1. PROCEDIMIENTO DE USO. 1.1.Del laboratorio: 1.1.1.saludnutricion.ibero.mx/recursos/Ev_ 2_2...

REGLAMENTO CODIGO: MO-L107-2019

Fecha: 10 ENERO 2019

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE

INVESTIGACIÓN L-107

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1. PROCEDIMIENTO DE USO.

1.1. Del laboratorio:

1.1.1. Pedir en el almacén de Salud las llaves para abrir este laboratorio.

1.2. De los equipos de seguridad:

1.2.1. El usuario deberá ubicar la posición donde se encuentran los extintores,

lavaojos, regadera, material absorbente para derrames.

1.3. De la limpieza :

1.3.1. El laboratorio estará limpio antes de su uso y contará con agua destilada y

desionizada, toallitas absorbentes, jabón de manos, jabón para limpieza,

franela, escobillones y esponjas con fibra.

1.3.2. Si el área está sucia reportar al almacén de salud y al coordinador de los

laboratorios.

1.3.3. El usuario deberá limpiar el área de experimentación con agua y jabón;

después con solución de etanol al 70% para desinfección antes y después de

cada experimentación. Al trabajar se colocara papel estraza en las mesas de

trabajo.

1.4. Del material y equipo:

1.4.1. El usuario deberá verificar que haya disponibilidad de material y equipo que

usará para la experimentación.

1.4.2. En caso de no contar con algún equipo y material avisará al responsable del

laboratorio (Dr. César Hernández Guerrero)

1.4.3. El usuario verificará que haya material estéril antes de iniciar la

experimentación.

1.4.3.1. Se apoyará con la preparación del material para esterilizar.

1.4.4. El usuario deberá anotarse en la bitácora de uso de cada equipo que se utilice

en la experimentación.

1.4.5. Si no funciona alguno de los equipos del laboratorio reportar inmediatamente

al almacén de salud, no tratar de repararlo.

1.4.6. El usuario utilizará correctamente los equipos facilitados para las prácticas, si

tiene dudas:

1.4.6.1. En caso que el equipo sea del Almacén de Salud puede solicitar el

procedimiento de uso y/o los manuales en el almacén.





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1.4.6.2. Si el equipo se ubica en el laboratorio el procedimiento de uso estará en la

bitácora respectiva.

1.4.7 El usuario será responsable del buen uso del material y los equipos utilizados.

1.4.7.1. Si el alumno descompone algún equipo deberá ser reportado al almacén de

salud.

1.4.7.2. Si el usuario rompe material de laboratorio, llenará un vale y lo repondrá o

pagará en las cajas de la Universidad.

1.4.8. El usuario limpiara el equipo que utilizo durante la práctica.

1.5 De los reactivos:

1.5.1. Solicitar con 1 semana de anticipación los reactivos a utilizar en la experimentación.

1.5.2. En caso de no haber en existencia, se le informara al responsable del laboratorio.

1.6. Del manejo de residuos:

1.6.1. Residuos orgánicos e inorgánicos:

1.6.1.1. Para el desecho de residuos orgánicos e inorgánicos en laboratorio tiene

contenedores para basura orgánica e inorgánica. Cada contenedor tendrá la indicación de

lo que se depositará.

1.6.2. Residuos químicos:

6.6.2.1. Para el manejo de residuos químicos revisar el numeral 7.1.2.

1.6.3. Residuos biológico-infecciosos y punzocortantes:

6.6.3.1. Para material con residuos de sangre se realizará en bolsas de polietileno

color rojo.

6.6.3.2. Para material punzocortante se realizará en recipientes rígidos de

polipropileno color rojo.

1.7 De los procedimientos de los experimentos:

1.7.1. Procedimiento de obtención de plasma a partir de una muestra de sangre





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1. Tomar 5 mL de muestra de sangre en un tubo vacutainer con EDTA (tapón lila). Agitar los tubos suavemente para mezclar bien el anticoagulante con la sangre.

2. Si se va a realizar extracción de RNA, poner los tubos en baño de hielo y enseguida se realiza el siguiente paso. Si no se va a hacer RNA no poner en baño de hielo y se dejan reposar los tubos a temperatura ambiente por 15 min.

3. Nivelar los tubos por peso en la balanza de doble platillo. 4. Centrifugar tubos a 3500 rpm x 10 min. 5. Colocar el plasma en tubos eppendorf, cuidando de rotular bien los tubos. Guardar en el

ultracongelador.

Nota: Para rotular los tubos poner una P para saber que son de plasma, la clave de la muestra y fecha.

1.7.2. Procedimiento de obtención de suero a partir de una muestra de sangre

1. Tomar 5 mL de muestra de sangre en un tubo vacutainer (tapón azul rey). 2. Dejar reposar los tubos a temperatura ambiente por 15 min. 3. Con un hisopo estéril, remover el coagulo formado en el tubo. 4. Nivelar los tubos por peso en la balanza de doble platillo. 5. Centrifugar tubos a 3500 rpm x 10 min. 6. Colocar el suero en microtubos, cuidando de rotular bien los tubos. Guardar en el

ultracongelador.

Nota: Para rotular los tubos poner una S para saber que son de suero, la clave de la muestra y fecha.

1.7.3 Procedimiento de Extracción de DNA a partir de una muestra de sangre 2. Tomar 5 mL de muestra de sangre en un tubo vacutainer con EDTA (tapón morado). Agitar

suavemente el tubo. 3. Del tubo, tomar 100 μL de sangre y colocar en un tubo de 2mL estéril. 4. Agregar a la muestra 1mL de DNAzol. Homogenizar (pipetear) 10 veces con la pipeta. 5. Adicionar 600 μL de etanol 100% grado biología molecular. Cerrar tubo y agitar para

mezclar. 6. Centrifugar el tubo a 3°C, 8500 rpm por 7 min, para precipitar el DNA. 7. Si hubo precipitación de DNA (formación del pellet o moco color café) continuar con la

decantación del líquido en un vaso de precipitado conteniendo una mezcla de agua con cloro (un chorrito de cloro). Si no precipito, dejar reposar 1 día en el congelador y volver a centrifugar. Se debe cuidar que en la decantación el pellet quede en el tubo.

8. Dejar secar el tubo en forma vertical con la boca del tubo hacia abajo sobre una gasa previamente rociada con alcohol al 75% grado reactivo. (aproximadamente 15-20 min).

9. Poner al tubo 1 mL de etanol al 75% grado biología molecular. 10. Mezclar con el vortex, hasta que el pellet se disuelva (se despegue del tubo).





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11. Centrifugar el tubo a 3°C, 8500 rpm por 7 min, para volver a precipitar el pellet. 12. Decantar el líquido en el agua con cloro, cuidando que el pellet se quede en el tubo. 13. Dejar secar el tubo en forma vertical con la boca del tubo hacia abajo sobre una gasa

rociada con alcohol al 75%. (Aproximadamente 20-30 min). 14. Agregar 200 μL de NaOH al 0.8 mM. Homogenizar con la pipeta, tratando de que se

disuelva el pellet y cuidando de no hacer espuma. 15. Calentar el tubo a 60-80°C por 20 min en la parrilla “multi block”. (ojo: se debe hacer en

LOW y controlar con su perilla correspondiente. 16. Terminado el tiempo se agita en el vortex y se guarda el tubo en congelación.

1.7.4 Procedimiento de Extracción de Células Blancas con Ficoll a partir de una muestra de sangre

1. Tomar 5 mL de muestra de sangre en un tubo vacutainer con EDTA (tapón morado). Agitar suavemente el tubo. Colocar el tubo en baño de hielo.

2. Nivelar los tubos por peso en la balanza de doble platillo. 3. Centrifugar tubos a 3500 rpm x 10 min. 4. Colocar el plasma en tubos eppendorf, cuidando de no tocar el buffy coat (capa blanca) 5. Tomar con una pipeta pasteur el buffy coat tratando de llevarse pocos eritrocitos y

colocarlo en un tubo estéril. 6. Colocar una cantidad de PBS pH 7.2 “1X” proporcional al buffy (a partir de aquí, el

procedimiento es a temperatura ambiente). Homogeneizar. 7. Colocar en un tubo estéril de 2 mL la cantidad de 1 mL de Ficoll (el Ficoll se saca del

refrigerador 30 min antes de usarse para que se temperize). 8. Agregar la mezcla de buffy coat + PBS lentamente , con la punta de la pipeta pegada a la

pared en el tubo que contiene el Ficoll, con el fin de que se distingan las dos fases. 9. Centrifugar a 3000 rpm x 40 min a Temperatura ambiente. 10. Se distinguirán varias fases





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11. Desechar el plasma en un vaso de precipitados y con la pipeta tomar la capa de células blancas y colocarlas en un tubo de 2mL estéril.

12. Al tubo que contiene las celulas blancas, agregar 1 mL de PBS 1X y homogenizar. 13. Centrifugar el tubo a 2500 rpm por 10 min a temperatura ambiente. (para que se precipite

el pellet) 14. Desechar el líquido del tubo cuidando de que no se vaya el pellet. 15. Volver a agregar al tubo 1 mL de PBS 1X, homogenizar y volver a centrifugar. (se realiza 2

veces está operación). 16. Desechar el líquido y en la campana de extracción adicionar 1 mL de trizol al tubo con el

pellet y homogenizar. (El trizol siempre debe estar en frío) 17. Guardar en el ultracongelador.

Reactivos utilizados

PBS 1X

Preparar 10mL de PBS 1X

Tomar 1 mL de PBS 10X y colocarlo en un tubo falcón nuevo y agregar 9mL de agua milliQ estéril.

1.7.5. Procedimiento de la técnica PCR

1. Limpiar el área con agua y jabón. Después limpiar con una gasa con alcohol al 75%. Poner un pedazo de papel estraza. (es en la mesa que está en el cubículo).

2. Sacar del congelador los reactivos para el master mix PCR, excepto la taq polimerasa: Buffer PCR, dNTPs, primer forward, primer reverse, y agua ultrapura libre de RNasas y DNasas en baño de hielo para descongelar. Agitar con vortex.





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3. Descongelar muestras de DNA en baño de hielo. Esto se realiza en el área de extracción de DNA. Agitar con vortex.

4. Rotular tubos para PCR de 0.2 mL estériles: blanco(s) y la clave de la muestra para las muestras a analizar.

5. Preparación del master mix PCR. Tomar un tubo eppendorf 0.5 mL estéril para realizar la mezcla del mix. Las cantidades a poner por cada tubo de reacción son:

Reactivo 1X

Buffer PCR 10X 2.5μL

MgCl2 2.0μL

dNTPs 20 μM 2.5μL

Primer forward 2.5μL

Primer reverse 2.5μL

Agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas 10μL

Taq polimerasa# 1.0μL

Volumen total 23μL

Calcular el master mix para la cantidad de tubos a analizar considerando un tubo más por error de pipeteo.

# La taq polimersasa se saca del congelador y se agrega justo antes de poner master mix a cada tubo

6. Poner 2μL de DNA de muestra en cada tubo. OJO: el blanco no lleva muestra, solo el master mix.

7. Adicionar 23μL de master mix a cada tubo. Pipetear 20 veces para homogenizar. 8. Agitar los tubos con el vortex. 9. Colocar los tubos en el termociclador. Elegir el programa según el primer utilizado.

Preparación de primers

Centrifugar los primers nuevos a 3500 rpm por 5 min.

Adicionar 200 μL de agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas a cada primer. Homogeneizar.

Tomar 5 μL de la mezcla anterior del primer, pasar a un microtubo estéril y agregar 15 μL de agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas a cada primer. [10X]. homogeneizar.





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Tomar 10 μL de la mezcla anterior del primer [10X], pasar a un microtubo estéril y agregar 90 μL de agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas a cada primer. [1X].

Preparación de dNTPs 20 μM

Se realizan a partir de una concentración de dNTPs 10 mM.

[ ]inicial = 10mM ----------------- [ ]final = 200μM

Por lo tanto se hará una dilución 1:50

Para preparar 250μL de dNTPs 200 μM, agregar a un microtubo estéril 5 μL de dNTPs 10mM y adicionar 245 μL de agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas.

Para ya obtener la concentración de 20 μM, se realizará otra dilución.

[ ]inicial 2=200μM ----------------- [ ]final2 = 20μM

Por lo tanto se hará una dilución 1:10

Para preparar 200μL de dNTPs 20 μM, agregar a un microtubo estéril 20 μL de dNTPs 200 μM y adicionar 180 μL de agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas.

1.7.6. Electroforesis en gel de agarosa

Preparación de la cámara de electroforesis

Nivelar la cámara

Poner masking tape a los lados de “platito” donde se realiza la electroforesis, para que no se salga la agarosa cuando se agregue.

Poner peines de 10 pozos en cada ranura.





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Preparación del gel de agarosa al 3%

Para el gel completo, pesar 1.2 de agarosa y agregar a un matraz Erlenmeyer de 250mL, agregar 40 mL de TBE 1X. Tapar la boca del matraz con papel aluminio. Calentar la mezcla hasta que empiece a burbujear, cuidando que no suba mucho las burbujas.

Colocar rápidamente la agarosa en el “platito” de la cámara, cuidando que no tenga mucha burbuja grande, si no hay que repetir el procedimiento. Dejar enfriar hasta que solidifique.

Quitar peines y maskingtape con cuidado.

Agregar TBE 1X (puede ser nuevo o usado 1 vez) a la cámara hasta llegar a la mitad de las bolitas blancas de la cámara. Cerrar la cámara, revisar que los electrodos estén conectados y encender la fuente de poder a 111 volts en rango LOW por 5 min. Apagar fuente de poder.

Preparación de las muestras: en un parafilm, colocar 7μL de buffer de carga (un punto) por cada muestra a analizar. A cada punto de buffer se le agrega 10μL de muestra de PCR, homogeneizar cada una 20 veces con la pipeta y se coloca en un pozo teniendo cuidado de que no salga la mezcla del pozo, así para cada muestra y blancos. Dejar en medio de cada lado de los pozos un pozo para poner el ladder con el que se van a comparar las muestras. En el pozo de ladder poner 3μL (solo de ladder, sin buffer de carga). Guardar sobrante de muestras PCR en el congelador para su uso posterior.

Después de colocar todas las muestras en los pozos, cerrar la cámara y encender la fuente de poder a 77 volts en rango LOW por 90 min (checar, que el corrimiento este entre el num 3 y 4). Apagar fuente de poder. Sacar gel y colocarlo en un plástico.

Tinción del gel de agarosa en solución de bromuro de etidio

Colocar el gel de la electroforesis en el contenedor con bromuro de etidio por 20 min. (ojo: utilizar los guantes solo para manipular el bromuro para evitar contaminación; para manipular la computadora hacerlo con otros guantes)

Mientras se tiñe el gel, conectar el fotodocumentador, colocar un plástico (puede ser de bolsa de plástico o egapack) dentro del fotodocumentador para evitar que se contamine el equipo. Encender la computadora, en la contraseña solo dar enter. Abrir el icono de AlphaImager mini. Encender el fotodocumentador.(ojo: no encender la luz ultravioleta (switch de abajo rojo), solo la luz del switch de arriba)

Sacar el gel del contenedor de bromuro de etidio, escurrir para quitar el exceso, ponerlo en un plástico para evitar que el bromuro contamine el área, poner el gel dentro del fotodocumentador, acomodar ayudado de la computadora. Cerrar el fotodocumentador.





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Obtener imagen apagando la luz normal y encendiendo la luz ultravioleta. Guardar imagen en la computadora. En este primer gel se verá si se amplifico el DNA de cada muestra.

Apagar la luz ultravioleta antes de abrir el fotodocumentador y así poder sacar el gel y depositarlo en el contenedor para desechos de bromuro de etidio.

Preparación de la solución de bromuro de etidio.

20μL de bromuro de etidio agregarle 200 mL TBE 1X usado 2 veces.

Preparación del buffer de carga

35μL xilenol cianol al 0.25%

150μL azul de bromofenol al 0.25%

750μL agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas

450μL glicerol

Preparación de digestión para SOD

Sacar a temperizar las tubos de las muestras PCR que sobraron: blancos y muestras (aproximadamente debe haber 15μL en cada tubo).

Acondicionar incubadora a 60°C.

Se prepara un master mix con la enzima BsaWI con las siguientes cantidades:

Reactivo 18X

Agua ultrapura libre de DNAsas y RNAsas 16μL

Buffer 10X 32.4μL

BSA 100X 3.6μL

BsaWI 2μL

Total= 54μL

Mezclar muy bien.

Agregar 3μL a cada tubo y homogeneizar con el vortex. Incubar por 18 hrs a 60°C.





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Sacar muestras y realizar electroforesis siguiendo la metodología anterior, solo ahora las muestras son estos nuevos tubos. Ya con la tinción se verá si corto la enzima o no para saber el tipo de polimorfismo tiene cada muestra.

2 SEGURIDAD.

2.7 Durante las prácticas es indispensable:

2.7.1 Material personal y de seguridad:

2.7.1.1 Los usuarios deben ubicar el lugar en que se encuentran los materiales

absorbentes para derrames, lavaojos, regaderas y extintores.

2.7.1.2 Las siguientes actividades están estrictamente prohibidas dentro del laboratorio:

fumar, maquillarse, beber, comer, almacenar alimentos y bebidas en los

refrigeradores o anaqueles así como cualquier artículo ajeno al laboratorio.

2.7.1.3 El uso de zapato cerrado y bata de algodón abotonada es obligatorio durante la

estancia en el laboratorio.

2.7.1.4 El uso de guantes de nitrilo y cubre bocas es obligatorio al realizar los

experimentos.

2.7.1.5 Cuando se trabaje con ácidos o solventes el usuario deberá utilizar mascarilla con

filtros para vapores ácidos o de solventes, la cual se solicitará al Almacén de Salud

en el formato de préstamo de material.

2.7.1.6 Cuando se trabaje con ácidos el usuario deberá utilizar guantes para manejo de

ácidos los cuales estarán disponibles en el laboratorio.

2.7.1.7 Cuando se trabaje con parrillas de calentamiento el usuario deberá utilizar guantes

aislantes los cuales se solicitarán al Almacén de Salud en el formato de préstamo

de material.

2.7.1.8 Uso de guantes y mandil para manejo del ultracongelador.

2.7.2 Manejo de Residuos químicos:

2.7.2.1 Ubicar las gavetas donde se tienen los frascos para colocar los residuos químicos.





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2.7.2.2 Cuando se utilicen los frascos para residuos químicos, estos se deben rotular con los

siguientes datos: nombre del reactivo, si el caso concentración a la que se preparo,

fecha de generación del residuo.

2.7.2.3 Los frascos de residuos químicos se colocaran en la gaveta destinada para residuos

peligrosos ubicada por loe equipos de Elisa.

2.7.2.4 El auxiliar de laboratorio se encargará de revisar los frascos de residuos químicos y

cuando ya estén llenos a una tercera parte los llevara al almacén y los colocara en el

área asignada para ellos.

2.7.3 Manejo de Residuos Biológico-Infecciosos:

2.7.3.1 El usuario deberá ubicar los contenedores para colocar los residuos biológico-

infecciosos. Los contenedores usados en el laboratorio son:

Bolsas de polietileno rojo: Desecho de gasas, guantes, material desechable y papel que

haya estado en contacto con sangre, suero, plasma, heces y muestra de DNA.

Recipientes rojos de polipropileno rígido: Para materiales punzocortantes como agujas

de jeringa, lancetas y pipetas de vidrio.

7.7.3.2. El auxiliar de laboratorio se encargará de llevar los contenedores cuando ya

estén llenos a un 80% de su capacidad o cada 30 días según la cantidad generada al

refrigerador de residuos del laboratorio de Inocuidad de los alimentos.

3 EN CASO DE ACCIDENTES.

3.7 Cuando se derrame un ácido o solución ácida o básica sobre mesas de trabajo o

piso:

3.7.1 Avisar al Almacén de Salud, ubicado a la mitad del pasillo del mismo piso del

laboratorio, ya sea a los auxiliares de almacén o al jefe de almacén, el personal del

almacén y de los laboratorios se encuentra capacitado para tratar los derrames de

éstos productos.

3.7.2 Colocarse los guantes negros, se encuentra en…, con el material absorbente y las

bolsas para poner los residuos químicos.

3.7.3 Si el derrame es pequeño, se pueden utilizar las toallitas absorbentes y colocarlas

en las bolsas de residuos químicos, rotular la bolsa con el nombre del reactivo

recuperado.





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3.7.4 Si el derrame es mayor se utiliza la bolsa con confeti, la cual se esparce sobre el

derrame y se coloca le material en las bolsas de residuos químicos, rotular la bolsa

con el nombre del reactivo recuperado.

3.7.5 Si el derrame es considerable utilizar una o más calcetas absorbentes alrededor

del derrame e irlas cerrando hasta la absorción total, se colocara ellas calcetas en

las bolsas de residuos químicos, rotular la bolsa con el nombre del reactivo

recuperado.

3.8 Cuando se derrame un ácido o solución ácida o básica sobre un o más usuarios:

3.8.1 Avisar al Almacén de Salud, ubicado a la mitad del pasillo del mismo piso del

laboratorio, ya sea a los auxiliares de almacén o al jefe de almacén,

3.8.1.1 Si el derrame es en manos, antebrazo o pies y el reactivo esta en contacto con la

piel.

3.8.1.1.1 Retira la ropa que éste sobre el derrame si es el caso.

3.8.1.1.2 Enjuagar con agua abundante durante 15 minutos.

3.8.1.1.3 El personal del almacén o de los laboratorios acompañara al usuario lastimado al

servicio medico, ubicado en el edificio B, planta baja; con la finalidad de que se

valore el daño y le den tratamiento si es necesario.

3.8.1.2 Si el derrame es sobre el cuerpo con un ácido concentrado o sosa.

3.8.1.2.1 Avisar al Almacén de Salud, ubicado a la mitad del pasillo del mismo piso del

laboratorio, ya sea a los auxiliares de almacén o al jefe de almacén, el personal

del almacén hablará a la ext. 4174, del servicio medico, para reportar el

accidente y solicitar la presencia del servicio médico, también se marcara a la

ext. 7453 para avisar al Coordinador de los Laboratorios.

3.8.1.2.2 Otros usuario se coloque guantes si no los tienen y le ayuden al usuario

accidentado a retirarse la ropa que tenga el derrame del reactivo.

3.8.1.2.3 Se coloca al usuario accidentado debajo de la regadera.

3.8.1.2.4 Se jala la cadena de la regadera.





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3.9 Cuando algún usuario se queme con las parrillas de calentamiento:

3.9.1 Si la quemadura es leve el usuario lesionado se debe dirigir al almacén,

acompañado por algún compañero o el académico, y pedir la pomada Argentafil,

untarla en la parte quemada y acudir al servicio médico.

3.9.2 Si la quemadura es grave:

3.9.2.1 Avisar al Almacén de Salud, ubicado a la mitad del pasillo del mismo piso del

laboratorio, ya sea a los auxiliares de almacén o al jefe de almacén.

3.9.2.2 El usuario lesionado se debe dirigir al servicio médico, acompañado por el personal

del almacén o de los laboratorios o algún compañero o el académico.

4 EN CASO DE INCIDENTES.

4.1 Residuos químicos no rotulados:

4.1.1 Medir pH, con papel pH.

4.1.2 Rotular el frasco con reactivo desconocido y el valor del pH obtenido.

4.1.3 Llevar al almacén y dejar en el área asignado para los residuos químicos.

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