfológicas y bioquímicas en su fase de ejecución

(Kerr, Curríe y Wyllíe (1972), lo que sugeriría la presencia de una maquinaria de

ejecución común en los diferentes tipos celulares.

La apoptosis se caracteriza por: (l) la condensación y fragmentación de la

cromatina nuclear; (2) compactación del citoplasma y organelas; (3) dilatación del

reticulo endoplásmico; (4) disminución del volumen celular por pérdida de agua y

condensación del citoplasma; (5) la membrana plasmática se arruga y emite prominencias

en un sentido más pronunciado que el que se observa durante la necrosis. Este fenómeno

se ha llamado zeiosis; (6) la ce'lula se rompe en cuerpos apoptóticos cerrados y con la

capacidad de mantener su gradiente osmótico; y (7) las alteraciones en la membrana

plasmática llevan al reconocimiento y fagocitosis de los cuerpos apoptóticos, lo que

previene el proceso de inflamación (Figura 4).

La característica más saliente del proceso de apoptosis son las alteraciones en el

material nuclear, que están asociadas con el clivaje intemucleosomal del ADN, y se lo

reconoce en geles convencionales de agarosa como "DNA ladder". Esta escalera de ADN

deriva de fragmentos grandes de ADN de 30-50 y de 200-300 Kbp.

En general se considera a la apoptosis como un sinónimo de muerte celular

programada, pero es conveniente mantener ambos conceptos bien diferenciados. En

vertebrados, la muerte celular es usual y hasta altamente predecible pero, por lo general,

no es programada en el sentido estricto de la palabra en comparación de cómo mueren las

celulas en los invertebrados. En éste último grupo se puede predecir con total precisión la

muerte programada de grupos de células y tejidos. Por ejemplo, en los insectos las

glándulas salivares siempre son destruidas al finalizar la etapa larval. En el gusano

nematode, Caenorhabdiris elegans, de las 1090 células somáticas en el adulto

hennafrodita, 131 sufren MCP en un momento muy preciso del desarrollo. En cambio en

los mamíferos, durante el desarrollo de las células B, 95 de cada 100 celulas mon'rá por

Introducción

diferentes razones (por ejemplo, falta de estimulación, etc), pero es imposible predecir a

priori cual de ellas morirá.

Figura 4: Secuencia de cambios ultraestructurales durante los procesos deapoptosis (derecha) y necrosis (izquierda). Tomado de Kerr y Harmon (1991).l- célula normal, 2- inicio de apoptosis, compactación y segregación de la cromatinacontra la envoltura nuclear, condensación del citoplasma, 3- fragmentación del núcleo yaparición de prominencias en la superficie celular, formación de cuerpos apoptóticos. 4­fagocitosis por células adyacentes, 5- necrosis, condensación de la cromatina enpequeños grupos, daño en organelas, aumento del volumen celular, 6- las membranas serompen y las células se disgregan.

Introducción

En la Tabla l, se comparan las principales caracteristicas que presentan la MCP

en sentido estricto, la apoptósis y la necrósis (esta última se define más abajo).

Características MCP Apoptosis Necrosis

morfología condensación de Condensación, lisiscélulas, fragmentaciónfragmentación

integridad de la persiste hasta persiste hasta desintregraciónmembrana estadios tardíos estadios tardíos tempranamitocondrias destrucción por no son afectadas Aumentan su

autofagocitosis volumen por entradade Ca2+

cromatina condensada, densa marginación picnosisal microscópio

autofagia común ausente ausente

fase oculta varias horas minutos a horas no hay

sintesis de nuevas si si noproteínasprimer síntoma descenso en la

síntesis de proteínasactivación deendonucleasa

desintegración de lamembrana

cambiosbioquímicos a nivelnuclear

no hay "laddering" "laddenng”(clivaje)intemucleosomal

degradación difusa

cambios aveces, incremento no hay aumento de ruptura debioquímicos a nivel de enzimas enzimas lisosomales lisosomas, nuncacitoplasmático lisososmales sintesiscausa hormonal desaparición de toxinas

ciertas hormonastróficas o estímulos

Tabla l: Comparación de las principales caracteristicas de la MCP, la apoptosis yla necrosis. Tomado de Locksihn y Zakeri (1991).

MSe refiere así a una serie de caracteristicas morfológicas que se observan

generalmente en células que mueren como consecuencia del efecto (o de la aplicación) de

un tratamiento o un compuesto nocivo, tal como isquemia, hipertemia sostenida o

traumas fisicos o quimicos (Cohen, 1993). Este tipo de muerte celular no se produce en

un contexto de desarrollo y no require de la expresión de nuevos mARNs o proteínas.

En forma general, la necrosis se inicia como consecuencia de un daño celular que

rompe el balance osmótico de la célula. Iones, en su mayoria Ca2+, entran en forma

pasiva a la célula, la cual se hincha por la entrada de agua que se produce como respuesta

al flujo iónico. El aumento en la concentración de Ca2+ actúa a su vez inhibiendo algunas

vias enzimáticas, como por ejemplo la producción de ATP, mientras estimula otras, como

la proteólisis (Schwartz y Osborne, 1993) (Tabla l). Si la célula no puede revertir estos

cambios catastróficos, irremediablemente muere (Figura 4). La muerte celular por

necrosis produce la liberación de componentes celulares que en los vertebrados llevan a

una respuesta inflamatoria, la cual provoca a su vez otros cambios secundarios (Schwartz

y Osborne, 1993).

Enzimas participantes en la MCP

Si bien, en los primeros estudios sobre MCP o apoptosis se puso especial énfasis

en el rol de las nucleasas como moléculas efectoras de la muerte, actualmente la atención

se ha centrado en el rol de diferentes proteinasas, como por ejemplo, las cisteín

proteinasas, las serín proteinasas, las calpaínas y los proteosomas.

En especial, hay un grupo de proteinasas quejugaría un rol crucial en la inducción

de la apoptosis, y que ha acaparado una gran atención en los últimos años. Este grupo se

conformó alrededor de la enzima convenidora de interleukina l-B (ICE), similar en

secuencia e identidad con la proteinasa CED-3 de Caenorhabdítís elegans. Desde 1993 se

han aislado otras nueve proteinasas de este tipo y se las ha llamado "caspasas", donde 'c'

denota que son cisteín proteinasas y 'aspasa' se refiere a la capacidad de estas enzimas

para clivar un residuo de ácido aspártico. En la Tabla 2 se presentan las caspasas

identitificadas hasta la actualidad. Los análisis filogenéticos revelaron que habria tres

subfamilias dentro de las caspasas: (l) la subfamilia de las ICE, que incluye a las

12

Introducción

caspasas -l, -4 y -5 y a la císteín-proteinasa CED-3/CPP32, (2) la subfamilia que

comprende a las caspasas -3, -6, -7, -8, -9 y -lO, y (3) la subfamilia formada por la

caspasa —2.

Caspasa Otros nombres Sitio activo Organismo Mr Obtencióncapasa - l ICE QACRG mamíferos (0) 30 kDa purif, clonadocaspasa - 2 Nedd2, ICH - l QACRG cerebro de ratón clonado por

y humano (l) sustraccióncaspasa - 3 CPP32, Yama, QACRG líneas celulares N32 clonado Est

apopaína, DCP-l de linfocitos (2) kDacaspasa - 4 ICE rel II, TX, QACRG mayoría de los clonado

[CH-2 tejidos

caspasa - 5 ICE rel III, TY QACRG idem 4 clonadocaspasa - 6 Mch 2 QACRG «34 clonado,

kDa expresadocaspasa - 7 McH3, ICE- QACRG 303 aa clonado

LAP3, CMH-l

caspasa - 8 MACH, FLIC, QACQG idem 4 clonadoMCHS

caspasa - 9 ICE-LAP6, QACGG idem 4 N46 clonadoMCHÓ kDa

caspasa- lO MCH4 QACQG ídem 4 N55 clonado EstkDa expresado

Tabla 2: Denominación y características de las caspasas conocidas (elaboraciónpropia). (0) localización:citoplasmática, Mr: peso molecular, (l) Nedd2 se expresaen altos niveles durante el desarrollo embrionario en varios tejidos, SNC, higadoriñón y pulmón. En especial, SNC y riñón sufren una gran MCP durante esta etapadel desarrollo. (2) es uno de las caspasas claves del proceso de apoptosis. Es laenzima responsable del clivaje de la proteína PARP poli(ADP-ribosa) polimerasa.

C-Muerte celular programada en Insectos

MCP durante la embriogénesis

El patrón de MC es muy dinámico durante la embriogénesis, registrándose niveles

muy altos de muerte en la epidermis y sistema nervioso central. Inexplicablemente, y a

pesar de todo el conocimiento desarollado durante años en Drosophr'la, hasta hace poco

tiempo, practicamente no se habian realizado estudios tendientes a conocer los genes

específicos involucrados en el proceso de MCP (Raff, l994). Recién a partir del año

1994, Drosophila ha emergido como segundo modelo (después del gusano Caenorabditis

elegans) para el análisis genético de la MCP y la apoptosis.

White y colaboradores (1994) identificaron genes involucrados en la MCP de

Drosophila cuando examinaron las alteraciones producidas en el patrón de muerte celular

en 129 cepas de embriones homocigotas para deleciones cromosómicas. Estos autores

encontraron que sólo en tres cepas se había logrado abolir totalmente la muerte celular y

coincidentemente, las deleciones en las tres cepas se superponían en el cromosoma 3

(75Cl y 75C2 de posición citológica). Mediante esta técnica, las deleciones analizadas en

las 129 cepas cubrían aproximadamente la mitad del genoma de Drosophila. De esta

forma, se encontró una región cromosómica esencial para la muerte de practicamente

todas las células que normalmente mueren durante la embriogénesis. Los mismos autores

encontraron otra mutación en la misma región cromosómica, pero que no era una

deleción, y presentaba el mismo fenotipo (es decir, no presentaba MCP). Este mutante se

llamó H99 y muere poco antes de la eclosión del huevo. Cuando se clonó esta región en

el mutante H99, se identificó un gen llamado reaper (rpr), que codifica para una proteína

de 65 aminoácidos y que no presentaba similitud con ninguna otra proteína descripta.

Durante la embriogénesis normal, el mensajero de reaper se expresa especificamente en

aquellas células destinadas a morir, y su expresión precede en l o 2 h la tinción con

naranja de acridína (indicador de MCP). Por otra parte, la expresión ectópica de reaper,

induce MCP en embriones de H99. Por esta razón, se ha postulado que reaper sen'a uno

de los activadores de la MCP. Funcionalmente reaper es análogo a ced3/ICE o ced4 de

Caenorhabditis pero presenta una secuencia completamente diferente

Introducción

El análisis molecular posterior de la región 75C en el intervalo H99 ha revelado la

existencia de otros dos genes involucrados en MC, estos son head involution deffective

(hid) y grim. Estos dos genes también inducen apoptósís cuando son expresados

ectopicamente, y al igual que reaper, la muerte ectópica era inhibída por inhibidores de

caspasas, indicando que los tres genes inducirían muerte vía caspasas (White y col, 1994;

Grether y col, 1995 y Chen y col, 1996).

Reaper, hid y gn'm sólo presentan homología entre si en los primeros 14

aminoácidos del extremo amino terminal y no presentan similitud con ninguna otra

proteína conocida hasta ahora.

La MC durante la embriogénesis puede ser bloqueda por la expresión ectópica del

gen p53 de baculovirus, el cual funciona inhibiendo la actividad de las caspasas.

Recientemente, se han identificado en Drosophila, a varios genes relacionados con p53 y

que conforman la familia de los IAPs (inhibidores de la apoptósís), por ejemplo thread

también llamada DlAPl. Por lo tanto, la capacidad de las proteínas IAP de Drosophr‘la de

bloquear la muerte inducida por rpr o hid, sugiere que éstas también formar-lanparte del

programa de MCP, funcionando como reguladores negativos del mismo (Hay y col,

1995). Por otra parte, con la identificación reciente de caspasas en Drosophíla se ha

avanzado mucho en el aspecto regulatorio de la MC. En la Figura 5, se presenta el

modelo propuesto por McCall y Steller (1997) para explicar la activación de la MC

durante la embriogénesis de Drosophíla.

Interacciones

célula-célula [APS

J_reaper

Ecdisona-—> híd —> caspasa—> proteolisis—>apoptosis

Bloqueodela ps3

grím

diferenciacióncelular

Radiación

Figura 5: Modelo propuesto por McCall y Steller (1997) para explicar laactivación de la MC durante la embriogénesis de Drosophila.

MCP durante la metamorfosis

A diferencia de lo expuesto en la sección anterior, en los estudios realizados sobre

MCP de tejidos larvales durante la metamorfosis, no se han registrado avances

significativos en lo que se refiere al descubrimiento de moléculas activadoras o efectoras

del proceso de muerte.

El conocimiento actual de este fenómeno está centrado principalmente en dos

aspectos: el primero de ellos, se refiere a la descripción a nivel histológico de la

degeneración en diferentes tejidos larvales; mientras que el segundo, se refiere a la

Introducción

regulación hormonal de este proceso. Sin embargo, es muy poco lo que se ha avanzado en

el conocimiento de las moléculas que desencadenan el proceso de muerte celular de

tejidos larvales en insectos. Solamente existe un trabajo (Jiang, 1997) donde se registró la

expresión de reaper, hid y caspasas en glándulas salivales de Drosophíla melanogaster.

El estudio más completo de MC durante la metamorfosis se realizó en cuerpo

graso de la mosca Sarcophaga. En estos trabajos se describió el mecanismo molecular

por el cual las células larvales que forman una estructura en red, se dísocian en esta etapa

del desarrollo y pasan a flotar libremente en la hemolinfa (Kurata y col, 1989, l99la-b,

l992a-b; se discute más abajo). Sí bien estos estudios desentrañan el primer paso para la

histolísís de este tejido, posteriormente no se ha avanzado en determinar el mecanismo

que lleva a la muerte en las células que flotan libremente.

El nivel de cambios que sufren los distintos tejidos larvales durante metamorfosis

es muy variado y presenta características particulares en los distintos Ordenes de insectos.

En la Tabla 3 presentamos en fonna resumida el grado de muerte celular que sufren

diferentes tejidos larvales en los principales Ordenes de insectos holometábolos. Debido a

la gran variabilidad encontrada entre los distintos ordenes de insectos, en esta

Introducción se ha puesto especial énfasis en brindar un panorama de lo que se conocía

en los dípteros al iniciar esta Tesis.

Al comienzo de este trabajo, se contaba con relativamente pocos estudios sobre la

metamorfosis de insectos holometábolos, y en especial sobre la histolisis larva] durante la

metamorfosis temprana en los dípteros. En lo que se refiere a estos, los trabajos más

completos, donde se describió a nivel histológico la destrucción de varios tejidos larvales,

se realizaron en Drosophila melanogaster (Robertson, 1936; Eeken, 1977; Dean, 1978;

Srdic y Renhart, 1980). También existían estudios similares, aunque muy parciales y en

muy pocos tejidos, en otras moscas como Sarcophaga bullata y Calliphora erytrocephala

(Zachary y Hoffman, 1980; Kurata y col, 1989). Sin embargo, para los dípteros

tefrítidos en general, es decir las verdaderas moscas de las frutas, no se habían

realizado estudios de este tipo.

Tejido Degradación de tejidos larvalesNivel de los cambios que sufren los tejidos

DMwa Lepidoptera Himenoptera Coleopteraepidermis gradual l sin cambios gradual l sin cambios

epitelio del total total ND * sin cambiostracto digestivotubos de sin cambios sin cambios sin cambios sin cambios

Malpighiglándulas total NP * total totalsalivares

glándulas de la NP * total NP * NP *seda

glándula gradual gradual gradual gradualprotorácicacuerpo graso total 2 remodelación ND * pocosmúsculos total total ND "‘ ND "‘

corpora allata parcial parcial parcial parcial

Tabla 3: Cambios que sufren los principales tejidos de los insectosholometábolos durante la metamorfosis. (l) destrucción gradual de la epidermislarvaria y reemplazo de la misma por el crecimiento de células peripodiales devarios discos imaginales. En Dípteros, las células epidérmicas de los segmentosanteriores (que darán la cabeza y el tórax) se desintegran inmediatamente luego dela formación del pupario. Las células epidérmicas del abdomen se mantienen hastaque se secreta la cutícula pupal, luego de lo cual son reemplazadas. (2) durante losestadios que transcurren dentro del pupario se produce la destrucción de la mayorparte del cuerpo graso, completándose el proceso pocas horas después de laemergencia del imago. * : no se dispone de datos (ND) o los tejidos mencionadosno están presentes en estos Ordenes de insectos (NP).

l- Descripción del proceso de degradación de tejidos

En la Figura 6 se muestra un esquema general del corte transversal de una larva,

donde se identifican los principales órganos y tejidos, y permite imaginamos la ubicación

espacial que presentan éstos en el cuerpo del insecto.

cutícula

vaso dorsal

epidermistubo de Malpighi

tráquea

cuerpo graso

músculo

intestinocordón nervioso

Figura 6: Esquema de un corte transversal de una larva de Drosophílamelanogaster (tomado de Hartenstein, 1993). Las siglas indican la localización delos músculos somáticos: di, músculos internos oblicuos dorsales; de, músculosexternos oblicuos dorsales; pe, músculos transversales externos; ve, músculosventrales oblicuos externos; vi, músculos ventrales oblicuos internos; vs, músculosventrales oblicuos superficiales.

Introducción

Egidermis: en los dípteros ciclorráfos, las células epidérmicas larvales no se dividen, por

lo que mantienen un número más o menos constante desde larva I hasta larva III. Las

células epidérmicas acompañan el crecimiento de las larvas mediante el aumento del

tamaño celular y la politenización de sus cromosomas. Durante la metamorfosis, las

células epidérmicas de la cabeza y el tórax se desintegran inmediatamente después de la

formación del pupan'o, y la epidermis pupal (e imaginal) deriva de las células

pen'podiales de los discos imaginales correspondientes (Sehnal, 1985). En el abdomen,

las células epidérmicas larvales mueren luego de la secreción y deposición de la cutícula

pupal y son sustituidos por la proliferación de los histoblastos. Se ha postulado que la

proliferación de los histoblastos imaginales durante la metamorfosis, inducin’a la

involución de las células epidérmicas (Poodry, 1975), pero hasta la fecha no se han

realizado avances para demostrar esta hipotesis.

Sistema nervioso: durante la metamorfosis de los Dípteros se produce una considerable

restructuración del sistema nervioso, que incluye la formación, reorganización y muerte

de neuronas.

Sistema digestivo: el intestino larval en Drosophila es remodelado en forma completa

durante los estadios de pre-pupa y pupa temprana. Las células imaginales que dan lugar al

intestino adulto se encuentran formando anillos, en la base de las glándulas salivales, en

la unión del intestino anterior con el proventrículo, en la región del intestino posterior

cercana a los ureteres de los tubos de Malpighi, y alrededor del ano (Figura 7, tomado de

Skaer, 1993).

Bodestein (1950) describió los secuencias de eventos involucrados en esta

remodelación. En el intestino anterior y posterior, la degradación del epitelio larval es un

proceso gradual que está acompañado por un reemplazo inmediato por el epitelio del

adulto. En ambas regiones las células teminan siendo fagocitadas por hemocitos. En el

intestino medio el proceso es diferente, el epitelio del adulto crece y envuelve al epitelio

larval, que degenera dentro del lúmen del nuevo intestino y forma el cuerpo amarillo. El

cuerpo amarillo será evacuado como meconio luego de la emergencia del adulto (Skaer,

1993).

20

mmAparato digestivo larval Aparato digestivo del ¡mago

esophagus

salivaryduct

Malpighian .tubule

rectum

Figura 7: Esquema correspondiente al aparato digestivo de la larva (A) y eladulto (B) de Drosophíla, donde se indica la ubicación de los anillos imaginales ehistoblastos (flechas rojas) (Tomado de Skaer, 1993).

Glándulas salivales: en Drosophila, la histolisis de las glándulas salivales se inicia 5-7 h

luego de la formación del pupario, y se caracteriza por la aparición de gran número de

lisosomas y vacuolas autofágicas (Eeken, 1977).

Cueggo ggso: el cuerpo graso, que cumple multiples funciones relacionadas con el

metabolismo de los carbohidratos, lípidos, proteínas y pigmentos de los ojos, sufre

cambios importante en esta etapa del desarrollo. El cuerpo graso larval presenta una

diferenciación regional tanto en estructura como en el procesamiento de los metabolitos.

Se sabe que en otras moscas, durante el último estadio larval, se sintetiza la mayor

cantidad de proteínas de reserva (entre ellas arilforinas, proteínas ricas en metionina, etc).

Introducción

Muchas de estas proteínas de reserva son sintetizadas por el cuerpo graso de los

segmentos anteriores y durante el último estadio larval son secretadas a la hemolinfa,

donde llegan a alcanzar concentraciones muy altas (mayores a 60 mg / ml) (Haunerland y

Shirk, 1995). Luego son captadas por el mismo cuerpo graso, pero en la región

abdominal, durante el estadio pre-pupal, mediante el proceso de endocitosis mediada por

recectores específicos (Kanost y col, 1990, Levenbook, 1985). Se forman así los gránulos

proteicos, y se ha postulado que la síntesis de proteínas de reserva durante los estadios

larvales y su acumulación en el cuerpo graso durante la pre-pupa permite a los insectos

disponer de una gran reserva de aminoácidos, que serán utilizados para la producción de

las proteínas del adulto (Levenbook y Bauer 1984). En Drosophila y otros insectos

holometábolos, estas proteínas comienzan a ser removidas de la hemolinfa por parte del

cuerpo graso e incorporadas a los gránulos proteicos, a partir del momento de vaciado del

intestino y el inicio de la pupariación (Haunerland y Shirk, 1995); completándose este

proceso durante el estadio pupal (Kanost y col, 1990). En la mariposa Calpodes, por

ejemplo, los gránulos protéicos están completamente ausentes en la larva, pero son

abundantes durante los estadios dentro del pupario y el adulto (Haunerland y Shirk,

1995).

Durante la transición de larva a adulto la estructura con forma de red que

caracteriza al cuerpo graso cambia. En esta etapa, el cuerpo graso se disocia liberando

células que flotan libremente en la hemolinfa. Kurata y col. (1989, l99la-b, l99Za-b)

demostraron que dos proteinas sintetizadas por los hemocitos pupales, son las

responsables de este evento. Al inico de la metamorfosis, los hemocitos expresan en su

superficie una proteína de 200 KDa que reconoce a la membrana basal de las células del

cuerpo graso. Luego de unirse al cuerpo graso, los hemocitos secretan una cisteín­

proteinasa de 29 KDa (perteneciente a la família de las Catepsinas tipo B) que digiere

esta membrana, y produce finalmente la liberación de las células.

Luego de la disociación, el número de células del cuerpo graso comienza a

decrecer gradualmente, este proceso de muerte dura hasta aproximadamente dos días

despues de la emergencia del adulto cuando son reemplazadas completamente por el

cuerpo graso del adulto (Haunerland y Shirk, 1995). En Drosophila se determinó que al

final del estadio pupal, el 60 % de las células del curpo graso sufrieron MCP y que el 40

22

Introducción

% restante, desaparece completamente dentro de las 48-72 h posteriores a la emergencia

del adulto (Bate, 1993). Curiosamente, a pesar de ser el único tejido en el gue se ha

avanzado a nivel bioguímico y molecular en conocer el mecanismo de MC durante la

metamorfosis, no se conocen estudios histológicos en ningún díptero donde se analice la

evolución ni clase de cambios gue sufren las células durante este proceso.

Músculos: en dípteros, los músculos larvales involucionan en su mayoría durante esta

etapa del desarrollo. Robertson (1936), describió por microscopía óptica la degradación

de los músculos larvales durante la metamorfosis de Drosophila melanogaster. La MC de

la mayoría de los músculos de cabeza y tórax ocurre en etapas tempranas de la

metamorfosis, mientras que los músculos del abdomen son degradados posteriormente en

el estadio pupal. Existe un grupo de músculos abdominales que no sufren modificaciones

en esta etapa del desarrollo, ya que son necesarios para la emergencia del imago. Una vez

emergido el adulto, los músculos larvales intersegmentales son degradados

inmediatamente (Lockshin, 1985).

2- Determinación del papel gue juega la hormona de la muda en la activación de

la histolisis.

En la mosca Callíphora erytrhrocephala, Zachary y Hoffman (1980)

demostraron que: (l) el incremento en la concentración de la hormona de la muda hacia

el final del último estadio larval, induce la degeneración de los músculos larvales, (2) los

primeros síntomas de degeneración aparecen 2 h después de la formación del pupario, es

decir, l4 h más tarde de su inducción. La destrucción del cuerpo graso larva] en

Drosophila también es inducida por ecdisteroides; aunque en éste caso, también la

hormona juvenil está involucrada, especialmente en la fracción de cuerpo graso que se

destruye luego de la emergencia del adulto (Qin y col, 1997, Richard y col, 1993).

A pesar de las enormes diferencias que se encuentran en los procesos de MCP

entre las mariposas y las moscas, en ambos Ordenes la inducción de este proceso siempre

es hormonal. En la mariposa Calpodes se ha demostrado que la hormona 20-OH-ecdisona

induce la autofagia de organelas específicas en el cuerpo graso (peroxisomas,

mitocondrias y parte del retículo endoplásmico rugoso), que es seguida por una posterior

repoblación de las mismas. El proceso de autofagia implica el aislamiento de los

Introducción

componentes que serán digeridos, la posterior fusión con lisosomas primarios, formando

asi la vacuola autofágica. En esta última etapa se activan las enzimas lisosomales (Dean,

1978; Locke, 1985).

3- Determinación a nivel bíoguímico de las moléculas efectoras del proceso de muerte.

El análisis bioquímico de las moléculas efectoras de la MCP durante la

metamorfosis se ha centrado desde hace muchos años en el estudio de diferentes enzimas

lisosomales, especialmente fosfatasa ácida y proteinasas ácidas. En glándulas salivales

del mosquito Chironomus tentans (Henrikson y Clever, 1972), en cuerpo graso de las

moscas Callz'phora erythrocephala (Van Pelt Verkuil, 1978 y 1979) y Sarcophaga

bullata (Csikós y Sass, 1997) se encontró que la actividad de fosfatasa ácida está

incrementada durante el proceso de histolisis, y que ésta se localiza en las vacuolas

autofágicas derivadas de la fusión de los gránulos protéicos con lisosomas primarios. En

Musca domestica (Hegdekar y Smallman, 1967) se encontró que la actividad total de

fosfatasa ácida se encuentra incrementada durante la metamorfosis. Todos los trabajos

mencionados más arriba reafirman la idea de que los lisosomas juegan un papel

importante en el proceso de MC.

Existen otros trabajos que enfatizan la importancia de las proteinasas ácidas (con

caracteristicas lisosomales) en este fenómeno. Rodems y col. (1969) y Henrikson y

Clever (1972), postularon que las aspartil proteinasas estarían involucradas en la

destrucción de las glándulas salivales del mosquito Chironomus tentans. En la mosca

Lucz'lia cuprína, Smith y Bin (1972) encontraron un importante incremento en la

actividad de dos endopeptidasas ácidas en la primera etapa de la metamorfosis, con pH

óptimo de 2,8 y 4, respectivamente; aunque no identificaron a que familia de proteinasas

pertenecerían.

Kawamura y col. (1984 y 1987) identificaron, aislaron y caracterizaron la

catepsina D y la catepsina del tipo L en Aldrichina grahami. Estas proteinasas presentan

máxima actividad pocas horas después de iniciada la metamorfosis y su perfil coincide

con el de la fosfatasa ácida. Estos autores postularon que ambas proteinasas deberían

estar involucradas en MCP, pero no se encontraron reportes posteriores confimativos.

24

Introducción

Kurata y col (1992) aislaron la cisteín proteinasa de 29 kDa del tipo catepsina B

que participa en la disociación del cuerpo graso. Esta es la única proteinasa cuya función

ha sido asignada en un proceso de MCP en insectos durante la metamorfosis.

4- Determinación de los activadores de la MC.

Jiang y col. (1997) en un sólo trabajo, hace referencia a que los activadores de la

MCP, reaper y hid, identificados durante la embriogénesis, tambien paniciparían en la

activación de la MCP durante la metamorfosis. Estos autores encontraron que reaper y

hid inducin’an la degradación del intestino medio y las glándulas salivales durante la

metamorfosis en Drosophíla. En ambos tejidos la MC reponde al pulso de ecdisona al

final del tercer estadio larval, la cual estimula la transcripción de reaper y hia' en una

etapa que precede a los primeros signos de histolisis. Por otra parte, estas moléculas

activan a las caspasas, que probablemente serían las ejecutoras del proceso de muerte en

estos tejidos.

D- La mosca del Mediterráneo Ceratitis capitata (Wied)

Hemos utilizado la mosca del Mediterráneo como modelo experimental para el

estudio de la metamorfosis en general y del fenómeno de la histolisis de los tejidos

larvales en particular, por que para el estudio bioquímico y del desarrolo presenta

ventajas con respecto a la mosca del vinagre Drosophz'la melanogaster en cuanto a

tamaño y ciclo de vida más lento. A pesar de tratarse de una plaga de gran importancia

económica, con una extensa bibliografia en lo referente al control de la misma, son

relativamente pocos los estudios realizados en lo que respecta a la biología del desarrollo

de este insecto (Chn'stenson y Foote, 1960; Robles-Chillida, 1975; Shoukry y Hafez,

1979 y Rhum y Calkins, 1981). Esto llevó a nuestro laboratorio a plantearse en los

últimos años el estudio integral de los distintos eventos que se suceden durante la

transición larva - adulto. Estos estudios constituyeron la base para la iniciación de la

presente Tesis y han sido ampliados durante la misma. Se determinaron y caracterizaron

25

Introducción

fenotípica y bioquímicamente los programas de pupariación y pupación (Rabossí y col.,

1991 y 1992), asi como también, subprogramas tales como la esclerotización y

tanificación del pupario (Wappner, 1995). Se estudió la síntesis y deposición de las

proteínas cuticulares (Boccaccío y Quesada, 1989 y 1994) y de los pigmentos de los ojos

(Rabossí y Quesada, 1993), asi como los cambios en la morfología externa durante la

metamorfosis (Rabossí y col., 1992).

Características generales de C. cagítata

La mosca del Mediterráneo, Ceratitis capitata (Wiedemann) es un diptero

ciclorráfo perteneciente a la familia Tephritidae, cuyos miembros son conocidos como las

verdaderas "moscas de la fruta". Esta familia esta compuesta aproximadamente por unas

4000 especies ordenadas en unos 500 géneros (White y Elson-Harris, 1992). Además de

ser, -en cuanto al número de especies-, una de las familias más grandes del Orden

Díptera, es una de las de mayor importancia económica.

Cerca del 35 % de las especies de ésta familia ataca a una amplia variedad de

frutas silvestres y comerciales; otro 40 %, se desarrolla en las flores de la familia

Compositae, mientras que el resto de las especies se encuentran asociadas a flores de

otras familias (White y Elson-Harris, 1992).

En particular, la mosca del Mediterráneo es la plaga de mayor importancia

económica en el mundo, ya que afecta principalmente las frutas comerciales de climas

tropicales y subtropicales (Saul, 1986). En nuestro país ocupa todas las zonas templadas y

subtropicales, distribuyéndose fundamentalmente en la Mesopotamia, centro y norte de

Buenos Aires, Córdoba, San Juan, en todo el Noroeste, y hasta hace poco tiempo en

Mendoza y el alto valle del Río Negro, aunque estas dos últimas se encuentran

actualmente bajo control mediante la Técnica del insecto estéril.

La mosca adulta es un pequeño insecto de no más de 5 mm de largo, con alas

triangulares, con zonas de color anaranjado, pardo, negro y blanco. El macho se distingue

por sus vibrisas espatuladas ubicadas a ambos lados de los ocelos y el abdómen terminal

redondeado. La hembra, por su parte, exhibe un abdomen terminal puntiagudo debido a

un conspicuo ovipositor (Figura 8) (autor original y Quesada-Allué y col, 1994).

26

Figura 8: Hembra y Macho adultos de Ceratitis capitata. Tomado de Quesada­Allué (1994) y a su vez de W.W Frogatt (1910).

E] ciclo de vida de Ceratítis ca ¡tata

Previamente al comienzo de esta Tesis hemos delimitado las distintas etapas del

ciclo de vida de C.capitata. que se esquematizan en la Figura 9.

27

Introducción

Las hembras fecundadas insenan los huevos dentro de las frutas mediante el

ovipositor retráctíl. En el interior de éstas, se produce el desarrollo embrionario y larval.

Desarrollo embrionario

El huevo es de color blanco nacarado de forma ovoíde alargada y presenta una

longitud promedio de 0.8 mm. El desarrollo embrionario de esta mosca fue estudiado por

Cladera y Manso (1988).

La mayor parte de la información que se expone a continuación proviene de

resultados de nuestros grupo de trabajo y ha sido corregida y ampliada en el transcurso de

esta Tesis.

Estadios larvales

Al igual que otros dípteros ciclorrafos, en Ccapítata se reconocen tres estadios

larvales, cuyas larvas sucesivas se parecen mucho entre si, salvo el tamaño y los dientes

de las piezas bucales, y difieren completamente del adulto. Las larvas crecen

progresivamente en peso y tamaño expandiéndose notoriamente al pasar de un estadio al

otro (Rabossi y col, 1994).

Normalmente, cuando la larva ha alcanzado su tamaño cn'tico y está

comprometida para realizar la metamorfosis, todavia continúa alimentándose. El pen'odo

previo a alcanzar el tamaño critico se define como fase de alimentación obligatoria, ya

que es absolutamente esencial para el inicio de la metamorfosis. El siguiente periodo de

alimentación, se llama fase alimentaria facultativa, ya que el consumo de alimento

continúa pero no es esencial para el normal desarrollo del insecto (Denliger y Zdárek,

1994).

HORAS0 -l20 40 3140

Í EMBRION I U I UIT UII I PREPUPAI PUPA

l-ORAS 0 52 124 196 316 356

444444 444obcdol ghi

ADULTO FARADO l MAGO}

630

4k_.,g__E

l-—Pupariación-c

¡- Pupación-—¡

)—— P.C.L.——4

r- P.C.P.—c

i— P.C.A.

a- salto de larva IIIdel alimenlo (-8 hs.)

b- puparío blanco rugoso. Iniciode la pupariación. Iniciodel estadíode Prepupa. (0 hs.)

c- pupario blanco liso.d- coloración definitiva del puparioe- apólisis larvaI-pupal. lnicio de la pupaciónl- comienzo del estadío Pupol. Pupa cripfocelúlíca.g- Finalde la pupariación. Sólo trazas de las proteínas cuticulares

larvales. Se comienza a debcfar la PCG-lOO.

l'I-eversión de cabeza y apéndices lorócícos. Pupa laneracelúlica.i- linal de la pupación. Patrón definitivo de PCP. Proporciona

definitivasde cabeza, tórax y abdomen.i- muda de pupa a adullo Parado. Desaparición de PCG-lOO, cambio en

el patrón de proteínas cuticulares.lr emergencia del imago.

Figura 9: Resumen de los principales eventos macroscópicos y molecularesdurante el ciclo de vida de Ceratítis capitata a 239€. P.C.L, patrón de proteínascuticulares; P.C.P, Patrón de proteínas cuticulares del adulto (Rabossi y col, 1994).

29

Introducción

Al final de ésta última fase ocurre un cambio radical en el comportamiento de la

larva, que lleva a la misma a dejar de alimentarse, purgar su intestino y abandonar el

alimento, alejándose del mismo. Este cambio estaría dado por un pulso pequeño de

hormona de la muda previo al gran pulso que dispara la metamorfosis. Este pulso ha sido

detectado en Drosophila, pero hasta ahora no en Ceratitis. Cuando la larva emerge del

alimento permanece por cierto tiempo realizando el comportamiento de “wandering” o

deambulando, hasta que abandona definitivamente el alimento. Este período presenta una

duración variable en los dípteros y en Ceratitís es extremadamente corto, de sólo unos

pocos segundos, siendo sustituido por un comportamiento especial: el salto (Figura lO-A

y B).

Ceratitis capitata es el único ejemplo de un organismo de cuerpo totalmente

blando sin patas que es capaz de saltar (Maitland, 1992). El mecanismo de salto fue

estudiado en detalle por Maitland, quien observó que en una primera etapa los ganchos

bucales de la larva se prenden a los mamelones de cutícula que están por debajo de los

espiráculos posteriores, de modo que la larva adopta una forma de anillo (Figura lO-B).

Por contracción muscular se acumula fuerza elástica en la cutícula, la cual se libera

violentamente cuando los ganchos bucales se sueltan, produciéndose de este modo el

salto. El período en que la larva tiene la capacidad de saltar se extiende durante dos horas

aproximadamente, disminuyendo progresivamente la intensidad de los mismos. Al dejar

de saltar, la larva se moviliza distancias cortas a través de movimientos de alargamiento y

acortamiento del cuerpo. Este segundo tipo de movimiento se va haciendo cada vez más

infrecuente hasta que la larva se inmoviliza ocupando su posición definitiva en el terreno.

Durante la última hora u hora y media del proceso de inmovilización, se produce la

morfogénesis del pupan'o. La larva se acorta aproximadamente un 20 % de su longitud y

adquiere la típica forma ovoide (Figura lO-C). El acortamiento se produce por la

retracción de los tres primeros segmentos anteriores.

En nuestras condiciones de cria en el laboratorio, entre el primer salto y la

inmovilización definitiva de la larva transcurre un período de aproximadamente 8 h

(Wappner, 1995).

30

Figura 10: (A) Larva III de Ceratitis que abandonó el alimento (-12 h), (B) LarvaIII preparada para realizar el salto (-8 h) y (C) Larva III completamente inmovil,que adquirió la forma característica de la pupa por la retracción de los tresprimeros segmentos anteriores (Oh, inicio de la metamorfosis).

31

Tiempo cero

Hemos definido en forma arbitraria como "tiempo cero" de la metamorfosis al

momento en que la larva, habiendo retraído los tres segmentos anteriores y adquirido la

forma ovoide típica, se inmoviliza definitivamente, y ya no responde a estímulos

mecánicos (Rabossi y col, 1991 y 1994). Este es el momento que se utiliza en forma

rutinaria en nuestro laboratorio para re-sincronizar los cultivos de Ceratitis.

Para determinar el momento exacto se debe observar que la cutícula esté todavía

rugosa, ya que 15 min más tarde se produce turgencia en el insecto y la cutícula aparece

lisa y brillante.

Todos los horarios que se mencionan en esta Tesis están dados en relación a este

Tiempo cero definido aqui.

Estadio de pre-pupa

Hemos tomado la inmovilización definitiva de la larva, que definimos como

tiempo cero de la metamorfosis (ver descripción detallada arriba), como el momento que

determina el inicio del estadío pre-pupal y del proceso de puparíación.

El estadío de pre-pupa se extiende, de acuerdo a nuestro criterio, desde la

ínmobilización definitiva de la larva hasta el comienzo de la deposición de la cutícula

pupal (40 h) (Figura 9). En este sentido la definición del estadio de pre-pupa difiere de la

realizada por otros autores (Ashburner, 1989), ya que estos últimos consideran como final

de éste estadío a la apólisis, es decir, la retracción de la epidermis larva]. Pero en Ceratitis

hemos determinado que el tiempo que transcurre entre un proceso y otro es muy grande,

la apólisis ocurre a las ZOE h desde la inmovilización definitiva de la larva y recién a

partir de las 40 h comienza a depositarse la nueva cutícula pupal.

En nuestro laboratorio consideramos como marcador del inicio de un estadío, a la

deposición de la nueva cutícula (Rabossi y col, 1991).

Durante el estadío de pre-pupa se inician los dos fenómenos más importantes de la

metamorfosis: la pupan'ación y la pupación. El proceso de pupariación consiste en la

adquisición de color y dureza por parte de la cutícula larval que se transforma en una

cápsula protectora llamada pupario. Este proceso se caracteriza principalmente por la

insolubilización de las proteínas cuticulares larvales y la incorporación de catecolaminas

Introducción

que son precursoras de agentes que unen covalentemente entre sí a los compomentes

cuticulares. Hemos, identificado, además de las catecolamínas, la incorporación de

proteínas que a modo de calafateo recubren la parte interior del pupario (ver abajo)

Consideramos que el proceso de pupariación se inicia con la inmovilización

definitiva de larva (pupario blanco) aunque la pigmentación de la cutícula larval se inicia

aproximadamente 15 min después del "tiempo cero" definido anteriormente.

La mayon'a de las proteínas larvales son extraíbles del pupario hasta las 32-36 h.

Entre las 36 y 52 h se registró la aparente incorporación de nuevas proteínas al mismo. El

polipéptído mayoritario presentó un peso molecular aproximado de 26 KDa, siendo otras

que se incorporan, las de 19 y 15 KDa (Rabossi y col, 1991). Se determinó que el

polipéptido de 26 KDa se sintetiza entre las 24 y 30 h, y se deposita recién en el pupario

alrededor de las 46 h. Estos resultados nos llevaron a determinar que la pupariación

finaliza alrededor de las 46-48h cuando se alcanza el patrón definitivo de proteínas del

pupario (Rabossi y col, 1991).

El color del pupario cambia gradualmente desde un blanco-ámbar (en el tiempo

cero), a un marrón claro a las 8, hasta alcanzar el color marrón habano rojizo y la dureza

definitivas alrededor de las 16 de iniciado el proceso.

El otro gran programa de expresión génica que se superpone temporalmente,

aunque de forma parcial, al proceso de pupariación es la pupación.

La pupación es el proceso que lleva a la formación de la pupa; se inicia con la

apólisis larval-pupal (203-0h) y finaliza con la transformación de la pupa criptocefálica en

una pupa fanerocefálica, a través de la evaginación de la cabeza y los discos imaginales

de los apéndices torácicos (46 h) (Figura 9).

La apólisis consiste en la retracción de la epidermis de la cutícula del estadío

larval (Jenkin y Hinton, 1966). Este proceso presenta un marcador característico que lo

identifica y es la aparición de una burbuja de aire en la zona abdominal de la pupa. Esta

hace que la pupa flote cuando se la sumerge en el agua. Durante la pupación, la burbuja

ubicada en la zona posterior de la pupa se dispersa (Ashbumer, 1989).

Si bien a las 46 h se produce el pasaje de pupa criptocefálica a fanerocefálica, a

través de la eversión de la cabeza y los miembros torácicos, evento que otros autores

consideran como final de este proceso, consideramos más apropiado fijar como final de la

Introducción

pupación las 72 h cuando la pupa adquiere las proporciones definitivas del cuerpo y

también el patrón definitivo de proteínas cuticulares pupales (Boccaccío y Quesada­

Allué, 1989). El proceso de pupación se volverá a analizar en detalle en la sección de

Resultados.

Estadio de pupa y adulto farado

La deposición de la cutícula pupal a partir de las 38-40 h constiutye el primer

evento tangible de la existencia de una pupa en formación. Esta pupa no presenta cabeza

ni apéndices, y se llama criptocefálica. Como se mencionó más arriba, unas 6 u 8 h más

tarde, se produce la evaginación de la cabeza y los miembros. A partir de aquí, ocurren

innumerables cambios en la morfología externa, que llevan a la formación del adulto. En

la Figura 13 y 27 se muestra la evolución de la morfología externa durante los estadios de

pupa y adulto farado (Rabossi y col, 1992).

Entre las 144 y 152 h se produce la última muda que sufre Ceratitis, que

corresponde a la muda de la cutícula pupal a la de adulto (Figura 9). Esta muda está

separada en el tiempo de la ecdisis o emergencia del imago.

Aproximadamente un día antes de la emergencia, el saco frontal o ptilinum

situado en la parte anterior de la cabeza, se expande y contrae alternativamente golpeando

su superficie rugosa contra el opérculo del pupario.Este opérculo está delineado por una

linea de debilidad estructural

Ec_diSE

Finalmente, en nuestras condiciones de trabajo, a las 312 h se produce la ruptura y

separación del opérculo del pupario, con lo que se inicia la emergencia del adulto. Tras

abandonar el pupan'o, el imago recién emergido presenta las alas plegadas, las cuales se

extenderán pocos minutos más tarde.

34

E-Objetivos generales de este trabajo

El principal objetivo de esta Tesis es caracterizar el proceso de degradación de

tejidos larvales en la mosca del Mediterráneo para dar lugar a la formación de tejidos del

adulto. Para esto, se planteó un estudio horizontal e integral del proceso de histolisis

larva], que involucra los siguientes aspectos:

l- conocer con total presición la secuencia y la evolución temporal en que

suceden los principales eventos de los programas metamórficos que llevan a la formación

de la mosca adulta.

2- determinar la evolución de los cambios histológicos que acompañan la

destrucción de los tejidos larvales durante la metamorfosis de la mosca del mediterráneo.

En este sentido, se decidió tomar dos tejidos como modelo de estudio, que fueron el

cuerpo graso, y los músculos, ya que en estos la muerte celular es total o muy importante.

3- dado que los tejidos elegidos están relacionados directamente con la síntesis y

acumulación de las principales moléculas de reservas, se decidió analizar los cambios en

el contenido de las mismas en el marco de la metamorfosis.

Las recurrentes referencias, en los estudios histológicos realizados en otras

moscas a la presencia de numerosos lisosomas en los tejidos destinados a morir y los

escasos estudios bioquímicos del proceso de MC durante esta etapa del ciclo de vida, nos

llevaron a focalizar nuestro analálísís en la proteinasas lisosomales ácidas como posibles

moléculas efectoras del proceso de muerte. Entonces, disponiendo de un marco biológico

que nos permitiera definir con precisión las diferentes etapas del proceso de MC en

Ceratín's, decidimos estudiar en particular a las endopeptidasas ácidas:

4- en este aspecto, se decidió determinar la actividad lisosomal durante la

metamorfosis, identificando a las endopeptidasas ácidas más importantes durante los

estadios de pre-pupa y pupa.

5- un obtetivo parcial de nuestro trabajo fue estudiar la proteinasa ácida más

importante involucrada en la MC. Para esto, nos propusimos como paso inicial la

purificación a homogeneidad y realizar su caracterización bioquímica, determinando el

rol quejugaría en el proceso de MC.

35

MATERIALES YMETODOS

l) Cría en el laboratorio de la mosca del Mediterráneo:

Las moscas fueron criadas en nuestro laboratorio según los métodos descriptos que

se detallan más abajo, ó cedidas generosamente por la Dra Fanny Manso del Instituto de

Genética del CICA-INTA, Castelar. Se trabajó con dos cepas salvajes; "INTA - Arg 17" y

"Mendoza DOZ-l". La cría de Ceratitis se realizó a 23 s’C,50-60 % de humedad relativa y

un fotoperiodo luz-oscuridad 16 - 8 h, en cámaras de cn'a "Conviron".

Manejo de los adultos: Los imagos de ambos sexos son mantenidos en número no

superior a 60 en frascos de vidrio de 400 ml ("chicos") o no superiores a 300 en frascos de

2750 ml ("grandes"). Los frascos llevan tapas de goma espuma (poli-uretano). Se alimenta

a las moscas con una mezcla de sacarosa-levadura (3:1) y el agua se suministra como gel

de agar al l %. Para los frascos chicos se utilizan recipientes de lO ml, que se renuevan 2

veces por semana; para los frascos grandes, los recipientes de 25 ml se renuevan una vez

por semana.

Oviposición v recolección de huevos: Los huevos se colectan a partir de los 7 dias

después de la emergencia de los adultos. Para la recolección de los huevos se utilizan

frutas artificiales de plástico coloreado de aprox. 4 cm de diámetro a las cuales se les

realizan múltiples perforaciones con una aguja incandescente. Las frutas tienen un orificio

de l,5-2,0 cm de diámetro donde se coloca un corcho que sujeta un pedazo de goma­

espuma, que se moja con agua para mantener el interior de la fruta saturado de humedad.

Este dispositivo (ver Figura ll) cuelga hacia el interior, suspendido por un alambre de la

boca del frasco (Quesada y col., 1994). Tras el período de ovipuesta, que en ningún caso

debe superar el tiempo de desarrollo embrionario, es decir 40-50 horas, se retiran las

fi'utas. En el caso de cultivos de alta sincronización, el tiempo de ovipuesta fue de una a

tres horas. Para la recolección de los huevos, se quita el corcho y se agrega

aproximadamente l ml de agua destilada, se agita vigorosamente con el orificio tapado y

se vierte el líquido con los huevos arrastrados sobre un papel de filtro colocado en un

embudo. Después del filtrado, se agrupan cuidadosamente los huevos con una espátula en

un área de papel no superior a l-l.5 cm de diámetro, se recorta la misma y se la apoya

sobre el medio de cultivo para larvas contenido en una cubeta y preparado según Terán

(1977) con modificaciones introducidas en el INTA-CICA, Castelar, (Quesada y col,

1994). En el paso anterior es crítico que el papel permanezca siempre húmedo. Para

Materiales y métodos

cultivos pequeños (50-200 huevos) se utilizan cubetas con 25 ml de medio; para cultivos

grandes (hasta 1000 huevos), cubetas de 60 ml de medio.

ganchometálico orificio donde

/ encoia el corcho

l

‘ A

corcho Frutoplástica

l<> <>__gomoespumo I

Figura ll: Fruta artificial utilizada para la recolección de los huevos y frascodonde se mantiene a los adultos de Ceratz'tís.

Desarrollo larval: Los tres estadios larvales se desarrollan en el medio de cultivo donde

fueron colocados los huevos, que debe mantenerse húmedo, especialmente durante los

primeros días del período larval. Las cubetas se depositan en el fondo del frasco, sobre un

lecho de arena fina tamizada (esterilizada por calor). Al finalizar el tercer estadío larval,

las larvas abandonan el medio de cultivo saltando a la arena (a 23 9C, la etapa larva] dura

aprox. lO días). El tiempo de salto se dispersa a lo largo de van'as horas dependiendo del

tiempo de oviposíción, es decir, del tiempo que permaneció la fruta artificial en el frasco

(grado de sincronización del cultivo); de factores ambientales y del comportamiento

individual. A los 3-5 días después del salto se tamiza la arena para separar las pupas, que

37

Materiales y métodos

se colocan en los frascos donde se mantendrán los adultos luego de la emergencia. En el

caso de los cultivos de alta sincronización (l a 3 h de ovipuesta), al finalizar el tercer

estadio larval cerca del 80 % de la larvas saltan cuando se enciende la lámpara de la

cámara de cn’a.Luego de un período de salto de aproximadamente una hora, las larvas son

separadas de la arena y sincronizadas individualmente (ver más abajo).

2) Sincronización de los cultivos ("Tiempo cero")

Al finalizar el tercer estadio de la etapa larval, las larvas ascienden a la superficie

del alimento, y luego de un periodo muy corto de vagabundeo (tan sólo unos pocos

segundos), saltan en busca de un sustrato seco.

En el proceso de inmovilización de la larva que dura 8 (en nuestras condiciones de

trabajo) se observa una pérdida paulatina de la movilidad. Posteriormente se produce el

acortamiento de la larva por retracción de los tres primeros segmentos donde se encuentra

el esqueleto cefalofaríngeo; de manera que los espiráculos anteriores, ubicados en el tercer

segmento, pasan a ocupar una posición frontal (Richards y Davies, 1983). Finalmente la

larva queda totalmente inmóvil, con el eje antero-posterior acortado y con la forma ovoide

típica del pupan'o. Cuando la larva con las caracteristicas antes mencionadas deja de

responder a estímulos mecánicos mediante el movimiento de sus ganchos bucales,

decimos que se encuentra en el "tiempo cero" de la metamorfosis. Hemos tomado este

momento ("Tiempo cero") como el inicio visible de la metamorfosis en general y del

estadio pre-pupal y del programa de pupariación en particular (ver Introducción y Rabossi

y col, 1991 y 1992). Disponemos de esta manera de un marcador del inicio del desarrollo

dentro del pupan'o absolutamente independiente de las condiciones en que se esté

trabajando (temperatura y humedad). Por lo tanto, todos los tiempos que se mencionen en

esta Tésis, están dados en horas, en referencia a este "Tiempo cero" y siempre referidos a

un ciclo de vida a 23 9C.

3) Materiales

La hemoglobina, caseína, albúmina, gelatina, azocaseína, Pepstatina A, E-64,

Leupeptina, fenantrolina, PMSF, EDTA, p-Nitrofenil-fosfato, 4-methylumbelliferyl-B-D­

glucósido.p-nitrophenyl-B-D-galactopyranosido. fueron de la marca Sigma Chemical

38

Materiales y métodos

Co.(St. Louis,USA). El tiocianato de guanidina fue de Fluka BíoChemika (Alemania). Las

resinas cromatográficas Tiol-Sepharosa 4B, Sephacryl S-200, Mono S HR 5/5, Superosa

12 HR 10/30 empleadas durante la purificación fueron obtenidas de Pharmacía (Uppsala,

Sweden). La resina de afinidad Pepstatina A-agarosa fue de Sigma Co. Centricon-3O fue

de Amicon (Beverly, M.A, USA).

El material radioactívo utilizado fue adquin'do a New England Nuclear (NEN), la

solución acuosa de [32P] dCTP fue de 10 mCi/ml con una actividad específica de 270­

300 Ci/mmol.

4) Preparación de los extractos enzimáticos

La preparación de extractos totales de Ceratitis capitata correspondientes a las

diferentes etapas del desarrollo postembrionario con las que se trabajó en esta Tesis, se

realizaron teniendo en cuenta las características generales de las actividades que se

pretendían determinar. En todas las preparaciones, los individuos correctamente

sincronizados fueron lavados con agua bidestilada para retirarles la arena u otros

materiales que pudieran quedar adheridos. En todos los casos, las preparaciones se

realizaron a 4 °C.

-Extractos totales empleados para la determinación de la actividad trehalasa

durante la metamorfosis: Para todas las edades empleadas, se homogeneizaron SO

individuos en una solución tampón 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgClz, l mM EDTA, pH 7,4,

más el agregado en el momento de BHT y PTU. Este homogenato se centrifugó durante 15

min a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf, a 4 °C. El sobrenadante obtenido se

empleó como fuente de enzima.

-Extractos totales para la determinación de la actividad proteolítica general en larva

lIl con azocaseína: Para cada horario empleado, se homogeneizaron 20 individuos en 1,4

ml de un tampón 0,1 M acetato de sodio, pH 5,3. Este homogenato se centrifugó a 4 °C,

durante 20 min a 14.000 rpm en una centrífuga Sorvall RCSC (rotor SS-34) y el

sobrenadante obtenido se empleó como fuente de enzima.

-Extractos totales para la determinación de (a) la actividad groteolítica general

empleando proteínas enteras como sustrato, (b) la actividad de fosfatasa ácida y (c) la

actividad de hidrolasas ácidas durante la metamorfosis: Se homogeneizaron 50 individuos

Materiales y métodos

de cada edad en un homogenizador tipo Eveljheim con 3 ml de 0,1 M acetato de sodio, pH

4.0. Usualmente 25 recorridas del émbolo fueron suficientes para la completa

homogeneización de las muestras. El homogeneizador se lavó dos veces con 0,5 ml del

mismo tampón realizando 5 recorridas del émbolo cada vez. El homogenato fue

centrifugado en una centrífuga Sorvall RCSC (rotor SS34) a 4 °C, a 10.000 rpm durante 20

minutos. Se descartó el precipitado y el sobrenadante se tomó como fuente de enzima. En

la preparación de los extractos para medir las actividades de fosfatasa e hidrolasas ácidas

se agragaron las siguientes concentraciones finales de inhibidores de proteinasas, l mM

PMSF, 3 mM EDTA, lO pM E-64 y 10 uM pepstatina A.

5) Determinación de los cambios en el peso húmedo de los insectos

durante la metamorfosis

Se pesaron diariamente, 40 insectos en forma individual, desde la inmovilización

definitiva de la larva hasta la emergencia del imago. Se empleó una balanza de precisión

Mettler AE-240.

6) Determinación de la variación de proteínas totales durante la

metamorfosis

Las proteínas totales se determinaron de acuerdo a Lowry y col (1951). Para

eliminar interferencias y péptidos de bajo peso molecular, se empleó la técnica de

precipitación de proteínas con deoxicolato de sodio y ácido tricloroacético (DOC-TCA) de

Peterson (l977). Se determinó absorbancia a 750 nm en un espectrofotómetro Gilford

Response ll, empleando albúmina de suero bovino como estándar.

7) Purificación y cuantificación del contenido de glucógeno y lípidos

durante la metamorfosis

Determinación de glucógeno total: Para cada momento del desarrollo analizado, se

pulverizaron en N2 líquido, aproximadamente 0,5 g de moscas. Este material, luego de ser

pesado, se mezcló con KOH (en una realción 1:2, p/v), y se calentó a lOO0C durante 15

40

Materiales y métodos

min. Posteriormente, se centrifugó en Sorvall RCSC a 1000 rpm durante 5 min y al

precipirado obtenido se le repitió la extracción con KOH.

Luego de la extracción con KOH, el glucógeno se encuentra en la fracción suluble,

y es precipitado con 1.5 ml de etanol durante 12 h a 4 0C. Luego de centrifiJgar a 5000 rpm

durante 15 min, se descartan los sobrenadantes, y los pellets son secados a temperatura

ambiente y resuspendidos en agua bidestilada (100 pl). Para la determinación

espectofotométn'ca del contenido de glucógeno, se preparó una mezcla de 20 ul de la

solución de glucógeno, 80 ul de HCl 5 N y lOOul de agua. A esta solución se le agregó l

ml del Reactivo de Krisman (1962) y se realizó el espectro de absorbancia entre 380 y 580

nm. Como control del contenido y del estado del glucógeno, se empleó glucógeno de

higado de conejo preparado por la Dra D. Tolmasky¿

Determinación de lípidos totales: moscas individuales de diferentes horarios del desarrollo

fueron homogeneizadas en 200 ul de NagSO4. Luego se agregó 1,3 ml de cloroformo

metano] (1:2), se agitó vígorosamente y se centrifugó en microcentrífuga Eppendorf a

8000 rpm por 10 min. Se tomaron 500 ul del sobrenadante para cuantificar los lípidos

totales mediante el método de Warburg y Yuval (1997) que emplea vainillina(en ácido

fosfórico). Los lípidos se determinaron a 490 nm y se utilizó trioleína (Sigma Chemical

Co.) como estándar.

8) Ensayos enzimáticos

Durante esta Tesis, todos los ensayos enzimáticos de cada experimento fueron

realizados al menos por duplicado.

Ensayo de actividad Trehalasa: La actividad de trehalasa se determinó empleando

trehalosa (100 ug / ml) como sustrato. En un volúmen final de 0,2 ml se incubaron 20 ul

de extracto enzimático, lO ul de trehalosa, 20 ul de solución tampón l M Acetato de

Sodio, pH 5,2 y 150 ul de agua. Luego de incubar 60 min a 37 °C, se determinaron los

azúcares reductores por A520 mediante la reacción de Somogyi-Nelson. Una unidad de

actividad enzimática se definió arbitrariamente como la cantidad de umoles de producto

hidrolízado, por minuto y por mg de proteína.

Ensayo de actividad proteolítica general con azocaseína: Se preparó una solución al

2 % de azocaseína en 0,1 M Tris-I-ICl, pH 7 (20 mg / ml). La reacción enzimática se

41

Materiales y métodos

realizó en un volúmen final de l ml. Se preincubaron 0,25 ml de azocaseína al 2 % y la

solución tampón al pH determinado durante 5 min a 37 °C. La reacción se inició por el

agregado de 0,1 ml de extracto enzimático y luego de 50 min se la detuvo con 0,5 ml de

TCA 5 %. La azocaseína de color anaranjado precipita por centrifugación y la absorbancía

del sobrenadante que contiene los azopéptidos liberados se midió a 366 nm.

Ensayo de actividad proteolítica general con hemoglobina: Para la detección y

estimación de la actividad proteolítica general en extractos totales de la mosca del

Mediterráneo, se decidió emplear un método de amplia aplicación como es el basado en la

digestión de proteínas enteras desnaturalizadas por pH. Entre las muchas proteínas

empleadas para este fin resultaron más convenientes: la hemoglobina, la albúmina de suero

bovino, la caseína y la gelatina. El método se basa en la liberación de péptidos solubles en

solución de ácido tricloroacético (TCA) como consecuencia de la degradación de las

proteínas sustrato. La presencia de estos péptidos puede ser convenientemente medida en

el filtrado ácido o el sobrenadante ácido luego de una centrifugación a 14.000 rpm durante

4 min:

a- directamente por determinación espectrofotométrica a 280 nm.

b- por formación de un producto Azul con el reactivo fenólico de Folin- Ciocalteau

y determinación colorimétrica a 500 nm.

El método más conveniente para la medición de la actividad proteolítica general

durante los estadios que transcurren dentro del pupan'o fue el de Takayuki y Tang (1981)

con modificaciones realizadas por el suscripto; se empleó hemoglobina y se determinaron

en forma directa los péptidos liberados a 280 nm.

Se emplearon dos métodos diferentes para preparar hemoglobina bovina

desnaturalizada al 2,0, 2,5 y 5,0 % (p/v). En ambos, la hemoglobina debe ser agregada al

agua bidestilada de a poco. Se debe revolver despacio con una varilla de vidn'o para evitar

que se formen grumos y burbújas, que dificultan y enlentecen la disolución de la misma.

(a) La solución de hemoglobina se dializa durante aproximadamente 14 horas contra agua

bidestilada a 4 °C para eliminar péptidos pequeños que puedan provocar blancos altos (la

membrana de diálisis que se emplea excluye sustancias entre 6000 y 8000 KDa), y

posteriormente se lleva a pH 3,5 con ácido clorhídrico (HCl).

42

(b) La solución de hemoglobina se lleva a volúmen y a pH 3.5 con una solución tampón de

ácido acético 1,35 M, sulfato de amonio 0,02 M.

En ambos casos se debe guardar la solución de hemoglobina a 4 °C y debe ser

utilizada durante los 15 días siguientes a su preparación (utilizarla luego de más tiempo

provoca incrementos muy importantes en los blancos).

Para el ensayo enzimático se emplearon los siguientes reactivos: 0,3 ml de tampón

acetato de sodio 0,1 M (el pH se indicará en cada experimento), 0,1 ml de hemoglobina al

5 % ajustada a pH 3.5 y 0,05 ml de extracto enzimático. Se preincubaron la solución

tampón y el extracto enzimático durante 5 minutos a 45 °C, y se dió comienzo a la

reacción con el agregado del sustrato. El tiempo de incubación a 45 °C varió entre 5 y 30

minutos. La reacción se detuvo con la adición de 0,5 ml de TCA al 6 % en frio, durante 5

minutos. Luego se centrifugó a 14.000 rpm durante 4 minutos y se determinaron los

péptidos liberados en el sobrenadante por determinación espectrofotométrica directa a 280

nm, en un espectrofotómetro Gilford Response H. Se prepararon dos tipos de controles,

agregando los 0,5 ml de TCA 6 % inmediatamente después de agregar la enzima, o bien,

reemplazando la fuente enzimática por agua.

En este trabajo se adoptó la definición de unidad enzimática empleada por

Houseman (1982), donde una unidad de actividad enzimática se define arbitrariamente

como la cantidad de enzima que provoca un incremento de una unidad de absorbancia a

280 nm, por minuto y por mililitro, a 45°C.

Otras proteínas utilizadas como sustrato en el ensayo general de actividad

proteolítica

(a) caseína: Se prepara una solución de caseína al 2,5 % (w/v) en 0,2 M acetato de sodio,

pH 7. Se calienta durante 15 min. a 100 °C, para permitir su completa solubilización.

Cuando está completamente disuelta, se deja enfi-iar, se guarda a 4 °C y es estable por una

semana. Antes de cada ensayo es conveniente calentar la caseína durante 5 min. a 45 °C.

(b) albúmina de suero bovino: Se prepara una solución de BSA al 2,5 % (w/v) en agua

bidestilada. Se calienta durante 4 min. a 100 °C para permitir su completa solubilización.

Se guarda a -20 °C.

43

(c) Gelatina: Se prepara gelatina al 2,5 % (w/v) en agua bidestilada. Se calienta durante 4

min. a 100 °C, para su completa solubilizacíón. Se guarda a 4 °C y es estable por 5 días.

Antes de ser utilizada en los ensayos, se debe calentar durante 5 min. a 45 °C.

Determinación de la actividad de Fosfatasa Acida: El ensayo de actividad de

fosfatasa ácida en extractos totales de mosca del Mediterráneo fiJe realizado sobre p­

nitrofenil fosfato, según el método de Deloach y Mayer (1979). El sustrato fue preparado

en una concentración de 0,1 M en 0,2 M Acetato de sodio, pH 4,5; siendo la concentración

final en el ensayo de 3 mM. Las reacciones fueron realizadas en un volúmen final de 0,5

rnl. Las incubaciones se realizaron a 37 °C entre 5 y 30 minutos y para detener la reacción

se adicionaron 0,3 ml de 6 M Hidróxido de potasio (KOH) y fn'o. En todos los ensayos se

utilizó 0,05 ml de extracto enzimático y el tampón empleado fue el mismo en el que se

preparó el sustrato. En los controles se reemplazó a la fuente de enzima por tampón 0,2 M

Acetato de sodio, pH 4,5. Se cuidó que, en todos los ensayos, las reacciones fueron

lineales en el tiempo y proporcionales a la concentración de enzima. La actividad de

fosfatasa ácida fue determinada en forma directa a 410 nm utilizando un espectrofotómetro

Gilford Response II.

Una unidad de actividad enzimática se definió en forma arbitraria como los umoles

de sustrato hidrolizados por minuto a 37 °C. Para poder calcular las unidades enzimáticas

se debió realizar una curva de calibración con p-nitrofenol, el producto coloreado liberado

durante la reacción.

Determinación de la actividad de hidrolasas ácidas: La actividad de B- glucosidasa

durante la metamorfosis se determinó empleando el sustrato fluorogénico 4­

metilumbeliferil-B-D-glucósído (Sigma Chemical Co.) preparado en una concentración 3

mM en solución tampón 0,1 M acetato de sodio, pH 5,3. La reacción enzimática se realizó

en un volúmen final de 0,l ml, empleando 0,020 ml de extracto total. Luego de una

incubación de 20 min a 37 °C, se agregaron 1,4 ml de solución tampón Glicina/NaOH, pH

10,3 para detener la reacción. Los blancos se realizaron incubando la enzima con la

solución tampón Glicina/NaOH, pH 10,3 antes de agregar el sustrato. La fluorescencia del

44

Materiales y métodos

producto liberado (4-metilumbeliferona) durante la reacción, fue determinada en un

espectrofluorómetro Jasco excitando a 360 nm y registrando la emisión a 450 nm.

La actividad de B-galactosidasa durante la metamorfosis fue ensayada con 3 mM p­

nitrofenil-B-D-galactopiranósido (Sigma Chemical Co.) preparado en 0,1 M acetato de

sodio, pH 5,3. La reacción se inició con el agregado de 0,025 ml de extracto total y luego

de una incubación de 25 min a 37 °C, la reacción se detuvo con 2 ml de solución tampón

carbonato de sodio, pH 9,8. Los blancos se prepararon incubando la fuente de enzima con

carbonato de sodio, pH 9,8 antes de la adición del sustrato. El producto de la reacción

liberado (p-nitrofenol) fue determinado en un espectrofotómetro Gilford Response H a 415

nm. Para ambas hidrolasas, se definió en forma arbitraria a la unidad enzimática como los

umoles de sustrato hidrolizado por minuto.

9) Determinación del tiempo de precipitación en el ensayo de avtividad

proteolítica general

Con el objetivo de determinar el tiempo óptimo de precipitacion de las proteínas

enteras sin digerir cuando se adiciona la solución de TCA al 6 %, se realizó el ensayo

enzimático a 45 °C, con 25 ul de extracto de larva III. Luego de detener la reacción con 0,5

ml de TCA al 6 %, se mantuvo en frío entre S y 240 minutos. No se registraron diferencias

en la absorbancia a 280 nm de los péptidos liberados durante la digestión, en los distintos

tiempos ensayados. Por lo que se adoptó 5 min como tiempo de frenado de la reacción en

frio luego de la adición del TCA.

10) Ensayos de inhibición de la actividad proteolítica general

Todos los ensayos donde se emplearon inhibidores fueron realizados al menos por

triplicado.

Inhibición de la actividad proteolítica general en larva III: Se emplearon los

siguientes inhibidores de proteínasas, PMSF l mM, fenantrolina lO mM, leupeptina 50

uM y E-64 lO uM. En todos los ensayos se preincubaron durante 20 min a temperatura

45

Materiales y métodos

ambiente la fuente de enzima y el inhibidor, luego de lo cual se agregó el sustrato

(azocaseína o hemoglobina), iniciándose de esta forma la reacción a 37 °C.

Ensayo de inhibición de las actividades proteolíticas durante la metamorfosis: Se

utilizaron dos inhibidores específicos, E-64 10-25 uM y pepstatina 10-25 uM preparada en

metanol. En todos los casos, los inhibidores fueron agregados a la solución tampón

empleada y se preincubaron durante 20 minutos a 45 °C, al inhibidor y la fuente de

enzima. Luego de este periodo, se agregó el sustrato (hemoglobina 5 %) para dar comienzo

a la reacción. Todos los controles fueron tratados de la misma manera y estos fueron:

control sin enzima, control con enzima, control con enzima y metano], éste último se

realizó para determinar si los solventes en que fueron preparados los inhibidores producían

por si mismos la inactivación de la enzima.

ll) Reactivos empleados para la caracterización de la actividad

proteolítica

Iodoacetamida, L-cisteína, Ditiotreitol (DTT), B-mercaptoetanol, fueron de la

marca Mallinckrodt Chemical Works (Ny, USA), mientras que Etilen diamino tetraacetato

(EDTA), cloruro de calcio (CaClz), cloruro de magnesio (MgClz), sulfato de cobre

(SO4Cu), fueron de la marca Sigma Chemical Co (St. Louis, USA). Estos compuestos

fueron adicionados directamente a los tampones de reacción (las concentraciones

empleadas de cada uno se indican en Resultados). En todos los ensayos se preincubó

durante 12 minutos al tampón con el reactivo, junto con el extracto enzimático y luego se

inició la reacción con la adición del sustrato. Para todos los ensayos, los blancos se

realizaron preincubando el tampón con el reactivo, el extracto enzimático y TCA 6 %, y

posteriormente se agregó el sustrato.

12) Precipitación con sulfato de amonio de los extractos totales de mosca

del Mediterráneo

Cinco gramos de pupas de 24 h fueron homogeneizados en 15 ml de 100 mM

acetato de sodio, pH 3. Se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min en una centrífuga

Sorvall RCSC (rotor SS34). El sobrenadante fue sometido a precipitación con sulfato de

46

Materiales y métodos

amonio en las siguientes concentraciones 0-20 %, 20-40 %, 40-60 %, y 60-80 %. Los

precipitados de los cortes antes mencionados fueron resupendidos en el menor volúmen

posible de la solución tampón 100 mM acetato de sodio, pH 3,5. Estos precipitados junto

con los sobrenadantes de cada fracción se díalizaron durante 14 horas en 5 litros de la

solución tampón antes mencionada. Posteriormente, se determinó la concentración de

proteínas y la actividad para cada fracción.

A excepción del precipitado correspondiente al corte 0-20 % y el sobrenadante de

la fracción 60-80 % de sulfato de amonio, se registró actividad proteolítica en todas las

demás fracciones. La actividad registrada en el corte 40-60 % fue muy superior a las

demás, por lo que se decidió analizar por separado el efecto del sulfato de amonio en los

cortes 20%, 30%, 70% y 80%. En los resupendidos de 30 y 70 % se registró actividad

proteolítica, mientras que en los correspondientes a 20 y 80%, la actividad fue

prácticamente nula. Como consecuencia de estos experimentos, detenninamos que entre

30 y 70% de sulfato de amonio precipitan la mayoría de las actividades proteolíticas.

13) Aislamiento de las proteínasas involucradas en la histólisis

Se emplearon pupas de 40-45 h y de 98 h para la purificación de la aspaníl y

císteín- proteinasas. Los insectos fueron sincronizados, lavados con agua bidestílada,

congelados con N2 líquido y se mantuvieron a -7O°C hasta su utilización.

- Aproximadamente 60 g de pupas fueron homogeneizadas en una licuadora Omni­

Mixer (Sorvall, Co), en 120 ml de una solución tampón 100 mM Acetato de sodio, lmM

EDTA, 300 mM ClNa, pH 5,0. El pH luego de la homogeneización fue de 6,3. El

homogenato se centrifugó a 12.000 x g durante lO min a 4 °C.

- El sobrenadante obtenido fue sometido a una extracción ácida con ácido acético

glacial hasta pH 4,2. Este homogenato acidificado fue centrifugado a 12.000 x g durante

30 min a 4 °C.

- El sobrenadante acidificado fue precipitado con sulfato de amonio 30-70%.

Luego de un período de reposo de 30 min a 4 °C, las proteínas fueron colectadas por

centrifugación durante 5 min a 12.000 x g. Las proteínas asi precipitadas, se

47

Materiales y métodos

resuspendieron a un pequeño volúmen de la solución tampón de homogeneización y se

dializó contra 3 l de la misma solución durante 2 - 3 h a 4 °C. El material precipitado

durante la diálisis fué removido por centrifugación a 12.000 x g durante 5 min.

- Aproximadamente lO o 20 ml de éste material fueron aplicados a una columna de

tamiz molecular tipo Sephacryl S-200 (Pharrnacia, 135 cm x 3 cm) equilibrada con la

misma solución tampón de homogeneización. Empleando diferentes sustratos, se

registraron cuatro actividades proteinásicas. Se continúó por separado la purificación de

los picos l, Ill y IV.

a) Las fracciones del pico III con actividad de aspartil-proteinasa fueron recolectadas,

concentradas por ultraflltración empleando membranas de Amicon YM- 5 y dializadas

contra una solución tampón 10 mM MES, 10% etanol, pH 5,8. Este material se aplicó a

una columna de intercambio iónico, Mono S- FPLC (Pharmacia) equilibrada con 10 mM

MES, 10% etanol, pH 5,8 y eluída empleando un gradiente linear de NaCl entre 0 y 0,5 M

preparado en la misma solución tampón de equilibrio.

Las fracciones con actividad fueron recolectadas y concentradas hasta 0,5 ml con

Centricon-3O en centrífuga Sorvall, a 1000 rpm en rotor SS34. Este material se aplicó a

una columna de tamiz molecular Superosa 12- FPLC (Pharmacia) equilibrada con lO mM

MES, 300 mM NaCl, 10% etanol, pH 5,8.

b) Las fracciones del pico l con actividad de cisteín-proteinasa fueron recolectadas,

concentradas por ultrafiltración empleando membranas de Amicon YM- 5 y se dializaron

contra la solución tampón de homogeneización, pH 6,0. Este material se sometió a una

cromatografía covalente (Tiol-Sepharosa, Pharmacia) y se eluyó con 20 mM Cisteina en

100 mM fosfato,l mM EDTA, 300 mM ClNa, pH 6,0.

Las fracciones con actividad fueron recolectadas, concentradas y dializadas contra 20 mM

acetato de sodio, l mM EDTA, pH 5,0. Este material se aplicó a una columna de

intercambio iónico, Mono S- FPLC (Pharmacia) equilibrada con la misma solución

tampón antes mencionada y se eluyó empleando un gradiente linear de NaCl entre 0 y 0,7

M preparado en la misma solución tampón de equilibrio.

El material con actividad se aplicó a una columna de tamiz molecular Superosa 12- FPLC

(Parmacia) equilibrada con 20 mM acetato de sodio, l mM EDTA, 300 mM NaCl, pH 5,0.

48

Materiales y métodos

c) Las fracciones del pico IV con actividad de cisteín-proteínasa fueron recolectadas,

concentradas por ultrafiltración empleando membranas de Amicon YM- 5 y se dializó

contra la solución tampón de homogeneización, pH 6,0. Este material se sometió a una

cromatografia covalente (Tiol-Sepharosa, Pharmacia) y se eluyó con 20 mM Cisteína, 100

mM fosfato,l mM EDTA, 300 mM NaCl, pH 6,0.

Las fracciones con actividad fueron recolectadas, concentradas y dializadas contra 20 mM

acetato de sodio, l mM EDTA, pH 5,0. Este material se aplicó a una columna de

intercambio iónico, Mono S- FPLC (Pharmacia) equilibrada con la misma solución

tampón antes mencionada y se eluyó empleando un gradiente linear de NaCl entre 0 y 0,3

M preparado en la misma solución tampón de equilibrio.

14) Columna de afinidad: Concanavalina A-Sepharosa

El material proveniente de una precipitación con sulfato de amonio 30-70 % fue

dializado contra 100 mM acetato de sodio, pH 3,5. La columna de Con A-Sepharosa fue

equilibrada en 100 mM acetato de sodio; l mM ClzCa; l mM Clen y 150 mM ClNa, pH

4. La muestra fue pasada a través de la columna y el eluido reciclado tres veces, luego de

lo cual se lavó la misma con lO volúmenes de la misma solución tampón pero sin metales.

La elución se realizó con 100 mM acetato de sodio pH 5, 150 mM ClNa, 300 mM a-metil­

glucósído y a-metil-manósido, luego de lo cual se midió actividad a todas las fracciones.

15) Columna de afinidad: Pepstatina A- Sepharosa y Pesptatina A­

Agarosa

Columna de Pepstatina A-Sepharosa: La resina se mantiene a 4°C en 0,1M Tris­

HCl, 1M NaCl, l mM EDTA, pH8,6 (solución A). Antes de empaquetarla en la columna

se realizan tres series de lavados. En el primero y el último, se lava tres veces con O,lM

Acetato de Sodio, l M NaCl, l mM EDTA, pH 3,5 (solución B). El segundo lavado se

repite tres veces con la solución A. La resina equilibrada a pH 3,5, se seca y se acopla con

la muestra durante 45 min a temperatura ambiente. La resina se empaqueta en la columna,

se lava con la solución B, y se eluye con O.lM Acetato de Sodio, l M NaCl, l mM EDTA,

pH 5 y posteriormente con la solución A.

49

Materiales y métodos

Se determinaron proteinas por A 280 nm y la actividad proteolítica por el método de

Anson (1939) (ver más abajo).

Columna de Pepstatina A-Agarosa: se realizó exactamente igual que la anterior,

pero las fracciones eluídas con la solución A fueron dializadas inmediatamente contra la

solución B durante 45 min, a 4 °C. Luego de la diálisis se determinó actividad por el

método de Anson.

16) Ensayos de actividad proteolítica empleados durante la purificación

Aspartil-groteinasa: Se empleó el método de Anson (1939) para registrar la

actividad de aspanil-proteinasas durante la purificación. Entre 50 y 200 ul de fuente de

enzima fueron mezclados con 1200 ul de solución de hemoglobina al 2 % utilizada como

sustrato. Esta mezcla enzimática se incubó a 37 °C por 30 min. La reacción se detuvo

adicionando 2400 ul de 0,33 M de ácido tricloroacético y luego de 30 mín de reposo, se

separaron los péptidos liberados durante la digestión de esta proteína entera por medio de

filtración con papel Whatman 3. Dos mililitros de este filtrado se mezclaron con 4 ml de

0,5 M de NaOH y l ml de reactivo de Folin-Ciocalteau (diluido 1:3). Luego de 5 min, se

determinó la absorbancia a 750 nm. Una unidad de actividad es la cantidad de enzima que

digiere a la hemoglobina bajo condiciones estándares a una velocidad tal que los péptidos

liberados (que no precipitan con ácido tn'cloroacético) producen la misma intensidad de

color con el reactivo de fenol que un miliequivalente de tirosina.

En todos los ensayos donde se empleó pepstatina A como inhibidor especifico de

aspartil-proteasas, se preincubaron durante 20 min la fuente de enzima y el inhibidor, a

temperatura ambiente, luego de lo cual se agregó el sustrato, iniciandose de esta forma la

reacción a 37 °C.

Cisteín-proteinasas: Para seguir la actividad de las cisteín-proteinasas durante la

purificación se emplearon sustratos fluorogénicos, Z-Phe-Arg-NHMec y Z-Val-Arg­

NHMec (Sigma Chemical Co), cuyo producto liberado (aminometilcumarina) se

determinó fluorométricamente (excitación 370 nm y emisión 460 nm). Los reactivos

empleados fueron, 340 mM acetato de sodio, 4 mM EDTA, pH 5,5; 4 mM DTT preparado

en la solución tampón anterior; lmM del sustrato, preparado en DMSO y la reacción se

50

Materiales y métodos

detuvo con l mM ácido iodoacético en agua (IAA). El ensayo comenzó preincubando lO

pl de fuente enzimática, 490 pl de solución tampón y 250 pl de DTT, durante 5 min a 37

°C. La reacción se inició con el agregado de 250 ul de sustrato y luego de 10 min se paró

con 2 ml de IAA. Una unidad de actividad enzimática se expresa como la cantidad de

enzima que hidroliza l uM de sustrato por min

17) Electroforésis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantes

Se realizaron electroforésis en geles de poliacrilamida con el sistema

desnaturalizante de Laemmli (1970), empleando geles (30 ml) y mini-geles (5 ml)

verticales. El tamaño del poro del gel de corrida fue relativo a una concentración de lO,

12,5 ó 15 % de acrilamida según se indique, preparado en 0,375 mM Tn's-HCl, 0,1% SDS,

pH 8.6. El gel de empaque fue de 5 % de acrilamida. El tampón de corrida utilizado fue

0,1 % SDS, 190 mM glicina y 25 mM Tris-HCI, pH 6.8.

Las proteínas desnaturalizadas fueron fijadas y teñidas en una solución de

"Coomasie brillant blue" (CBB R-250) en ácido acético, durante dos horas en caliente

(55°C) ó durante la noche a temperatura ambiente. Los geles fueron desteñidos utilizando

pn'mero una solución de metano] 45 %, ácido acético 9 % durante 1-2 horas y luego ácido

acético lO %, metanol 5 %, durante 2-3 horas.

Dos tipos de estándares de peso molecular marca Sigma fueron empleados en los

geles de poliacrilamida con SDS:

a) Estándares sin teñir: b) Estándares preteñídos

94 KDa, fosforilasa B 211 KDa macroglobulina67 KDa, seroalbúmina bov. l 19 KDa B-galactosidasa43 KDa, ovoalbúmina 98 KDa Fructosa-ó-P quinasa30 KDa, anhidrasa carbóníca de eritr. bov. 80,6 KDa, Piruvato quinasa20,1 KDa, inhibidor de tripsina de soja 64,4 KDa, fumarasa14,4 KDa, B-lacto-albúmina 44,6 KDa deshidrogenasa.láctíca

38,9 KDa, 3-P isomerasa

18) Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no

disociantes

Materiales y métodos

Para cada muestra analizada, tres insectos fueron homogeinizados en una solución

tampón 0,1 M acetato de sodio, pH 4.4, de la misma manera que se describió

anteriormente. Este extracto crudo fue disuelto S veces con la solución tampón de

homogeneización conteniendo lO % glicerol y fiJe utilizado como fuente de enzima. Las

muestras no fueron hervidas antes de la electroforesis. Se prepararon geles verticales de

poliacrilamida díscontinuos, no disociantes de acuerdo a Hames (1987). Las proteinas

fueron separadas en geles con una concentración de lO % acrilamida a 100 volts durante

80 min y a 4 °C. Los valores de pH del gel concentrador, separador y la solución tampón

de corrida fueron 6,8; 4,3 y 4,5; respectivamente.

Luego de la electroforesis, el gel fue incubado durante 20 min a 28 °C con 2 %

hemoglobina desnaturalizada a pH 3,5 e inmediatamente transferida a otro recipiente con

la solución tampón de incubación, 0,1 M acetato de sodio, S mM 2- mercaptoetanol, pH

4,4, durante 60 min a 37 °C. La reacción se interrumpió dejando el gel tiñendo durante

toda la noche con 0,8 % Coomasie brillant blue R-250 en 7 % ácido acético. La actividad

proteolitica se determinó como un área clara en contraste con el fondo azul de la

hemoglobina no degradada.

Para determinar el efecto de los inhibidores, los extractos crudos de pupas de 45 h

fueron preincubados con los mismos durante 20 min a 4 °C antes de la electroforesis, o

bien los inhibidores fueron adicionados en la solución tampón de incubación, luego de la

electroforesis.

19)Electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa

Las proteínas separadas en los geles de poliacrilamida, fueron electrotransferidas a

membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Shuell, Alemania) con solución tampón 20 mM

Tris, 150 mM glicina, 20 % metanol (v/v) en un aparato de transferencia a 95 voltios

durante una hora y media, a 4 °C para el caso de los mini-geles, y a 75 voltios durante 4

horas a 4 °C para geles de 30 ml.

20) Detección de glicoproteínas por la técnica de "affinobloting"

Una muestra de la fracción con actividad de cistein-proteinasa que denominamos

MCP II proveniente de una Mono S (fracción altamente purificada) fue sometida a una

Materiales y métodos

electroforesis en geles de poliacrilamida 10 % en presencia de SDS. Las proteínas fueron

electrotransferidas a una membrana de celulosa, según se describe en el punto anterior.

Para la detección de las glicoproteínas se utilizó el método de Faye y Chrispeels (1985)

con leves modificaciones introducidas en nuestro laboraton'o, que utiliza la capacidad de la

Con A de unir simultaneamente el sustrato en el gel y otra glicoproteína como la

peroxidasa en su condición de reactivo (di)(tetra)valente. Como controles positivos de

proteínas glicosiladas, se empleó la fitohemoaglutínina y la ribonucleasa B. La membrana

de nitrocelulosa se fijó a temperatura ambiente durante 15 min en ácido acético­

isopropanol-agua (lO: 25: 65). Se lavó en primer lugar tres veces de 5 min cada una con

agua bidestilada y luego lO min con TBS (20 mM Tris-HCl, 500 mM ClNa, pl-I 7,4). La

membrana se bloqueó con BSA 3 % en TBS durante l h a temperatura ambiente. Luego de

lavar con TBS, se procedió a realizar la unión de la Concanavalina A. Para ésto se incubó

la membrana durante l h a temperatura ambiente con 1% BSA, l mM Clen, 1 mM

ClzCa en TBS con 50 ug Con A/ml de la solución antes mencionada. Se enjuagó 2 veces

con TBS durante lO min cada una y posteriormente 4 veces con l mM Clen, l mM

ClzCa, 0.1 % Tween-ZO en TBS, durante 15 min cada uno.

La unión a la peroxidasa se realizó incubando durante l h 100 ug de peroxidasa/

ml de la siguiente solución: l % BSA, l mM Clen, l mM ClzCa en TBS. Se enjuagó la

membrana dos veces con TBS durante lO min cada uno y luego 4 veces de 15 min cada

una con l mM Clen, l mM ClzCa, 0.1 % Tween-ZOen TBS.

Para el revelado se prepararon 50 mg de 4 Cl-l-Naftol en 20 ml de metanol frío, que se

mezcla con 80 ml de TBS. 500 ul de imidazol 2 M, 100 ul H202. Esta reacción se

interrumpió con agua.

21) Determinación del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico de las proteinasas purificadas se realizó en un aparato

PhastSystem de Pharmacia. Se emplearon 3 ul de las fracciones puras de las tres enzimas

(20-30 ngul). Luego de realizar la electroforesis, las proteínas fueron fijadas con ácido

tricloroacético al 20 %, para ser teñidas posterionnente con CBB.

Para la determinación del punto isoeléctrico se emplearon los siguientes estándares:

aminoglucosidasa (3,50), inhibidor de tripsina de soja (4,55), B lactoglobulina A (5,20), B­

53

Materiales y métodos

anhidrasa carbónica bovina (5,85), B-anhídrasa carbónica humana (6,55), banda de

mioglobina ácida de caballo (6,85), banda de mioglobina básica de caballo (7,35), banda

lectina ácida de lenteja (8,15), banda lectina media de lenteja (8,45), banda lectina básica

de lenteja (8,65), tripsinógeno (9,30).

22) Preparación de antisueros contra las proteinasas purificadas en

geles de poliacrilamída

Para la preparación de los antisueros contra las proteinasas MCP I, MCP II y

EMAP, se utilizó el siguiente protocolo:

En todos los casos, las proteínas purificadas fueron aisladas mediante electroforesis

preparativas en geles de poliacrilamida desnaturalizantes

l- luego de la electroforesis, se cortó una tira de cada lado del gel, se tiñó con CBB y se

localizaron a las proteinas de interés. Estas tiras asi teñidas, se utilizaron de guía para

cortar las bandas correspondientes a las proteínas requeridas del gel.

2- la banda se congeló en nitrógeno líquido, y se molió hasta polvo impalpable en un

mortero.

3- se emulsionó el polvo con adyuvante completo de Freund (en la primera inoculación y

se inoculó la suspensión, subcutáneamente en varios puntos del dorso de un conejo de

cinco meses (2.5-3 kg de peso). Se inocularon aproximadamente 100 pg de proteína por

cada inyección.

4- entre los 15-20 dias de la primera inoculación, el conejo recibió el primer refuerzo (en

los refuerzos, la proteína se emulsionó con adyuvante incompleto de Freund).

5- a los diez días de esta inyección, se extrajo de la vena externa de la oreja del conejo por

corte, aproximadamente l ml de sangre. El suero se obtuvo luego de incubar la sangre

extraída por una hora a 37 °C, dejarla en frio durante una noche y centrifugar a baja

velocidad. Se determinó el título de anticuerpos por método de inmunoblotting (si el

título resultara bajo, se continúa aplicando refuerzos hasta obtener un título adecuado para

trabajar).

6- alcanzado el título adecuado, se sangraron los conejos a blanco por punción cardíaca.

23) Aislamiento de RNA total y RNA mensajero

Materiales y métodos

Para la extracción de RNA total de C. capitata se emplearon individuos en

distintas etapas del desarrollo. Se siguió el método descripto por Chomczynski y Sacchi

(1987), con pequeñas modificaciones:

l- 0.3 g de pre-pupas fueron pulverizadas en mortero con N2 líquido.

2- posteriormente se homogeneizaron en 2 ml de solución desnaturalizante (4 M

tiocianato de guanidina, 25 mM citrato de sodio, 0.5% sarcosil, 0.1 M 2-mercaptoetanol,

pH 7).

3- por cada ml de homogenato se agregaron 0.1 ml de 2 M acetato de sodio, pH 4, l ml de

fenol : agua y 0.2 ml de cloroformo : isoamílico (49:1) y se incubó durante 15 mín a 0 °C.

4- se centrifugó a 10.000 x g a 4 °C durante 20 min.

5- la fase acuosa superior con el RNA se transfirió a otro tubo.

6- se agregó un volúmen de isopropanol y se incubó durante 2 h a -20 °C.

7- se centrifugó a 10.000 x g a 4 °C durante lO min.

8- se resuspendió el pellet de RNA en 0.3 ml de solución desnaturalizante.

9- se agregó un volúmen de isopropanol y se incubó l h a -20 °C.

10- se centrifugó a [0.000 x g a 4 °C durante 10 min.

ll- se resuspendió el pellet de RNA en 0.2 ml de etanol 75 % y se incubó 15 min a

temperatura ambiente.

12- se centrifugó a 10.000 x g a 4 °C durante 5 min.

13- se dejó secar el pellet durante IO min a temperatura ambiente.

14- se resuspendío el precipitado en 0.2 ml de agua DEPC y se guarda a -70 °C.

Purificación de mRNA: Luego de la extracción del ARN total, se aislaron los mensajeros

con extremo 3’ poli (A), mediante el kit comercial PolyATract Systems (Promega),

siguiendo las indicaciones del fabricante. Este método emplea como iniciador a un oligo

(dT) biotinilado que hibridiza con gran eficiencia a la región 3' poli (A) de la mayoria de

los ARN mensajeros maduros de eucan'otas. Estos híbridos fueron capturados por

partículas magnéticas que tienen acopladas estreptoavidina, que son separadas de la

muestra por un imán. Posteriormente el ARN mensajero purificado se eluyó con agua

tratada con DEPC.

Materiales y métodos

24) Síntesis de cDNA

La primera hebra de cADN fue sintetizada empleando la transcriptasa reversa M­

MLV (Promega). EL ARN poli (A) de Ceratitis fue empleado como templado para el

iniciador oligo(dt). Se siguió el protocolo propuesto por GIBCO BRL:

1- 330 ng de ARN total (3 ul) se mezclaron con 0.5 ug de oligo(dt) (l ul) y se agregó

agua tratada con DEPC hasta un volúmen de 13.5 ul.

2- se incubó a 65 °C durante lO min, y luego de este tiempo se pasó inmediatamente a

hielo durante 2 min.

3- en forma separada se preparó una mezcla que contenía 4 pl de tampón RT 5X (250 mM

Tn's-HC], 375 mM KCl, 15 mM MgClz, SOmM DTT, pH 8,3), l ul de lO mM dNTPs y

0.5 ul de RNAsin (20 U) (Promega).

4- se agregó la mezcla preparada en el paso anterior al tubo que contenía el ARN y se

incubó a 42 °C durante 5 min.

5- la reacción se inició por el agregado de l ul de transcriptasa reversa M-MVL (200 U)

de forma tal que el volúmen final de reacción fue de 20 ul y se incubó a 42 °C durante 50

min.

6- la reacción se detuvo al inactivar a la enzima por incubación a 72 °C durante 15 min.

7- los tubos se guardaron a -70 °C hasta su uso.

8- se realizó un tubo control sin la enzima.

25) Reacción de polimerización en cadena mediante la Taq polimerasa

(PCR)

Diseño de los iniciadores ("primers")

En función de la secuencia de los extremos amino terminales de cada una de las

tres proteinasas purificadas en C. capitata., se diseñaron los iniciadores específicos. Por

otro lado, se diseñaron iniciadores para los sitios cataliticos conservados de las

proteinasas aspárticas y de las císteín proteinasas. A continuación se presenta las

secuencias de los mismos; los primeros cuatro fueron sintetizados por la empresa

GENESET, mientras que el ultimo fue sintetizado por Life Technologies, INC;

1- Secuencia del iniciador para el extremo amino terminal de EMAP

56

Materiales y métodos

5'-CCC AAT TTC gCC ATg gg-3'A c Tg

2- Secuencia del iniciador para el extremo amino terminal de la cisteín proteinasa MCP-II

5'-AAC ATC gAg TCC gAT ACC gCC gAC gA-3'T T C g

3- Secuencia del iniciador para el extremo amino terminal de la cisteín proteinasa MCP-I5'-TTg CCg gAA AgC TTC gA-3'

A 8C

4- Secuencia del iniciador para el sitio catalítico de cisteín proteinasa;5'-TgT ng gCA TTT ggA-3'

C C C Cg gT T

5- Secuencia del iniciador para el sitio activo de proteinasa aspártica;

5'-AAT CTA gAT TNC TNC TNC CNg TAT CAA A-3'

6- Secuencia del iniciador de reaper

5’-CGGGATCCCGACAngCAnggCATTCTACATACCCgA (pri 1-25)

5’—CGGGATCCCGACCGGAGCAGAAGGAGCAGCAGATTCTC (pril70-l97)

5’-CTTAAGTCATTGCGATGGCTTGCGATATTTGCCGG (pri 50-75)

Las condiciones utilizadas para la realización de la reacción de amplificación se presentan

en la sección de Resultados en la leyenda correspondiente de cada figura.

Condiciones empleadas para la amplificación de los cDNAs egpe_cíficospor PCR

Las reacciones de PCR fueron realizadas en un ciclador térmico MJ Research,

empleando como templado cADN de la mosca del Mediterráneo de distintos horarios

según el experimentoLas condiciones óptimas para la reacción de amplificación fue la

misma para las tres proteinasas: 0.5 mM dNTP, 5 U de Taq polimerasa (Promega).

Mientras que para la proteinasa aspártica se empleó 3.5 mM MgClZ, para las dos cisteín­

proteinasas 2.5 mM Mg C12 fue la concentración óptima. De los 20 ul de la reacción de

cDNA se emplearon 2 ul para la reacción de PCR de la proteinasa aspártica y entre l y 1.5

ul para las cisteín- proteinasa. El volúmen final de reacción en todos los casos fue 50 ul.

El programa empleado para la amplificación de los fragmentos de interés fue: 3 min a 93

57

Materiales y métodos

°C; 35 ciclos de 30 seg a 94 °C, 30 seg a 43 °C y 2 min a 72 °C finalizando la reacción con

5 min a 72 °C.

Análisis de los productos de PCR

Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa l-l.2-l.6-l.8 %­

TBE segun Sambrook et al (1989). Los geles fueron desarrollados a 50 V y luego de la

corrida fueron teñidos con Bromuro de etidio.

26) Elución del DNA proveniente de geles de agarosa

Los productos de PCR identificados a la luz UV fueron aislados cortando la banda

del gel que se guardó a -2O °C hasta su utilización. Se emplearon dos métodos para

obtener los productos de PCR puros:

Método l: 1- para eluír el ADN de la agarosa, se agregaron 100 ul de agua bidestilada

esteril y se dejó eluir toda la noche a temperatura ambiente.

2- para precipitar el ADN eluído se agregó acetato de sodio hasta una concentración final

0.3 M, y glucógeno hasta una concentración final de lO mg / ml y 2 volúmenes de etanol

fn'o.

Se dejó precipitar toda la noche a -20 °C y se centrifugó 20 min a 14.000 rpm en

centrífuga Eppendorff.

Método 2: Kit comercial GENECLEAN II (BIO lOl Inc) siguiendo las instrucciones

del fabricante. Este kit contiene una matn'z de sílica que une especificamente ADN de

simple o de doble cadena, purificandolo de cualquier otro contaminante que pudiera

contener el pedazo de agarosa

27) Clonado de los productos de PCR en el Vector T

Los productos de PCR eluídos y purificados, fueron clonados en el vector de alto

número de copias, PGEM-T de Promega. Este vector comercial proviene del vector

PGEM®-52f(+) que fue cortado con EcoR V y se le adicionaron timidinas en ambos

58

Materiales y métodos

extremos. La adición de 3' T en el sitio de inserción, aumenta la eficiencia de ligación del

producto de PCR, y previene la recirculan'zación del vector. El clonado de los distintos

productos de PCR se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante.

28) Bacterias, medios de cultivo y antibióticos

La cepa bacteriana empleada para en la transformación fue E. coli DHS F’ Iq de la

familia K-lZ.

LB: 1% Bacto triptona, 0,5 % extracto de levadura, 1% NaCl en agua destilada; se ajusto

el pl-l a 7,0 con NaOH (Sambrook y col., 1989)

LB agar: al medio descripto anteriormente se le agregó agar hasta una concentración de

1,5%. Todos los medios se esterilizaron en autoclave durante 30 min a 1,5 atmósferas

Las bacterias fueron seleccionadas empleando ampicilina hasta una concentración

final de 100 ug/ml.

29) Purificación de plásmidos de cultivos de E.coli

Se empleó el kit comercial de Qíagen siguiendo las instrucciones del fabricante.

Este kit comercial presenta un rendimiento en la purificación de ADN de hasta lO ug en

cultivos entre l y 5 ml. El protocolo se basa en una lisis alcalina y degradación del ARN.

Se eliminan las proteínas mediante una precipitación ácida a pH 4,8. Finalmente, se

emplea una columna que adsorbe específicamente al ADN.

30) Secuenciación directa del DNA y de los fragmentos clonados

Se utilizó el kit comercial CircumVent Thermal Cycle Dídeoxy DNA Sequencing

(New England Biolabs), que permite secuenciar nanogramos de ADN simple o doble

cadena. mediante PCR. Se empleó en cada reacción una cantidad aproximada de 200 ng

de ADN y [32P] dATP radiomarcado. Además de la poca cantidad de templado que se

utiliza en la reacción de secuenciación, este kit emplea una ADN polimerasa Vent RTM

(exo-) que no requiere de una reacción de desnaturalización de la doble hebra de ADN, asi

59

como tampoco de una reacción de "annealing". En todos los casos se siguieron las

instrucciones del fabricante.

Luego de detener la reacción, las muestras fiJeron calentadas a 80 °C durante 3 min

y sembradas en un gel de poliacn'lamida 6% conteniendo 45% de urea. La electroforésis

se realizó a 1500 V, previa precorrida durante 30 min al mismo voltaje. Inmediatamente

finalizada la con-ida, el gel fue transferido a papel Watman 3 MM y secado por vacio a 80

°C durante 60 min en un equipo secador BRL. Posteriormente al secado, se expuso por

diferentes tiempos en contacto directo con una película X-omat AR-S (Kodak).

31) Análisis histológicos

Grupos de 10 individuos perfectamente síncronizados fireron colocados a distintos

horarios del desarrollo en el fijador de Bouin durante 24 h a temperatura ambiente.

Posteriormente fueron cortados transversalmente entre el cuarto y quinto segmento y

dejados otras 24-48 h en fijador para permitir que penetre y llegue a los tejidos más

internos. Luego se procedió a preparar las piezas para la inclusión en parafina. Para esto,

se deshidrató ambas parte de los individuos empleando una serie de concentración

creciente de alcohol etílico, y para pasar finalmente a un líquido intermediario que facilite

la penetración de la parafina. Ambas porciones fueron embebidas en parafina y se

realizaron cortes entre 3 y 5 um. El método general empleado para la coloración de los

preparados en parafina fue hematoxilina-eosína, y se emplearon otras tinciones

específicas, como la técnica P.A de Schiff, el método tricrómico de Mallory, el Rojo

Sudán lll y Rojo Congo. Los cortes y la tinción de los preparados fueron realizados en

colaboración con la histotécnica Sra. Marta Grinfeld del Dpto. de Patología del centro

Gallego de Buenos Aires.

60

RESULTADOS

Resultados

Debido a la importancia que le asignamos en esta Tesis al enmarcamiento del

proceso de histolisis larval durante la metamorfosis y su relación con otros procesos que

ocurren durante la misma, es necesario definir en estas primeras páginas de Resultados

los distintos estadios que transcurren durante la vida postembrionaria de la mosca del

Mediterráneo y los principales eventos que llevan a la transformación de la larva en el

adulto (Figura 12), todo ello de acuerdo a nuestros datos. Por otra parte, describimos

también los horarios principales en que se han tomado las muestras para su análisis.

El desarrollo postembrionario y los principales programas de la metamorfosis

fueron descriptos y estudiados en detalle durante mi Seminario de Licenciatura, y

publicados (Rabossi y col, 1991, 1992, 1993). En muchos casos éstos estudios fueron

completados durante esta Tesis y publicados en Rabossi y Quesada (1994), Quesada y col

(1995) y Rabossi y col (2000). En la Figura 12, presentamos un esquema con los

pn'ncipales eventos macroscópicos y moleculares durante el ciclo de vida de Ceratitis

capitata.

Los horarios que se mencionan en esta Tesis están dados en relación al “Tiempo

cero” que se define más abajo y que consideramos por definición como el inicio de la

metamorfosis, por lo tanto, las horas precedidas por el signo menos, corresponden a

larvas de tercer estadio y los horarios positivos se refieren a individuos

correspondientes a los estadios de pre-pupa, pupa y adulto farado.

La duración de los distintos estadios que se mencionan, están dados para insectos

criados en nuestras estrictas condiciones de laboratorio, a 239€, 50-60 % RH y un

régimen de luz-oscuridad 16-8 h (ver Materiales y Métodos). En estas condiciones, la

duración de ciclo de vida -desde la ovipuesta hasta la emergencia del adulto- es de 25

dias (604-630 h). El desarrollo embrionario presenta una duración de 52 h, la etapa larva],

240 h y las etapas que se desarrollan dentro del pupario, 312 h.

61

Resultados

HORAS0 '120 O 40 l“ 314

l EMBR'ONl U I UI I lJII I PREPUPAI PUPA l ADULÏOFAMPDRAS 0 52 ¡24 196 3l6 356 460 630

¿#4 4 4 4 4 Á 4 4 4a b c cl e Í g h i ¡ lr

r- Pupañación-i

i- Pupación—-4

i-——P.C.L—l

9- P.C.P.—I

l—- P.C.A.

a- salio de larva IIIdel alimento {-8 hs.)

b- pupario blanco rugoso. Iniciode la puporiación. Iniciodel estadiode Prepupa. (0 hs.)

c- pupario blanco liso.d- coloración definitiva del puparioe- apólisis larval-pupal. Iniciode la pupaciónF comienzo del estadio Pupol. Pupa criplocelúlica.g- linal de la pupariación. Sólo trazas de las proteinas cuticulares

larvales. Se comienza a detectar la PCG-l 00.

h- aversión de cabeza y apéndices larócicos. Papa laneracelúlica.i- final de la pupación. Patrón definitivo de PCP. Proporciones

definitivasde cabeza, tórax y abdomen.i- muda de pupa a adulto iarado. Desaparición de PCG-lOO,cambio en

el patrón de proteínas cuticulares.lr- emergencia del irnago.

Figura 12: Resumen de los principales eventos macroscópicos y moleculares ysu ocurrencia temporal durante el ciclo de vida de Ceratz'tis capítata a 23 9C.P.C.L: patrón de proteínas cuticulares larvales, P.C.P: patrón de proteinas pupales,P.C.A: patron de proteínas cuticulares del adulto (Rabossi y col., 1994).

Estadios larvales

En Ccapítam se reconocen tres estadios larvales, cuyas larvas sucesivas se

parecen entre si. Las larvas crecen en peso y tamaño al pasar de un estadío al otro (la

larva I presenta una longitud media entre 0.9 y l mm, la larva II mide entre 3 y 5 mm,

mientras que la larva III mide entre 7 y 9 mm) (Quesada y col, 1995).

62

Resultados

En nuestros estudios hemos utilizado larvas en el último día del tercer estadio,

antes de iniciar la metamorfosis. Principalmente, hemos empleado larvas de tres horan'os

diferentes que presentan las siguientes caracteristicas:

- Larva III con el intestino lleno, es la larva en el último de día de

desarrollo antes de iniciar la metamorfosis. Esta larva se alimenta activamente y

rechaza la exposición a la luz. Las muestras correspondientes a este horan'o se

separan del alimento aproximadamente 20 h antes del inicio de la metamorfosis

(-20 h).

- Larva III con el intestino vacio, es la larva madura que ha dejado de

alimentarse, ha “purgado” su intestino y que rechaza la exposición a la luz. Las

muestras correspondientes a este horario se separan del alimento

aproximadamente 12 h antes del inicio de la metamorfosis (-12 h). Este cambio

de comportamiento alimentario estaría dado por un pulso pequeño de hormona de

la muda (no detectado hasta ahora en Ceratitis), previo al gran pulso de hormona

que dispara la metamorfosis.

- Larva “de salto” (—8h), es la larva que emergió a la superficie del

alimento y después de un período muy corto de vagabundeo (“wandering”), que

en esta especie es de tan sólo unos pocos segundos, salta del mismo en busca de

un lugar seco y oscuro donde pupariar. Esta larva es fototrópica para salir del

alimento, pero inmediatamente luego de saltar busca un lugar oscuro. En nuestras

condiciones de cría, el salto de la larva III ocurre 8 h antes del inicio de la

metamorfosis (—8h), con oscilación de i 15 min.).

Proceso de inmovilización

Después del primer salto, el pen'odo en que la larva salta secundariamente para

dispersarse se extiende durante dos horas aproximadamente. Durante este tiempo la

intesidad de los saltos disminuye progresivamente. Finalmente la larva deja de saltar y

emplea otra forma de movilización, esta es a través de movimientos de alargamiento y

acortamiento del cuerpo. Este segundo tipo de movimiento se va haciendo cada vez

menos frecuente hasta que la larva se inmoviliza ocupando su posición definitiva en el

terreno.

63

Resultados

Durante la última hora u hora y media del proceso de inmovilización, se produce

la morfogénesis del pupario. La larva acorta aproximadamente un 20 % su longitud y

adquiere la típica forma ovoide (Rabossi y col, 1992). El acortamiento se produce

esencialmente por la retracción de los tres primeros segmentos anteriores.

Tiempo cero

Hemos definido en forma relativamente arbitraria como "tiempo cero" de la

metamorfosis al momento en que la larva, habiendo retraído los tres segmentos

anteriores y adquirido la forma ovoide típica, se inmoviliza definitivamente, y ya no

responde a estímulos mecánicos (Rabossi y col 1991 y 1994). Este es el momento que

se utiliza en forma rutinaria en nuestro laboratorio para sincronizar los cultivos de

Ceratitís con muy alta precisión

Es necesario Tener en cuenta que, en ocasiones, algunos horarios se determinan

retroactivamente a partir del tiempo cero y que ello permite descartar aquellos animales

que se aparten significativamente de la sincronización

Estadios que transcurren dentro del pupario

Dentro del pupario se reconocen tres estadios:

Estadio de pre-pupa: se extiende desde la inmobilización definitiva de la larva (0

h) hasta el comienzo de la deposición de la cuticula pupal (40 h) (Figura 12). Durante

este estadio hemos utilizado, principalmente, muestras tomada en los siguientes horarios:

Pre-pupa 0 h; son los individuos que han adquirido la forma ovoide

tipica, y la cuticula larval que formará el pupario es rugosa y transparente. Estos

individuos se han inmovilizado definitivamente, y ya no responden a estímulos

mecánicosEn este horario se inicia el proceso de pupariación (ver más adelante).

Pre-pupa ZOEh; son los individuos que están completando el proceso de

apolisis larval-pupal, es decir la separación de la epidérmis de la cuticula larval,

dejando un espacio para la deposición de la cuticula pupal Su obtención está

facilitada por que tienen la capacidad de flotar cuando se los sumerge en el agua.

Estadio de pupa: se extiende desde la deposición de la cuticula pupal a partir de

las 40 h (considerado por nosotros como el primer evento tangible de la existencia de una

Resultados

pupa en formación) hasta las 144-152 h, cuando se produce la muda de la cutícula pupal­

adulto (Figura 12). El marcador morfológico asociado con este último evento es la

aparición del color anaranjado pálido en los ojos. Al igual que en el estadio pre-pupal se

utilizaron distintos horarios, pero en todos los casos los horarios clave empleados fueron:

Pupa 40 h; (pupa criptocefálica) estos individuos tienen aspecto de

bolsa, donde el abdómen representa la 4 / 5 partes del cuerpo y está segmentado.

El tórax es reducido y aún no se han evaginado ni la cabeza ni los apéndices

(Figura 13).

Pupa 46-48 h; (pupa fanerocefálica) en estos individuos se ha producido

la evaginación de la cabeza y los miembros torácicos. La cabeza presenta un

perfil trilobulado con los ojos muy prominentes de color marfil pálido. El

abdomen permanece aún segrnentado y de mayor tamaño que el tórax (Figura

13). La cutícula está recién depositada por lo que es más firme.

Pupa de 72 h; en este horan'o se alcanzan las proporciones definitivas del

cuerpo, que se mantendrán hasta la emergencia del imago. En tamaños relativos,

el abdomen es de similar longitud que el tórax y a su vez, ambos son de mayor

tamaño que la cabeza (Figura 13). La cabeza presenta una forma triangular con

los vértices redondeados, los ojos son grandes, aunque no tan prominentes. Los

ojos son de color amarillo pálido (código: Y-l9—12, ver Capítulo 2, Figura 27).

Pupa de 144 h; presenta los ojos de color anaranjado muy suave (código:

0-17-8, ver Capítulo 2, Figura 27), y este color constituye un marcador

importante del desarrollo ya que indica la finalización del estadio pupal. A partir

de este horario se inicia la muda de la cutícula pupal a adulto farado

Estadio de adulto farado: se extiende desde las 168 h hasta la emergencia del

¡mago (312 h) (Figura 12). A las 168 h es posible separar la cutícula pupal por disección.

65

Resultados

Durante el estadío de pre-pupa se inician los dos fenómenos más importantes de

la metamorfosis; la puparíacíón y la pupación.

Pupariación consiste en la adquisición de color y dureza por parte de la cutícula

larval que se transforma en una envoltura protectora llamada pupario. Este proceso se

caracteriza principalmente por la incorporación de catecolaminas que son precursoras de

quinonas reactivas que unen covalentemente entre si a los componentes cuticulares y la

consecuente insolubilización de las proteínas cuticulares larvales.

Consideramos que el proceso de puparíacíón se inicia con la inmovilización

definitiva de larva (“Tiempo cero”, pupario blanco). El inicio de la pigmentación de la

cutícula larval se inicia aproximadamente 15-30 min después del "tiempo cero" definido

anteriormente. Endurecimiento y coloración son procesos concomitantes y son resultado

del mismo fenómeno bioquímico mediado por quinonas.

La mayoría de las proteínas larvales son extraíbles del pupario hasta las 32-36 h,

pero entre las 40 y 52 h se registró la incorporación de nuevas proteínas al mismo. El

nuevo polípéptido mayoritario presentó un peso molecular aproximado de 26 KDa,

siendo otros que se incorporan, de 19 y 15 KDa (Rabossi y col, 1991). Se determinó que

el polípéptido de 26 KDa se sintetiza entre las 24 y 30 h, y se deposita recién en el

pupario alrededor de las 46-48 h. Estos resultados nos llevaron a determinar que la

puparíacíón finaliza alrededor de las 46-48h cuando se alcanza el patrón definitivo de

proteínas del pupan'o (Rabossi y col, 1991).

El color del pupario cambia gradualmente desde un blanco-ambar (en el tiempo

cero), a un marrón claro a las 8 h, hasta alcanzar el color marrón habano rojizo y la

rigidez definitivas alrededor de las 16 h de iniciado el proceso.

Pupación es el proceso que lleva a la formación de la pupa; se inicia con la

apólisis larval-pupal (20E h) y finaliza a las 72 h (Figura 12). La apólisis consiste en la

retracción de la epidermis de la cutícula del estadío larval (Jenkin y Hinton, 1966). Este

evento presenta un marcador característico que lo identifica y es la aparición de una

burbuja de gas en la zona abdominal de la pupa. Durante la pupación, la burbuja ubicada

en la zona posterior de la pupa se dispersa (Ashbumer, 1989).

Si bien varios autores postulan el pasaje de la pupa criptocefálica a fanerocefálica

a través de la eversión de la cabeza y los miembros como final de la pupación

67

Resultados

(Ashbumer, 1989), nosotros consideramos más apropiado fijar como final de este proceso

recién a las 72 h cuando la pupa adquiere las proporciones definitivas del cuerpo y

también el patrón definitivo de proteínas cuticulares de la pupa (Boccaccio y Quesada­

Allué, 1989). Durante el proceso de pupacíón ocurre la histolísis larva].

CAPÍTUL0 I

Capítulo l

Análisis histológico del proceso de degradación detejidos larvales en la Mosca del Mediterráneo

En esta sección se presentan los estudios histológicos que realizamos en la Mosca

del Mediterráneo con el objetivo de establecer la secuencia temporal en que los músculos

esqueléticos y el cuerpo graso larva] son degradados durante la metamorfosis. Se describe

.en detalle, por primera vez y en cualquier mosca, la evolución de los cambios que llevan

a la degradación del cuerpo graso larval. En estos estudios se emplearon individuos desde

“Tiempo cero” de metamorfosis hasta pupas de 120 h, y se describieron los cambios

comparándolos con aquellos de larvas de tercer estadio (-20 h, con el intestino lleno, y -6

h, larvas de “salto”), donde todavia no se ha disparado el proceso de muerte celular.

Por otra parte, el análisis histológico ha permitido corroborar con total precisión

el momento de ocurrencia de la apolisis larval-pupal postulado previamente por nosostros

(Rabossi y col., 1991) mediante estudios fisiológicos. Como se verá más adelante, el

horan'o en que finaliza este evento (20-3-Qh) coincidió con la aparición de los primeros

cambios microscópicos observados en los distintos tejidos estudiados, y que llevan a la

muerte celular.

Todas las figuras que se muestran en esta sección, corresponden a preparados

analizados por microscopía óptica, y en todos los casos se empleó la solución de Bouin

como fijador. La misma cuenta en su composición con formol, ácido pícrico y ácido

acético y resultó ser más penetrante que otros fijadores empleados (por ejemplo, 2%

glutaraldehído o 2% glutaraldehído-2% parafonnaldehído-2% acroleina). Por otra parte,

es un fijador muy versátil, ya que por lo general, permite el empleo posterior de un gran

número de coloracíones.

Para cada horario del desarrollo, el tiempo de fijación del insecto entero van'ó

desde 24 h de fijación en la larva III, donde la cutícula es blanda, hasta 48 h en pre-pupa

y pupa. cuando el fijador debe penetrar no sólo el pupario endurecido sino también la

nueva cutícula pupal. Observamos, sin embargo, que éste tratamiento no bastó para fijar

69

CM

completamente las muestras, en especial los tejidos más internos. Por lo tanto, luego de

fijar al insecto entero en los tiempos antes mencionados, se debió cortarlo entre el cuarto

y quinto segmento, manteniendo ambas mitades en fijador de Bouin durante otras 24 h.

En la figura l4 se muestra el corte transversal de la región abdominal de una larva

III de Ceratitis, donde se identifican los principales órganos y tejidos. Las flechas de

color celeste indican los tejidos (músculos y cuerpo graso) en que se han centrado

nuestros estudios.

Figura 14: Identificación y disposición de los principales órganos y tejidos enuna larva III de la mosca del Mediterráneo. Corte transversal de la regiónabdominal de larva de -20 h, teñido con I-l-E(100X).Para todos estos estudios se contó con la valiosa colaboración técnica de lahistotécnica Marta Grinfeld (Dpto. de Patología del “Centro Gallego de BuenosAires”) en la realización de los cortes y la coloración de los preparados.

cutícula

epidermis

músculo

tráquea

intestino

cuerpo graso

Apolisís larval-pupal

La apolisis larval-pupal consiste en la separación de la epidermis del pupario

(cutícula larval III endurecida y coloreada), creandose un espacio llamado espacio

ecdisial, que permite la deposición de la nueva cuticula pupal. En la Figura 15, hemos

observado que en la pre-pupa de Ceratitis, el proceso de apolisis larval-pupal se ha

completado a las 2030 h. En esta Figura se aprecia claramente que la epidermis está

completamente separada del pupario, dejando un amplio espacio ecdisial.

Este resultado coincidió exactamente con el momento de apolisis que habiamos

determinado previamente (Rabossi y col, l99l) mediante ensayos de flotación de las pre­

pupas en el agua. En este trabajo, determinamos que este evento ocurría a las 203Qh luego

de iniciada la metamorfosis, utilizando un marcador caracten’stico que identifica a la

apolisis, que es la aparición de una burbuja de gas (C02) en la zona abdominal de la pre­

pupa y que hace que ésta flote cuando se la sumerge en el agua.

Larva III (-20 h) Pupa (203Qh)

Cutícula larva] III

y pupario

epidermis espacio ecdisial

Figura 15: Apolisís larval-pupal en la mosca del Mediterráneo. Corte transversalde larva lll (-20 h) y pre-pupa (2030h) teñido con H-E (400X).

Cuerpo graso

En Ceratr'tis, al igual que en los demás dípteros, el cuerpo graso larval está

organizado en lóbulos delgados ubicados entre el intestino y los músculos de la pared del

cuerpo (Figura 14). La ubicación que presenta este tejido le confiere un acceso muy

rápido a los nutrientes, proteínas y hormonas transportadas por la hemolinfa.

Al igual que en otros tipos celulares de insectos, las células del cuerpo graso

completan sus divisiones en el embrión y posteriormente, durante los estadios larvales,

solo incrementan su tamaño y su politenización (Haunerland y Shirk, 1995).

En los dípteros ciclorrafos, las células del cuerpo graso acumulan reservas durante

la segunda mitad de la larva II y todo el tercer estadío, para ser utilizadas posteriormente

durante la metamorfosis. Durante la etapa larval, las células del cuerpo graso de Ceratitis

se encuentraron asociadas unas con otras, formando una red (Figura 16).

En la Figura l7 mostramos una célula típica de cuerpo graso correspondiente a

larva llI de Ceratitís. Estas células presentaron formas variadas, aunque principalmente

fueron redondeadas o poliédricas, con límites bien definidos. En esta mosca, las células

se caracterizaron por presentar gran cantidad de vesículas de grasa de distinto tamaño,

interconectadas entre si; que en su conjunto ocuparon la mayor parte del citoplasma

celular del cuerpo graso larval (Figura 17).

Empleando la tinción con PAS, deterrninamos que el glucógeno se almacena en el

cuerpo graso en la cercanía del núcleo, rodeando al mismo (Figura 19, a -20 h se obtiene

tinción positiva con PAS). Para determinar si el glucógeno se almacena en gránulos

pequeños. como había sido obsevado por microscopía electrónica por Dean (1977) en

mariposa, se tiñeron preparados con hematoxilina-eosina (H-E). Al microscopio óptico

(lOOOX)no se llegó distinguir con claridad si el glucógeno se almacena en gránulos, sino

que sólo se logró observar una masa de apariencia granulosa violácea, mas o menos

compacta alrededor del núcleo (Figura 17).

El núcleo presentó, por lo general, un nucleolo muy grande y redondeado,

ubicado en una posición central (y que adquiere una coloración azul intenso cuando se

tiñe con H-E), mientras que la cromatina se distribuyó medianamente empaquetada

alrededor del mismo (Figura 17). En las larvas, obSCrvamos que tanto la membrana

plasmática como la nuclear se distinguen en forma muy clara.

72

Figura 16: Asociación característica en forma de red que presenta el cuerpograso larval de Ceratitis (-20 h) (cone longitudinal teñido con H-E) (4OOX).

conexión entrevesículas de

lípidos

núcleo

nucleólo

cromatina

membrananuclear

vesícula dclípidos

membranaplasmática

región dondese almacena el

glucógeno

Figura 17: Célula característica del cuerpo graso larva]. Cortes tranversales delarvas de -20 y -6 h, respectivamente, teñidos con H-E. (1000 X).

74

En Ceratitis, hemos determinado que la estructura del cuerpo graso cambia

drásticamente alrededor de las 203-Qh. En este horario observamos que la estructura en

forma de red característica de la larva desaparece y las células del cuerpo graso pasan a

flotar libremente en la hemolinfa (Figura 18). Esto coincidió con Kurata y col. (1989),

quienes observaron este proceso por primera vez en la mosca Sarcophaga peregrina, y lo

definieron como "disociación o remodelación de cuerpo graso"

En Ceratitís encontramos que la disociación del cuerpo graso coincidió

temporalmente con el final de la apólisis larval-pupal, y lo consideramos como el primer

signo tangible del proceso de muerte celular.

En la Figura 20, se presentan los cortes histológicos donde se muestra la

evolución temporal de los cambios que llevan a la degradación del cuerpo graso larva]

durante la metamorfosis. El cuerpo graso larval presentó una estructura relativamente

estable hasta la mitad del estadio pre-pupal, es decir cerca de las 2039h. A partir de este

horan'o, cuando ocurre la disociación de la estrutura en fonna de red, comenzaron a

reconocerse numerosos cambios en las células del cuerpo graso. Esta es la primera vez

que la MCP del cuerpo graso es descripta en cualquier mosca durante la metamorfosis.

-20 h

Figura 18: Disociación del cuerpo graso. La estructura en forma de red seconserva varias horas después de iniciado el estadio pre-pupal, desapareciendorecién alrededor de las 2019 h. Corte longitudinal de larva ,-20 h y de pre-pupa,20E h, ambas teñidas con H-E, 400X.

En la Figura 21, se muestran en detalle (lOOOX)los cambios que ocurren en cada

horario. Para facilitar su descripción, hemos analizado por separado las distintas

estructuras celulares reconocidas al microscopio óptico.

l- Membrana plasmática:

Tanto en larva III como en la pre-pupa hasta las 203-oh, la membrana plasmática

presentó límites muy bien definidos y reconocibles (Figura 21, flechas rojas delgadas). A

partir de este último horario la membrana plasmática se volvió cada vez más difusa y

dificil de reconocer, llegando a ser completamente irreconocible a partir de las 72 h

(Figura 21, flecha rojas gruesa).

2- Vesículas de or:asa:

Las vesículas que contienen los lípidos ocupan la mayor parte del citoplasma

celular en las larvas y durante las primeras horas de la metamorfosis (Figura 20, -20 h, lS

y 201) h; Figura 21, flechas celestes). Posteriormente, a partir de la segunda mitad del

estadio pre-pupal y durante todo el estadío pupal, registramos una disminución progresiva

en el número de vacuolas y en el tamaño de las mismas. Además, hemos observado que

los bordes de las mismas se vuelven más difusos a medida que transcurre la metamorfosis

(este fenómeno que se observa en unas pocas células desde las 22 h, se generaliza a partir

de las 48 h) (Figura 21, flecha celeste gruesa).

-20 h

Figura 19: Célula de cuerpo graso de larva lll (-2Oh) y de pupa (40 h) sometidasa la tinción por PAS. (lOOOX).

3- Gránulos protéicos:

Como ya mencionamos en la Introducción, en las moscas, muchas de las proteínas

de reserva son sintetizadas durante el último estadio larval en el cuerpo graso de los

segmentos anteriores. Al final de este estadio, muchas de estas proteinas son secretadas a

la hemolinfa, para luego ser captadas por el mismo cuerpo graso, pero en la región

abdominal durante el estadio pre-pupal (Kanost y col, 1990 y Levenbook, 1985). Se

forman así los gránulos proteicos y se ha postulado que las proteínas de reserva permiten

a los insectos disponer de una gran reserva de aminoácidos, que serán utilizados para la

producción de las proteinas del adulto (Levenbook y Bauer 1984).

En Ceratítís, hemos podido observar que los gránulos proteicos del cuerpo graso

pudieron ser reconocidos desde la inmovilización definitiva de la larva (O h) aunque en

muy bajo número y tamaño. Recién entre las 15 y ZOE h registramos un incremento en el

número de gránulos y el tamaño, manteniendo una posición periférica, muy cercanos a la

membrana plasmática (Figura 20 y 21, flechas negras). Estos gránulos proteicos

adquieren un color rosado en los preparados teñidos con H-E (Figura 20 y 21).

La ubicación periférica de los gránulos se mantuvo aproximadamente hasta las 40

h, encontrándose luego distribuidos en toda la célula (Figura 20, 40 h y Figura 21, 72 h).

4-Núcleo

Se observó que el núcleo de las células del cuerpo graso de Ceratitis es grande y

ocupa generalmente una posición central. En las larvas, el nucleólo presentó gran tamaño

y adquirió una coloración azulada cuando se tiñó con H-E. Se vió que la cromatina forma

paquetes compactos ubicados alrededor del nucleolo y muy cercanos o pegados a la

membrana nuclear. Hasta las ZOE h no se registraron cambios importantes a nivel

morfológico. Pero a partir de las 22 h, en algunas células, el núcleo apareció perdiendo su

estructura, ya no se reconoció más la membrana nuclear, tampoco se distinguió más el

nucleolo, y la cromatina pareció quedar flotando en el citoplasma (Figura 21, 22 h, flecha

verde). A partir de las 48 h, estos cambios en el núcleo se extendieron a la mayoria de las

células.

S-Framentación celular

A partir de las 72 h, la membrana plasmática resultó completamente irreconocible

(Figura 20, 72 h, flechas negras) y se observó que las células comenzaron a fragmentarse

en porciones más pequeñas, de formas variadas. Este proceso continuó por varias horas y

se hizo masivo a las 120 h (Figura 21, 120 h)

Figura 20: Evolución de los cambios en el cuerpo graso larva] durante lametamorfosis de Ceratitis capitata. Cortes longitudinales teñidos con H-E.(400X).

Figura 21: Detalle de los cambiosobservados en el cuerpo graso durante lametamorfosis de Ceratitis mediante elanálisis de células individuales teñidascon H-E. (lOOOx).

Capítulo l

A modo de resumen, podemos decir esta es la primera vez que se describe la

secuencia temporal de eventos que llevan a la destrucción del cuerpo graso larval durante

la metamorfosis, en cualquier mosca. Los estudios histológicos realizados con cuerpo

graso de Ceratitís capítata demostraron que:

(1)

(3)

(4)

a las 203-0h, comienza a producirse la desintegración de la estructura en forma de red

que presenta el cuerpo graso larval y las células pasan a flotar libremente en la

hemolinfa. Esta es la primer evidencia visible de histolisis que hemos podido

registrar por microscopía óptica,

a las 22 h, se ha registrado la pérdida de la estructura nuclear y la desaparición del

nucleolo en un pequeño número de células. En este mismo grupo de células, las

vesículas de grasa redujeron su tamaño y los bordes se presentaron más difusos. A

partir de las 48 h estos cambios se generalizaron a una importante proporción de las

células. Por lo tanto, la degradación del cuerpo graso en Ceratítís es un proceso

gradual, donde posiblemente la inducción para la muerte celular no llegue en forma

homogénea a todas las células ni al mismo tiempo (ver Discución).

en Ceratitis, nuestros estudios histológicos nos permiten postular que la degradación

del cuerpo graso larval es un proceso que llevaría aproximadamente 100 h en

completarse. Esto es, desde las 20E h hasta las 120 h, es decir, desde la disociación

de la estructura en forma de red, hasta la fragmentación celular.

la histolisis del cuerpo graso en Ceratitis no es total. A partir de las 120 h,

observamos la fragmentación de gran número de células del cuerpo graso, aunque

una proporción menor se mantienen intactas. Esto coincidió con lo que acontece en

Drosophila melanogaster, donde se observó que el 60 % del cuerpo graso se destruye

durante la metamorfosis, mientras que el 40 % restante permanece intacto durante los

estadios que transcurrendentro del pupario y desaparece completamente dentro de los

tres días posteriores a la emergencia del adulto.

83

Hemocitos:

Los hemocitos son células de la hemolinfa que están implicadas principalmente

en la respuesta inmune celular de los insectos, participando normalmente de los procesos

de detoxíficación, fagocítosis y encapsulación de microorganismos entomopatógenos. Se

acepta que durante la metamorfosis participan activamente en el proceso de muerte

celular. Durante esta etapa se produce la diferenciación de ciertos hemocitos en células

con características similares a la de los macrófagos de mamíferos, y que participar-¡an de

la fagocitosis de los músculos fragmentados (sarcolítos) o de las células disociadas del

cuerpo graso y otros tejidos.

En Ceratitis, hemos observado tanto en cortes transversales como longitudinales

de distintas partes del cuerpo, que los hemocitos son muy escasos y dificiles de reconocer

en el último estadio larval. Esta observación es válida también para las primeras horas del

estadio pre-pupal. Recién a partir de las 2059 h comenzó a observárselos cercanos o

asociados a la membrana plasmática de las células de cuerpo graso (Figura 22, flechas

negras). En los horarios posteriores, incrementan su número y especialmente fueron muy

numerosos a panir de las 72 h cuando las células del cuerpo graso comienzan a

fragmentarse (Figura 20, flechas azules y Figura 22, 120 h, flechas negras).

En Ceratítis, postulamos que los hemocitos también participan de la fagocitosis

de los músculos fragmentados. Como se observa en la Figura 22, 120 h y Figura 25, 120

h) luego de la fragmentación muscular, es posible distinguir claramente gran número de

hemocitos en la periferia del cuerpo entre los sarcolitos musculares.

Los hemocitos en Ceratitis presentaron una forma variada, aunque en general

fueron circulares o ligeramente ovales, y en todos los cortes adquirieron con H-E

coloración muy oscura (Figura 22). Postulamos que la mayoría de los hemocitos

indentiflcados en estos horarios tendrían actividad fagocítica.

84

20”!)

Figura 22: Identificación de los hemocitos (flechas) asociados y cercanos alcuerpo graso larval (203-oh) y entre los sarcolítos musculares (120 h). Preparadosteñidos con H-E (lOOOX).

R‘

Músculos

En la Figura 14 se muestra la distribución de los músculos esqueléticos en la larva

III de Ceratitis, en un corte tranversal. En esta mosca al igual que en otras, cada

segmento abdominal contiene alrededor de 30 músculos. Durante la etapa larva], los

músculos crecen en tamaño y probablemente en ploídía.

En las larvas, la mayon'a de los músculos esqueléticos se encuentran unidos a la

cutícula por un extremo del músculo, mientras que el otro extremo está unido a una parte

móvil. En la Figura 23-A (-20 h) se muestran los espesamientos cuticulares invaginados o

apodemas en forma de cuerdas, bandas o estructuras en placa que proporcionan los

puntos de unión a los músculos (flecha roja). Durante la apolisis larval-pupal (203-Qh),

acompañando la separación de la epidermis del pupario, hemos obsevado que los

músculos de Ceratitís se separan de sus respectivos apodemas (Figura 23-A, 201) h y B).

Como se descn'be más abajo, también para los músculos, la apolisis coincidió

temporalmente con el inicio de la degradación de los músculos.

epidermis

apodema h

epícutícula

exocutícula

endocutícula

espacioecdísial

Figura 23: Apólisis larval-pupal en la mosca del Mediterráneo. Alrededor de las20-0 h, se produce la separación de los músculos larvales de sus apodemas. Laepidermis se separa de la cutícula de larva III transformada en pupario, formandoel espacio ecdísial. Corte transversal de pre-pupas teñidas con I-I-E (A, 4OOX; B,lOOOX).

Capítulo 1

Hemos estudiado la secuencia temporal de cambios que sufren los músculos

esqueléticos larvales de Ceratitis en las regiones correspondientes al tórax y el abdomen.

Las fibras musculares esqueléticas son estriadas transversalmente y están

compuestas esencialmente de un cierto número de largas fibras, cada una de las cuales

está subdividida en fibrillas menores, independientes, que están compuestas a su vez de

una colección altamente organizada de miofilamentos. La fibra muscular está rodeada por

una membrana exterior llamada sarcolema.

En Ceratitís, el primer indicio de degeneración muscular que hemos encontrado,

es la aparición de protuberancías suaves del fasciculo muscular a partir de las 2039 h

(Figura 25, fiech negra). Acompañando esto, registramos cambios abruptos en la

estructura del núcleo, que pasa de tener una forma oval y achatada en la larva (Figura 25,

-20 h, flecha roja), a otra lobulada y muy agrandada (Figura 25, 203-0h, flecha roja).

Como ya se mencionó, en forma coincidente con la apolisis larval-pupal, los músculos se

separan de su lugar de inserción (Figura 23).

A medida que la histolisis avanza, se aprecia que el interior de los músculos se

rompe por separación de la fibrillas, que le dan al músculo una apariencia vacuolada

cuando se lo corta tranversalmente (Figura 25, 44 y 48 h, flechas azules). Cuando se

sometió cortes de músculos esqueléticos de larvas III (-20 h) y pupa de 40 h a la tinción

por PAS, los músculos pupales (40 h) dieron una reacción negativa, indicando que,

además de los signos claros de degeneración que presentan, las reservas de glucógeno

practicamente habían desaparecido (Figura 24). Posteriormente, los músculos se

fragmentaron formando los sarcolitos, que permanecen como flotando en la hemolinfa

pero manteniendo en todos los casos su posición original, cercana a la pared del cuerpo

(Figura 25, 22 y 120 h, flechas verdes)

En Ceratin's encontramos que la fragmentación de los músculos esqueléticos

ocurre en dos momentos distintos del desarrollo dentro del pupario. En los músculos de la

región torácica, correspondientes a los segmentos anteriores l a 4, la fragmentación

ocurre a partir de las 22 h (7 % del tiempo acumulado del desarrollo dentro del pupan'o).

Por su parte, en los segmentos abdominales, la fragmentación se registra recién a partir de

88

Capítulo l

las 72 h (23 % del tiempo). Finalmente, a partir de las 120 h, practicamente la totalidad

de los músculos esqueléticos se encuentran fragmentados en ambas partes del cuerpo. En

ambos casos, la forma en que se fragmentan los músculos es la misma, los sarcolitos

permanecen en la periferia del cuerpo y entre éstos observamos numerosos hemocitos

(Figura 25, 22 y 120 h).

40h

Figura 24: Preparados de músculos esqueléticos de larva III (-20 h) y pupa de 40

h, analizados mediante la Técnica de PAS (lOOOX).

RO

22 h 120h

Figura 25: Fragmentación de los músculos esqueléticos de la porción anterior(segmentos 1-4, 22 h) y posterior del cuerpo (120 h). Preparados teñidos con I-I-E

(lOOOX).

CAPÍTUL0 II

Capítulo 2

Comparación de la metamorfosis en Ceratitis capitata yDrosophíla melanogaster

En esta sección se compararon los ciclos de vida de Ceratitis capitata y

Drosophila melanogaster, poniendo especial énfasis en la secuencia temporal en que

ocurren diferentes eventos a lo largo de la metamorfosis. Nuestra hipótesis de trabajo fue

que, si eventos de distinto tipo ocurren en la misma porción de tiempo de desarrollo

dentro del pupario en ambas moscas, ésto permitiría pasar de una mosca a otra para

completar información.

De esta manera, pasaríamos a contar con una herramienta de gran utilidad que es

Drosophila, el organismo más conocido desde el punto de vista genético y molecular.

Empleando esta herramienta, esperamos poder completar nuestra información

acerca de la degradación de otros tejidos que no pudieron ser estudiados en Ceratitís y

comprobar si los tiempos de desarrollo dentro del pupario determinados en el Capítulo

anterior, en que ocurre la degradación de los músculos esqueléticos de Ceratitis, se

corresponden con aquellos descriptos previamente por otros autores en Drosophila

melanogaster.

Los resultados presentados en el Capítulo anterior, sumados a los que esperamos

obtener en este Capítulo, nos permitirán disponer de una primera aproximación por

inferencia, acerca del momento de la metamorfosis en que se produciría la histolisis de

los principales tejidos larvales en Ceratitis capítata, donde se tomaron como referencia

los estudios previos antes mencionados, realizados en Drosophila.

Capitulo 2

Ocurrencía de los principales eventos de la metamorfosis en Ceratítis

cagitata v Drosoghíla melanogaster

Por estudios previos realizados por este autor en la mosca del Mediterráneo

(Rabossí y col, 1991 y 1992) y otros autores en Drosophila melanogaster (Bodestein,

1950; Ashbumer, 1989 y Bainbridge y Bownes, 1981) se disponía de información

bastante detallada acerca de:

a- la evolución de la morfología externa de la pupa y del adulto farado,

b- el inicio de los diferentes estadios que transcurren dentro del pupario (pre-pupa, pupa y

adulto farado),

c- las caracteristicas generales y extensión en el tiempo de los principales programas de la

metamorfosis (pupariación y pupación).

Al inicio de esta Tesis, fue necesario volver a analizar con la máxima precisión

algunos eventos ya estudiados previamente y considerar otros nuevos eventos marcadores

del desarrollo. Se compararon en ambas moscas, la aparición y posterior coloración de

estructuras morfológicas externas, asi como también la duración de diferentes eventos

durante la metamorfosis.

Duración de los ciclos de vida

Habíamos determinado previamente que el ciclo de vida estándar de Ceratitís,

desde la eclosión del huevo hasta la emergencia del imago es de aproximadamente 600 h

a 23 9C; mientras que el de D. melanogaster a 25 9C es de 192 h (Bainbridge y Bownes,

l98l). A su vez, hemos confirmado repetidamente en el transcurso de esta Tesis, que el

tiempo total desde la inmovilización definitiva de la larva, retracción de los segmentos

anten’ores y la adopción de la forma ovoíde, hasta la emergencia del ¡mago en Ceratitis

es de 312 h, mientras que en Drosophila es de 96 h .

Como se puede observar, el ciclo de vida de Ceratitis es aproximadamente tres

veces más largo que el de Drosophila, y hemos podido constatar que se mantiene también

esta relación durante la etapa del desarrollo dentro del pupario, objeto de esta

investigación.

Apéndices y estructuras cuticulares: aparición y coloración

Se correlacionaron l4 marcadores morfológicos externos durante el transcurso de

la metamofosis de ambas moscas. En la Tabla 4, se muestran los resultados obtenidos,

93

Capítulo 2

donde la aparición o duración de cada marcador o evento, se expresa como porcentaje del

tiempo acumulado durante el desarrollo dentro del pupario (es decir, desde la

inmovilización definitiva de la larva y la emergencia del imago). Los marcadores

utilizados en esta comparación pueden corresponder a eventos puntuales o casi puntuales,

como por ejemplo "tiempo cero", donde la larva completamente inmóvil no responde más

a ningún estímulo mecánico; o bien a la acotación de períodos, donde se indica en cada

caso si es el inicio o final de un evento, por ejemplo, pupan'o completamente coloreado.

Como se observa claramente en la Tabla 4, a excepción de uno, en los 13

marcadores restantes se encontró una estrecha correlación entre los tiempos relativos de

aparicición o coloración de un marcador, o de occurrencia de un evento durante el ciclo

de ambas moscas. En todos los casos las diferencias encontradas fueron menores al 10 %

del tiempo acumulado (Tabla 4). La implicancia de este resultado se analizará en la

Discusión.

El único marcador en el que aparentemente se encontró una diferencia importante

fue el relacionado con el momento en que se distingue a la pupa criptocefálica, es decir,

al individuo que no ha evenido la cabeza ni los miembros (Tabla 4 y Figura 26). Esto

podría implicar según nuestra definición de estadios y eventos (Rabossi y col, 1992), que

el estadío de pre-pupa en Ceratitis sería más largo que en Drosophíla.

Como consecuencia de esto, y dado que la duración del estadio de adulto farado

es proporcionalmente similar en ambas moscas, en Ceratitís, el estadío pupal podn'a ser

más corto que el de Drosophila (Figura 26). Altemativamente, dadas las mayores

dificultades de sincronización en Drosophila, podría existir un error en esta observación,

máxime que los tiempos del ciclo son muchos más cortos que en Ceratitis. No obstante,

como en Drosophila la observación se realizó sin intervención fisica alguna, por

transparencia, nos inclinamos por la primer hipótesis

94

Capítulo 2

|--pre l pupa l adulto farado---------- --| CeraritisPupa

If 51,3 l 0l %de tiempoa b acumulado

Á / \2 enel pupario4,2 5 ,5 100Iprel pupa l adulto farado----------- --| Drosophíla

pupa Íemergencia

Figura 26: Extensión de los estadios que transcurren dentro del pupario enCeratitís y Drosophíla . Las letras indican los eventos o características quepermiten definir el inicio o final de cada estadío dentro del pupario; a- pupario“blanco” (equivalente a “tiempo cero”), b- pupa criptocefálica, c- comienzo de lacoloración de los ojos, d- emergencia del imago.

Marcadores morfológicos externos D.melanogaster C. cagítata

horas %tiempo* horas %tiempo*

inicio de la pupariación. "tiempo cero". Pupario alcanzó

su forma definitiva, es blanco y rugoso. °P

O O 0 ()

pupario completamente coloreado í:P 3.5 3_6 16 5.l

apólisis larval-pupal. Pre-pupa con burbúja gaseosa eP 20.5

pupa con cabeza, alas y patas no evaginados ep 4 4.2 40 13

eversión de cabeza,alas y patas. fP (pupa fanerocefálica) 13 13.5 48 15

apólisis pupal-adulto. Adulto farado fp 50 52 5 160 5 l .3

coloración de las cerdas de la cabeza y tórax fP 70 72 9 216 69

coloración gris en los extremos de las alas ÏP. Primeros 76 79.2 240 77

dos segementos abdominales con cerdas coloreadas fP

cerdas y pelos de las patas visibles, pero incoloros íP 78 81.2 240 77

alas completamente grises fP 78 81.2 264 84.6

oscurecimiento de las cerdas y uñas tarsales fP 82 85 .3 264 84.6

alas adquieren coloración negra Í:P 86 89.6 288 92.3

eclosión del imago fp 96 100 312 100

Tabla 4: Equivalencia de horarios en cuanto a la aparición / coloración deestructuras externas, y duración de eventos, durante el desarrollo dentro delpupario de Ceratitis y Drosophila. *, indica el porcentaje de tiempo acumuladodurante el desarrollo dentro del pupario; ep, evento puntual; ip, inicio de unevento; fp, final de un evento. Como en Drosophila la aparición de muchos deéstos marcadores está expresado en intervalos de tiempo, en esta correlación setomó en todos los casos el horario mayor, que expresa la finalización del evento alque se hace referencia.

06

Eventos moleculares tempranos en Ceratitis y Drosoghila

Como se mencionó en el párrafo anterior, se encontró una estrecha coincidencia

entre ambas moscas, en cuanto al momento en que pueden ser reconocidos y

eventualmente se colorean numerosos caracteres morfológicos externos. Este resultado

nos llevó a preguntarnos si esta equivalencia de horarios podn’a ser registrada también a

nivel bioquímico, es decir, si se podrian utilizar "marcadores moleculares" más precisos.

Para responder esta pregunta se eligieron dos eventos bioquímicos completamente

diferentes como son la deposición de pigmentos de los ojos y la acumulación de proteínas

cuticulares pupales.

Momento de deposición del pigmento anaranjado de los ojos

En trabajos previos (Rabossi y Quesada-Allué, 1993; completados y confirmados

en esta Tesis), habia estudiado la deposición de los pigmentos de los ojos durante la

metamorfosis de Ceratitis, en las condiciones de cría empleadas en nuestro laboratorio y

con el alimento desarrollado por Terán (1977). Es importante hacer notar que diferentes

alimentos empleados durante la etapa larval, podrían variar la calidad o afectar la

cantidad relativa de pigmentos oculares. La coloración visible de los ojos durante los

estadios que transcurren dentro del pupan'o, en nuestras condiciones estandar de cría se

muestra en la Figura 27. El verdadero color de ojos está claramente determinado según

Atlas de colores y es imposible de reproducir con tinta comercial de impresora.

Se analizaron los pigmentos correspondientes a cada estadio de color de ojos. Para

ello se tomaron pupas de moscas, se extrajeron las pteridinas en completa oscuridad y se

analizaron las mismas por cromatografia en capa delgada. Durante las primeras horas del

estadio de adulto farado se detectó la deposición de un pigmento que fluoresce bajo luz

UV (254 nm) con color anaranjado pálido (Figura 28). Este pigmento presentó color,

perfil de fluorescencia y movilidad relativa en diferentes solventes, similar al pigmento

anaranjado drosopterina de Drosophila (Rabossi y Quesada-Allué, 1993).

Las drosopterinas fueron definidas como pigmentos exclusivos de Drosophíla y

componen una familia de tres pigmentos por criterio de separación en cromatografia en

papel y capa delgada, mientras que el pigmento de Ceratitis presentó, en todos los

solventes ensayados, un solo componente.

97

PUPA ADULTO FARADO

40 48 72 98 120144 168 192 216 240 264 288hpo' L ‘v ¡5.1: Ï'w: fÉ' l 2‘47‘ "iii ïÏ‘v‘ÏQy-‘fifíi{sisi-1151"? Fan-“¡Ñ

Colores White (1979) Villalobos (1947)72 hdp 11-7-04 9Y 8.4/4.8 Y-l9-1296 hdp 11-7-15 6Y 8.5/7.5 Y-18-12120 hdp 11-7-06 9Y 8.8/7.8 Y-18-12144 hdp 11-8-43 lOYR 7.6/8.8 0-17-8168 hpd 11-9-62 SYR 6.8/10.l SO-l4-12192 hdp 1-11-04 lYR 5.8/6.5 SSO-12-12240 hdp 1-13-04 9R S.0/6.4 SSO-lO-7

Figura 27: Evolución de la coloración de los ojos de Ceratítís durante losestadios de pupa y adulto farado. El color de ojos se nombró y registró empleandolos Atlas de colores deVillalobos (1947) y White (1979), a partir de la pupafanerocefálica (48 h).

En Ceratitis, determinamos que este pigmento se deposita alrededor de las 192 h

desde la inmovilización definitiva de la larva, lo que corresponde al 61.5 % del

porcentaje de tiempo acumulado dentro del pupario (Figura 30). Por su parte, en

Drosophila, Hardom y Mitchel (1951) determinaron que las drosopterinas se depositaban

alrededor de las 60 h desde la inmobilización definitiva de la larva, lo que corresponde al

62.5 % (Fígura 30). Por lo tanto, en ambas moscas, estos pigmentos se depositan después

de la muda a adulto farado, y en Ceratitis esto ocurre cuando los ojos adquieren una

coloración anaranjada fuerte (Figura 27, 168 h). Una vez más, la coincidencia en

terminos de porcentaje de tiempo de desarrollo es notoria.

QR

l l

.z .. ,I

sFigura 28: Patrón de pigmentos de los ojos de C.capitata durante la transiciónadulto farado-imago. TLC celulosa desarrollada en isopropanol-acetato de amonio2 % (1:1). SR: 168 h, Sc: 216, T: 240 h I: imago, Dr: ¡mago de Drosophila. Lasflechas azules indican cambios en el patrón de pigmentos, mientras que la flechanegra indica drosopterina.

Parentesco molecular de las proteínas cuticulares pupales en dípteros

La cutícula de los insectos holometábolos suele ser específica en su composición,

para cada estadío y para cada región del integumento. Decidimos tomar como referencia

para nuestros estudios comparados, la síntesis y deposición de la glicoproteína cuticular

pupal, llamada PCG-lOO, estudiada en nuestro laboratorio por Boccaccio y Quesada­

00

Capítulo 2

Allué (1989), quienes determinaron que PCG-lOO representa más del 80 % (w/w) de las

proteínas cuticulares pupales de Ceratitiís.

Se utilizaron anticuerpos policlonales contra PCG-IOO para estudiar la reacción

cruzada con proteinas cuticulares pupales de Drosophila. El antísuero contra PCG-lOO

reconoció a PCP-82, la principal proteína cuticular de Drosophila (junto con PCP-56)

(Figura 29). En mucha menor medida, estos anticuerpos también reconocieron en esta

última mosca polipéptidos de menor peso molecular.

Según los estudios realizados por Boccaccio, los principales determinantes

antigénicos de PCG-lOO no parecerían residir en su oligosacán'do, por lo cual el antísuero

reconocería secuencias aminoácidicas presentes en PGP-82. Por tanto, consideramos que

ambas glicoproteínas principales son comparables y probablemente son producto de

genes homólogos.

Equivalencia en los tiempos relativos de deposición de las proteínas cuticulares pupales

en ambas moscas

PCG-lOO se sintetiza y acumula rápidamente en la cutícula alrededor de las 48 h

(Boccaccio y Quesada-Allué, 1994), lo que equivale según nuestro esquema de

equivalencia de horarios, a alrededor del 15.4 % del tiempo acumulado de los estadios

que transcurren dentro del pupario. Por su parte, en Drosophila, Doctor y col. (1985)

determinaron que PCP-82 se acumula a partir de las 14 h desde la inmobilización

definitiva de la larva, es decir, alrededor del 14.6 % (Figura 30).

Por lo tanto, PCG-lOO de Ceratitr's y PCP-82 de Drosophila, que son las

principales proteínas de las cutícula pupal en las respectivas moscas, y que estarían

relacionadas por su secuencia aminoacidica, se acumularian en momentos equivalentes

del desarrollo dentro del pupario. Además, el momento del desarrollo en que se

acumulan, coincide en ambas moscas con la eversión de la cabeza y los miembros (pupa

fanerocefálica) (Tabla 4).

[00

BDm Cc Dm Cc

-q maga

Figura 29: Preparaciones masivas de proteínas cuticulares de D.melanogaster (Dm) yC.Capilata (Cc) fueron separadas en geles SDS-PAGE 12.5% y sometidas a "Western

blot" revelado con suero anti PCG-lOO, seguido por proteína A [1251]. (A)autorradiograña, (B) tinción con tinta china. La flecha vacia indica la posición de PCG­lOOde Cc; flecha oscura, indica PCP-82 de Dm. (tomado de Bocaccio, Tesis Doctoral,1991).

l--pre l pupa l adulto farado -------- --| CeratitisPupa

a b %de tiempo

i \ Ñ (il acumuladoa b' C' d dentro del pupario

Iprel pupa l adulto farado ------ --| Drosop/zí/aPupa

Figura 30: Equivalencia de horarios registrada a nivel bioquímico. a: inmobilizacióndefinitiva de la larva, b y b': deposición de las principales proteinas cuticulares pupales deCerau'tis y Drosophila (14,6 y 15,4 % del tiempo acumulado), c y c': deposición delpigmento drosopterina en Ceratitis y Drosophila (61,5 y 62,5 % del tiempo acumulado),y d- emergencia del imago.

lOl

Capítulo 2

Inferencia del momento de la metamorfosis en gue se degradarían los

diferentes teiidos v órganos larvales en Ceratitis.

La sorpresiva y notoria equivalencia de horarios encontrada entre ambos

dípteros en cuanto a la ocurrencia de eventos fisiológicos y bioquímicos, nos

permitió formular como hipótesis de trabaio la extrapolación a Ceratitis del tiempo

de degradación de diferentes órganos y tejidos larvales de Drosophila. Para establecer

esta relación, se utilizaron los estudios histológicos realizados en Drosoplu'la por:

Robertson (1936); Srdic y Renhart (1980); Dean (1978) y Ashbumer (1989).

Como se muestra en la Figura 31, nuestros cálculos indican que los músculos de

la cabeza y tórax (con excepción del músculo dilatador de la fan'nge y 3 pares de

músculos torácicos) se degradarían en Ceratitis durante la segunda mitad del estadío pre­

pupal, entre las 12 y 37 h (es decir, entre el 4 y 12% del tiempo acumulado).

La degradación de los músculos abdominales ocurriría en una etapa porterior del

desarrollo, es decir, durante todo el estadio pupal (entre las 39 y 136 h, que corresponde

al 12.5- 43.7 % del tiempo).

El músculo dilatador de la fan'nge se degradar-ía entre las 50 y 59 h.

El tracto digestivo de Ceratitis se degradar-íadesde la inmobilización definitiva de

la larva hasta el final del estadio pre-pupal (0-37 h, que corresponde al 0-12 % del tiempo

acumulado.

'Por su pane, las primeras señales del inicio de la histolisis en las glándulas

salivales se registran’an unas pocas horas antes de la inmobilización definitiva de la larva,

mientras que la disolución definitiva ocurriría alrederor de las 78 h (25% del tiempo

acumulado).

Los estudios histológicos presentados en el Capítulo I nos permitieron comprobar

que la extrapolación a Ceratitis del tiempo de degradación de diferentes órganos y tejidos

larvales de Drosophila es perfectamente válida ya que los tiempos teóricos se acercan

bastante a lo observado. En el Capítulo anterior, mostramos que los músculos

esqueléticos de Ceratitis correspondientes a la región torácica completan su histolisis

alrededor de las 22 h (7% del tiempo acumulado del desarrollo dentro del pupario),

mientras que los de la región abdominal lo hacen entre las 72 y las 120 h (es decir, entre

el 23 y 38,5 % del tiempo). Estos tiempos coincidieron perfectamente con los tiempos

l02

Capítulo 2

inferidos de Drosophíla, en este último la mayoría de los músculos de la cabeza y el

tórax completan su histolisis alrededor de las 8h (8.35 % del tiempo) y los músculos

abdominales desaparecen durante las primeras 24 h (25 % del tiempo) (Bodestein, 1951).

Los resultados alcanzados y los cálculos de equivalencia realizados nos permiten

establecer como hipótesis de trabajo, la secuencia en que se degradarían los principales

tejidos larvales de Ceratítis durante la metamorfosis; y si bien, en forma total la histolisis

se extendería desde la inmovilización definitiva de la larva (0 h) hasta el final del estadio

pupal (144 h) (Figura 31), claramente se observa que la mayoría de los tejidos se

degradarían durante las primeras 72 h de este proceso. 0110 aspecto interesante a

destacar, es que la transición de pre-pupa a pupa (40 h) parecería ser un momento crítico

en este fenómeno, ya que se superpondrían tejidos en diferentes etapas de degradación.

pre-pupa pupa adulto faradol I l I

I

0 40 144 312 h

|-----| | degradación de músculos de cabeza y tóraxI--| |

i ' degradación de músculos abdominales

................... --| degradacióndel tractodigestivo

Figura 31: Hipótesis de Trabajo: horarios inferidos para la degradación de losprincipales tejidos larvales durante la metamorfosis de la mosca del Mediterráneo.

CAPÍTUL0 III

Capítulo 3

Variación de las principales reservas energéticas durante lametamorfosis

La metamorfosis en los dípteros es una etapa de transición estática donde el

insecto inmóvil no se alimenta, lo que trae aparejado una importante disminución del

metabolismo general. Durante esta etapa se consumen progresivamente reservas que se

acumularon durante los estadios larvales precedentes, especialmente, durante el tercero.

En este Capítulo, nos propusimos determinar los cambios en el contenido de los

hidratos de carbono, proteínas y lípidos durante la metamorfosis de C. capitata, con el

objetivo de conocer en que contexto metabólico ocurre el proceso de histolisís larva].

Por otra parte, dado que el cuerpo graso y los músculos son los principales tejidos de

reserva en las moscas, nos propusimos cor-relacionar estas variaciones en las reservas

metabólicas con los cambiós anatómicos observados en el Capítulo I.

Variación del peso durante la metamorfosis

En la Figura 32 se muestran los cambios en el peso húmedo durante los estadios

de pre-pupa, pupa y adulto farado de la mosca del Mediterráneo, para lo cual se pesó

diariamente a los insectos en forma individual durante los casi 12 días que duran los

mismos. Se estudiaron grupos de 40 individuos.

Durante el estadío de pre-pupa se registró una disminución brusca del peso

húmedo que alcanzó el 23 % a las 48 h. A partir de este horario y hasta la emergencia

del adulto, el peso de los individuos disminuyó muy lentamente, siendo la pérdida total

del mismo en los imagos recién emergidos, de aproximadamente el 28 % (Figura 32), es

decir un 5 % durante los estadios de pupa y adulto farado. Si bien no se ha determinado

todavía en detalle las causas que provocan esta disminución de peso, se acepta que sería

debido, simplemente, a una pérdida de agua y C02 por respiración. Por su parte, el peso

seco de los individuos no presentó diferencias significativas en ningúno de los horarios

ensayados entre la larva de salto (-8 h) y el ¡mago recién emergido (280 h). Para cada

horario analizado, el peso seco representó entre el 28 y el 30 % del peso húmedo

respectivo.

104

11 ­

A10: ­UI

é 91 'a

CDI

l—1

n

. Pre' pupa adulto farado .7PUpa

6 l l I I l l0 40 80 120 160 200 240 280 320

Horas

Figura 32: Variación en el peso durante la metamorfosis de C.capitata. Lotesde 40 individuos fueron pesados diariamente, siendo el porcentaje de emergenciadel 79 %.

Cambios en el contenido de lípidos durante la metamorfosis

Recientemente, nuestro laboratorio en colaboración con el Dr. David Nestel

deterrninamos el contenido de lípidos totales durante la metamorfosis de la mosca del

Mediterraneo. Los resultados obtenidos mostraron que existió una acumulación de

lípidos desde el salto de larva III (-8 h) hasta la apolisis larval-pupal (20m h).

Posteriormente. entre las 203-0y 40 h no se produjeron cambios significativos en el

contenidos de lípidos totales. A panir de éste último horario comenzarían a utilizarse

los lípidos como fuente de energía, ya que se registró un descenso muy marcado en el

contenido de los mismos (Figura 33).

105

650 . .

o ' I:1-o . .'S‘5 490 - ­.E

m .

:3 410 - .. ­.9 - ­

g 330 - ­g _ larva III pre-pupa pupa _

250 ' '-50 O 50 100 150

horas

Figura 33: Contenido de lípidos totales durante la metamorfosis de Ceratítz's.Lotes de 25 individuos fueron analizados en forma individual (ver Materiales yMétodos).

Cambios en contenido de proteínas totales durante la metamorfosis

Como en otros insectos, durante la degradación de los tejidos larvales de

Ceratitis se produce el proceso de hidrólisis completa de las proteínas. En la histolísis,

las proteínas larvales son degradadas a péptidos de menor tamaño por endopeptidasas; y

estas, a su vez, llevadas a aminoácidos libres por las exopeptidasas. Posteriormente, los

aminoácidos libres serían empleados principalmente en la construcción de las proteínas

106

Capítulo 3

y tejidos del adulto, durante el proceso de histogénesis (Locke, 1985) y, presuntamente,

en muy baja proporción sen’anutilizados como fuente de energía.

En la Figura 34-A se muestra la variación en la cantidad de proteínas

precipitables con ácido tricloroacético-deoxicolato (Doc-TCA) (Peterson, 1977) durante

la metamorfosis. Como se observa claramente, el contenido de proteínas precipitables

disminuyó en forma sostenida durante las primeras 72 h desde la inmovilización

definitiva de la larva (0 h) hasta alcanzar una reducción de aproximadamente el 30 %.

Tras una aparente acumulación de nuevas proteínas (Figura 34-A). registramos otró

descenso a partir de las 100 h hasta el final del estadio pupal (144 h), donde la

reducción final fue del 40 %. Posteriormente, luego de la transición de pupa a adulto

farado (168 h) se registró una recuperación en la cantidad de proteínas precipitables,

llegando a niveles similares a los observados en la larva de salto (-8 h).

Por su parte, cuando se determinó en forma aproximada el contenido de

proteínas totales, medidas en forma directa por el método de Lowry (1951), no se

encontraron variaciones significativas, a pesar del proceso radical que significa la

histolisis (Figura 34-B). La máxima variación en el contenido de proteínas se obtuvo

entre las 0 y las 40 h y fue de tan sólo el 14,9 %. Los extractos crudos medidos en forma

directa contienen muchos componentes que podrían estar interfiriendo con la medición

real del contenido de proteínas; por ejemplo los pigmentos de los ojos y el cuerpo, el

ácido ún'co, nucleótidos como la guanidina, lípidos, xantina, péptidos de distintos

tamaños, aminoácidos libres, etc.

A Proteínas TCA precipitables

0.5 . . I I

o 0.44 - j .J'OEE 0.38 - _

E‘é 0.32 - _9D.

g 0'26 La“ P’e'PUPa pupa adulto.III farado

l l l n-20 20 60 100 140 180

HorasB

Proteinas totales

0.8 . . , '

g 0.68 - .'UE

E 0.56 - f _EE 0.44 - ¡8o.m 0.32 Lama pre'pupa pupa adulto.E l“ farado

l l l l-20 20 60 100 140 180

Horas

Figura 34: Cambios en la concentración de proteínas durante la metamorfosisde la mosca del Mediterráneo. (A) medición de proteínas precipitadas con Doc­TCA + Lowry, (B) medición directa de proteínas por el método de Lowry.

108

Cambios en el contenido de carbohidratos durante la metamorfosis

En general, en los insectos el glucógeno se almacena principalmente en los

músculos y el cuerpo graso. En los músculos representa la fiJente inmediata de glucosa y

por ende de energía para el movimiento, mientras que en el cuerpo graso, es el

encargado de proveer indirectamente de glucosa a los demás tejidos del cuerpo a través

de la formación del azucar circulante trehalosa. En colaboración con la Dra D.

Tolmasky hemos determinado el contenido total de glucógeno durante la metamorfosis

temprana de Ceratitis.

Como se observa en la Figura 35, el contenido de glucógeno registró una

reducción muy importante durante el pen’odo que involucra el salto y la inmovilización

definitiva de la larva. En la larva de salto (-8 h) se registró una reducción en el

contenido de glucógeno de aproximadamente el 50 % respecto de la larva con el

intestino lleno (-16 h), alcanzando el 86 % de reducción en el “Tiempo cero”, cuando la

larva se queda completamente inmóvil (Figura 35).

Durante las primeras horas del estadio pre-pupal, el contenido de glucógeno

continuó disminuyendo hasta alcanzar niveles casi indetectables a las 15 h. En este

horario, el contenido de glucógeno fue 15 veces menor al registrado en la larva con el

intestino lleno (Figura 35).

A partir de la apólisis larval-pupal (2039 h), parece iniciarse una etapa de

sintesis, con un incremento sostenido en el contenido de este carbohidrato, tendencia

que se mantuvo hasta el final del estadio pupal. Entre las 15 h y la transición de pre­

pupa a pupa (40 h), el contenido de glucógeno aumentó tres veces (en relación al

registrado a las 15 h), llegando a ser seis veces mayor al final del estadío pupal (144 h)

(Figura 35). De todas maneras, es necesario recordar que, como se observa en la Figura

35, los valores registrados durante esta etapa de síntesis “de novo” del glucógeno,

fueron siempre muy inferiores a los registrados en la larva IH con el intestino lleno.

Dear:adación del glucógeno y trehalosa

El glucógeno almacenado en el cuerpo graso de los insectos provee la glucosa

para la síntesis del disacárido trehalosa. Este disacarido se sintetiza principalmente en

109

Capítulo 3

dicho tejido, y circula libremente por la hemolinfa. La gran ventaja de la trehalosa es

que almacena dos veces más enegía por partícula osmóticamente activa que la glucosa

(Friedman, 1985).

Debido a que la histolisís es un proceso degradativo muy amplio, nos interesó

determinar la actividad de las enzimas degradatívas, tanto del glucógeno, como de la

trehalosa. En este sentido estudiamos la actividad de a-amilasa, que hidrolíza las

uniones al,4 del glucógeno, y de la trehalasa que convierte en la hemolinfa a la

trehalosa en dos moléculas de glucosa.

pre-pupa

V

8Larvalll7.

o 6'IEa 5'fs” 4­

2 3­0c» 2':1.

1.O-30 30 60 90 120 150

Horas

Figura 35: Determinación del contenido de glucógeno (ug / mg de tejido)durante la metamorfosis temprana ( ver Materiales y Métodos).

En colaboración con la Dra D. Tolmasky, deterrninamos la actividad de 0t­

amilasa, mientras que con el Lic. Berman hemos determinado la actividad trehalasa

llO

Capítulo 3

durante el desarrollo postembn'onario de Ceratitis y, de manera indirecta, la

disponibilidad del sustrato trehalosa.

En la Figura 36-A se muestra que la actividad de a-amilasa fue practicamente

nula en la larva III que está en plena etapa de alimentación (-36 h), y que ésta comenzó

a incrementarse a partir del salto (-8 h). Posteriormente, desde la inmovilización

definitiva de la larva, y durante todo el estadio de pre-pupa, la actividad a-amilasa

continuó aumentando, alcanzando la máxima actividad durante la transición de pre­

pupa a pupa (40 h). En este último horario, la actividad resultó 5 veces mayor que en la

larva de salto. A partir de este horario, la actividad amilasa se redujo en un 60 %

durante el estadio pupal. Finalmente, durante las últimas horas del estadio pupal (140 h)

se registró un nuevo incremento en la actividad amilasa (Figura 36-A).

En la Figura 36-B se observa que la trehalasa presentó mayor actividad hacia el

final del tercer estadío, cuando la larva madura abandona el alimento (-8 h). El

incremento de esta actividad enzimática coincidió exactamente con el período del salto

y de mayor movilidad, donde hay un gasto muy importante de energía. Luego de la

inmovilización definitiva de la larva (0 h), esta actividad decayó en forma sostenida,

alcanzando el nivel más bajo (7 veces menor) cuando la pupa adquiere las proporciones

definitivas del cuerpo (72 h). Posteriormente, se mantuvo en estos niveles hasta el final

del estadio pupal, y según resultados preliminares (no se muestra), hasta poco antes de

la emergencia del adulto, donde se registró un nuevo incremento en esta actividad. Este

segundo pico coincidió con el periodo de emergencia del adulto, cuando la mosca adulta

abandona el pupan'o.

Por lo tanto, durante el desarrollo postembrionario, la actividad de trehalasa

estuvo claramente asociada con dos momentos de gran actividad muscular que son la

dispersión de la larva y la emergencia del adulto.

lll

2Abs460nmlmgprot.

160

140

120

100

Ulmgproteína/min

larva III prepupa pupa

a —amilasa

¿no O

horas50 100 150

Ilarva Ill pre-pupa

trehalasa

pupa

0 50horas

100 150

Figura 36: Actividad de a-amilasa (A) y de trehalasa (B) durante lametamorfosis temprana de Ceratítis (ver Materiales y métodos).

112

Capítulo 3

Los resultados obtenidos nos permiten afirmar que la trehalosa no es utilizada

como fuente de energía durante la metamorfosis.

Los cambios en los contenidos de glucógeno y lípidos registrados durante la

metamorfosis temprana de Ceratitís se encontarían finamente balanceados, cuando se

consume una de éstas moléculas de reserva, en la otra se produce acumulación:

- desde el “Tiempo cero”(0 h) hasta las 203-Qh se consume el glucógeno remanente del

proceso de inmovilización llegando a niveles casi indetectables. En el mismo período

registramos acumulación de lípidos

- entre las 20m y las 40 h se produciría síntesis de novo del glucógeno, mientras que el

contenido de lípidos no sufre cambios significativos.

-a partir de las 40 h hasta el final del estadio pupal, se consumen principalmente los

lípidos, mientras que continúa la acumulación de glucógeno.

Por su parte, el contenido de proteínas disminuyó en forma sostenida desde la

inmovilización definitiva de la larva hasta las 72 h y luego de una pequeño incremento,

continuó con esta tendecia a partir de las 100 h hasta el final de] estadio pupal. Si bien

varios autores (Agrell y Lundquist, 1974 y Locke, 1985) han sugerido que la

degradación de proteínas, principalmente provee aminoácidos para la construcción de

las proteínas del adulto, también se acepta que una proporción de éstos se utilizaría para

la generación de energía. En este último caso, según nuestros resultados este aporte

energético podría ocurrir en cualquier momento de la metamorfosis ya que el contenido

de proteínas disminuye desde el inicio de la metamorfosis.

Los resultados obtenidos en el Capítulo I correlacionaron bien con los cambios

en las reservas energéticas. El cuerpo graso y los músculos abdominales presentarón los

primeros signos de MC a partir de las ZOE h. En ambos tejidos, las pupas de 40

presentaron tinción negativa con PAS (Capítulo I, Figura 19 y 24), indicando que en

éstos el glucógeno ha sido agotado completamente. Estos resultados nos permiten

postular que posiblemente la síntesis de novo de glucógeno registrada a partir de las

203-0h ocurre en los tejidos del adulto en formación­

El descenso en el contenido de los lípidos se correlacionó bien con la

disminución del número y tamaño de las vesículas de lípidos observada en el cuerpo

ll3

Capítulo 3

graso a partir de las 48 h (Capítulo I, Figura 21). Además, a partir las 72 h registramos

que parte del cuerpo graso comienza a fragmentarse.

CAPÍTUL0 IV

Capítulo 4

Degradación de tejidos larvales en Ceratitís: caracterización de

la actividad lisosomal

El objetivo de este capítulo fue: (l) determinar los cambios de la actividad

lisosomal durante la metamorfosis, a través del estudio de tres marcadores bien

conocidos; la fosfatasa ácida, B-glucosidasa y la B-galactosidasa, (2) estudiar la actividad

de las endopeptídasas ácidas lisosomales durante la metamorfosis y (3) identificar y

realizar una caracterización preliminar de las principales proteinasas detectadas.WWdurante las últimas horas del tercer estadío larval

Empleando alimento coloreado, hemos logrado determinar el momento en que la

larva III de Ceratílis vacia el intestino. En estos experimentos, los estadios larvales I y II

se desarrollaron en el alimento que normalmente se emplea en nuestro laboratorio (ver

Materiales y Métodos). Cuando éstas alcanzaron el tercer estadio fueron transferidas a

recipientes individuales, pequeños y chatos con una delgada capa de alimento coloreado

de azul, y mantenidas en completa oscuridad. Este dispositivo permitió observar (siempre

bajo luz roja de seguridad) el crecimiento de las larvas de tercer estadio y la tinción del

intestino (Figura 37-A). Durante el último día de larva III, se realizaron observaciones

cada 15 min para determinar el momento del vaciado del intestino.

Hemos determinado que la larva de tercer estadio deja de alimentarse y purga los

restos de alimento sin digerir que aún quedan en el intestino, aproximadamente 12 h antes

de la inmovilización definitiva de la misma (Figura 37-C)(Rabossi et al, 2000). Cuando la

larva esta pungando el intestino, el alimento expulsado es reemplazado por aire. Por lo

tanto, a partir de este momento el insecto no ingerirá ningún tipo de alimento hasta

después de su emergencia como imago y el intestino larval deja de ser funcional.

Para demostrar que la pérdida de la función intestinal implica, entre otros cosas, la

inactivación de las enzimas degradatívas, se midió la actividad proteolitica general antes

(-20 h) y después del vaciado del intestino (-8 h). Por lo que se conoce en dípteros, las

llS

Capítulo 4

proteinasas. Las primeras, representadas principalmente por la tripsina y quimotn'psina,

presentan habitualmente actividades máximas a pH alcalino. El segundo grupo, que

incluye a las cistein-proteinasas presenta actividades máximas a pH ácido y neutro

(McGhie y col, 1995). Por lo tanto, en los estudios preliminares se decidió utilizar

azocaseína para detectar endopeptidasas con actividad a pH neutro o alcalino, y se

empleó hemoglobina para detectar aquellas con actividad a pH ácido o ligeramente

neutro.

Figura 37: En Ceratitis, el vaciado del intestino ocurre 12 horas antes de lainmovilización definitiva de la larva.(a) larva III con el intestino lleno, (b) la flecha indica el momento en que una larvaIII se encuentra vaciando el intestino y (c) larva con el intestino vacio queabandonó el alimento (colaboración y fotografias de Laura Ación ).

lló

Capítulo 4

En la Figura 38-A, se muestra que la actividad degradativa sobre azocaseína, a pH

alcalino, prácticamente desapareció en la larva de salto (-8 h, que lleva cuatro horas con el

intestino vaciado); mientras que sobre hemoglobina (a pH ácido) disminuyó alrededor de

un 70 % (—8h).

En Ceratitis, los extractos crudos de intestino de una larva de —20h presentaron

los máximos valores de actividad sobre azocaseína entre pH 8 y 10, registrándose el

máximo a pH 9,6 (Figura 38-B). A pHs inferiores a 8 se observó una disminución notoria

en la actividad proteolítica, registrándose una pérdida de aproximadamente el 60 % a pH

5.3. No se pudo registrar la actividad a pHs inferiores a 5, ya que la azocaseína deja de ser

soluble. Cuando estos extractos fueron ensayados sobre hemoglobina, el pH óptimo se

registró a pH 3,5, auque no fue significativamente supen'or al registrado a pH 4,5 (Figura

3,5)

0.06

0.05

0.04

0.03

U/mgprot.

20 8horas antes del inicio de la metamorfosis

ll7

0.04 . . fi .

0.032 - .

É: 0.024 - ­a.cnE 0.016 - ­

D

0.008 - —O- azocaseína

—e- hemoglobinao l l l

0 2 4 6 8 10 12

pH

Figura 38: (A) Determinación de la actividad proteolítica en larvas III con elintestino lleno (-20 h) y vacio (larva de salto, -8 h). Los ensayos se realizaronempleando azocaseína 2% a pH 8 (Az) y hemoglobina 2% a pI-I 5.3 (Hb), según sedetalla en Materiales y Métodos. En (B) se muestra la curva de pH óptimo para lahidrólisis de azocaseína y hemoglogina en extractos de intestino de una larva III de—20 h.

En las larvas con el intestino lleno (—20h) las actividades proteolíticas registradas

a pH alcalino fueron inhibidas principalmente con PMSF y Leupeptina. Estos inhibidores

especificos de serín-proteinasas, produjeron una reducción cercana al 55 % en la actividad

proteolítica general contra azocaseína (Figura 39). En este mismo horario, la fenantrolina,

inhibidor de metaloproteinasas produjo una reducción de aproximadamente el 20 % de la

actividad proteolítica general (Figura 39).

118

00

_i--_

00000

86425V«¿se8223

gún se2 % como sustrato. (C)

lfonil-fluoruro; Leup: leupeptina: Phen:

imática se rea ¡zó sesobre la actividad proteolítica

l.ammem81m0OlZcca

fiC

,180CCd

ernuwaameLhn.mmSOe

ene

r

“m5,..lmi.onmeñh.Ut...müéncm

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acmmachñpmóEWC.l_th..an;3nn.mCHAN]alelmraaotUÜCHM.WanmmnanCnm

la larva de

a pH alcalinotividad proteolítica general

ión de la misma a pH ácido registradas en

0rtnemd

Se

.mnmwemeSUum.mqC.I.er.S..Dr.matCer..bmadtm.aaWD..BlPpue.Ym

e

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a.l

ol.S

hmOVumIltpcee

muPds

0.msmW.mCm.mCl.nl.a.m..mlX;nmweoommzonanmn3¡D.I.dm

,mD.0mo0u..lmCUMen dDS».wh.Wadm4.apa(.I.nW.I.aluueuasyVaa dmCII..MuuakW.l.I.emmlmmmmudLheaLneq.Jnwn¡msuu0ümamrteedlO¿laameD.Sddfd

1 o vacío ilustran claramente la pérdida de la función

tívidades proteolíticas que se

serándel pupario

específicas de los diferentes

ales, el principal es la hístolísis

Capítulo 4

Actividad lisosomal durante la metamorfosis de Ccagitata

En los lisosomas se produce la hidrólisis completa de proteínas hasta aminoácidos.

El pH acídico de estas organelas favorece una rápida desnaturalización de las proteínas

quedando el polipéptido expuesto para su posterior hidrólisis por parte de endo- y

exopeptidasas, fosfatasas e hidrolasas ácidas.

Para determinar en forma global la actividad ácida, asumiendo que ésta está

constituía fundamentalmente por enzimas lisosomales, se decidió medir la actividad de

distintas enzimas hidrolíticas durante la metamorfosis. En la Figura 40, se muestran los

perfiles de actividad durante esta etapa del desarrollo, de la fosfatasa ácida (FA),

hidrolasas ácidas (B-glucosilasa y B-galactosidasa), todas ellas enzimas típicamente

lisosomales.

La actividad de FA presentó niveles bajos de actividad hasta aproximadamente la

mitad del estadio pre-pupal. Hacia las ZOE h (que consideramos el inicio del proceso de

pupación), la actividad de FA aumentó en forma sostenida, hasta alcanzar el máximo de

actividad durante la transición de pre-pupa a pupa (40 h) (Figura 40-A). En este momento,

la actividad especifica de F.A. fue ocho veces mayor que la registrada en la larva de salto.

Posteriormente, cuando la pupa alcanzó las proporciones definitivas del cuerpo (72 h), se

registró un segundo incremento en la actividad F.A., aunque de menor magnitud que el

anterior (Figura 40-A), manteniéndose en estos niveles hasta el final del estadío pupal.

Las actividades de B-glucosidasa y B-galactosidasas fueron determinadas como

ejemplo de hidrolasas ácidas lisosomales. A diferencia de la fosfatasa ácida, las hidrolasas

ácidas incrementaron su actividad desde el inicio del estadio de pre-pupa (figura 40-B). A

partir de las 4 h se registró un abrupto incremento en la actividad de ambas enzimas. La

actividad de B-glucosidasa alcanzó un incremento de unas seis veces poco después de la

apólisis larval-pupal (24 h), manteniendo niveles similares de actividad hasta las 72 h,

donde comenzó a declinar en forma permanente hasta el final del estadio pupal (Figura

40-B).

Por su parte, la actividad de la B-galactosidasa presentó un perfil de actividad

similar al registrado con la B-glucosidasa, aunque el descenso de la actividad fue más

abrupto y errático a partir de las 24 h. En ambas hidrolasa se registró un descenso de la

actividad a las 40 h (Figura 40-B), que coincidió con la máxima actividad proteolítica

120

Capítulo 4

registrada (Figura 40-C). Si bien los extractos de los diferentes horarios ensayados fueron

preparados con un coctel de inhibidores de proteinasas (ver Materiales y métodos), es

posible que éstos no hayan inhibido completamente y permitan justificar este descenso

momentáneo de ambas actividades.

Actividad general de endopeptidasas ácidas

La actividad general de endopeptidasas ácidas se determinó utilizando una

proteina entera como sustrato (fundamentalmente hemoglobina), con la idea de poder

detectar la mayor cantidad de actividades proteolíticas posibles. Las mediciones se

realizaron a pH 3,5, que como se muestra más adelante, resultó el pH óptimo de reacción

para los distintos horarios del estadio pre-pupal y un pH en el que se logró medir

actividad en todos los horarios analizados durante el estadio pupal

En la mosca del Mediterráneo se encontró que la actividad proteolítíca general

comenzó a ser detectable recién a partir de las 16 h, y que la máxima actividad se alcanza

alrededor de las 40 horas (Figura 40-C). Se vió que durante la transición de pre-pupa a

pupa, ésta actividad fue 8 veces mayor que al comienzo de la metamorfosis y 4 veces

mayor que cuando la pupa ha adquirido las proporciones definitivas del cuerpo (72 h).

Como se observa claramente en la Figura 40 A y C, el perfil de actividad que presentaron

las endopeptidasas ácidas durante las primeras 60 h de la metamorfosis fue muy similar al

de la fosfatasa ácida.

Las máximas actividades de las tres enzimas lisosomales determinadas, se

registraron en una ventana de desarrollo relativamente angosta (28 h) que se ubica entre la

apolisis larval-pupal (20.3.9h) y la transición de la pupa criptocefálica en fanerocefálica

(48 h). Coincidentemente, las máximas actividades antes mencionadas se registraron

durante el proceso de la pupación.

Figura 40: Actividad lisosomal durante la metamorfosis de Ceratítz's. Aexcepción de la medición de la actividad proteolítíca general, donde se empleó unsustrato general (hemoglobina 5%), para la evaluación del resto de las enzimas seutilizaron sustratos especificos (ver Materiales y Métodos). La actividad de cadaenzima está representada por la actividad específica (U / mg prot).(Ver gráfico en la página siguiente)

lZl

abcd efmv n

É LARVA III

® 0.9

0.1

units/mgprot

@

units/mgprot

S‘PÍGQ4 <n...

I I I

9 4.0 1-?2l I I

©

0.74-!9Q.U)E 05\

+2CJ 0.3

0.1-1O 10 30 50 70 90 110130150

Capítulo 4

En el Capítulo anterior, se indicó la existencia de un descenso constante en el

contenido de proteínas precipitables con TCA desde el inicio de la metamorfosis. Esta

disminución llegó a ser de aproximadamente del 40 % hacia el final del estadío pupal

(144 h) (Figura 34-A). Cuando comparamos el perfil de actividad de endopeptidasas

ácidas durante la metamorfosis con el de las proteínas precipitables con TCA, observamos

que ambas curvas coincidieron en forma bastante estrecha (Figura 41). A medida que

aumentó la actividad proteolítica general el contenido de proteínas disminuyó. Estos

resultados indicarían, aunque de manera indirecta, que las endopeptidasas ácidas (y por lo

tanto lisosomales) estarían jugando un papel fundamental en la destrucción de las

proteínas larvales.

0.5 . . . . 0.9,arva pre-pupa pupa adulto

o lll farado8 0.44 - - 0.74E 23: 0.38 - «0.58 eN D..E cn

‘3 032 - -o42 Éa DcnE 0.26- - 026-.­

__,_ J0.2 - ‘ 4 - 0.1

—2o 20 60 100 14o 180

Horas

Figura 41: Cambios en la actividad de endopeptidasas ácidas (curva roja) y en elcontenido de proteínas precipitables con TCA (curva negra) durante lametamorfosis.

El pH óptimo para la proteólisís de proteínas enteras cambió durante la

metamorfosis

El pH óptimo para la proteólisís de proteínas enteras fije determinado empleando

moscas de los estadios de pre-pupa y pupa. La Figura 42, A y B, muestra que el pH

123

Capítulo 4

El pH óptimo para la proteólisis de proteínas enteras cambió durante lammEl pH óptimo para la proteólisis de proteinas enteras fue determinado empleando

moscas de los estadios de pre-pupa y pupa. La Figura 42, A y B, muestra que el pH

óptimo para la proteólisis de hemoglobina se desplazó, acompañando el desarrollo del

insecto dentro del pupan'o. Este desplazamiento se produjo desde pH 3,5 en la larva

definitivamente inmovilizada (0 h) hasta pH óptimo 6,5 cuando la pupa está

completamente formada (98 h).

Durante el estadio de pre-pupa predominaron actividades proteóliticas con pH

óptimo ácido (Figura 42-A). En todos los pHs ensayados, los valores de actividad

registrados en "Tiempo Cero" fueron practicamente indetectables. En los extractos de 24

y 40 h, el pH óptimo para la proteólisis de hemoglobina fue de 3,5. En este ultimo

horan'o, si bien el máximo de actividad se registró a pH 3,5, no fue significativamente

supen'or a los registrados entre 2,5 y 5,5.

Durante el estadío pupal se observó que el pH óptimo para la proteólisis de

hemoglobina cambió a lo largo del estadío (Figura 42-B). En la pupa fanerocefálica (48 h)

predominaron actividades proteolíticas con pH óptimo de 4,5. A las 61 h y 98 h, las

curvas de pH presentaron dos máximos de actividad bien diferenciados, el primero, en

ambos horarios a pH 3,5; mientras que el segundo, de mayor importancia en ambos

horarios se generó a pH 5,5 y 6,5, respectivamente.

O'O 'l I U I

—e- 0 h—o- 24 h

O —I— 40 hg 0.06­EE \z 0.04- .m0Em8 0.02- ­uJD

o l l l l l

1 2 3 4 5 6 7 8

pH

0.1 . . r

g 0.08­'CIEU.E 0.06.

a3e 0.04. .

0.02 i n n

Figura 42: Determinación del pH óptimo para la proteólisís de hemoglobinadurante los estadios de pre-pupa (A) y pupa (B) (ver Materiales y Métodos para lasdistintas condiciones del ensayo).

125

Capítulo 4

Los resultados obtenidos durante el estadio pre-pupal de Ceratitis coincidieron

con datos bibliográficos previos en Lucília cuprina (Smith y Birt, 1972), Aldríchina

grahami (Kawuamura et al, 1984; Rodems et al, 1969; Henrikson y Clever, 1972), donde

se registró una actividad proteolítica general con pl-l óptimo entre 2,8 y 3,5 en el inicio de

la metamorfosis. En el estadio pupal de Lucilla cuprina, Smith y Birt (1972) registraron

actividades con pH óptimo de 6,5 o superiores y propusieron que estas actividades son

caracteristicas de proteinasas de mantenimiento.

Caracterización preliminar de las actividades proteolíticas detectadas

en los extractos crudos dela mosca del Mediterráneo.

Específicidad de sustratos: la actividad proteolítica contra distintas proteínas

enteras utilizadas como sustrato fue ensayada con extractos totales de 24, 48, 61 y 98 h.

para determinar si a lo largo del desarrollo dentro del pupan'o existían diferentes

especificidades con respecto al sustrato que nos permitieran caracterizar estas enzimas.

Además de hemoglobina se utilizaron caseína, seroalbúmína bovina y gelatina, todas

preparadas al 2.5 % (p/v). En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidos que fueron

expresados como procentaje respecto a la actividad registrada con hemoglobina, tomada

como referencia (l00%).

La albúmina fue digerida con mayor dificultad en los extractos de 24 y 48 h,

mientras que en los de 61 y 98 h no presentó diferencias con el ensayo estándar con

hemoglobina. Trabajos previos reportan que la Catepsina D perteneciente a la familia de

las aspartil proteinasas es poco eficaz en la digestión de BSA (Press, 1960).

La digestión de caseína no presentó diferencias importantes con la hemoglobina a

las 24, 48 y 98 h, mientras que a las 61 h presentó un incremento del 34%.

La gelatina fue el sustrato donde se obtuvieron las mayores diferencias de

digestión. A excepción de la pre-pupa de 24 h, donde no se registró diferencia con la

hemoglobina, la gelatina resultó ser el sustrato mejor digerido por los extractos totales de

pupa. El incremento en la digestión de esta proteína acompañó la evolución de la

metamorfosis. Este fue 23% superior a las 48 h, 64% a las 61, y alcanzó un 74% de

incremento a las 98 h. Es interesante destacar que la catepsina D y otras asprtil

126

Capitulo 4

proteinasas son incapaces de degradar gelatina (Barret, 1967), por lo que con este sustrato

se estarian registrando sólo actividades de endopeptidasas pertenecientes a las familias de

las císteín-proteinasas.

Actividad relativa (%)

Sustrato 24 h 48 h 61 h 98 h

Hemoglobina 100 100 100 100

Albúmina 77 80 101 99

Caseína 93 107 134 119

Gelatina 89 123 164 174

Tabla 5: Especificidad de la digestión de proteínas enteras empleadas comosustrato. Se emplearon extractos totales de distintos horarios durante lametamorfosis de Ceratitis. Todos los ensayos fueron realizados al menos porduplicado, con los sustratos preparados al 2.5%, en solución tampón 0.2 M fosfato­cítrato en los pH óptimos para cada horario. La reacción emzimática se realizópreincubando el tampón y la fiJente enzimática durante 20 minutos, antes deagregar el sustrato.

Temperatura óptima de proteólisis: se determinó la temperatura óptima para la proteólisis

de hemoglobina, empleando extractos enzimáticos crudos correspondientes al estadio de

pre-pupa (24 y 40 h) y pupa (48, 61 y 98 h).

Durante cl estadio pre-pupal se obtuvieron curvas de dependencia de temperatura

bimodales con máximos poco marcados a 30 y 45 9C. Tanto a las 24 como a las 40 h, la

actividad proteolítica decayó a temperaturas por debajo de los 20 9C y por encima de los

55 9C (Figura 43-A).

La Figura 43-B muestra la temperatura óptima para la proteólisis de hemoglobina

durante el estadio pupal. Si bien los extractos de 48 y 61 h mostraron un comportamiento

bimodal. es a las 48 h donde se obtuvo las diferencias más marcadas. En este último

127

Capítulo 4

horario la actividad a 45 °C fue netamente superior que a 30 °C. La actividad de 98 h no

presentó un comportamiento bimodal y la máxima actividad se alcanzó a 45 °C.

A

0-08 I I I I I I I

É 0.07­.2'O

E 0.06­í'o 005­CU

79.2

2 0-04' —o—24 hora—e—40 horas

0.03 l l l l n l 120 25 30 35 40 45 50 55 60

Temperatura (°C)

B

0.07 U I í I I I I

—o— 98 horas0065 ,_ —9— 61 horas

—u- 48 horas

3° o 03I

0.055 '

.o o 01r

Actividad(U)/individuo

0.045 ' ' ‘ ‘ ‘20 25 30 35 40 45 50 55 60

Temperatura (°C)

128

Capítulo 4

Figura 43: Temperatura óptima para la proteólisís de hemoglobina (2.5%)durante los estadios de pre-pupa (A) y pupa (B). (Ver página anten'or)

Efecto de cationes y agentes reductores: el efecto que producen los cationes divalentes y

agentes reductores sobre la actividad proteolítica general de extractos totales fue

determinado en distintos horarios. La actividad proteolítica fue determinada con

hemoglobina en los pH óptimos determinados para cada horario, y los resultados se

muestran en la Tabla 6.

Ni el Ca”, ni el Mg++ produjeron cambios significativos en la actividad

proteolítica en los distintos horarios ensayados. El calcio provocó una activación del 30%

en las muestras de 48 h respectivamente, mientras que el magnesio provocó una

activación entre el 23 y 28% en las muestras de 48, 61 y 98 h (Tabla 6).

En cuanto a los agentes reductores, mientras que DTT practicamente no presentó

efecto alguno en los horarios ensayados; B-mercaptoetanol provocó una activación del 34

% en la actividad proteolítica general a las 98 h cuando se empleó en una concentración

de 5 mM.

Actividad relativa (%)

Reactivos 43 h 61 h

control 100

+Cl3C85 mM Ï 121

+ClMg 2,5 mM 123

+ DTT 2,5 mM 107

5,0 mM

+ B-SH 2,5 mM

5,0 mM

Tabla 6: Efecto de cationes divalentes y agentes reductores sobre la actividadproteolítica general en diferentes horarios Se emplearon extractos totales de

129

Capitulo 4

distintos horarios. Todos los ensayos fueron realizados al menos por duplicado,con los sustratos preparados al 2.5%, en solución tampón 0.2 M fosfato-citrato enlos pH óptimos para cada horario. Para el empleo de los diferentes reactivos, lareacción emzimática se realizó preíncubando el tampón con el reactivo, y la fuenteenzimática durante 20 minutos, antes de agregar el sustrato.

Los resultados obtenidos en esta caracterización preliminar nos permiten postular

que: (l) el no requerimiento de cationes, unido al pH óptimo de 3,5; y a la digestión

disminuida de BSA y gelatina; parecen indicar que durante el estadío de pre-pupa

predominarían proteinasas pertenecientes a la familia de las aspartil-proteinasas.

(2) la activación producida por el B-mercaptoetanol, en conjunto con la importante

digestión de la gelatina y el pl-I óptimo de 6,5 hacen presumir que en la pupa de 98 h

predominan actividades pertenecientes a la familia de las cistein proteinasas.

Caracterización de las principales actividades proteinasas que actúan

durante la metamorfosis mediante el uso de inhibidores de proteinasas

Con el objetivo de asignar las actividades proteolíticas detectadas durante la

metamorfosis a alguna de las seis familias de proteinasas conocidas actualmente, se

emplearon inhibidores generales y específicos de proteinasas. En base a la comparación

del sitio activo, el mecanismo de acción y la estructura tridimensional, las familias de

proteinasas conocidas actualmente son: serina-proteinasas I y II, cisteína-proteinasas,

aspartil-proteinasas y metalo-proteinasas I y II (Neurath, 1989).

Se realizaron ensayos de inhibición empleando EDTA como inhibidor de metalo­

proteinasas y E-64, Leupeptina y Sulfato Cúprico como inhibidores de cistein-proteinasas.

Pepstatina A se utilizó como inhibidor de aspartil-proteinasas y PMSF y Leupeptina como

inhibidores de serin-proteinasas.

En primer lugar, utilizamos extractos totales de 0, 24 y 50 h (Tabla 7) y

observamos que ningúno de los inhibidores ensayados produjo un descenso significativo

de la actividad proteolítica general. Estos resultados fueron similares a los obtenidos con

extractos de pupas criptocefálicas de 40 h (Tabla 8- A), e iguales a cuando se emplearon

130

CMdiferentes concentraciones de los respectivos inhibidores. El EDTA por su parte, no a las

24 h no sólo no inhibió sino que cuando fue empleado en concentraciones entre 3 y 7 mM

provocó una activación de hasta el 60 % en la actividad proteolítica general de pre-pupas

de 24 h (Tabla 7 y Figura 44).

Actividad relativa (%)

Inhibidor 0 h 24 h 50 h

Sin inhibidor lOO 100 100

EDTA 3mM 137 103 104

SO4Cu SmM ND 101 107

Pepstatina A lOpM 85 87 91

PMSF lmM 102 100 ND

13-64 lOpM 103 96 104

Leupeptína lO pM 103 97 ND

Tabla 7: Efecto de inhibidores sobre Ia actividad proteolítica general, en distintosmomentos del desarrollo. Los ensayos fueron realizados por duplicados,empleando hemoglobina 2.5%. En todos los horarios se preincubó el inhibidor conla fuente de enzima durante 20 mín antes de agregársele el sustrato. (ND: no sedeterminó)

13]

I I I I I I I

A 80 ..\°

Ng 60­N

Eg 40­TE.2

2 20- -<

0 l l l I L l I

EDTA [mM]

Figura 44: Efecto del EDTA sobre la actividad proteolítica general de pupas de 24 h.

Los resultados obtenidos podrían explicarse por el hecho de que en extractos

impuros existe superposición de varias proteinasas y los inhibidores podrían ser

destruidos por éstas, o bien ligarse a otros componentes de la muestra (Barret, 1977). Se

decidió utilizar entonces, como fuente de enzima el material de 40 h fraccionado con

sulfato de amonio. La Figura 45 muestra el fraccionamiento de la actividad proteolítica

general con sulfato de amonio, que en su mayoría precipitó entre 40 y 60 %. En base a

estos datos, para recuperar el 90% de la actividad se decidó utilizar como fuente de

enzima la fracción entre 30-70 %.

132

100

Actividadrelativa(%) 'Iwï ¿55“ ,o 2° 4° 80 103

Sulfato de amonio (%)

Figura 45: Fraccionamiento con sulfato de amonio del extracto total de pupas de 40 h.

La actividad proteolítica en todas las fracciones obtenidas se midió con hemoglobina 2,5

% como sustrato (ver Materiales y Métodos).

En la Tabla 8-B, se muestra claramente que la sumatoria de las actividades

proteolíticas (a pH 3,5) en las pupas de 40 h fraccionadas con sulfato de amonio, parece

pertenecer a las familias de las aspartil y cisteín-proteinasas. La pepstatina A, inhibidor

especifico de aspartil-proteinasas, produjo una inhibición del 59 % en la actividad

proteolítica general, mientras que el E-64, inhibidor específico de cisteín-proteinasas,

produjo una inhibición del 35 % (Tabla 8-B). Juntos, estos inhibidores produjeron una

reducción del 95 % de la actividad proteolitica general.

133

Capitulo 4

Inhibidor Concentración (mM) Actividad relativa (%)

A. Extracto crudo

Sin inhibidor 100

EDTA 3 160

PMSF l 97

E- 64 0,013 86

Pepstatina A 0,010 84

E-64 + Pepst. A 0,013 + 0,010 83

B. deo 00102804

Sin inhibidor 100

EDTA 3 104

PMSF l 87

E- 64 0,010 65

Pepstatina A 0,012 41

E-64 + Pepst. A 0,010 + 0,012 4

Tabla 8: Efecto de inhibidores específicos de proteinasas sobre la actividadproteolítica de homogenatos totales de insectos de 40 h (A) y los correspondientesprecipitados con sulfato de amonio 30-70 % (B). Los ensayos fueron realizados almenos por duplicado, empleando hemoglobina 2.5% y 5%. En todos los casos sepreincubaron el inhibidor y la fuente de enzima durante 20 minutos antes deagregar el sustrato.

134

CAPÍTUL0 V

Capítulo 5

Purificación y caracterización de las cisteín-proteinasas

identificadas durante la metamorfosis temprana de Ceratitís

El empleo de inhibidores específicos permitió postular la presencia de dos grupos

principales de proteinasas predominantes en los extractos totales de pupas de 40-45 horas

de Ceratz'tís.Una de estas actividades perteneceria a la familia de las aspartil-proteinasas,

mientras que la otra, perteneceria a la familia de las cisteín-proteinasas (ver Capítulo IV,

Tabla 8-B).

En este Capítulo se presenta la purificación a homogeneidad y la caracterización

preliminar de actividades con características de cisteín-proteinasas presentes en la

metamorfosis temprana de esta mosca.

El protocolo empleado tuvo en cuenta los siguientes aspectos:

a) Dada la dificultad de obtener grandes cantidades de material homogéneo de Ceratitis,

ya que esto implicaba sincronizar individuo por individuo al inicio de la metamorfosis, se

decidió emplear un protocolo de purificación que permitiera separar en los primeros

pasos la principales actividades proteolíticas posibles, aunque no fuera el ideal en cuanto

a los rendimientos de enzima pura obtenida posteriormente.

b) Por lo tanto, para lograr aislar en forma simultánea las diferentes proteinasas se decidió

trabajar a pH ácido, donde se había registrado la mayor estabilidad y actividad en los

extractos crudos. En esta situación, sabíamos que habría también una merma considerable

en el rendimiento debido al proceso de proteólisis recíproca y/o autoproteólisis, ya que a

estos pHs las enzimas están activas.

Las condiciones empleadas para cada método cromatográfico utilizado en esta

sección, se describen en forma detallada en Materiales y Métodos.

En la Figura 46 se muestra el esquema de purificación empleado para la

separación de las cistein-proteinasas.

135

HOMOGENATO

I

, I

EXTRACCION ACIDA (pH 4.2)

I

, I

PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO (30-70%)

I

SEPHACRYL S- 200®

PICO I PICO IV

I I

CROMAT. COVALENTE CROMAT. COVALENTE(THIOL- SEPHAROSE®) (THIOL- SEPHAROSE®)

l l

MONO S® (FPLC) MONO S® (FPLC)l

SUPEROSE 12®(FPLC) iI

MCP" MCPI

Figura 46: Equema de purificación empleado en la separación de las actividadesproteolíticas con características de cisteín-proteinasas, que estarían implicadas enla degradación de tejidos larvales durante la metamorfosis. MCP II : cisteín­proteinasa de la metamorfosis II, de alto peso molecular; MCP I: cisteín­proteinasa de la metamorfosis I, de bajo peso molecular.

136

Capítulo 5

Purificación de las cisteín-proteinasas de extractos de 40 h

De acuerdo a la caracterización preliminar de las endopeptidasas ácidas detectadas

durante la metamorfosis (ver Capítulo IV), la homogeneización de las pupas se realizó en

una solución tampón de 0,1 M acetato de sodio, 0,001 M EDTA, 0,3 M ClNa, pH 5,0 (en

una relación 1:2, p/v). Luego de la ruptura de los tejidos y su posterior centrifugación, el

sobrenadante elevó su pH a 6,3.

Como primer paso de purificación, se decidió en base a ensayos previos, someter

el homogenato total a una precipitación ácida, por ajuste gradual del pH hasta 4,2 con

ácido acético glacial. De esta manera, muchas proteínas sufren cambios desnaturalizantes

en su conformación que provocan su precipitación. Tanto la o las cisteín proteinasas y la

o las aspartil-proteinasas de los extractos permanecieron en solución luego de esta

precipitación ácida. Por otra parte, este paso resultó esencial para activar las cisteín­

proteinasas de la muestra. Como fue descripto previamente por Mason y col. (1985) y

Barret (1977) muchas cisteín-proteinasas se encuentran en el extracto crudo en una forma

inactiva de pro-enzima (o zimógeno) ya que se hallarían asociadas a inhibidores

específicos. El descenso del pH de la muestra hasta valores ácidos provocan'a la

disociación de éste complejo, produciendo una máxima activación de las cisteín

proteinasas.

Como segundo paso, se optó por el método de precipitación por incremento de la

fuerza iónica, para lo cual se utilizó sulfato de amonio. La fracción que contiene a las dos

clases de proteinasas antes mencionadas precipitó en un 90 % en el rango de saturación

entre 30-70% (ver Capítulo IV, Figura 45).

La fracción protéica, resuspendida y dializada, fue aplicada a una columna de

exclusión molecular tipo Sephacryl-S 200® (Pharmacia). En la figura 47 se muestra el

diagrama de elución de ésta columna. La actividad proteolítica fue determinada con un

sustrato sintético fluorogénico (Z-Phe-Arg-NHMec), y se detectaron tres picos

(denominados, I, H y IV). El pico I quedó conformado con las fracciones 50 a 60, el pico

II con las fracciones 63 a 67, mientras que el pico IV desde las fracciones 80 a 90.

El inhibidor irreversible E-47S, específico de cisteín-proteinasas, abolió por

completo la actividad proteolítica en los picos I, II y IV, mientras que la Pepstatina A,

Capítulo 5

inhibidor específico de las aspartil-proteinasas, no tuvo efecto en ninguno de los tres

picos antes mencionados.

3.o . 200

2.5 - É

E ' ÉC \o 2.o - oa a

< 1.5 - 1100 L“

—<i-— —<—

1.o ­- 5o

0.5 r

0.o A¿.2 ¿3.2.2 m ' ' - : oo 20 4o 60 eo 100 120

Fracción (N°)

Figura 47: Cromatografia de exclusión molecular Sephacryl S-200® (3 cm x 135cm) donde se identifican los tres picos con actividad de tiol-proteinasa. Quince mldel material proveniente de la precipitación con sulfato de amonio fueronaplicados a la columna, equilibrada con una solución tampón 100 mM acetato desodio, l mM EDTA, 300 mM ClNa, pH 5.0. Se colectaron fracciones de 5 ml cadauna, mientras que la velocidad de flujo fué de 33.6 ml / h.

Capítulo 5

El trabajo de purificación se continuó con los picos I (fracciones 50-60) y IV

(fracciones 80-90) por separado, mientras que el pico II presentó dificultades por lo que

se lo intentará purificar en el fiituro.

Aprovechando las propiedades de las cisteín-proteínasas de presentar al menos un

grupo tiol en su molécula (especificamente en su sitio activo), se sometió a los picos I y

IV en forma separada a una cromatografia de afinidad covalente del tipoThiol-Sepharose

4B® (Pharmacia). La unión selectiva de los grupos tioles libres de las proteínas

componentes de estos picos a la resina activada permitió separar las cisteín proteínasas de

una mezcla con gran cantidad de polipéptidos (figura 48, A y B).

A Pico I

3 r .

2.5 '

e ÉC 2 - 88 vN l< 1.5 - En

LIJ—<_ 1 I

Cisteína _._

o 5 _ 20 riMo ' ví­O 5 10

Fracción (N°)

139

B Pico II

3.5 . . . . . 600

3 ' - 500E' c

É - 400 88 2 ' "N - 300 ó< 1.5 - 5

IJJ

—q_ 1 _ Cisteína ' 20020mM _._

0.5 100

- 0O 5 10 15 20 25 30

Fracción (N°)

Figura 48: Cromatograña covalente Thiol- Sepharose 4B®. El Pico I (A) y elPico IV (B) provenientes de la columna de exclusión molecular, fueronconcentrados y díalizados para ajustar su pH a 6,0. La elución se realizó con unasolución tampón 20 mM L-cisteína en 0,1 M fosfato 0,3 M ClNa, lmM EDTA, pH6,0. Cada fracción fué de 5 ml.

En la Figura 49, se muestra un gel de poliacrilamida lO % con SDS, donde se

compararon, para los picos I y IV, la cantidad de proteínas que no se retuvieron en la

Thiol-Sepharose® (calles l y 3), con las retenidas y eluídas con L-cisteína (calles 2 y 4).

Como se observa claramente en esta Figura, la reducción del número de polipéptidos

lograda fue notoria en el pico IV, y también, aunque en menor medida, en el pico I.

140

PicoI Pico IV

2 l st 4 3 st

_ 94—> 67¡‘43

ü 30 _>W 20.1

Figura 49: Gel de poliacrilamida 10 % con SDS, teñido con CBB R-250. Pico I: (l)material unido a la columna, (2) material eluído con 20 mM Císteína. Pico IV: (3)material unido a la columna, (4) material eluído con 20 mM Císteína. St: estándares depeso molecular. Las flechas indican la posición de las enzimas de interés.

Pico I : El material proveniente del eluído de la Thiol-Sepharose® luego de ser

dializado y concentradopor ultrafiltración (Amícon YMS), se aplicó a una columna de

intercambio catiónico Mono S®-FPLC (Pharmacia). La fracción con actividad de císteín­

proteinasa se eluyó con un gradiente linear de ClNa, entre 0.3 y 0.4 M (Figura 50). Este

material fue aplicado por último a una columna de tamiz molecular Superose 12®-FPLC

(Pharrnacia), obteniéndose una fracción protéica constituída por la enzima pura a

homogeneidad (dentro del rango de detección en geles de poliacrilamida con tinción con

CBB y con sales de plata) (Figura 51 y 53). La cistein-proteinasa purificada fue

denominada MCP Il (cisteín-proteinasa de la metamorfosis H, metamorphosis cistein­

proteinase II).

14]

A280nm__ E370/460-«­

20

Volumen (ml)

Figura 50: Cromatografia de intercambio catiónico Mono S® del materialproveniente del eluído de Thiol-Sepharose®, correspondiente al Pico l. El materialdíalizado contra 20 mM acetato de sodio, l mM EDTA, pI-I 5 y concentrado hasta0,5 ml, fue cromatografiado con una velocidad de lml / min. La actividad fueeluída con una gradiente lineal de ClNa O- 0,7 M (0-100%). Para cada fracción sedeterminó actividad de císteín-proteinasa y proteínas totales como absorbancia a280 nm.

¡42

A280nmlVolúmen (ml)

Figura 51: Cromatografia de exclusión molecular Superose 12®. La fracción conactividad proveniente de la columna Mono S® correspondiente al Pico I, seconcentró hasta un volumen de 0,5 ml y se aplicó a la columna. La velocidad deflujo fue 0,5 ml / min. Para cada fracción se determinó actividad y se estimó lasproteínas totales como absorbancia a 280 nm.

Pico IV: el material proveniente del eluído de la Thiol-Sepharosa® luego de ser

dializado y concentrado por ultrafiltración, se aplicó a una columna de intercambio

catiónico Mono S®- FPLC y la fracción con actividad de cisteín-proteinasa, tambien se

eluyó con un gradiente linear de NaCl entre 0,3 y 0,4 M (Figura 52). Esta fracción

contuvo la enzima pura a homogeneidad bajo el criterio de electroforesis en geles de

143

A280nm

Capítulo 5

poliacrilamida-SDS y revelado con CBB y con sales de plata (Figura 53), y se la llamó

MCP I (cisteín-proteinasa I de la metamorfosis, metamorphosis cistein-proteinase I).

Volumen ( ml)

Figura 52: Cromatograña de intercambio catiónico Mono S® del eluído deThiol-sepharose® correspondiente al Pico IV. El material díalizado contra 20 mMacetato de sodio, l mM EDTA, pH S, y concentrado hasta 0.5 ml fuecromatografiado con una velocidad de flujo de l ml / min. La actividad fue eluídacon un gradiente lineal de NaCl, entre O-O,45M (0-100%). Para cada fracción, sedeterminó la actividad de cisteín-proteinasa y se estimó proteínas totales comoabsorbancia a 280 nm.

144

_-.._.

E370l460

Capítulo 5

Ceratitís

Peso molecular relativo:

El peso molecular aparente de las enzimas punficadas fue estimado mediante

geles desnaturalizantesde poliacrilamida 10 % con SDS. Tanto en presencia o ausencia de

B-mercaptoetanol, MCP II presentó un peso molecular aparente de 67.000 Da, mientras

que el de MCP l fue de 32.000 Da (Figura 53). Como ambas proteinasas presentaron la

misma movilidad en condiciones reductoras como no reductoras, concluímos que en

pn'ncipio, en ambos casos, las enzimas serían monoméricas.

MCPII MCPI Stl 2 St l 2 Kda

67

20,1

Figura 53: Peso molecular aparente de las proteinasas MCP I y MCP llpurificadas. Gel de poliacrilamida 10 % con SDS, teñido con CBB. Las muestrasfueron tratadas con (l) o sin B-mercaptoetanol (2). St: estándares empleados.

145

Punto isoelectrico:

El punto isoeléctríco de las enzimas purificadas fue determinado mediante geles

de poliacrilamida, con el sistema PhastGel IEF (Pharmacia), empleando marcadores de pl

entre 3,5 y 9,3. MCP II (67.000 Da) presentó una sóla forma con un pI de 5,85. Por su

parte, y a pesar del comportamiento homogéneo que presentó en SDS-PAGE, en

condiciones reductoras y no reductoras (ver Figura 54), MCP I estaría compuesta por dos

formas principales. Ambas formas fueron identificadas en el rango de pH entre 6,00 y

6,70 (Figura 54).

9.308.658.45

8.15

7.35

6.856.55

pl MCP-IIfi MCP-I pI

Figura 54: Determinación del punto isoeléctrico de MCP II (2) y MCP I (3). Enambos casos, las proteinas estándares se corrieron en la calle (l).

146

pH óptimo

El pH óptimo de proteólisis de MCP II fiJe determinado con el sustrato sintético

fluorogénico Z-Phe-Val-Arg-NHMec, y dió alrededor de pH 5, aunque no varió

significativamente entre 4 y 6 (Figura 55-A). Por otra parte, se determinó que la actividad

de MCP II decayó rapidamente a pH superiores a 6, mientras que a pH inferiores a 4, lo

hizo en forma menos drástica.

Por su parte, el pH óptimo de MCP I fue determinado con Z-Phe-Arg-NHMec, y

dió alrededor de 6 (Figura SS-B). La actividad de MCP I practicamente desapareció a pH

7, mientras que a pHs inferiores a 6, decayó lentamente (a pH 2, retuvo todavia más del

50% de la actividad).

A MCP II

(Z-Phe-Arg-NHMec)

250 ' ' '

200 ' '

E370-460nm

50' '

147

B MCP I

(Z-Phe-VaI-Arg-NHMec)

1 I I l

500 '

400 ‘

200 ‘E370-460nm

oo oo

pH

Figura 55: Determinación del pH óptimo de proteólisís de MCP II (A) y MCP I(B). Fracciones provenientes de MonoS® fueron ensayadas con los sustratos Z­Phe-Val-Arg-NHMec para MCP ll y Z-Phe-Arg-NHMec para MCP I. Los ensayosse realizaron según se detalla en M y M, y las soluciones tampón empleadas fueronFosfato-Citrato para el rango de pH entre 2 y 7 y Tris-HCl entre 8 y lO.

Estabilidad de las enzimas al pH

La estabilidad de las enzimas al pH fue determinada para un sólo tiempo de

incubación (20 min) a temperatura ambiente. Luego de la preincubación de las enzimas

purificadas en las distintas soluciones tampón a diferentes pH, la actividad se midió

empleando los mismo sustratos que para el pH óptimo.

MCP lI presentó un amplió rango de pI-Is (entre pl-I 4-6) donde la estabilidad fue

máxima (Figura 56-A). A su vez, en la Figura se observa que MCP II resultó muy poco

148

Capítulo 5

estable a pH inferiores a 4, ya que perdió rapidamente su actividad. MCP II parece ser

más estable a pH neutro y alcalino, ya que luego de 20 mín. de incubación a pH 8 todavia

retiene el 50 % de la actividad (Figura 56-B).

A diferencia de lo mencionado en el párrafo anterior, MCP I resultó más estable a

pHs ácidos (entre pH 2 y 6). Para MCP I se registró la estabilidad máxima a pH 5 y en el

tiempo ensayado, perdió rapidamente su actividad a panir de pH 6, inactivándose por

completo a pH 7 (figura 56-B).

A MCP II

80 l I I I

70 ' '

50- ­

40- ­

30- d

20- ­

10- ­

E370-460nm

149

B MCPI

600 r n u .

500 ' ­

400 - ­

300 ' 1

200 ' ­E370-460nm

Figura 56: Estabilidad de MCP II (A) y MCP I (B) al pH. Fracciones provenientede sendas Mono S ®(FPLC) fueron preincubadas durante 20 min a 25 °C, adiferentes pHs. Posteriormente, se realizó el ensayo enzimático al pH óptimo paracada enzima, según se detalla en Materiales y Métodos. Las soluciones tampónempleadas fueron 0,1 M fosfato-citrato para el rango de pH entre 2 y 7, y 0,1 MTris-HCl entre 8 y lO.

Evidencias de glicosilación en las enzimas purificadas

Mediante un ensayo de afinidad por cadenas de manosa ("afñnobloting) con

Concanavalina A (Con A), se determinó que MCP II de 67.000 Da sería una glicoproteína

con no menos de una cadena del tipo asparragina, conteniendo alta manosa en su porción

glicosídica (Figura 57). Con respecto a la cisteín-proteinasa de bajo peso molecular, MCP

l, todavia no se pudo llegar a resultados concluyentes sobre si está glicosilada o no, ya

150

Capítulo 5

que no hay una clara unión a Con A. Esto podría indicar que tal vez, MCP I contenga

cadenas cortas de manosa o de tipo o-unidas.

l 2 MCPI St

180.000l 16.000

84.000

48.500

36.500

26.600

Figura 57: Ensayo de "Affinobloting" para determinar si MCP II está glicosiladao no. Electroforesis en poliacrilamida-SDS seguida de unión a Con A y reveladopor unión de ésta con peroxidasa y posterior exposición a sustrato (ver Materialesy Métodos). (l) fitohemoaglutinína, Mr 32.000 (control +), (2) ribonucleasa B, Mr13.200, MCP II proveniente de Mono S (flecha, Mr 67.000), St: estándarespreteñidos, marca Sigma.

lSl

Antisueros contra MCP I y MCP II

El material proveniente del eluído de la columna de Thiol-sepharose® fue

utilizado como antígeno para generar antisueros en conejos. Como se mencionó

anteriormente, debido a que las fracciones eluídas de esta columna no resultaron

suficientemente puras (ver Figura 49), se decidió aumentar el grado de purificación

mediante geles preparativos de poliacn'lamida 10 %. El material sembrado en los geles

fue calentado previamente a 100 9C durante lO min Las bandas identificadas como MCP I

y MCP II en los geles teñidos con Coomasie Brillant Blue (CBB) fueron cortadas,

pulverizadas en Ng-líquido, y el polvo, mezclado con Adyuvante de Freund, e inoculado

en conejos (ver Materiales y Métodos).

Lamentablemente, después de numerosos ensayos y variantes de los mismos, no

ha sido posible obtener hasta la fecha, antisueros satisfactorios contra estas enzimas. En

una primera ronda de intentos, se realizaron inoculaciones en grupos de dos conejos por

cada enzima, con la banda del gel pulverizada en N2 líquido y homogeneizada con

adyuvante completo de Freund. En todos los casos, los conejos murieron antes de cumplir

la primera semana de inoculación. Para evitar reacciones del sistema inmune, que podrian

sumarse a la acción de las propias proteinasas, y dado que la acrilamida estimula por si

misma la respuesta inmune, se decidió realizar otra serie de intentos. En ésta, se

inocularon grupos de conejos, pero sin utilizar al adyuvante de Freund. En este caso, los

conejos resistieron todas las inoculaciones, pero no produjeron anticuerpos contra

ninguna de las enzimas. Se intentaron sin éxito, otras van'antes de antígeno, y se van'aron

los modos de inoculación, sin resultados positivos.

Se sabe que otros investigadores sufrieron problemas similares para obtener

antisueros contra proteinasas, por ejemplo en el caso de la cistein-proteinasa llamada

cruzipaina (proteinasa de T.cruzi) (Campetella, comunicación personal) y de la tripsina en

el mosquito Aedes (legyptí (Noriega, comunicación personal). Según estos investigadores,

la alternativa más recomendada para obtener antisueros de proteinasas cuando ocurren

este tipo de problemas es inocular la proteína digerida parcialmente. Pero, hasta la

escritura de esta Tesis, no se han obtenido resultados con esta estrategia.

Análisis de los extremos N-terminales de MCP-I y MCP-H

El análisis de los extremos amino-terminales de las proteinasas purificadas se

realizó durante la visita de colaboración del autor de esta tesis en el laboratorio del Dr. V.

Turk, del Instituto "Josef Stefan" de la Universidad de Lujblijana, Eslovenia. El análisis

de los péptidos obtenidos según Lenarcic y col (1993) se realizó en un analizador de

secuencias Applied Biosystems 475 (Pharmacia, USA).

En MCP I se logró secuenciar los primeros 12 aminoácidos, aunque en las

posiciones 7 y 9 no se logró determinar con claridad la identidad de los mismos.

La secuencia obtenida fue la siguiente: L P E Q F E - P - Q F

En MCP II se logró secuenciar los primeros lO aminoácidos y en este caso la

secuencia obtenida no presentó indeterminaciones. La secuencia aminoacídica que

presentóMCPIIfue: VNIESDTADQLos extremos amino-tenninales de MCP I y MCP II fueron comparados con

aquellos de otras cisteín-proteinasas de mamíferos e insectos y los resultados se presentan

en el Capitulo 7.

Comparación entre las propiedades de MCP-I de Ceratitis cagitata. Catepsina B de

mamífero v la cisteín proteinasa de 29 kDa de Sarcoghaga

La similitud de las secuencias de los extremos amino terminales obtenidas entre

MCP-I de Ceran'tis con el grupo de las catepsínas del tipo B, se vio reforzada cuando se

compararon diferentes propiedades bioquímicas entre nuestra proteinasa y la Catepsina B

de mamífero (a éste grupo pertenecen las papaínas), y la cisteín proteinasa de 29 kDa de

la mosca Sarcophaga.

Como se observa en la Tabla 9, el peso molecular de MCP-I resultó cercano a los

pesos que generalmente presentan las enzimas de este grupo. La digestión de

hemoglobina y de los sustratos sintéticos, al igual que el pH óptimo para la proteólisis de

153

Capítulo 5

Z-PHe-Arg- MCA, fue similar para las tres enzimas comparadas. Con respecto a la

estabilidad de estas enzimas frente al pH, MCP-I presentó un rango más amplio de

estabilidad que la catepsina B y la proteinasa de 29 KDa, sin embargo, todas son

inestables a pH igual o mayores que 7. Por otro lado, todas son ínhibidas por el inhibidor

específico E-64.

Propiedades Catepsina B MCP-l Cp Sarcophaga

Peso molecular 26 (l, GF) 32 (PAGE) 29

relativo (kDa) 30 (2, GF y (5,GF,PAGE)

PAGE)

26 (3, GF)

Sustratos:

hemoglobina ++++++ (3) ++++++

Z-Phe-Arg- ++++++ (1) +++-+++ ++++++ (5)

Z-Arg-Arg +++ (1 y 4) +++ ++ (5)

pH óptimo 6 (I, SS) 6 (SS) 6 (SS)

Estabilidad al pH 4,7 - 5,5 (4) 2 - 6 5,5 —6.5

Inestable a 7 Inestable a 7 Inestable < 4

(1,4) Inestable a 7

Pl 4 formas entre 2 formas pples ND

pH 4,7-5,5 pH 6,00-6,70

Inhibición Ep - 475, E-64 Ep - 475, E-64 E-64, leupeptina,

antipaína,

quimostatina

Tabla 9: Propiedades bioquímicas de MCP-I, Catepsinas B humana y proteinasade 29 KDa de la mosca Sarcophaga. GF: filtración en geles, PAGE: gel depoliacrilamida, SS: sustrato sintético, ND: no se determinó. Referencis: l:

154

Capítulo 5

Delaíssé, J.M, P. Ledent y G. Vaes (1991), 2: Nishímura, Y., T. Kawabata y K.Kato (1988), 3: Locnikar y col. (1981), 4: Kirshke, H y col. (1981), 5: Kurata, S.,H. Saito y S. Natorí (1992).

CAPÍTUL0 VI

Purificación de la aspartíl-proteinasa identificada durante la

metamorfosis temprana de Ceratitis

En este Capitulo presentamos la purificación hasta homogeneidad de la

proteinasa aspártica identificada en los extractos de pupas de 40 h.

Los aspectos mencionados al comienzo del Capítulo anterior con respecto a la

elección del protocolo de purificación, son válidos e incluían al grupo de las aspartíl­

proteínasas. La actividad de aspartíl-proteinasa durante la purificación fue determinada

empleando el método general de Anson (1939), que utiliza la hemoglobina como

sustrato. Hasta la actualidad, no se dispone de sustratos sintéticos comerciales que sean

específicos de este grupo de enzimas; sólo han sido propuestos algunos (Orlowskí y

col., 1984, Dunn y col., 1984).), pero su uso no se ha generalizado.

En la Figura 58 se presenta el esquema de purificación de la aspartíl proteinasa

de Ceratitis capítata. Las condiciones empleadas para cada cromatografia en columna,

se describen en forma detallada en la sección de Materiales y Métodos.

HOMOGENATO

I

EXTRACCION ACIDA(pH 4.2)

I

PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO(30-70%)

I

SEPHACRYL s—200®

I

PICO III

I

FPLC (Mono S)®I

FPLC (Superose 12)®I

EMAP

Figura 58: Esquema de purificación empleado en la separación de la aspanilproteinasa que estaría involucrada en la degradación de tejidos larvales durante lametamorfosis. Se denominó EMAP, a la Aspartil-proteinasa de la metamorfosistemprana purificada a homogeneidad (Early metamorphosis aspartyl proteinase).

158

Purificación de la proteinasa aspártica de Ceratítís

La homogeneización de las pupas de 40-45 h, la precipitación ácida y la

precipitación por incremento de la fuerza iónica con sulfato de amonio, fueron

realizadas en forma simultánea con las cisteín-proteinasas, según se describió en detalle

en el Capítulo IV.

La fracción que contiene a las dos clases de proteínasas identificadas en el

Capítulo III y que precipitó en el rango de saturación entre 30-70%, fue aplicada a una

columna cromatográfica de exclusión molecular tipo Sephacryl-S 200® (Pharmacia). Al

igual que para las cistein-proteinasas esta columna resultó ser un paso clave, y permitió

aislar la fracción que contenía la aspartil-proteinasa del resto de las actividades

proteolíticas. En la Figura 59 se muestra el diagrama de elución de esta columna donde

se identificaron tres picos con actividad proteolítica sobre hemoglobina a pH 3,5. El

pn'mero (Pico I, fracciones 50-60) y el último (Pico IV, fracciones 80-90), coincidieron

con los picos I y IV descriptos en el Capítulo anterior como las cistein-proteinasas

MCP-II y MCP-I, respectivamente. En ambos casos, la actividad proteolítica sobre

hemoglobina no fue inhibida con pepstatina A (inhibidor específico de aspaníl­

proteínasas), y si lo fue con E-475.

La mayor actividad proteolítica sobre hemoglobina en esta columna se registró

entre las fracciones 67-75. A este pico se lo denominó Pico III, y la actividad

proteolítica fue completamente inhibida por pepstatina A.

El trabajo de purificación se continuó con el pico III, que fue sometido a una

columna de intercambio catiónico Mono S- FPLC® (Pharmacia). Los primeros ensayos

con las fracciones de esta columna fueron realizados con una solución tampón 20 mM

acetato de sodio, l mM EDTA, pH 4,5, y en todos los casos, la fracción eluída presentó

muy baja actividad. Por otra parte, cuando se analizó esta fracción por SDS-PAGE, se

observaron dos polipéptidos mayoritarios que presentaban un peso molecular entre 14 y

28 Kda, respectivamente (ver Figura 63). Estos resultados nos llevaron a concluir que

en éstas condiciones estabamos favoreciendo el proceso de autólisis caracten'stico de las

aspartil-proteinasas. Decidimos entonces cambiar la solución tampón del pico III por

una solución 10 mM MES, lO % etanol, pH 5,8.

159

3.o . 0.4

2.5 ­

-0.3 EE 2.o - co s8 a

< 15 ' -o.2 <

—°_ 1.o - '- 0.1

0.5 ­

0.0 “3 c 3 31733 0o 20 4o 60 80 100 120

Fracción (N°)

Figura 59: Cromatografía de exclusión molecular Sephacryl S-200®.Aproximadamente 15 ml del material dializado proveniente de la precipitacióncon sulfato de amonio fueron aplicados a la columna, equilibrada con unasolución tampón 100 mM acetato de sodio, l mM EDTA, 300 mM NaCl, pH5.0. Se colectaron fracciones de 5 ml cada una, y la velocidad de flujo fué de33.6 ml / h. La actividad proteolítica se determinó con hemoglobina 2% comosustrato.

El empleo de etanol y e] incremento del pH en la solución tampón permitió

detener no sólo el proceso de autólisis, sino también mantener la estabilidad de la

enzima. La muestra sometida a cromatograña de intercambio catiónico Mono S­

FPLC®, fue eluída con un gradiente linear de NaCl 0-0,5 M. La fracción con actividad

de aspartil-proteinasa eluyó entre 0,075 y 0,12 M de NaCl (Figura 60). Esta

concentración de sales coincidió con las requeridas en columnas catiónicas similares,

utilizadas para proteinasas aspárticas en otros organismos como la mosca Aldríchina

lfifl

grahami (Kawuamura y col, 1987) y la levadura Candida parapsilosis (Fusek y col,

1993).

Finalmente, se empleó una columna de tamíz molecular Superose 12- FPLC®

(Phannacia), con la que se obtuvo la enzima pura a homogeneidad (Figura 61). A esta

proteinasa se la denominó EMAP, aspartil-proteinasa de la metamorfosis temprana

(early metamorphosis aspanil-proteinase).

A280nm

o 5 1o 15 20 25 30

Volumen (ml)

Figura 60: Cromatograña de intercambio catiónico Mono S del Pico IIIproveniente de Sephacryl 8-200. El material dialízado contra lO mM MES, 10%etanol, pH 5,8 y concentrado hasta 0.5 ml, fue cromatografiado a l ml/min. Seempleó un gradiente lineal de NaCl 0-0.5 M (0-100%). Para cada fracción sedeterminó la actividad específica, mientras que la estimación de proteínas totalesfueron determinadas por absorbancia a 280 nm.

__.._.

A750nm

161

I I I I I 1

0.16 ' ' 0.8

É ' Éo 0.12 - - 0.6 82 _ N< <

0.08 - ' 0.4‘ Il __.

0.04 - - 0.2

.—.’ "x io Ï'—“ r' —l l ‘nr- ‘01 0

0 5 10 15 20 25 30

Volúmen (ml)

Figura 61: Cromatografia de exclusión molecular Superose 12®. La fraccióncon actividad de aspartil-proteinasa, proveniente de la columna de Mono S®, seconcentró con Centricon 30 (Amicon) hasta un volúmen de 0.5 ml y se aplicó a lacolumna. Las condiciones empleadas en la corrida fueron 0.5 ml/min. Para cadafracción se determinaron actividad y proteínas totales como absorbancia a 280nm.

Características principales de la aspartil proteinasa de Ceratítíscagitata (EMAPIPeso molecular aparente:

El peso molecular de EMAP fue estimado mediante geles de poliacrilamida lO

% en presencia de SDS. Tanto en condiciones reductoras como no reductoras se

observó una sóla banda que correspondería a un sólo polipéptido con un peso molecular

aparente de aproximadamente 41-43 kDa (Figura 62). El peso molecular de la

162

proteinasa aspártica de Ceratitis coincidió con los pesos característicos del grupo de las

Catepsinas D de mamífero, y con las dos únicas proteinasas aspárticas de insecto

conocidas previamente (Cho y col, 1991 y Kawamura y col, 1987).

EMAP St

4... 94,000

4..., 67,00043,000

¿ 30,000

¡su 20,100

14,000“‘53

Figura 62: Determinación del peso molecular aparente de la proteinasa EMAP.Las muestras fueron tratadas con B-mercaptoetanol antes de ser desarrolladas enel gel de poliacrilamida 10% en presencia de SDS. El gel fue teñido con CBB­R250. St: estándares de peso molecular.

Autólisis:El proceso de autólísis es un fenómeno muy extendido entre las distintas clases

de proteinasas conocidas (por ejemplo en tripsina, quimotrípsina, pepsina, papaina,

catepsina B) (Barrett, 1977), y especialmente las aspartil-proteinasas como la catepsina

D (Lah y Turk, 1982). Por esta razón, habitualmente, la purificación de las proteinasas

163

que pertenecen a esta última clase se realiza preferentemente a pHs alcalinos, alejados

del pH óptimo de proteólisis.

En nuestro caso, como el objetivo principal fue aislar en forma simultánea la

mayor cantidad de proteinasas posibles, se trabajó en condiciones de pH ácido donde

habíamos registrado la mayor actividad y estabilidad de la enzimas. Por lo tanto,

sabíamos que en estas condicones se favorecería el proceso de autólisis de EMAP.

En la figura 63, se muestra un gel de poliacrilamida 10%, donde se analizó el

eluído de una columna de intercambio catiónico Mono S (FPLC), desarrollada en una

solución tampón 0.02 M Acetato de Sodio, 0.001 mM EDTA, pH 4,5. En la misma se

observa solamente una banda mayoritaria de aproximadamente 14-16 KDa, que

coincidió, en cuanto a su peso molecular con el producto final observado por Lah y

Turk (1982) durante el proceso de autólisis de la Catepsina D de bazo bovino. Aunque

en la figura no se observa, en este gel se reconoció de manera completamente

minoritan'a al polipeptidode 40-43 KDa que corresponde a la proteinasa entera. Aún

cuando el proceso de autólisis estaba muy avanzado y la banda de 14-16 KDa fiJera

mayoritaria, se logró registrar actividad sobre hemoglobina.

En Ceratitis, encontramos que el empleo de etanol 10% (v/v), y el incremento de

pH hasta 5,8 en la solución tampón permitió detener el proceso de autoproteólisis.

Como consecuencia de esto, se decidió emplear este solvente en las distintas soluciones

tampón que se utilizaron a partir del tamiz molecular Sephacryl 8-200.

Figura 63: SDS-PAGE 10 % donde se muestra el proceso de autólisis que sufrela Aspartil-proteinasa de Ceratitz's. El material eluído de una columna Mono S®,desarrollada a pH 4,5 sin etanol 10%, se sembró en el gel. La flecha negra, indicael fragmento de autólisis mayoritario. St: estándares de peso molecular.

Punto isoeléctrico:

El análisis del punto isoeléctrico fue determinado mediante geles de

poliacrilamida, utilizando el sistema Phast System [EF de Pharmacia. Se emplearon

marcadores de pl entre pH 3,5 y 9,3. La proteinasa aspártica de la mosca del

Mediterráneo mostró multiples formas con pIs entre 5,35 y 7,35. Identificamos sies

formas principales, cuyos pIs fueron 5,60, 5,90, 6,20; 6,35; 6,55; 7,35, respectivamente

(Figura 64). En este aspecto, se encontraron diferencias con respecto a otros insectos en

cuanto al número de formas de la enzima y los pIs de las mismas. Mientras en Ceratitis

se reconocen estas 4 formas, en la mosca Aldrichina grahami se reconocen 2 formas a

pH 5.4 y 6.2 (Kawamura y col; 1987) y en el mosquito Aedes aegypti una sóla a pl-l 5.4

(Cho y col, 1991).

165

pl

9,308,658,458,15

7,35

6,856,55

5,85

Figura 64: Determinación del punto isoeléctrico de la proteinasa aspárticaEMAP: st: proteinas estandares. La flecha indica la isoforrna de 5,60 y la barranegra indica las multiples formas observadas entre 7,35 y 5,85.

pH óptimo

El pH óptimo de EMAP se determinó empleando hemoglobina como sustrato y

la máxima actividad obtenida fue alrededor de 3,0. El pH óptimo registrado coincidió

con el de la mayoria de las proteinasas pertenecientes a esta familia, tanto de

vertebrados como de invertebrados (figura 65). La actividad de EMAP decayó en forma

pronunciada a partir de pHs superiores a 3,5 , siendo indetectable a partir de pH 5,5.

166

Ñr I I I0.30 - ­

0.25 - .

É 0.20 - ­8rs 0.15 ' '

“ lo.1o ­

0.05 - ­

0.o ' L — á =o 2 4 6 e 1o

Figura 65: Curva de pH óptimo de EMAP purificada. La fracción con actividadde Asp-p proveniente de Superose 12® fue ensayada con hemoglobina 2%. Losensayos se realizaron según se detalla en Materiales y Métodos. Las solucionestampón empleadas fueron Fosfato-citrato para el rango de pH entre 2 y 7 y Tris­HCl entre 8 y lO.

Estabilidad al pH

El estudio de la estabilidad de EMAP frente a soluciones tampón con distintos

pH fue realizado para un sólo tiempo de incubación (20 min.) a 23 9C. EMAP presentó

una estabilidad restringida a pH 5,0 y, tanto a pHs superiores, como inferiores a éste, la

enzima perdió su estabilidad en forma rápida y constante (Figura 66).

La actividad de EMAP disminuyó más de un 60 % tanto a pH 4,0 como a pH

6,0, y desapareció totalmente a partir de pH 3.0, luego de 20 min.de incubación. A su

vez, la actividad de EMAP a pH 7,0 fue un 80 % inferior que a pH 5,0 (Figura 66).

La inestabilidad de EMAP a pH superiores a 5,0 fue la primera diferencia

significativa con las proteinasas de mamíferos. Por otra parte, los resultados obtenidos

167

fueron similares a los registrados por Kawamura y col en la mosca Aldrichína (1987) y

por Cho y col (1991) en el mosquito Aedes aegypti, y, esta importante inestabilidad a

pH neutros y alcalinos pareciera ilustrar una caracteristica que diferenciar-ia las

proteinasas aspánicas de insectos de las de mamíferos (ver Discusión).

Por otra parte, estos resultados realzan la capacidad estabilizadora del etanol,

que permitió, no sólo completar la purificación, sino tambien realizar la caracterización

parcial de la enzima.

2.5 r '

2.0 - .

g 1.5 - ­o2< 1.0 ' "

0.05 " .

; v l l 1O 2 4 6 8 10

pH

Figura 66: Curva de estabilidad al pl-l de EMAP. La fracción con actividad deAsp-p proveniente de Superose 12® fue ensayada con hemoglobina 2%. Losensayos se realizaron preincubando EMAP a un pH dado durante 20 min a 25°C, luego de lo cual se realizó el ensayo enzimático en el pl-I óptimo. Lassoluciones tampón empleadas fueron Fosfato-citrato para el rango de pH entre 2y 7 y Tris-HC] emtre 8 y lO.

¡68

Evidencia de glicosilación :

Empleando una fracción relativamente impura (por razones de disponibilidad de

material) se determinó que la proteinasa aspánica se unió a una columna de

Concanavalina A- Sepharose® y se eluyó con 0.3 M a-metilglucopiranósido (Figura

67-A). Esta fracción, además de capacidad para degradar la hemoglobina y de inhíbírse

completamente con pepstatina A, presentó en un gel de poliacrilamida 10 % con SDS,

un peso molecular de alrededor de 40.000 (Figura 67-B). Esta banda coincidió con el

peso molecular aparente de la proteinasa aspártica purificada. Al igual que las

proteinasas aspánicas ya conocidas en otros dípteros (Kawamura y col, 1987 y Cho y

col, 1991) y en mamíferos (Barret, 1977), esta enzima sería una glicoproteína cuyo

árbol glicosidico contiene principalmente residuos de alta manosa.

A 0.4 rr G8

0.3 < 0.6E EC Co OC0 lnN 0.2 - 0.4 N< <

_._ _O_0.1 l - 0.2

0 I I l l I I l o0 2 4 6 8 10 12 14 16

Fracción (N°)

KDa

-116

- 80,6- 64,4

\44.6

Figura 67: (A) Cromatografia de afinidad Con A - Sepharose®. El extractocrudo fraccionado con sulfato de amonio (30-70%) y dializado, file aplicado a lacolumna previamente equilibrada con la solución tampón 0,1 M acetato de sodio,pH 4,0, l mM CaClz, l mM MnClz y 1 M NaCl. La actividad fue eluída con 0,3M a-metil glucopiranósido (flecha). En (B) se muestra SDS-PAGE donde sesembró la fracciones 8 y 9 con actividad. La flecha vacia indica la localización deEMAP.

Empleo de la columna de afinidad Pepstatina A- agarosa:

La resina de afinidad, pepstatina A-agarosa es una de las más empleadas en la

purificación de aspartil-proteinasas en mamíferos. En éstas, el acople de la muestra a la

resina generalmente se realiza a pH 3,5, mientras que la elución se lleva a cabo a pH

8,6. Cuando probamos esta resina para aislar la proteínasa aspártica de Ceratitis y

eluímos a pH 8,6, la actividad fue indetectable.(Figura 68-A).

Realizamos entonces dos modificaciones al protocolo: (l) se intentó eluír la

proteínasa a pH 5,7 (pH mucho más benigno para la enzima), pero como se observa en

la Figura 68-B prácticamente no se despegó proteina de la columna y (2) cuando cada

fracción eluída a pH 8,6 fue dializada inmediatamente contra una solución tampón a pH

4, se logró registrar actividad de aspartil-proteinasa (nunca debe permitirse que las

fracciones pasen más de 15 min a pH 8,6 ya que se inactivan completamente). Es decir,

EMAP, al ser tan inestable a pH superiores a 5, pierde rápida e irreversiblemente su

actividad a pH 8,6.

Estos resultados corroboraron la baja estabilidad de la enzima EMAP a pHs

superiores a 5,0, registrados en los análisis de estabilidad al pH (Figura 66) y permite

explicar la causa por la cual no se puede emplear esta resina de afinidad en nuestro

sistema. Lpor lo tanto, la resina pepstatina agarosa empleada corrientemente en

mamíferos no serviría para insectos como se demuestra en esta Tesis y en Cho y col.

(1991).

170

5 . . . . . . 0.3

' 0.25

E - 0.2 EC C

° 83 ' 0.15 p< <

-—<— PH 3.6 - 0.1 —o—

' 0.05

e“ - ‘ : * O15 20 25 30 35

Fracción N°

B

5 I I I I

4

É ' - 0.2 Éo 3 ' oQ lnN rs< <

2 .a - 01+

1 n

0 —-‘=1- 00 5 10 15 20 25

Fracción (N°)

Figura 68: Cromatografia de afinidad Pepstatína-agarosa (3 cm x 8 cm). Veinteml de extracto 30-70% de sulfato de amonio de pupas de 40-45 h centrifugado a12000 x g fueron aplicados a la columna, equilibrada en 0,1 M acetato de sodio,

171

l M NaCl, l mM EDTA, pH 3,5. La elución se realizó con 0,1 M acetato desodio, l M NaCl, l mM EDTA, pH 5,0 o 5,7 y 0,1 M Tris-I-ICl, l M Na Cl , lmM EDTA, pH 8,6 (A). En (B), cada fracción fue dializada inmediatamente.Cada fracción fue de 5 ml.

Comparación entre las propiedades bioguímicas de EMAP, y otras

proteínasas aspártícas

La Tabla 10 muestra claramente que EMAP presenta características comunes

con otras aspatil proteínasas purificadas. Específicamente presenta peso molecular

aparente, pH óptimo, inhibidores y sustratos similar a las catepsina D de mamíferos.

También EMAP presenta una gran heterogeneidad de formas, característica que

comparte con las Catepsinas D. En este aspecto, el isoelectroenfoque resolvió 6 formas

con distintos pl, 5,6; 5,9; 6,2, 6,35, 6,55; 7,35.

EMAP es una glicoproteína al igual que todas las aspaníl proteínasas descriptas.

Solomente en la Catepsína D de Bazo se analizó la composición de la cadena de

azúcares, y se encontró que esta compuesta por manosas, glucosamina, galactosamina,

glucosa, y fucosa (Yamamoto y col, 1979).

EMAP es la tercera aspanil proteinasa purificada en insectos y comparte la

mayon'a de las caracten’sticas analizadas en la Tabla 10 con las proteínasas de

Aldrichina (Kawamura y col, 1987) y mosquito (Cho y col, 1991). Además, EMAP

comparte una característica con las aspartíl proteínasas de insectos que las hace

diferenciar de las catepsinas D de mamíferos, y es la importante inestabilidad frente al

pl-I. Como se observa en la figura 65, EMAP es muy inestable a pHs por encima de 5 y a

panir de pH 6,5 es completamente indetectable.

172

Capítulo 6

Propiedades Catepsina D EMAP Ap Aldríchina LAP mosquitoPeso molecular 44 (la.GF) 40-43 41 (2,8DS-PAGE) 80 (3, PAGE)

aparente (Kda) 45 (lb. GF) 40 (3,SDS-PAGE)

Sustratos hemoglobina hemoglobina hemoglobina hemoglobina

pHóiLfimo 3,5 y 3,8 (la) 3 3,5 3

Estabilidad Estable a pH >6 5 5.5 (2, en 10° NDal pH muy inestable etanol)

a pH inf. o sup Inestable a 6,55

pl pH 4,2-4,9-6,l- 4 formas, 2 formas, l forma, pH 5,46,4 (la) o pH pH 5,6-5,9-6,9 pH 5,4 y6,25,1-5,4-5,7 (lb) 6,35-6,55-7,35

licoproteína Si Si SÍ si

inhibidores Pepstatina-A Pepstatina-A Pepstatina-A Pepstatina-AUrea EPNP, DAN 6 M Urea

ND: no se determinó, GF: filtración en geles, PAGE: gel de poliacrilamida

Tabla 10: Propiedades bioquímicas de EMAP, y Catepsina D de mamíferos,apartíl-proteinasa de Aldrichina y de mosquito. la: Yamamoto y col (1979), lb:Barret (1970) 2: Kawamura y col (1987), 3: Cho y col (1991),

Detección de la actividad de aspartíl-proteinasa en geles de

poliacrilamida nativosPara la determinar la actividad de EMAP durante la metamorfosis de Ceratitis

capitan: se empleó la técnica de geles de poliacrilamida discontinuos, no disociantes.

incubados luego de la electroforesis, con hemoglobina 2 % (Hames, 1987). En éste tipo

de geles, el pH del gel concentrador, del separador y la solución tampón de corn'da son

de 6.8; 4.3 y 4,5, respectivamente. Luego de la electroforésis, se incubó al gel con

hemoglobina desnaturalizada a pH 3,5, permitiendo que ésta se adhiera y penetra muy

levemente el gel. Cuando se incuba el gel en las condiciones adecuadas de reacción, (pH

4,4 y 37 9C) la proteinasa digiere la hemoglobina, liberandola. Finalmente, se tiñe el gel

con CBB-RZSO observándose que éste adquiere una coloración azul donde la

hemoglobina no fue degradada y un fondo claro donde fue degradada.

Con esta técnica, se identificó una sola banda que digin'ó la hemoglobina en

muestras de 45 h (Figura 69-A). Para determinar a que familia de proteinasa

correspondía la misma, se emplearon inhibidores especificos. Estos fiieron empleados

de dos formas con igual resultado; (l) preincubando 20 min a 4 °C al inhibidor con la

muestra de 45 h antes de correr el gel o (2) luego de desarrollado el gel, incubando el

mismo con el inhibidor durante 60 min.

En la Figura 69- B se muestra que la banda detectada en este tipo de geles de

actividad corresponde a la aspartíl-proteinasa, EMAP, ya que se inhibe unicamente con

pepstatina A (inhibidor específico aspartíl-proteinasas). Las condiciones empleadas en

este tipo de geles no permitieron detectar la actividad de las císteín-proteinasas,

especialmente MCP-II que digiere satisfactoriamente la hemoglobina.

Los cambios en la actividad de EMAP durante la metamorfosis de la mosca del

mediterráneo se muestran en la Figura 70. La actividad de ésta proteinasa no se detectó

en la larva de salto (-8 h) y comenzó a detectarse recién a partir de la inmobilización

definitiva de la larva (0 h) (Figura 70-B). Por densitometn’a se determinó que la

actividad de EMAP aumenta en forma contínua durante todo el estadio pre-pupal,

alcanzado el máximo de actividad durante la transición de pre-pupa a pupa que ocurre a

las 40 h. A partir de este último horario y hasta el final del estadio pupal, la actividad se

mantuvo en estos niveles (Figura 71). Si se realiza una incubación de sólo 5 min, se

detecta actividad sólo durante el estadio pupal, es decir, a partir de las 45 h hasta las 144

h (Figura 70-A).

174

A pupas 45 h

Figura 69: (A) Detección de la actividad de EMAP en geles de poliacn'lamidade 10%, no disociantes, discontinuos. Las muestras ensayadas corresponden apupas de 45 h. (B) Efecto de inhibidores de proteínasas sobre la actividad EMAP.En todos los casos se preincubó el extracto enzimático con el inhibidor durante20 min a 4 °C antes de ser sembrado en el gel. C, extracto total de pupas de 45 h;l, PMSF l mM; 2 EDTA SmM; 3, 1,10 fenantrolina 2 mM; 4, E-64 lO uM;5,Pepstatina A lO uM; 6 propano] (solvente en que se preparó al PMSF); 7metano] (solvente en que se preparó la Pepstatina A) 8, E-64 lO uM+ Pepstatina10 pM.

-8 0 6 18 24 45 72 98 120 144 horas

-8 0 6 18 24 45 72 98 120 144 horas

Figura 70: Determinación de la actividad de la proteinasa aspártica, EMAP,durante la metamorfosis, mediante geles discontínuos, no disociantes depoliacnlamida. Los geles fueron desarrollados a pH 4,3 e incubadosinmediatamente con hemoglobina 2 % (pH 3,5). A: 5 min de incubación a 37°C,B: 60 min de incubación a 37 °C.

Podemos postular entonces, que si bien se registró actividad de EMAP durante

toda la metamorfosis; el estadio de pre-pupa sen'a la etapa de activación de esta enzima,

mientras que el estadio pupal sería la etapa ejecutora de máxima actividad. La actividad

de EMAP durante la metamorfosis coincidió estrechamente con la curva de actividad

proteolítica general, presentada previamente en el Capítulo III, Figura 40. En la Figura

71 se presenta una cuantificación por densitometría de un gel con 60 min de incubación.

3500 . . . .larva pre-pupa pupa adulto‘

, III . faradq2800 - ­

tuAo cn . O

33 9E 3;. 2100 - .

É É ,'o 8 1400 - ­8 8 0 .'s .12 Z

25 700 / .o ' z. I L l l-25 15 55 95 135 175

horas

Figura 71: Cuantíficación por densitometría de la actividad de EMAP durantelametamorfosis en geles que fueron incubados a 45 C durante 60 min. La

actividad enzimatica se expresó como unidades relativas y la curva se ajustó a

una polinomial de grado 3.

CAPÍTUL0 VII

Capitulo 7

Análisis de las secuencias codificantes de los genes de las

proteinasas descriptas en esta Tesis y búsqueda de activadores

de proceso de muerte celular en C. capítata

En este Capítulo se resumen los diferentes esfuerzos realizados para tratar de

identificar tanto a nivel de genoma como de ARN, la secuencia de los genes

correspondientes a las nuevas proteinasas descn’ptas en esta Tesis. Asi mismo se

muestran los intentos de encontrar en la mosca del Mediterráneo genes activadores de

muene celular, similares a los descriptos en Drosophila melanogaster.

Comparación de las secuencias N-terminal de MCP I y MCP II de C.

capítata con otras de vertebrados e invertebrados

El análisis de los extremos amino-terminales de las proteinasas purificadas se

realizó durante la visita de colaboración del autor de esta Tesis al laboratorio del Dr. V.

Turk, del Instituto “Josef Stefan” de la Universidad de Lujblijana, Eslovenia (ver

Capítulo V).

La comparación de la secuencia de MCP-I obtenida, con otras cisteín proteinasas,

mostró claramente que esta proteinasa pertenece al grupo de las papainas de plantas y de

las catepsinas B de mamíferos. MCP-l presentó alta similitud con la catepsina B de

hígado de rata (66.7%) y también con la proteinasa de 29 KDa de la mosca

Sarcophaga peregrina (50%) (Tabla ll). Se sabe que esta última juega un rol

fundamental en la remodelación del cuerpo graso durante la metamorfosis de este díptero

(ver Discusión).

l78

Capítulo 7

Proteinasas Secuencia de aminoácidos del NH 2-terminal

MC P-I L P E Q F E - P - Q F

catepsina B L P E S F I) A R E Q W

OMEGA L P E N V l) W R K K G

papaína I P E Y V l) W R Q K G

catepsina H Y P S S M I) W R K K G

catepsina L I P K T V l) W R E K G

catepsina S L P D S M l) W R E K G

Sarcophaga prot V P E - F D A R K - ­

Bombyx prot. X P E Q V l) D R K H G

catepsina Museu A P K Y V l) Y S Q N G

ICE A D K V L K E K R K L

Cp K V I L L F V L A V F

Dicryostelíum

Tabla ll: Alineación de la secuencia amino-terminal de MCP-I con otras cisteínproteinasas (catepsinas, B, H, L, S; papaína; omega-papaína; proteinasa deSarcophaga; proteinasa de Bombyx; catepsina de Musca; ICE; proteinasa deDictyostelium).prot: proteinasa, Cp; císteín-proteinasa.

La comparación realizada con MCP-II demostró que esta cisteín-proteinasa no

presenta similitud con ninguna de las cisteín-proteinasas conocidas hasta el momento de

escribir esta Tesis (Tabla 12) (ver Discusión). Unicamente, en los diez primeros

aminoácidos, MCP II presentó al ácido apártico en la posición 6, característico de las

cisteín-proteinasas del Clan CA y dentro de éste, de la Familia Cl a la cual pertenecen la

Catepsina B, la proteinasa de 29 KDa de mosquito, la papaína, las catepsinas H, K, L, O

y S, y MCP I de Ceratitis.

Proteinasas Secuencia de aminoácidos del NH z-terminal

MC P-ll V N l E S D T D Q ­

MCP I L P E Q F li - P - Q F

catepsina B L P E S F l) A R E Q W

OMEGA L P E N V l) W R K K G

papaína I P E Y V l) W R Q K G

catepsina H Y P S S M l) W R K K G

catepsina L I P K T V l) W R E K G

Sarcophaga prot V P E - F D A R K - ­

Bomhyx prot. X P E Q V l) D R K H G

catepsina Musa: A P K Y V l) Y S Q N G

ICE A D K V L K E K R K L

Cp.DicIyostelium K V l L L F V L A V F

Tabla 12: Alineación de la secuencia amino-terminal de MCP-II con otras cisteínproteinasas (catepsinas, B, H, L, S; papaína; omega-papaína; proteinasa deSarcophaga; proteinasa de Bombyx; catepsina de Musca; ICE; proteinasa deDystiostelium).

Intentos de clonado del ADNc de MCP I y MCP II de la mosca del Mediterráneo

Los intentos por lograr amplificar los ARNm de MCP I y MCP II utilizando la

técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron infructuosos. Al conocer

las secuencias amino terminales de ambas proteinasas, diseñamos cebadores específicos

de esta región. Por otra parte, dada la similitud de MCP l con la Catepsina B, diseñamos

un cebador del sitio catalítico y también empleamos el oligo dT¡2 N (a,g,c),G.

Capítulo 7

En esta serie de experimentos los productos de PCR amplíficados fueron siempre

clonados y secuenciados y en todos los casos se trató de fragmentos inespecíficos

(secuencias que no tienen relación con ningún gen de proteinasas).

Comparación de la secuencia N-terminal de EMAP de C. capitata con

otras de vertebrados e invertebrados

El análisis del extremo terminal de EMAP también se realizó en colaboración con

el grupo del Dr V. Turk. Hemos logrado conocer la secuencia de los primeros seis

aminoácidos a pesar de las dificultades que tuvimos para obtener la enzima pura en

cantidades adecuadas para realizar este tipo de ensayos,

En la Tabla 13 se muestra la comparación del extremo amino terminal de EMAP

con otras proteinasas aspárticas de insectos y mamíferos. EMAP no mostró homología ni

con las catepsinas D de mamíferos, ni con la proteinasa aspártica de mosquito (única

proteinasa aspártica secuenciada en insectos). Con estas proteinasas, EMAP coincidió

unicamente en la presencia del aminoácido prolina en la posición dos (Tabla 13). Los seis

aminoácidos de EMAP secuenciados, solamente mostraron cierta similitud con los

iniciales de mucorpepsina. La poca cantidad de aminoácidos secuenciados en la primera

nos hace ser cautelosos en cuanto a las conclusiones de esta homología.

Mucorpepsina es una proteinasas que pertenece a la. familia Al del grupo de las

proteinasas aspánicas. Todos los miembros de este grupo son endopeptidasas de

eucariotes y en su gran mayoría activas a pl-l ácido. Este grupo incluye enzimas del tracto

digestivo (pepsina y quimosima), enzimas lisosomales (Catepsina D) y enzimas

involucradas en el procesamiento postranscripcional (renina), etc

l8l

Proteinasas Secuencia de aminoácidos del NH 2-terminal

1-:M AP (‘w-unnzs- 1 P N r M (; - - - ­

Asp-p Mosquito G P V P E P L S N Y

catepsina D G P I P E V L K N Yporcinacatepsina D G P I P E V L K N Yhumana

mucorpepsina l P V S I (i T P G Q

catepsina E Q G S L H R V P L Hhumana

Tabla 13: Alineación de la secuencia amino terminal de EMAP con otrasproteinasas aspárticas y la única proteinasa aspártica de insecto secuenciada.

Clonado del ADNc de EMAP de la mosca del Mediterráneo

Empleamos la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con

cebadores específicos como estrategia para el clonado del ADNc de EMAP. Los

iniciadores se diseñaron en base a la secuencia obtenida del extremo amino-terminal

(iniciador l), del primer dominio catalítico conservado de las proteinasas aspárticas del

tipo de la Catepsina D (iniciador 2) y también se empleó el oligo dle N (a,g,c),G

(iniciador 3). En el diseño de los iniciadores l y 2 se tuvieron en cuenta los codones más

comúnes encontrados en Drosophíla (Ashbumer, 1989).

En la preaparación de los ARN mensajeros se emplearon moscas de distintos

horarios (desde larva de salto hasta pupas de 98 h), asi como también moscas de 18 a 24

h. En la Figura 72-A se muestra un gel de agarosa l,6 % donde se observan los productos

de PCR con los iniciadores l y 3. Se reconocieron varios fragmentos que presentaron los

siguientes tamaños relativos: 1,8; 0,8; 0,35 Kb, respectivamente. Debido a la gran

cantidad de material aplicado en el gel, los fragmentos de 0,8 y 0.35 fueron purificados y

IR?

Capitulo 7

sembrados nuevamente en un ge] de agarosa 1,6 % encontrando que la banda de 0,8 kb

resultó de 1,1, kb; mientras que la otra conservó su tamaño relativo (Figura 72-B).

A B

M .....Cc ......

M ....Cc2 Kb 1,8 0,35

Kb

2,07 -­

2.07 -­1,5 -­

0.6 -­

Figura 72: Gel de agarosa 1,6 % donde se muestan los productos de PCR con losiniciadores l y 3. (A) para la reacción de la polímerasa se empleó ADNc de pre­pupas de 18 a 24 h. (B) debido a la gran cantidad de material aplicado en el gel,los productos Cc 0,8 y Cc 0,35 fueron cortados, purificados y sembrados en otrogel de igual tamaño de poro. M: marcadores de tamaño del ADN.

Capítulo 7

Ambos productos de PCR (1,1 y 0,35 kb) fueron clonadas en vector T (Promega.

USA) y luego secuenciados. Al analizar la secuencia correspondiente al fragmento de

0,35 Kb, no presentó homología con ninguna aspartil-proteinasa, ni tampoco con otras

proteinasas conocidas, por lo que se deduce que este fragmento clonado no pertenece al

gen buscado sino que quizás se debe a una amplificación inespecífica.

El fragmento de l,l kb que presentó un tamaño aproximado al que debería tener

el ARMm de EMAP fue imposible de secuenciar en forma automática utilizando el

secuenciador Alf Express II (Amersham-Pharmacia, USA). Unicamente se logró

secuenciarlo parcialmente de manera no automática empleando [aJSS] dATP en la

reacción de PCR, utilizando el kit comercial CircumVent thermal cycle dideoxy DNA

sequencing (New England Biolabs). Mediante esta técnica manual, se logró determinar

una secuencia parcial de 127 nucleótidos, que se presenta a continuación:

5’agctagtagtctagcgaggacgtgacgatgcgacgatcgctgcatcgacagcgtagcgtcatgcatgcgtgatgagtcgtgagctatgcacgcatgcgcgcatgccgagtcgaaacagcgcgtgtca

Homología entre ARNm de EMAP de Ceran'tís y otras proteinasas aspárticas

La secuencia nucleotídica del ARNm de EMAP presentó similitud con las de

varias aspartil-proteinasas de diversos orígenes. La mayor homología se encontró con la

proteinasa aspártica de arroz (60 %) y la catepsina D (59 %). En la Tabla 14 se muestra la

homologia que presentó la secuencia nucleotídica de EMAP con otras proteinasas

aspánícas.

184

Capítulo 7

ProteinasasProteínasa

humana Earroz Proteínasa

D

Proteínasa

Tabla 14: Homología entre el ARNm de EMAP y otras proteinasas.

La similitud encontrada en el fragmento de l,l kb con las proteinasas aspárticas

de mamífero y mosquito hicieron que redobláramos los intentos de obtener la secuencia

completa, mediante el empleo tanto de secuenciación manual como automática. No

obstante, todos los intentos resultaron infructuosos. Se modificaron las técnicas de

purificación del plásmído, se modificó el protocolo de secuenciación para emplear a los

iniciadores específicos, se adicionaron compuestos desnaturalizantes como

dimetilsulfóxido. detergentes y se aumentó la temperatura de reacción. También se clonó

nuevamente el fragmento de l,l Kb obtenido por PCR en Vector T. A pesar de todas

estas modificaciones en ninguno de los casos se logró obtener resultados positivos.

Los intentos por lograr amplificar el ARNm de EMAP fueron también

infructuosos aún cuando se emplearon ARN mensajeros totales de distintos horarios o

cuando se empleó ADN genómico. En esta serie de experimentos los productos de PCR

amplificados fueron siempre clonados y secuenciados. En todos los casos se trató de

fragmentos que no tenían relación con ningún gen de proteinasas.

185

Activadores de la muerte celular en Ceratitis

Uno de los tópicos más interesantes relacionado con la regulación de la muerte

celular era la detección de secuencias desencadenantes de este tipo de fenómeno. Como

complemento a la línea central de esta Tesis, tratamos -como se verá, sin éxito- de aislar

algún activador de C. capitata.

Jiang y col. (1997), en el único trabajo publicado hasta la actualidad, lograron

detectar los activadores de la MCP, reaper y hid, en tejidos larvales de Drosophila que

sufren histolisis durante la metamorfosis. Estos autores encontraron que reaper y hid

inducirían la degradación del intestino medio y las glándulas salivales durante la

metamorfosis. En ambos tejidos la MC responde al pulso de ecdisona al final del tercer

estadío larval, y según estos autores, estimula la transcripción de reaper y hid en una

etapa que precede a los primeros signos de histolisis. Por otra parte, estas moléculas

activarian a las caspasas. que probablemente serían las ejecutoras del proceso de muerte

en estos tejidos. Conociendo las secuencias nucleotidicas de reaper y híd de Drosophíla,

y de acuerdo a la importante correlación de eventos fisiológicos y bioquímicos obtenida

entre ésta y Ceratitis, decidimos determinar si estos activadores de MCP están presentes

yjuegan un rol similar en la mosca del Mediterráneo.

El ARNm del gen que codifica reaper presenta un tamaño de 854 nucleótidos de

los cuales 197 se traducen dando la proteina madura. Diseñamos entonces tres cebadores

específicos y tres con secuencias degeneradas de 25 nucleótidos cada uno (1-25; 50-75 y

170-197), que amplificarían solamente el fragmento que codifica la proteína madura de

65 aa.

La puesta a punto de las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa

se realizó con ADN genómico y ADNc de embrión de Drosophila melanogaster. En la

Figura 73- A se muestra el gel de agarosa (2%) donde se puede apreciar que la reacción

de PCR con los cebadores 1-25 y 170-197 produjo un único fragmento con un tamaño

ligeramente menor a 200 pb. En la Figura 73-B podemos observar que utilizando los

cebadores 50-75 y l70-l97, obtuvimos un fragmento de aproximadamente 150 pb. Es

decir, ambos juegos de cebadores amplíficaron en la reacción de PCR productos con los

tamaños esperados en reaper.

186

Capítulo 7

Para corroborar que estos productos de PCR fueran realmente reaper, se aisló el

fragmento de 200 pb y se lo clonó en vector T (Promega). La secuencia del inserto de 200

pb clonado presentó 97 % de homología con la secuencia publicada por White y col

(1994) en Drosophila.

M ........Dm .......NI ..Dm... l-l97 -50-l97—

Kb

2,07 -­1,50 -- 0,60 —

0,30 —‘ 1;0.60 —- ‘ , ,

' 4- 150pb0,30 -- '0,20-- Ü m <— 200pb

Figura 73: Amplificación por PCR de reaper empleando ADN genómico deembrión de Drosophila y los cebadores 1-25 y 170-197 (A) y (B) con loscebadores antes mencionados en la primer calle, mientras que en las restantes seemplearon los cebadores 50-75 y 150-197. Gel de agarosa (2%) teñido conbromuro de etidio. Las flechas indican los fragmentos de 200 y 150 Kb.

187

Capítulo 7

Utilizando ADN genómico o ADNC extraído de C. capítata, no logramos

amplificar ningún fragmento por PCR, aún cuando se probaron numerosas condiciones,

que se enumeran a continuación:

-empleando cebadores específicos se realizaron ensayos a diferentes temperaturas

de unión del cebador al templado (68 9C, temperatura óptima empleada por nosotros para

obtener reaper de Drosophila, 58 ó 50 9C), con diferentes concrentraciones de magnesio

(2. 2,5 y 3,5 mM), de cebador ( 0,25 o 0,3 pM) o templado.

-empleando cebadores degenerados, variando las condiciones como se menciona

en el punto anterior.

-empleando ADNc o ADN genómico

-empleando ADNc extraído de moscas de diferentes horarios (-8, 0, 5, 12, 24 h)

En la Figura 74 se muestra un gel de agarosa con los resultados de la

amplificación por PCR de ADNc de Ceratitis de diferentes horarios y con distintos

iniciadores. Como se observa en la Figura, no se logró amplificar ningún fragmento. Las

bandas que se observan debajo del marcador de 0,1 kb, corresponden a los inciadores

empleados. Esta banda aparece aún cuando se realiza la PCR sin templado.

M ......Cc 1-197....... Cc 50-197....-6 0 51224 -6 0 51224

3::.N.._.0.t...a...M.

Figura 74: Gel de agarosa 2 % donde se muestra el resultado de la reacción dePCR utilizando ADNc de Ceratitís (Cc) de diferentes horarios y empleando loscebadores 1-25 y l70-l97 y con 50-75 y 170-197.

188

Capítulo 7

También realizamos ensayos de híbridización con la sonda radioactiva específica

del ARNm de reaper de Drosophila (“Northem blot”). La única señal de híbridización

que se observó fue con ARNm total de embrión de Drosophila, pero no se detectó

ninguna señal en los distintos horarios que analizamos en la mosca del Mediterráneo (-20,

-6, O, 5, 12, 205-0,24, 42, 48 h). Tampoco se obtuvo señal cuando se probaron otras

temperaturas de híbridización para lograr condiciones de mayor laxitud.

Cuando analizamos el activador hid de Drosophila, tampoco obtuvimos

resultados positivos en la mosca del Mediterráneo.

Los resultados de la búsqueda utilizando las técnicas mencionadas hasta aquí,

indicar-¡an que no se encuentran presentes en la mosca del Mediterráneo activadores

similares a reaper y hid. Como consecuencia de la acumulación de resultados negativos,

y no siendo ésta la linea central de la Tesis, se decidió discontinuar el esfuerzo para

avanzar en paralelo en las otras líneas.

DISCUSIÓN y

CONCLUSIÜNES GENRALES

Discusión

Se han estudiado en detalle, por primera vez, los eventos moleculares más

importantes responsables de la histolisís de tejidos larvales durante la transición larva­

adulto de dípteros. Se han descripto, por primera vez en los insectos, proteinasas

lisosomales específicas de la histolisís y se ha correlacionado su actividad con la de otras

enzimas degradativas y con las imágenes de cambios anatómicos degenerativos en

músculos y cuerpo graso.

El fenómeno de histolisís de los tejidos larvales fue enmarcado y correlacionado

con otros programas fundamentales de la transformación larva-adulto. Nuestros estudios

han expandido otros preliminares realizados por nuestro laboratorio y permitido definir a

Ceratítis capítata como un modelo experimental muy completo para el estudio de la

metamorfosis en sus diversos aspectos.

Presentamos a continuación la discusión de los principales resultados obtenidos en

esta Tesis;

l- Estudios histológicos del cuerpo graso en Ccagitata

Hemos descripto por primera vez en dípteros, la secuencia temporal de eventos

que llevan a la destrucción del cuerpo graso larval durante la metamorfosis.

A pesar de que el cuerpo graso es un tejido relativamente simple, compuesto por un

solo tipo celular, no existía previamente a esta Tesis ningún trabajo donde se describieran

los cambios tisulares durante la metamorfosis de las moscas ni mariposas. En la última

revisión publicada sobre cuerpo graso, Haunerland y Shirk (1995) mencionaron

especialmente que los cambios dramáticos en morfología y organización tisular que sufre

el cuerpo graso durante la metamorfosis hacen de este tejido un modelo muy dificil de

estudiar tanto a nivel bioquímico como ultraestructural.

La casi totalidad de los estudios histológicos existentes en dípteros sobre la

degradación del cuerpo graso, se desarrollaron en adultos recién emergidos (Butterworth

190

Discusión y Conclusiones generales

y LaTendresse, 1973; Rizki, 1978, Bothe y Galler, 1996, Quin y col, 1997), donde una

fracción del cuerpo graso larval remanente permanece por dos o tres días luego de la

emergencia.

Los estudios histológicos realizados con cuerpo graso de Ceratítís capitata permiten

establecer las suguientes conclusiones:

a) El comienzo de la disociación de la estructura en forma de red característica del

cuerpo graso larval de las moscas, ocurre a las 202 h. Esta es la primera evidencia

visible de hístolisis que hemos podido registrar por microscopía óptica. Posteriormente,

las células flotan libremente en la hemolinfa

Kurata, Natori y colaboradores, describieron en la mosca Sarcophaga peregrina,

el mecanismo molecular que produce la disociación del cuerpo graso larval (Kurata y

col., 1989, l99la-b, l992a-b). Estos autores demostraron que dos proteínas sintetizadas

por los hemocitos pupales son las responsables de este evento. Al inico de la

metamorfosis, los hemocitos expresan en su superficie una proteína de 200 KDa que

reconoce a la membrana basal de las células del cuerpo graso. Luego de unirse a estas

células, los hemocitos secretan una cisteín-proteinasa de 29 KDa (perteneciente a la

familia de las Catepsinas tipo B) que digíere esta membrana, y produce finalmente la

liberación de las células. Estos autores no realizaron ni ningún análisis de los cambios

ultraestructurales ni bioquímicos de las etapas posteriores a la disociación del cuerpo

graso larval en Sarcophaga peregrina.

En coincidencia con Natori y colaboradores, en la mosca del Mediterráneo hemos

detectado la presencia de hemocitos durante el proceso de disociación (203 h).

Durante este proceso los hemocitos se encontraron cercanos o unidos al cuerpo

graso larval y su número fue mayor que al inicio de la metamorfosis (0 h). (Capítulo

I, Figura 18).

Por otra parte, durante esta Tesis se aisló una cistein-proteinasa, que

llamamos MCP] que presentó características similares con la proteinasa de 29 KDa

de Sarcophaga (se discute más abajo). Si bien no hemos realizado aún experimentos in

vitro para confirmar si MCPI cumple una función similar, hemos podido determinar

mediante ensayos con inhibidores específicos, que la actividad de la misma en Cerati'tr's,

es importante en extractos de prepupa, etapa en que ocurre la disociación de este tejido.

l9l

Discusión y Conclusiones generales

Comparando los ciclos de vida de S.peregrina y Ccapítata encontramos que la

disociación del cuerpo graso en estas moscas ocurre en distintos momentos del

desarrollo dentro del pupario. Mientras que en la primera, este evento ocurre alrededor

del 18,3 % del tiempo de desarrollo, en C.capítata deterrninamos que sucede alrededor

del 6,5 % del tiempo.

b) La degradación del cuerpo graso en Ceratitis es un proceso gradual. Luego de la

disociación de la estructura en forma de red, a partir de las 22 h registramos en un

número pequeño de células la pérdida de la estructura nuclear y la cromatina parece

quedar flotando entre las vesículas de grasa. En este mismo grupo de células, las

vesículas de grasa redujeron su tamaño y los bordes se presentaron más difusos. A partir

de las 48 h estos cambios se generalizaron a una importante proporción de las células

(Capítulo l, Figura 20 y 21). Posiblemente, la inducción para la muerte celular no llegue

en forma homogénea a todas las células, ni al mismo tiempo.

c) La histolisis del cuerpo graso en Ceratítis no es total. La desintegracion celular se

observó en forma masiva a partir de las 72 h. Sin embargo, hacia el final del estadio

pupal (120 o 144 h) todavia observamos una cantidad importante de células intactas de

cuerpo graso, que flotan entre los restos de éste tejido y los sarcolitos musculares.

En Drosophila se determinó que al final del estadío pupal, el 60 % de las células

del cuerpo graso sufrieron muerte celular y que el 40 % restante desaparece

completamente dentro de las 48-72 h posteriores a la emergencia del adulto (Bate, 1993)

siendo reemplazado completamente por el cuerpo graso del adulto (Haunerland y Shirk,

1995). Muy probablemente, en la mosca del Mediterráneo, un porcentaje similar de

células larvales alcance el estadio adulto y desaparezca completamente en los días

posteriores a la emergencia.

192

Discusión v Conclusiones generales

d) Los cambios morfológicos observados durante la histolisis del cuerpo graso no

presentaron características de tipo apoptótico.

La muerte celular programada de tipo apoptótico se caracteriza por una serie

estereotipada de cambios morfológicos. Durante el proceso de histolisis del cuerpo graso

larval en la mosca del Mediterráneo no hemos observado esta secuencia de cambios.

Unicamente, en las etapas tempranas del proceso de muerte celular del cuerpo

graso larval hemos registrado cambios en el núcleo que coincidieron con los que se

observan durante de la muerte celular por apoptosis. Estos cambios consistieron en que la

cromatina se observó aún más condensada que en la larva III y totalmente marginada

contra la membrana nuclear, en que el nucleolo desaparece y en que la estructura nuclear

se desintegra por completo.

En el cuerpo graso de la mosca del Mediterráneo no observamos ningúna de las

alteraciones morfológicas que caracterizan las etapas finales del proceso de muerte por

apoptosis. No hemos observado, disminución del volumen celular, ni las características

prominencias producidas por la membrana plasmática, ni los cuerpos apoptóticos

cerrados que se desprenden de las células.

e) Nuestros resultados fortalecen la hipótesis de que, en los dípteros, el cuerpo graso

del adulto es un tejido nuevo y el larval se histoliza completamente. En base a

estudios realizados en los Ordenes Diptera y Lepidoptera, Haunerland y Shirk (1995) han

propuesto dos mecanismos principales para explicar los cambios observados en el cuerpo

graso durante la metamorfosis:

(i) El primero de estos, implica un proceso que lleva a la completa destrucción del cuerpo

graso larval y la sintesis simultánea del cuerpo graso del adulto a partir de histoblastos no

diferenciados.

(ii) En el segundo mecanismo no se produce destrucción, sino que se trata de un proceso

de remodelación. Este proceso implica:

-la disociación de las células del cuerpo graso larval que pasan a flotar libremente

en la hemolinfa,

-en éstas células se produce la destrucción de ciertas estructuras “larvales” y su

reemplazo por otras del adulto y

193

Discusión v Conclusiones generales

- posteriormente, se produce la reasociación para formar el cuerpo graso del

adulto.

El primer mecanismo propuesto estuvo basado principalmente en los estudios

realizados con adultos de Drosophila melanogaster (Butterworth y LaTendresse, 1973;

Rizki, 1978, Bate, 1993) y Sarcophaga bullata (Bothe y Galler, 1996). Nuestros

resultados que muestran la destrucción de una proporción importante del cuerpo gaso

larval, aportan evidencias al primero de los procesos. El segundo mecanismo propuesto es

característico de las mariposas, la mayoría de los estudios indican que el cuerpo graso no

es eliminado, sino que éste se disocia y se reasocia posteriormente para formar el tejido

adulto (Dean, Locke y Collins, 1985; Wang y Haunerland,l992 y Walker, 1996). En el

Orden Coleoptera, en dos trabajos donde se estudió la degradación del cuerpo graso larval

peri fén'co durante la metamorfosis no determinaron si la histolisis es total o no.

2- Estudios histológicos de los músculos en C.cagítata

Hemos confirmado y ampliado datos preexistentes sobre la degradación de

músculos en dípteros, correlacionándolos por primera vez con otros eventos de

la metamorfosis

Los estudios histológicos realizados con músculos esqueléticos de Ceratitis

capitata penniten establecer las suguientes conclusiones:

a) Durante la apolisis larval-pupal (ZOE h), acompañando la separación de la

epidermis del pupario, hemos observado que los músculos esqueléticos se separan de

sus respectivos apodemas (Capítulo I, Figura 23-A, ZOLQh y B).

b) En Ceratítis capitata encontramos que la fragmentación de los músculos

esqueléticos larvales del tórax y abdomen está defasada en el tiempo, ocurriendo en

dos momentos distintos del desarrollo dentro del pupario. En los músculos de la

región torácica, correspondientes a los segmentos anteriores l a 4, la fragmentación

194

Discusión y Conclusiones generales

ocurre en el estadio prepupal, a partir de las 22 h luego de la inmovilización definitiva del

pupario. Por su parte, en los segmentos abdominales la fragmentación se registra recién a

partir de las 72 h, durante el estadio pupal.

La explicación para esta diferencia tan importante en el tiempo de histolisis de los

músculos larvales debe estar directamente relacionada con la eversión de la cabeza y los

apéndices torácicos de la pupa. La evaginación de las estructuras pupales a partir de los

discos imaginales se produce en tres etapas y, como veremos, algunas de estas requieren

de un importante trabajo muscular (Denliger y Zdárek, 1994):

(i) primero, los discos imaginales se evaginan y la pupa adquiere el aspecto y la forma

general del adulto. Presumiblemente, en este paso no actúan fuerzas musculares.

(ii) posteriormente, los discos evaginados son inflados con hemolinfa. Este proceso es

producido por contracciones peristálticas de la musculatura abdominal que generan una

presión hemocélica relativamente baja.

(iii) finalmente, las estructuras infladas se expanden hasta adquirir la forma final que

presentan en la pupa. Este último paso es acompañado por un período prolongado de

actividad de los músculos abdominales.

En trabajos previos habíamos determinado que la eversión de la cabeza y los

apéndices torácicos en la mosca del Mediterráneo se produce 46-48 h después de la

inmovilización definitiva de la larva (Rabossi y col, 1992). Esta pupa, llamada

“fanerocefálica” presenta la cabeza con aspecto trilobular (los ojos son pequeños,

redondeados y saltones, el rostro es puntiagudo) y las alas y patas son cortas (alcanzan el

primer segmento abdominal) (Figura 13, 48 h). La forma definitiva de la cabeza y los

miembros se alcanza a partir de las 66 h y a las 72 h la pupa alcanza las proporciones

definitivas del cuerpo (Figura 13, 72 h y Rabossi y col, 1992).

Por lo tanto, en C. capitata, desde que la pupa criptocefálica (sin cabeza) de 42 h

comienza a contraer ritmicamente la región abdominal hasta que completa

totalmente el inflado y expansión de los apéndices torácicos a las 66 h, existe un

importante trabajo de cierto grupo de músculos abdominales. La extensión de este

proceso explica claramente por qué la fragmentación masiva de los músculos

195

Discusión y Conclusiones generales

abdominales se comienza a registrar recién a partir de las 72 h y se extiende hasta

las 120 h.

c) Finalmente, a partir de las 120 h, practicamente la totalidad de los músculos

esqueléticos se encuentran fragmentados en ambas partes del cuerpo. En ambas regiones

del cuerpo, la forma en que se fragmentaron los músculos resultó ser la misma. Los

sarcolitos musculares permanecen en la periferia del cuerpo y entre éstos

observamos numerosos hemocitos (Capitulo 1, Figura 25, 22 y 120 h).

d) La degradación de los músculos larvales en la mosca del Mediterráneo presentó

características morfológicas similares a las descriptas previamente por Robertson (1936)

en Drosophíla. La secuencia de cambios fue la siguiente: aparición de protuberancias

del fascículo muscular - separación de fibrillas en el interior del músculo ­

fragmentación y formación de sarcolitos. Por lo tanto, nuestros resultados indicarían un

proceso similar para todos los dípteros. Estas características morfológicas también

coincidieron con las descn'ptas por Lockshin y Williams (1965) durante la histolisis de

los músculos intersegmentales de mariposa.

En la Figura 75 se muestra el esquema de la evolución temporal de los cambios

morfológicos observados en el cuerpo graso y los músculos esqueléticos larvales durante

la metamorfosis de la mosca del Mediterráneo. Resultó muy llamativo para nosotros el

hecho de que en ambos tejidos, luego de iniciarse el proceso de desintegración o

fragmentación celular, sus restos toman una posición periférica cercana a la epidermis

pupal. Los hemocitos que al final del estadio pupal se encuentran en gran cantidad,

presentan la misma ubicación en el cuerpo. Es la primera vez que se realiza una

observación de este tipo.

En conclusión, los estudios realizados durante esta Tesis nos ha permitido conocer

la secuencia de cambios que ocurren a nivel tisular en los músculos y cuerpo graso. Sobre

esta base se podrán realizar estudios histológicos en ambos tejidos que nos permitan

focalizar estos cambios en forma más detallada (por microscopía electrónica) a n_iv¿l

celular. Por otra parte, se podrán realizar estudios histológicos que permitan la

caracterización de los hemocitos en esta mosca. Creemos que el empleo de métodos de

196

Cuerpograso Hemocitos MúsculosC-T MúsculosA.

2240

-=c --_-----­Nv-t

°ImQN

¡n _______--­v-t

Ó

G‘7‘

disociación

delaestructuraenformadered

desintegración

delnúcleo

estructuraen

enformadered

aparicióndegránulos

protéicos

membrana

plasmática

irreconocible

—>

fragmentación

celular

muybajagrancantidad

4

alrededorde

lossarcolitos

cantidad

asociaciónalas célulasdelCg

fragmentación-sarcolitos

fragmentación_'>

sarcolitos

protuberanciassuaves delfascículomúsc.

núcleoslobulados yagrandados

separaciónde

lasfibrillasmúsc.

núcleosovales yachatados

Figura75:Secuenciatemporaldeeventosdelahistolisisdelcuerpograsoylosmúsculoslarvalesdurantela metamofosisdelamoscadelMediterráneo.Cgindicacuerpograso.MúsculosC-Tindicamúsculosdecabezay tórax.MuscúlosAindicamúsculosabdominales.Laflechaindicacontinuidadtemporaldeleventoquelaprecede.La líncaconelnuntonegroindicaincrementoenelnúmero.

Discusión v Conclusiones generales

tinción enzimáticos permitirán discriminar las dos clases principales de hemocitos que se

conocen en insectos, los granulocitos y plasmatocitos. En este sentido, el empleo de

métodos de detección de actividad esterasa y fosfatasa ácida, que permiten identificar

lisosomas, nos ayudará a identificar los granulocitos que son los principales hemocitos

con actividad fagocítica.

3-Estudio de un momento clave en la histolisis de los teiidos larvales:

203°h luego de la inmovilización definitiva de la larva:

El análisis histológico realizado en Ceratiris permitió reconocer a la prepupa de

20H h como un momento clave de la metamorfosis, en el que comienzan a

reconocerse los primeros signos del proceso de histolisis tanto en el cuerpo

graso como en los músculos larvales. Los estudios realizados durante esta Tesis

corroboraron que en las prepupas de ZOE h, la epidermis larval está

completamente separada de la cutícula larval transformada en pupario.

Este horario coincidió con el final del proceso de apolisis larval-pupal por el cual

la epidermis larval se separa del pupario dejando un espacio, llamado ecdisial que permite

la posterior deposición de la nueva cutícula pupal.

Durante la apólisis aparece una burbuja de aire en el abdómen (Mitchell y

Mitchell, 1964), que hace que las pre-pupas floten cuando son sumergidas en el agua.

Aprovechando esta particularidad habíamos determinado el momento final de apolisis

larval-pupal en Celulitis alrededor de las 20m h (Rabossi y col 1991). Posteriormente,

esta burbuja aumenta paulatinamente hasta alcanzar su mayor tamaño durante la

evaginación de la cabeza. para luego desaparecer rapidamente. Los estudios histológicos

durante esta Tesis corroboraron que en las prepupas de 203-0h, la epidermis larval está

completamente separada de la cutícula larva] transformada en pupario.

l98

Discusión y Conclusiones generales

4-Cambios metabólicos durante la metamorfosis.

Luego de la inmovilización definitiva de la larva, la metamorfosis de los dípteros

se caracteriza por una importante disminución del metabolismo que está relacionada con

el hecho de que las moscas no se alimentan durante la transformación larva-adulto.

El metabolismo representado por el consumo de 02, producción de C02 o

producción de calor está representado por una curva con forma de U, es alto

inmediatamente despues de la inmobilización definitiva de la larva, cae a un mínimo

durante los estadios que transcurren dentro del pupario y aumenta antes de la emergencia

del adulto (Agrell y Lundquist, 1974). Este tipo de curva fue registrada en varios Dípteros

(Callíphora, Luci/ía y Drosophila), asi como tambien en otros ordenes de insectos

holometábolos (Coleoptera, Lepidoptera e Himenoptera). Por lo tanto parece un perfil de

consumo general para todos los insectos holometábolos.

En los insectos holometábolos, durante el último estadio larva] se produce la

acumulación de reservas que serán utilizadas posteriormente durante la metamorfosis.

Hemos determinado por primera vez y en detalle en que contexto metabólico

ocurre la transformación larva-adulto y en especial, como se relaciona con el

proceso de histolisis en la mosca del Mediterráneo. El estudio de las variaciones en

el contenido de glucógeno estuvo directamente relacionado con el cuerpo graso y los

músculos, ya que ambos acumulan practicamente la totalidad de ésta molécula en los

insectos, mientras que el cuerpo graso es el principal reservorio de lípidos y proteínas

en las moscas. Los principales resultados en esta sección se discuten a continuación:

a) Cambios en el peso durante la metamorfosis

En Ceraríu'scapitata, hemos registrado que el peso húmedo disminuyó durante

todo el estadio de pre-pupa, alcanzando durante la transición de pre-pupa a

pupa (40 h) una reducción del 22 %. A partir del estadio pupal y hasta la

emergencia del ¡mago no se registró una variación importante en el peso

húmedo de los insectos (sólo 6 %), siendo la pérdida total del mismo en toda la

metamorfosis, del 28 %. Por su parte, el peso seco varió muy poco (10 %)

durante todad la metamorfosis.

199

Discusión y Conclusiones generales

Estos resultados nos indican que la reducción del peso húmedo de los individuos

registrada durante la etapa inicial de la metamorfosis se debe a una simple pérdida de

agua (y C02). La reducción del peso húmedo, durante los primeros días luego de la

pupan'ación también fue observada en Calliphora (Agrell, 1974) y en Drosophila

(Needham, 1929 y Dobzhansky y Poulson, 1935).

En nuestro laboratorio se demostró que la deshidratación del pupario en esta etapa

del desarrollo es una de las causas del descenso del peso húmedo, que representa una

pérdida de aproximadamente el 5 % del peso total del insecto (Wappner y Quesada-Allué,

1996). Hasta la fecha no hemos determinado las causas que ocasionan la pérdida del l7 %

restante pero, posiblemente, la degradación de proteínas larvales, al igual que otras

reacciones catabólicas prodrían ser, en parte, las responsables de la producción del resto

del agua que es eliminada por el insecto.

b) Pérdida de agua y apolisis

Denliger y Zdarek (1994) postularon que la burbuja de gas que aparece durante la

apolisis larval-pupal, compensar-ía la pérdida de agua durante el estadio prepupal,

manteniendo un volúmen constante dentro del pupario endurecido y por otro lado, crearía

presión en el sistema hidráulico que ayudaría en la evaginación de la cabeza y los

miembros.

Nuestros resultados demostraron que la apolisis larval-pupal en la mosca del

Mediterráneo coincidió temporalmente con la etapa de disminución del peso

húmedo durante el estadio pre-pupal, reforzando la hipótesis de que la

burbuja de gas compensaría la pérdida de agua, manteniendo la constancia

de volúmen del sistema.

200

Discusión y Conclusiones generales

c) Cambios en los niveles de las moléculas de reserva

(i) Trehalosa

La trehalosa, principal azucar circulante en hemolinfa, que abastece de

glucosa a todos los tejidos del cuerpo, se consumió en forma practicamente

total durante el salto y la dispersión de la larva.

Durante el salto, la actividad de la enzima trehalasa fue máxima, proveyendo

glucosa, y por ende, energía para el movimiento. Posteriormente, se produjo una

disminución crecana a las 7 veces en esta actividad al comienzo del estadio pre-pupal,

manteniendose en estos niveles hasta el final del estadio pupal.

(ii) Glucógeno

El contenido de glucógeno Iarval acumulado durante la larva III disminuyó

en forma muy importante durante la etapa de salto y dispersión de la larva

(86 %). Por lo tanto, el glucógeno larval participa en una proporción muy

baja (14 %) como fuente de energía en los estadios que transcurren dentro

del pupario.

En Ccapitata, para nuestra sorpresa, el 86 % del glucógeno fue consumido

durante la etapa del salto, dispersión e inmovilización de la larva. Esta abrupta

disminución debe estar relacionada con que el salto es un movimiento de mucha violencia

que requiere de gran cantidad de energía para poder lleverse a cabo. Como consecuencia,

el glucógeno larval participa en una proporción muy baja (14 %) como fuente de energia

en los estadios que transcurren dentro del pupario, y practicamente deja de ser detectado

durante la primera mitad del estadio de pre-pupa.

El análisis histológico de preparados de cuerpo graso y músculos Iarvales,

principales tejidos de reserva de glucógeno en insectos, una vez teñidos por PAS,

201

Discusión y Conclusiones generales

corroboraron los resultados recién mencionados, mostrando que el glucógeno está

agotado en estos tejidos larvales (40 h).

A pesar de la poca información comparada que existe entre diferentes especies de

dípteros, resulta interesante observar como varía el contenido de glugógeno en este etapa

del desarrollo en otra familia de moscas (Calliphora), cuyas larvas se dispersan de una

manera completamente distinta, para hacernos un idea del enorme gasto de energía que

representa el salto en Ceratitis capitata. Chippendale (1978) demostró que Lucilla

cuprina consume durante el proceso de dispersión y pupariación de la larva III solamente

el 20 % del glucógeno acumulado durante la etapa larval. Esta mosca, cuyas larvas se

desarrollan en las heridas de ovinos, abandonan el cuerpo del animal por medio de

movimientos de alargamiento y acortamiento del cuerpo y se dejan caer al suelo en busca

de un sustrato adecuado donde se entierran para pupariar. Es decir, la actividad de

dispersión en esta mosca es menor, ya que aprovechan la movilidad del animal y sólo

gastan energía para abandonar el cuerpo del mismo y para enterrarse.

En Ceratitis hemos observado que a partir de la 20” h comienza una etapa de

síntesis de novo del glucógeno que se mantiene hasta el final del estadio pupal.

Este resultado nos permite postular que, posiblemente, esta síntesis de novo se

produzca en los nuevos tejidos correspondientes al adulto, ya que como observamos en

los preparados de pupas de 40 h teñidos por PAS, el cuerpo graso y los músculos larvales

dieron tinción negativa (Capitulo I, Figura 19 y 24). El otro tejido que acumula glucógeno

es el intestino larval (aunque en una proporción mucho menor), pero por nuestro esquema

de correlación de eventos, en estos horarios se encuentra en una etapa avanzada de

histolisis. Esta etapa de resíntesis podn'a estar implicada en la acumulación de glucógeno

que posteriormente sen'a empleado para la síntesis de quitina, que se deposita formando la

cutícula correspondiente al adulto farado.

202

(iii) Lípidos

En Ceratitis, hemos determinado que el contenido de lípidos comienza a

decrecer a partir del estadio pupal (48-64 h). Es decir, la utilización de los

lípidos en Ceratítís se produciría varias horas después de haberse

consumido por completo el glucógeno larval. Este descenso en el contenido

de los lípidos coincidió temporalmente con la disminución en el número y

tamaño de las vesículas de lípidos que comienza a ser observada en el

cuerpo graso a partir de las 48 h

Agrell y Lundquíst (1974) observaron en otras moscas (especialmente aquellas

pertenecientes a la familia Calliphora) que los lípidos se consumen desde el inicio de la

metamorfosis. En la mosca del Mediterráneo encontramos que el contenido de lípidos

recién diminuye a panir de las 48-64 h. Una pocas horas más tarde (72 h) observamos

que parte del cuerpo graso comienza a fragmentarse y este proceso se hace todavia más

evidente a las 120 h, coincidiendo estos horarios con la etapa de descenso pronunciado

en el contenido de lípidos totales (Capítulo I, Figura 21)

(iv) Correlación entre el contenido de lípidos y el de glucógeno

Las variaciones en el contenido de las dos principales macromoléculas de

reserva (glucógeno y lípidos) parecerían demostrar que los cambios

registrados en éstas durante la metamorfosis temprana de Ceratitis sepnrnntarían finamente balanceadnc.

Durante los estadios de pre-pupa y pupa, hemos observado que cuando se

consume alguna de éstas moléculas de reserva, en la otra se produce acumulación:

203

Discusión v Conclusiones generales

(i) desde el “Tiempo cero”(0 h) hasta las 201Qh se consumió el glucógeno

remanente acumulado en la larva III, llegando a niveles casi indetectables entre las 15 y

ZOEh. En este mismo período registramos acumulación de lípidos

(ii) entre las 20” y las 40 h se produce síntesis de novo de glucógeno, mientras

que el contenido de lípidos no sufre cambios significativos.

(iii) desde las 40 h hasta el final del estadio pupal, se consumió principalmente

lípidos, mientras continúa la acumulación de glucógeno.

(v) Proteínas

Durante los estadios de pre-pupa y pupa registramos una reducción

importante en el contenido de proteínas que alcanzó el 40 % al final del

estadio pupal.

El contenido de proteínas enteras disminuyó en forma sostenida desde la

inmovilización definitiva de la larva hasta las 72 h, cubriendo de esta manera la etapa

entre las ZOE y 40 h cuando los lípidos no parecen consumirse y se inicia la resíntesis

del glucógeno. Luego de una pequeño incremento, continuó con esta tendecia a partir

de las 100 h hasta el final del estadio pupal. La reducción en el contenido de proteínas

al final del estadio pupal fue del 40 %. Si bien, varios autores (Agrell y Lundquist, 1974

y Locke, 1985) han sugerido que las proteínas son degradadas principalmente para

proveer aminoácidos para la construcción de las proteínas del adulto, también aceptan

que una proporción de estos aminoácidos podría ser utilizada para la generación de

energía. En este último caso, según nuestros resultados este aporte energético podria

ocurrir en cualquier momento de la metamorfosis ya que el contenido de proteínas

disminuye desde el inicio de la misma.

En general todas las moscas ciclorráfas sintetizan proteínas de reserva durante el

último estadio larval (Haunerland y Shirk, 1995). Estas proteínas serán la fuente de

reserva de aminoácidos para la construcción de las proteínas del adulto. Se ha

demostrado que la síntesis de estas proteínas ocurre en el cuerpo graso de los segmentos

204

Discusión v Conclusiones generales

anteriores y que, posteriormente, cerca del inicio de la metamorfosis son secretadas a la

hemolinfa y el cuerpo graso de la región posterior las secuestra, almacenandolas en los

gránulos protéicos. Hemos determinado que a partir de la inmovilización definitiva

de la larva (0 h), comienzan a reconocerse gránulos proteicos en el cuerpo graso.

Estos incrementan su número y tamaño desde las 15-203-0h y pasan, de tener una

posición periférica a las 48 h, a estar distribuidos por toda la célula a las 72 h. Este

cambio de posición en la célula ocurre simultáneamente con la reducción del tamaño y

número de las vacuolas de grasa. Si bien se requiere de estudios más detallados,

posiblemente con proteínas marcadoras de éstos gránulos, observamos que,

aparentemente, cuando la célula de cuerpo graso se disgrega, los gránulos proteicos

mantienen su estructura y permanecen flotando en la hemolinfa.

5- Equivalencia de horarios entre Ceratitis y Drosoghila

Hemos demostrado la validez del esquema de correlación de eventos durante la

metamorfosis entre Ceratitis capitata y Drosophila melanogaster. Esta es una

herramienta de enorme utilidad que nos permite disponer del conocimiento de

Drosophíla, la mosca más estudiada desde el punto de vista genético y

molecular.

Como ya mencionamos en el Capítulo II, pudimos demostrar la sorpresiva y

notoria equivalencia relativa de horarios de ciclo de vida entre Ceratítis capitata y

Drosophila melanogaster en cuanto a la ocurrencia de eventos fisiológicos y

bioquímicos. Esto nos permitió en principio, plantear una extrapolación a Ceratitís del

tiempo de degradación de diferentes órganos y tejidos larvales estudiados en Drosophíla.

Nuestros estudios histológicos demostraron que la equivalencia de horarios

fue muy estrecha entre ambas moscas en cuanto a los tiempos de degradación de los

músculos larvales.

En Ceratitis, nuestros resultados revelaron que la fragmentación de los músculos

esqueléticos correspondientes a los primeros cuatro segmentos anteriores ocurre a partir

205

Discusión y Conclusiones generales

del 7 % del tiempo acumulado del desarrollo dentro del pupario, cuando por inferencia

habíamos calculado que ocurriría entre el 4 y 12 % del tiempo acumulado. Por su parte,

en los segmentos abdominales, la fragmentación se registró recién a partir del 23 % del

tiempo acumulado, cuando habíamos calculado que debería ocurrir durante todo el

estadio pupal (entre 12.5- 43.7 % del tiempo). Finalmente, a partir de las 120 h (38,5 %

del tiempo acumulado), practicamente la totalidad de los músculos esqueléticos se

encuentran fragmentados en ambas partes del cuerpo. Por lo tanto, la degradación de

los músculos esqueléticos torácicos y abdominales larvales de C. capitata ocurrió

dentro de los tiempos pre-establecidos en nuestro cuadro de equivalencias.

Los resultados alcanzados ratificaron tambien que, en forma global, la histolisis

de los principales tejidos larvales en Ccapítata se extendería desde la inmovilización

definitiva de la larva (O h) hasta el final del estadio pupal (144 h). El esquema de

correlación de eventos resultó una herramienta de enorme utilidad para este estudio

puntual, y podn'a extenderse a otras problemáticas, ya que nos permite disponer de]

conocimiento disponible durante esta etapa del desarrollo en la mosca más estudiada

desde el punto de vista genético y molecular.

6-Actividad lisosomal durante la metamorfosis de Ccagitata

Mediante el empleo de enzimas marcadoras demostramos que las enzimas

lisosomales están activas durante la metamorfosis y que esta actividad fue

máxima durante el proceso de pupación (formación de la pupa), que en la

mosca del Mediterráneo se extiende desde las ZOEhasta las 72 h.

Los primeros análisis bioquímicos del proceso de histolisis de tejidos larvales de

dípteros involucraron a los lisosomas como ejecutores finales de la MC (en Musca

domestica, l-Iegdekar y Smallman, 1967; Hennkson y Clever, 1972; Smith y Birt, 1972;

en Stomoxvs calcitrans, Deloach y Mayer, 1979). Recientemente, Jiang y col. (1997)

206

Discusión y Conclusiones generales

presentaron a las caspasas, proteinasas citosólicas, como probables ejecutoras finales del

proceso de muerte en glándula salival e intestino de Drosophila.

Hemos determinado la actividad lisosomal durante la metamorfosis de Ceratitis a

través del estudio de enzimas marcadoras clásicas (con rol similar tanto en vertebrados

como en invertebrados), fosfatasa ácida, B-glucosidasa y B-galactosidasa. Mientras que

ambas hidrolasas ácidas presentaron máxima actividad a las 2039 h, la fosfatasa ácida

alcanzó su máximo a las 40 h. En forma global, la actividad lisosomal fue máxima

durante el proceso de pupación (formación de la pupa), que en la mosca del Mediterráneo

se extiende desde las 203-0hasta las 72 h. En este período se producen los cambios

histológicos más importantes en el cuerpo graso y músculos larvales.

7- Actividad de endopeptidasas ácidas de tigo lisosomal

En Ceratitis capitata, la máxima actividad de las enzimas proteolíticas se

registró durante el proceso de la pupación y su perfil se correlacionó

estrechamente con el descenso en el contenido de proteínas. Hemos

determinado que la actividad proteolítica general esta compuesta en un 96

°/opor dos clases de proteinasas, la primera y de mayor importancia fue del

tipo aspartil-proteinasa y la segunda del tipo cisteín-proteinasa

La inactivación de las enzimas digestivas larvales registrada en las larvas que

saltan (-8 h) nos permitió postular que las actividades proteolíticas que detectamos

durante los estadios que transcurren dentro del pupario son especificas de eventos

particulares que se producen durante la metamorfosis. Principalmente, durante esta etapa

del ciclo de vida, se conocen dos procesos en los que las actividades degradatívas estarían

involucradas; estos son:

(i) la apólisis larval-pupal, donde diversas proteínas son secretadas por la

epidermis con el fluido ecdisial, entre las que se destacan las quitinasas, hidrolasas y

proteinasas. Estas enzimas sen'an las responsables de la degradación de las capas más

internas de la vieja cutícula larva]. El material asi obtenido es reutilizado por las células

207

Discusión y Conclusiones generales

epidérmicas en la síntesis de la nueva cutícula pupal. Brookhart and Kramer (1990)

detectaron más de diez proteinasas diferentes en el fluido de la muda de la mariposa

Manduca sexta. En general, la mayoría de éstas, presentaron características de serin­

proteinasas con pH óptimo alcalino. Las mismas se expresan en períodos cortos de

tiempo que coinciden con la apolisis larval-pupal y pupal-adulto, cuando se separa la

epidermis de las cutículas correspondientes.

(b) en el proceso de histolisis de tejidos larvales. El estudio de este grupo de

proteinasas fue uno de los objetivos principales de esta Tesis.

Para concentrar nuestros estudios en las proteinasas involucradas en la histolisis

de tejidos larvales, decidimos emplear un método general pero de gran sensibilidad, que

utiliza la proteína hemoglobina desnaturalizada a pH ácido como sustrato. Las

condiciones de reacción empleadas (pH 3,5) en este método nos permitieron excluir casi

por completo la posibilidad de estar registrando proteinasas de la familia serina­

proteinasas involucradas en el proceso de apolisis. y ciscunscribir nuestro estudios sólo a

proteinasas activas en condiciones ácidas como lo son las de origen lisosomal.

En la mosca del Mediterráneo, hemos determinado que la actividad proteolítica

general comenzó a incrementarse a partir de las 16-203-Q h coincidiendo,

aproximadamente, con la aparicición de los primeros signos de muerte celular en cuerpo

graso y músculos. La actividad proteolítica alcanzó su máximo entre las 40-44 h durante

la transición del estadio pre-pupal a pupal. Posteriormente, la misma decreció hasta las 80

h donde alcanzó valores similares a los registrados en la pre-pupa de 16 h (Capítulo 4,

Figura 40). Deterrninamos tambíen que durante todo todo el estadio de pre-pupa, el pH

óptimo para la proteólisis de hemoglobina fue 3,5, mientras en el estadio pupal el pH

óptimo de reacción varió desde 3,5 al inicio hasta pH 6,5 durante la transición pupal­

adulto farado.

Nuestros resultados coincidieron con los reportados en los primeros trabajos

bioquímicos en Chironomus tentans (Rodems et al, 1969; Henrikson y Clever, 1972),

Luci/ia cuprina (Smith y Birt, 1972), donde se detectaba una importante actividad

proteolítica general durante la metamorfosis y se la relacionaba con la degradación de

tejidos larvales. A diferencia de estos, logramos discriminar a que clase de proteinasas

correspondía esta actividad. La dos clases de proteinasas identificadas en la mosca del

208

Discusión v Conclusiones generales

Mediterráneo coincidieron con lo observado por Dorsey y Lockshín (1983) que

demostraron durante la degradación de los músculos intersegmentales de mariposa, que

las actividades de Catepsinas del tipo D y B son muy importantes.

8- Proteinasas de la metamorfosis

En esta Tesis, hemos logrado aislar tres proteinasas durante la metamorfosis

temprana de C. capitata, que denominamos MCP I, MCP II y EMAP.

La Cisteín-proteinasa MCP I presentó muy alta similitud con la catepsina B

de mamíferos. La Cisteín-proteinasa MCP lI resultó una proteinasa de nuevo

tipo. La aspartil-proteinasas EMAP presentó características similares a la

Catepsina D de mamíferos.

Cuando iniciamos esta Tesis, contábamos solamente con dos trabajos

relacionados en los que se habian aislado proteinasas similares a las identificadas en la

mosca del Mediterráneo. Kawamura y col (1984, 1987) habían aislado una Catepsina D y

otra cistein-proteinasa del tipo L que presentaban actividad durante las primeras 24 h del

estadio pupal de la mosca Aldríchina grahami. Posteriormente no se detectaron otros

trabajos de estos autores. El otro trabajo estaba relacionados con la purificación de una

Catepsina tipo D involucrada en el proceso de vitelogénesis en los mosquitos adultos

(Cho y col, 1991).

En esta Tesis, hemos logrado purificar tres proteinasas durante la metamorfosis

temprana de C. capitata que denominamos MCP l, MCP II y EMAP. El tamaño de las

pupas (9 a 12 mg cada una) y la gran inversión de tiempo de sincronización individual de

cada insecto nos obligaron a emplear un protocolo que nos permitiera aislar

simultáneamente las diferentes proteinasas y maximizar el rendimiento del material

utilizado. El condicionamiento que nos imponía el material de partida nos obligó a

trabajar en condiciones ácidas, donde sabíamos que habría una menna importante de la

actividad debido al proceso de proteólisis recíproca y autoproteólisis que caracteriza a

209

Discusión y Conclusiones generales

muchas proteinasas, en especial, las aspartil-proteinasas. Ante este compromiso

preferimos aislar todas las proteinasas posibles.

MCP I (metamorphosis cystein-proteinase I)

El análisis del extremo amino terminal de MCP I reveló muy alta similitud con la

catepsina B de hígado de rata (66,7%) y en menor medida con la cisteín-proteinasa

de la mosca Sarcophaga peregrina (50%) y la de la mariposa Bombyx mori (36%)

(Capítulo 7, Tabla l l). Curiosamente, no presentó similitud con la cistein-proteinasas de

la mosca Musca domestica (Ribolla y Bianchi, 1995).

Este tipo de análisis permitió clasificar a MCP I dentro del grupo de cisteín­

proteinasas, en el Clan CA y dentro de éste, en la Familia C l al cual pertenecen las

proteinasas antes mencionadas y otras como la papaína, catepsinas H, K, L, O y S,

(Barret y col, 1998). En coincidencia con la Catepsina B, MCP l presentó una prolina en

posición 2, pero en la posición 6 presentó al aminoácido glutamico en vez del aspártico

característico del clan.

La Familia Cl es la que cuenta con el mayor número de miembros, e incluye

endopeptidasas y exopeptidasas de las más diversas especies. Por lo general, la mayoría

de las endopeptídasas de esta familia están asociadas a la vía secretoria, por lo que se la

identifica en vacuolas o lisososmas, mientras que las exopeptidasas mayoritariamente son

citosólicas. La Catepsina B en los mamíferos es fundamentalmente una importante

proteinasa lisosomal, pero también hay reportes en los que se la ha encontrado en

citoplasma, asociada a la membrana plasmática o secretada. La Catepsina B se sintetiza

como precursor inactivo, de mayor tamaño molecular que la enzima activa. Nishimura y

col (1988) propusieron que la catepsina D sería la responsable de la activación "in vitro"

de esta enzima. La forma activa en los mamíferos presenta un peso de alrededor de 30

KDa.

MCP l presentó un peso molecular relativo de 32.000 daltons. La similitud

encontrada a nivel de secuencia aminoacídica con catepsina B y la proteinasa de 29

KDa de Sarcophaga, también se la observó en ciertas propiedades bioquímicas

(Capítulo 5, Tabla 9). Estas proteinasas presentaron similitudes en cuanto a los pesos

210

Discusión y Conclusiones generales

moleculares, la digestión de hemoglobina y sustratos sintéticos, el pH óptimo y la muy

baja estabilidad frente a pH neutros y alcalinos. Sin embargo, MCP I presentó en un

amplio rango de estabilidad frente al pH (pH 2 a 6), a diferencia de las otras dos que

presentan una estabilidad más restringida que oscila entre 4,7 y 5, 5 para la catepsina B, y

5,5, y 6,5 para la de Sarcophaga. El punto isoelectrico también fue diferente con respecto

a la Catepsina B, mientras que esta última presenta cuatro formas entre 4,7 y 5,5, en

Ceratitis se identificaron dos formas principales con pI de 6 y 6,7.

La similitud observada entre MCP l y la proteínasa de 29 KDa de Sarcophaga

principalmente en cuanto a características bioquímicas nos permite hipotetizar que MCP I

posiblemente participa de la disociación del cuerpo graso larval en la mosca del

Mediterráneo.

MCP II (metamorphosís cystein-proteinase ll)

MCP lI es una cisteín-proteínasa de 67.000 daltons de nuevo tipo. No presentó

similitud en su extremo amino terminal con ninguna otra cisteín proteínasa

conocida en mamíferos e insectos (Capítulo 7, Tabla 12).

MCP II presentó, solamente, el aminoácido aspártico en la posición 6,

característico del Clan A al que pertenecen la catepsina B y las papaínas. Además del

tamaño, MCP II presentó otra diferencia inportante con MCP I que es la estabilidad de la

enzima con el pH. El comportamiento de MCP II frente al pH fue muy similar a la

Catepsina B de mamíferos. MCP II fue estable a pH entre 4 y 6, perdiendo rápidamente

su actividad por encima y ,especialmente, por debajo de 4.

Ninguna de las dos cisteín-proteinasas de aisladas en la mosca del Mediterraneo

presentaron ningun tipo de homología en el extremo amino terminal con las caspasas de

Drosophila ni tampoco de mamíferos.

EMAP (Early metamorphosis aspartiI-proteinasa)

La proteínasa aspártica purificada en la mosca del Mediterráneo presentó

caracteríticas bioquímicas que la relacionan fuertemente con la Catepsina D de

211

Discusión y Conclusiones generales

mamíferos, sin embargo, en el análisis de la secuencia amino terminal, no presentó

ningúna homología con ésta.

Otra particularidad de EMAP y que coincidió con las otras dos proteinasas

aspártícas aisladas en dípteros (en mosquito y la mosca A. grahami), es la importantísima

inestabilidad a pHs superiores a 5 (Capítulo 6, Figura 66). Esta caracteristica diferencia

completamente a las proteinasas aspártícas de dípteros de las catepsinas tipo D de

mamíferos, aunque presenten, como en el caso de mosquito, una alta homología en

secuencia. Además, esta característica impide la utilización de las columnas de afinidad

del tipo pepstatina-agarosa o hemoglobina-agarosa en la purificación, ya que en éstas la

enzima está expuesta a condiciones alcalinas. Esta característica hace que se pierda una

herramienta que ayudaría a reducir los tiempos de purificación y así, el proceso de

autoproteólisis característico de esta clase de proteinasas.

Cuando empleamos etanol 10% logramos aumentar la estabilidad a pH 5,8, y esto

resultó clave, ya que nos permitió concluir con la purificación de la enzima a

homogeneidad. En la primera proteinasa aspártíca aislada en insectos, Kawamura y col.

(1987) hicieron referencia a la necesidad del empleo de alcoholes para estabilizar la

enzima. En esta mosca, la proteinasa en 10% etanol presentó estabilidad máxima a pH

5,5. Estos autores postularon que el incremento de la polaridad del medio que rodea la

enzima como consecuencia de la disminución de la concentración de proteínas durante el

proceso de purificación, afecta la estabilidad e inactiva la proteinasa aspártíca de la

mosca.

Hemos determinado la actividad de EMAP durante la metamorfosis de la mosca

del Mediterráneo en geles de poliacrílamida incubados con hemoglobina. Cuando

realizamos incubaciones de 60 min, EMAP presentó actividad creciente desde la

inmovilización definitiva de la larva (Capítulo 6, Figura 70-B y 71). Cuando redujimos el

tiempo de incibación a 5 min, solamente se detectó actividad durante el estadio pupal

(Capítulo 6, Figura 70-A, 45-144 h), mostrando solamente los horarios de máxima

actividad. Por lo tanto, la máxima actividad de EMAP registrada durante el estadio

de pupa coincidió temporalmente con el descenso en el contenido de proteínas y con

las etapas avanzadas del proceso de histolisis, tanto en músculos como en el cuerpo

graso larval.

212

Discusión y Conclusiones generales

9- Localización de las enzimas estudiadas

Para poder determinar definitivamente la localización tisular y celular de las

proteínasas detectadas y aisladas, resulta fundamental obtener anticuerpos específicos

para realizar estudios inmunocitoquímicos.

Lamentablemente, no hemos logrado obtener anticuerpos en conejo contra las

enzimas MCP I, MCP II y EMAP. En los distintos ensayos realizados, se registró una

mortandad muy alta de los conejos a posteriori de la inoculación y en los conejos que

resistian, no se obtuvieron anticuerpos. Aparentemente, las cisteín-proteinasas de la

Familia C1 presentan dificultades para producir antisueros. Barret y col (1998) hacen

especial mención de que la catepsina B es muy poco inmunogénica en conejos.

Campetella (comunicación personal) también tuvo una alta mortandad de conejos en los

primeros intentos para obtener antisueros contra la cruzipaína (cistein proteinasa de la

Família C l). Estos anticuerpos hubieran permitido determinar el rol de estas proteínasas

en el cuerpo graso, músculos y en que momento del proceso degradativo su actividad es

máxima. Hubiera resultado interesante determinar si los hemocitos, cuya actividad

fagocítica es fundamental en la remoción de los restos celulares, también contienen a

estas proteínasas en sus lisosomas.

En ensayos muy preliminares de fraccionamiento subcelular, mediante gradientes

de sacarosa, hemos determinado que la actividad de EMAP está asociada en una alta

proporción a la fracción lisosomal. Debemos profundizar estos estudios y mejorar los

protocolos para reducir a un minimo la rotura de lisosomas durante el procesamiento y

extenderlos a las otras proteínasas aisladas

213

Discusión y Conclusiones generales

lO-Análisis de las secuencias codificantes de los genes de las proteinasas

de Ccagitata

La secuencia parcial de EMAP presentó 59 % de homología con la

catepsina D de porcino y 60 % con la proteinasa aspártica de arróz.

La estrategia que empleamos para clonar y secuenciar los ARNm de las

proteinasas de C. capitata se centró en la técnica de la reacción de la polimerasa en

cadena. Lamentablemente, los resultados con esta estrategia no fiJeron del todo positivos,

pese a los numerosos intentos y variaciones empleadas.

Sólo en el caso de EMAP se logró conocer la secuencia parcial que presentó S9 %

de homología con la Catepsina D de porcino y 60 % con la proteinasa apánica de arróz.

Debido al bajo número de bases que hemos podido secuenciar, a pesar de que el inserto

era de aproximadamente l,l kb, no hemos podido realizar estudios más profundos, ni

afirmaciones concluyentes. En base a la homología encontrada y las propiedades

bioquímicas similares que observamos en EMAP, proponemos que es una

proteinasa aspártica del Clan AA del tipo de la catepsina D.

La catepsina D en mamíferos es una proteinasa lisosomal cuya función principal

es la degradación de proteínas y se expresa en practicamente en todos los tejidos. En este

grupo, se ha demostrado que en los lisosomas, la Catepsina D degrada entre lO a 50 % de

las proteinas (Barret y col, 1998). Cho y col (1991) demostraron que la proteinasa

aspártica de mosquito era lisosomal y colocalizaba con la hidrolasa y fosfatasa ácida en

ensayos de fraccionamiento subcelular. En los mosquitos adultos presentó una

distribución amplia, aunque es muy abundante en cuerpo graso. En este tejido, los

lisosomas y, en especial, la proteinasa aspártica juegan un papel fundamental en la

destrucción de organelas involucradas en la biosíntesis y secreción de la proteína de

huevo, vitelogenina.

La estrategia identificar los ARN m de las cisteín-proteinasas MCP l y MCP II

fue similar a la empleada con EMAP y los resultados obtenidos en esta búsqueda han

214

Discusión y Conclusiones generales

sido infructuosos. Por lo tanto, cremos que resulta necesario la construcción de una

libreria genética de expresión que abarque las últimas horas de la larva III y todo el

estadio de pre-pupa (hasta las 40 h) para iniciar las búsqueda de los ARNm de las

proteinasas aisladas. El conocimiento de estos ARNm, nos permitirá corroborar

definitivamente las identidades de MCP I y EMAP, y obtener información que nos

permita caracterizar la proteinasa de nuevo tipo MCP II.

ll-Busgueda de activadores del proceso de muerte celular

La busqueda de los activadores de la muerte celular reaper y hid durante la

metamorfosis de Ceratitis capitata no dió resultados positivos. Las técnicas

empleadas indicarían que estos activadores no se encontrarían en esta

mosca.

Los activadores reaper y hid fueron identificados durante la histolisis de glándula

salival e intestino de Drosophila melanogaster (Jiang y col, 1997). Esta es la única

referencia hasta la fecha, donde se encontró que la maquinaria de activación del proceso

de MC durante la metamorfosis utiliza las mismas moléculas que se emplean durante el

proceso de MC durante la embriogénesis.

Los resultados en la mosca del Mediterráneo no nos permiten concluir de manera

definitiva que estos activadores no existan en esta mosca. Pero, cuenta a favor nuestro

que no hemos detectado ningún reporte en otro insecto hasta la fecha y tampoco fueron

encontrados durante la búsqueda específica en la mosca Sarcophaga o en lepidópteros

(comunicación personal, 1999).

215

Discusión y Conclusiones generales

12- Cambios macroscópicos durante la transición larva adulto

Los cambios a nivel tisular y molecular que registramos durante este trabajo han

sido relacionados en todo momento con los cambios de habito en la larva III y la pupa en

formación.

Hemos determinado que en C.capitata, la larva de tercer estadio deja de

alimentarse e inicia el vaciado del intestino doce horas antes (-12 h) de su

inmovilización definitiva e inicio de la metamorfosis. Por lo tanto, a partir de este

momento la mosca no se alimenta hasta recién después de la emergencia del imago

(es decir, 324 h más tarde). La larva que ha dejado de alimentarse completa la digestión

y comienza a purgar los restos de alimento que quedan en su interior. Si bien es muy

dificil determinar con precisión en que momento finaliza la digestión y ocurre el purgado

del último alimento ingerido, hemos comprobado reiteradamente que cuando la larva de

Ceratitis abandona el alimento a las —8h, presenta el intestino completamente vaciado y

traslúcido.

En diferentes insectos holometábolos y particularmente en moscas (Drosophila

melanogaster y Calliphora vicina) se ha demostrado que cuando el último estadío larva]

ha alcanzado su tamaño crítico, se produce la liberación de un pequeño pulso de ecdisona.

Este pulso de hormona de la muda hace que la larva deje de alimentarse, purgue su

intestino e inicie una etapa de vagabundeo en la superficie del alimento hasta que lo

abandona definitivamente (Denlinger y Zdárek, 1994).

Si bien, no hemos registrado aún este pequeño pulso de ecdisona en la mosca del

Mediterráneo, cuatro horas más tarde del vaciado del intestino (es decir, -8 h) hemos

registrado el máximo pulso de hormona de la muda (Rabossí y col., 2000 y Stoka,

comunicación personal) que induce a la larva a abandonar el alimento.

La larva de Ceratitis asciende a la superficie del alimento y luego de un período

de vagabundeo (“wandering”) de tan sólo unos pocos segundos, lo abandona mediante

saltos. La capacidad que presentan estas larvas caracteriza a la mayoría de las especies de

la Familia Trephritidae, y se trata de un comportamiento de dispersión único en los

insectos. El abandono del alimento y el comportamiento de dispersión fue descripto en

detalle por nosotros (Quesada y col., 1995), mientras que el mecanismo muscular por el

216

Discusión y Conclusiones generales

cual las larvas saltan fue descripto por Maitland (1992). En la figura 76 se muestran los

principales eventos registrados durante las últimas horas del tercer estadio larval de

Ceratitis.

En la larva que salta, y como mencionamos antes, que presenta el intestino

completamente vaciado, hemos demostrado que las endopeptidasas digestivas

(principalmente del tipo serín y cisteín-proteinasas) se encuentran completamente

inactivadas.

La definición del "tiempo cero" de la metamorfosis nos permitió disponer de

una herramienta de gran utilidad, completamente independiente de las condiciones de

cn'a, a partir de la cual referenciar los eventos que ocurren durante la metamorfosis, asi

como también durante el estadio larval III. En el “tiempo cero”, la larva se encuentra

completamente inmovilizada, no responde a estímulos mecánicos y completó la

morfogénesis del pupario (es decir, presenta los tres primeros segmentos anteriores

totalmente retraídos y la larva adquiriendo así la forma ovoide típica) (Rabossi y col,

1991 y 1994).

La definición del “tiempo cero” nos ha permitido obtener un alto grado de

precisión y repetibilidad en nuestro sistema, lo cual nos permitió definir los estadios que

transcurren dentro del pupario, los programas de pupariación y pupación.

La morfología externa recién pudo analizarse a partir de la pupa criptocefálica (40

h) cuando las capas externas de la cutícula pupal han sido depositadas y el individuo

puede separarse del pupario. Los estudios realizados en esta Tesis sobre la degradación

del cuerpo graso y músculos larvales completan el cuadro de eventos durante la

metamorfosis de la mosca del Mediterráneo elaborabo por nuestro laboratorio durante los

últimos años (Figura 77).

2l7

Larva III

horas —l')

Etapa dealimentaciónactiva

T

T

-8

? Etapa de saltos

Larva deja dealimentarse. ypurga elintestino

Abandono delalimento.Instestinocompletamentevacio, enzimasdigestivasinactivadas

ÍMáximo pulso deecdisona

-3

Locomociónpor Ímovimientostelescópícos

Deja de saltar.Secreción analpegajosa, unahora antes.

Posición definitiva enel terreno. La larva

deja de moverse

_—

La larva luego de emerger a la superficie del alimento, vagabundea sólo unos pocos segundos y loabandona mediante saltos 7La larva inmovil adquiere progresivamente la forma de barril, a través de la retracción de los tressegmentos anteriores

Figura 76 : Principales eventos estudiados durante el final del tercer estadio larva]de Ceratítis capitata.

PupaPrepupa

horas o 16 20E 4o 46 43 72 93 120 144152

Í -------pupariación-----"T

T ?------pupación------"T

_, ' ProporcionesColoracnon pupa definitivas del Muda pupal­

adulto faradodefinitiva ' ' 'cnptocefalica y cuerpo

del pupario

pupafanerocefálica

Apolisislarval-Duoal

Incremento en la cantidad de hemocitos krO O: 5 L. : V

Disociación Las célulasdel cuerpo del Cggraso larval comienzan a

a................................................. disgregarse

95 Lr’ Il Fragmentación de los músculos

Separïmmn de esqueléticoslos musculosde sus

apodemas

Figura 77 : Principales eventos analizados durante los estadios de pre-pupa y pupa.La flecha horizontal punteada, indica la dirección del incremento.

Conclusiones Generales

La metamorfosis holometábola (completa) representa una adquisición evolutiva

cuyo estudio resulta de enorme interés para la comprensión de la evolución de los

insectos. En los dípteros ciclorráfos la metamorfosis alcanza su mayor complejidad al

convertirse la cutícula larval, mediante el proceso de pupariación, en una cápsula donde

transcurre toda la transición de larva a adulto.

En la presente Tesis se ha realizado un estudio horizontal del proceso de histolisis

larva], donde se ha puesto especial énfasis en la caracterización del mismo y correlación a

diferentes niveles; celular, estructural, fisiológico y molecular; enmarcado siempre dentro

del contexto de los cambios que ocurren durante la metamofosis temprana. Para este

autor, este es el aporte principal de esta Tesis, ya que, hasta el presente, la histolisis de

tejidos larvales en la metamorfosis de insectos había sido un tema poco estudiado, no

cor-relacionado con otros eventos y encarado de manera discontinuada en el tiempo. En la

mayoría de los trabajos que preceden a esta Tesis, sólo han sido analizados aspectos muy

parciales del proceso de histolisis. Las principales conclusiones alcanzadas en esta Tesis

SOI]:

-Hemos podido describir en detalle y con precisión, por primera vez en un

insecto, la secuencia temporal de eventos que llevan a la degradación del

cuerpo graso larva] durante la metamorfosis.

-Hemos confirmado y ampliado datos preexistentes sobre la degradación de

músculos en dípteros. Hemos correlacionando por primera vez la histolisis

de los músculos abdominales con el proceso de evaginación de la cabeza y

apéndices torácicos.

-En el marco de esta Tesis, por primera vez en C. capitata y en gran parte en

los insectos, se han descripto y ubicados temporalmente con gran precisión

218

Discusión y Conclusiones generales

los siguientes acontecimientos fisiológicos y anatómicos: vaciado del

intestino en larva III, inactivación de enzimas digestivas, pulso de ecdisona,

salto de la larva, “Tiempo O” de metamorfosis, apolisis larval-pupal,

evaginación de cabeza y apéndices, evolución anatómica de la pupa y otros.

-Por primera vez se han podido estudiar enzimas específicas de la histolisis y

correlacionar su accionar con eventos de degradación de cuerpo graso y

músculos, observables al microscópio.

-Se ha podido determinar la identidad y relación de tres proteinasas

participantes de la degradación tisular. Estas son las cisteín proteinasa MCP

I y MCP II, y la aspartil-proteinasa EMAP.

-En particular, se aisló y caracterizó una cisteín-proteinasa de nuevo tipo,

MCP II, aparentemente no relacionada con ninguna conocida en los

artrópodos ni en otros organismos.

-Hemos demostrado que la actividad de EMAP resultó máxima durante el

estadio pupal, coincidiendo temporalmente con las etapas avanzadas del

proceso de histolisis en músculos y cuerpo graso larval y con el descenso en

el contenido de proteínas. Se ha clonado un fragmento de 127 nucleótidos

del gen que codifica EMAP.

-I-Iemos correlacionado temporalmente los cambios en el contenido de la

principales moléculas de reserva con la histolisis del cuerpo graso y los

músculos larvales Se ha estudiado en detalle la degradación de trehalosa,

219

Discusión y Conclusiones generales

lípidos, proteínas y glucógeno producidos y almacenado durante el último

estadio larva].

-Hemos demostrado la equivalencia, en tén'ninos de proporción del ciclo de

vida, entre la metamorfosis de Ccapitata, estudiada en detalle en esta Tesis

y la de D. melanogaster, poco estudiada. Esto permitirá, a partir de ahora,

utilizar el conocimiento genético existente en D.melanogaster para

correlacionar eventos mediados por proteínas o genes desconocidos con

actividad de genes conocidos sin fiJnción conocida.

-Se ha postulado la aparente falta en Ccapítata de genes con homología de

secuencia similares a los genes reaper y híd, encargados del control de la

muerte celular en D.melan0gaster, confirmando y extendiendo resultados en

otros organismos.

220

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