UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

E.A.P. DE FARMACIA Y BIOQUMICA

Departamento Acadmico de Qumica Bsica y Aplicada Docente : MG Amrico Jorge Castro Luna Curso: Qumica Orgnica II Monografa: Cromatografa lquida de alta presin

(HPLC). Aplicacin en compuestos orgnicos Grupo de laboratorio : Viernes Mesa: 5 Integrantes :

Gonzalo Aire, Gabriel / 08040051 Murga Sulca, Jhonatan Antonio / 08040101 Prez Guerreo, Fiorella Yahaira / 08040106 Quispe Ollero, Elas / 08040064

1

Todos hacemos uno, todos hacemos bioqumica, pero somos pocos los que la practicamos.

La cooperacin es la conviccin plena de que nadie puede llegar a la meta si no llegan todos.

2

Obviamente, nadie reconoce ser o haber sido un bioqumico. Sin embargo, estamos seguros gracias a los documentos supervivientes de los grandes pioneros Jesucristo (Cuando convirti agua en vino)

Da Vinci (Mezcl agua y azcar cuando haca te)

RESUMEN

Este trabajo tiene como objetivo fundamental, la aplicacin de la Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC) en compuestos orgnicos, una metodologa que permite la separacin, identificacin y cuantificacin de los compuestos orgnicos ms complejos. Para lograr el objetivo planteado, la metodologa utiliza la informacin aportada por un conjunto de revistas y libros cientficos. En cuanto al anlisis de la informacin, se fundamenta en principio que la cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil; mientras que por otro lado la cromatografa lquida consta de una fase mvil que es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin o alta presin (HPLC).

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser: Cromatografa de adsorcin, Cromatografa de reparto, Cromatografa inica, Cromatografa de exclusin por tamao. Finalmente, se hace mencin a la instrumentacin que constituye la Cromatografa Liquida de Alta Presin y se hacen sugerencias para su correcto empleo en otras investigaciones similares que se realicen en el futuro.

3

Palabras clave: Cromatografa Lquida de Alta Presin, orgnicos, fases inmiscibles, fase fija, fase mvil, cromatografa lquida, micrones, Cromatografa de adsorcin, Cromatografa de reparto, Cromatografa inica, Cromatografa de exclusin.

SUMMARY

This work has as fundamental aim(lens), the application of Alta Presin's Liquid Chromatography (HPLC) in organic compounds, a methodology that allows the separation, identification and quantification of them composed organic more complexes. To achieve the raised aim(lens), the methodology uses the information contributed by a set of magazines and scientific books. As for the analysis of the information, there is based at first(in principle) that the chromatography is a physical method of separation based on the distribution of the components of a mixture(mixing) between(among) two immiscible phases, a hinge or stationary and mobile other one; whereas on the other hand the liquid chromatography is clear of a mobile phase that it is a liquid that flows across a column that it(he,she) contains to the fixed phase. In order to increase the efficiency in the separations, the size of the particles of fixed phase was diminished up to the size of the microns, which generated the need to use discharges press to achieve that the mobile phase flows. Hereby, there was born the technology(skill) of liquid chromatography of high resolution or high pressure (HPLC).

Depending on the type of fixed phase and of the type of physical phenomenon that provokes the separation, the liquid chromatography of high resolution can be: Chromatography of adsorption, Chromatography of distribution, ionic Chromatography, Chromatography of exclusion for size. Finally, there is mentioned the instrumentaria that constitutes the Chromatography Liquidates of Alta Presin and suggestions are done for

4

his(her,your) correct employment in other similar investigations(researches) that are realized in the future.

Keywords: Alta Presin's Liquid Chromatography, organic, immiscible phases, phase fixes, mobile phase, liquid chromatography, microns, Chromatography of adsorption, Chromatography of distribution, ionic Chromatography, Chromatography of exclusion.

NDICE

Leyenda.Pg. 2 ResumenPg 3 Palabras Claves . Pg 3 Summary. Pg. 4 Keywords . Pg. 4 Introduccin Pgs.6 - 7 Objetivos..Pg. 8 Marco terico ..Pgs. 9- 45 Conclusiones ..Pg. 46 Bibliografa Pgs. 47-48

5

INTRODUCCIN La cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos qumicos. La muestra es distribuida entre dos fases inmiscibles (slida, lquida o gas), una estacionaria y otra mvil, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto ntimo, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente retenido por la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separacin. Si un componente est la mayor parte del tiempo en la fase mvil el producto se mueve rpidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho ms lenta.

La separacin se lleva a efecto en una columna tubular rellena de un slido poroso finamente dividido, el cual puede actuar como fase estacionaria propiamente dicha como soporte de una fase estacionaria lquida. Tambin se puede efectuar utilizando como fases estacionaria papel de filtro o un slido finamente dividido colocado en forma de capa fina sobre una placa de vidrio. Estos tres tipos de cromatografa se basan en los mismos principios fundamentales, y se conocen respectivamente como cromatografa en columna, en papel y de capa fina. En esta cromatografa solo se considerar la cromatografa en columna.

6

La cromatografa es un proceso de separacin muy comn en ingeniera qumica y bioqumica. Es un procedimiento altamente selectivo, capaz de distinguir y separar componentes con caractersticas fsicas y qumicas muy similares. Esta tcnica se considera importante tanto a nivel de produccin como de anlisis.

Desde el siglo pasado las separaciones analticas se llevaban a cabo por mtodos clsicos como son la precipitacin, destilacin y extraccin. Los crecientes esfuerzos por conocer ms sobre la composicin y la funcin de las protenas han obligado a los cientficos a buscar tcnicas, cada vez, ms precisas.

Para elegir una tcnica de separacin, adems de tener en cuenta los criterios econmicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades fsicas y estructurales de las molculas que se pretende separar, o de las caractersticas de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del anlisis (sensibilidad, resolucin, tiempo de anlisis, necesidad de una deteccin especfica).

El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la obtencin, preparacin y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicacin de la tcnica analtica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.

Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: tcnicas de separacin y tcnicas espectroscpicas. Las tcnicas espectroscpicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una informacin compleja, relacionada con sus caractersticas estructurales especficas, por otro lado las tcnicas de separacin se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la seal obtenida puede utilizarse con fines analticos cuantitativos o cualitativos.

Actualmente las separaciones analticas se realizan fundamentalmente por cromatografa y electroforesis.

La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una mezcla, sino tambin su identificacin y cuantificacin. Se pueden separar molculas en funcin de sus cargas, tamaos y masas moleculares. Tambin a travs de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y volmenes de retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado

7

en la medida de alturas o reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin.

Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar segn la forma en que la fase mvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. As en la cromatografa de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a travs de la cual se hace pasar la fase mvil por presin. En la cromatografa en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como su nombre lo indica, la fase mvil en las tres tcnicas son lquido, gas y fluido supercrtico respectivamente. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. Solo la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase mvil. La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), por su sensibilidad, fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles y su aplicacin a sustancias de primordial inters en la industria, como son los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.

8

OBJETIVOS

Conocer los fundamentos tericos bsicos del HPLC. Conocer los componentes del sistema HPLC. Advertir los cuidados para el manejo del HPLC. Conocer al detalle sus diversas aplicaciones en

compuestos orgnicos.

MARCO TERICO

9

Cromatografa Liquida de Alta Performance

ASPECTOS HISTORICOS DEL HPLC

10

Aunque procesos parecidos ocurren en la naturaleza cuando disoluciones pasan a travs de arcilla, rocas, etc. La cromatografa como tal adquiere importancia cuando en 1850 el qumico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubri que los cationes orgnicos se separaban por migracin cuando se depositaba una disolucin que los contena sobre un material poroso, como el papel.

En 1906 el botnico ruso Tswett utiliz la cromatografa en columna para separar extractos vegetales coloreados, y a este proceso le dio el nombre de cromatografa. Pero el mayor desarrollo se produce en 1930 con Lederer cuando consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Posteriormente los qumicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografa en el campo de la Qumica Orgnica e Inorgnica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

A partir de 1940 los mtodos cromatogrficos adquieren extensin mundial de forma que en 1940 Tiselius divide los mtodos cromatogrficos en cromatografa por anlisis frontal, desarrollo por elucin y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.

Al mismo tiempo la cromatografa se aplicaba en el campo de la bioqumica, y as Martn consigue separar algunos aminocidos acetilados.

TIPOS DE CROMATOGRAFA .. [9]

En la cromatografa en columna, la fase mvil puede ser un lquido o un gas, y segn el caso se denominan respectivamente cromatografa lquida y cromatografa de gases . Esta fase mvil fluye a travs del relleno de la columna, arrastrando los componentes de la mezcla, que son selectivamente retenidos por al fase estacionaria. EL flujo de la fase mvil se mantiene constante a travs de todo el proceso y de esta manera se logra que cada componente de la mezcla sea eludo de la columna como un compuesto puro, disuelto en la fase mvil. A esta tcnica se le llama cromatografa de elusin. De acuerdo con la naturaleza de las fases involucradas y con los mecanismos de separacin, es posible distinguir diferentes tipos de

cromatografa, como se indica en la figura 1.

11

FIG. 1 - Mtodos cromatogrficos. CGS: cromatografa gas-slido; CGL: cromatografa gas-lquido; CLS: cromatografa lquido-slido; CLL: cromatografa lquido-lquido; CFQU: cromatografa de fase qumicamente unida; CII: cromatografa de intercambio inico; CCF: cromatografa de capa fina; CP: cromatografa de papel;

Cromatografa de gases y cromatografa lquida de alta presin.

Cromatografa liquida clsica y cromatografa liquida de alta performance

La cromatografa liquida clsica se lleva acabo en una columna generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase lquida. Luego de colocar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia

12

en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas presin es para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Ver figura 2.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN

13

Con esta tcnica es usual obtener separaciones en minutos e inclusive en algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren columnas de alta eficacia y sistemas de bombeo de alta presin, ya que separaciones rpidas requieren flujos rpidos de fase mvil y esto a su vez requiere presiones elevadas. Su alta resolucin permite obtener y separar mezclas muy complejas; como algunos fluidos biolgicos como la orina humana. Las muestras naturales son difciles de manejar, pero con CII y programacin de fase inmvil la resolucin es notable.

Los mtodos de HPLC proporcionan muy buena informacin de tipo cualitativo, efectuando anlisis con precisin del 1%. Los detectores proporcionan buena sensibilidad y segn el tipo de muestra suelen medir hasta los 10 9 ng (nanogramos), otros ms especializados pueden detectar cantidades muy pequeas.

Entre las ventajas de esta tcnica, la ms importante es la diversidad de sus aplicaciones tantos a compuestos orgnicos como inorgnicos. Las nicas muestras no susceptibles de poderse analizar con facilidad son las gaseosas. Mediante los instrumentos cromatogrficos, la identificacin de cada seal de la muestra a anlisis se realiza comparando los tiempos de retencin con valores previamente determinados y la cuantificacin se obtiene mediante las reas integradas de las seales de acuerdo con el mtodo analtico seleccionado.

Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa inversin para los laboratorios. Otra limitacin es la necesidad de que el

Ventajas Desventajas

-Velocidad de anlisis -Alta resolucin -Resultados cuantitativos -Buena sensibilidad -Automatizacin -Amplio espectro de aplicaciones

-Instrumentacin costosa -Difcil anlisis cualitativo -No existe detector universal y sensible-Elevado costo de operacin-Experiencia indispensable

14

personal que utiliza estos mtodos tenga experiencia para poder obtener provecho, lo cual requiere de 6 a 12 meses de experiencias para llegar a ser operador eficiente.

CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

1) Cromatografa de reparto o CLL

Separa los solutos basndose en la solubilidad.

Formada por CLL y CFQU. Estas tcnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte relleno. En el segundo caso, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada debido a que la cromatografa CLL necesita de un recubrimiento peridico de las partculas del soporte debido a la prdida de la fase estacionaria por disolucin en la fase mvil.

En general, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas qumicamente se preparan con slice rgida o composiciones donde la slice es el elemento bsico. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y uniformes.

Los rellenos de columna en la CFQU se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.Este mecanismo de separacin se basa en la distinta solubilidad que presenta una molcula de la muestra en la fase mvil y en la fase estacionaria. De ah que los compuestos ms solubles en la fase estacionaria sean selectivamente retenidos por ella en tanto que los menos solubles son transportados ms rpidamente por la fase mvil. Puede utilizarse en la separacin de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, bebidas refrescantes entre otras.El inconveniente de esta tcnica es la solubilidad de la fase estacionaria en la fase mvil y el deterioro de la columna. Esto se puede corregir saturando la fase mvil con la fase estacionaria por medio de una precolumna que contenga un alto porcentaje de fase estacionaria. O bien, utilizando materiales que contengan la fase estacionaria qumicamente unida a la superficie de un soporte (a modo de material de relleno de la columna no suele ser empleada); esto evita la perdida de fase estacionara y hace innecesario el uso de precolumnas para saturar la fase mvil.

Esta requiere un control cuidadoso de flujo y de la temperatura para poder identificar un compuesto determinado en funcin del tiempo de retencin que es caracterstico del compuesto determinado en las condiciones de flujo y temperaturas utilizadas.

15

2) Cromatografa de fase qumicamente unida (CFQU)

Esta tcnica surgi como consecuencia de problemas asociados con la CLL. Dado que su fase estacionaria esta qumicamente unida a la superficie de un soporte, la fase mvil difcilmente produce deterioro alguno en la columna. Si se vara la naturaleza de los grupos funcionales de la fase estacionaria es posible obtener diferentes tipos de selectividad. Dichos grupos pueden ser de naturaleza polar, como el grupo amino y el grupo nitrilo en el caso de la cromatografa de fase normal, o bien no polar como el grupo octilo, octadecilo, fenilo, etc.; en el caso de la cromatografa de fase inversa, sta tiene innumerables aplicaciones.

Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es posible unir a la superficie de un soporte (partculas de slice), es limitada y como consecuencia los tamaos de muestra separados en esta columna son reducidos, por lo comn menor de 1 mg.

Este mecanismo de separacin es complejo, cuyas caractersticas son similares a la de la CLL y es el ms utilizado.

3) Cromatografa de adsorcin o CLS

Se basa en la afinidad de adsorcin Es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un mtodo importante de la HPLC.

Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina, siendo la primera la preferida.

Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5000. Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen.

En general la CLS es ms adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase inversa. En ste tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.El mecanismo de separacin de sta, se basa en la competencia que existe entre las molculas de la muestra y de la fase mvil o disolvente por ocupar los sitios activos en la superficie de un slido (almina y gel de slice).

En conclusin, este tipo de cromatografa es muy til y se aplica a molculas de baja o media polaridad.

4) Cromatografa lquida por exclusin o CE

16

Separa solutos segn el peso molecular

La cromatografa de exclusin, tambin llamada de filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de las molculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separacin obtenida depende del tamao de la molcula. El tiempo de retencin es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separacin por tamao difiere de las dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida.

La fase fija est formada por partculas de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el volumen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente.

Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables: mecnica y qumicamente; tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y tamao. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna.

Esta tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

La columna se rellena de un gel, cuyos poros son de tamao similar al tamao de las molculas de la muestra. Las molculas pequeas pueden penetrar dichos poros y quedan retenidas en tanto que las grandes no. Las columnas empleadas pueden ser muy largas (varios metros) y esto es especialmente cierto cuando se desea separar muestras cuyos pesos moleculares estn distribuidos en intervalos muy amplios.

Estas dos variantes en CE: la cromatografa de filtracin, emplea materiales blandos; incapaces de resistir presiones mayores de 4 atm. y es muy aplicada en el estudio de los biopolmeros y en contraste; la cromatografa de permeacin, emplea materiales de relleno semirgidos o rgidos, y que pueden resistir presiones muy elevadas. Ambas no implican mecanismos de separacin diferentes y su divisin se debe a motivos puramente histricos.

Aunque existen excepciones, la eficacia de las columnas de la CE es por lo general relativamente baja, por lo cual no es frecuente en esta tcnica obtener la separacin de compuestos individuales, sino ms bien fracciones de un cierto intervalo de pesos moleculares. El mecanismo de separacin es tal que el tiempo de retencin es inversamente proporcional al volumen de las molculas en la fase mvil y por lo tanto proporcional al peso molecular; las molculas ms pequeas son las que son objeto de una mayor retencin en la columna.

17

5) Cromatografa por intercambio inico o CII

Separa solutos segn la carga inica.

Est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aninicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catinicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto.

Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio inico tienen aplicacin de estudios donde intervienen molculas pequeas (PM = 500) que pueden penetrar en los poros pequeos de la resina. Los intercambiadores inicos de poliestireno son tan grandes que en las macromolculas muy cargadas, como las protenas, se pueden lanzar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio inico de macromolculas. Los geles de intercambio inico se usan en el caso de molculas grandes (protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos inorgnicos.

La separacin por intercambio inico se basa en la competencia entre la fase mvil y la muestra inica por los sitios o grupos activos de una resina intercambiadora de iones.

Este tipo de separacin se aplica a compuestos de un intervalo de pesos moleculares muy amplio, y ejemplos caractersticos de stos son los pptidos y los aminocidos. Las columnas son ms largas que las empleadas en otro tipo de cromatografa, esto se basa en la baja eficiencia de los materiales intercambiadores de iones. La gran variabilidad de los mtodos cromatogrficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Todas estas tcnicas tienen en comn la existencia de una fase estacionaria a travs de la cual fluye una fase mvil, as como la presencia de un mecanismo de inyeccin de la muestra y un mecanismo de deteccin de los diferentes componentes separados.

INSTRUMENTACIN

18

Depsito de disolvente Bomba Puerto de inyeccin Columna Detector Sistema de Adquisicin de Datos

1. Depsito de disolvente [1]

Los Pantanos de disolvente se utilizan para almacenar a la fase mvil. Lasbotellas Scott Duran son comnmente utilizados como depsitos de disolvente. El depsito de disolvente debe ser de material inerte como el vidrio y debe ser lisa, a fin de evitar el crecimiento de microorganismos en sus paredes. Puede ser transparente o de color mbar puede ser. Un graduado botella da una estimacin aproximada de la fase mvil por volumen de la botella. Disolvente embalses se encuentran situados por encima del sistema de HPLC (a un nivel ms alto) en una bandeja. Ellos nunca deben ser directamente sobre el sistema como cualquier vertido de disolvente en el sistema puede daar las piezas electrnicas.

El depsito que mantiene la fase mvil a menudo no es ms que una botella de vidrio. A menudo, el frasco de reactivos que posee nuestro disolvente HPLC puede ser utilizado como un depsito. Disolvente se entrega del depsito a la bomba por medio de tubos de tefln - denominada "lnea de entrada" a la bomba. Algunos sistemas como el HPLC tienen compartimentos especiales para calibrar uno o ms reservorios de fase mvil. Los depsitos en estos sistemas pueden tener funciones adicionales que permiten la fase mvil a desgasificar y aislados de contacto con el aire.

Los requisitos para un depsito de disolvente son simples:

El embalse y su anexo a la bomba debe ser de materiales que no contaminan la fase mvil: tefln, vidrio o acero inoxidable.

El buque debe tener algn tipo de tapa para evitar la contaminacin de partculas de la fase mvil. Algunos sistemas de LC para esto como parte del diseo del embalse. Si est usando una botella de disolvente en un embalse, la parte superior de la botella puede ser envuelto en papel de aluminio para mantener el polvo o la tapa de la botella puede ser perforado para permitir la insercin de la lnea de entrada a travs de la tapa.

19

No cierre la botella demasiado o eliminacin de la fase mvil por la bomba va a crear un vaco. Esto evita que fluya la fase mvil de la bomba, la creacin de un "bloqueo de vapor" en la bomba

Ejemplos de depsitos de la fase mvil de gama estndar de laboratorio, tales como vasos o frascos cubiertos con papel de aluminio a travs de los buques ms grandes, tales como los medios de comunicacin botellas, jarras disolvente, o Bombonas, a fin de fabricacin de vidrio que incluye-en disposicin de agitacin y de desgasificacin.

2. Bomba HPLC [2]

Clsica en la cromatografa de columna abierta, la fase mvil fluye a travs de la cama de la columna de embalaje a causa de la gravedad. Esto funciona (apenas) con partculas de gran tamao envases (de partculas ms grande que el dimetro 50-100 micras o menos), pero la separacin veces puede ser muy largo. Con el fin de reducir la separacin del tiempo y permitiendo la utilizacin de envases de menor tamao de partcula (10 micras y ms adelante), hay que forzar el lquido fase mvil a travs de la columna bajo presin. Esta es la funcin de la bomba (tambin llamado el "sistema de distribucin del disolvente"): para mantener un flujo constante de fase mvil, independientemente de la presin (presin) causada por la resistencia al flujo de la columna empaquetada.

La mayora de las bombas de HPLC comerciales se basan en un diseo de pistones alternativos, como se muestra aqu. Un motor de levas empuja el pistn hacia atrs y hacia adelante en el cabezal. Un sello flexible alrededor de la periferia del pistn previene la fuga de la fase mvil en la parte posterior de la bomba. Comprobar vlvulas montado en la cabeza se abren y se cierran en respuesta a pequeos cambios en la presin para mantener un flujo de disolvente. Cilindro de la bomba con sus vlvulas de retencin a menudo es accesible desde el exterior para facilitar la prestacin de servicios a la comprobacin y

20

Este "genrico" fase mvil embalse muestra el principio de los componentes de la reserva del mdulo.

sustitucin de vlvulas de la bomba focas. Esta parte de la bomba, la bomba se llama cabeza.

El siguiente diagrama muestra cmo la bomba de flujo vara con el tiempo:

Durante la entrega de un accidente cerebrovascular, aumenta el flujo de cero hasta un mximo y luego disminuye de nuevo a cero. Durante la admisin, el flujo es cero. La presin en el interior de la bomba de los cambios de la misma manera que el flujo - al pasar de cero a un valor mximo, y luego quedarse en cero durante la ingesta de un accidente cerebrovascular.

El tipo de flujo se muestra arriba, donde los cambios de la tasa de flujo durante el ciclo de bombeo, provoca pulsos de presin. Impulsos son indeseables por varias razones:

que causan problemas de deteccin

21

Seccin transversal de un simple diagrama de una sola

bomba de pistones alternativos

Una sola operacin de la bomba de pistn reciprocando.

que impiden una buena anlisis cuantitativo dan lugar a principios de la columna fracaso.

La mayora de las diferencias en las bombas de diferentes fabricantes son modificaciones para dar mayor flujo uniforme. Un enfoque consiste en mantener el diseo de un solo pistn, pero para variar la forma de la leva y / o la velocidad del motor. Esto conduce a un cambio en el flujo como se muestra a la derecha. La forma de la leva lleva a una ms plana la curva de flujo en el medio de la entrega de un accidente cerebrovascular. Adems, el motor se acelera durante la admisin y se ralentiza durante la entrega de un accidente cerebrovascular. Algunos pulsacin sigue siendo, sin embargo, estas bombas y con frecuencia usan alguna forma de "pulso de mojado" para reducir an ms el flujo de las fluctuaciones.

En forma de (no circulares) leva para reducir al mnimo los pulsos de presin.

Flujo de salida de una cmara con forma de bomba.

Otro enfoque comn combina el flujo de salida de dos cabezas que operan 180 grados fuera de fase, de modo que la admisin de una cabeza de entrega coincide con el trazo de la segunda cabeza. Esto significa que, si bien es un cilindro de la bomba de llenado del cilindro, el segundo cilindro est cumpliendo la fase mvil. Entonces, cuando la segunda recarga, proporciona el primer cilindro. Podemos combinar estas dos corrientes de alimentacin de salida de cada bomba en un t que se conecta con el sistema de CLAR. Ahora, el flujo combinado de ambos jefes ofrece una apariencia mucho ms suave, menos el flujo pulsante de la LC sistema. La lnea de entrada del depsito tambin se alimenta a un t que ambas ramas para alimentar a los cilindros de la bomba. Bomba de pulsaciones se puede reducir an ms especial por leva formas, variando la velocidad de la bomba de motor, y por el uso de amortiguadores de pulso.

22

Otro enfoque para la reduccin de la bomba de pulsaciones de mantenimiento de la bomba, mientras que el diseo es bastante simple pistn bomba Tndem. Un gran y un pequeo pistn / cilindro unidad se combinan para proporcionar el flujo continuo de fase mvil de la bomba. Si bien el gran pistn llena, el pequeo pistn ofrece. Cuando se llena el pequeo pistn, el gran pistn ofrece suficiente fase mvil a la vez llenar el pequeo pistn y proporcionar un flujo neto de la fase mvil a la LC sistema. Observe que

slo tres vlvulas de retencin son necesarias para esta bomba y cuatro vlvulas de retencin para una convencional de dos bombas de pistones.

Un tndem-bomba a pistn proporciona un flujo continuo de salida.

La mayora de las bombas de LC (incluso aquellos con mltiples cabezas) tienen algunas pulsaciones en el flujo de la bomba de salida. Esto es a menudo suavizadas por el uso de un amortiguador de impulsos. Estos dispositivos suelen consistir en una bobina de flexibles de acero inoxidable tubo. Cuando la presin sube (como resultado del flujo de pulsacin), el tubo se extiende y aumenta su volumen de manera que el flujo adicional de la bomba en este momento est alojado por el extra volumen del pulso amortiguador. Cuando la presin disminuye, el volumen disminuye la tubera, con el extra de disolvente va a compensar el flujo de dficit. En efecto, el pulso acta como un amortiguador hidrulico "amortiguador" para suavizar el flujo pulsante

3. Puerto de inyeccin .. [3]

La muestra la introduccin de dispositivos tales como inyector para introducir la muestra en un flujo de fase mvil a alta presin. No es posible utilizar la jeringa de inyeccin directa en la columna como la GC como la presin de entrada en LC es demasiado alta. La vlvula de inyeccin fija o variable a travs de bucle es una forma comn de introducir la muestra. La vlvula Rheodyne es el ms utilizado concebir. El bucle puede ser parcial o

23

completamente lleno. Hay dos tipos de inyectores de la disposicin. La ventaja de llenado parcial es la posibilidad de utilizar pequeas cantidades de muestra, cuando hay escasez de la muestra. La precisin de la inyeccin es de 1% de RSD y de compensacin de remanentes

5. Tubos y Accesorios

Hasta ahora no hemos hablado de la manguera y los accesorios que se conectan nuestros diversos mdulos LC juntos. Para tubos de las conexiones entre el depsito y la bomba y del inyector, el nico requisito es que los accesorios no de fugas, y que la tubera entre el depsito y la bomba de ser lo suficientemente grande en el dimetro para que el flujo de la fase mvil a la bomba no se limita. El tubo de conexin entre el inyector y la columna, y de la columna al detector, sin embargo, requieren ms atencin.

Las conexiones entre el depsito y la bomba se suele hacer con tubo de tefln, a menudo bastante amplio de la cavidad. Conexiones de abajo de la bomba son generalmente realizadas con acero inoxidable o PEEK (poli ter ter cetona) tubo. Conexiones entre el inyector y la columna-columna-detector debe hacerse de tubo de dimetro estrecho (0,010 "id o menos) con el fin de minimizar el volumen muerto.

Esta parte del sistema de LC debe ser cuidadosamente diseado y construidos para reducir al mnimo el volumen de la tubera y accesorios. Nosotros decimos que tenemos que eliminar el volumen muerto en la mayor medida posible. As que tenemos que mantener el tubo de corta duracin, y que por lo general el uso de tubos de dimetro muy estrecho: 0.010 pulgadas de dimetro interno (o "diez milsimas") es el tubo de tamao normal para esta parte del sistema (tubos pequeos puedan ser necesarios para su uso

25

con "microbore" columnas; tubos ms grandes slo deben utilizarse con preparativa columnas

Hablemos acerca de los prximos accesorios utilizados en LC. Estos se denominan accesorios de compresin y su diseo se ilustra a continuacin.

Un pedazo de tubo es la primera equipada con un ferrul avellanas y como se muestra en la derecha. Para este fin de conectar el tubo con otro montaje (la columna final, una T, conector, etc) por primera vez, slo tornillo en la tuerca de la instalacin. Tenga cuidado de no a la instalacin en exceso.

Generalmente la tuerca debe apretarse dedo de la mano firme y, a continuacin, un 3 / 4 de una vuelta (270 grados en sentido horario) con una llave.

Al volver a una instalacin existente (al cambiar las columnas, por ejemplo), la tuerca debe apretarse el dedo apretado y, a continuacin, snugged ligeramente con una llave para evitar fugas.

Instalacin estndar de compresin utilizada en HPLC.

Lamentablemente, no todas las piezas son intercambiables. Este es un gran dolor de cabeza para la mayora de los trabajadores LC, pero tenemos que vivir con ella por el momento. Normalmente coincide piezas parecen funcionar, y esto hace la situacin an peor. Esto es, las piezas se parecen ir de la mano de la forma habitual. No obstante coincide accesorios no funciona correctamente. La razn es que la principal diferencia en estas instalaciones es la distancia entre el tubo y la virola final, como se muestra en la derecha.

26

Nota la diferencia en la distancia desde la parte inferior de la virola hasta el final del tubo en estos tres extremos del tubo montado con los accesorios de

diferentes fabricantes.

Los accesorios para los extremos de la columna son similares a tubos de accesorios. Una virola y tuerca en la columna celebrar la columna en el montaje final - al igual que la tubera se conecta juntos. Debido a que la columna est llena de pequeas partculas de la columna de embalaje, es necesario tener una forma de mantener estas partculas en la columna. Esto se suele lograr con un fritas - un pequeo, moneda en forma de pieza de metal sinterizado tener estrechos poros. La mayor parte de las columnas fritas son nominalmente de 2 micras de porosidad, aunque ms pequeas fritas (0,5 micrones) se usan para las columnas de partculas muy pequeas (3-micrones de dimetro).

27

Si se desconecta la columna final del montaje, podemos ver las fritas en la parte superior de la columna. Este fritas pueden ser removidos y

reemplazados con un nuevo fritas si se convierte en la antigua fritas conectado. Sin embargo, si hacemos esto, tenemos que ser muy cuidadoso. Si la columna de embalaje en la entrada se ve perturbado, podra arruinar la

columna permanente.

6. Detectores de HPLC [5]

El detector mide la concentracin de la muestra, ya que bandas de la columna y dejar pasar por el detector de flujo de clulas. Cuando no es la banda que pasa por el detector, una constante de la seal se registra - llamada la lnea de base del cromatograma o detector. Cuando una muestra llega a la banda del detector, el detector responde a la diferencia en la fase mvil propiedades causados por la presencia de la muestra compuesta, dando lugar a un cambio en la seal del detector, considerado como un pico.

28

Cmo funciona el Detector de trabajo? En la mayora de los casos que vamos a utilizar un detector fotomtrico, comnmente llamado detector de UV. En su forma ms simple, se trata de una fuente de luz, una celda de flujo (o "muestra de clulas"), y un sensor de luz, como se muestra en la derecha

Diagrama esquemtico simplificado de un detector de UV.

Cuando no se muestra fluye a travs del detector, la luz pasa a travs de la clula de flujo mximo y genera una seal en el sensor de luz. Si una muestra de la banda entra en el detector, la muestra se reduce la cantidad de luz alcance el sensor y provoca un cambio en la seal del detector. Esta seal est invertida electrnicamente por el sistema de datos resultante de la aparicin de un pico en el cromatograma. La seal muestra aumenta en proporcin a la concentracin de la muestra en la celda de flujo. El detector tambin responder a otros cambios en el contenido de la celda de flujo. Por ejemplo, si las partculas o "polvo" se encuentran atrapados dentro de la celda de flujo, estos se interrumpa el paso de la luz a travs de la clula de flujo y causa un cambio en la lnea de base. O una burbuja de aire puede ser atrapado en la celda de flujo, causando un gran cambio en la cantidad de luz de paso. En este caso, la seal puede pasar completamente fuera de escala y, a continuacin, volver a la base de referencia si la burbuja pasa a travs de la clula.

Dos tipos de detectores de radiacin UV se utilizan hoy en da:

De longitud de onda variable (a veces llamado "espectrofotomtrico" detectores de

Fotodiodo Array (a veces simplemente llamada "red de diodos" detectores.

Los De longitud de onda variable detectores son menos costosos, son el tipo de detector de nivel de anlisis cuantitativos y ensayos de rutina. Los de Fotodiodo gama son ms verstiles, porque permiten la adquisicin simultnea de ambos y de cromatografa de informacin espectral, que se utilizan habitualmente en el mtodo de desarrollo.

El detector de longitud de onda es una caracterstica importante de una separacin por HPLC. Como regla general, la longitud de onda se ajusta a la mxima absorbancia del analito. Uso de la longitud de onda equivocado

29

puede resultar en disminucin de tamao de pico, o incluso no en todos los picos

Debido a los diferentes compuestos pueden tener diferentes espectros de absorcin, una comparacin cuantitativa de los diferentes picos en el cromatograma mismo puede ser engaosa. Una pequea cantidad de un compuesto que absorbe fuertemente en el detector de longitud de onda puede dar un pico ms grande que una gran cantidad de una absorcin deficiente. Cuantificacin fiable, una calibracin debe llevarse a cabo con un conocimiento exacto de la cantidad de compuestos que se van a analizar.

El Detector de rayos UV de longitud de onda variable utiliza un monocromador (aberturas y una rejilla) para seleccionar una

longitud de onda de la luz para pasar a travs de la muestra de clulas.

La matriz de detectores de fotodiodo pasa todas las longitudes de onda de la luz a travs de la muestra de clulas y, a continuacin, se

centra cada longitud de onda en un nico sensor de elemento.

Hay una serie de otros controles o ajustes para el detector, que pueden ser incorporadas en el propio detector, o pueden ser parte del sistema de datos:El tamao de todos los picos en el cromatograma puede cambiarse usando el atenuador o ajustes de gama. La atenuacin de la escala por lo general se refiere al tamao de un pico que aparecer como un pico de escala completa en la pantalla. Esta escala se mide en unidades de absorbancia (que es proporcional a la concentracin de la muestra), que se expresa a menudo

30

como "Unidades de Absorbancia escala completa" (AUFS). La figura de la derecha ilustra el efecto de un cambio en la atenuacin. Como el ajuste es el aumento de la atenuacin (AUFS se reduce), se convierte en el detector ms sensible, y todos los picos de aumento de tamaoEn muchos sistemas, el rango o la atenuacin se puede establecer ya sea en el detector o en el propio sistema de datos. Si la atenuacin o la gama se encuentra en el sistema de datos, por lo general afecta slo a la pantalla. No cambia la forma de cuantificacin se lleva a cabo porque no cambia la informacin presentada en el sistema de datos. Si la atenuacin o la gama se sita en el propio detector sin embargo, es posible que el gran tamao de los picos puede superar las capacidades de los datos del sistemaOtro ajuste es el detector de Base Cero (a veces llamado el "Cero offset"). Mover este ajuste (que se muestra a la derecha) se limita a desplazar la totalidad del cromatograma arriba o hacia abajo en la pantalla. Al igual que con la atenuacin de configuracin, si se ajusta el cero en el sistema de datos, que slo afecta a la pantalla; cuantificacin se mantiene sin cambios. Si la lnea de base cero se cambia en el detector en s, la integracin puede verse comprometido si la base de referencia se compensa suficientemente bajo para enviar una seal de voltaje negativo a los datos del sistema (la mayora de los sistemas de datos slo puede tratar con seales de voltaje positivo).

Diversos tipos de detectores de HPLC

Existen varios detectores disponibles en el mercado. Sin embargo detector UV-VIS, Foto-detector por red de diodos, detectores de fluorescencia, y Conducta mtricas coulometric detector son ms comnmente utilizados. El nuevo detector de ELSD est demostrando ser importante detector, mientras que la MS como detector es sobresaliente.

31

7. HPLC Data Systems .. [6]

Un sistema de cromatografa de datos es bsicamente un equipo que ejecuta software especializado diseado para integrar y picos cromatogrficos corresponden altura o rea del pico a la cantidad de analito presente en la base de datos de calibracin. En muchos casos, el software incluir la base de datos y estadstica adicional para mejorar la capacidad de anlisis, el almacenamiento y la presentacin de la informacin.

En su forma ms fundamental, un cromatograma es simplemente un registro de la parcela o una seal de tensin en funcin del tiempo. En un buen funcionamiento del detector de UV (por ejemplo), este voltaje es directamente proporcional a la absorbancia de los efluentes en el detector de celda.

Detectores diferentes y su comparacin

Suponiendo que la cerveza tiene el derecho-Lambert, esta absorbancia ser directamente proporcional a la concentracin de la absorcin de las especies (el analito), lo que significa que el cromatograma es (indirectamente) una parcela de muestra de la concentracin frente al tiempo. Suponiendo que la fase mvil a travs del detector de flujo es constante, el volumen de la fase mvil se bombea directamente proporcional al tiempo transcurrido. Por lo tanto, es el cromatograma (ms indirectamente) una representacin de la concentracin frente al volumen. Medir el rea bajo el pico asciende a medir el producto de la concentracin veces el volumen, que es proporcional a la masa (o moles) del analito.

El trmino "integracin" se refiere al proceso de medicin de la zona comprendida en virtud de un pico cromatogrfico. Esto se logra mediante la adicin de la tensin de las mediciones efectuadas en la igualdad de los intervalos de tiempo entre el inicio y el final de la cumbre, y luego restando una "correccin trapezoidal" para corregir el desplazamiento de la cromatografa de referencia a partir del verdadero cero de referencia, as como la deriva.

HPLC, Detector de

RI UV / VIS Fluor MS

Respuesta Universal Selectiva Selectiva Selectiva

Sensibilidad 4 microgramos 5 nanogramos 3 picogramo 1 picogramo

Rango lineal 10 10 10 10 Flujo sensibles S No No S Temp. Sensible S No No No

32

APLICACIONES

La cromatografa lquida de alta presin a pesar de ser una tcnica relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la literatura qumica. En la mayora de los casos, stas consisten en determinaciones de sustancias cuyo anlisis por otra tcnica cromatogrfica resulta muy difcil. Estos resultados comprenden:

Compuestos inicos: como aminocidos, sales inorgnicas, cidos orgnicos, etc.

Compuestos de alto peso molecular: como polmeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.

Compuestos termolbiles y no voltiles: como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacuticos.

En los problemas relacionados con la contaminacin ambiental, la HPLC se utiliza para la contaminacin de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, hervicidas, etc.). Tambin es posible la determinacin de hidrocarburos aromticos polinucleares que son contaminantes atmosfricos muy importantes

33

En cromatografa lquida el anlisis de compuestos vitamnicos es posible en corto tiempo.

El anlisis de medicamentos es tambin una aplicacin muy interesante, la determinacin de los componentes activos de una tableta analgsica. Tambin el anlisis de barbitricos, anticonceptivos, etc. [9]

1. DETERMINACIN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTNEOS POR CROMATOGRAFA

LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

INTRODUCCIN

Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneos se efectu la validacin de la metodologa para la determinacin de la vitamina A por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Con los resultados obtenidos se demostr que el mtodo en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control de calidad de dichos alimentos.

Como sabemos la Vitamina A es el nombre genrico utilizado para describir al retinol, sus steres y los correspondientes ismeros.

La vitamina A no es ms que un alcohol polinico isoprenoide que se conoce tambin con otros nombres como axeroftol, biosterol, vitamina antixeroftlmica y vitamina antiinfecciosa.

Del retinol derivan por oxidacin el retinal y el cido retinoico.

El 11-cis-retinal juega un papel decisivo en el proceso visual.

En los vegetales y en algunos organismos marinos, encontramos a la vitamina A como provitamina A en la forma de caroteno, pigmento amarillo constituido por dos molculas de retinal unidas en el extremo aldehdo de sus cadenas carbonadas.[7]

34

Vitamina A

Dentro de las principales funciones de la vitamina A encontramos la proteccin de la piel y su intervencin en el proceso de visin de la retina. Tambin participa en la elaboracin de enzimas en el hgado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El dficit de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en los ojos y en la piel, y afecciones diversas de las mucosas. Mientras que por otro lado el exceso de este puede provocar alteraciones seas y hemorragias en diversos tejidos.

La vitamina A se encuentra principalmente en productos lcteos, mantequilla, queso, huevos, carne, hgado y aceite de hgado de bacalao.

Se destruye fcilmente por la accin de la luz, con temperaturas elevadas.

DETERMINACIN DE LA VITAMINA A

Los mtodo espectrofotomtrico y fotomtrico empleados en la determinacin de la vitamina A estn expuestos a interferencias de algunas sustancias como la presencia de los carotenos, derivados y productos de descomposicin de la vitamina A que de alguna forma podran absorber luz en la regin ultravioleta o dar colores similares con los reactivos utilizados en la determinacin fotomtrica. Por ello estos mtodos no son lo suficientemente especficos para determinar esta vitamina, agregado que la confiabilidad de sus resultados dependendern del xito en los pasos de purificacin y los procedimientos de trabajo.

En ese sentido, y buscando una ptima metodologa de anlisis, en el presente estudio se realiz la validacin de la metodologa por HPLC para la determinacin de vitamina A contenida en alimentos infantiles instantneos.

MATERIALES Y METODOS

35

cido Retinoioo

B Caroteno

A. EQUIPO

Equipo de cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC), de marca Shimadzu, modelo LC10A.

Inyector automtico. Bomba con sistema de degasificacin. Integrador o sistema de registro Software para el procesado de datos cromatogrficos. Detector de arreglo de diodos (longitud de onda variable). Columna cromatogrfica de acero inoxidable LC-18 para fase

reversa (25 cm. x 4,6 mm de dimetro interno, 5mm de dimetro de partcula, con columna de cartucho C18 de marca Supelco)

B. CONDICIONES DE OPERACIN

Sistema isocrtico Flujo 1,2 mL/min Volumen de inyeccin

20ml Deteccin UV 242 nm Temperatura de horno Ambiente Tiempo de corrida 7

min Fase mvil: metanol al

100% grado HPLC.

C. REACTIVOS

Metanol grado HPLC ( Merk) Estndar all-trans Retinol: Vitamina A (Sigma) Hexano p.a. (Merck) Etanol absoluto p.a. (Merk) Solucin de hidrxido de potasio al 50% BHT Acido Ascrbico (antioxidantes) Agua tridestilada o grado HPLC Solucin stock estndar de vitamina A: Se disolvieron 100

mg del estndar en 100 mL de etanol absoluto, con aproximadamente 0,002 g de BHT, y se guard la solucin en congelacin (-20 C)

36

D. PROCEDIMIENTO

Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil un recipiente de base plana y se adicion 70 mL de etanol absoluto. Ambas mezclas se colocaron en los tubos de reflujo y se agit hasta su ebullicin con corriente de nitrgeno.

Luego, se adicion 20 mL de solucin de KOH al 50% saponificando la mezcla por 30 minutos con agitacin moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuag el contenido con 50 mL de agua en 3 porciones.

La solucin se enfri a temperatura ambiente y luego se filtr al vaco, colocndose rpidamente el contenido en un embudo de decantacin de 250 mL al cual se le adicion 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extraccin.

Se agit la mezcla por 20 segundos y al separarse se evidenci la formacin de la fase orgnica (en la parte superior), el cual se transvas a un baln de 250 mL de base redonda que contena aproximadamente 0,5 g de BHT cido ascrbico. Se efectu dos veces ms la extraccin y se juntaron los extractos en el baln de 250 mL.

Se evapor a sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor con bao de agua a 40C.

Se diluy inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se llev a volumen en un matraz volumtrico de 10 mL.

Finalmente, se pas la solucin final por un filtro de 0,2mm, llenndolos en viales mbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatgrafo.

E. CLCULOS

Donde: Am (Area del pico de vitamina A en la muestra)As (Area del pico de vitamina A en el estndar)Cs (Concentracin de vitamina A en el estndar, mg/ml)D (Factor de dilucin)Wm (Peso de la muestra, g)

37

Concentracin de Vitamina A ( mg/g ppm ) = Am x Cs x D As Wm

F. RESULTADOS

En la Figura 1 podemos observar los cromatogramas representativos de dos concentraciones (una mayor y otra menor) de vitamina A para la curva de calibracin. El tiempo de retencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min., siendo el tiempo total de anlisis para una muestra de 7 min.

La respuesta de deteccin fue lineal en el rango de concentraciones de 5 15 mg/g (Figura 2), obtenindose un coeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccin del mtodo en base a la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/g y el lmite de cuantificacin de 0,58 mg/g. El perfil de la precisin que se obtuvo en 16 determinaciones por analista en dos das diferentes, fue: CV de repetibilidad de 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs. en tanto, el mtodo oficial de la AOAC

(CV de 3,62%); el CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs. el obtenido por el mtodo oficial (de 9,72%).Los resultados de la precisin del sistema, basados en la variacin del tiempo de retencin, rea y altura; se muestran en la Tabla 1. La recuperacin obtenida fue de 97,98%Vs. la obtenida por el mtodo oficial de la AOAC (de 98,8%).

38

La especificidad del mtodo se muestra en la Figura3, donde se observa la ausencia de interferencias debido a la adecuada extraccin del analito, y adems se muestra la comparacin del espectro del estndar puro vs. el espectro del analito en la muestra.

G. DISCUSIN

Esta metodologa propuesta para la determinacin de la vitamina A por HPLC tiene la ventaja de que el tratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo, en relacin al mtodo oficial de la AOAC 992.06 VitaminaA (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Adems, la columna que se utiliza en el mtodo propuesto (C18) es ms comercial que la columna del mtodo de la AOAC (ciano), ya que esta ltima trabaja en fase normal siendo, por tanto, ms difcil de controlar y por la naturaleza no polar del extracto, se debe usar cromatografa en fase reversa.

El tiempo de corrida en esta metodologa es ms corto (7 minutos), comparado con el mtodo oficial que es de 10 minutos. Estas caractersticas contribuyen al menor costo del anlisis. Es necesario tener presente que tanto la saponificacin, la isomerizacin y la ruptura de la vitamina A son retardadas por la adicin del antioxidante (cido ascrbico) y el uso de nitrgeno, el cual interfiere con los agentes de oxidacin presentes. Asimismo, el retinol y sus steres son rpidamente destruidos por la luz, el oxgeno y los cidos,

39

por lo que deben almacenarse en frascos mbar o cubiertos con papel platino o su equivalente.La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidacin, evitndose la luz solar directa y la luz brillante. La iluminacin artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberan realizarse en material de vidrio mbar para prevenir la degradacin.Dado que el calor tambin contribuye a la isomerizacin o a una posterior alteracin de las vitaminas, debera evitarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la evaporacin de los solventes se realice lo ms suave posible utilizando un evaporadorrotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfriamiento adecuado de los condensadores y un vaco ptimo. [8]

H. CONCLUSIN

De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos concluir que el Mtodo de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Mtodo para la Determinacin de Vitamina A (retinol) en alimentos infantiles instantneos por HPLC es preciso, exacto, especfico y sensible para los parmetros evaluados en este estudio, ya que se encuentran dentro de los rangos establecidos.

2. ANALISIS COMPARATIVO POR CCD Y HPLC DE ALCALOIDES PRESENTES EN PRODUCTOS COMERCIALES A

BASE DE UA DE GATO

40

INTRODUCCIN

En el presente trabajo se realiz el anlisis comparativo de 10 muestras comerciales de ua de gato, por Cromatografa de Capa delgada (CCD) y por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), observndose la presencia de los alcaloides oxindlicos con el mismo perfil cromatogrfico que la muestra patrn. Se determin el contenido de alcaloides totales por HPLC comparando la concentracin de alcaloides ingeridos por el usuario de acuerdo a las dosis recomendadas por los fabricantes.

La Uncaria tomentosa (Willd) DC (Rubiaceae) conocida comnmente como ua de gato al igual que la Uncaria guianenis contienen una diversidad de compuestos, incluyendo alcaloides tetracclicos y pentacclicos, glicsidos triterpnicos, esteroles, flavonoides y procianidinas.

MATERIALES Y MTODOS

Anlisis por CCD

Diclorometano Cloroformo Acetato de etilo Cromatofolio de

Silicagel 60 F254 (Merck) (20 x10)

Anlisis por HPLC

Agua Acetonitrilo Metanol Fosfato bsico de

potasio Fosfato dibsico de

sodio anhdrido

Las muestras analizadas fueron adquiridas en el mercado local, y las contra muestras se depositaron en el laboratorio (M1 a M10, todas cpsulas excepto M7 que es comprimido).

Los estndares Mitrafilina, Peropodina e Isopteropodina fueron aislados en el laboratorio, su identidad y pureza fueron confirmadas por mtodos cromatogrficos (CCD, HPLC), comparadas con

41

muestra de referencia, y por los datos publicados.[10]

PREPARACIN DE LA MUESTRA

Anlisis por CCD

Los productos comerciales deben estar previamente molido.

1g de cada producto comercial se humedece con NH4OH al 10%.

Extraer con 5ml de diclorometano.

Secar con Sulfato de sodio anhdrido.

Aplicar 25 ml de la muestra.

Anlisis por HPLC

Los productos comerciales deben estar finamente molidos.

250mg del producto comercial fueron extrado por 5 veces con 5 ml del sistema extractante Metanol:Agua:cido clorhdrico 1.2 M (50:50:1) por sonificacin durante 15 min.

Filtrar los extractos. Combinar con 25 ml

de la solucin extractante.

Tomar una parte de la solucin muestra y agregar con cuatro parte del buffer fosfato.

CALIBRACIN

2.00 mg de isopteropodina estndar fue disuelto en 50 ml de Metanol, a partir de l cual se prepararon las soluciones diluidas en un rango de concentracin de 0.5 a 20.00mg/ml. La curva de calibracin se realiz por triplicado. Se observ linealidad de respuesta del detector en el rango mencionado, con un factor de correlacin (R2) de 0.99827.

42

MTODO ANALTICO

Anlisis por CCD

Se llev a cabo por comparacin con los estndares Mitrafilina (MI), Isopteropodina (IP) y Pteropodina (P). El sistema de elusin fue CHCl3:EtOAc en las proporciones 8:2, 7:3, y 6:4; desarrollados en forma consecutiva. Se revelaron con la luz UV a 254 nm y reactivo de Dragendorff.

Anlisis por HPLC

Fueron realizados e un equipo Merck Hitachi, sistema HPLC LaChrom-700, equipado con un detector de arreglo de fotodiodos (Merck Hitachi L 7450 a). Para todas las

43

separaciones se trabaj con una columna Ultrasphere ODS (Beckman, 150X4.6 mm, 4mm) y guarda columna (ODS). La fase mvil consisti de Acetonitrilo(A) y de un buffer fosfato 10nM (B) ajustado a p H 7.0, en la longitud de deteccin a 245 nm

y fueron aplicado 20ml de cada muestra. Todas las separaciones se llevaron a 30C. Los picos fueron asignados por superposicin con las muestras estndares y por comparacin con los tiempos de retencin y espectros UV.

RESULTADOS

Anlisis por CCD

Para el anlisis por CCD, los cromatofolios fueron revelados por luz UV 254 nm y reactivo de Dragendorff. Con los sistemas de elusin se ha obtenidos muy

buena resolucin de los alcaloides Mitrafilina (Rf=0.35), Pteropodina (Rf=0.65) e Isopteropodina (Rf=0.74), permitiendo la identificacin

44

inequvoca de stos por CCD.

Anlisis por HPLC

Los cromatogramas de una muestra de Uncaria tomentosa estndar y de una de las muestra analizadas (M6). Los alcaloides pudieron ser separados con una resolucin no menor del 90% para la isopteropodina y el alcaloide 4, a una temperatura de 30C en un tiempo de 30min.

45

El lmite de deteccin encontrado fue de 0.07 mg/ml para el compuesto estndar Isopteropodina.

Para la extraccin de los alcaloides se ha evitado el uso de cido-base, pues est comprobado que produce su isomerizacin. La extraccin con solucin extractante por 5 veces por sonificacin cada vez, asegura una extraccin total de los alcaloides

3. DETERMINACION DE TOCOFEROLES POR HPLC EN ACEITE DE QUINUA (Chenopodiun quinoa) Y KAIWA

(Chenopodium pallidicaule)

INTRODUCCIN

El siguiente trabajo tiene como investigacin la caracterizacin de la fraccin lipdica de la quinua y kaiwa.La quinua y la kaiwa, son cultivos andinos muy poco estudiados pero que sin embargo nos muestran que son alimentos ricos en protenas con un buen balance aminoacdico.Con el objetivo de determinar el contenido de tocoferol en estos aceites se analizaron especialmente a y g tocoferoles. Los aceites vegetales son ricos en Vitamina E La forma mas abundante y potente de la Vitamina E es el alfa-tocoferol.El beta-tocoferol, ganma-tocoferol y delta-tocoferol tienen tambin poder vitamnico y se encuentran, junto con el alfa-tocoferol en los aceites vegetales. Los aceites ms ricos en tocoferoles son los aceites de germen seguido del aceite de soya.Sus efectos en el hombre es el de disminuir la tasa de colesterol en la sangre [11]Entre los tocoferoles, el alfa-tocoferol tiene la actividad vitamnica E ms elevada y la menor actividad antioxidante. Las actividades antioxidantes de otros tocoferoles en orden decreciente son: delta, beta o ganma, y alfa.

La mezcla de ismeros del tocoferol como el alfa-tocoferol son aditivos para mejorar el efecto antioxidante en alimentos. [12]

La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) ha sido empleada para determinar tocoferoles en los aceites vegetales. En los ltimos aos, la introduccin de la cromatografa lquida de alta presin, juntamente con la deteccin por fluorescencia, permiten una determinacin ms precisa.

MATERIALES Y METODOS

A. ESTANDARES

47

Tocoferol pureza 99.9% preparada a una concentracin de 40ppm en hexano.

Tocoferol pureza de 99.9 % preparada a una concentracin de 40ppm en hexano.

B. MUESTRA

Aceite crudo de quinua Aceite de kaiwa

C. CONDICIONES

Columna: C18 de fase reversa El mtodo consiste en una gradiente lineal y

gradiente isocrtico siendo:

Solvente A: Metanol Solvente B: Acetato de etilo Velocidad de flujo de la fase mvil: 1,5 mL/min Detector: Espectrmetro de Fluorescencia.

D. TECNICA ANALTICA

Los 5 ml de las muestras de aceite en 100 mL de hexano.

E. RESULTADO

Los cromatogramas obtenidos durante la corrida por HPLC para el los aceites de quinua, kaiwa y el estndar se muestran en las figuras 1,2 y 3 respectivamente.

De acuerdo a la concentracin del estndar y a el rea de los picos, las concentraciones de a y g tocoferol en cada uno de los aceites fueron los siguientes:

Para quinua :

48

de 797.2 ppm de g tocoferol y 721.4 ppm de a tocoferol

Para kaiwa:

788.4 ppm de g y 726 ppm de a tocoferol.

Los tocoferoles existen en la naturaleza como cuatro diferentes ismeros cuyo poder antioxidante en orden en el aceite es de : d > g > b > a , siendo ligeramente superior la concentracin de g tocoferol en los aceites obtenidos, si lo comparamos con el maz que tiene 251 ppm de a tocoferol y 558 ppm, de g tocoferol , el contenido en aceite de quinua y kaiwa es mayor, garantizndonos mayor tiempo de conservacin por el poder antioxidante del g tocoferol.

Por otro lado tenemos el contenido de a tocoferol que tiene mayor poder como vitamina E siendo esta vitamina el mejor antioxidante a nivel de membranas en las clulas y protege los cidos grasos de las membranas de los daos causados por los radicales libres. Los radicales libres son molculas inestables que tienen un electrn no apareado, el cual lo hace altamente energizado y reactivo, estos buscan a otros electrones, provocando reacciones en cadena que daan las clulas y al DNA, hasta que ellos regresan a su estado estable.[13]

49

50

Cromatograma obtenido en la determinacin de a y g tocoferoles por HPLC en el aceite de kaiwa

Cromatograma obtenido en la determinacin de a y g tocoferoles por HPLC en el aceite de quinua

51

Cromatograma estndar en la determinacin de a y g tocoferoles por HPLC

CONCLUSIONES

Una de las principales ventaja de esta tcnica frente a otras metodologas analticas clsicas es su especificidad, permitiendo la separacin, identificacin y cuantificacin de los componentes orgnicos ms complejos.

La HPLC analtica ha adquirido una especial importancia en el campo de la investigacin y desarrollo cientfico, encargndose del control de calidad farmacutico y el anlisis medioambiental.

Concluimos que unas de las caractersticas ms resaltantes del HPLC es su alta resolucin, su reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de automatizacin que presentan; lo cual la hace ser una de las tcnicas ms empleadas en el anlisis de diversas formulaciones cosmticas y alimentarias.

52

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

[1] Depsito de disolvente. [Consulta: 28 de junio del 2009]

[2] Bomba HPLC. 22 de Febrero del 2009. . [Consulta: 26 de junio del 2009]

[3] Puerto de inyeccin. 21 de Marzo 2006. .[Consulta: 27 de junio del 2009]

[4] Columna HPLC. 30 de Diciembre 2005. .[Consulta: 27 junio del 2009]

[5] Detectores de HPLC. 18 de julio 2008. .[Consulta: 27 junio del 2009]

53

[6] HPLC Data Systems. 16 de Abril 2008. .[Consulta: 27 junio del 2009]

[7] Nutiinfo.com Vitamina A en pigmentos vegetalesa fuente de informacin confiable. [En lnia] [http://www.nutrinfo.com/pagina/info/vita0.html]. 20-05-2000

[8] Prez Caldern, Ruth. Estudio de Validacin de la Metodologa para la Determinacin de Vitamina A en Alimentos Infantiles Instantneos por Cromatografa Lquida De Alto Rendimiento (HPLC). Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica. Instituto Nacional de Salud (Per) Lima, Per.2000. Disponible en: [http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/html/363/36317406/36317406.html]

[9] Beck, Cristina Soledad; Ibarra, Ariana. Cromatografa lquida de alta performance. Soledad Ibarra, Ariana, 2006. [27/06/2009]

[10] Villegas V., L. F.; Sing de Ugaz, O. L.(eds.). Anlisis comparativo por CCD y HPLC de alcaloides presentes en productos comerciales a base de "Ua de gato" . Primera reunin internacional del gnero Uncaria "Ua de gato". Iquitos (Per). 2001. p. 114 - 121.

[11] PRIMO, E. 1997 Qumica de los Alimentos. Madrid: Edit. Sntesis S.A Espaa, 1994. p. 154-156.

[12] DECKER, E. and ZHIMIN X. 1998 Minimizing Rancidity in Muscle Foods. Food Technology. Vol. 52 No. 10. USA.. p 210-214

[13] Clara Raquel Espinoza Silva, Ritva Repo Carrasco Valencia, &.S-E. Jacobsen. Determinacin de Tocoferoles por HPLC En Aceite De Quinua (Chenopodiun Quinoa) Y Kaiwa (Chenopodium Pallidicaule). Organizacin de Las Naciones Unidas para La Agricultura y La Alimentacin. Disponible en: [27/06/2009]

54

55