DETERMINACIN DE FACTORES ANTINUTRITIVOSTERMORRESISTENTES EN LEGUMINOSAS.

I: ALCALOIDES

M. MUZQUIZC. BURBANO

C. CUADRADOC. DE LA CUADRA

CIT-INIA,Apdo. 8111, Madrid

RESUMENSe han aislado y purificado, en forma cristalina, los alcaloides quinolizidnicos lupanina y lupinina

a partir de semillas de Lupinas albas y L. luteus con alto contenido en alcaloides. El alcaloide esparlei-na se obtuvo utilizando la tcnica de cromatografa preparativa ultrarrpida en columna. Se han compa-rado dos mtodos de extraccin de alcaloides, cuantifcndose por cromatografa de gases y cromato-grafa lquida de alta resolucin. Para la deteccin de los alcaloides se utiliz la tcnica de cromatogra-fa en capa fina.

PALABRAS CLAVE: LupinasAlcaloides

ABREVIATURAS: CPUC = cromatografa preparativa ultrarrpida en columna; CCF = cromato-grafa en capa fina; CG - cromatografa de gases; CLAR = cromatografalquida de alta resolucin.

INTRODUCCINDentro de las leguminosas que tienen importancia desde el punto de vista ali-

menticio por su alto contenido en protena, existen diferentes factores txicos oantinutritivos que las pueden hacer poco aptas para el consumo humano y animal.Entre estos factores los alcaloides son compuestos termorresislentes que seencuentran principalmente en el gnero Lupinus. Las especies de Lupinus demayor inters desde el punto de vista de la alimentacin humana y animal son:L. albus, L. angustifolius, L. consentira, L. luteus, L. hispnicas y L. mutabilis.

Los alcaloides de las especies del gnero Lupinus son derivados de la quinoli-zidina de variable complejidad, aunque la mayora son bicclicos o tetracclicos.Se encuentran como bases terciarias y como N-xidos en concentraciones quevaran desde niveles indetectables en variedades dulces (genticamente obtenidas)hasta un 3,8 p. 100 en algunas especies amargas de Lupinus albus y Lupinus muta-bilis. (Keeler, 1989; Muzquiz et al., 1989). Las bases terciarias son normalmentesolubles en agua y fuertemente bsicas. Las proporciones relativas de alcaloides

Recibido: 8-1-93Aceptado para su publicacin: 14-5-93Redactor asociado: J. L. Garca Martnez

Invcst. Agr.: Prod. Prol. veg. Vol. H (3), 1993

352 M. MI J/QUI/

en una especie determinada varan con el cultivar, la localidad y las condicionesclimatolgicas.

Uno de los mayores impedimentos para una amplia aceptacin del lupinocomo grano o forraje es, sin duda, la presencia de alcaloides. Los efectos txicosde los alcaloides del lupino no son acumulativos y los alcaloides son rpidamenteexcretados del cuerpo por el rion. Por tanto se pueden ingerir grandes cantidadesde semillas de lupino siempre que la cantidad total de alcaloides presentes noexceda un determinado nivel. En dosis txicas, los alcaloides del lupino puedencausar daos en el sistema nervioso y el exceso puede producir tambin una seriede efectos que incluyen depresin respiratoria y fallo cardiaco (Culvenor et al.,1986). Es por tanto importante conocer la cantidad de alcaloides presentes y losniveles txicos de los alcaloides individuales.

Por otra parte, la ingestin de lupinos tambin puede producir intoxicacinpor lupinosis originada por una hepatotoxina. Durante mucho tiempo se relacio-n la lupinosis con el contenido de alcaloides en las plantas, aunque la lupinosistambin se presentaba despus del pastoreo del lupino dulce. En realidad, la lupi-nosis es debida a las micotoxinas producidas por una contaminacin secundaria dela planta por el hongo Phomopsis leptostromirformis (Culvenor et al., 1986).

Actualmente hay gran inters en encontrar nuevas variedades de Lupinus conbajo contenido en alcaloides. En este sentido, tanto el potencial del mtodo analti-co para discriminar entre diferentes tipos de alcaloides, como su sensibilidad paradetectar bajos niveles son importantes debido a la gran variedad de alcaloidesencontrados en las diferentes especies. (Trugo, Gross, 1989).

El presente estudio examina el contenido total e individual de alcaloides endiferentes especies del lupino utilizando diferentes mtodos de extraccin y cuan-tificacin.

MATERIAL Y MTODOSMaterial vegetal

Las semillas utilizadas para la realizacin de este trabajo fueron cultivares olneas de las siguientes especies: L. albus, L. angustifolius, L. mutabihs, L. luteus yL. hispnicas, procedentes del SIA de Badajoz.

Los patrones de alcaloides utilizados fueron: perclorato de lupanina y 13-OHlupanina (Koch-Light, Ltd, Colnbrook, UK); esparteina y gramina (Sigma, StLouis, MO, USA); lupinina (Serva, Heidelberg, FRG). La angustifolina y la epilu-pinina fueron proporcionadas por el Dr. Wiewiorowski y el Dr. Jach (Polonia).

Extraccin

Se han utilizado dos mtodos de extraccin:(a) El primer mtodo est basado en el de Muzquiz et al, (1989). A 2 g de

harina molida se aadieron 32 mi de la mezcla ter etlico: cloroformo:hidrxido sdico 4 N (20:10:2). Se agit durante 30 min y se dej reposardurante la noche. Se filtr en ampollas de decantacin y el residuo se lavdos veces con 20 mi de ter etlico. A los tres filtrados se aadi 3 x 10 mide cido clorhdrico 0,3 N, los extractos cidos se llevaron a pH 10 con

l-Afl'ORI-i ANT1 NUTRITIVOS TI-HMOKKl-SIS'n-N'HiS IN UiiUMINUSAS I i Vi 1

hidrxido sdico 4 N y se extrajeron con 3 x 10 mi de cloroformo. Losextractos clorofrmicos se evaporaron u sequedad (30 C) y el residuo sedisolvi en 1 mi de metanol: 0,5 mi fueron usados para cromalograla encapa fina y 0,5 mi para cromatografa de gases tras aadir 0,5 mi de unasolucin de codena en metanol (2 mg/ml) como estndar interno. Des-pus de filtrar la muestra (filtros Millipore 0,45 |m), se inyectaron alcuo-tas de 0,2 |il.

(b) El segundo mtodo es una modificacin del mtodo de Harris, W i I son(1988). Se pesaron 0,5 g de harina y se homogeneizaron con 5 mi decido tricloroactico al 5 p. 100 durante 1 min a temperatura amhiente. Lamezcla se centrifug durante 5 min (700 g) y se decant el sobrenadante.La extraccin se repiti dos veces ms y a los sobrenadantes se aadi1 mi de hidrxido sdico 10 M en una ampolla de decantacin. Se extrajocon cloruro de metileno ( 3 x 5 mi) y los extractos se evaporaron a seque-dad (25 C). El residuo se disolvi en 1 mi de metanol y se procedicomo en el mtodo (a).

Aislamiento y purificacin de lupanina y lupinina

La lupanina, se aisl de semillas de L. albus amargo en forma de perclorato.Para ello se utiliz 1 kg de harina y la extraccin se llev a cabo siguiendo elmtodo (a). La fase acuosa fue evaporada a 200 mi y basificada con hidrxidosdico 4 N a pH 10. Los alcaloides fueron extrados con cloroformo (4 x 30 mi) ylos extractos evaporados a sequedad. El residuo se disolvi en 20 mi de metanol yse ajust a pH 6-7 con una solucin de cido perclrico en metanol (1 :1 ) , ticacuerdo con Perkowska et al., (1979). Los cristales blancos obtenidos fueronrecristalizados varias veces con metanol.

La lupinina se aisl de semillas de L. luteus amargo (1 kg) utilizando elmismo proceso de extraccin que para el perclorato de lupanina. La fase acuosafue evaporada a 200 mi y basificada con hidrxido sdico 4 N. Los alcaloides fue-ron extrados con ter dietlico (4 x 30 mi) y los extractos evaporados a sequedad.Los cristales obtenidos fueron recristalizados con ter de petrleo para separar lalupinina de la esparteina (Cromwell, 1955).

Los cristales de perclorato de lupanina y lupinina se disolvieron en mclanol yla pureza se determin por cromatografa de gases y espectrometra de masas(Hewlett Packard Mod. 5992 A).

Aislamiento y purificacin de alcaloides minoritarios por cromatografapreparativa ultrarrpida en columna

El extracto crudo de alcaloides que qued una vez cristalizado el alcaloidemayoritario, lupinina, se utiliz para aislar el alcaloide esparteina. El extractocrudo de alcaloides se disolvi en cloroformo y se cromatogra'i en capa f ina(Silica gel 60 F 254, Merck) con cloroformo: ciclohexano: dielilamina (6:4:0,5).

La tcnica utilizada fue la de cromatografa rpida en columna ( S t i l l vi til.,1978). Para ello se utiliz una columna de silicc (silicagel 60, 230-400 mesh)

354 M. MII/QUI/,

su pureza, en las condiciones descritas posteriormente en este trabajo, y pasadasde nuevo por columna hasta conseguir esprtenla pura.

Cromatografa en capa fina

Alcuotas de 2 p,l se aplicaron en placas de silica gel 60 F254 (20 x 20 cm,250 (im, Merck), usndose como fase mvil cloroformo, ciclohexano y dietilami-na (6:4:1). Para el desarrollo de las placas se utiliz luz ultravioleta, reactivo deDragendorff y reactivo de Bouchardat.

Cromatografa de gases

Las muestras (0,2 fil) se analizaron usando un cromatgrafo de gases (PerkinElmer, Sigma IB) con detector de ionizacin de llama (FID) y columna capilar(Teknokroma) SPB-1 (30 m x 0,4 mm d.i.). Las temperaturas del inyector y deldetector fueron 240 y 300 C respectivamente y la temperatura del horno fue pro-gramada de 150 C a 235 C a 5 C por minuto, permaneciendo a esta temperatura15 min. El gas portador fue nitrgeno y el flujo 1,1 mi miir1.

Los alcaloides individuales se cuantificaron mediante curvas patrn.

Cromatografa lquida de alta resolucinLa extraccin utilizada fue la del mtodo (b). La fase acuosa se evapor a

sequedad y los alcaloides se disolvieron en 10 mi de metanol. 10 (il fueron dilui-dos en 3 mi de tampn fosfato.

El sistema cromatogrfico usado fue un Beckman (System Gold) y la columnautilizada fue una Ultrasphere-ODS, 5 im (25 x 0,46 cm).

La fase mvil descrita por Me Calley (1986) se us como base para desarro-llar un nuevo solvente. Los eluyentes (acetonitrilo, tampn fosfato) fueron desga-sificados a vaco y filtrados a travs de membrana Millipore HA (0,45 u.m). Elflujo fue de 1 mi min^1 y el eluyente se monitoriz a 210 nm con un detectorDiode Array utilizando una velocidad de carta de 1 cm

RESULTADOS Y DISCUSINA partir de semillas amargas de L. albus y L. luteus se aislaron y purificaron

los alcaloides lupanina y lupinina, respectivamente. La pureza obtenida fue de un97 p. 100 para ambos alcaloides. El espectro de masas de la lupanina se muestraen la Figura 1 y coincide exactamente con el obtenido por Wink et al., (1980). Enla Figura 2 se muestra el espectro de masas de la lupinina obtenida de semillas deL. luteus amargo, que fue exactamente igual al obtenido con un patrn de lupinina.

Para el aislamiento y purificacin de esparteina, alcaloide que se encuentra enmenor proporcin en la semilla, se utiliz la tcnica de cromatografa preparativaultrarrpida en columna. El eluyente cloroformo: ciclohexano: dietilamina(6:4:0,5) fue el que permiti una mejor separacin de los alcaloides. A partir delextracto crudo, y mediante sucesivas purificaciones, se aisl el alcaloide esparteina.Esta tcnica nos ha permitido el aislamiento de alcaloides minoritarios con mayorfacilidad y rapidez que la cromatografa convencional.

l'M"IX)HI'.SANTINinirr!V()STlllMORII'.SISri',NT1'.SI',NI.1'.(HIMINO,SAS, I

7.1-

50-

25-

l i, ll '^,1, Jjp ,

LUPANINA

50 150 200 250 300

Fig. 1.-Espectro de masas de perclorato de lupanina aislado y purificad u partirde semillas de L. albus

Mass spectra of apanine perchlorate ohtainedfrom L. albus secdx

100^

75-

50-

25-

50 100 150 200

Ki|>, 2.-Kspectn> de masas de lupinina aislada y purificada a partir de semillas di- /. luteusMus* \i>i't'ini iifliipiriini- ixolaU'd

356 M.MUZQUIZcfu / .

Para la deteccin de alcaloides individuales se utiliz la cromatografa en capafina. Los resultados de ecotipos y cultivares de cinco especies de lupino (Fig. 3)muestran que la lupanina (b) fue el alcaloide ms comn en L. mutabilis, L. albus,y L. angusfolius. La esparteina (a) aparece en L. mutabilis y L. luteus, y la angus-tifolina (d) en L. angustifolius. En las especies L. luteus y L. hispanicus, el alcaloidedominante fue la lupinina (e). La lupanina no se encontr en estas especies. Laesparteina se detect en algunas variedades y ecotipos de L, luteus estudiadas.Solamente en L. hispanicus ssp bicolor se encontr epilupinina (f). Un alcaloidede naturaleza indlica, no quinolizidnica, la gramina (g) apareci en las dossubespecies del L. hispanicus (ssp hispanicus y ssp bicolor). Este alcaloide apare-ci en alguna muestra de L. luteus pero no se detect en ninguna de las otras espe-cies estudiadas.

Para la determinacin de alcaloides se han comparado dos mtodos de extrac-cin usando dos especies diferentes de Lupinus: L. albus (LO 2423) y L. luteus(LO 2915), cuantificndose por cromatografa de gases. Los contenidos de losalcaloides mayoritarios de estas especies aparecen en la Tabla 1. Los dos mtodosdieron resultados muy semejantes, mostrando ambos una alta reproducibilidad(coeficientes de variacin inferiores al 5 p. 100) tanto para los alcaloides que pre-sentan tanto altas como bajas concentraciones. El mtodo (b) es sin embargomucho menos complicado y con l pueden analizarse tres veces ms muestras enun da que con el mtodo (a). Con el mtodo de extraccin (b), y cromatografa degases, se han cuantificado los alcaloides de diferentes muestras dulces y amargasde lupino cuyos valores aparecen en la Tabla 2. Puede observarse que este mtodopermite cuantificar alcaloides en muestras que presentan contenidos muy bajos delos mismos. Mediante esta tcnica, adems de los alcaloides cuantificados se handetectado otros alcaloides, como la albina, que no se ha podido cuantificar porfalta de patrones.

Debido a que en algunos casos es necesario analizar cantidades pequeas demuestra se ensay la tcnica de CLAR. Existen pocos datos en la bibliografasobre anlisis de alcaloides del lupino mediante dicha tcnica, por lo que sedesarroll un nuevo mtodo basado en los de Hermans-Lokkerbol et al., (1989) ySaito et al., (1989), este ltimo utilizado en alcaloides lupinnicos de Thermopsislupinoides y T. chinenesis. Para ello se ensayaron diferentes sistemas cromatogr-

TABLA 1

CONTENIDO DE ALCALOIDES (mg/g de M.S. error tpico)DE DOS MUESTRAS DE LUPINUS

Alkaloid conten (mg/g D.M. std. error) oftwo samples of LupinusLupinus albus

Mtodo aMtodo b

lupanina

21,0 + 0,8920,3 0,90

13-OH-iupanina

0,9 + 0,020,8 0,03

lupinina

3,5 0,093,8 0,10

Lupinus luteusesparteina

0,9 + 0,031,0 0,02

gramina

0,4 + 0,020,7 0,03

La cuantificacn se realiz por CG. Ver Material y Mtodos para detalles experimentalesThe (fuautitalion wax carnea oul by GC. See Malcriis and Melhodx SSCtionjor jwrther dciails

l:A("l'Oli;S ANTINiri'KlTIVOS'niRMORItESISTN'l'HSlN l . l I I I M I N O S A S .

/,. allms L. angustifolius

&O O O Oo o o O c=>

o o o

' c o o O c

o o >OOOOOt> a, o o

O O o O O

O O O OO O O O "

1 2 3 4 5 6 7 8

L. mutabilis L. luteus

O O O O O

o oC, o

o o

Co o

O8

2 3 4 5 6

o o o O

O o

1 2 3 4 5 6 7 H )

L. hispanicus

OQoflOoflflOOOOOoW

Fig. 3.-Cromatografa en capa fina de extractos de aloiltiides de diferentes cultivares de /..L. angustifolius, L. mutabilis, I,. Luteus y L. hispanicus

Diagramatic repres'nttilion o/Tl.C ojalkaloui extracmjront iiffi'ri'ni L tilhitx. I,, (in^uxlifnl/,. niiittihilix, L. Inicua, /,. fii.\i>finifii.\

t: cspurli-inu. sfHtl,-iii,; b: It ipjimiui, liii>iiniii\1: H Ol l u p m i i m . M Ol ln>-i l 'nul l 'inl vi-0. Vul . H t I ) , l'J'H

JM. Mll/Ql]]/ f l a l .

TABLA 2< :ONTENIDO DE ALCALOIDES (mg/g de M.S. error tpico)

I'.N D1FKRKNTES ESPECIES DE LUPINUS CUANTIFICADO POR CGAI ka I od conten (mg/g DM. + std. error) in different species of Lupinas

quantified by GCEspecies

.a//wisL01584A../,. i 0 04

3,45 0 ,1 3 1,X70,051 2.KO 0 54

2,63:1 0,1')

sptirl i'lnu

-

-

-

l.as i l i ' lo r i l i t iu t i ' i iHi i - s si- iv i iM/ i i i im r i K - d i m i l o uom;iUif' .r;ih;i l i q u i d a ikl ; i l | : i resol lie (StlTin- dtttftntnOtQR HT;C inutif h\ ('

I n v r M A ) > i l ' nu l !'...! v.-n Vul H l

irahajos, en colaboracin con el Centre de Recherches Agronomiqucs de Bl-gica, en anlisis de alcaloides con tcnicas de NIRS dentro de un ProgramaICLA1R (AGRE -CT 90-0048) de la CE.

En la ltima Conferencia Internacional del Lupino se acord que la cromato-grafa de gases con columnas capilares sea aceptada como mtodo oficial a la horade hacer trabajos en colaboracin entre distintos laboratorios del mundo (Harris,1991; Trugo et al., 1989). Esta tcnica es, sin duda, la mejor para cuantificar losalcaloides, ya que no es necesario derivatizar las muestras y en las condicionespropuestas se pueden cuantificar todos los alcaloides del lupino.

Debido a que existen muy pocos alcaloides comerciales del lupino, la purifi-cacin y extraccin de estos es muy importante. La CPUC es una tcnica de granayuda para separar principalmente alcaloides que se presentan en las distintasespecies en menor proporcin y poder as usarlos posteriormente como patrones.

El mtodo de cromatografa lquida de alta resolucin no es el idneo a lahora de cuantificar los alcaloides de todas las especies del lupino, pero s podraser muy til en programas de mejora del L. albus.

La cromatografa en capa fina es un mtodo de gran ayuda a la hora de cono-cer qu alcaloides tenemos que cuantificar en cada especie.

AGRADECIMIENTOS

Parte de este trabajo ha sido financiado por el INIA (Proyecto n.e 8202) y por la CICYT (ProyectoALI91-1092-C02-02).

Queremos agradecer al Dr. Serafn Valverde, Director del Instituto de Qumica Orgnica del CSIC,su experta colaboracin en las tcnicas de CPUC.

SUMMARY

Determination of thermoresistant antinutritional factors in legumes.I: Alkaloids

Quinolizidine alkaloids lupanine and lupinine were isolated and purified from L. albus andL. luteus seeds with high alkaloid conten. The sparteina alkaloid was obtained using flash chromato-graphy. Two methods of alkaloid extraction were compared. Thin layer chromatography was used foralkaloid detection and the quantitation was made using gas liquid chromatography and high performan-ce liquid chromatography techniques.

KE\ LupinasAlkaloids

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