1. INTRODUCCIÓN

El tomate (Lycopersicon esculentum Mill) es una de las hortalizas de mayor

importancia a nivel mundial debido a su gran difusión comercial. Sus frutos

se consumen frescos y también son materia prima para la agroindustria. Es

una de las plantas que ha sido más investigada por los estudiosos en todos

sus aspectos básicos y agrícolas (GIACONI Y ESCAFF, 1993; CHAMARRO,

1995).

En Chile, se estima que su superficie cubre unas 18.800 ha, de las cuales

11.200 ha corresponden a tomate industrial, 6.300 ha de tomate al aire libre y

1.300 ha bajo invernadero. Es la hortaliza con mayor superficie a nivel

nacional (ODEPA, 2002).

El cultivo bajo invernadero frío, se concentra en la V región, principalmente

en la provincia de Quillota (INDAP, 1998).

En la zona central de Chile, el principal objetivo de la producción es cosechar

tomates fuera de la época estival, para así entrar al mercado cuando la oferta

de tomates para consumo fresco es baja, alcanzando de este modo los

mejores precios.

Es importante destacar la diferencia que existe entre la incidencia de

enfermedades en el mismo cultivo al aire libre o bajo plástico, debido a que

en este último se modifican las condiciones ambientales y aumentan el

desarrollo de enfermedades, especialmente las causadas por hongos y

bacterias (BESOAIN, 1989).

2

El medio ambiente tiene gran influencia en la multiplicación de las bacterias,

especialmente con alta humedad relativa y temperatura entre 20-22 °C se

beneficia su difusión (BLANCARD, 1990; RECHE, 1991; APABLAZA, 1999).

Esta combinación de factores en cultivos bajo plásticos se ve favorecida

sobre todo por la humedad relativa, al permitir que existan condiciones de

sobresaturación o agua libre por varias horas (BESOAIN, 1989).

Durante la temporada pasada (2003) se diagnosticó una patología asociada

a la presencia de Pseudomonas syringae en tomate, afectando

principalmente al cultivar Fortaleza en invernaderos de la V región. Esta

enfermedad se caracteriza por la presencia de manchas necróticas rodeadas

de halo clorótico en los folíolos, y por sobre todo un severo atizonamiento de

los tallos, caracterizado por la presencia de lesiones corticales necróticas sin

comprometer el tejido vascular. Las plantas severamente atacadas detienen

su crecimiento, fructifican pobremente y eventualmente mueren (BESOAIN,

McLEAN y LATORRE, 2004). Estos síntomas difieren de la enfermedad

conocida como peca bacteriana, la que se caracteriza por producir sólo

manchas necróticas en hojas y frutos.

A partir de un total de 12 muestras de cv. Fortaleza, recolectadas en cinco

diferentes predios ubicados en Quillota, Limache y La Cruz, se efectuaron

aislamientos en medio B de King, obteniéndose en forma consistente la

presencia de colonias bacterianas fluorescentes, a las cuales se les realizó el

test de LOPAT y se probó patogenicidad en limones y cerezas. Las cepas

aisladas se identificaron tentativamente como Pseudomonas syringae. Tres

de estos aislamientos fueron patogénicos en tomate luego de asperjar y

frotar levemente una suspensión bacteriana. Los síntomas aparecieron luego

de siete días de la inoculación y a los 35 días las plantas presentaron un

atizonamiento similar al inicialmente descrito. Se reaisló Pseudomonas

3

syringae cumpliéndose de este modo con los postulados de Koch (BESOAIN,

McLEAN y LATORRE, 2004).

Debido a la gran importancia que tiene la V región como zona productora de

tomates bajo plástico y a la magnitud de los daños observados, surge la

necesidad de realizar nuevos estudios que permitan incrementar el

conocimiento de esta nueva sintomatología. De acuerdo a ello, esta

investigación tuvo como objetivos:

• Determinar a qué patovar de Pseudomonas syringae, corresponden las

cepas asociadas a una nueva sintomatología que afecta a plantas de

tomate cv. Fortaleza, en la V región.

• Comparar daño y comportamiento de las cepas bacterianas obtenidas, en

comparación con Pseudomonas syringae pv. syringae.

• Evaluar la susceptibilidad de cuatro variedades de tomate con la cepa

más virulenta causante de la nueva sintomatología.

4

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Antecedentes generales de Pseudomonas syringae:

El género Pseudomonas Migula 1894 (EUZÉBY, 2005), pertenece a la

familia Pseudomonadacea Winslow et al. 1917 (EUZÉBY, 2005), del Reino

Bacteria. Corresponde a un organismo ampliamente distribuido en cultivos

hospederos y malezas, esto significa que en ausencia de síntomas aún es

posible detectar poblaciones bacterianas en diversos órganos de la planta

(BRUNA, 1993).

Pseudomonas syringae van Hall 1902 (DYE et al., 1980) es una de las

especies fitopatógenas que se denominan fluorescentes, debido a que al

crecer en un medio nutritivo con bajo contenido de hierro, produce pigmentos

fluorescentes, de color verde amarillo, con capacidad de difundirse (SMITH et

al., 1992). Se trata de un organismo estrictamente aerobio, gram-negativo,

que posee forma de bastón y se moviliza utilizando un flagelo polar. Esta

bacteria, responde en forma negativa a la producción de citocromo c-

oxidasa, a la de arginina dihidrolasa y que aún siendo muy patogénica para

muchas plantas, no produce pudrición en papa. Además, causa una reacción

de hipersensibilidad cuando se infiltra en hojas de tabaco, esta reacción es

utilizada para el diagnóstico entre pseudomonas fitopatógenas de las no

fitopatógenas (HIRANO y UPPER, 1990). BRADBURY (1986); BRAUN-

KIEWNICK y SANDS (2001) y GONZÁLEZ, RODICIO y MENDOZA (2003)

concuerdan con lo citado anteriormente y añaden que Pseudomonas

syringae origina colonias convexas en un medio hipersacarosado dando una

respuesta positiva a la producción de levano.

5

De acuerdo a la clasificación recién mencionada, Pseudomonas syringae

puede ser diferenciada de las otras Pseudomonas fluorescentes, y esto se

resume en el denominado perfil LOPAT que está compuesto por las

siguientes pruebas: Levano (+), Oxidasa (-), Papa (-), Arginina (-) e

hipersensibilidad en Tabaco (+) (LELLIOTT, BILLING y HAYWARD, 1966).

2.2. Sistema de agrupación de Pseudomonas syringae:

Entre las pseudomonadas fluorescentes la más representativa es

Pseudomonas syringae, que comprende 45 diferentes patovares, los que se

basan en la patogenicidad específica en relación con la planta hospedera.

Sin embargo, de acuerdo a las características fenotípicas y a la

patogenicidad cruzada que presenta un patovar, confrontado a hospederos

específicos de otros patovares, se ha evidenciado que muchos de éstos

presentan notable parecido y pueden inducir síntomas en plantas que

normalmente se clasifican como no hospederas (SCORTICHINI, 1995).

2.3. Peca bacteriana, mancha del halo o “bacterial speck”:

2.3.1. Agente causal El agente causal de esta enfermedad corresponde a Pseudomonas syringae

pv. tomato (Okabe 1933) Young, Dye y Wilkie 1978 (DYE et al., 1980). Se

han reportado dos razas, denominadas “0” y “1” (GABOR y WIEBE, 1997).

Pseudomonas syringae pv. tomato raza 0 corresponde al primer registro de

la peca bacteriana a nivel mundial, esta raza se logró controlar mediante la

utilización de cultivares resistentes, estos poseían el gen PTO de resistencia

a Pseudomonas syringae pv. tomato. En 1986 aparece el primer reporte de

6

Pseudomonas syringae pv. tomato raza 1 (LAWNTON y MAcNEILL, 1986).

Posteriormente en 1998, la enfermedad fue encontrada nuevamente en

numerosos cultivos resistentes a raza 0 en campos a través del valle de

Sacramento, California, Estados Unidos. En varios de estos predios causó

defoliación severa de los plantines de tomate, los síntomas incluían hojas

café oscuras hasta negras y lesiones en los tallos rodeadas por halos

amarrillos, por lo tanto corresponden a los mismos síntomas descritos para la

raza 0 (ARREDONDO y DAVIS, 2000).

El gen PTO de resistencia a la raza 0 fue introducido en numerosas

variedades de tomates orientadas principalmente al mercado fresco. Sin

embargo, este gen no confiere resistencia a la raza 1 de Pseudomonas

syringae pv. tomato (WILSON et al., 2002).

2.3.2. Hospederos

Pseudomonas syringae pv. tomato ataca exclusivamente a las solanáceas

pimentón (Capsicum annuum L) y tomate (Lycopersicon esculentum Mill), sin

embargo, existen reportes que también puede ser patogénica al realizar

inoculaciones en berenjena (Solanum melongena L) (BRADBURY, 1986).

2.3.3. Sintomatología

La sintomatología se manifiesta sobre hojas, tallos, pedúnculos y sépalos, en

forma de pústulas negras de 2 a 3 mm de diámetro que adquieren una

morfología redondeada, pudiendo o no estar rodeadas por un halo amarillo

(RECHE, 1991; LATORRE, 1992; MESSIAEN et al., 1995; FLOYD, 2004).

Otros autores señalan que las lesiones en tallos y pecíolos se pueden

7

desarrollar con formas ovaladas a elongadas de color café oscuro (JONES,

1993; POHRONEZNY y VOLIN, 2002; DAVIS et al., 2003).

Las lesiones negras con bordes amarillos también pueden ocurrir en los

márgenes de las hojas donde se acumulan las gotas por efecto del proceso

de gutación; cuando estas lesiones se unen, grandes áreas de tejido foliar

pueden morir. Generalmente las lesiones en el fruto son pequeñas (1 mm),

con forma de lunar y superficiales, sin embargo, también pueden ser más

grandes y hendidas, y en frutos inmaduros están rodeadas por un halo verde

(GABOR y WIEBE, 1997).

En los frutos las manchas se desarrollan superficialmente y no afectan la

pulpa (RECHE, 1991). JONES (1993) señala que también en los frutos se

desarrollan lesiones o punteados minúsculos de coloración oscura y rara vez

con diámetro mayor a un mm. El tejido alrededor de cada punto puede ser de

un verde más intenso que en las áreas no afectadas. Las lesiones pueden

ser levemente elevadas o inicialmente planas. En algunas instancias los

puntos son hendidos y un halo verde oscuro puede estar asociado. Además,

VENETTE, LAMEY y SMITH (1996) indican que al ser los tejidos inmaduros

son más susceptibles, al infectarse la fruta temprano, las lesiones con forma

de punto pueden causar orificios, debido a que el tejido fino infectado crece

más lento que tejido fino sano. Las frutas maduras son resistentes como

resultado de su alta acidez.

La multiplicación de esta enfermedad puede generar un amarillamiento

generalizado, seguido de desecación foliar (MESSIAEN et al., 1995). En

casos severos, las plantas infectadas presentan retraso en la madurez de su

fruta y reducen la producción (DAVIS et al., 2003).

8

2.3.4. Diseminación y sobrevivencia

Es una enfermedad que puede penetrar por heridas, estomas y que se

puede transmitir por semilla contaminada y a través del suelo (RECHE,

1991). Además puede sobrevivir en la rizosfera de las raíces y en restos

vegetales, en forma epífita en tomate y malezas, pudiendo también sobrevivir

en las semillas (RISTA, 2005).

GABOR y WIEBE (1997), concuerdan con lo citado en el párrafo anterior ya

que argumentan que el organismo puede sobrevivir en el suelo y en hojas de

muchos cultivos y malezas, además de semillas que también pueden

infectarse. Sin embargo, señalan que la transmisión por semilla es

usualmente de menor importancia, JONES (1993) añade que algunos

autores no reconocen a dicho órgano como una vía de transmisión, aun

cuando sería una forma de explicar el incremento de los reportes mundiales

de esta enfermedad. El mismo autor indica que entre plantas de un mismo

cultivo la bacteria es diseminada por las salpicaduras de gotas de lluvia y por

los utensilios usados en el proceso de transplante de almácigos.

En condiciones de verano la bacteria puede sobrevivir en la superficie de

plantas voluntarias de tomate, pero en una cantidad muy baja

(POHRONEZNY y VOLIN, 2002).

2.3.5. Factores predisponentes

La enfermedad se favorece por un clima frío (13-20°C), y condiciones de alta

humedad y lluvias. Usualmente se requiere de un día de elevada humedad

constante en la hoja para que la enfermedad se desarrolle (BRUNA, 1993;

9

JONES, 1993; GABOR y WIEBE, 1997; RISTA, 2005). Los síntomas de la

enfermedad se hacen presentes 8 a 10 días después de la inoculación

(RISTA, 2005)

MESSIAEN et al. (1995) señalan que esta enfermedad es muy dañina en

primaveras lluviosas o bajo plástico, por generarse condiciones demasiado

húmedas. Además POHRONEZNY y VOLIN (2002), mencionan que en el

año 1977-1978 en la localidad de Homestead, Florida del Sur, Estados

Unidos, el invierno se desarrolló en condiciones inusuales de altas

precipitaciones y de bajas temperaturas, favoreciendo un fuerte brote de

Pseudomonas syringae pv. tomato.

Esta bacteria a menudo aparece en zonas con agroclimas secos y donde se

usa riego por aspersión, pero muy pocas veces ocurre cuando en dichos

lugares se usa goteo o riego por surco (GABOR y WIEBE, 1997).

2.3.6. Incidencia e importancia económica

La peca bacteriana ha llegado a ser económicamente importante en todo el

mundo, desde mediados de la década de 1970 (AGRIOS, 1996). JONES

(1993) señala un incremento en los reportes de esta enfermedad en esta

última década.

2.3.7. Estrategias de control

Según RECHE (1991), el control se basa en eliminar restos vegetales y de

plantas enfermas, utilizar semilla sana y certificada, favorecer la aireación del

invernadero para disminuir la humedad y aplicar productos bactericidas.

10

JONES (1993) concuerda y sugiere además evitar plantar en el mismo

terreno por dos años consecutivos, producir plantines libre de la enfermedad

en lugares donde no se haya producido tomate anteriormente, y el

tratamiento a las semillas debe ser un procedimiento de rutina. Por otro lado,

se deben mantener todos los terrenos de producción libres de malezas y

plantas voluntarias, y no amontonar desechos vegetales en o cerca de las

zonas de producción.

Referente al tratamiento a las semillas FLOYD (1990) y VENETTE, LAMEY y

SMITH (1996) indican que se deben utilizar sólo semillas tratadas. Una

opción consiste en sumergir las semillas por 25 minutos en agua caliente a

50 °C, con este proceso se logra controlar las bacterias al interior de las

semillas, pero reduce la germinación. Otra alternativa consiste en bañar las

semillas por un minuto en hipoclorito de sodio al 1 %, en este caso se

eliminan sólo las bacterias superficiales de la semilla. Por otra parte SIKORA,

GAZAWAY y MULLEN (1998) sugieren tratar las semillas con una solución

de ácido acético al 0,6 %, para asegurar que las semillas estén libres de la

enfermedad.

GABOR y WIEBE (1997) señalan que el uso de variedades resistentes es

una forma efectiva de controlar la enfermedad. Los autores también

mencionan que la aspersión temprana de cobre puede reducir su ocurrencia.

El riego por aspersión aumenta la incidencia cuando la bacteria está

presente, y por lo tanto se debe usar en lo posible riego por goteo o surcos.

Referente al uso de variedades resistentes VENETTE, LAMEY y SMITH

(1996) señalan que no existen cultivares de tomate totalmente resistentes a

la peca bacteriana y que sólo algunas líneas soportan la enfermedad mejor

que otras.

11

POHRONEZNY y VOLIN (2002) y ZITTER (2005), indican que aun cuando

no se conocen productos químicos específicos para el control de la peca

bacteriana, el uso de mancozeb, cobre y antibióticos como la estreptomicina

pueden utilizarse como estrategias de control. JETT (2003) y RISTA (2005)

agregan que aplicaciones de cobre en forma preventiva como caldo bordelés

o como oxicloruro de cobre, pueden disminuir la incidencia y la dispersión del

organismo patógeno, y concuerda con la utilización de mancozeb, ya que

trabajos recientes han demostrado que el cobre asociado con este fungicida

de la familia de los ditiocarbamatos aumenta la eficacia del cobre. Del mismo

modo, WICK (1991); SIKORA, GAZAWAY y MULLEN (1998) y DAVIS et al.

(2003) señalan que al adicionar hidróxido de cobre y mancozeb se aumenta

la efectividad del cobre y lo sugieren como una medida de control efectiva.

En otro ámbito, recientes experiencias indican que Actigard 50WG

(Acibenzolar-S-metil) tiene la habilidad de inducir la resistencia sistémica

adquirida SAR para un gran número de patógenos en diferentes cultivos.

Esto se evaluó en el manejo de la peca bacteriana en experimentos

realizados en tomate en distintas localidades de Estados Unidos,

concluyendo después de un periodo de cuatro años de estudio que Actigard

50WG puede ser integrado como una alternativa viable junto a bactericidas a

base de cobre para el manejo de esta enfermedad, particularmente donde

predominen las poblaciones resistentes al cobre (LOUWS et al., 2001). En

relación con esto, JETT (2003) añade que actuales estudios de la

Universidad de Kentucky, indican que programas de aspersiones de 14 días

con Actigard 50WG pueden proporcionar un aceptable control de la

enfermedad, al igual que MAcNAB (2004a) que también lo sugiere como una

herramienta de control.

12

RIEDEL (2000) señala que Actigard 50WG tiene un modo de la acción único,

distinto al de los fungicidas y bactericidas actualmente disponibles, puesto

que no tiene ninguna actividad directa sobre los patógenos de la planta, por

lo tanto la probabilidad de desarrollar resistencias o insensibilidad en el

patógeno es escasa.

Es importante destacar que el cobre proporciona un control parcial de la

enfermedad, por lo cual se debe aplicar al aparecer los primeros síntomas y

repetir a intervalos de 10 o 14 días si las condiciones frescas y húmedas

prevalecen. Se utiliza idealmente como producto preventivo, por lo cual debe

ser aplicado antes de que ocurra el periodo de la infección. Una o dos

aplicaciones serán suficientes para proteger a las plantas de tomates durante

las etapas más susceptibles del crecimiento (DAVIS et al., 2003).

Por otra parte, el uso de la estreptomicina debe ser restringida

exclusivamente a aplicaciones en plántulas de tomate previo al transplante,

idealmente cuando la primera hoja verdadera aparezca, continuando las

aplicaciones cada cuatro o cinco días hasta transplantar (WICK, 1991;

VENETTE, LAMEY y SMITH, 1996; MAcNAB, 2004b; ZITTER, 2005).

Finalmente DAVIS et al. (2003) se refieren a los controles culturales. Los

autores mencionan el retraso de las plantaciones para escapar de las

condiciones frescas y húmedas que favorecen el desarrollo de la

enfermedad, y las aspersiones de cobre tempranas en la temporada, ambos

como métodos de control aceptados para la producción orgánica certificada.

13

Además RISTA (2005), añade que para complementar un manejo integrado

en invernaderos es conveniente el control de la humedad, evitando la

presencia de agua libre en las plantas, ventilando en forma constante.

2.4. Mancha foliar de syringae o “syringae leaf spot”:

2.4.1. Agente causal

El agente causal de esta enfermedad es Pseudomonas syringae pv. syringae

van Hall 1902 (DYE et al., 1980).

2.4.2. Hospederos

Pseudomonas syringae pv. syringae, es sin lugar a dudas la bacteria

fitopatógena más polífaga y ubicua, capaz de causar infección en alrededor

de 170 especies diferentes y además puede ser encontrada fácilmente en

forma epífita (SCORTICHINI, 1995).

2.4.3. Sintomatología

En tomate los síntomas en las hojas pueden variar desde manchas café que

no tienen halo, hasta manchas negras con aureolas amarillo fuerte, que se

asemejan bastante a aquellas causadas por el patovar tomato, pero de

mayor tamaño. Sin embargo, es necesario aislar la bacteria y realizar

pruebas de laboratorio para determinar qué patógeno está involucrado

(GABOR y WIEBE, 1997).

GITAITIS (1993) indica que los síntomas varían desde pequeñas lesiones

color café sin halos a lesiones casi negras con halos color amarillo fuerte,

14

igual a aquellos causados por P. syringae pv. tomato. En ocasiones el

patógeno puede originar necrosis marginal aislada, extensas áreas marchitas

y tejidos que aparentemente han sufrido heladas, siendo difícil reproducir los

síntomas en un invernadero.

2.4.4. Diseminación y sobrevivencia

P. syringae pv. syringae en plantas de tomate es considerado un patógeno

débil y oportunista, que se encuentra frecuentemente en heridas y como un

organismo secundario, presente en infecciones mixtas con otros patógenos

que causan manchas en hoja (GITAITIS, 1993; GABOR y WIEBE, 1997). La

bacteria sobrevive tanto en plantas hospederas como no hospederas en un

estado no parasitario, y puede diseminarse desde esas plantas cuando las

condiciones medio ambientales frías y húmedas favorecen el desarrollo de la

enfermedad (GABOR y WIEBE, 1997).

En frutales de carozo la infección se produce a través de estomas, la bacteria

se propaga intercelularmente produciendo el colapso y muerte de las células,

dando origen a pequeñas manchas de forma irregular. Cuando el clima es

húmedo, las bacterias exudan de las manchas y se propagan hacia otras

hojas por contacto directo, a través de insectos, lluvia y otros factores

(AGRIOS, 1996)

2.4.5. Factores predisponentes

El patógeno requiere de heridas para infectar el tejido vegetal y puede invadir

lesiones ya existentes causadas por otra enfermedad (GABOR y WIEBE,

1997).

15

GITAITIS (1993) coincide señalando que el desarrollo de la enfermedad en

tomate se favorece por alta humedad y heridas. Además, las únicas fuentes

conocidas de inóculo son otros hospederos, siendo los más comunes: el

centeno, que se usa como cubierta verde de invierno y árboles de cerezo

silvestre que bordean las plantaciones. Áreas con gran número de cerezos

tiene una alta incidencia de P. syringae pv. syringae cada año. En el estado

de Georgia, Estados Unidos, esta enfermedad se concentra en abril durante

la época fría, en cambio, P. syringae pv. tomato y Xanthomonas campestris

pv. versicatoria se desarrollan en mayo, cuando las temperaturas promedio

durante el día han aumentado.

2.4.6. Incidencia e importancia económica

Esta enfermedad usualmente no se encuentra en tomate y en caso de

presentarse no es común que se produzca daño económico (GABOR y

WIEBE, 1997).

GITAITIS (1993) señala que el diagnóstico correcto es crítico, ya que P.

syringae pv. syringae es relativamente inocua. Consecuentemente, en el

programa de certificación para la producción de plantines de tomate del

Estado de Georgia (Estados Unidos), sólo las plántulas que tienen P.

syringae pv. syringae se les permite mantener su certificado libre de

enfermedades, y las plantas que tienen P. syringae pv. tomato o

Xanthomonas campestris pv. versicatoria son puestas en cuarentena.

El mismo autor indica que en la zona del sureste de Estados Unidos se

presentó una mayor incidencia de P. syringae pv. syringae, y por lo tanto, fue

necesario un análisis de laboratorio más específico y costoso en el programa

de certificación de esta área.

16

2.4.7. Estrategias de control

GABOR y WIEBE (1997) recomiendan hacer aspersiones de cobre, pero al

no ser comunes los daños económicos esta práctica generalmente no es

necesaria. Si se sospecha de esta enfermedad se debe verificar que los

síntomas son causados por P. syringae pv. syringae y no por otra

enfermedad bacterial que requeriría un control más estricto.

GITAITIS (1993) coincide con los autores mencionados en el párrafo anterior

y además recomienda aplicaciones semanales de bactericidas para controlar

esta enfermedad adecuadamente. Asimismo, advierte la importancia de

comprobar que efectivamente P. syringae pv. syringae es el causante del

problema, para lo cual se debe realizar una caracterización acuciosa y

rigurosa del agente causal, especialmente en aquellos casos en que la

enfermedad requiera tratamientos de control más duros.

2.5. Caracterización de los aislados:

La correcta identificación de enfermedades bacterianas que causan manchas

pequeñas sobre hojas de plantines de tomate, es muy difícil si el diagnóstico

está basado exclusivamente en los síntomas. Sin embargo, existen pruebas

útiles para distinguir entre P. syringae pv. syringae y P. syringae pv. tomato,

patógenos que probablemente pueden ser confundidos (GITAITIS, 1993).

Similares antecedentes entrega SCORTICCHINI (1995), quien indica que la

gran versatilidad bioquímica de las bacterias, permite discriminar entre las

especies y patovares. Ello se realiza en base a la capacidad del aislado de

utilizar compuestos orgánicos particulares, producir pigmentos, crecer en

17

condiciones de temperatura específicas y provocar reacciones características

de hipersensibilidad, entre otras pruebas específicas.

Otra característica fenotípica útil para caracterizar un aislado en etapa de

estudio, es la producción de proteínas que desarrollan funciones

catalizadoras en la formación de núcleos de hielo. Este es uno de los

factores de virulencia más desarrollados entre las bacterias fitopatógenas y

que permite discriminar entre ellas (BRAUN-KIEWNICK y SANDS, 2001).

Por su parte YOUNG y TRIGGS (1994) indican que existen ensayos claves

para la caracterización de los patovares syringae y tomato de Pseudomonas

syringae, estos son el estudio de la capacidad para formar núcleos de hielo

“ice nucleation” y la utilización de los sustratos orgánicos eritritol y DL-lactato

como únicas fuentes de carbono.

Los dos organismos mencionados en el párrafo anterior también se pueden

diferenciar por sus perfiles de ácidos grasos. Aunque los dos perfiles son

casi idénticos, el patovar syringae contiene una cantidad significativa de

ácido δ-cis-9 hexadecanoico, 10-metileno, compuesto que está ausente en el

patovar tomato. Por lo tanto, las pruebas más importantes para discriminar

entre estos patovares son la utilización de eritritol, y DL-lactato por parte de P.

syringae pv. syringae, que lo diferencia de P. syringae pv. tomato el cual no

utiliza estos compuestos. Además, las cepas de P. syringae pv. syringae son

activas a la nucleación de hielo, lo cual también puede diferenciar éste

organismo de P. syringae pv. tomato (Cuadro 1).

Es importante destacar que las cepas de P. syringae pv. syringae inducen

una reacción de patogenicidad marcada en el cultivar caupí (Vigna

unguiculata (L.)), variedad California Blackeye N°3, lo cual también puede

18

diferenciar éste organismo de P. syringae pv. tomato. (GITAITIS, 1993).

Referente a esto, OTTA y ENGLISH (1971) junto a LAY y HASS (1973),

coinciden en señalar al test de patogenicidad en frejol caupí como una

instancia adecuada para el reconocimiento de P. syringae pv. syringae, por

ser una planta indicadora específica para este patovar y no así para patovar

tomato.

CUADRO 1. Identificación de cepas de Pseudomonas syringae pv. syringae y Pseudomonas syringae pv tomato

Reacción Test P. syringae pv.

syringae P. syringae pv

tomato Reacción gram - -

Arginina dihidrolasa - - Reacción citocromo oxidasa - - Hipersensibilidad en tabaco + +

Fluorescencia en MB de King + + Utilización de eritritol + - Utilización DL-lactato + -

Formación de núcleos de hielo + - Fuente: BRADBURY (1986)

Esta información aún está vigente y ha sido citada por SCHAAD (1980),

JONES (1993), GITAITIS (1993), YOUNG y TRIGGS (1994), SCORTICCHINI

(1995), LUDWIG y KLENK (2001) y BRAUN-KIEWNICK y SANDS (2001).

El sistema de clasificación en patovares se adapta a las necesidades

prácticas de los patólogos vegetales, pero no refleja necesariamente las

relaciones genéticas reales entre las cepas. Sin embargo, la llegada de la

biología molecular ha causado un cambio significativo en el tipo de

herramienta utilizada, permitiendo una caracterización y clasificación mucho

más rápida y fiable. Los protocolos que analizan ácidos nucleicos reducen el

19

tiempo utilizado, parecen producir resultados más estables y repetitivos, con

frecuencia reflejan más fielmente las relaciones filogenéticos y son útiles para

ordenar las cepas en grupos (ROSALES, 2005).

CINTAS, BULL y KOIKE (2002) mencionan que una alternativa actualmente

muy utilizada corresponde a la caracterización genotípica mediante rep-PCR,

donde una reacción en cadena de la polimerasa reconoce cadenas repetidas

de ADN bacteriano. Con esta reacción de la polimerasa de ADN en cadena

usando iniciadores de óligonucleótidos dirigidos a distintas secuencias, se

pueden generar patrones de fragmentos de ADN, dichos patrones se llaman

huellas digitales del ADN. Estos métodos se usan tanto para investigar la

diversidad genética dentro de las poblaciones de cepas como para agrupar

las cepas bacterianas, y se basan en la variación genética en las secuencias

blanco localizadas en los genomas que sirven para anclar a los iniciadores.

Los productos sintetizados por la reacción de PCR se separan por

electroforesis en base a su tamaño molecular y su secuencia de nucleótidos.

Los iniciadores comunes usados en la caracterización de bacterias son los

de las secuencias “BOX” (BOX-PCR) y los que sirven para las secuencias

repetidas extragénicas y palindrómicas (rep-PCR) entre otros (WANG y

MARTÍNEZ-ROMERO, 2000).

2.6. Principales variedades de tomate utilizadas en la provincia de Quillota, V

región:

Fortaleza. Híbrido indeterminado precoz, para producciones de ciclo corto en

condiciones de frió y baja luminosidad. Variedad multilocular estructural, de

vigor moderado, con hojas pequeñas que permite una alta densidad de

plantación, una buena ventilación, penetración de luz y productos

fitosanitarios, estas características hacen que sea una variedad ampliamente

20

utilizada en el valle de Quillota para el tomate de cultivo primor

(BIOAMERICA, 2004).

Naomi. Híbrido indeterminado precoz y de cosecha concentrada. Variedad

multilocular estructural, caracterizada por un excelente vigor, abierta con

buena ventilación, se utiliza como tomate de otoño en la zona central de

Chile, por el mayor rendimiento en comparación con los multiloculares

tradicionales (BIOAMERICA, 2004).

FA-593. Variedad larga vida indeterminada, caracterizada por un buen vigor,

tendiente al crecimiento vegetativo. Se utiliza como cultivo trastomate o

tomate de otoño en el valle central de Chile (DEVIA, 2004)*.

Yonit. Al igual que FA-593, es una variedad larga vida. Tomate hibrido

indeterminado, que se caracteriza principalmente por su escaso vigor, su

gran precocidad y rusticidad. Ideal para el uso en invernadero

(TATTERSALL, 2003).

* DEVIA, J. Ing.Agr. 2004. Profesor cátedra cultivos forzados. Universidad

Católica de Valparaíso. Facultad Agronomía. Comunicación personal.

21

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Los ensayos fueron llevados a cabo en el Laboratorio e Invernadero del área

de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad

Católica de Valparaíso, ubicada en la comuna de Quillota, V región

(coordenadas 32º Lat Sur y 71º Long Oeste).

Se trabajó en un invernadero de madera tipo capilla con cubierta de

polietileno transparente, de dimensiones: 9 m de ancho, 15 m de longitud y

una altura de 3,10 m en el punto más alto. En el Anexo 1, se presenta el

comportamiento térmico y de humedad relativa, registrados en un

invernadero similar en la localidad de La Palma.

Los aislados de Pseudomonas se obtuvieron a partir de 12 muestras de

tomate cv. Fortaleza de cinco diferentes predios, las cuales fueron

identificadas tentativamente como Pseudomonas syringae. La sintomatología

que presentaron las plantas naturalmente infectadas (Figura 3 a), a partir de

las cuales se aislaron las cepas bacterianas, se caracterizó por la presencia

de manchas necróticas rodeadas de halo clorótico en los folíolos y un severo

atizonamiento de pecíolos y tallos, esta presencia de lesiones corticales

necróticas no comprometía el tejido vascular y su movimiento a través del

tallo se iniciaba desde la zona basal de las plantas hasta la parte alta, donde

se detiene el atizonamiento sin comprometer frutos.

Los aislados 627.1, 627.2, 627.3, 593.1, 593.2 593.3, 593.4, 588.1 588.2,

290, Sta. Rosa y McLean, fueron recuperadas a partir de conservados

liofilizados, los que habían sido aislados desde plantas enfermas en la

primavera del año 2003. Para su reactivación las cepas se sembraron sobre

22

un medio B de KING (MBK) (LELLIOTT y STEAD, 1987) y tras cinco días de

incubación a 23ºC se repicaron a partir de una colonia sobre placas del

mismo medio de cultivo, para purificar y obtener nuevo inóculo.

3.1. Caracterización de aislados de Pseudomonas syringae (in vitro):

3.1.1. Utilización de sustratos orgánicos

A todos los aislados mencionadas en el párrafo anterior, junto con la cepa

112 correspondiente a P. syringae pv. syringae, se les realizó pruebas de

crecimiento de colonias sobre dos distintas fuentes de carbono: eritritol y DL-

lactato. Se utilizó 1 g de la fuente de carbono en 1000 ml del medio de sales

minerales Ayers, el cual para un litro de medio requiere: 1 g de NH4H2PO4,

0,2 g de KCl, 0,2 g de MgSO4x7H2O, 1 ml de bromotimol azul 1,6% p/v en

95% de etanol y 12 g de agar. Antes de autoclavar el medio se ajustó el pH a

7,2. Luego de 20 minutos en autoclave se dejó enfriar, se traspasó a placas

Petri, luego de dos días se sembró las bacterias mediante un estriado y se

incubó a 27°C por 3, 7 y 14 días. El crecimiento se comparó con placas que

no contenían una fuente de carbono (LELLIOTT y STEAD, 1987;

SCORTICHINI, 1995).

3.1.2. Capacidad de formar núcleos de hielo

Inicialmente los aislados 290, 588, 593, Sta Rosa y 112 se hicieron crecer

por dos días a 25ºC sobre el medio LPGA, el cual está compuesto por 5 g de

extracto de levadura, 5 g de peptona, 5 g de glucosa y 15 g de agar. Luego

de dos días de crecimiento se preparó una suspensión de 1x109 u.f.c./ml que

se introdujo en tubos estériles, además se prepararon tubos control que

contenían sólo agua destilada estéril. Posteriormente los tubos se

23

sumergieron por cinco minutos en un recipiente de plástico con una solución

anticongelante (NaCl 2 M) a una temperatura estable de -4°C, que se logró

utilizando un congelador horizontal con termostato ajustable, el cual se

instaló dentro de una cámara frigorífica a temperatura constante de -1°C

perteneciente al Laboratorio de Poscosecha. Se registró un resultado

positivo, cuando el líquido contenido en el tubo donde fue puesta la

suspensión bacteriana, se congeló claramente. Se verificó que en los tubos

control no se presentara congelación. Esta prueba se repitió dos veces

(SCORTICHINI, 1995; CINTAS, BULL y KOIKE, 2002).

3.2. Ensayos de virulencia, susceptibilidad varietal y patogenicidad (in vivo):

Se realizaron tres ensayos bajo condiciones de invernadero, el primero

consistió en evaluar en un cultivo de tomate cv. Fortaleza, la virulencia de

cinco cepas de las cuales, una era P. syringae pv. syringae y las cuatro

restantes correspondieron a aislados causantes de la nueva sintomatología

en plantas de tomate. En el segundo ensayo se utilizó uno de los cuatro

aislados anteriormente analizados causantes de la nueva sintomatología,

para evaluar susceptibilidad en cuatro variedades de tomate. En el tercer

ensayo se realizó la prueba de patogenicidad en frejol caupí, utilizando las

mismas cepas del Ensayo 1.

3.2.1. Ensayo 1: Evaluación de virulencia de cuatro aislados de P. syringae

causantes de la nueva sintomatología.

Este primer ensayo constó con seis tratamientos, con cinco cepas

bacterianas y un testigo en plantas de tomate con cinco hojas verdaderas. Se

empleó una cepa de Pseudomonas syringae pv. syringae contrastada con

24

cuatro aislados de Pseudomonas syringae causantes de la nueva

sintomatología.

Se trabajó con plántulas de tomate variedad Fortaleza donadas por Quintil

S.A., las cuales fueron sembradas el 20 de abril en bandejas almacigueras

de 286 alvéolos. El día 28 de mayo fueron transplantadas en bolsas

individuales de polietileno negro con un volumen de sustrato de siete litros y

llevadas a invernadero frío, donde se mantuvieron todo el ensayo. El sustrato

consistió en una mezcla de 60% de tierra de hoja, 20% de suelo franco

arcilloso y 20 % de arena, el cual fue vaporizado y esterilizado el día 26 de

mayo.

Una semana después del transplante se inoculó con las cepas

correspondientes a cada uno de los tratamientos (ver sección 3.2.1.2.),

conservadas en forma liofilizada y estriadas a MBK para su purificación y

multiplicación.

El cultivo presentó durante el periodo del ensayo ataques de mosquita blanca

(Trialeurodes vaporariorum) y de polilla del tomate (Tuta absoluta). Para su

control se utilizó productos tales como Confidor 350 SC (i.a. imidacloprid) y

Evisect-S (i.a. thiocyclam) en dosis comerciales para mantener la sanidad

vegetal de la parte aérea mediante aspersiones foliares. Durante el ensayo

no se empleó ningún bactericida o fungicida.

En cuanto al manejo de riego y fertilización, se realizaron riegos semanales y

para esto se utilizó un sistema de riego presurizado, formado por una matriz

a la cual estaban conectadas cuatro líneas de riego de 16 mm y a estas los

microtubos con gasto de 4 l/h (un emisor por planta). La fertilización consistió

25

en la aplicación semanal vía riego de tres fertilizantes, las dosis utilizadas se

presentan en el Anexo 2.

3.2.1.1. Método de obtención y aislamiento del inóculo

Las cinco cepas se obtuvieron a partir de la recuperación de conservados

liofilizados. Para reactivarlas se sembraron sobre un MBK. Tras cuatro días

de incubación a 23°C se repicaron nuevamente sobre otras placas del mismo

medio para aumentar la cantidad del inóculo.

Una vez recuperadas las cinco cepas a inocular, se procedió a repicar

nuevamente cada una de ellas, a partir de una colonia en una nueva placa

de MBK, con el fin de obtener un cultivo puro para todas las cepas. Una vez

transcurridas 48 horas (máximo) desde el repique se realizó el test de

LOPAT (LELLIOTT, BILLING y HAYWARD, 1966) a todas las cepas.

3.2.1.2. Forma de inoculación

Para la obtención del inóculo de las cinco cepas, se procedió a sembrar en

placas con cada una de ellas. Luego de dos días de incubación con un

crecimiento bacteriano abundante, se diluyó el contenido de cada placa en

40 ml de agua destilada estéril, midiendo posteriormente la transmitancia de

la suspensión en un espectrofotómetro a 580 nm, aceptándose una lectura

de 50% para asegurar una adecuada concentración del patógeno (en este

caso corresponderá a 1 x 108 ufc/ml, cantidad suficiente para lograr un

adecuado y homogéneo nivel de desarrollo de Pseudomonas syringae).

La solución bacteriana se aplicó sobre las hojas de las plantas de tomate una

semana luego del transplante (4 de junio). Previo a la inoculación, las hojas

26

de las plantas de cada tratamiento se asperjaron con carborundum, y luego

la superficie se rozó para generar microheridas en la epidermis de las plantas

y facilitar el ingreso del patógeno. Luego se utilizó un asperjador manual

estéril, hasta dejar la epidermis notoriamente húmeda con la suspensión

bacteriana. Es importante destacar que las plantas testigo también fueron

frotadas con carborundum y posteriormente rociadas con agua destilada

estéril.

Inmediatamente post inoculación de cada planta, se cubrió cada una de ellas

con una bolsa de polietileno transparente, cerrándola con un elástico para

evitar el contagio entre tratamientos y lograr un efecto de cámara húmeda. El

plástico se retiró luego de tres días.

Para evitar el contagio entre tratamientos se inició la inoculación por los

testigos (T1) y siguiendo uno a uno en orden con los otros tratamientos. En la

medida que se avanzó en la inoculación, luego de cada tratamiento por

bloque (10 plantas) se realizó una minuciosa desinfección de manos con

hipoclorito de sodio (0,1%).

3.2.1.3. Tratamientos

Con el fin de evaluar y comparar el comportamiento y daño ocasionado por

los aislados causantes de la nueva sintomatología versus P. syringae pv.

syringae, se realizaron los siguientes tratamientos:

Tratamiento 1: Testigo, sin inoculación

Tratamiento 2: Cepa 112 de P. syringae pv. syringae

Tratamiento 3: Aislado Cepa 290

Tratamiento 4: Aislado 588

27

Tratamiento 5: Aislado 593

Tratamiento 6: Aislado Sta. Rosa

3.2.1.4. Diseño estadístico

El experimento se condujo mediante un diseño de bloques completos al azar.

La unidad experimental correspondió a 10 plantas, las que fueron

observadas y evaluadas. Se realizaron seis tratamientos incluyendo un

testigo, los cuales se distribuyeron aleatoriamente sobre cada una de las

cuatro repeticiones (cuatro bloques) en el invernadero del ensayo. Los

factores de bloqueo fueron riego y luminosidad dentro del invernadero. La

distribución de este ensayo se representa en el Anexo 3.

Para la evaluación del experimento, los datos se sometieron a un análisis de

varianza mediante la Prueba de significancia de Fisher (prueba F) y cuando

el valor P asociado al estadístico F fue ≤ 0,05, se realizó una comparación de

medias con el test de Tukey (α=0,05).

3.2.1.5. Variables evaluadas

Las variables se eligieron de acuerdo al tipo de daño ocasionado por el

patógeno, por tratarse de una enfermedad que se caracteriza por producir

lesiones a nivel foliar y de tallo, se evaluó el efecto del patógeno en la planta

considerando daños en el follaje, pecíolos y tallo, a través del estudio del

porcentaje de incidencia de la enfermedad (usando como criterio la

observación de presencia y ausencia de síntomas en las plantas de cada

tratamiento mediante un seguimiento de éstos), y estimaciones del índice de

daño de la enfermedad (utilizando una escala de daño o lesiones causadas

por las distintas cepas de Pseudomonas syringae).

28

La fórmula utilizada es la siguiente:

% de Incidencia (I) = Nº de plantas enfermas por unidad x 100

Total de plantas observadas (sanas más enfermas)

(COMMONWEALTH MYCOLOGICAL INSTITUTE, 1985).

Para efectos del índice de daño, se utilizó la siguiente escala:

0 Ausencia de síntomas, planta sana.

1 Manchas necróticas puntiformes en escaso número sobre las

hojas.

2 Manchas necróticas puntiformes sobre las hojas y atizonamiento

de pecíolos.

3 Manchas necróticas puntiformes esparcidas sobre las hojas y

atizonamiento del tallo.

A través de la observación visual se estableció una nota dentro de la escala

de 0 a 3 para cada una de las plantas y posteriormente se obtuvieron los

promedios para cada tratamiento.

La evaluación fue realizada un mes después del transplante, cuando se

evidenciaron los síntomas en las plantas (2 de julio).

3.2.2. Ensayo 2: Evaluación de la susceptibilidad de cuatro variedades de

tomate al aislado 593.

En este ensayo se trabajó con plántulas de tomate de diferentes variedades:

Fortaleza, Naomi, FA 593 y Yonit. Estas fueron producidas por Euro Plant

29

Chile S.A., con siembra el 15 de junio en bandejas almacigueras de 286

alvéolos para la obtención del almácigo. El día 26 de julio de 2004 fueron

transplantadas en bolsas individuales de polietileno negro con un volumen de

sustrato de siete litros y llevadas a invernadero frío. El sustrato fue formulado

de igual manera que en el Ensayo 1.

El día 5 de agosto se procedió con la inoculación de los tratamientos. El

testigo con agua destilada estéril y el resto con el aislado 593 recuperado

desde frascos conservados en forma liofilizada.

En relación a los manejos fitosanitarios, de riego y fertilización de cultivo,

éstos se desarrollaron del mismo modo que los descritos en el Ensayo 1.

3.2.2.1. Método de obtención y aislamiento del inóculo

Para obtener el aislado 593 se procedió con la recuperación de conservados

liofilizados, se reactivó la cepa sembrándose sobre un medio B de King y tras

cuatro días de incubación se repicó nuevamente sobre otras placas de este

mismo medio para aumentar la cantidad del inóculo. Luego se volvió a

repicar sobre 20 placas, cada una de ellas a partir de colonias individuales.

3.2.2.2. Forma de inoculación

Luego de dos días de incubación con un crecimiento bacteriano abundante,

se diluyeron las 20 placas en 800 ml de agua destilada estéril y al igual que

el Ensayo 1, se midió su transmitancia a 580 nm en un espectrofotómetro,

ajustada a una lectura de 50%.

30

El proceso de inoculación fue el mismo realizado en el Ensayo 1 (también los

tratamientos testigos).

La solución bacteriana fue aplicada sobre hojas de las plantas de tomate el

día 5 de agosto de 2004, 10 días después de la plantación utilizando un

asperjador manual estéril, hasta dejar la epidermis a punto de escurrimiento.

Luego de la inoculación, al igual que el Ensayo 1, se procedió a cubrir cada

planta con una bolsa de polietileno transparente. El plástico se retiró el 7 de

agosto.

3.2.2.3. Tratamientos

El ensayo constó de los siguientes tratamientos:

Tratamiento 1: Variedad Fortaleza sin inoculación

Tratamiento 2: Variedad Fortaleza inoculada con aislado 593

Tratamiento 3: Variedad Naomi sin inoculación

Tratamiento 4: Variedad Naomi inoculada con aislado 593

Tratamiento 5: Variedad FA 593 sin inoculación

Tratamiento 6: Variedad FA 593 inoculada con aislado 593

Tratamiento 7: Variedad Yonit sin inoculación

Tratamiento 8: Variedad Yonit inoculada con aislado 593

3.2.2.4. Diseño estadístico

Los experimentos fueron conducidos mediante un diseño de bloques

completos al azar. La unidad experimental correspondió a 10 plantas, las que

fueron observadas y evaluadas. Se realizaron ocho tratamientos incluyendo

31

un testigo los cuales se distribuyeron aleatoriamente sobre cada una de los

cuatro bloques en la nave de invernadero del ensayo. Se procedió a bloquear

los tratamientos debido a las variables riego y luminosidad dentro del

invernadero. La distribución de los tratamientos se observa en el Anexo 4.

El análisis de datos fue igual al Ensayo 1.

3.2.2.5. Variables evaluadas

Al igual que en el Ensayo 1, el daño fue estudiado mediante estimaciones del

índice de daño y el porcentaje de incidencia de la enfermedad. Se

consideraron además las variables altura, peso fresco y peso seco, con la

intención de establecer diferencias en la agresividad del ataque de acuerdo a

la variedad.

La evaluación de la escala de daño fue realizada un mes después de la

inoculación, el día 2 de septiembre de 2004, cuando se evidenciaron los

síntomas en la parte aérea de las plantas.

Para la evaluación de las variables altura de plantas, peso fresco y peso

seco, se cosecharon las plantas extrayéndolas con el sistema radical lo más

íntegro posible. La altura de la planta se obtuvo midiendo la distancia desde

el cuello hasta el ápice de las plantas, utilizándose una huincha graduada en

centímetros. Consecutivamente se procedió a lavar las raíces, las cuales

fueron secadas con papel absorbente y debidamente pesadas junto con el

follaje. Posteriormente cada planta se secó a 62ºC hasta lograr un peso

constante, para luego medir el peso seco.

32

Para el análisis estadístico de estas tres variables se procedió a realizar un

test de Tukey a las diferencias obtenidas entre los tratamientos testigos y los

tratamientos inoculados para cada variedad. El objetivo fue obtener el

porcentaje de disminución de cada una de las variables, para las cuatro

variedades.

3.2.2.6. Recuperación de Pseudomonas syringae desde lesiones y tejido

sano de plantas de tomate con nueva sintomatología.

Se realizó un seguimiento de la bacteria a lo largo de la planta, para lo cual

se eligieron al azar dos plantas enfermas por variedad y se efectuaron

aislamientos a partir de tejido de tres puntos de las plantas enfermas: desde

la zona de avance considerada como zona basal, a 5 cm del punto anterior

hacia el ápice o zona media y a 10 cm de la zona de avance o zona alta. Los

trozos de tallo se cortaron con un bisturí estéril. Los tejidos fueron

desinfectados bajo cámara de flujo laminar del laboratorio, con hipoclorito de

sodio al 1 % por 15 segundos; luego, se lavaron tres veces con agua

destilada estéril, se maceraron, y el extracto fue sembrado con un asa en

placas Petri en MBK. Estas placas se identificaron, se sellaron con parafilm y

luego se colocaron en estufa a 23ºC por dos días, para posteriormente

verificar la fluorescencia de las placas bajo luz cercana a ultravioleta (320

nm). Se evaluó desde que zona existía crecimiento bacteriano, para estudiar

si la enfermedad se desarrolla en forma sistémica.

3.2.3. Ensayo 3: Test de patogenicidad en frejol caupí.

Para efectuar el test de patogenicidad se emplearon las semillas de frejol

caupí variedad Blackeye, las cuales fueron facilitadas por el Ingeniero

Agrónomo, M. Sc. Gabriel Bascur B. del Departamento de Horticultura y

33

Cultivos del Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, CRI-INIA La

Platina.

El día 11 de noviembre de 2004, se inició el proceso de imbibición de las

semillas en agua destilada estéril por 24 horas; posteriormente se

introdujeron en placas Petri con papel absorbente levemente húmedo. Las

placas se incubaron a 23°C en estufa durante dos días para inducir el

proceso de germinación.

El día 15 de noviembre de 2004, se sembraron semillas previamente

germinadas y a las tres semanas de crecimiento se procedió con la

inoculación de las plantas. Al igual que en el primer y segundo ensayo se

utilizó carborundum, para generar microheridas en los folíolos de las plantas

y facilitar el ingreso del patógeno.

La recuperación de los aislados 588, 593, Sta Rosa, Mclean y 112

correspondió al mismo proceso realizado en los ensayos anteriores, y la

inoculación de las soluciones bacterianas se realizó mediante un asperjador

manual estéril, hasta dejar las hojas de las plantas de caupí notoriamente

húmedas. Las plantas testigo también fueron rociadas con carborundum y

posteriormente fueron asperjadas con agua estéril.

Post inoculación todas las plantas fueron cubiertas en bolsas transparentes

de polietileno por 36 hrs para proveer de alta humedad. Las plantas fueron

ubicadas en un invernadero climatizado en un rango de temperatura entre 15

y 25ºC. Los síntomas fueron registrados 15 días después de la inoculación.

34

3.3. Análisis realizados por IMI, Inglaterra:

El día 28 de diciembre 2004 fue enviado el aislado 593 al CAB International

Mycological Institute, Inglaterra, para corroborar la identificación del agente

causal. En este instituto se identificó la especie y patovar mediante análisis

de ácidos grasos y descripción molecular utilizando la técnica rep-PCR.

35

4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1. Caracterización de los aislados de Pseudomonas syringae (in vitro):

4.1.1. Utilización de sustratos orgánicos

A través del cambio en la coloración en el medio de cultivo Ayers y a la

fluorescencia bajo luz ultra violeta, que indica crecimiento de la cepa

bacteriana a causa de la utilización de la fuente de carbono adicionada, se

evaluó el uso tanto de eritritol como DL-lactato, por parte de los aislados

causantes de la nueva sintomatología y de P. syringae pv. syringae (cepa

112), cuyos resultados se presentan en el Cuadro 2.

CUADRO 2. Análisis de aislados de Pseudomonas syringae enfrentándose a diferentes fuentes de carbono.

Medio Cepa 112 (pv. syringae) Aislados 290 - 593 - 588 - McLean - Fdo. Sta Rosa

Ayers Medio base de color celeste.

Sin fluorescencia en UV.

Medio base de color celeste .

Sin fluorescencia en UV.

Ayers con

Eritritol

Medio de color celeste amarillo.

Con fluorescencia

Cepa 112 eritritol positivo

Medio de color celeste claro.

No presentan fluorescencia

Respuesta negativa

Ayers con

DL-lactato

Medio vira a azul.

Con fluorescencia

Cepa 112 DL-lactato positivo

Medio de color celeste claro.

No presentan fluorescencia

Respuesta negativa

36

Se debe considerar que el medio base de sales minerales Ayers se utiliza

como control.

El análisis muestra en el Cuadro 2, que sólo la cepa 112 correspondiente a

P. syringae pv. syringae presenta un viraje en la coloración del medio, lo cual

corrobora lo descrito por SCORTICCHINI (1995), que indica un cambio de

coloración en el medio de cultivo como la respuesta positiva, debido al

crecimiento bacteriano.

Además SCHAAD (1980), GITAITIS (1993), YOUNG y TRIGGS (1994),

SCORTICCHINI (1995) y BRAUN-KIEWNICK y SANDS (2001), señalan que

P. syringae pv. syringae tiene respuesta positiva a la utilización de eritritol y

DL-lactato y no así P. syringae pv. tomato.

Asimismo, JONES, McCARTER y GITAITIS (1986), obtuvieron crecimiento y

fluorescencia, al analizar la utilización de DL-lactato como fuente de carbono

para las cepas de P. syringae pv. syringae; la misma respuesta obtuvieron al

utilizar como sustrato orgánico de crecimiento a eritritol. Por otro lado, las

pruebas realizadas a las cepas de P. syringae pv. tomato no mostraron

crecimiento ni fluorescencia para ambas fuente de carbono.

4.1.2. Capacidad de formar núcleos de hielo

La capacidad de formar núcleos de hielo por las bacterias en estudio, se

evaluó mediante la congelación de las suspensiones bacterianas a -4°C. Los

resultados se visualizan en la Figura 1 a, donde se evidencia claramente que

sólo una suspensión bacteriana se congela y es la correspondiente a la cepa

112 de P. syringae pv. syringae. Ninguno de los aislados causantes de la

nueva sintomatología fue capaz de congelarse.

37

Estos resultados coinciden con lo señalado por GITAITIS (1993) y LUDWIG y

KLENK (2001) quienes indican que las cepas de P. syringae pv. syringae son

activas a la nucleación de hielo, lo cual diferencia este organismo de P.

syringae pv. tomato.

Además los resultados concuerdan con estudios anteriores (JONES,

McCARTER y GITAITIS, 1981; BONN y GITAITIS, 1987; SCORTICHINI,

1995; CINTAS, KOIKE y BULL, 2002) que ratifican la capacidad de formar

núcleos de hielo en diferentes cepas de Pseudomonas syringae y

concuerdan con la utilidad de esta técnica para discriminar entre los

patovares en estudio.

38

FIGURA 1. (a) Respuesta a la capacidad de formar núcleos de hielo de

diferentes aislados bacterianos causantes de la nueva sintomatología, una cepa de P. syringae pv. syringae (2ª de izq. a derech.) y un tratamiento testigo. (b) Recuperación del aislado 593 desde tres puntos de la planta en placas con medio B de King observadas bajo luz ultravioleta. Las placas desde izquierda a derecha corresponden a la zona de avance, zona media (a 5 cm de la zona de avance hacia el ápice) y zona alta (a 5 cm de la zona anterior).

a

b

39

4.2. Ensayos de virulencia, susceptibilidad varietal y patogenicidad (in vivo):

4.2.1. Ensayo 1: Evaluación de virulencia de cuatro aislados de P. syringae

causantes de la nueva sintomatología.

De acuerdo a los resultados obtenidos en el Cuadro 3, se puede afirmar que

se observaron diferencias significativas en cuanto a incidencia de la

enfermedad, ya que se visualiza en forma clara que sólo los aislados

causantes de la nueva sintomatología tienen el máximo porcentaje de

incidencia, mientras que los tratamientos testigo (T1), como los inoculados

con la cepa 112 (T2) no presentan síntomas de enfermedad.

CUADRO 3. Efecto de diferentes aislados bacterianos causantes de la nueva sintomatología, una cepa de P. syringae pv. syringae y un tratamiento testigo sobre la incidencia de la nueva sintomatología en plantas de tomate cv. Fortaleza.

Tratamiento Incidencia de la Enfermedad (%)

T1: Testigo (planta sin inocular) 0 a

T2: Cepa P. syringae pv. syringae 0 a

T3: Aislado 290 100 b

T4: Aislado 588 100 b

T5: Aislado 593 100 b

T6: Aislado Sta. Rosa 100 b

Promedios con letras iguales dentro de una columna no presentan diferencias significativas (α=0,05), según test de Tukey.

Por otro lado, el máximo índice de daño es alcanzado por todos los

tratamientos inoculados con los aislados causantes de la nueva

40

sintomatología, los cuales difieren significativamente de los tratamientos

testigo (T1) y los inoculados con la cepa 112 (T2) (Figura 2).

Tanto el Cuadro 3 como la Figura 2, revelan que todas las cepas causantes

de la nueva sintomatología son igualmente virulentas, con una incidencia del

100% y con el grado de daño mayor de la escala. Lo anterior deja en

evidencia que las cepas en estudio no corresponden a P. syringae pv.

syringae y que todas ellas poseen igual capacidad para desarrollar la

enfermedad.

Estos resultados concuerdan con lo experimentado por LAWNTON y

MAcNEILL (1986) y CINTAS, KOIKE y BULL (2002), quienes señalan que no

hay desarrollo de la enfermedad en plantas de tomate al inocular con cepas

de P. syringae pv. syringae y si hay desarrollo de la enfermedad en las

plantas inoculadas con P. syringae pv. tomato. Lo observado concuerda con

lo descrito por GITAITIS (1993), quien advierte que es sumamente difícil

reproducir los síntomas de P. syringae pv. syringae bajo condiciones de

invernadero. Una posible explicación a esto es que P. syringae pv. syringae

en plantas de tomate actúa como un patógeno débil y oportunista, que se

encuentra frecuentemente en heridas y como un organismo secundario en

infecciones mixtas, sin desarrollar sintomatología, pero presente en forma

epífita en el vegetal (GITAITIS, 1993; GABOR y WIEBE, 1997).

Referente a la sintomatología observada, esta se presentó igual a la descrita

en plantas naturalmente infectadas (Figura 3 a). Post-inoculación los

síntomas se iniciaron en los folíolos en forma de pecas o pequeñas manchas

necróticas rodeadas de halo clorótico, posteriormente se ennegrecieron los

pecíolos y luego avanzó en forma contagiosa hacia la base del tallo de la

planta, iniciando un movimiento ascendente (Figura 3 b), el cual se detuvo en

41

la parte superior, produciendo un severo atizonamiento a lo largo de los tallos

el cual no se prolongó a las hojas superiores ni a los frutos. El daño se

traduce en un menor desarrollo de las plantas (Figura 3 c). Cabe destacar

que estas lesiones corticales necróticas son superficiales y no comprometen

el tejido interno, lo que se visualiza al hacer cortes transversales. Esto

permite confirmar que la bacteria posee un movimiento periférico vía células

epidermicas o subepidérmicas.

Llama la atención la forma autónoma de avance de la lesión dentro de la

planta. Esto puede ser explicado por la falta de medios que propicien la

difusión de la bacteria como son la lluvia, el riego por aspersión, la

manipulación, el roce entre plantas por viento, maquinarias, etc. Factores

que ayudan a la dispersión y movimiento de la bacteria tanto dentro de las

plantas como entre ellas. Estas condiciones no se ven favorecidas bajo

invernadero, lo cual podría aclarar lo ocurrido tanto en los ensayos realizados

como en plantas naturalmente infectadas, donde se detiene el movimiento de

la bacteria y no hay presencia de síntomas en frutos y hojas superiores.

Por otra parte esta particular forma de avance de la lesión y el severo

atizonamiento en los tallos no corresponde a la tradicional descripción de la

sintomatología que ocasiona P. syringae pv. tomato, donde destaca el daño

en los frutos. En Chile ha sido descrita únicamente en tomate cultivado al

aire libre en la VI y VII región, específicamente en las zonas de Talca,

Rengo, Pelequen y Requinoa. En estos lugares la sintomatología origina

manchas negras de pequeño tamaño rodeadas de halo amarillo en las hojas

que pueden confluir llegando a secar foliolos. Tallos, pecíolos y bordes de los

sépalos, también pueden presentar manchas negras de contorno irregular.

Los frutos se afectan en estado verde, donde se observan pequeñas

manchas deprimidas (APABLAZA, 2000).

42

bbbb

aa0

1

2

3

Fortalezas/inocular

Fortaleza + cepapv. syringae

Fortaleza +aislado290

Fortaleza +aislado588

Fortaleza +aislado593

Fortaleza +aisladoSta.Rosa

Tratamientos

Indi

ce d

e D

año

FIGURA 2. Efecto de diferentes aislados bacterianos causantes de la nueva

sintomatología, una cepa de P. syringae pv. syringae y un tratamiento testigo, sobre el índice de daño de la nueva sintomatología en plantas de tomate cv. Fortaleza. Tratamientos seguidos por letras iguales no presentan diferencias significativas (α=0,05), según test de Tukey.

43

FIGURA 3. Plantas de tomate con nueva sintomatología provocada por

aislados de Pseudomonas syringae (a) Planta de tomate naturalmente infectada. (b) Planta de tomate con manchas necróticas puntiformes sobre las hojas y atizonamiento de tallo (nivel de daño 3). (c) Plantas de tomate variedad Fortaleza inoculadas con aislado 593 en comparación con sus testigos.

a

b

c

Plantas testigo Plantas

inoculadas

44

4.2.2. Ensayo 2: Evaluación de la susceptibilidad de cuatro variedades de

tomate al aislado 593.

De acuerdo a los resultados obtenidos en la evaluación de la susceptibilidad

de cuatro variedades de tomate (Cuadro 4), se puede afirmar que hay

diferencias significativas en cuanto a incidencia de la enfermedad, ya que se

observa que todas la variedades inoculadas con el aislado 593 tienen el

máximo porcentaje de incidencia y cada uno de sus respectivos tratamientos

testigo (sin inoculación) no desarrollan la enfermedad en las plantas.

CUADRO 4. Incidencia del aislado 593 causantes de la nueva sintomatología inoculado sobre diferentes variedades de tomate y sus respectivos testigos.

Tratamiento Incidencia de la Enfermedad (%)

T1: Variedad Fortaleza sin inocular 0 a

T2: Variedad Fortaleza inoculada con aislado 593 100 b

T3: Variedad Naomi sin inocular 0 a

T4: Variedad Naomi inoculada con aislado 593 100 b

T5: Variedad FA 593 sin inocular 0 a

T6: Variedad FA 593 inoculada con aislado 593 100 b

T7: Variedad Yonit sin inocular 0 a

T8: Variedad Yonit inoculada con aislado 593 100 b

Promedios con letras iguales dentro de una columna no presentan diferencias significativas (α=0,05), según test de Tukey.

Como se puede observar en la Figura 4, el máximo índice de daño es

alcanzado en todas las variedades en estudio por los tratamientos inoculados

con el aislado 593, causante de la nueva sintomatología, los cuales difieren

significativamente de sus respectivos tratamientos testigo.

45

FIGURA 4. Índice de daño de la aislado 593 causantes de la nueva

sintomatología inoculada sobre diferentes variedades de tomate y sus respectivos testigos. Tratamientos seguidos por letras iguales no presentan diferencias significativas (α=0,05), según test de Tukey.

a

b

a

bb

a

b

a

0

1

2

3

Fortaleza Naomi FA 593 Yonit

Tratamientos

Indi

ce d

e D

año

46

4.2.2.1. Altura, peso fresco y peso seco

En relación con la altura de planta, el peso fresco y el peso seco, se buscó

medir la diferencia existente entre las plantas testigos y las inoculadas, con la

intención de estudiar el comportamiento de las variables evaluadas para

cada una de las variedades.

CUADRO 5. Porcentaje de variación entre plantas testigos e inoculadas con aislado 593 en las variedades de tomate Fortaleza, FA 593, Yonit y Naomi, para las variables altura, peso fresco y peso seco.

Promedios con letras iguales dentro de una columna no presentan diferencias significativas (α=0,05), según test de Tukey.

Al analizar el Cuadro 5, la variable altura, se observa que la variedad FA 593

puede ser catalogada como la variedad que se ve significativamente menos

disminuida en tamaño en comparación con Fortaleza y Yonit.

Lo anterior deja en evidencia que si bien en el presente ensayo se obtuvo

diferencia en el tamaño de la parte aérea, estos resultados no expresan que

la variedad FA 593 sea resistente o tolerante, ya que en los ensayos

Variedad Disminución de altura (%)

Disminución de peso fresco (%)

Disminución de peso seco (%)

Fortaleza 35,02 a 66,88 a 67,08 a

FA 593

22,42 b 47,07 b 49,34 b

Yonit 34,82 a 54,63 a b 46,42 b

Naomi

29,28 a b

57,39 a b

50,03 b

47

realizados previamente se comprobó que todas las variedades obtienen el

máximo índice de daño y 100 % de incidencia de la enfermedad.

En relación con la disminución del peso fresco de las plantas inoculadas y

sus respectivos testigos, Yonit y Naomi mostraron estadísticamente el mismo

comportamiento, el cual se encuentra en un sitial intermedio entre FA 593 y

Fortaleza. FA 593 al igual que en la variable altura se ve menos afectada en

la disminución del peso fresco y se diferencia significativamente de Fortaleza,

variedad que se ve mayormente afectada por el aislado bacteriano.

Esto se acentúa aun más en la disminución de peso seco donde Fortaleza

marca una diferencia notable por un altísimo porcentaje de disminución, el

cual es significativamente mayor en comparación con las otras variedades.

Estos estudios concuerdan con lo observado en la Figura 3 c, puesto que en

lo referente al peso fresco, y altura de las plantas inoculadas en comparación

con sus respectivos testigos presentan diferencias evidentes.

Finalmente, se puede afirmar que la bacteria tuvo una influencia detrimental

en el desarrollo de las plantas inoculadas, y aun cuando todos los

tratamientos se ven severamente afectados en comparación con sus

respectivos testigos, en general es la variedad Fortaleza quien tiene la

diferencia mayor en todas las variables, por lo tanto, se convierte a la más

susceptible al ataque en comparación con las otras tres variedades incluidas

en este ensayo.

Esto concuerda con lo observado a nivel de campo, donde todos los predios

que presentaron este problema utilizaban la variedad Fortaleza.

48

4.2.2.2. Recuperación de Pseudomonas syringae desde lesiones y tejido

sano de plantas de tomate con nueva sintomatología

En relación a los resultados obtenidos mediante el aislamiento de tejidos,

desde distintos puntos de las plantas enfermas (Cuadro 6), se puede ver que

en ocho de las doce zonas muestreadas se aisló P. syringae. La zona de la

cual no se logró aislar la bacteria correspondió a la zona alta ubicada a 10

cm de la zona de avance hacia el ápice (Figura 1 b).

CUADRO 6. Respuesta del crecimiento bacteriano de los aislados 593 recuperados desde distintas alturas de las plantas de tomate, para las diferentes variedades, post-incubación en medio B de King a 23°C.

Variedad Zona de Avance Zona Media Zona Alta

Fortaleza +++ + −

FA 593 +++ + −

Yonit +++ + −

Naomi +++ + −

+++ Abundante crecimiento bacteriano + Escasas colonias − No hubo presencia de colonias

De los ocho aislados que si se lograron recuperar, se constató mediante luz

ultravioleta y la fluorescencia (Figura 1 b), que el número de colonias en la

zona media era muy escasa, sin embargo en la zona de avance la cantidad

de bacteria fue abundante. Estos resultados confirman que la enfermedad no

se desarrolla en forma sistémica.

49

4.2.3. Ensayo 3: Test de patogenicidad en frejol caupí

Como se observa en el Cuadro 7, los aislados de P. syringae pv. syringae

produjeron lesiones necróticas rodeadas por halos en todas las repeticiones

de frejol caupí a los 15 días después de ser inoculadas. Ningún testigo ni

aislado de P. syringae produjo la reacción típica de síntomas.

CUADRO 7. Respuesta de las inoculaciones realizadas en frejol caupi con diferentes aislados bacterianos causantes de la nueva sintomatología, una cepa de P. syringae pv. syringae (cepa 112) y un tratamiento testigo. Se inocularon un total de cuatro plantas por aislado.

Aislado Plantas sanas Plantas con síntomas

593 4 0

Sta. Rosa 4 0

588 2 2*

McLean 4 0

112 0 4

Testigo 4 0

* Sintomatología diferente: áreas de foliolos con síntomas de escaldado.

Las dos plantas con síntomas correspondientes al aislado 588 no

presentaron los mismos síntomas que la cepa 112, sino que produjeron

aureolas blancas (escaldado). Se pueden considerar como una reacción

posible ya que ha sido descrita por JONES, McCARTER y GITAITS (1981),

quienes además señalan que la reacción típica de patogenicidad

corresponde a lesiones necróticas rodeadas por halos cloróticos, como los

manifestados en este ensayo, por lo que podemos decir que el test con frejol

50

caupí resultó de acuerdo a lo esperado, es decir, positivo sólo para P.

syringae pv. syringae.

Estos resultados concuerdan con lo descrito por GITAITIS (1993), quien

señala que la mayoría de las cepas de P. syringae pv. syringae recuperadas

desde tomate, inducen una reacción en frejol caupí cultivar California

Blackeye Nº3.

4.3. Análisis realizados por IMI, Inglaterra:

Los resultados de los análisis realizados por el Dr. L. Offord del IMI, registro

número 392758 (Anexo 5), revelaron que el agente causal corresponde a

Pseudomonas syringae y la respuesta al rep-PCR realizado reveló un perfil

idéntico al registrado tanto para P. syringae pv. tomato, como para P.

syringae pv. maculicola. Al ser el aislado 593 inicialmente recuperado desde

tomate, el IMI afirma con un alto grado de confianza que esta cepa

corresponde a P. syringae pv. tomato.

Lamentablemente la caracterización de P. syringae pv. tomato y P. syringae

pv. maculicola es idéntica, por lo cual tanto las pruebas bioquímicas como

biológicas arrojan la misma respuesta (LUDWIG y KLENK, 2001; BRAUN-

KIEWNICK y SANDS, 2001).

De acuerdo a esto, ZHAO et al. (2000) señalan en su estudio que al analizar

los perfiles oxidativos de la utilización de sustratos orgánicos entre cepas de

estos patovares, el porcentaje de semejanza corresponde a un 79,5%. Por

su parte WIEBE y CAMPBELL (1993) se refieren a la estrecha relación

existente entre P. syringae pv. maculicola y P. syringae pv. tomato y

51

aseveran que dentro de la especie P. syringae, estos son los patovares más

cercanos, debido a que poseen más del 75% de homología en su ADN.

Es importante destacar que P. syringae pv. maculicola en la caracterización

del rep-PCR posee dos perfiles definidos posibles, A o B. Esto indica que

puede haber convergido de al menos dos líneas evolucionarias. Por lo tanto,

al analizar los patrones de banda entre este patovar y P. syringae pv. tomato

puede ocurrir que este último revele el patrón de banda correspondiente al

grupo A de P. syringae pv. maculicola (ZHAO et al., 2001).

Por su parte CINTAS et al. (2001) y BRADBURY (1986) indican que todos los

hospederos de P. syringae pv. maculicola corresponden a crucíferas y la

mayor parte pertenece al género Brassica. Además LOPEZ y MONTESINOS

(2000) especifican como hospederos naturales a la col y la coliflor.

Sin embargo WIEBE y CAMPBELL (1993) prueban que al inocular en tomate

y coliflor cepas de los patovares maculicola y tomato, ambos fueron capaces

de infectar en tomate. No obstante la respuesta obtenida, aseveran que

estos patovares corresponden a entidades diferentes, ya que aún cuando las

cepas de P. syringae pv. maculicola causaron lesiones en hojas de tomate,

estas fueron diferentes a las naturalmente originadas por patovar tomato, el

cual no logró ser patogénico en coliflor. Esto concuerda con los estudios

realizados por CINTAS, BULL y KOIKE (2002) quienes indican que P.

syringae pv. tomato no fue patogénica en las crucíferas por ellos utilizadas

(sí en tomate), mientras que todas las cepas de P. syringae pv. maculicola si

reprodujeron enfermedad en crucíferas, y en tomate se describe una

reacción variable.

52

Esta información del rango de hospederos apoya la hipótesis de que el

patovar en estudio no se considera como una bacteria capaz de ocasionar

enfermedad en tomate y además no ha sido descrita en Chile (BRADBURY,

1986).

A partir de lo anterior, y considerando que no hay reportes que incluyan al

tomate como hospedero de P. syringae pv. maculicola, se puede afirmar que

el perfil descrito por el IMI corresponde a P. syringae pv. tomato.

4.4. Resumen de pruebas biológicas, bioquímicas y patogénicas:

De acuerdo a las diferentes pruebas biológicas, bioquímicas y de

patogenicidad realizadas (Cuadro 8), la nueva sintomatología originada por

los aislados en estudio, se ajusta a la especie y patovar P. syringae pv.

tomato, lo que concuerda con los resultados obtenidos por, las pruebas

bioquímicas conseguidas por LAWNTON y MAcNEILL (1986); CINTAS,

KOIKE y BULL (2002) y MALAVOLTA et al. (2002) y a la respuesta negativa

observada por JONES, McCARTER y GITAITIS (1986) en la formación de

núcleos de hielo.

Lo anterior, más la respuesta del IMI que corrobora que el aislado 593

corresponde a P. syringae pv. tomato permite afirmar que esta bacteria

causante de una sintomatología nunca antes reportada, corresponde a una

nueva variante o raza, sobre todo al considerar la magnitud del daño

ocasionado en las plantas afectadas a nivel de campo.

53

CUADRO 8. Caracterización de cepas de Pseudomonas syringae pv. syringae y Pseudomonas syringae causantes de la nueva sintomatología.

Reacción

Test P. syringae pv. syringae

P. syringae causante de nueva

sintomatología Levano + + Oxidasa - -

Pudrición en Papa - - Arginina dihidrolasa - -

Hipersensibilidad en Tabaco + + Fluorescencia en MB de King + +

Utilización de Eritritol + - Utilización DL-Lactato + -

Formación de núcleos de hielo + - Patogenicidad en caupí + -

54

5. CONCLUSIONES

En los tratamientos in vivo, se puede concluir que los aislados 290, 593, 588

y Sta. Rosa atacan con igual nivel de daño a la variedad Fortaleza, actuando

todas con igual grado de virulencia.

Las cuatro variedades evaluadas resultaron ser altamente susceptibles al

aislado bacteriano en estudio. Sin embargo FA-593 resultó ser más tolerante

y Fortaleza fue la variedad más susceptible.

De acuerdo a los resultados obtenidos en los ensayos in vitro, junto a la

respuesta del análisis molecular realizado por el CAB International

Mycological Institute, se puede concluir que los aislados causantes de la

nueva sintomatología corresponden a Pseudomonas syringae pv. tomato. De

acuerdo a la sintomatología observada, correspondería a una nueva variante

o raza de este patovar.

55

6. RESUMEN

Durante el año 2003, se observó una nueva sintomatología asociada a Pseudomonas syringae afectando plantas de tomate en invernadero frío. Se detectaron manchas necróticas rodeadas de halo clorótico en los folíolos y por sobre todo un severo atizonamiento en pecíolos y tallos. En un estudio preliminar se determinó que la especie correspondía a P. syringae [Fitopatología 39(1):54-55 (2004)]. En la presente investigación se realizaron pruebas bioquímicas para diferenciar patovares. Las pruebas de eritritol y DL-lactato indicaron que se trataría de P. syringae pv. tomato. Igual resultado se obtuvo al evaluar la capacidad de formar núcleos de hielo a -4ºC. Posteriormente se evaluó la virulencia de cuatro aislados en estudio (290, 588, 593 y Sta. Rosa) en comparación a P. syringae. pv. syringae (cepa 112, aislada de cerezo) y los respectivos testigos. Los cuatro aislados fueron capaces de producir síntomas iniciales de manchas necróticas circulares y halo clorótico en hojas, y al cabo de 10 días un atizonamiento de los tallos y pecíolos, aspectos que no fueron observados en las plantas tratadas con P. syringae pv. syringae, ni en las plantas testigo. Luego se diseñó un segundo ensayo, inoculándose el aislado 593 utilizado en el Ensayo 1, en los cvs. Fortaleza, FA 593, Naomi y Yonit. Todas las variedades presentaron una reducción en la altura, peso fresco y peso seco, en comparación con sus respectivos testigos. Sin embargo, se afectó en mayor grado el cv. Fortaleza. Paralelamente fue enviado el aislado 593 al CAB International Mycological Institute, Inglaterra, para la identificación del agente causal mediante rep-PCR. La respuesta del análisis molecular coincide con la caracterización de este aislado como patovar tomato. En base a estos resultados, y de acuerdo con los síntomas observados, que difieren a los descritos para P. syringae pv. tomato, se concluye la presencia de una nueva variante o raza de este patovar afectando a plantas de tomate bajo invernadero en la zona de Quillota y Limache, V región, Chile, problema denominado atizonamiento bacteriano del tomate.

56

7. ABSTRACT

During the year 2003, new symptoms related to Pseudomonas syringae were observed, affecting unheated greenhouse tomato plants. Severe necrotic spots surrounded by chlorotic halos and an overall blight in petioles and stems were detected. A preliminary study determined that this species corresponded to P. syringae [Fitopatología 39(1):54-55 (2004)]. In this study biochemical tests were done in order to differentiate pathovars. The erythritol and DL-lactate tests suggested that it could be P. syringae pv. tomato. The same result was obtained from evaluating the ice nucleation activity at -4ºC. Subsequently, the virulence of four isolates being studied (290, 588, 593 and Sta. Rosa) was evaluated and compared to P. syringae. pv. syringae (strain 112, isolated from cherry tree) and the corresponding negative controls. The four isolates produced the initial symptoms of circular necrotic spots and chlorotic halos on leaves, and after 10 days, blighting of stems and petioles, none of which were observed on plants treated with P. syringae. pv. syringae, nor in the negative control plants. A second test was then designed, in which the tomato cultivars Fortaleza, FA 593, Naomi and Yonit, were inoculated with isolate 593, used in Test 1. All of the varieties showed a reduction in height, fresh weight and dry weight, compared with their respective negative controls. Nevertheless, cv Fortaleza was the most strongly affected. At the same time, isolate 593 was sent to the CAB International Mycological Institute, England, for an identification of the causal agent by rep-PCR. The result of the molecular analysis coincided with the characterization of this strain as pathovar tomato. Based on these results, and on the symptoms observed, which differ from those described for P. syringae pv. tomato, the presence of a new variant of this pathovar is deduced, which affects greenhouse tomato plants in the area of Quillota and Limache, V region, Chile, and has been designated bacterial blight of tomatoes.

57

8. LITERATURA CITADA

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