1 PCR: Aplicaciones en Infectología Laboratorio de Biología Molecular Facultad de Medicina UASLP...
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1
PCR:Aplicaciones en Infectología
Laboratorio de Biología MolecularFacultad de Medicina UASLP
CA Garcia Sepúlveda MD PhD
2
Tan solo en los EEUUA, cada año se reportan entre 5 y 7 millones de enfermedades asociadas a infecciones.
Se estima que un número mucho superior de enfermedades infecciosas no son reportadas cada año.
Gran morbi-mortalidad de enfermedades infecciosas a nivel mundial.
Las bacterias y virus continuan siendo una amenaza para la raza humana (2do riesgo despues de Homo sapiens).
La intervención temprana (y apropiada) ante dichas patologías requiere de la identificación rápida del patógeno implicado, sobretodo en UCI, UCEN o SE en donde la vida del paciente pudiera estar en riesgo.
Introducción
3
El desenlace clínico ante enfermedades infecciosas se encuentra directamente relacionado con el tiempo transcurrido para identificar al patógeno:
Mayor tiempo = Peor pronóstico.
Acercamiento diagnóstico actual (en la era posgenómica) sigue basandose en métodos tradicionales, engorrosos, lentos y poco sensibles.
- Poco útiles ante escenarios de emergencia/críticos
- Poca información resultante (Streptococcus spp)
- Seguimiento con otros ensayos lentos de caracterización
- Poco utiles en pacientes que reciben antibióticos
Introducción
4
Consecuencias:
Lleva a la adopción de estrategias clínicas empíricas y conservadoras.
Lleva al abuso en la prescripción de antiobióticos.
Incrementa el costo de la atención médica (incuso extrahospitalaria).
Incrementa la tasa de hospitalizaciones innecesarias (hay un control?)
Presiona a los patógenos a evolucionar más rápidamente o a escapar de escenarios de riesgo (resistencias, recombinantes nosocomiales, etc).
Introducción
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Reacción en Cadena de la Polimerasa
Método enzimático para amplificar pequeñas regiones de DNA in vitro.
Una sola bacteria no se puede estudiar, por lo que se hace uso de técnicas de cultivo para incrementar sus números de tal modo en que se puedan realizar estudios bioquímicos.
¿Que es la PCR?
6
Invención
Kary Banks Mullis, Ph.D. (Dic 28, 1944)
Bioquímico norteamericano.
Laureado Nobel (1993).
Criado en Carolina del Norte EEUUAA en una granja.
Trabajo en cardiología pediátrica, farmacéutica, sintesis proteica.
Escribio ciencia ficcion por un tiempo y trabajo (como PhD) en una panaderia.
Trabajo para Cetus donde divisó el mecanismo general subyacente de la PCR.
Niega que el SIDA sea causado por HIV y niega el calentamiento global.
7
Molécula que contiene información que define la manera en que un organismo debe:
- armarse,
- funcionar y
- degradarse (morir).
DNA
3.4 nm (34 Å)
0.34 nm (3.4 Å)
2 nm (20 Å)
8
DNA
Molécula de DNA es:
- Bicatenaria
- Complementaria
- Antiparalela
9
DNA
A
T
G
C
A
G
C
A
T
G
C
T
A
C
G
T
A
C
G
T
A
C
G
T
Molécula de DNA es:
- Bicatenaria
- Complementaria
- Antiparalela
10
DNA
5' 3'
3' 5'
Molécula de DNA es:
- Bicatenaria
- Complementaria
- Antiparalela
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Desnaturalización Reversible
¿Como se descontamina una superficie de DNA?
- Detergentes o jabones- NaOCl - Calor- Acidos- Bases - Luz ultravioleta- Radiación actínica - DNAsas
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Desnaturalización Reversible
¿Como se descontamina una superficie de DNA?
- Detergentes o jabones ✗- NaOCl ✗- Calor ✗- Acidos ✗- Bases ✗- Luz Ultravioleta ✓- Radiación actínica ✓- DNAsas ✓
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Desnaturalización Reversible
CONTEXTO:
Una célula humana promedio contiene entre 6 y 9 picogramos de DNA.
46 cromosomas.
100,000 genes a 22,000 genes
3 mil millones de bases
El cambio de tan solo 1 base es suficiente para alterar al organismo.
PROBLEMA:
Como detectar un cambio de 1 base entre 3 mil millones de bases?
14
Desnaturalización Reversible
SOLUCION:
PCR
15
Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
16
Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
Estabiliza a la DNA polimerasaAmortigua pHAportando iones necesarios (KCl)Puede contener aceleradores (Tween)Promotores de la reacción:
• FBS• DMSO• Gelatina
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Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
Necesario para el correcto funcionamiento de la DNA polimerasa
Su concentración modifica el éxito (nivel de amplificación) de la reacción.
18
Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
Monomeros que será polimerizados durante la reacción.
Desoxyadenosin trifosfato (A)Desoxyguanosin trifosfato (G)Desoxycitidin trifosfato (C)Desoxytimidin trifosfato (T)
No se puede crear DNA de la nada.
19
Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
Pequeños fragmentos de DNA (18-30 bp)
Dirigen la polimerización de regiones específicas.
DICTAN LA ESPECIFICIDAD DE LA REACCION!
20
Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
Es la responsable de polimerizar los monómeros (dNTPs) para formar copias de DNA.
5´-3´ Polimerasa3´-5´ Exonucleasa
21
Componentes
• Componentes• Condiciones
Agua
Buffer
MgCl2dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA
Sirve de referencia o molde para la síntesis de nuevo DNA.
Le indica el orden con el cual deben agregarse dNTPs a la DNA polimerasa.
22
Componentes
• Componentes• Condiciones
Component l
Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 MgCl2 (50mM) 2.5 dNTP’s (10mM each) 1.0 PrimerFWD (25 pmol/l) 1.0 PrimerREV 1.0 DNA Polymerase 0.5 DNA Template 1.0
Total Volume 50.0
Component l
Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 MgCl2 (50mM) 2.5 dNTP’s (10mM each) 1.0 PrimerFWD (25 pmol/l) 1.0 PrimerREV 1.0 DNA Polymerase 0.5 DNA Template 1.0
Total Volume 50.0
Volumen de PCR común:
Hace 10 años = 500 y 1000 µLHace 5 años = 25 y 50 µLHoy = 10 a 12.5 µL
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Condiciones
• Componentes• Condiciones
Desnaturalizar
Hibridizar
Extender
AcidosBasesSalesDetergentesTemperatura
24
Condiciones
• Componentes• Condiciones
Desnaturalizar
Hibridizar
Extender Ciclos de temperatura(Termociclaje)
AcidosBasesSalesDetergentesTemperatura
Incompatibles con DNA pol
Thermophilus aquaticus = Taq
25
Termociclador
• Componentes• Condiciones
Desnaturalizar
Hibridizar
Extender
26
Condiciones
• Componentes• Condiciones
Desnaturalizar
Hibridizar
Extender
27
Condiciones
• Componentes• Condiciones
Desnaturalizar
Hibridizar
Extender
28
Cinetica de la reacción
• Componentes• Condiciones
95ºC
55ºC
72ºC
Desnaturalización Hibiridización
20 – 40 X
Hibrido= DNA + OligonucleotidoDepende de contenido GC%Dicta la especificidad de union del oligo al DNA
Extensión
29
Cinetica de la reacción
• Componentes• Condiciones
95ºC
55ºC
72ºC
Desnaturalización Hibiridización
20 – 40 X
Polimerasa Velocidad Exonuc Tasa Error %Prod -MutTaq 2 Kb/min No 8.0x10-6 16Pfu 0.5 Kb/ min Si 1.3x10-6 2.6Pwo 1 Kb/min Si 0.4x10-6 0.7
Extensión
30
Cinetica de la reacción
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Cinetica de la reacción
• Componentes• Condiciones
nº ciclos
DN
A p
rod
uct
o
pri
mer
s
La eficiencia neta del proceso es tán elevada que permite amplificar una copia de DNA original a mil millones de copias en tan solo 30 ciclos (2 hrs)!
La especificidad está dictada por el diseño de oligos y optimización de la técnica.
La sensibilidad del proceso es alta gracias a su elevada eficiencia.
32
Proceso logarítmico (de tan solo 15 pasos):
1-2-4-8-16-32-64-128-256-512-1024-2048-4096-8192-16,384-32,768
33
Proceso logarítmico (de tan solo 15 pasos):
1-2-4-8-16-32-64-128-256-512-1024-2048-4096-8192-16,384-32,768
34
35
30 ciclos
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Electroforesis
• Fosfatos y carga negativa del DNA responsable de migración electroforética.
(-)
(-)
(-) (-)
(-)(-)
(-)
(-)
37
Electroforesis
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Aplicaciones en Infectologia
• Facilita procesamiento de muestras• DNA es muy estable (meses a años).• Pequeño volumen de procesamiento y almacenamiento.• Archivable.• No requiere de red fria para transporte.
• Posee mayor sensibilidad que métodos tradicionales (serologicos)• Teóricamente capaz de detectar una sola molécula de DNA.• Muestras no viables pueden ser analizadas.
• Posee mayor especificidad.• Reacciones cruzadas mínimas (calidad de diseño del oligo).• Capaz de distinguir diferencias de tan solo UNA sola base nucleotídica.
• Permite identificar organismos dificiles o lentos de cultivar (Mycobact)
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Aplicaciones actuales
•Multiplex PCR
Detección simultánea de más de un patógeno en la misma reacción.
Incorpora mayor número de oligonucleótidos.
½ del costo (obvio).
Incrementa rapidez tamizaje.
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Aplicaciones actuales
Nested-PCR
Anidada.
Realizar una PCR sobre el producto de otra PCR.
Detección de especies de DNA raras (en número) en muestras diluidas o con bajos títulos.
Al menos cuatro oligos diferentes.
Supra-sensible (detección).
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Aplicaciones actuales
Random-PCR
Aleatoria.
PCR poco específica que permite amplificar a muchas entidades (especies, bacterias, etc) en una sola reacción.
Oligos dirigidos contra secuencias conservadas de bacterias (16S rRNA).
Permiten ampificar a cualquier bacteria (bacteremias, meningitis, etc).
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Aplicaciones actuales
RT-PCR
Reverse Transcriptase.
PCR realizada sobre RNA.
Expresión de genes (mRNA).
Genomas virales RNA (HIV, Flu).
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Aplicaciones actuales
Q-PCR
Quantitative.
Permite cuantificar el nivelde los productos de PCR.
Util para medir expresión de genes (mRNA).
Utilisima para medir niveles de replicación viral(carga viral).
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Aplicaciones clínicas
45
Aplicaciones clínicas
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Conclusiones
El diagnóstico molecular ha demostrado ser revolucionario para la práctica clínica del infectólogo (hospitalario o epidemiologo).
Utilidad incomparable en escenarios críticos como UMQx, UCI y UCEN en donde es preciso contar con herramientas rápidas, sensibles y robustas para la toma de decisiones clínicas.
La PCR sigue siendo la mejor técnica molecular que se haya desarollado y aunpromete mucho respecto a aplicaciones, optimización (costo y tiempo) y derivaciones (RT, QT, etc).
Utilidad demonstrada para detección de patógenos, seguimiento clínico, vigilancia de patógenos emergentes, detección de amenzasa biológicas y detección de patógenos resistentes a fármacos.
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Laboratorio de Biología Molecular
Gracias
Felicidades al personal del Laboratorio Estatal de Salud Pública en su décimo aniversario.