PRCTICA # 1 CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDIMETRAOBJETIVO: Explicar el fundamento de las tcnicas ms utilizadas en el recuento microbiano. Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicacin de diferentes mtodos. Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variacin de estos.

INTRODUCCINPara trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza. Para el aislamiento se de organismos utilizan medios slidos (agar. Ventajas) o lquidos. Medios slidos: siembra (extensin o vertido) en placa. Separacin e inmovilizacin de organismos de forma individualizada en un medio nutritivo slido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. Mtodo: diluciones consecutivas de la muestra. Medios lquidos: Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Mtodo de la dilucin lmite. Medios selectivos: Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo especfico. Se emplean cuando el organismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. Pueden utilizarse para: - Enriquecer: medios lquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento ms elevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas - Aislar directamente: medios slidos que permiten aislar colonias. Suelen llevar un inhibidor que impide el desarrollo de los dems microorganismos. Los mtodos de aislamiento microscpicos tienen poca (o nula) utilidad en Microbiologa. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede expresar en funcin de: Aumento del nmero de clulas aumento de masa del cultivo Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo). Cuantificacin de microorganismos: Recuento de viables: Se utiliza una tcnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en placas (30-300 bacterias/placa). Recuento de totales. Medida del nmero de clulas: - Directo mediante microscopio (cmaras de recuento de Newbaver). - Contador electrnico de partculas (contador de Coulter) Medida de la masa celular. - Turbidimetra (densidad ptica). Se utiliza un colormetro (Repasar la ley de Lamber- Beer: A= bC, o log Ii/It = k*C). Es el mtodo ms utilizado. Peso seco Medida de la masa celular

Mtodos Directos: En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas.

1) Determinacin del peso hmedo: se tara un tubo de centrfuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.

- Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. 2) Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. - Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3) Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl. 4) Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, ATP, clorofilas en organismos fotosintticos, etc. Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros mtodos ms fciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

Mtodos Indirectos:

1) Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos. 2) Mtodos turbidimtricos (pticos). Son muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio. La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo. a) Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a travs de la suspensin). Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema; La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamao de la partcula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la tcnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml. b) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.

Mtodo nefelomtrico: Determinar la concentracin de bacterias en UFC/ml, utilizando la Tabla Solucin de BaCl2 al 1,0% ml Solucin de H2SO4 al 1,0% ml Escala de McFarland UFC Millones/ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 4,0 3,7 3,5 3,4 3,3 3,2 3,15 3,10 3,04 3,00 300 600 900 1 200 1 500 1 800 2 100 2 400 2 700 3 000

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Diluir la suspensin bacteriana con solucin salina estril al 0,85%, a la transmitancia o turbiedad elegida, de acuerdo con la concentracin de bacterias establecida. Medida del nmero de individuos Mtodos Directos:

1)

Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: excavacin con 0.02 mm de profundidad; rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes; cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeos. O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeos). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml. - Ventajas: es un mtodo muy rpido. - Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10 6 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2) Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 m dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula). Hay que usar suspensiones absolutamente libres de partculas extraas (las pequeas seran contabilizadas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato). Mtodos Indirectos

1)

Recuento de viables en placa: Los mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre clulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una clula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido (con agar). Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. Precauciones: para minimizar los errores estadsticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin; hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin; contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias. Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de ms de un individuo (y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o ms clulas), el recuento se refiere no a clulas viables reales sino a unidades formadoras de colonia (UFC). Por lo tanto, una UFC corresponde, como mnimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembra en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada UFC puede corresponder a dos o ms individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa. 2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

MATERIAL

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10 Tubos de 16x150 con tapn de baquelita 10 Tubos de 16x150 con tapn de baquelita conteniendo 20, 18, 16, 15, 12, 10, 7.5 y 5ml de caldo nutritivo estril 1 pipeta 1ml 1 pipeta 10ml 5 pipetas estriles de 5, 10 y 20ml Un espectrofotmetro con su celdasREACTIVOS:

Solucin salina Cultivo de Escherichia Coli en caldo nutritivo Solucin de cloruro de bario al 1% cido sulfrico al 1% Caldo nutritivo estril PROCEDIMIENTO: 1.- Escala de McFarland o Identifique los tubos con las claves indicadas en la tabla o Con la bureta de 1ml, agregue a cada uno de los tubos el volumen de bario indicado en la tabla. o Con la bureta de 10ml, agregue a cada tubo los volmenes correspondientes de cido sulfrico. o Con el espectrofotmetro determine la turbiedad de las diferentes mezclas. Para ello calibrar el aparato con un tubo que contenga agua. o Graficar las lecturas, colocando en la ordenada los valores de densidad ptica registrados y en las absisa el nmero aproximado de bacterias representado. Clave del Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 1% MI 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 H2SO4 1% MI 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 No. Aproximado de bacterias Representadas x 106/ml 300 600 900 1,200 1,500 1,800 2,100 2,400 2,700 3,000 D.O. Terico 0.602 0.568 0.544 0.532 0.519 0.505 0.498 0.491 0.483 0.477 D.O. Experimental 0.906 0.935 0.928 0.928 0.927 0.917 0.955 0.955 0.958 0.953

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Escala de McFarland (TERICA) 1 0.9 0.8 0.7 D.O. 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1500 3000 1800 300 600 900 1200 2100 2400 2700

No. de aprox. de bacterias representadas x 100000/m l

Ecala de Mc Farland

2.- Lectura de problemas: o Identificar los matraces que contienen diferentes volmenes de medio de cultivo o En condiciones de asepsia agregar a cada matraz el volumen necesario del cultivo Escherichia Coli para obtener un volumen total de 20ml, mezclar el contenido. o Proceder a determinar la turbiedad con el espectrofotmetro. Ajustar el aparato a cero, empleando caldo nutritivo estril. Tubos con caldo nutritivo inoculados (ml) 20 18 16 15 12 10 7.5 5 A Blanco 0.880 0.877 0.884 0.896 0.885 0.892 0.892

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CURVA DE CALIBRACIN

1 0.8D.O.

0.6 0.4 0.2 0 300 600 900 1,200 1,500 1,800 2,100 2,400 2,700 3,000No de Microorganism os Escala de Mc Farland D.O. experimental

DISCUSIN DE RESULTADOS: Se realiz la escala de McFarland para la determinacin y cuantificacin del nmero de microorganismos existentes en los caldos preparados, sin embargo, estos valores nos dieron muy altos posiblemente debido a que el espectrofotmetro se encontraba descalibrado, as que se averiguo cules eran los valores tericos para esta escala y estos se muestran en la tabla de resultados, junto a los resultados experimentales, observndose as la gran diferencia que se encontr entre los valores. Debajo de la tabla se puede observar la curva terica de Mc farland. En la segunda grfica se observan los resultados obtenidos de las muestras para realizar la escala de Mc Farland en la misma grfica que los resultados tericos y ya que los datos no se podan interpolar, se realiz una tercera grfica que se encuentra despus de la tabla con los resultados de las Absorbancias obtenidos de las muestras problema, en la cul se prolongo la grfica hacia el cero para poder interpolar los resultados, adems de que se tuvo que hacer una recta para que se extendiera la grfica y de esta manera los puntos coincidieran y que de esta manera los resultados nos dieran el nmero de bacterias aproximado que se contena en los tubos de los cules los resultados aproximados para los tubos fueron:

18ml 480 x106 M.O. 16ml 420 x106 M.O. 15ml 600 x106 M.O. 12ml 930 x106 M.O. 10ml 840 x106 M.O. 7.5ml 900 x106 M.O. 5ml 900 x106 M.O.

Estos resultados, no pueden ser muy confiables debido a que hubieron varios errores de muestreo comolo fueron el hecho de que los trasvasados, diluciones, tubos de la escala, lecturas, etc. No se realizaran por la misma persona, y en el caso de los tubos de Mc Farland no se realizara con las pipetas volumtricas correspondientes al volumen, y que el espectrofotmetro no se encontrara calibrado, lo que caus que los resultados fueran poco confiables y que los resultados de la curva de calibracin diera tan altos y poco certeros. CONCLUSIONES

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Con esta prctica se puede concluir que para lograr un mtodo adecuado de cuantificacin por el mtodo de Mc Farland, hay que tener en cuenta varias variables para realizar adecuadamente el mtodo y prevenir errores, ya que este se basa principalmente en la medicin de la cantidad de luz dispersada otransmitida a travs de un cultivo bacteriano, y si este no es realizado correctamente, entonces los resultados pueden variar desproporcionalemente, adems de que lo ms adecuado para esta tcnica en especial es la utilizacin de un nefelmetro ya que este posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro, sin embargo, no se contaba con uno para la realizacin de la prctica.

REFERENCIAS: http://www2.cbm.uam.es/jlsanz/Docencia/archivos/02.pdf http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934317 http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/181ssa18.html

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