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1. INTRODUCCIÓN A MEMBRANAS BIOLÓGICAS

1. Mencione las características comunes de las membranas biológicas. Describa el modelo de mosaico fluido.

(1.1) Las membranas son estructuras con forma de hoja. Su espesor varía de 6 a 10 nm. (1.2) Consisten principalmente de lípidos y proteínas. El cociente de lípidos a proteínas varía de 1:4

a 4:1. También contiene carbohidratos que están unidos a los lípidos y a las proteínas. (1.3) Los lípidos de membrana son moléculas relativamente pequeñas que tiene una parte

hidrofóbica y otra hidrofílica. Estos forman hojas bimoleculares cerradas en el medio acuoso. Estas bicapas de lípidos son barreras al flujo de las moléculas polares y son disolventes de las proteínas integrales de membrana.

(1.4) Las proteínas específicas median las distintas funciones de las membranas. Las proteínas sirven como bombas, canales, receptores, transductores de energía y enzimas. Las proteínas de membrana están embebidas en la bicapa de lípidos, la cual proporciona un ambiente adecuado para su acción.

(1.5) Las membranas son ensamblajes no covalentes. Las proteínas y los lípidos están unidos por muchas interacciones no covalentes de tipo cooperativo.

(1.6) Las membranas son asimétricas. Las dos caras de una membrana son diferentes. (1.7) Las membranas son estructuras fluidas. Las moléculas de los lípidos se difunden rápidamente

en el plano de las membranas, como las proteínas, a menos que estén ancladas por interacciones específicas. Por el contrario, las proteínas no rotan a través de la membrana. Las membranas pueden ser consideradas como soluciones en dos dimensiones de lípidos y proteínas orientadas.

(1.8) La mayoría de las membranas están polarizadas eléctricamente, con el interior negativo (típicamente -60 milivolts). El potencial de membrana juega un papel clave en el transporte, conversión de energía y excitabilidad. (1.9) Una pequeña proporción de los lípidos de las membranas interaccionan específicamente con determinadas proteínas y pueden ser esenciales para la función de éstas. Algunas proteínas están unidas covalentemente a los lípidos. 2 (a) ¿Por qué se dice que las membranas son barreras de permeabilidad altamente selectivas, y no barreras impermeables?

Por que contienen canales y bombas, que son sistemas de transporte (proteínas alostéricas) que regulan la composición iónica y molecular del medio intracelular; los canales permiten que los iones fluyan rápidamente a través de las membranas en una dirección termodinámicamente favorable (cuesta abajo), y las bombas, por el contrario, usan una fuente de energía como el ATP o la luz para impulsar el transporte de moléculas cuesta arriba. Algunos canales son operados por ligandos (receptor de acetilcolina) y otros como los de sodio y potasio son operados por cambios de voltaje (despolarización de la membrana). (b) ¿Cómo controlan las membranas el flujo de información entre las células y el medio ambiente?

Las membranas contienen receptores específicos para estímulos externos. En los siguientes procesos, el evento primario es la detección de una señal por un receptor específico en una membrana: el movimiento de una bacteria hacia el alimento, la respuesta de una célula blanco a la insulina y la percepción de la luz. A su vez, algunas membranas generan señales, que pueden ser químicas o eléctricas, como en la transmisión del impulso nervioso (c) Mencione los dos procesos de conversión de energía mas importantes que se llevan a cabo en sistemas membranales.

La fotosíntesis se lleva a cabo en la membrana interna de los cloroplastos, y la fosforilación oxidativa se lleva a cabo en la membrana interna de la mitocondria. (d) Explique en que consiste el hecho de que las membranas son estructural y funcionalmente asimétricas y que importancia tiene en su función.

Las superficies externa e interna de todas las membranas biológicas conocidas tienen diferentes componentes y diferentes actividades enzimáticas. Un ejemplo claro es la bomba que regula la

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concentración de iones sodio y potasio en la célula. Esta bomba está orientada para que bombee iones sodio hacia afuera de la célula y iones potasio al interior de la misma. Además el ATP debe estar del lado interior de la célula para impulsar la bomba. La ouabaína, un inhibidor específico de la bomba, es efectivo solo si se localiza afuera de la célula. Las proteínas de membrana. Esta asimetría es preservada porque la proteínas de membrana no rotan de un lado de la membrana a otro. Los lípidos también están distribuidos asimétricamente como consecuencia de su modo de biosíntesis, pero su asimetría no es completamente absoluta, excepto en el caso de los glicolípidos. 3 (a) ¿Cuál es la clasificación de los lípidos de membrana? 1. FOSFOLÍPIDOS, 2. GLICOLÍPIDOS, 3. ESTEROLES (b) ¿Cómo se clasifican los fosfolípidos? A. Glicerofosfolípidos (contienen glicerol)

fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol (cardiolipina).

A1. Lípidos éter: alquil acil glicerofosfolípidos, plasmalógenos. B. Esfingomielina (no contienen glicerol) Ceramida es su unidad estructural fundamental Su cabeza polar es fosfocolina o fosfoetanolamina. (c) ¿De dónde se derivan los fosfolípidos?

Se derivan del glicerol (fosfoglicéridos), o de la esfingosina (un alcohol mas complejo). (d) ¿Cómo están formados los glicerofosfolípidos? Dibuje su estructura general.

Del esqueleto de glicerol, de dos cadenas de ácidos grasos y de un alcohol fosforilado. (e) Dibuje la estructura del ácido palmítico y del ácido oleico.

Los ácidos grasos en los fosfolípidos contienen normalmente un número par de ácidos grasos (de 14 a 24): 16 y 18 los mas comunes, de cadena no ramificada (en animales), la configuración del doble enlace es casi siempre cis, la longitud y el grado de instauración de las cadenas de ácidos grasos en los lípidos de membrana afectan mucho la fluidez de las membranas. Pueden ser saturados o insaturados. 4 (a) Mencione 5 residuos de alcohol de los fosfoglicéridos:

serina, etanolamina, colina, glicerol e inositol: están esterificados al grupo fosfato del fosfatidato. (b) ¿Cuál es el único fosfolípido de membrana que no se deriva del glicerol y cuál es su estructura general?

La esfingomielina, es una amino alcohol que contiene una larga cadena hidrocarbonada no saturada y que tiene unido a su grupo amino un residuo de ácido graso.

cadena hidrocarbonada- esfingosina-o- fosforilcolina -NH2-ácido graso (c) ¿Cómo se clasifican los glicoesfingolípidos (esfingolípidos cuya cabeza polar son carbohidratos? Estos compuestos tienen 1 o mas azúcares en su cabeza polar, conectados directamente al OH del C-1. NO CONTIENEN FOSFATO. Su clasificación es la siguiente: A. Cerebrósidos 1. Glucocerebrósidos 2. Galactocerebrósidos 3. Sulfátidos

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B. Globósidos Oligosacáridos neutros de ceramida C. Gangliósidos Oligosacáridos ácidos de ceramida GM3, GM2, GM| 1. cerebrósidos (monosacáridos de ceramida) 2. sulfátidos (sulfatos de nonosacárido ceramida) 3. globósidos (oligosacáridos neutros de ceramida) 4. gangliósidos (oligosacáridos ácidos de ceramida que contiene ácido siálico). Este azúcar es N-acetilneuraminato o N-glicolilneuraminato. Estos azúcares ácidos se denominan ácidos siálicos. Sus esqueletos de carbonos son sintetizados a partir de fosfoenolpiruvato (C3) y N-acetilmanosamina 6-fosfato (unidad C6).

En la células animales, los glicolípidos se derivan de la esfingosina. El grupo amino del esqueleto de

esfingosina está acilado por un ácido graso, como en la esfingomielina. Los glicolípidos difieren de la esfingomielina en el tipo de la unidad que está enlazada al grupo hidroxilo primario del esqueleto de esfingosina. En este caso están unidos uno o mas residuos de azúcar (en vez del residuo de fosforilcolina). El glicolípido mas simple es cerebrósido, en el cual hay solo un residuo de azúcar (glucosa o galactosa).

Los gangliósidos son glicolípidos mas complejos que tiene una cadena ramificada de varios

residuos de azúcar (hasta 7). Las tres partes principales son:

cadena hidrocarbonada- esfingosina- azúcar (glucosa o galactosa) ácido graso (d) ¿Cuál es la unidad hidrofóbica e hidrofílica de los siguientes lípidos de membrana: fosfoglicéridos, esfingomielina, glicolípidos y colesterol? LÍPIDO DE MEMBRANA UNIDAD HIDROFÓBICA UNIDAD HIDROFÍLICA Fosfoglicérido Cadena de ácidos grasos Alcohol fosforilado Esfingomielina Cadena de ácido graso y cadena

hidrocarbonada de esfingosina Fosforilcolina

Glicolípido Cadena de ácido graso y cadena hidrocarbonada de esfingosina

Uno o mas residuos de azúcar

Colesterol* Toda la molécula, excepto un grupo OH Un grupo OH en C-3 *Los esteroles se clasifican así: Colesterol (animales); Estigmaesterol y β-Sitoesterol (plantas) Ergoesterol (hongos y levaduras) 5. (a) ¿Cuáles son las actividades biológicas de las fosfolipasas, cuáles se han aislado y cuál es su especificidad? Las fosfolipasas tienen dos papeles principales. Muchas de ellas son enzimas digestivas que están presentes en alta concentración en los jugos intestinales, secreciones bacterianas y venenos. Las fosfolipasas están agrupadas de acuerdo a su especificidad. Las fosfolipasas hidrolizan preferencialmente

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sustratos que están localizados en la bicapa de la membrana, micelas o partículas de lipoproteínas. Las fosfolipasas que se han aislado son la A1, A2, C y D. (b) ¿Cuáles son las moléculas con actividad biológica que se liberan como consecuencia de la actividad de las fosfolipasas A2 y C? Las fosfolipasas también generan moléculas señal altamente activas o sus precursores inmediatos. P.e. la fosfolipasa A2 libera araquidonato, un precursor de los eicosanoides: prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos . Los eicosanoides son derivados del ácido araquidónico, un ácido graso poliinsaturado 20:4 (Δ5,8,11,14) del cual toman su nombre (eikosi = veinte) con una gran variedad de acciones extremadamente potentes parecidas a las hormonas. En varios tejidos de los animales vertebrados. A diferencia de las hormonas, los eicosanoides no se transportan entre tejidos en la sangre, sino que actúan en los tejidos en donde se producen. Se sabe que esta familia de compuestos está involucrada en la función reproductiva, en la fiebre, en la inflamación, y el dolor asociado con daño o enfermedad; en la formación de coágulo sanguino y en la regulación de la presión sanguínea, en la secreción ácida gástrica y en muchos otros procesos patológicos o fisiológicos en el humano. Todas las prostaglandinas contienen un anillo de carbonos de 5 miembros. Su nombre se deriva del tejido en donde se reconocieron por primera vez: la glándula prostática. Se han descrito las PGE (solubles en éter) y las PGF (solubles en amortiguador de fosfato, del sueco fosfat). Actúan en muchos tejidos aumentando la concentración intracelular de AMPc. Algunas PG estimulan la contracción del músculo liso del útero durante la labor de parto o la menstruación. Afectan el flujo sanguíneo a órgano específicos y la respuesta de ciertos tejidos a epinefrina y glucagon. Un tercer grupo de prostaglandinas elevan la temperatura corporal (produciendo fiebre) y causando inflamación, lo que desencadena dolor. Los tromboxanos se aislaron primero de las plaquetas sanguíneas (trombocitos) tienen un anillo de seis miembros con un enlace éter. Son producidas por las plaquetas y actúan en la formación del coágulo sanguíneo y en la reducción del flujo sanguíneo al sitio del coágulo. Los leucotrienos, encontrados primero en los leucocitos, contienen tres dobles enlaces conjugados. Son señales biológicas poderosas, por ejemplo, inducen la contracción del recubrimiento muscular de los conductos del aire al pulmón. La sobreproducción de leucotrienos, causa ataques de asma. La fuerte contracción del músculo liso de los pulmones que ocurre durante el choque anafiláctico es parte de la reacción alérgica potencialmente fatal en individuos con hipersensibilidad a la picadura de las abejas, penicilina u otros agentes. La fosfolipasa C libera dos mensajeros en la cascada de fosofinosítidos (diacilglicerol y fosfatidilinositol 4,5, bifosfato). El IP3 induce la liberación de calcio secuestrado en compartimientos celulares, lo que dispara la activación de una serie de enzimas dependientes de calcio, en respuesta a la señal hormonal. El diacilglicerol se une y activa a la proteína cinasa C, que une grupos fosfato a varias proteínas intracelulares, con la consecuente activación de las mismas. 6. (a) Describa la importancia biológica de los lípidos éter. Algunos animales y organismos unicelulares son ricos en lípidos éter, en los cuales una de las dos cadenas acilo está unida al glicerol en enlace éter y no éster. Las cadenas unidas por enlace éter pueden estar saturadas, como en los alquil-acil-glicerofosfolípidos, o puede contener un doble enlace entre losC-1 y C-2, como en los plasmalógenos. El corazón de los vertebrados está especialmente enriquecido de lípidos éter; aproximadamente la mitad de los lípidos del corazón con lípidos éter. Las membranas de las bacterias halofílicas, de los protistas ciliados, y de ciertos invertebrados, también contienen una alta proporción de lípidos éter. Su significado funcional en estas membranas es desconocidos; quizá confieran resistencia a las fosfolipasas que rompen los ácidos grasos unidos en enlace éster. Aproximadamente un 20% de los glicerofosfolípidos de los mamíferos son plasmalógenos. El porcentaje exacto varía de especie a especie y de tejido a tejido en una organismo dado. Mientras que los

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plasmalógenos comprenden solamente el 0.8% de los fosfolípidos en el hígado de humanos, representan el 23% en el tejido nervioso de humanos. Los alquil-acil-glicerofosfolípidos son menos abundantes que los plasmalógenos; por ejemplo, de todo el glicero fosfosfolípido etanolamina contenido en el corazón de humanos, el 59% son plasmalógenos y el 3.6% son alquil-acil-glicerofosfolípidos. Sin embargo, de todo el glicero fosfosfolípido etanolamina de los eritrocitos de bovino, el 75% son del tipo alquil-acilo. Al menos un lípido éter, el factor activador de plaquetas, es una hormona importante. Se libera de los basófilos y estimula la agregación de plaquetas y la liberación de serotonina de las plaquetas.. Ejerce una variedad de efectos sobre el hígado, músculo liso, corazón, útero y pulmón y juega un papel importante en la respuesta inflamatoria y alérgica. (b) Describa brevemente la importancia biológica de las esfingomielinas. La esfingomielina se parece a la fosfatidilcolina en sus propiedades generales, en la estructura tridimensional y en la ausencia de carga neta en su grupo polar. Las esfingomielinas están presentes en las membranas plasmáticas de las células animales; la hoja de mielina que rodea y aísla los axones de las neuronas mielinadas es una buena fuente de esfingomielinas. (c) Describa brevemente la importancia biológica de los glicoesfingolípidos. cerebrósidos. Son los glicoesfingolípidos mas simples. El galactocerebrósido, que está en concentración mas alta en las membranas de las células neuronales del cerebro, tiene un grupo β-D-galactosa. El glucocerebrósido, que tiene en vez β-D-glucosa, está presente en las membranas de otros tejidos. El glucocerebrósidos, aunque poco común, es precursor de globósidos y gangliósidos. Los residuos de galactosa de algunos galactocerebrósidos están sulfatados en su posición C3 para formar compuestos iónicos como los sulfátidos. Los gangliósidos forman son los glicoesfingolípidos mas complejos. Se han caracterizado cerca de 60 gangliósidos. Los gangliósidos son componentes principales de las membranas de la superficie celular y constituyen una fracción significativa de los lípidos del cerebro. También están presentes en otros tejidos en menor proporción. Los gangliósidos tiene un gran significado médico y fisiológico. Sus carbohidratos complejos, que se extienden mas allá de la superficie de la membrana celular, actúan como receptores específicos para ciertas hormonas de naturaleza glicoproteica de la pituitaria. También son receptores para toxinas proteínicas bacterianas, como la toxina del cólera. Hay mucha evidencia de que los gangliósidos son determinantes específicos del reconocimiento célula-célula, por lo que probablemente tengan un papel importante en el crecimiento y diferenciación de los tejidos así como en la carcinogénesis. Los esfingolípidos son los determinantes de los grupos sanguíneos A, B, y O en humanos. El gangliósido GM1, el cual, indudablemente juega un papel valioso en las células animales que lo contienen, es el punto de unión de la toxina del cólera en las membranas celulares. 7 (a) ¿Qué estructuras pueden adoptar en un medio acuoso los fosfolípidos y glicolípidos de acuerdo a su estructura química? Micelas y bicapas (b) ¿Por qué los fosfolípidos y los glicolípidos tienden a formar en el agua mas fácilmente bicapas que micelas?

Sus dos cadenas de ácidos grasos son demasiado voluminosas para estar dentro de la micela. Por el contrario, las sales de los ácidos grasos, tienden a formar micelas porque contienen solo una cadena hidrocarbonada. (c) Describa la formación de una bicapa de lípidos incluyendo las fuerzas que favorecen su formación y que la estabilizan.

Es un proceso de autoensamblaje. Es un proceso rápido y espontáneo en el agua. Las interacciones hidrofóbicas son las principales fuerzas conductoras en la formación de bicapas de lípidos. Además hay fuerzas de atracción de van der Waals entre las cadenas hidrocarbonadas. Estas fuerzas favorecen el

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empaquetamiento de las colas. Finalmente, hay atracciones electrostáticas y puentes de hidrógeno entre las cabezas polares y las moléculas de agua. Así, las bicapas de lípidos, están estabilizadas por un conjunto completo de fuerzas que median las interacciones moleculares en los sistemas biológicos. (d) ¿Cuáles son las consecuencias de que una bicapa lipídica sea una estructura no covalente cooperativa?

Las bicapas lipídicas son estructuras cooperativas; se mantienen unidas mediante muchas interacciones no covalente que las refuerzan, el agrupamiento se favorece por las fuerzas de van der Waals. Estos factores energéticos tienen tres consecuencias:

1) Las bicapas lipídicas tienen una tendencia espontánea a ser extensas, 2) las bicapas lipídicas tienden a cerrarse sobre sí mismas, de tal manera que no existan extremos

con cadenas hidrocarbonadas expuestas, lo que da por resultado la formación de un compartimiento y 3) las bicapas lipídicas se autoreparan, puesto que un orificio en la bicapa es energéticamente

desfavorable. 8 (a) ¿Cómo se ha estudiado la permeabilidad de la bicapa de lípidos a los iones y a las sustancias polares?

Se ha estudiado en dos sistemas: las vesículas lipídicas (liposomas) y las bicapas planas. Los liposomas son compartimientos acuosos encerrados por una bicapa de lípidos. Se pueden formar al suspender un lípido adecuado, tal como fosfatidilcolina, en un medio acuoso.

Esta mezcla es sonicada (agitada por ondas sonoras de alta frecuencia) para producir una dispersión de vesículas cerradas de un tamaño muy uniforme. Estas vesículas son útiles no solo para estudios de permeabilidad, sino para introducir sustancias impermeables a las células.

La estructura de las bicapas planas se puede construir a través de un hoyo de 1 mm en una división entre dos compartimientos acuoso. Se pueden formar de la siguiente manera; un pincel fino se sumerge en una solución formadora de membranas, tal como fosfatidilcolina en decano. La punta del pincel se coloca en el hoyo de partición entre los dos medios acuosos. La membrana en forma de bicapa plana constituida por fosfatidilcolina, se forma en pocos minutos. (b) ¿Cómo se pueden analizar (separar) las proteínas de membrana?

Por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.

(c) ¿Cómo se ha demostrado que muchas proteínas de membrana se encuentran embebidas o atraviesan la bicapa de lípidos?

Por microscopía electrónica de criofractura y grabado y por marcaje con compuestos radiactivos que

reaccionan con las cadenas laterales de las proteínas. En la técnica de criofractura, una muestra de membrana se congela rápidamente a una temperatura cercana a la del nitrógeno líquido (-196°C). Esto inmoviliza la muestra para las manipulaciones subsecuentes. La muestra se fractura con un microtomo frío, lo que con frecuencia rompe la bicapa en monocapa. La membrana se cubre con una capa delgada de carbón, sombreándola (cubriéndola por sedimentación evaporativa bajo vacío) con platino, y removiendo toda la materia orgánica por tratamiento con ácido. Tal réplica metálica puede ser examinada por microscopía electrónica.

En la técnica de congelación-grabado, la superficie externa de la membrana adyacente al área rota

revelada por criofractura puede también ser visualizada al sublimar primer (grabar) a -100°C, algo del hielo. Las micrografías electrónicas de crio-grabado de la mayoría de las membranas biológicas muestran una cara interna de la fractura salpicada con partículas globulares de 50 a 85 Å que están distribuidas al azahar. Estas partículas corresponden a proteínas de membrana, como se demuestra por su desaparición cuando la membrana es tratada con proteasas antes de la congelación. Las membranas de mielina (que tiene un contenido de proteínas muy bajo) y los liposomas (compuestas solo de lípidos) tienen lisa la cara interna de la fractura.

Los compuestos etilacetimidato (EA) e isoetionilacetamidato (IEA) reaccionan con los grupos amino

libres de las proteínas. Solo EA difunde a través de la membrana. La comparación del patrón de marcaje con

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estos dos compuestos revela si una proteína dada se expone solo en la superficie externa o en la interna. Las proteínas marcadas con ambos reactivos, están expuestas a ambos lados de la misma (cruzan toda la membrana). (d) ¿Cómo se ha demostrado que las proteínas de membrana plasmática tienen difusión lateral?

Se fusionaron células de ratón en cultivo con células humanas por tratamiento con virus Sendai para producir una célula híbrida llamada heterokarión. Se marcaron las proteínas de membrana de las células ratón y humano con marcadores fluorescentes diferentes (verde y rojo). El marcaje se hizo con anticuerpos dirigidos a las proteínas de ratón y humano, respectivamente, conjugados con moléculas fluorescentes de los colores ya mencionados. Después de una fusión, las proteínas de ambas especies aparecen completamente separadas, pero después de 40 min a 37°C se lleva a cabo una difusión de las proteínas de tal manera que ahora la fluorescencia verde y rojo está distribuida homogéneamente (entremezcladas).

La adición de sustancias que inhiben la síntesis de proteínas no disminuye la velocidad del proceso, pero sí lo hace la disminución de la temperatura a 15°C. (e) ¿En que consiste el movimiento flip-flop (transversal) de los fosfolípidos de membrana?

La transferencia de una molécula de un lípido a través de la bicapa, un proceso denominado difusión transversa o flip-flop, es un evento extremadamente raro porque se requiere que los grupos con cabeza polar de los lípidos pasen a través de la bicapa de lípidos. La vida media de estos cambios es de al menos varios días.

Por el contrario, los lípidos son altamente móviles en el plano de la bicapa (difusión lateral). Este movimiento se puede cuantificar por la velocidad de recuperación de fluorescencia después de la fotodecoloración. Un grupo fluorescente se une específicamente a un componente de la bicapa y un pulso intenso de láser enfocado en una área muy pequeña (∼3 µm2) es usado para destruir (blanquear) el fluoroforo.

La velocidad a la cual el área blanqueada recupera su fluorescencia, medida por microscopía de fluorescencia, indica la velocidad a la cual la moléculas con y sin fluorescencia difunden lateralmente hacia dentro y hacia afuera del área “blanqueada”, respectivamente. La bicapa de lípidos puede difundir la longitud de una bacteria ( ∼1 µm) en ∼ 1 segundo. (f) Explique por qué este movimiento transversal no se ha observado en las proteínas de membrana y que consecuencias funcionales tiene.

La barrera de energía libre que tienen que vencer las moléculas de proteínas para tener movimiento

transversal es muy grande. La consecuencia es que la asimetría de la membrana se mantiene durante largos períodos de tiempo. 9 (a) Explique como se controla la fluidez de las membranas.

El grado de fluidez depende de la composición de lípidos y de la temperatura. A bajas temperaturas, existe poco movimiento de lípidos y la bicapa está casi en forma cristalina (paracristalina). Arriba de una temperatura, que es característica para cada membrana, los lípidos pueden sufrir movimiento rápido. La temperatura de transición del estado paracristalino sólido al fluido depende de la composición de lípidos de la membrana. A una mayor proporción de ácidos grasos saturados, es mayor la temperatura de transición del estado sólido al fluido de la membrana.

El contenido de esteroles de una membrana es también un determinante importante de la

temperatura de transición. La estructura planar rígida del núcleo de esteroles, insertado entre las cadenas laterales de ácidos grasos, tiene dos efectos sobre la fluidez: abajo de la temperatura de transición sólido-fluido, la inserción de esteroles previene el empaquetamiento altamente ordenado de las cadenas de acil graso y así favorece la fluidez de la membrana. Arriba de la temperatura de transición, el sistema de anillo rígido de los esteroles, reduce la libertad de movimiento de las cadenas acil graso vecinas para moverse por

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rotación alrededor de los enlaces carbono-carbono y así reduce la fluidez de la bicapa. Los esteroles tienden a moderar los extremos de ambos estados de la membranas que los contienen.

El estado sólido se favorece por la presencia de residuos de ácidos grasos saturados y por la longitud

de la cadena. En los procariontes, la fluidez se regula por la variación del número de dobles enlaces y por la longitud de la cadena de ácidos grasos. En los eucariontes, el colesterol es un regulador clave de la fluidez. Los microorganismo y las células animales en cultivo regulan su composición de lípidos para lograr una fluidez constante bajo varias condiciones de crecimiento. Por ejemplo, cuando se cultivan a baja temperatura, las bacterias sintetizan una mayor proporción de ácidos grasos no saturados que cuando se cultivan a altas temperaturas. Como resultado de lo anterior, las membranas de las bacterias cultivadas a bajas o altas temperaturas, tienen el mismo grado de fluidez. (b) ¿De que moléculas en la membrana forman parte los carbohidratos y como se unen a éstas?

Las membranas de los eucariontes contienen normalmente de 2 a 10% de carbohidratos los cuales

forman parte de los glicolípidos y de las glicoproteínas. Los CHOS de las glicoproteínas de las membranas están unidos al nitrógeno amida de la cadena lateral de la asparagina (unido a N) o al átomo de oxígeno de la cadena lateral de la serina o la treonina (unido a O).

El azúcar unido directamente a estas cadenas laterales es normalmente N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina. (c) ¿Cómo se puede demostrar que los residuos de carbohidratos en las membranas están en la parte exterior de las mismas. Por técnicas específicas de marcaje. Las lectinas, proteínas de plantas con alta afinidad para residuos de azúcar, son herramientas valiosas para este propósito. Por ejemplo, la concanavalina A se une a los residuos internos y no reducidos de alfa-manosilo, mientras que la aglutinina de germen de trigo se une a los residuos terminales de N-acetilglucosamina. Estas lectina se pueden visualizar rápidamente al microscopio electrónico si se conjugan con marcadores densos a los electrones como ferritina, una proteína de 460 kd y un centro de cerca de 4000 iones Fe+3. La concanavalina A se une específicamente a la superficie externa de la membrana del eritrocito y no a la parte citosólica. Los estudios de unión de una amplia variedad de lectinas a muchas clases de membranas han demostrado que los residuos de azúcar de los glicolípidos y glicoproteínas de membrana están siempre localizadas en el lado extracelular de las membranas plasmáticas. Los residuos de carbohidratos de las glicoproteínas de las membranas ayudan a mantener el carácter asimétrico de las membranas biológicas. 10 (a) ¿Cuáles son las características de la glicoforina A?

Es una proteína de la membrana de eritrocitos constituida por una sola cadena polipeptídica de 131 residuos de aa que tiene unidas 16 unidades de oligosacáridos. Fue la primera proteína integral de membrana que se secuenció. ¿Cuál es su contenido de carbohidratos? 60% ¿De cuántas partes esta constituida? De tres partes:

(1) Una región amino terminal de 72 residuos de aa localizada en la parte extracelular de la membrana la cual contiene todas las unidades de CHOS,

(2) Una región media hidrofóbica de 19 residuos de aa la cual está enterrada en el centro hidrocarbonado de la membrana, y

(3) una región carboxilo terminal de 40 residuos de aa rica en cadenas polares y ionizables y que está en el lado citosólico de la membrana. ¿Qué tipo de carbohidrato predomina? Ácido siálico ¿A qué aminoácidos están unidos los residuos de carbohidratos?

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De las 16 unidades de carbohidratos (Aprox 100 residuos de carbohidratos) quince de ellas están unidas a la serina o treonina y 1 de ellas está unida al grupo amida de la cadena lateral de la asparagina. ¿Qué características le da a los glóbulos rojos? Una cubierta aniónica e hidrofílica, que los capacita para circular sin adherirse a otras células y paredes de los vasos (b) Describa la manera de predecir exactamente las hélices transmembrana a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína.

La presencia de un segmento de 19 residuos de aa altamente polar en la glicoforina A sugirió que

este segmento de la proteína atraviesa la bicapa de lípidos y que está doblado en forma de alfa-hélice. Con polipéptidos sintéticos se ha demostrado que las hélices alfa son mas estables en un medio no polar que en el agua, la cual compite con los enlaces de hidrógeno que estabilizan a la alfa-hélice entre los grupo imino y carbonilo.

Un enfoque para identificar las hélices transmembranales es preguntar si el segmento helicoidal postulado prefiere estar en un ambiente hidrofóbico o en el agua. Entonces hay que calcular el cambio de energía libre cuando un segmento helicoidal es transferido del interior de la membrana al agua. Por ejemplo, la transferencia de la hélice de poli-L-Arg del interior de una membrana al agua debe ser altamente favorable (-12.3 kcal/mol de Arg en la hélice), mientras la transferencia de una hélice de poli-L-Phe sería desfavorable (+3.7 kcal/mol de Phe en la hélice).

El centro hidrocarbonado de la membrana es típicamente 30 Å de ancho, la cual puede ser atravesada por una hélice alfa de los 20 residuos. Se puede tomar la secuencia de proteínas y calcular el cambio de energía libre en la transferencia de una alfa-hélice de los residuos 1 a 20 del interior de la membrana al agua. Los mismos cálculos pueden hacerse para los residuos 2 a 21, 3 a 22 y así sucesivamente hasta que lleguemos hasta el fin de la secuencia. El ancho de 20 aminoácidos escogido para este cálculo se la llama ventana.

Para la glicoforina A, una gráfica de cambio de energía libre contra la posición del primer residuo en la ventana muestra un máximo bien definido de +40 kcal/mol cuando el residuo 73 es el primero en la ventana. Esta gráfica de hidropatía identifica correctamente la hélice transmembrana de la glicoforina. En general, un pico de +20 kcal o mas en una gráfica de hidropatía basada en una ventana de 20 residuos indica que un segmento polipeptídico pudiera ser una hélice que atraviesa una membrana. Por este criterio, la glicoforina A tiene solamente una hélice que cruza la membrana, lo que concuerda con hallazgos experimentales.

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2. TRANSPORTE A TRAVÉS DE MEMBRANAS

1 (a) ¿Cuáles son los tipos de transporte en las membranas biológicas? I. NO MEDIADO. Ocurre por difusión simple (sin proteína acarreadora o transportadora). p.e. agua, oxígeno, nitrógeno y metano II. MEDIADO (1). Transporte pasivo. (1.1) Difusión facilitada. Glucosa permeasa de los eritrocitos, intercambiador cloro-bicarbonato de los eritrocitos. (1.2) Ionóforos y porinas. Valinomicina, monensina y gramicidina. (2). Transporte activo. (2.1). Primario: Energía: ATP, luz, oxidación. Ejemplos: H+ ATPasa (membrana plasma, plantas), NaK ATPasa (membrana plasmática, animales), ATPasa de Ca+2 y ATPasa de H+-K+ . (2.2). Secundario: Gradiente de iones; AA y azúcares (impulsado por sodio en intestino); lactosa (impulsado por H+, bacterias) (permeasa de lactosa). (b) Cómo podemos distinguir entre transporte activo y transporte pasivo?

Depende del cambio en energía libre de las especies transportadas. Cuando el ΔG es positivo, el proceso de transporte es activo y cuando el ΔG es negativo el proceso de transporte es pasivo. El transporte activo requiere una entrada acoplada de energía libre, mientras que el transporte pasivo ocurre espontáneamente. (c). Cuáles son las clases generales de sistemas de transporte mediado de acuerdo a la (c1) estequiometría del proceso. (c1.1) Uniporte y (c1.2). Cotransporte: a) simporte y b) antiporte, y (c2) al carácter eléctrico del ion transportado. (c2.1) electroneutro cuando hay una neutralización de cargas simultánea, ya sea por el simporte de iones con carga opuesta o por el antiporte de iones con carga similar y (c2.2) electrogénico cuando el proceso de transporte resulta en la separación de cargas. (d) ¿Cuáles son los papeles de los sistemas de transporte específicos? (d1) Regular el volumen celular y mantener el pH intracelular y la composición iónica en un rango muy estrecho para proporcionar un medio ambiente favorable para la actividad enzimática. (d2) Extraer y concentrar los combustibles metabólicos y los bloques constructores del medio ambiente y eliminar las sustancias tóxicas. (d3) Generar gradientes iónicos que son esenciales para la excitabilidad de nervios y músculo. 2 (a) Describa el funcionamiento del acarreador de glucosa de eritrocitos.

El transporte de glucosa a los eritrocitos tiene las siguientes características que los diferencian del transporte no mediado y que comprueban que es mediado por un número limitado de proteínas: (1) velocidad y especificidad; el transporte de glucosa en los eritrocitos es cuatro órdenes de magnitud mayor que el valor calculado en una bicapa sintética de lípidos, mientras que el valor de manitol es similar en ambos sistemas; (2) cinética de saturación; demuestra que hay un número saturable de sitios para realizar el transporte; (3) susceptibilidad a la inhibición competitiva; muchos compuestos parecidos a la glucosa inhiben el transporte, el compuesto 6-0-benzil-D-galactosa muestra una conducta típica de inhibición competitiva y (4) susceptibilidad a la inhibición química; el tratamiento de los eritrocitos con HgCl2, el cual reacciona con los grupos SH de las proteínas y así inactiva a muchas enzimas. causa la desaparición rápida del flujo saturable de glucosa y la constante de permeabilidad se aproxima a la del manitol. Es una glicoproteína de PM 55 kDa que tiene cuatro dominios principales:

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(1) un conjunto de 12 segmentos hidrofóbicos en forma de α hélice que atraviesan la membrana y que se piensa forman un cilindro hidrofóbico que rodea un canal hidrofílico a través del cual la glucosa es transportada; (2) un dominio citoplásmico grande y muy cargado localizado entre las hélices 6 y 7; (3) un dominio externo, pequeño que contiene carbohidratos localizado entre las hélices 1 y 2, y (4) un dominio COOH terminal citoplásmico relativamente grande. Esta proteína constituye el 2% de las proteínas de los eritrocitos.

El transporte de glucosa aparentemente toma lugar cuando la glucosa se une a la proteína en un lado de la membrana, seguido por un cambio conformacional que cierra el primer sitio, mientras expone el segundo. Parece que todas las proteínas transportadoras están situadas asimétricamente a través de la membrana y que alternan entre dos estados conformacionales en los cuales los sitios de unión al ligando están expuestos, a su vez en lados alternos de la membrana.

Esta proteína de eritrocitos se conoce como GLUT1 y se expresa en la mayoría de los tejidos, aunque en hígado y músculo, los tejidos que transportan activamente glucosa, está presente solo en pequeñas cantidades. Se han identificado al menos otros 4 transportadores de glucosa, GLUT2 a GLUT5 que tiene de un 40 a un 65% de homología a GLUT1 y que tiene diferente distribución en los tejidos. Por ejemplo GLUT2, es prominente en células pancreáticas β (las cuáles secretan insulina en respuesta a un aumento en la [glucosa] y en hígado (donde su defecto produce la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo I). El GLUT4 está presente principalmente en las células musculares y del tejido adiposo. La distribución de estos transportadores correlaciona con la respuesta de estos tejidos a la insulina. El transporte de glucosa en hígado no es sensible a insulina, mientras que el músculo y el tejido adiposo toman glucosa cuando son estimulados por insulina.

Después de 15 minutos de la administración de insulina, el transporte máximo (J max) para el transporte masivo mediado de glucosa a éstas células aumenta de 6 a 12 veces, mientras que la Km permanece sin cambio. La captación de glucosa retorna a lo normal 20 min a 2 horas después de la remoción de insulina. Los inhibidores de la síntesis de proteínas no inhiben este proceso. En el estado basal, las células musculares y del tejido adiposo almacenan transportadores de glucosa en las membranas de vesículas internas. Después de la estimulación con insulina, éstas vesículas se fusionan con la membrana plasmática, un proceso conocido como exocitosis (b) Describa el sistema de cotransporte de Cl- y HCO3

- (intercambiador de aniones). Este es otro sistema de difusión facilitada, un intercambiador aniónico, el cual es esencial para el

transporte de CO2 de los tejidos a los pulmones El CO2 de desecho liberado, de los tejidos que respiran al plasma sanguíneo, entra a los eritrocitos, donde se convierte en HCO3

- por la enzima anhidrasa carbónica. El bicarbonato regresa al plasma para transportarse a los pulmones.

En los pulmones, el bicarbonato regresa a los eritrocitos donde se convierte en CO2 Se le conoce como intercambiador cloro-bicarbonato, proteína intercambiadora de aniones o banda 3. Proteína integral de membrana de 103 kD, cruza la membrana probablemente 12 veces, a diferencia del transportador de glucosa, este es bidireccional. El movimiento acoplado de ambas especies iónicas es obligatorio. No es electrogénico (no hay una ganancia neta de cargas eléctricas en ningún lado de la membrana). Este intercambiador consiste de un dominio amino-terminal hidrofílico. (c) Describa el sistema de transporte de los ionóforos y la porina.

Los ionóforos son moléculas orgánicas de diferentes tipos, muchos de los cuales son antibióticos de

origen bacteriano, que aumentan mucho la permeabilidad de las membranas a iones específicos. Los ionóforos pueden ser acarreadores (valinomicina y monensina) o formadores de canales (gramicidina A). Los acarreadores aumentan la permeabilidad de la membrana a su ion uniéndolo, difundiéndolo a través de la membrana y liberando el ion al otro lado.

Los formadores de canales forman canales transmembrana o poros, a través de los cuales los iones pueden difundir. La valinomicina es una molécula cíclica compuesta de la siguiente secuencia que se repite

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3 veces: ácido L-láctico-L-valina-ácido D-hidroxiisovalérico-D-valina. La valinomicina es un acarreador de potasio.

La gramicidina es un péptido compuesto por 15 aminoácidos, algunos tienen la forma D y otros la L. Dos cadenas de este péptido forman un túnel por donde pasan iones catiónicos. La manera en que se distingue experimentalmente si un antibiótico es un acarreador o forma un túnel es estudiando la sensibilidad del fenómeno a la temperatura: mientras que los acarreadores son altamente sensibles, los formadores de canales son poco sensible, aunque en ambos casos el incremento de la temperatura aumenta el transporte de los iones. 3 (a) ¿Cómo se puede calcular el cambio de energía libre para (a1) especies sin carga y (a2) especies con carga?

Es el cambio de energía libre requerida para transportar una especie del lado 1 en donde está presente en una concentración c1 al lado 2 donde está presente en una concentración c2 (a) ΔG = RTln(c2/c1) (b) ΔG = RTln(c2/c1) + ZF ΔV

Para una especie cargada se está considerando el potencial eléctrico a través de la membrana. La suma de las concentraciones y los términos eléctricos se llama potencial electroquímico Z = carga eléctrica de las especies transportadas, ΔV = potencial en volts a través de la membrana; F = constante de Faraday (23.062 kcal/V mol). (b) Calcule el ΔG para el transporte de una molécula no cargada (b1) de c1 = 10-3 mM a c2 = 10-1 mM y (b2) de c1 = 10-1 mM a c2 = 10-3 mM. Indique si el transporte es pasivo o activo. T = 25oC (298oK). (b1) = 1.987 x 298 x ln(10-1/10-3), R = cal/moloK. = + 2.7 kcal/mol (es positivo, entonces el transporte es activo). La sustancia se transporte de una concentración menor a una mayor. (b2) = 1.987 x 298 x ln(10-3/10-1) = - 2.7 kcal/mol (es negativo, entonces el transporte es pasivo). La sustancia se transporta de una concentración mayor a una menor. 4. ¿Cuáles son los tres tipos generales de ATPasas de transporte? 4.1. ATPasas tipo P. (se fosforilan reversiblemente como parte de su ciclo de transporte). Tienen homología de secuencia, especialmente cerca del residuo Asp que se fosforila. Todas se inhiben por el vanadato, un análogo de fosfato,. Son proteínas integrales de membrana que cruzan la membrana varias veces. Ejemplos: Na+K+ (eucariontes superiores), H+K+ (células que secretan ácido), H+ (Neurospora, plantas superiores), Ca+2 (de plasma de eucariontes superiores y retículo endoplásmico de células de músculo animal). 4.2. ATPasas tipo V. (V es por vacuola) Esta es una clase de ATPasas de transporte que es responsable de acidificar los compartimientos intracelulares de muchos organismos. Dentro de las vacuolas de plantas superiores y hongos, el pH se mantiene muy abajo por este tipo de ATPasas. Las ATPasas tipo V también son responsables de la acidificación de lisosomas, endosomas, el complejo de Golgi y las vesículas secretoras en las células animales. Estas ATPasas no sufren fosforilaciones y desfosforilaciones cíclicas y no son inhibidas por ouabaína o vanadato. Su papel es el de crear un pH bajo en el compartimiento para activar proteasas y otras enzimas hidrolíticas. 4.3. ATPasas tipo F (La F en el nombre se originó en su identificación como factores acoplantes de energía) Juegan un papel central en las reacciones de conservación de energía en bacterias, mitocondrias y cloroplastos. Catalizan el paso transmembrana reversible de los protones impulsado por la hidrólisis del ATP. El flujo de los protones a través de la membrana para disipar el gradiente de concentración se acompaña de síntesis de ATP a partir de ADP y Pi (la inversa de la hidrólisis del ATP). Por lo tanto el

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nombre mas apropiado es la ATP sintetasa. En algunos casos, la formación del gradiente de protones es impulsada por una fuente de energía diferente al ATP, como la oxidación de sustratos o la luz del sol. 5 (a). ¿Cómo se genera el gradiente iónico de Na+ y K+ a través de la membrana celular?

Se genera por medio la bomba de Na+K+. Esta proteína bombea de manera activa K+ al interior de la

célula y Na+ al exterior de la célula. De esta manera se mantiene una alta concentración de K+ y un baja concentración de Na+ en el interior de la célula en relación con el medio extracelular. Esta proteína requiere de ATP, de hecho solo hidroliza ATP si el Na y el K están presentes. Se denominó Na+K+ ATPasa. Ecuación: ATP + H2O --> ADP + Pi + H+ (b) ¿Cuál es la localización de la bomba de NaK ATPasa en la membrana celular?

La bomba consiste de 2 clases de subunidades α (112 kD) y β (aprox 40 kD), asociadas en la

membrana como un tetrámero de composición α2β2. Ambas subunidades son proteínas integrales de membrana. El extremo extracelular de la subunidad a contiene los sitios para la unión a cardiotónicos y la parte intracelular los sitios de unión para el ATP. La subunidad β contiene cadenas de oligosacáridos en su parte extracelular (c) ¿Dónde se localizan los centros de unión para el ATP, los iones y los inhibidores en la Na+K+ ATPasa? Se determinaron por estudios en los fantasmas de eritrocitos. (c1) El sodio debe estar adentro y el potasio afuera para que se active la ATPasa y para que se transporten los iones. (c2) El ATP es un sustrato efectivo para la ATPasa y la bomba solo cuando esta fuente de energía está dentro de la célula. (c3) Los esteroides cardiotónicos inhiben la bomba y la ATPasa solo cuando están localizados fuera de la célula. (c4) El vanadato inhibe la bomba y la ATPasa sólo cuando está localizado dentro de la célula (d) ¿Cuáles son algunos de los posibles mecanismos involucrados en el funcionamiento de la Na+-K+ATPasa?

El ATP fosforila a la ATPasa sólo cuando el Na+ y el Mg+2 están presentes. El intermediario

fosforilado se hidroliza entonces cuando el K+ está presente. También la bomba interconvierte, al menos, dos diferentes conformaciones E1 y E2 lo cual produce 4 estados conformacionales E1, E1-P, E2-P y E2 . Se transportan 3 Na y 2 K por ATP hidrolizado. La bomba genera una corriente eléctrica a través de la membrana (es electrogénica). (e) ¿Es posible que la bomba hidrolice ATP cuando los iones no se transportan?

No, la hidrólisis del ATP y el transporte de Na y K están estrechamente acoplados como otros

proceso biológicos: flujo de electrones y síntesis de ATP, hidrólisis de ATP y contracción muscular. Es posible que la bomba sintetice ATP cuando el flujo de iones se invierte al alterar las concentraciones de Na y K en el medio extracelular de los eritrocitos (f) ¿Cuáles son las características del modelo de la Na K ATPasa?

Tres Na+ son tomados del medio intracelular (E1), la proteína se fosforila (E2), la proteína sufre

eversión y libera al Na+, toma K del medio extracelular, se desfosforila (1) y libera al potasio al medio intracelular (g) Dé dos ejemplos de esteroides cardiotónicos y su mecanismo de inhibición.

La Digitoxigenina y la ouabaína, son derivados de plantas y tienen una profunda influencia sobre la

función del corazón (aumentan la fuerza de contracción cardíaca). El anillo de lactona insaturado en la conformación β en C-17 y el grupo OH en C-14 y una fusión cis de los anillos C y D son esenciales para su

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actividad inhibitoria. Estos compuestos inhiben las reacciones de desfosforilación de la NaK ATPasa, sólo si el esteroide está localizado en la parte extracelular de la membrana. Estabilizan la forma E2-P de la bomba.

La inhibición de la bomba de NaK por los digitálicos conduce a un mayor nivel de sodio dentro de la célula. La disminución en el gradiente de sodio produce una menor extrusión de calcio por el intercambiador sodio-calcio. El aumento subsecuente en el calcio intracelular aumenta la fuerza de contracción del músculo. 6 (a) ¿Cómo se bombean del citosol los iones calcio?

El Ca+2 es un segundo mensajero que dispara numerosas respuestas celulares incluyendo la

contracción muscular, la liberación de neurotransmisores y el rompimiento del glucógeno. El Ca+2 es un activador importante del metabolismo oxidativo. La [Ca+2] en los espacios extracelulares (aprox 1500 mM) es de 4 órdenes de magnitud mayor que en el citosol (0.1 mM). Este gradiente de [ ] es mantenido por el transporte activo de Ca+2 a través de la membrana plasmática, el retículo endoplásmico (retículo sarcoplásmico en el músculo), y la membrana interna mitocondrial.

La membrana plasmática y el retículo endoplásmico contienen una ATPasa de Ca+2 que bombea activamente al Ca+2 fuera del citosol a expensas de la hidrólisis del ATP. Su cinética es muy similar a la de la NaK ATPasa. Se ha estudiado mas intensamente la ATPasa de calcio del retículo endoplásmico debido a su abundancia. Constituye mas del 80% de las proteínas integrales y abarca 1/3 del área de superficie de la membrana (b) ¿Cuál es la relación estructural y funcional de la ATPasa de calcio con la de NaK?

Las gráficas de hidrofobicidad sugieren que la ATPasa de calcio tiene el mismo patrón de hélices

transmembrana que la ATPasa de NaK. Un residuo de aspartato es fosforilado transitoriamente por ATP en una reacción dependiente de calcio, después se hidroliza este intermediario fosforilado (no requiere calcio). El ciclo para la extrusión del ATP es el siguiente: El calcio se une a la proteína del lado citosólico (E1), se fosforila y cambia de conformación a E2 de tal manera que el calcio se extruye, se desfosforila y regresa a la conformación E1. En resumen las similitudes entre ambas ATPasas son las siguientes: 1. La enzima existe en dos conformaciones: E1 y E2, 2. La fosforilación favorece a E2 y la desfosforilación favorece a E1, 3. Los sitios de unión de los iones se invierten (se vuelven de dentro hacia afuera) y su afinidad para Ca+2 cambia mas de 1000 veces en la transición de E1 a E2, 4. Se forma el intermediario aspartil fosfato E-P. La secuencia de 10 residuos que contiene al aspartato es idéntica en ambas bombas. 5. El vanadato inhibe al transporte de Ca+2 y a la ATPasa estabilizando la forma E2. 6. La transición de E2 a E1 es acelerada por el ATP. 7. (a) Describa el transporte activo secundario (TAS).

El gradiente de iones formado por el transporte primario de Na+ o H+, impulsado por la luz, oxidación,

o hidrólisis de ATP puede en sí mismo proveer la fuerza conductora para el cotransporte de otros solutos. Muchas células contienen sistemas de transporte que acoplan el flujo espontaneo cuesta abajo de H+, o Na+ al bombeo simultáneo cuesta arriba de otro ion, azúcar o aminoácido. (b) ¿Cómo está involucrado el flujo de sodio en el transporte de azúcares y aminoácidos dentro de la célula animal (TAS)?

En las células epiteliales intestinales la glucosa y ciertos aminoácidos son cotransportados por el

sodio usando el gradiente de sodio establecido por la NaK ATPasa (simporte). Si el movimiento es en la misma dirección es simporte y si es en dirección opuesta es antiporte. El sodio es eliminado posteriormente por la bomba de NaK. En muchas células la glucosa entre por difusión facilitada por medio de un transportador de glucosa. Este sistema simporte de glucosa dependiente de sodio es bloqueado por Phlorizin, (solo si se une a la superficie externa del transportador) mientras que el sistema de transporte uniporte de glucosa (independiente de sodio) es inhibido por citocalasina B (solo si se une del lado citoplásmico del transportador)

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Muchas células animales tienen un sistema antiporte que bombea simultáneamente 1 ion Ca+2 al exterior de la célula y permite la entrada de 3 iones Na+. Este sistema permite que la célula tenga bajas concentraciones de calcio requeridas para su función normal. El papel del Na+ en los sistemas simporte y antiporte como los descritos requiere un continuo bombeo de Na+ para mantener el gradiente de Na+ transmembrana. De manera clara, la bomba de NaK ATPasa es un elemento central en muchos procesos de cotransporte (c) Explique como el flujo de protones puede impulsar algunos proceso en las bacterias (TAS).

La galactosido permeasa de E. coli permite la acumulación del disacárido lactosa a niveles de 100

veces mayores que en el medio externo de crecimiento. La E. coli tienen normalmente un gradiente de protones a través de su membrana plasmática producido por metabolismo que produce energía, los protones tienden a fluir espontáneamente de regreso a la célula para disipar este gradiente. La bicapa de lípidos es impermeable a los protones, pero la galactosido permeasa proporciona una ruta para que los protones regresen, y la lactosa es acarreada simultáneamente a la célula en la proteína simporter (permeasa). La acumulación endergónica está acoplada al flujo exergónico de protones; el cambio de energía libre total para el proceso acoplado es negativo. 8. La concentración de Na+ dentro de una célula es aproximadamente 12 mM, la cual está bañada por el plasma con una concentración de Na+ de 145 mM.

El potencial transmembrana típico de una célula es de -0.07 V (adentro negativo en relación al

exterior). ¿Cuál es la energía libre para el transporte de 1 mol de Na+ fuera de la célula a 37oC? NOTA cuando un ion positivo es transportado desde el lado negativo de la membrana al lado positivo, el signo del potencial de membrana es positivo. Cuando es transportado hacia el lado negativo, el signo es negativo. ΔG = RTln(c2/c1) + ZF ΔV R = 1.987 x 10-3 kcal mol-1 oK-1 (8.315 x 10-3 kJ mol-1 oK-1). Faraday = 23.062 kcal mol-1 V-1 (96.5 kJ mol-1 V-1). c1 = 12 mM, c2 = 145 mM ΔG = 1.987 x 10-3 kcal/mol oK (310oK) ln(145/12) + (+1)(23.012 kcal mol-1 V-1)(+0.07 V). ΔG = 0.61597 ln12.06 + (+1)(23.012 kcal mol-1 V-1)(+0.07 V). ΔG = 0.61597 (2.49) + 1.61084. ΔG = 1.53377 + 1.61084. ΔG = 3.14461 kcal/mol (13.157 J/mol). ΔG = + 3.1 Kcal/mol (+13.1 kJ/mol). 9. El jugo gástrico (pH 1.5) es producido por el bombeo de ácido clorhídrico desde el plasma (pH 7.4) hacia el estómago. (a) Calcule la energía requerida para concentrar los H+ en un litro de jugo gástrico a 37oC. R = 8.315 x 10-3 kJ/mol oK. (a) Los protones se bombea de la sangre a un pH de 7.4 (c1) hacia el jugo gástrico a un pH de 1.5 (c2). c1= 3.981x10-8, c2 = 3.1x10-2

ΔG = RTln(c2/c1) ΔG = (8.315 x 10-3 kJ/mol oK)(310.15 oK)ln(3.1x10-2/3.98x10-8) ΔG = 2.5789 ln 793969.8 ΔG = 2.5789 (13.59) ΔG = + 35.0349 kJ/mol (8.37 kcal/mol) Si consideramos la carga se tendría que agregar el factor +1(23,012 kcal)(+0.07) = 1.61 kcal (6.75 kJ)

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(b) Bajo condiciones celulares, ¿cuántas moles de ATP deben ser hidrolizadas para proporcionar esta cantidad de energía? (La energía libre de la hidrólisis del ATP bajo condiciones celulares es aproximadamente -58 kJ/mol). Nota: no tome en cuenta el calculo por la carga. Si la hidrólisis de 1 ATP libera 58 kJ/mol, ¿cuántas moles deben hidrolizarse para liberar 35.03 kJ) R = 0.6040 mol ATP

La ATPasa de H+K+ es estimulada por la histamina por un proceso mediado por receptor cuyo segundo mensajero es el AMPc. De tal manera que la cimetidina (Tagamet), un bloqueador de los receptores de histamina (inhiben competitivamente la unión de histamina a sus receptores), es una droga muy usada en el tratamiento de la úlcera péptica. 10. Calcule la energía libre para el transporte simultáneo de 3 moles de Na+ y 2 moles de K+ por el sistema de la NaK ATPasa, tomando en cuenta las siguientes concentraciones:

[Na+] [K+] Potencial electroquímico Dentro célula 14 mM 157 mM -50 mV Fuera célula 143 mM 4 mM

NOTA, cuando un ion positivo es transportado desde el lado negativo de la membrana al lado positivo, el signo del potencial de membrana es positivo. Cuando es transportado hacia el lado negativo, el signo es negativo). El sodio se bombea de adentro (c1) hacia afuera (c2) de la célula, el potasio se bombea de afuera (c1) hacia adentro (c2) de la célula Para Na+: c1 = 14 mM, c2 = 143 mM ΔG = 1.987x10-3 (298.13) ln (143/14) + (+1)(23.062) (+0.05) ΔG = 0.59213ln 10.2143 + 1.15 ΔG = 0.59213 (3.67) + 1.15 ΔG = 1.37598 kcal/mol + 1.15 ΔG = 2.53 kcal/mol Para tres iones sodio ΔG = 2.53 x 3 = 7.59 kcal/mol Para K+: c1 = 4 mM, c2 = 157 mM (Atráctilósido y ácido bongkreico) ΔG = 1.987x10-3 (298.13) ln (157/4) + (+1)(23.062) (-0.05) ΔG = 0.59213ln 39.25 -1.15 ΔG = 0.59213 (3.67) - 1.15 ΔG = 2.173 - 1.15 cal/mol ΔG = 1.02 Para dos iones potasio ΔG = 1.02 x 2 = + 2.04 Kcal/mol ΔGtotal = + 7.59 Kcal/mol + 2.04 Kcal/mol ΔG = 9.63 Kcal/mol

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3. ACCIÓN HORMONAL

1. Defina lo que es una hormona y haga una clasificación de acuerdo a la distancia que hay entre el sitio de acción y el sitio de síntesis.

Una hormona es un mensajero químico y se puede clasificar en autocrina, paracrina y endocrina cuando la hormona actúa sobre la misma célula que la produce, sobre células vecinas o cuando ingresa al torrente circulatorio para actuar sobre células muy distantes, respectivamente. (b) Haga una clasificación breve de las hormonas en base a su naturaleza química. (b1) moléculas derivadas de aminoácidos: epinefrina y tiroxina, (b2) polipéptidos y proteínas: oxitocina, insulina, glucacon, vasopresina, hormona estimulante de la tiroides, (b3) hormonas esteroides: (derivadas del colesterol): cortisol, aldosterona, testosterona, y (b4) eicosanoides (derivadas del ácido araquidónico, un ácido graso poliinsaturado de 20 carbonos): prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos. (c) ¿Cómo se pueden clasificar los mecanismos generales de transducción hormonal? (c1) La cascada de la adenilato ciclasa y AMPc, (c2) La guanilato ciclasa de membrana y soluble. (c3) La cascada de los fosfoinosítidos, inositol trifosfato y canales de calcio y diacilglicerol que activa a una proteína cinasa; (c4) actividad de tirosina cinasa de algunos receptores (insulina y muchos factores de crecimiento); (c5) receptores intracelulares cuyo complejo con la hormona aumenta la transcripción a nivel nuclear (hormonas esteroides y tiroideas). (d) ¿Quién sintetiza y degrada al AMPc?

La adenilato ciclasa de membrana a expensas del ATP y teniendo como subproducto al PPi. Es

degradado por la fosfodiesterasa (citosólica). (e) ¿Por qué el AMPc recibe el nombre de segundo mensajero?

El AMPc se forma dentro de la célula en respuesta a la unión de la hormona con su receptor en la membrana plasmática, lo que activa a la adenilato ciclasa. La hormona no penetra a la célula, sino que activa a la adenilato ciclasa cuando se une a su receptor. De esta manera la hormona es el primer mensajero y el AMPc es el segundo mensajero. (f) Qué efecto tendrían sobre los niveles de AMPc la cafeína y la teofilina?

Los aumentarían porque inhiben a la fosfodiesterasa. (g) Mencione 4 ejemplos de hormonas que usan al AMPc como segundo mensajero: Epinefrina, glucacon, hormona estimulante del folículo, noreprinefrina, hormona paratiroidea, y vasopresina. 2 (a) Mencione algunos efectos metabólicos del AMPc.

Aumenta la degradación de combustibles de almacenamiento, aumento la secreción de ácidos por la mucosa gástrica, conduce a la dispersión de gránulos de pigmentos de melanina, y disminuye la agregación de las plaquetas. (b) Explique cómo se acoplan los receptores con la adenilato ciclasa.

Por medio de las proteínas G. (c) ¿Cuántas y cuáles son las subunidades de las proteínas G acopladas a la adenilato ciclasa (AC)? Dos tipos diferentes de proteínas G se unen a la AC: (c1) La Gs (estimulatoria) que estimula a la AC y tienen 3 subunidades: α de 45 kD, β de 35 kD y γ de 7 kD. La subunidad α-GTP es la que activa a la AC y

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(c2) La Gi (inhibitoria) que inhibe a la AC y tiene 3 subunidades: α (41 kD) y las β y γ ya mencionadas para Gs. (d) ¿Cuál de las subunidades es la que se une a la AC? La subunidad α. 3. (a) ¿Cuál es el papel del GTP en la activación de la adenilato ciclasa?

La unión de la hormona al receptor cataliza el intercambio de GTP por GDP en la proteína G lo cual conduce a la disociación de la subunidad α y el dímero βγ. De esta manera el complejo subunidad α-GTP se libera y se une a la AC. La hidrólisis posterior del GTP permite la reasociación de las tres subunidades para formar el complejo inactivo proteína G-GDP. (b) ¿Cuál sería el efecto de la inhibición de la actividad de GTPasa de la proteína G sobre los niveles de AMPc?

Los aumentaría ya que esta inhibición causaría que la adenilato ciclasa estuviera permanentemente activa. (c) ¿Cómo actúa la toxina del cólera?

La toxina colérica (del Vibrio cholerae) es una proteína que consta de una subunidad α y 5 subunidades β. Cuando la subunidad α entra a las células hay una modificación covalente en Gs y se cataliza la transferencia de 1 unidad ADP-ribosa del NAD+ a una cadena lateral de una arginina específica de la subunidad α de Gs.

Esta ADP-ribosilación bloquea su capacidad para hidrolizar a GTP unido y por lo tanto daña el mecanismo de desactivación y mantiene a la proteína G en forma activa. Así la AC permanece activada, incluso en ausencia de la hormona. El nivel de AMPc es anormalmente alto lo que estimula el transporte activa de iones y provoca una fuerte irrupción de iones sodio y agua en el tubo digestivo. (d) Describa brevemente la topología del receptor β-adrenérgico en la membrana celular.

La epinefrina (adrenalina) activa a la adenilato ciclasa cuando se une al receptor β-adrenérgico, una

proteína transmembranal (membrana plasmática) de 64 kD. Tiene un conjunto de 7 hélices transmembranales, 2 unidades de oligosacáridos están localizados en la parte extracelular de la membrana plasmática, un lazo en el lado citoplasmático participa en la activación de las proteínas G. La fosforilación de múltiples residuos de serina en el extremo carboxilo impide la interacción del receptor con la proteína G. 4 (a) ¿En que consiste el fenómeno de desensibilización de los receptores?

Consiste en la fosforilación por una cinasa específica en múltiples lugares impidiendo al complejo hormona receptor catalizar el intercambio GTP-GDP y por consiguiente bloquea la transmisión de la señal. La desfosforilación restaura la capacidad para activar a la proteína G. (b) ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual el AMPc activa a la proteína cinasa?

La proteína cinasa tienen dos subunidad: 1 reguladora que puede unirse al AMPc y dos catalíticas. En ausencia de AMPc las subunidades reguladoras y catalíticas forman un complejo R2C2 que es enzimáticamente inactivo. La unión del AMPc a cada una provoca la disociación del complejo R2C2 en una subunidad R2 y dos subunidades C.

Estas subunidades catalíticas libres son enzimáticamente activas. Así la unión del AMPc a las subunidades reguladoras suprime la inhibición de las subunidades catalíticas en donde el AMPc actúa como un efector alostérico. (c) Describa el sistema de la guanilato ciclasa. Esta enzima cataliza la reacción GTP -à GMPc + PPi . Como la AC, la guanilato ciclasa está unido a una señal biológica específica a través de un receptor de membrana. El dominio extracelular de la guanilato ciclasa cumple el papel de receptor de hormona. Esto está directamente acoplado al dominio citosólico a través de un dominio que cruza la membrana, el cual puede ser el sistema receptor de factor auricular natriurético (ANF o atriopeptina) - guanilato ciclasa. Así, las actividades del sitio de unión de la hormona, el

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dominio transmembrana y la guanilato ciclasa están contenidas en la misma cadena polipeptídica. El ANF es liberado por las células de la aurícula del corazón cuando aumenta el volumen sanguíneo. Es transportado al riñón pro la sangre, el ANF activa a la guanilato ciclasa en las células de los túbulos colectores y así resulta en un aumento de GMPc, el cual dispara la excreción renal de Na+ y, consecuentemente de agua. La pérdida de agua reduce el volumen sanguíneo, y así contrarrestando el estímulo inicial que conduce a la secreción de ANF.

El músculo liso vascular también tiene un receptor de ANF-guanilato ciclasa; cuando este receptor es estimulado causa vasodilatación, lo cual reduce la presión sanguínea.

Un sistema similar receptor-guanilato ciclasa en la membrana plasmática de las células epiteliales intestinales es activado por una endotoxina bacteriana (n pequeño péptido) producido por E. coli. La elevación resultante en GMPc produce una disminución en la reabsorción de agua por el epitelio intestinal, produciendo la diarrea característica de la acción de la toxina.

Una segunda enzima de la guanilato ciclasa diferente es una proteína citosólica asociada con el grupo hemo. Esta enzima es activada por su ligando natural óxido nítrico (NO), y por varios vasodilatadores - compuestos tales como la nitroglicerina y nitroprusiato - usado en el tratamiento de la enfermedades cardíacas. Los nitrovasodilatadores se rompen espontáneamente, produciendo NO.

El No es producido a partir de arginina por una oxidasa de función mixta dependiente de Ca+2, la sintasa de NO, presente en muchas células de mamíferos. El NO difunde de sus células de origen a las células vecinas en donde se une al grupo hemo de la guanilato ciclasa y activa a la enzima para producir GMPc. En el corazón el GMPc disminuye la fuerza de contracción al estimular la bomba de iones que mantiene una baja concentración de Ca+2 citosólico. Esta relajación del músculo cardíaco también es producida por las tabletas de nitroglicerina tomadas parta aliviar la angina, el dolor causado por la contracción del corazón deprivado de O2 debido al bloqueo de las arterias coronarias.

El NO es inestable y su acción es breve; dentro de segundos de su formación, el NO sufre degradación a nitrito o nitrato. Debido a que se convierte lentamente a NO, la nitroglicerina produce una relajación de largo plazo del músculo cardíaco.

Se piensa que la mayoría de las acciones del GMPc son mediada por una proteína cinasa dependiente de GMPc, también conocida como cinasa G. Esta enzima está distribuida ampliamente en los eucariontes; ciertos tejidos de mamíferos, incluyendo el músculo y el cerebro, son ricos en esta enzima. Esta constituida por un dominio catalítico y un dominio regulatorio en una sola cadena polipeptídica (Mr aprox 80 kD). La secuencia de dominio catalítico es homóloga con la subunidad C de la proteína cinasa A, y el dominio regulatorio se parece a la subunidad R de la enzima dependiente de AMPc. La unión del GMP a la proteína cinasa G provoca que el dominio auoinhibitorio abandone el sitio de unión del sustrato, permitiendo que la enzima fosforile proteínas con residuos de Ser y Tir rodeados por la secuencia consenso apropiada. Las proteínas cinasas A y F reconocen diferentes secuencias consenso y por lo tanto regulan diferentes proteínas. (d) Explique la vía de formación del inositol trifosfato y del diglicérido y sus efectos biológicos.

La unión de la hormona con su receptor específico estimula el intercambio GTP por GDP en la proteína Gp. El complejo GTP-Gp estimula a las fosfolipasa C (enzima de membrana). Esta última enzima hidroliza al fosfolípido de membrana fosfatidil inositol 4,5 bifosfato en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol. El IP3 se une a su receptor específico en el retículo endoplásmico para liberar al Ca+2 secuestrado.

El diacilglicerol y el Ca+2 activan a la proteína cinasa C en la superficie de la membrana plasmática. La fosforilación de las proteínas por la proteína cinasa C produce la respuesta celular a la hormona. Algunos efectos biológicos son: Glicogenólisis en células hepáticas, secreción de histamina en mastocitos, contracción de músculo liso, agregación de plaquetas, y secreción de insulina por islotes pancreáticos. 5 (a) ¿Cuál es la estructura y función de la calmodulina?

Es una proteína de 17 kD y funciona como un detector de calcio en casi todas las células eucarióticas. Consiste en dos lóbulos globulares similares unidos por una hélice a larga. Cada lóbulo contiene dos centros de unión al calcio. Es miembro de una gran familia de proteínas que unen Ca+2, que incluye troponina, la cual dispara la contracción muscular en respuesta a un aumento en la [Ca+2]. Cuando el Ca+2 se eleva a 1 µm, la unión del calcio induce un cambio conformacional en la calmodulina. En este estado, la calmodulina se asocia con una gran cantidad de proteínas y modula su actividad. Una isoenzima de la fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos que degrada al AMPc es una enzima dependiente de Ca+2/calmodulina.

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La influencia de un segundo mensajero (Ca+2) sobre el nivel de otro (AMPc) es típico de muchos sistemas de transducción; existe un entrecruzamiento y retroalimentación entre varias sistemas de una célula, produciendo una complejidad adicional en las señales que en la mayoría de los casos no se ha entendido completamente.

Normalmente la [Ca+2] se mantiene muy abajo (<10-7 M) por la ación de las bombas de Ca+2 en el retículo endoplásmico, mitocondria y membrana plasmática. Algunos estímulos hormonales producen la entrada de calcio a través de canales específicos para el Ca+2 en la membrana plasmáticas o la liberación del Ca+2 secuestrado en el RE o en la mitocondria y así elevando la [Ca+2] y disparando la respuesta celular. Una forma en la cual el Ca+2 dispara las respuestas celulares es por la activación de una variedad de enzimas dependientes de Ca+2 incluyendo otra cinasa, la cinasa de proteínas dependiente de Ca+2/CM. La subunidad regulatoria de esta enzima es CM. Cuando aumenta el Ca+2 intracelular en respuesta a un estímulo, esta cinasa fosforila y así regula a otras enzimas. La CM es una de las subunidades de la fosforilasa b cinasa y de la sintetasa del NO, las cuales son activadas por Ca+2. (b) ¿Cuál puede ser la utilidad de los ionóforos de calcio?

Los ionóforos pueden atravesar la bicapa lipídica porque tienen una superficie hidrofóbica. Se pueden

usar para introducir Ca+2 en células y orgánulos. Muchas respuesta fisiológicas que normalmente se desencaden por la unión de hormonas a receptores de la superficie celular pueden también conseguirse usando ionóforos de Ca+2 para elevar el nivel de Ca+2 citoplasmático. De forma similar, la concentración de Ca+2 no unido en una célula se puede hacer muy baja introduciendo un quelante específico para Ca+2 (EGTA). (c) Explique los efectos metabólicos de la insulina y su mecanismo de acción.

La insulina promueve proceso anabólicos e inhibe otros catabólicos en músculo, hígado y tejido adiposo. Aumenta la velocidad de síntesis de glucógeno, ácidos grasos y proteínas. Estimula la glicólisis induciendo la formación de monómeros para la síntesis de macromoléculas. Promueve la entrada de glucosa y de algunos otros azúcares y aminoácidos en las células musculares y adiposas. Inhibe proceso catabólicos como la degradación de glucógeno y de grasa.

Disminuye la gluconeogénesis disminuyendo el nivel de enzimas tales como piruvato carboxilasa y fructosa 1,6 bifosfatasa. Muchos de los efectos de la insulina son opuestos a los inducidos por adrenalina y glucacon ya que estas hormonas indican que la glucosa es escasa, mientras que la insulina indica que la glucosa es abundante.

La insulina actúa uniéndose a receptores en la membrana plasmática de las células blanco. La elevada afinidad de la insulina por su receptor es esencial, ya que el nivel de insulina en sangre es muy bajo. El receptor de insulina es una glicoproteína intrínseca de membrana que consiste en dos cadenas α y dos β unidas por 3 puentes disulfuro.

El receptor activado de la insulina es una enzima que cataliza la fosforilación de residuos de tirosina en proteínas blanco. Los dominios de tirosina cinasa del receptor están localizados en la parte citoplasmática de las cadenas β.

Los centros de unión de la insulina están en las cadenas α en la parte extracelular de la membrana. La unión de insulina promueve la actividad tirosina cinasa del receptor (autofosforilación) y el receptor activado es una enzima que fosforila a proteínas blanco que van a ejercer su efectos metabólicos. (d) Explique como actúan las hormonas esteroides y tiroideas.

Los efectos primarios de las hormonas esteroides tales como el estradiol, progesterona y cortisona se

centran sobre la expresión genética y no sobre las actividades enzimáticas o sobre los proceso de transporte, estas hormonas deben penetrar en las células blanco para ejercer sus efectos. Su principal lugar de acción es el núcleo de la célula y no la membrana plasmática. El complejo hormona-receptor migra hasta el núcleo de la célula y se une a puntos específicos en el ADN. Los receptores de hormonas esteroides tienen una región de unión al ADN rica en residuos de cisteína, Arg y Lis.

En esta región tienen secuencias Cis-X2-Cis que probablemente formen proyecciones dactilares que se unan a metales que se ajustan bien para unirse a secuencias específicas de ADN como se ha

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demostrado por el factor de transcripción III una proteína reguladora que activa la expresión del gen del ARN ribosómico 5 S. Las hormonas esteroides unidas a sus receptores actúan como intensificadores de la transcripción. 6 (a) ¿Cómo funciona el receptor de acetilcolina de las sinapsis (punto de conexión entre dos neuronas) de los vertebrados?

Este receptor juega un papel esencial en el paso de una señal de una neurona a la siguiente. Cuando

la señal eléctrica llevada por la neurona presináptica alcanza el extremo sináptico de la célula, el neurotransmisor acetilcolina es liberado al espacio sináptico. La acetilcolina se difunde rápidamente a través del espacio hasta la neurona postsináptica, donde se une con gran afinidad al receptor de acetilcolina.

Esta unión induce un cambio en la estructura del receptor, abriendo un canal transmembrana en la proteína. Los cationes del fluido extracelular, presentes a una mayor concentración que en el citosol de la neurona postsináptica, fluyen a través del canal abierto hacia la célula y así despolarizando (disminuyendo el gradiente electroquímico transmembrana) de la célula postsináptica.

El receptor de acetilcolina permite el paso de Na+ y K+ con igual facilidad, pero otros cationes y aniones son incapaces de pasar a través de este receptor.

Inicialmente, la membrana plasmática de la neurona presináptica está despolarizada, con el interior negativo, resultado de la acción de la bomba de NaK. (1) Un estímulo a esta neurona produce una disminución del potencial de acción a lo largo del axón. La apertura de un canal de sodio operado por voltaje, permite la entrada de sodio y la despolarización local resultante causa que se abran otros canales de sodio adyacentes y así sucesivamente. (2) cuando esta onda de despolarización alcanza la punta del axón, los canales de calcio operados por voltaje permiten la entrada de calcio a la neurona presináptica. (3) La entrada de calcio dispara la exocitosis del neurotransmisor acetilcolina al espacio entre las neuronas (4) la acetilcolina se une a su receptor en la membrana plasmática de la neurona postsináptica causando que el canal de iones operado por el ligando, que es parte del receptor, se abra. (5) El Na y K extracelular entran a través de este canal, despolarizando la célula postsináptica. La señal eléctrica ha pasado así a la célula postsináptica y se moverá a lo largo del axón a una tercera neurona por la misma secuencia de eventos (b) Explique el efecto de glicina y el ácido γ-aminobutírico (GABA) sobre los canales de cloro.

La glicina y el GABA aumentan la permeabilidad de la membrana postsináptica al ion cloro. Un aumento en la conductancia del cloro conduce a la hiperpolarización de la membrana, lo cual aumenta el umbral para disparar un potencial de acción. La glicina y el GABA sirven como transmisores inhibitorios en el SNC.

El GABA es formado por la descarboxilación del glutamato en una reacción catalizada por glutamato descarboxilasa. El piridoxal fosfato es el grupo prostético de esta descarboxilasa. El GABA es inactivado por la transaminación a succinato semialdehído, el cual es oxidado a succinato. El receptor GABA del cerebro es un tetrámero con estructura α2β2. La subunidad α de 53 kd contiene un sitio de unión para barbiturato y otras drogas que afectan el SNC. La subunidad β de 57 kd une GABA.

Los perfiles de hidrofobicidad sugieren que cada subunidad tiene cuatro hélices transmembranales. El poro de 6 Å está formado por la conjunción de al menos una hélice de cada una de las cuatro subunidades. El agrupamiento de las cadenas laterales cargadas positivamente en el extremo del poro hacen al canal altamente sensible a los aniones.

El receptor de glicina tiene una estructura similar. Su subunidad que une estricnina se parece mucho a la subunidad que une al receptor de GABA. Además, esta subunidad del canal activado por glicina y ambas subunidades del receptor de GABA exhiben una identidad de secuencia de 25% con el receptor nicotínico de acetilcolina. (c) Explique como se sintetizan los eicosanoides.

Las prostaglandinas, los tromboxanos y los leucotrienos se denomina en conjunto eicosanoides debido a que contienen 20 carbones (eikosi es la palabra griega para veinte). Se sintetizan a partir del ácido araquidónico por acción de las enzimas lipooxigenasa (leucotrienos) o ciclooxigenasa (prostaglandinas y tromboxanos).

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Las principales clases de PG se denominan PGA a PGI, un subíndice denota el número de dobles enlaces C-C fuera del anillo, Las PGs con dos dobles enlaces, tal como PGE2, son derivadas del araquidonato; los otros dos dobles enlaces se pierden en la formación del anillo de 5 miembros.

Los leucotrienos, encontrados primero en los leucocitos, contienen tres dobles enlaces conjugados, de aquí su nombre. Los tromboxanos son compuestos relacionados con un anillo de 6 miembros. Los eicosanoides son hormonas locales debido a su corta vida. Estos compuestos alteran la actividad de las células que los sintetizan y las células vecinas.

La naturaleza del efecto puede variar de un tipo de célula a otro, en contraste con las acciones mas uniformes de las hormonas globales como insulina y glucagon. Se ha estudiado el mecanismo de acción de PGE1 sobre la lipólisis. La PGE1 a concentraciones nanomolares inhibe la lipólisis y el aumento del AMPc inducida por epinefrina y glucagon en las células adiposas, pero no inhibe la lipólisis inducida por dibutiril AMPc, un análogo de AMPc, liposolube.

Se concluye que esta PG inhibe a la AC de los adipocitos. Otros efectos de las PGs son la estimulación de la inflamación, la regulación del flujo sanguíneo a órganos particulares, el control del transporte de iones a través de la membrana y la modulación de la transmisión simpática. El ácido araquidónico necesario para la síntesis de los eicosanoides proviene de los fosfolípidos de la membrana por acción de una fosfolipasa.

La aspirina inhibe la biosíntesis de las prostaglandinas inactivando a la PG sintetasa. Específicamente, la aspirina (acetil salicilato) inhibe la actividad de la ciclooxigenasa de la enzima acetilando el grupo amino terminal de esta subunidad. Las PGs aumentan los efectos inflamatorios, mientras que la aspirina los abate. La aspirina es un potente agente antiinflamatorio porque inhibe el primer paso de la síntesis de las PG.

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4. METABOLISMO, CONCEPTOS BÁSICOS Y VISIÓN DE CONJUNTO.

1. (a) ¿Cómo puede definir metabolismo? Como la suma de todas las transformaciones químicas que ocurren en una célula u organismo, las cuales se llevan a cabo en una serie de reacciones consecutivas catalizadas por enzimas que constituyen las vías metabólicas. El metabolismo es el proceso global a través del cual los sistemas vivos adquieren y utilizan la energía libre que necesitan para realizar varias funciones. Los organismos vivos no están en equilibrio, sino que requieren un influjo continuo de energía libre para mantener el orden en un universo inclinado al desorden máximo. Ellos realizan esto acoplando las reacciones exergónicas de la oxidación de los nutrimentos a los procesos endergónicos requeridos para mantener el estado vivo tales como la realización de trabajo mecánico, el transporte activo de moléculas contra gradientes de concentración y la biosíntesis de moléculas complejas. ¿Cómo obtienen los organismos vivos esta energía libre? y ¿cuál es la naturaleza del proceso de acoplamiento de energía? Los fotótrofos (plantas y ciertas bacterias) adquieren la energía libre del sol a través de la fotosíntesis, un proceso en el cual la luz impulsa un proceso endergónico entre el CO2 y el H2O para formar carbohidratos. Los quimiótrofos obtienen su energía libre por la oxidación de compuestos orgánicos (carbohidratos, lípidos y proteínas) obtenidos de otros organismos, en última instancia, fotótrofos. Esta energía libre está acoplada frecuentemente a reacciones endergónicas a través de la síntesis de intermediarios de compuestos fosfato de alta energía tal como el ATP. Cada uno de los pasos consecutivos en una vía metabólica produce un cambio químico específico y pequeño, usualmente la remoción, transferencia o adición de un átomo específico, grupo funcional o molécula. En esta secuencia de pasos (la vía), un precursor es convertido en un producto a través de una serie de intermediarios metabólicos (metabolitos). El término metabolismo intermediario se aplica frecuentemente a las actividades combinadas de todas las vías metabólicas que interconvierten precursores, metabolitos, y productos de bajo peso molecular (excluyendo macromoléculas). (b) ¿Cuál es la diferencia entre anabolismo y catabolismo? Catabolismo es la fase degradativa del metabolismo, en la cual las moléculas de nutrimentos orgánicos (carbohidratos, grasas y proteínas) se convierten en productos terminales mas simples y pequeños (p.e. ácido láctico, CO2 y NH3). Las vías catabólicas liberan energía libre, parte de la cual es conservada en la formación de ATP y en los acarreadores reducidos de electrones (NADH y NADPH). En el anabolismo, también llamado biosíntesis, los precursores pequeños y simples se ensamblan en moléculas mas complejas y grandes como lípidos, polisacáridos, proteínas y ácidos nucleicos. Las reacciones anabólicas requieren de energía libre generalmente en la forma de energía libre de hidrólisis del ATP y del poder reductor de NADH y NADPH. En general las vías catabólicas son convergentes y las anabólicas son divergentes. (c) ¿Cuáles son las etapas en la extracción de energía de los alimentos? En la primera etapa, las grandes moléculas en los alimentos se hidrolizan en unidades pequeñas. Las proteínas se hidrolizan a sus 20 aminoácidos constituyentes, los polisacáridos a azúcares simples como glucosa, y las grasas se hidrolizan a glicerol y ácidos grasos. No se genera energía útil en este proceso. En la segunda etapa, estas moléculas numerosas y pequeñas son degradadas a una unidad simple que juega un papel central en el metabolismo. La mayoría de los compuestos producto de la hidrólisis de las macromoléculas, se convierten en la unidad acetilo de acetil CoA. Se genera una pequeña cantidad de ATP en esta etapa comparado con el obtenido de la oxidación completa de la unidad acetilo de acetil CoA.

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La tercera etapa consiste del ciclo del ácido cítrico y la fosforilación oxidativa que son las vías finales comunes de la oxidación de moléculas de combustible. La acetil CoA introduce las unidades de acetilo al ciclo de Krebs, donde se oxidan completamente a CO2. Se transfieren cuatro pares de electrones (tres al NAD+ y uno al FAD) por cada grupo acetilo que es oxidado. Entonces el ATP es generado cuando los electrones fluyen de las formas reducidas de estos acarreadores al O2 en un proceso llamado fosforilación oxidativa. Mas del 90% del ATP producido por la degradación de los alimentos se produce en esta etapa. (d) ¿Cuáles son algunas razones por las que las vías catabólicas y anabólicas son diferentes? La síntesis y degradación simultánea de un compuesto dado en la célula sería un proceso que consumiría mucha energía y sin un propósito claro. Lo anterior es prevenido por la regulación independiente de las vías catabólicas y anabólicas, para que cuando una ocurra, la otra esté suprimida. Esta regulación no ocurriría si ambas vías estuvieran catalizadas por el mismo conjunto de enzimas. La inhibición de una enzima involucrada en el anabolismo inhibiría la secuencia de reacciones en la dirección anabólica. Las vías catabólicas y anabólicas que conectan los mismos extremos, pueden emplear muchas de las mismas enzimas, pero invariablemente al menos uno de los pasos está catalizado por enzimas diferentes en las direcciones catabólica y anabólica, y estas enzimas son los sitios de la regulación independiente. Es también común que las vías catabólicas y anabólicas de un compuesto tomen lugar en compartimientos celulares diferentes (P.e. síntesis y degradación de ácidos grasos en citosol y matriz mitocondrial, respectivamente). (e) Explique tres maneras de regulación de las vías metabólicas: (e1) Enzimas alostéricas que son capaces de cambiar su actividad catalítica en respuesta a moduladores estimulatorios o inhibitorios. En muchos casos, la primera enzima de una vía, es inhibida alostéricamente por el producto final de la vía. La inhibición de la aspartato transcarbamilasa por citidina trifosfato es un ejemplo muy conocido de inhibición por retroinhibición. (e2) En los organismos superiores existe un segundo nivel de regulación metabólica que es la regulación hormonal. Estas son mensajeros químicos que son liberados por un tejido y que estimulan o inhiben un proceso en otro tejido. La hormonas sirven para coordinar las actividades metabólicas de diferentes tejidos, y sus acciones y efectos son generalmente en una escala de tiempo mayor que las de los efectores alostéricos. Ejemplos de regulación hormonal son la degradación de glucógeno por epinefrina, la cual aumenta la concentración intracelular de AMPc y calcio lo cual modifica la actividad de la glucógeno fosforilasa (por fosforilación covalente reversible) y la insulina que promueve la entrada de glucosa a algunas células. (e3) Regulación de la concentración de la enzima. Esta es el resultado de un balance entre la velocidad de síntesis y la de degradación. El nivel de la mayoría de las enzimas se ajusta principalmente por cambios en la velocidad de transcripción de sus genes. La lactosa induce un aumento de mas de 50 veces en la velocidad de síntesis de β-galactosidasa, una enzima requerida para el rompimiento de este disacárido. (f) Mencione en resumen cuatro características de las vías metabólicas. (f1) Son irreversibles. Tienen cambios grandes de energía libre negativa. Son muy exergónicas y la reacción continua hasta terminarse, lo cual le da dirección a la misma. Por esa razón las vías catabólicas y anabólicas no son idénticas. (f2) Tienen un paso comprometido. Aunque las vías metabólicas son irreversibles, la mayoría de las reacciones que la componen funcionan cercano al equilibrio. Al principio de cada vía, s/e, hay generalmente una reacción irreversible (exergónica) que “compromete” el intermediario y produce la continuación de la vía. (f3) Están reguladas. (f4) En las células eucariontes las vías metabólicas se llevan a cabo en sitios celulares específicos. 2. (a) ¿Cómo puede definir energía libre?

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La energía que puede hacer trabajo durante una reacción a presión y temperatura constante. (b) ¿ Qué es el ΔGo’ y cómo se puede calcular el ΔGo’ de una serie de reacciones acopladas? El ΔGo’ es el cambio de energía libre estándar (cuando la concentración inicial de cada componente es 1.0 M, el pH es 7.0 y la temperatura 25°C). Se suman algebraicamente los valores individuales de ΔGo’ de cada reacción y el resultado es el ΔGo’ para la suma de todas las reacciones. Es un criterio de espontaneidad de las reacciones bioquímicas. (c) ¿Defina ΔG y explique cómo se puede calcular el ΔG y el ΔGo’ de una reacción bioquímica partiendo de la constante de equilibrio? ΔG = Cambio de energía libre en condiciones celulares (no estándar) ΔG = ΔGo’ + RT ln [A] [B]/[C] [D] ΔGo’ = -RT ln Keq En negritas están las condiciones actuales del sistema. (d) ¿Cuál es la diferencia entre ΔG y ΔGo’? ΔG es el cambio de energía libre en condiciones celulares y el ΔGo’ es el cambio de energía libre en condiciones estándar. Cada reacción química tiene un valor característica el cual puede ser positivo, negativo o cero, dependiendo de la constante de equilibrio de la reacción. El valor de ΔGo’ es un valor característico y constante, pero el ΔG de una reacción química dada es una función de la concentración y la temperatura que prevalecen durante la reacción y que no son necesariamente condiciones estándar. El ΔG de una reacción que procede espontáneamente al equilibrio es siempre negativo, llega a ser menos negativo cuando la reacción procede, y cero al punto final de equilibrio, indicando que la reacción no puede hacer mas trabajo. (e) ¿Cómo se puede calcular la constante de equilibrio a partir del ΔGo’? Keq = 10-

ΔGo’/RT

(f) ¿Cuál es la relación entre la constante de equilibrio y el ΔGo’? Cuando Keq es ΔGo’ es Empezando con componentes 1 M de la reacción > 1.0 Negativo Procede hacia adelante 1.0 Cero Está en equilibrio < 1.0 Positivo Procede en reversa 3. (a) ¿Cuáles son las dos reacciones de hidrólisis del ATP por medio de los cuales se puede liberar energía libre? (a1) ATP (→ADP + Pi), ΔGo’ = -7.3 kcal/mol (a2) ATP (→AMP + PPi), ΔGo’ = -7.7 kcal/mol (b) ¿Cuál es el ΔG de la hidrólisis del ATP? ΔG ≅ -12.5 kcal/mol (c) ¿Qué reacción cataliza la enzima adenilato cinasa (miocinasa)? ATP + AMP = ADP + ADP. Esta enzima interconvierte ATP, AMP y ADP, esto permite regresar el AMP al ciclo ATP-ADP. (d) ¿Cuál es la estabilidad del PPi en condiciones celulares y su ΔGo’? Ninguna, se hidroliza inmediatamente y el valor de su ΔGo’ es -8.0 kcal/mol. (e) ¿Qué reacciones cataliza la enzima nucleósido difosfocinasa (difosfato cinasa)? NTP + NDP ↔ NDP + NTP, p ej. ATP + GDP ↔ GTP + ADP.

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(f) ¿Qué reacción cataliza la enzima nucleósido monofosfato cinasa? ATP + NMP ↔ ADP + NDP. Es una reacción similar a la adenilato cinasa, pero usa otros nucleótidos monofosforilados como sustrato (en vez de AMP). 4 (a) De manera general, mencione en que reacciones se sintetiza y se consume el ATP. Se sintetiza durante la oxidación de moléculas de combustible o durante la fotosíntesis y se consume durante el movimiento, transporte activo, biosíntesis, amplificación de señales y almacenamiento de la información genética. (b) Mencione algunos compuestos fosforilados que tengan un ΔGo’ menor y otros que tengan un ΔGo’ mayor que el ATP. ¿Cuál es el significado práctico de esto? ΔGo’ menor: Glucosa 1 P (-5.0), Glucosa 6 P (-3.3) y glicerol 3 P (-2.2) y un ΔGo’ mayor: fosfoenolpiruvato (-14.8), carbamil P (-12.3), acetil-P (-10.3), creatina-P (-10.3), pirofosfato (-8.0). El significado es que el ATP puede sintetizarse a partir de compuestos con un ΔGo’ mayor a este (el grupo fosfato del ADP puede recibir un P de otro compuesto) y por otro lado el ATP puede donar un grupo fosfato para formar los grupo con un ΔGo’ menor. (c) Explique cómo el acoplamiento de una reacción termodinámicamente desfavorable puede convertirse en una favorable cuando se acopla a la hidrólisis de ATP. Al sumar algebraicamente los valores de ΔGo’ de la reacción en cuestión con el valor del ATP se obtiene un ΔGo’ negativo (una reacción que procede espontáneamente en la dirección en la que está escrita). Así, la hidrólisis del ATP desplaza el equilibrio de las reacciones acopladas por un factor de 108. Generalmente la reacciones en las que está acoplada la hidrólisis del ATP y que están señaladas por una sola flecha, representan un proceso de 2 pasos, en los cuales parte de la molécula del ATP, ya sea un grupo fosfato o el AMP, es transferido y unido covalentemente a la molécula del sustrato o a un residuo de aminoácido en la enzima lo que aumenta el contenido de energía libre del sustrato o de la enzima. En el segundo paso, el residuo que contiene el fosfato transferido en el primer paso, es desplazado generando Pi o AMP. 5. Problemas 1, 2, 3 del CAP 13. 6. Problemas 4, 5 y 7 del Cap 13. 7. (a) ¿Cuáles son los acarreadores de electrones en las reacciones de óxido-reducción? NADH y FADH2 (b) ¿Cuál es el tipo de reacciones en donde el acarreador de electrones es el NAD+ y el FAD? El NAD+ es el aceptor de electrones en reacciones donde se forma un grupo ceto y el FAD es el aceptor de electrones en reacciones en donde se forma una doble ligadura. (c) ¿Cuántos electrones son transferidos a estas moléculas y en que parte de estas se lleva a cabo la reacción de óxido-reducción? En el primer caso, un átomo de hidrógeno (ion hidruro) del sustrato se transfiere directamente al NAD+, mientras que el otro (protón) aparece en solución. Los dos electrones perdidos por el sustrato son transferidos al anillo de nicotinamida. En el segundo caso, el FAD, al igual que el NAD+ puede aceptar dos electrones. Sin embargo, a diferencia del NAD+, el FAD acepta los dos átomos de hidrógeno del sustrato (el ion hidruro y el protón). La parte reactiva del FAD es el anillo de isoaloxazina. (d) ¿Cuál es la diferencia estructural y funcional entre el NADH y el NADPH? El NADPH tiene esterificado un grupo fosfato al OH en la posición 2’ del anillo de ribosa. El NADPH (a diferencia del NADH) se usa preferentemente en los procesos anabólicos.

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8. (a) ¿Cuál es el acarreador universal de grupos acilo? Coenzima A (b) ¿Que moléculas acarrean: (1) grupos fosforilo, ATP (2) electrones, NADH, NADPH, FADH2 y FMNH2 (3) acilo, coenzima A y lipoamida (4) aldehído, tiamina pirofosfato (5) CO2, biotina (6) unidades de 1 carbono, tetrahidrofolato (7) grupos metilo, S-adenosilmetionina (8) glucosa, uridina difosfato glucosa y (9) fosfatidato? citidina difosfato diacilglicerol. 9. (a) ¿Cuáles son las vitaminas hidrosolubles precursores de las siguientes coenzimas?: tiamina pirofosfato (TPP), tiamina o vitamina B1; FAD y FMN, riboflavina o vitamina B2; NAD, nicotinato o niacina; piridoxal fosfato, piridoxina, piridoxal y piridoxamina (vitamina B6); coenzima A, pantotenato; tetrahidrofolato, folato y biotina unida covalentemente a la carboxilasa, biotina (b) Mencione el proceso metabólico principal de las vitaminas liposolubles E, K, D y A. La vitamina K se requiere para realizar el proceso normal de coagulación, participa en la carboxilación de residuos de glutamato para producir γ-carboxiglutamato, lo cual lo hace un quelante de calcio mucho mas fuerte. La vitamina A o retinol, es el precursor del retinal, un grupo sensible a la luz en la rodopsina y otros pigmentos visuales. Una deficiencia de esta vitamina conduce a ceguera nocturna. Además, los animales jóvenes requieren vitamina A para el crecimiento. El ácido retinoico, el cual contiene un grupo carboxilato terminal en lugar del alcohol terminal del retinol, activa la transcripción de genes específicos que median el crecimiento y el desarrollo. El metabolismo el calcio y del fósforo está regulado por una hormona derivada de la vitamina D. Una deficiencia de vitamina D produce un deterioro en la formación del hueso en los animales en crecimiento. La infertilidad en las ratas es una consecuencia de la deficiencia de vitamina E (α-tocoferol). Esta vitamina protege a los lípidos insaturados de membrana de la oxidación.

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5. CARBOHIDRATOS

1. (a) De la definición de carbohidrato. Son aldehídos o cetonas con múltiples grupos hidroxilo o compuestos que producen tales sustancias por hidrólisis. Forman la mayoría de la materia orgánica en la tierra debido a sus múltiples papeles en todas las formas de vida. (b)¿Cuáles son las funciones de los carbohidratos? (b1) Como almacén de energía, combustibles e intermediarios metabólicos; almidón y glucógeno, ATP y glucosa 6 P. (b2) Los azúcares ribosa y desoxirribosa forman parte de la estructura del ADN y ARN (b3) Los polisacáridos son elementos estructurales de las paredes celulares de bacterias y plantas y en el exoesqueleto de los artrópodos. (b4) los CHOS están unidos a muchas proteínas y lípidos. Por ejemplo, las unidades de azúcar de la glicoforina proporciona a los eritrocitos una cubierta aniónica altamente polar. (c) ¿Cómo se clasifican los carbohidratos? Monosacáridos, azúcar simple que consiste de una sola unidad de polihidroxialdehído o cetona (glucosa); oligosacáridos, cortas cadenas de unidades de monosacáridos unidas por enlaces glicosídicos (disacáridos y cadenas de mas de tres unidades) y polisacáridos, largas cadenas, lineales o ramificadas, con cientos o miles de unidades de monosacáridos. (d) ¿Cómo se calcula el número de isómeros de un compuesto? Con la fórmula 2n, donde n es el número de carbones asimétricos de la molécula. (e) ¿Qué es un enantiómero y un epímero? De un ejemplo de cada uno. Un enantiómero es un compuesto que es imagen especular de otro, p.e. D y L gliceraldehído, un epímero es un azúcar que difiere del otro solo en la configuración alrededor de un solo átomo de carbono; D-glucosa y D-manosa son epímeros en C-2 y glucosa y galactosa son epímeros en C-4. 2 (a) ¿Qué es un hemiacetal y un hemicetal intramoleculares? Las formas predominantes de glucosa y fructosa en solución no son cadenas abiertas, en vez, las cadenas abiertas de estos azúcares forman un anillo. En general un aldehído puede reaccionar con un alcohol para formar un hemiacetal. El C-1 del adehído en la forma de cadena abierta reacciona con el grupo hidroxilo C-5 para formar un hemiacetal intramolecular. El anillo de 6 miembros que resulta se llama piranosa. De igual manera una cetona puede reaccionar con un alcohol para formar un hemicetal, el grupo ceto C-2 en la forma de cadena abierta de la fructosa puede reaccionar con el hidroxilo C-5 para formar un hemicetal intramolecular. (b) ¿Que es un anómero? Se refiere a las nuevas configuraciones que se producen cuando las formas abiertas de los monosacáridos se cierran para formar un anillo. Para los azucares de la serie D dibujados como proyección de Haworth, la designación α significa que el grupo hidroxilo unido al carbón 1 está abajo del plano del anillo, β significa que está arriba del plano del anillo. El C-1 es llamado átomo de carbón anomérico, y así las formas α y β son llamadas anómeros. (c) ¿Qué es mutarrotación?

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Se refiere a la interconversión en agua, de la α-D-glucopiranosa y la β-D-glucopiranosa a través de la forma de cadena abierta para dar una mezcla de equilibrio. Este fenómeno se puede detectar siguiendo los cambios en la rotación óptica (d) ¿Cuál es la conformación mas estable de los anillos de carbohidratos en forma de furano y de pirano? La forma de silla de β-D-glucopiranosa predomina sobre la forma de bote debido a que todas las posiciones axiales están ocupadas por átomos de hidrógeno (e) ¿Qué es un enlace glicosídico y como se puede formar? El enlace O-glicosídico, se forma cuando un grupo hidroxilo de un azúcar reacciona con el carbón anomérico de otro. Los disacáridos maltosa, lactosa y sacarosa están formados por dos monosacáridos unidos covalentemente por este enlace. La formación del enlace glicosídico representa la formación de un acetal de un hemiacetal (glucopiranosa) y un alcohol (un grupo hidroxilo de una segunda molécula de azúcar). Cuando un carbón anomérico llega a estar involucrado en un enlace glicosídico no puede ser oxidado por iones cúpricos o férricos. El átomo de carbón anomérico de un azúcar puede estar unido al átomo de nitrógeno de una amina por un enlace N-glicosídico. La importancia biológica crucial de este tipo de enlaces glicosídicos en biomoléculas muy importantes como nucleótidos, ARN y ADN. Los enlaces N-glicosídicos de casi todas la biomoléculas naturales tienen la configuración β. 3 (a) Mencione algunos intermediarios fosforilados de los carbohidratos: Glucosa 6P, gliceraldehído 3 P, dihidroxiacetona P. Una de las estrategias de la glicólisis es formar intermediarios de 3 carbones que pueden transferir sus grupos fosfato al ADP para lograr una síntesis neta de ATP. La fosforilación también sirve para darles una carga neta negativa a los azúcares. Estos grupos fosfato cargados negativamente pueden tener interacciones electrostáticas fuertes con el sitio activo de algunas enzimas y también impiden que estos azúcares crucen espontáneamente la barrera de lípidos. Otra función de la fosforilación es la creación de intermediarios reactivos para la formación de enlaces O- y N-glicosídicos. (b) ¿Qué es un disacárido y mencione tres ejemplos de los disacáridos mas abundantes? Son dos monosacáridos unidos por un enlace O-glicosídico. Los tres mas abundantes son: sacarosa, lactosa y maltosa. (c) ¿Cómo se sintetiza la sacarosa y la lactosa? La sacarosa se sintetiza en el citosol. Un translocador de fosfato abundante media el transporte de triosas fosfato de los cloroplastos al citosol en intercambio por fosfato. La fructosa 6 P formada de las triosas fosfato une la unidad de glucosa de UDP glucosa para formar sacarosa 6 P. La hidrólisis del éster fosfato produce sacarosa un azúcar rápidamente transportable y movilizable que es almacenado en muchas células de plantas como en la remolacha y en la caña de azúcar. (d) ¿Cuáles son los principales polisacáridos de reserva y estructurales y su estructura en el espacio? El almidón y el glucógeno son los principales polisacáridos de reserva en las plantas y se presenta y en los animales, respectivamente. Ambos están presentes en forma de grandes agregados o gránulos intracelulares. Están muy hidratados, debido a que contiene muchos grupos hidroxilo disponibles para formar enlaces de hidrógeno con el agua. La mayor parte de las plantas tienen la capacidad de sintetizar almidón, pero es especialmente abundante en los tubérculos como la papa y en las semillas como el maíz. De reserva: almidón (formado por amilosa, almidón de tipo no ramificado con enlaces α-1,4 y la amilopectina, una forma ramificada, con un enlace α-1,6 por cada 24 a 30 enlaces α-1,4 y así es como el

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glucógeno, pero con menor grado de ramificación). El peso molecular de las cadenas de amilosa varían de unos pocos miles a 500,00. La amilopectina también tiene un alto peso molecular, cercano a 1 millón.. glucógeno (un polímero de glucosa muy ramificado, la cadena lineal está formada por enlaces α-1,4 y las ramificaciones son α-1,6, una por cada 8 a 12 enlaces α-1,4, de esta manera se aumenta la solubilidad del glucógeno y hace mas disponibles a las unidades de azúcar). Está mas ramificado y en gránulos mas compacta que el almidón. Puede constituir hasta 7% del peso húmedo del hígado. En los hepatocitos, el glucógeno se encuentra en grandes gránulos, los cuales son acúmulos de gránulos mas pequeños compuesto de moléculas sencillas de glucógeno altamente ramificado con un peso molecular promedio de varios millones. Estos gránulos de glucógeno también contienen, unidos fuertemente, las enzimas responsables de la síntesis y degradación del glucógeno. Dado que cada ramificación en almidón y en glucógeno termina con un azúcar no reductor (uno sin un carbón anomérico libre), éstos polímeros tienen tantos extremos no reductores como ramificaciones, pero solo un extremo reductor. El glucógeno y el almidón que se ingieren en la dieta, son hidrolizados por α-amilasas, enzimas en la saliva y en el jugo intestinal que rompen los enlaces glicosídicos (α1--->4) entre las unidades de glucosa. dextrán (un polisacárido de almacenamiento en levaduras y bacterias, consiste solo de residuos de glucosa, pero sus enlaces son principalmente α-1,6 con ramificaciones ocasionales formadas por α-1,2, α-1,3 o α-1,4. Estructurales: la celulosa es uno de los compuestos orgánicos mas importantes en la biosfera, es un polímero no ramificado de glucosa, unida por enlaces β-1,4 lo que le permite formar cadenas rectas muy largas. La celulosa es una sustancia fibrosa, dura e insoluble en agua y que se encuentra en las paredes celulares de las plantas, particularmente en stalks, stems, trunks y en las partes de madera de la planta. Constituye mucho de la masa de la madera y casi todo el algodón es celulosa. Es un homopolisacárido de 10,000 a 15,000 residuos de glucosa. Cada residuo de glucosa es unido al siguiente por una rotación de 180°, y el átomo de oxígeno del anillo de uno está unido por puente de oxigeno al grupo 3-OH del siguiente. Las fibras son formadas por cadenas paralelas. Los enlaces α-1,4 en glucógeno y almidón producen una arquitectura molecular muy diferente. Se forma una hélice hueca en lugar de una cadena recta. Estas diferencias de los enlaces α y β tienen una gran importancia biológica. Las cadena recta formada por el enlaces β es óptima para la construcción de fibras que se caracterizan por una alta fuerza tensil. Por el contrario, la hélice abierta formada por enlaces a es adecuada para la formación de un azúcar de almacenamiento. La celulosa no puede ser usada por la mayoría de los animales como fuente de combustible almacenado, debido a que las uniones β1à4 de la celulosa no son hidrolizados por la α-amilasa. Las termitas digieren rápidamente la celulosa (y por lo tanto la madera), pero solo debido a que contienen en su tracto intestinal un microorganismo simbiótico, Trichonympha, la cual secreta celulasa, una enzima que hidroliza los enlaces β1à4 de la celulosa. Los hongos wood rot, también y las bacterias también secretan celulasa. El único vertebrado capaz de usar celulosa como alimento es el ganado y otros animales rumiantes (borregos, cabras, camellos y jirafas). Los estómagos extras (rumen) contienen bacterias y protistas que secretan celulasa. Otro polisacárido estructura es la quitina que consiste de residuos de N-acetilglucosamina unidos por enlaces β-1,4 lo que le permite formar largas cadenas rectas que tiene un papel estructural. Así, la quitina es como la celulosa excepto que el sustituyente en C-2 es un grupo amino acetilado, en lugar de un grupo OH. Al igual que la celulosa, la quitina no es digerida por los vertebrados. La quitina es el componente principal del exoesquelto duro de casi 1 millón de especies de artrópodos (p.e. insectos y crustáceos) y es posiblemente el segundo polisacárido mas abundante en la naturaleza, después de la celulosa. 4 (a) ¿Cómo participan los carbohidratos en la estructura de la pared celular de las bacterias?

El componente rígido de las paredes de las células bacterianas es un heteropolímero de unidades de N-acetilgalactosamina y ácido N-acetilmurámico unidas por enlaces β-1,4. Muchos de tales polímeros

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lineales situados lado a lado en la pared celular, entrecruzados por péptidos cortos, la estructura exacta de la cual depende de la especie bacteriana.

El peptidoglicano entrecruzado es degradado por la enzima lisozima, la cual hidroliza los enlaces glicosídicos entre N-acetilgalactosamina y ácido N-acetilmurámico, y matando de esta manera a las bacterias. (b) ¿A qué aminoácidos de las proteínas se unen los oligosacáridos para formar las glicoproteínas?

Formando enlaces O-glicosídicos con Ser y Thr y N-glicosídicos con el grupo amida de Asn. (c) De algunos ejemplos del papel de los carbohidratos en el reconocimiento célula-célula.

La fertilización empieza con la unión de un esperma a un oligosacárido específico sobre la

superficie del huevo. La adhesión de leucocitos a la cubierta de los vasos sanguíneos dañados y el regreso de los leucocitos a su sitio de origen en los nódulos linfáticos, ilustra la importancia de los carbohidratos en los procesos de reconocimiento. (d) ¿Cómo participan los carbohidratos en la estructura de la matriz extracelular?

El espacio extracelular en los tejidos animales está lleno de un material parecido al gel, la matriz

extracelular, que también se conoce como sustancia basal, la cual mantiene unidas a las células de un tejido y proporciona una vía porosa para la difusión de los nutrimentos y oxígeno a las células individuales. La matriz extracelular está compuesta de una red interconectada de heteropolisacáridos y proteínas fibrosas.

Los heteropolisacáridos, llamados glicosaminoglicanos, son una familia de polímeros lineales compuestos de unidades repetitivas de disacáridos. Uno de los dos monosacáridos es siempre N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina; el otro es, en la mayoría de los casos un ácido urónico, usualmente ácido glucorónico.

En algunos glicosaminoglicanos, uno o mas de los hidroxilos del amino azúcar es esterificado con sulfato. La combinación de estos grupos sulfato y los grupos carboxilato de los residuos de ácido urónico le dan a los glicosaminoglicanos una densidad de cargas negativas muy alta.

Para minimizar las fuerzas repulsivas, entre los grupos cargados vecinos, estas moléculas asumen una conformación extendida en solución. Una consecuencia de lo anterior es la viscosidad muy alta de las soluciones de estas moléculas largas y delgadas.

Los glicosaminoglicanos están unidos a las proteínas extracelulares para formar los proteoglicanos, enormes agregados, en donde los polisacáridos forman la mayoría de la masa, frecuentemente el 95% o mas.

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6. GLICÓLISIS

1. (a) Defina glicólisis y fermentación. Mencione el sitio celular en donde se llevan a cabo Es la degradación de una molécula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas por enzimas para producir dos moléculas de piruvato. Se lleva a cabo en el citosol de los eucariontes. Durante las reacciones secuenciales de la glicólisis se libera algo de la energía libre de la glucosa y se conserva en forma de ATP. La glicólisis fue la primera vía metabólica que se dilucidó y quizá es la mas entendida. Es una vía universal central del catabolismo de glucosa. A través de esta vía ocurre el flujo de carbonos mas grande en la mayoría de las células. En ciertos tejidos de mamífero y en ciertos tipos celulares (eritrocitos, médula renal, cerebro y esperma), la glucosa es la única fuente o la fuente principal de energía metabólica a través de la glicólisis. Algunos tejidos de plantas que están modificados para el almacenamiento de almidón (como los tubérculos de las papas) y algunas plantas adaptadas para el crecimiento en áreas regularmente inundadas por agua (por ejemplo berro) obtienen la mayoría de su energía de la glicólisis. También muchos tipos de microorganismos anaeróbicos son dependientes enteramente de la glicólisis. Fermentación, es un término general que denota la degradación anaeróbica de glucosa u otro nutrimento orgánico en varios productos (característicos de cada organismo) para obtener energía en la forma de ATP. Se piensa que el rompimiento anaeróbico de glucosa es el mecanismo biológico mas antiguo para obtener energía de las moléculas de combustible orgánico. Las enzimas glicolíticas de los vertebrados son muy similares en secuencia de aminoácidos y estructura tridimensional a sus homólogas en levaduras y espinacas. El proceso de glicólisis difiere de una especie a otra solo en los detalles de su regulación y en el destino metabólico subsecuente del piruvato formado. (b). ¿Cuáles son los destinos metabólicos que puede tomar la glucosa dependiendo de la presencia o ausencia de oxígeno y del tipo de célula? (b1) En condiciones aeróbicas el piruvato se descarboxila oxidativamente para producir el grupo acetil de acetil Co-A, el cual se oxida completamente a CO2 por medio del ciclo de Krebs con la producción concomitante de poder reductor (en forma de NADH y FADH2) que va a alimentar la cadena de transporte de electrones mitocondrial hasta la reducción del oxígeno a agua con la producción simultánea de ATP. (b2) en condiciones anaeróbicas el destino depende de las células en donde se esté llevando a cabo. En el músculo en actividad vigorosa, en los eritrocitos y en algunos microorganismos el piruvato es reducido a lactato (fermentación láctica). En algunos tejidos y tipos celulares (como retina, cerebro y eritrocitos) la glucosa se convierte a lactato aún en condiciones aeróbicas. (b3) El tercer destino principal del piruvato es su conversión anaeróbica a etanol (fermentación alcohólica) y este proceso se lleva a cabo en algunos tejidos de plantas, en ciertos invertebrados, protistas y microorganismos como la levadura de cerveza. (c) Describa los tipos de reacciones involucrados en la glicólisis. 1. Transferencia de fosforilo. Un grupo fosforilo se transfiere del ATP a un intermediario glicolítico o viceversa (4 reacciones). De estas dos son fosforilaciones a nivel de sustrato 2. Desplazamiento de fosforilo. Un grupo fosforilo es desplazado dentro de una molécula de un átomo de oxígeno a otro (1 reacción) 3. Isomerización. Una cetosa se convierte en aldosa o viceversa (2 reacciones). 4. Deshidratación. Se elimina una molécula de agua (1 reacción). 5. Ruptura aldólica. Se rompe un enlace carbono-carbono en una reversa de una condensación aldólica. (1 reacción) 2 (a) ¿Cuáles son las características de las dos etapas en las que se divide la glicólisis?

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Los primeros cinco pasos constituyen la fase preparatoria (primera etapa) y en esta se consumen dos moléculas de ATP/mol de glucosa y se producen 2 moléculas de gliceraldehído 3 fosfato (G3P); las enzimas que utilizan el ATP son la hexocinasa y la fosfofructocinasa-1. En la segunda etapa las dos moléculas de G3P se oxidan completamente a piruvato y se producen 4 moléculas de ATP por mol de glucosa inicial; las enzimas que sintetizan ATP son fosfoglicerato cinasa y piruvato cinasa (b) ¿Cuáles son las 10 enzimas y los intermediarios involucrados en la conversión de glucosa a piruvato? ENZIMA TIPO DE REACCIÓN SUSTRATO Hexocinasa Transferencia de fosforilo Glucosa Fosfoglucosa isomerasa Isomerización Glucosa 6 fosfato Fosfofructocinasa-1 Transferencia de fosforilo Fructosa 6 fosfato Aldolasa Ruptura aldólica Fructosa 1,6, bifosfato Triosa fosfato isomerasa Isomerización Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa Oxidación y fosforilación Gliceraldehído 3 fosfato Fosfoglicerato cinasa Transferencia de fosforilo 1,3 bifosfoglicerato Fosfoglicerato mutasa Desplazamiento de fosforilo 3 Fosfoglicerato Enolasa Deshidratación 2 Fosfoglicerato Piruvato cinasa Transferencia de fosforilo Fosfoenolpiruvato Piruvato (c) ¿Cuántos de éstos son intermediarios monofosforilados y bifosforilados?:

mono: glucosa 6 fosfato, fructosa 6 fosfato, gliceradehído 3 fosfato, dihidroxiacetona fosfato, 3 fosfoglicerato, 2 fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato; (total = 7)

bi: fructosa 1,6 bifosfato y 1,3 bifosfoglicerato. (total = 2) 3 (a) Escriba la ecuación balanceada para la conversión de glucosa a piruvato, a lactato y a etanol. Sí hay óxido-reducción neta Glucosa + 2NAD+ + 2 ADP + 2 Pi ---> 2 piruvato + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H20 No hay óxido-reducción neta Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ----> 2 Lactato + 2 ATP Glucosa + 2 ADP + 2 Pi ----> 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O (b) ¿Qué porcentaje de la energía contenida en la glucosa se libera en la conversión de glucosa a piruvato?

Esta ecuación global se puede dividir en dos partes (1) la conversión de glucosa a piruvato, la cual es exergónica

Glucosa + 2NAD+ à 2 piruvato +2 NADH + 2H+ ΔG1 °’ = -146 kJ/mol

y (2) la formación de ATP a partir de ADP y Pi la cual es endergónica 2ADP + 2Pi à 2ATP + 2H2O ΔG2°’ = 2(30.5 kJ/mol) = 61 kJ/mol La suma algebraica de ambos procesos es de -85 kJ/mol

Esto es, bajo condiciones estándar o intracelulares, la glicólisis es un proceso esencialmente irreversible, conducido hasta su fin por esta gran disminución neta de energía libre.

Para calcular el porcentaje de energía contenido en la glucosa que se libera en la glicólisis hay que dividir el valor de 146 obtenido anteriormente entre el cambio de energía estándar total liberado por la glucosa cuando se oxida completamente (-2,840 kJ/mol) = 146/2,840 = 5.2%

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Esto significa que las dos moléculas de piruvato por la glicólisis aún contienen la mayoría de la energía disponible biológicamente de la molécula de glucosa, la cual puede extraerse por reacciones oxidativas en el ciclo del ácido cítrico. (c) ¿Qué es fosforilación a nivel de sustrato?

La síntesis de ATP fuera de la fosforilación oxidativa mitocondrial, por ejemplo la que se realiza en la glicólisis por acción de las enzimas fosfoglicerato cinasa y piruvato cinasa. 4 (a) ¿Cuál es la diferencia entre la glucocinasa y la hexocinasa y cómo se regula esta última?

La hexocinasa cataliza la entrada de glucosa libre a la vía glicolítica. La enzima presente en miocitos tiene una alta afinidad por glucosa. La Km es de 0.1 mM.

La glucosa sanguínea (4 a 5 mM) entra a los miocitos en donde alcanza una alta concentración, suficiente para saturar a la hexocinasa, por lo que actúa a su máxima velocidad. La hexocinasa de músculo es inhibida alostéricamente por su producto, glucosa 6 fosfato. Cuando la concentración de glucosa 6 fosfato se eleva arriba de lo normal, la hexocinasa se inhibe temporal y reversiblemente, estableciéndose así un balance con la velocidad de utilización.

Los mamíferos tienen varias formas de hexocinasa, las cuales catalizan la conversión de glucosa a glucosa 6 fosfato. La isoenzima predominante en hígado es la hexocinasa D o IV, también llamada glucocinasa, la cual difiere en dos aspectos importantes de la hexocinasa del músculo. Primero, la concentración de glucosa, a la cual la glucocinasa alcanza la mitad de su saturación, es mayor que la concentración normal de glucosa en sangre.

Esto es, la Km para la glucosa es de 10 mM mientras que su concentración en sangre es de 5 mM. Debido a que la concentración de glucosa en el hígado se mantiene a un nivel cercano al de la sangre por un sistema de transporte eficiente, esta propiedad de la glucocinasa permite su regulación directa por los niveles de glucosa en sangre.

Cuando la concentración de glucosa en sangre es alta, como sucede después de una comida rica en carbohidratos, el exceso de glucosa en sangre es transportado a los hepatocitos, donde la glucocinasa la convierte en glucosa 6 fosfato. Por el contrario cualquier disminución en la [glucosa] en sangre conduce a una disminución proporcional en la velocidad de fosforilación de la glucosa en hígado. Por lo tanto, el hígado usa glucosa a una velocidad significativa solo cuando la [glucosa] en sangre es alta. Este efecto amortiguador de la glucosa en sangre por el hígado no ocurriera si la glucocinasa tuviera una Km baja para glucosa, como es el caso de otras hexocinasas, las cuales están saturadas completamente a niveles fisiológicos de glucosa.

Por otra parte, la Km baja de la hexocinasa es una buena elección para tejidos como el cerebro que permite la fosforilación de la glucosa aún cuando las concentraciones de glucosa en sangre y tejido sean peligrosamente bajas.

En segundo lugar, la glucocinasa no es inhibida por el producto de su reacción, sino por el isómero de este último, fructosa 6 fosfato, el cual alcanza un equilibrio con glucosa 6-fosfato debido a la acción de fosfoglucosa isomerasa. También es activada por fructosa 1 fosfato.

La inhibición y activación de la glucocinasa por fructosa 6 fosfato y fructosa 1 fosfato está mediada por una proteína adicional, la proteína regulatoria, la cual, cuando se une a la glucocinasa, la inhibe.

En resumen, la fructosa 6 P promueve la unión y la fructosa 1 P inhibe la unión de esta proteína regulatoria a la glucocinasa.

La fructosa, un monosacárido presente en muchas verduras, frutas y endulzantes promueve la utilización hepática de la glucosa por un mecanismo indirecto. La fructuosa es convertida en el hígado directamente a fructosa 1 fosfato, y la fructosa 1 fosfato aumenta la actividad de glucocinasa al promover la disociación de una proteína inhibitoria sobre la glucocinasa.

Este puede ser un factor en el efecto adverso, por ejemplo, hipertrigliceridemia, asociado algunas veces con el consumo excesivo de fructosa.

La glucocinasa es una enzima inducible. Esto significa que en varias condiciones fisiológicas la cantidad de la enzima aumenta o disminuye. Estos procesos de inducción o represión de la síntesis de una enzima son procesos relativamente lentos, esto es, de varias horas.

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La insulina aumenta la cantidad de glucocinasa al promover la transcripción de su gen. En otras palabras, una persona que consume grandes cantidades de carbohidratos tendrá mayores cantidades de glucocinasa en el hígado que una persona que no los consume.

El hígado, en el cual la glucocinasa ha sido inducida hace una gran contribución a la disminución de los niveles circulantes de glucosa. La ausencia de insulina, hace que el hígado de los pacientes diabéticos esté deficiente de glucocinasa a pesar de la alta concentración de glucosa en sangre.

Y debido a esto, el hígado de los diabéticos pierde capacidad amortiguadora de glucosa circulante. (b) ¿Cómo se regula la actividad de la fosfocructocinasa-1 (PFK-1)? Describa el papel de fructosa 6 fosfato, ATP, citrato y fructosa 2,6 bifosfato.

La glucosa 6 fosfato puede fluir vía la glicólisis o a través de una vía secundaria oxidativa la cual se

describa mas adelante. La reacción irreversible catalizada por PFK-1 es el paso que compromete a una célula a usar glucosa por la vía glicolítica.

Además de los sitios de unión para sus sustratos, la fructosa 6 fosfato y el ATP, esta enzima compleja tiene varios sitios regulatorios donde se unen activadores e inhibidores alostéricos. El ATP no solo es sustrato de la PFK-1, sino un producto final de la vía glicolítica.

Cuando los niveles altos de ATP indican que la célula está produciendo ATP mas rápidamente de lo que lo está consumiendo, el ATP se une a un sitio alostérico y disminuye la afinidad de la enzima por su sustrato fructosa 6 fosfato. El ADP y el AMP, cuya concentración aumenta cuando el consumo de ATP supera su producción, actúan alostéricamente para aliviar esta inhibición por ATP. Estos efectos se combinan para aumentar la actividad enzimática, cuando la fructosa 6 fosfato, ADP o AMP aumentan, y para disminuirla cuando aumenta el ATP.

El citrato, un intermediario clave en la oxidación aeróbica del piruvato también es un regulador alostérico de PFK-1. Las altas concentraciones de ATP aumentan el efecto inhibitorio de ATP. En este caso, como en varios otros, el citrato sirve como una señal intracelular de las necesidades celulares de energía y de los intermediarios biosintéticos.

Otro punto de control de esta enzima es el ejercido por el pH. Cuando este disminuye, la actividad de PFKC-1 también disminuye. Este efecto inhibitorio impide que la formación excesiva de lactato y una caída brusca en el pH sanguíneo.

El regulador alostérico mas importante de PFK-1 es fructosa 2,6 bifosfato, el cual activa la enzima. La F2,6BP aumenta la afinidad de la enzima por F6P y disminuye el efecto inhibitorio de ATP. La F2,6BP se forma por la fosforilación de F6P, una reacción catalizada por fosfofructocinasa-2 (PFK-2).

La F2,6BP es hidrolizada por una fosfatasa específica, fructosa bifosfatasa 2 (FBPasa2). Lo sorprendente es que ambas actividades enzimáticas están presentes en una sola cadena polipeptídica de 55 kd. Esta enzima bifuncional tiene un dominio regulatorio amino terminal, seguido por un dominio cinasa y un dominio fosfatasa.

La PFK-2 se parece a PFK-1, mientras que la FBPasa2 se parece a la fosfoglicerato mutasa. La F6P acelera la síntesis de F2,6BP e inhibe su hidrólisis. Por lo tanto, la abundancia de F6P conduce a una mayor concentración de F2,6BP y a un aumento de la actividad de la PFK-1. Este proceso se conoce como estimulación feedforward.

Además, las actividades de PFK2 y FBPasa2 están controladas recíprocamente por fosforilación en un residuo único de serina. Cuando la glucosa es escasa, el aumento del nivel sanguíneo de glucacon dispara la cascada de AMPc, lo que conduce a la fosforilación de esta enzima bifuncional.

Esta modificación covalente activa a la FBPasa2 e inhibe a la PFK2, disminuyendo así el nivel de F2,6BP. Por el contrario, cuando la glucosa es abundante, la enzima pierde su grupo fosfato unido, lo cual aumenta el nivel de F2,6BP y la velocidad de la glicólisis.

En el músculo, la PFK1 es controlada de manera diferente, la cinasa que cataliza la síntesis de F2,6BP es estimulada, y no inhibida, por la fosforilación inducida por AMPc. Así, la epinefrina estimula la glicólisis en músculo pero la inhibe en hígado. (c) ¿Cómo se controla la actividad de la piruvato cinasa?. Describa el papel de ATP, alanina, acetil CoA y ácidos grasos de cadena larga.

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En los vertebrados hay al menos tres isoenzimas de piruvato cinasa, las que difieren un poco en su distribución en los tejidos y en la respuesta a moduladores. Las altas concentraciones de ATP inhiben alostéricamente a la PK, disminuyendo la afinidad de la enzima por su sustrato, PEP.

El nivel de PEP encontrado normalmente en la célula no es suficientemente alto para saturar a la enzima, y la velocidad de la reacción será de acuerdo a la baja concentración de PEP. La piruvato cinasa es inhibida también por acetil-CoA y ácidos grasos de cadena larga, ambos son importantes combustibles del ciclo del ácido cítrico. La acetil CoA es un producto terminal de la degradación de ácidos grasos, aminoácidos y glucosa.

Debido a que el ciclo del ácido cítrico es una fuente de energía principal para la producción de ATP, la disponibilidad de estos otros combustibles reduce la dependencia de glicólisis en la producción del ATP. De tal manera que cuando la célula tiene altas concentraciones de ATP o cuando están disponibles altas cantidades de combustible para la respiración que está acoplada a la producción energía, la glicólisis es inhibida por la disminución de la actividad de PK.

Cuando la concentración de ATP disminuye, la afinidad de PK por PEP aumenta, capacitando a la enzima para catalizar la síntesis de ATP a pesar de la baja concentración de PEP. El resultado es una alta concentración de ATP en el estado estacionario. (d) ¿Cuál es la enzima clave en la regulación de la glicólisis? La fosfofructocinasa-1. 5. Describa el concepto de válvulas metabólicas de las enzimas regulatorias.

Aunque no están en equilibrio con sus alrededores, los organismos adultos existen generalmente en

un estado estacionario. Un influjo constante de combustible y nutrimentos y una liberación constante de energía y productos de desecho permite al organismo mantener una composición constante.

Cuando el estado estacionario se altera por cambios en las condiciones externas o en el aporte de combustible, la alteración temporal en los flujos en las vías metabólicas individuales dispara los mecanismos regulatorios intrínsecos de cada vía.

El efecto neto de todos estos ajustes es regresar al organismo al estado estacionario- para lograr la homeostasis. Debido al papel central del ATP en las actividades celulares, existen enzimas catalíticas sin propiedades regulatorias que aseguran una alta concentración de ATP en el estado estacionario. El término “alto” en este contexto significa alto en relación a sus productos de rompimiento: ADP y AMP.

El flujo a través de cada vía metabólica depende de las actividades de las enzimas que catalizan cada reacción. Algunas de las enzimas en una vía tal como la glicólisis, catalizan reacciones esencialmente en equilibrio dentro de la célula, la actividad de tales enzimas es suficientemente alta que el sustrato es convertido a producto tan pronto como el sustrato esté presente.

El flujo a través de este paso es esencialmente limitado por sustrato, esto es, determinado por la concentración instantánea del sustrato. Otras reacciones celulares están muy lejos del equilibrio. En la vía glicolítica, la constante de equilibrio para la reacción catalizada por la fosfofructocinasa-1 es cercana a 250, pero el cociente de acción de masas [fructosa 1,6 bifosfato] [ADP]/[fructosa 6 fosfato] [ATP] en el estado estacionario es de 0.04. La reacción está muy lejos del equilibrio debido a que la velocidad de conversión de fructosa 6 fosfato a fructosa 1,6 bifosfato está limitada por la actividad de PFK-1.

El aumento en la producción de fructosa 6 fosfato por las enzimas precedentes en la vía glicolítica no aumenta el flujo a través de este paso, sino que conduce a la acumulación de sustrato, fructosa 6 fosfato. Así la PFK-1 actúa como una válvula, regulando el flujo de carbono a través de la glicólisis; aumentando la actividad de esta enzima (por activación alostérica, por ejemplo) aumenta el flujo total a través de la vía.

El flujo de metabolitos a través de esta vía está determinado, no por la acción de masas (por concentraciones de sustrato y producto) sino por la apertura de esta válvula enzimática. En cada vía metabólica hay, al menos, una reacción que en la célula, está muy lejos del equilibrio debido a la actividad relativamente baja de la enzima que lo cataliza.

La velocidad de esta reacción no está limitada por disponibilidad de sustrato, sino solo por la actividad de la enzima. Por lo tanto, se dice que esta reacción está limitada por enzima, debido a que su velocidad limita la velocidad de la secuencia total de reacciones, el paso se denomina paso limitante de la velocidad en la vía.

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En general, estos pasos limitantes de la velocidad son reacciones muy exergónicas y son por lo tanto irreversibles en condiciones celulares. Las enzimas que catalizan estos pasos exergónicos y limitantes de la velocidad son comúnmente los blancos de la regulación metabólica.

Además de la regulación enzimática alostérica muy rápida dentro de las células individuales, los organismos multicelulares usan señales hormonales para coordinar las actividades metabólicas de diferentes tejidos y órganos. La acción de hormonas altera las actividades de enzimas claves, dentro de minutos o segundos.

Cuando las circunstancias externas cambian a largo plazo, por ejemplo cuando la persona cambia de una dieta rica en grasa a una dieta rica en carbohidratos, el ajuste en el flujo a través de las vías específicas se lleva a cabo por medio del cambio en el número de moléculas de enzimas regulatorias específicas. Esto se acompaña por cambios en las velocidades relativas de síntesis y degradación de las enzimas. 6.Describa el mecanismo de acción de las enzimas hexocinasa, aldolasa, fosfoglicerato mutasa y gliceraldehído 3 fosfato (OPCIONAL).

Hexocinasa. La unión de la glucosa a esta enzima induce un gran cambio conformacional en esta molécula. La hexocinasa consiste de dos lóbulos, los cuales se acercan cuando la glucosa se une. La glucosa induce una rotación de 12 grados de un lóbulo con respecto al otro, resultando en un movimiento de la cadena polipeptídica de 8 Å.

La hendidura entre los dos lóbulos se cierra y la glucosa, excepto su grupo 6 hidroximetilo, queda rodeada de proteína. El efecto de la glucosa sobre la hendidura es un ejemplo claro del papel del cambio inducido (induced fit) en la acción de la enzima. Este cambio estructura inducido por la glucosa tiene, al menos dos significados.

Primero, el medio ambiente de la glucosa, llega a ser no polar (hidrofóbico), lo cual estimula la donación del grupo fosforilo terminal del ATP.

Segundo, el hecho de que la glucosa sea abrazada por la hexocinasa capacita a la enzima para que discrimine al agua como sustrato. Si la hexocinasa fuera rígida, una molécula de agua, ocupando el sitio del grupo hidroximetilo de la glucosa, atacaría al grupo fosfato gamma del ATP.

En otras palabras, una cinasa rígida, sería necesariamente una ATPasa como una cinasa. La actividad indeseable de ATPasa se previene haciendo a la hexocinasa activa solo cuando la glucosa cierra la hendidura.

La piruvato cinasa, la fosfoglicerato cinasa y la fosfofructocinasa, también contiene hendiduras entre los lóbulos que se cierran cuando se une el sustrato. Es probable que el mecanismo de cierre de la hendidura inducida por el sustrato, sea un mecanismo general de las cinasas.

Aldolasa. El mecanismo se explica mejor analizando la reacción inversa catalizada por la aldolasa. Una molécula de DHAP forma una base de Schiff protonada con un residuo de lisina específico en el sitio activo de la aldolasa.

En esta reacción, un nucleófilo (el grupo amino) ataca el grupo carbonilo para formar un intermediario tetraédrico, el cual se deshidrata. La base de Schiff protonada juega un papel crítico en la catálisis. Promueve la formación del anión enolato de dihidroxiacetona fosfato sirviendo como un potente aceptor de electrones (electron sink).

El anión enolato se condensa con el grupo aldehído de gliceraldehído 3 fosfato para formar una base de Schiff protonada de fructosa 1,6 bifosfato. Esta base de Schiff se desprotona y se hidroliza para producir fructosa 1,6 bifosfato y la enzima regenerada. La vía de la ruptura de fructosa 1,6 bifosfato es simplemente la reversa de la de su formación.

Fosfoglicerato mutasa. Cataliza el desplazamiento reversible de un grupo fosfato entre un C2 y un C3 del fosfoglicerato. La reacción ocurre en dos pasos. Un grupo fosfato unido inicialmente a un residuo de His en el sitio activo de la enzima es transferido al grupo hidroxilo en C2 de 3 fosfoglicerato, formando 2,3 bifosfoglicerato.

El fosfato en C3 del 2,3 bifosfoglicerato es transferido al mismo residuo de histidina de la enzima, produciendo 2 fosfoglicerato y regenerando la enzima fosforilada. Debido a que la enzima está fosforilada inicialmente por la transferencia de fosfato de 2,3 bifosfoglicerato, este compuesto funciona como un

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cofactor; es requerido en pequeñas cantidades para iniciar el ciclo catalítico, y se requiere continuamente por el ciclo.

Esencialmente el mismo mecanismo es empleado por la enzima fosfoglucomutasa, que convierte glucosa 1 fosfato a glucosa 6 fosfato. En esta reacción, la glucosa-1,6 bifosfato sirve como un cofactor esencial. Las mutasas son subclases de isomerasas, enzimas que interconvierten esteroisómeros, o isómeros estructurales o de posición.

Otra molécula regulatoria que viene de la vía glicolítica (además de F2,6BP), es el 2,3BFG, un controlador del transporte de oxígeno en los eritrocitos. Estas células tiene una alta concentración de 2,3BPG (4 mM), en relación con otras células que tiene solo pequeñas cantidades. El 2,3BPG se une a la desoxihemoglobina y en consecuencia altera la afinidad de la hemoglobina. Los eritrocitos sintetizan el 2,3BPG a partir de 1,3 BPG.

La enzima bifosfoglicerato mutasa cataliza la transferencia intramolecular de un grupo fosforilo de C1 a C2 de 1,3 BPG. El 2,3 BPG resultante es hidrolizado a 3 PG por la enzima 2,3 bifosfoglicerato fosfatasa. La velocidad de la glicólisis afecta la afinidad del oxígeno por la hemoglobina. A través de la mediación de 2,3 BPG. En consecuencia, los defectos heredados de enzimas de la glicólisis alteran la capacidad de la sangre para transportar oxígeno.

Por ejemplo, la concentración de intermediarios glicolíticos en los eritrocitos deficientes de hexocinasa es menor que lo normal debido a que la hexocinasa cataliza la primera reacción de la glicólisis. Esto resulta en una disminución de la concentración de 2,3 BPG y por lo tanto en un aumento de la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno.

Por el contrario, una deficiencia de piruvato cinasa disminuye la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno, ya que aumenta la concentración de 2,3BPG como resultado del bloqueo en la glicólisis en un paso posterior al de la producción de 2,3 BPG.

Gliceraldeído 3 fosfato deshidrogenasa. La conversión de un aldehído en un acilo fosfato involucra tanto la oxidación como la fosforilación.

La oxidación requiere de la remoción de un ion hidruro. La remoción de un ion hidruro a partir del un grupo aldehído es energéticamente muy costoso debido al carácter dipolar del grupo carbonilo: el átomo de carbono del grupo carbonilo ya tiene una carga parcial positiva.

La remoción del ion hidruro se facilita enormemente al hacer el átomo de carbono menos positivo. Esto se acompaña por la adición de un nucleófilo.

El ion hidruro deja rápidamente el compuesto de adición debido a que el átomo de carbono no lleva mas una carga positiva. Además, algo de la energía libre de oxidación es preservada en el intermediario acilo.

La adición de ortofosfato a este intermediario acilo, produce un acil fosfato, el cual tiene una alta transferencia de grupo.

En el caso de la enzima G3PD, el nucleófilo X- es el grupo sulfhidrilo del residuo de cisteína del sitio activo. El sustrato aldehído reacciona con la forma ionizada de este grupo sulfhidrilo para formar un hemitioacetal.

El siguiente paso es la transferencia de un ion hidruro a la molécula de NAD+ que está fuertemente unida a la enzima. Los productos de esta reacción son la coenzima reducida NADH y un tioéster, que es un intermediario rico en energía correspondiente al acilo intermediario mencionado antes. El NADH se disocia de la enzima y otro NAD+ se une al sitio activo.

El ortofosfato ataca entonces al tioéster para formar el 1,3 BPG, un donador de fosforilo de alto potencial. Un aspecto crucial de la formación de 1,3BPG a partir de G3P es que una reacción termodinámicamente desfavorable, la formación de un acilo fosfato a partir de un carboxilato, es impulsada por la reacción termodinámicante, la oxidación de un aldehído.

Estas dos reacciones están acopladas por el intermediario tioéster, el cual preserva mucho de la energía libre liberada en la reacción de oxidación. Aquí se ve el uso de intermediario covalente unido a la enzima como un mecanismo de acoplamiento de energía. 7 (a) Explique cuál es el efecto del arsenato, del piridoxal fosfato y del iodoacetato sobre la glicólisis.

El arsenato es un análogo del fosfato y toma su lugar en la reacción catalizada por la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa. Como consecuencia de lo anterior, se forma un compuesto inestable

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(en vez del 1,3 bifosfoglicerato) que se hidroliza espontáneamente, y por lo tanto no se forma ATP en este paso.

Se dice que el arsenato es un desacoplante entre la oxidación del sustrato y la síntesis del ATP y la consecuencia es que en estas condiciones no hay síntesis neta de ATP en la glicólisis, aunque el flujo a través de esta vía no se detiene.

El piridoxal fosfato no ejerce ningún efecto sobre la glicólisis. El iodoacetato modifica covalentemente a la enzima gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y de esta manera la inhibe irreversiblemente. La modificación consiste en la unión covalente de un grupo acetato a un grupo SH esencial para la actividad de la enzima. El efecto es que el flujo a través de la vía se detiene completamente. (b) ¿Que coenzimas son indispensables para la conversión de piruvato a etanol? Tiamina pirofosfato (TPP) es una coenzima de la enzima piruvato descarboxilasa. Esta enzima también requiere del ion Mg+2 . (c) ¿Cuáles iones metálicos son cofactores indispensables para la conversión de glucosa a lactato y de glucosa a etanol? De glucosa a lactato: Mg+2 y K+ (piruvato cinasa) y de glucosa a etanol, además de los mencionados, Zn+2 (deshidrogenasa alcohólica). El sitio activo de la deshidrogenasa alcohólica contiene un ion zinc que está coordinado con los átomos de azufre de dos residuos de cisteína y un átomo de nitrógeno de un residuo de histidina. Como en la carboxipeptidasa A, el Zn+2 polariza el grupo carbonilo del sustrato para estabilizar el estado de transición. (d) ¿Qué efecto tendría sobre la glicólisis anaeróbica la inhibición de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa? En condiciones anaeróbicas, la inhibición de esta reacción tiene como consecuencia la inhibición de la glicólisis debido a que no se regeneraría el NAD+ (que se regenera en la reducción de piruvato a lactato) el cual se requiere subsecuente en la reacción catalizada por gliceraldehído fosfato deshidrogenasa. 8 (a) Explique como pueden entrar a la vía glicolítica otros monosacáridos como fructosa, manosa y galactosa. Mencione las enzimas adicionales que se requieren en cada caso.

La fructosa puede entrar por uno de dos caminos siguientes: (1) se puede fosforilar directamente por

hexocinasa para dar fructosa 6 fosfato, el cual es un intermediario glicolítico o (2) se puede fosforilar por fructocinasa para dar fructosa 1 fosfato, el cual se rompe en gliceraldehído y dihidroxiacetona fosfato por la enzima fructosa 1 fosfato aldolasa.

La dihidroxiacetona fosfato se isomeriza a gliceraldehído 3 fosfato por medio de la triosa fosfato isomerasa y el gliceraldehído se fosforila por medio de la enzima triosa cinasa para producir gliceradehído 3 fosfato.

La afinidad de hexocinasa por glucosa es 20 veces mayor que por fructosa. Se forma poca fructosa 6 fosfato en el hígado debido a la abundancia de glucosa en relación con fructosa en ese órgano La manosa es fosforilada por hexocinasa a manosa 6 fosfato y después es isomerizada a fructosa 6 fosfato por medio de fosfomanosa isomerasa. La galactosa es fosforilada por galactocinasa para dar galactosa 1 fosfato. Este compuesto es convertido en su epímero en C-4, glucosa 1 fosfato, por un conjunto de reacciones en las cuales uridina difosfato funciona como a un acarreador, parecido a una coenzima, de grupos hexosa. (b) ¿Cómo afectaría a la conversión de galactosa a glucosa la ausencia de NAD+?

La epimerización de la galactosa a glucosa ocurre cuando la primera se encuentra unida a UDP. La configuración del grupo hidroxilo en C-4 es invertida por la enzima UDP galactosa 4 epimerasa, la cual contiene NAD+ fuertemente unido. Los estudios de fluorescencia han demostrado que este NAD+ se reduce transitoriamente a NADH durante la catálisis.

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El NAD+ acepta, probablemente, un átomo de hidrógeno unido al C-4 del azúcar, y se forma un intermediario 4-ceto. El NADH transfiere entonces el mismo átomo de hidrógeno al otro lado de C-4 para formar el otro epímero. Por lo tanto, la ausencia de NAD+, impediría que se realizara esta reacción. (c) ¿Qué es la galactosemia? (OPCIONAL).

Es una enfermedad genética heredada en la cual se afecta el metabolismo de la galactosa. En la

forma mas común de esta enfermedad la enzima UDP-glucosa:galactosa-4-epimerasa está defectuosa genéticamente, lo que previene la conversión de galactosa 1 P en glucosa 1 P.

Otras formas de galactosemia se originan por la deficiencia de galactocinasa o de UDP-glucosa-4-epimerasa. Los niños afectados con galactosemia tienen problemas de crecimiento y se presenta vómito y diarrea cuando se consume leche.

Es común la hepatomegalia y la ictericia y en varios casos los pacientes sufren de retraso mental. La galactosa en sangre se eleva mucho y esta aparece en orina. Un criterio de diagnóstico es la ausencia de la transferasa en los eritrocitos. Esta enfermedad se trata por la exclusión de la galactosa de la dieta. Este tratamiento produce una regresión de casi todos los síntomas clínicos, excepto por la deficiencia mental, la cual no es reversible.

Por el contrario, si se continúa la ingestión de galactosa, puede ocurrir la muerte. El daño en la galactosemia se debe a una acumulación de sustancias tóxicas y no a la ausencia de un componente esencial. Una de las sustancias tóxicas es el galactitol, el cual se forma por la reducción de la galactosa. 9. Problemas 1,2 y 3 del Cap. 15. 10. Problemas 4,5 y 9 del Cap. 15 11. Problemas 10,11,12 del Cap. 15. 12. Qué enzima(s) de fermentación alcohólica o láctica: (1) Tiene un residuo de lisina específico en el sitio activo que forma una base de Schiff protonada cuando reacciona con el sustrato. Aldolasa. (2) Sufre un cambio conformacional cuando se une a la glucosa. Hexocinasa. (3) Requiere NAD+ para su actividad. Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa y deshidrogenasa alcohólica. (4) Es estimulada por fructosa 1,6 bifosfato e inhibida por ATP y alanina. Piruvato cinasa. (5) Es estimulada por fructosa 2,6 bifosfato. Fosfofructocinasa-1. (6) Catalizan reacciones irreversibles. Hexocinasa, fosfocructocinasa-1 y piruvato cinasa. (7) Puede usar como sustrato arsenato en vez de fosfato. Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (8) Usan como sustrato ATP. Hexocinasa, fosfocructocinasa-1. (9) Catalizan reacciones de síntesis de ATP. Fosfoglicerato cinasa y piruvato cinasa. (10) Tiene una cisteína en su sitio activo, cuyo grupo SH es indispensable para su actividad. Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa. (11). Requieren de NADH. Deshidrogenasa alcohólica/Deshidrogenasa láctica. (12). Requiere Zn+2. Deshidrogenasa alcohólica. (13) Cataliza una reacción de deshidratación. Enolasa. (14) Es inhibida por iodoacetato. Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa. (15) Requiere de FAD. Ninguna. (16) Catalizan la isomerización cetosa⇔aldosa o viceversa. Fosfohexosa isomerasa, Triosa fosfato isomerasa. (17) Es inhibida por glucosa 6 fosfato. Hexocinasa.

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(18) Tiene una Km alta para glucosa y no es inhibida por glucosa 6 fosfato (isoenzima de la anterior). Hexocinasa D o glucocinasa. (19) Requiere tiamina pirofosfato (TPP). Piruvato descarboxilasa. (20) Cataliza un rearreglo intramolecular de fosfato. Fosfoglicerato mutasa. (21) Catalizan la formación de compuestos con un ΔGo’ mayor que el ATP. Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y enolasa. (22) Cataliza una reacción de descarboxilación. Piruvato descarboxilasa. (23) Catalizan reacciones conocidas como fosforilaciones a nivel de sustrato. Fosfoglicerato cinasa y piruvato cinasa. (24) Catalizan la ruptura de un compuesto fosforilado de 6 átomos de carbono. Aldolasa. (25) Cataliza la formación de un anhídrido llamado acil fosfato. Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa. (26) Tiene una histidina en su sitio activo y requiere de cantidades catalíticas de 2,3 bifosfoglicerato. Fosfoglicerato mutasa. (27) Catalizan reacciones de isomerización. Fosfohexosa (fosfoglucosa) isomerasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglicerato mutasa. (28) Requiere de potasio. Piruvato cinasa. (29) Requieren de Mg+2. Hexocinasa, fosfohexosa isomerasa, fosfofructocinasa-1, fosfoglicerato cinasa, fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, piruvato descarboxilasa. (30) Regenera el NAD+ para que continúe la glicólisis anaeróbica. Lactato deshidrogenasa y deshidrogenasa alcohólica. 13. Explique en que consiste el “Efecto Pasteur”.

En los estudios de la fermentación de glucosa por las levaduras, Pasteur descubrió que, tanto la

velocidad como la cantidad total de glucosa consumida fueron muchas veces mayor bajo condiciones anaeróbicas que bajo condiciones aeróbicas.

La cantidad de ATP de la vía glicolítica bajo condiciones anaeróbicas (2 moléculas de ATP/mol de glucosa) es mucho menor que el obtenido de la oxidación completa de la glucosa (36 o 38 moléculas de ATP/mol de glucosa).

Esto es, aproximadamente 18 veces mas glucosa se debe consumir de manera anaeróbica que de manera aeróbica.

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7. CICLO DE KREBS

1. ¿Cuál es el mecanismo de reacción del complejo piruvato deshidrogenasa? Indique (A) la ecuación balanceada y el sitio de la célula en donde se lleva a cabo esta reacción y las del ciclo de Krebs. Piruvato + NAD+ + CoASH --------------àAcetil CoA + NADH + CO2 ΔG°’ = -33-4 kJ/mol Esta reacción y las del ciclo de Krebs se lleva a cabo en la matriz mitocondrial. Es una reacción de descarboxilación oxidativa e irreversible. El grupo carboxilo es removido del piruvato como una molécula de CO2 y los dos carbonos restantes llegan a ser el grupo acetilo de AcCoA. (B) La forma en que el piruvato ingresa a la mitocondria. Por medio de un simporte piruvato-H+ (c) Las enzimas y coenzimas que la forman y el número de copias de cada enzima Enzima Coenzima(s) PM, subunidades # subunidades por complejo Piruvato deshidrogenasa (E1) TPP 96,000 24 Dihidrolipoil transacetilasa (E2) Lipoato, CoA 65,000-70,000 24 Dihidrolipoil deshidrogenasa (E3) FAD, NAD 56,000 12 También forman parte del complejo dos proteínas: una proteína cinasa y una fosfoproteína fosfatasa. (D) el tamaño de este complejo en relación con el de un ribosoma. El complejo de piruvato deshidrogenasa aislado de E. coli (Mr > 4.5 x 106) es de 45 nm de diámetro, mayor que el de un ribosoma de procariontes (que es de 20-25 nm con un peso de 2-2.5 x 106 y ligeramente mayor que el de un ribosoma de eucariontes de una masa de 4.2 x 106) y puede ser visualizado por el microscopio electrónico. (E) La secuencia de transformaciones que da lugar a la formación de productos. Se lleva a cabo en cuatro pasos: E1. El piruvato se descarboxila después de su reacción con TPP. Esta reacción es catalizada por la enzima E1 del complejo

Piruvato + TPP --------à hidroxietil-TPP + CO2 Una característica del TPP es que el átomo de carbono entre los átomos de nitrógeno y azufre en el anillo de tiazol es mucho mas ácido que la mayoría de los grupos =CH-. Por lo tanto se ioniza para formar un carbanión, el cual se combina rápidamente con el grupo carbonilo del piruvato. El nitrógeno cargado positivamente del anillo de TPP actúa entonces como un potente aceptor de electrones para estabilizar la formación de una carga negativa, la cual es necesaria para la descarboxilación, produciéndose el intermediario hidroxietil-TPP. E2. El grupo hidroxietilo unido a TPP es oxidado para formar un grupo acetilo y transferido concomitantemente a lipoamida. El oxidante en esta es el grupo disulfuro de lipoamida, el cual se convierte en forma sulfhidrilo. Esta reacción también es catalizada por la enzima E1, y el producto de la misma es acetillipoamida y se regenera el carbanión de TPP. E3. El grupo acetilo es transferido de acetillipoamida a CoA para formar acetilCoA. Esta reacción es catalizada por dihidrolipoil transacetilasa (E2). El enlace tioéster rico en energía es preservado cuando el grupo acetilo es transferido a CoA. E4. La forma oxidada de lipoamida es regenerada por dihidrolipoil deshidrogenasa (E3). Dos electrones se transfieren al grupo prostético FAD de la enzima y luego al NAD+.

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(F) la manera en que se regula la actividad del mismo. Esta es una reacción irreversible en los animales, lo que conduce a que éstos sean incapaces de convertir AcetilCoA en glucosa. La descarboxilación oxidativa del piruvato a acetilCoA compromete los átomos de carbono de la glucosa a dos vías principales: oxidación a CO2 por el ciclo del ácido cítrico, con la generación simultánea de energía, o la incorporación de lípidos. Se regula de la siguiente manera: La fosforilación del componente piruvato deshidrogenasa inactiva al complejo. Esto es revertido por la acción de una fosfatasa específica. Ambas enzimas están unidas al componente transacetilasa (E2). Los cocientes NADH/NAD+, acetilCoA/CoA o ATP/ADP altos promueven la fosforilación y así la desactivación del complejo. El piruvato activa la deshidrogenasa al inhibir a la cinasa, mientras que el Ca+2 la activa al estimular a la fosfatasa. De tal manera que el complejo piruvato deshidrogenasa es inactivado cuando la carga energética es alta y los intermediarios biosintéticos están elevados. Por el contrario, las hormonas como la vasopresina y los agonistas α1-adrenérgicos estimulan la piruvato deshidrogenasa al elevar el Ca+2 citosólico, el cual a su vez eleva el Ca+2 mitocondrial. El calcio puede ingresar a la matriz mitocondrial en respuesta al potencial de membrana (adentro negativo) y puede abandonar la mitocondria en intercambio por Na+ (intercambiador sodio-calcio). La insulina también acelera la conversión de piruvato a acetilCoA estimulando la desfosforilación. 2. Haga un bosquejo del ciclo de Krebs indicando: (A) Las reacciones individuales con el cambio de energía libre estándar y la reacción global balanceada, Reacción Enzima Gpo. prostético ΔG°’ AcetilCoA + OA +H2O -> Citrato + CoA + H+ Citrato sintetasa -75 Citrato >< cis-aconitato + H2O Aconitasa Fe-S +2.0 cis-aconitato +H2O >< isocitrato Aconitasa Fe-S -0.5 Isocitrato + NAD+ >< α-CG + CO2 + NADH + H+ Isocitrato

deshidrogenasa -2.0

α-CG + NAD+ + CoA >< succinil CoA + CO2 + NADH + H+

α-CG deshidrogenasa TPP, FAD, Lipoico

-7.2

Succinil CoA + Pi + GDP >< succinato + GTP + CoA succinil CoA sintetasa -0.8 Succinato +FAD >< fumarato + FADH2 succinato

deshidrogenasa FAD, Fe-S ≅ 0

Fumarato + H2O >< L-malato Fumarasa -0.9 L-malato + NAD+ >< OA + NADH + H+ Malato deshidrogenasa + 7.1 (B) si se puede obtener síntesis neta de oxaloacetato en el ciclo de Krebs. No es posible, ya que entran dos átomos de carbono en forma de acetilCoA y salen dos átomos de carbono en forma de CO2. (C) las reacciones del ciclo de Krebs en donde se produce CO2, NADH, FADH2 y GTP, Se produce CO2 en las reacciones catalizadas por ICD (isocitrato à α-CG) y α-CGD (α-CG a succinil CoA). El NADH se produce en las reacciones catalizadas por ICD, α-CGD y malato deshidrogenasa. El FADH2 se produce en la reacción catalizada por succinato deshidrogenasa. El GTP se produce en la reacción catalizada por succinil CoA sintetasa. (D) la enzima que está unida a la membrana interna mitocondrial. Succinato deshidrogenasa.

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(E) el complejo enzimático que es muy parecido estructural y funcionalmente al complejo de la piruvato deshidrogenasa. α-cetoglutarato deshidrogenasa. (F) la enzima que tiene un centro hierro-azufre. Aconitasa/succinato deshidrogenasa (G) La reacción en donde se lleva a cabo una fosforilación a nivel de sustrato, succinil CoA + GDP + Pi à succinato + GTP + CoA (Succinil Coa sintetasa) (H) La reacción que es inhibida por malonato. Succinato à fumarato (succinato deshidrogenasa). (I) La reacción que es inhibida por fluorocitrato. Aconitasa. El fluoroacetato está presente en la hojas de ciertas plantas venenosas de Africa, Australia y Sudamérica. En sí mismo tiene poco efecto tóxico sobre las células, sin embargo, las células lo convierten enzimáticamente en fluoroacetil-CoA y entonces a (2R,3R)-fluorocitrato, el cual inhibe a la aconitasa. 3. (a) Describa el mecanismo de acción de la citrato sintetasa (OPCIONAL). Esta enzima cataliza la formación de citril CoA, el cual se hidroliza a citrato y CoA. Esta enzima está compuesta de dos subunidades idénticas de 49-kD. Cada sitio activo está localizado en una hendidura entre el dominio pequeño y grande de una subunidad, adyacente a la interface de las subunidades. Se ha demostrado, por estudios de cristalografía de rayos X de citrato sintetasa y sus complejos con varios sustratos e inhibidores, que la enzima sufre un cambio conformacional muy grande durante la catálisis. Primero se une el OA y después la acetilCoA. La unión del OA induce un gran rearreglo estructural lo que conduce a la creación de un sitio de unión para acetilCoA. La forma abierta de la enzima, en ausencia de ligando, se transforma en una forma compacta o cerrada por la unión del OA. (b) ¿Por medio de que reacción se sintetiza ATP a expensas del GTP sintetizado en el ciclo de Krebs? Por medio de la enzima nucleósido difosfocinasa que cataliza la reacción reversible GTP +ADP <--> ATP + GDP. Esta enzima requiere de Mg+2 y tiene un ΔGo’ de 0.0 kcal/mol. 4. (a) ¿Cómo se regula la actividad del ciclo de Krebs? Mencione el papel y sitio de acción del ATP, acetil CoA, NADH, succinil CoA y ADP.

El ATP inhibe las reacciones de piruvato deshidrogenasas, citrato sintetasa e isocitrato deshidrogenasa.

La acetil CoA inhibe la reacción de la piruvato deshidrogenasa El NADH inhibe las reacciones de piruvato deshidrogenasa, citrato sintetasa y α-cetoglutarato

deshidrogenasa. El succinil CoA inhibe las enzimas citrato sintetasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa. El ADP estimula las enzimas citrato sintetasa e isocitrato deshidrogenasa. Además, el Ca+2 estimula las deshidrogenasas de piruvato, isocitrato y α-cetoglutarato, el citrato

inhibe a la citrato sintetasa, y los ácidos grasos inhiben y el AMP, CoA y NAD+ estimulan alostéricamente la piruvato deshidrogenasa.

En resumen, la actividad de piruvato deshidrogenasa se inhibe cuando hay grandes cantidades de

combustible en la forma de ácidos grasos y acetil CoA y cuando la concentración de ATP y el cociente [NADH]/[NAD+] son altos y se estimula cuando las demandas de energía son altas y se requiere un mayor flujo de acetil-CoA al ciclo del ácido cítrico.

Todas las modificaciones descritas anteriormente para piruvato deshidrogenasa de los vertebrados son alostéricas, y se complementan por un segundo nivel de regulación, la modificación covalente de las proteínas.

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El complejo se inhibe por la fosforilación reversible de un residuo de serina en una de las subunidades de E1 (Piruvato deshidrogenasa). Además de las enzimas E1, E2 y E3, el complejo Pir des contiene dos proteínas regulatorias cuyo único propósito es regular la actividad del complejo. Una cinasa de proteína específico fosforila y por lo tanto inactiva a E1, y una fosfatasa de fosfoproteína específica remueve el grupo fosfato por hidrólisis y por lo tanto activa a E1.

La cinasa es activada alostéricamente por ATP: Cuando los niveles de ATP son altos, este

complejo se inactiva por fosforilación de E1. Cuando el nivel de ATP disminuye, la actividad de la cinasa disminuye y la acción de la fosfatasa remueve los fosfatos de E1 y así activando al complejo.

El complejo en las plantas está regulado primariamente por los niveles de NADH, aunque también hay evidencia de la regulación por fosforilación reversible. En E. coli el complejo es regulado alostéricamente de una manera similar a lo que sucede en los vertebrados y la regulación por fosforilación no ocurre.

Las tres enzimas del ciclo que se regulan lo hacen principalmente por (el flujo a través de la vía está

gobernado): (a) disponibilidad de sustrato, (b) inhibición por acumulación de productos, y (c) inhibición por retroalimentación alostérica de las primeras enzimas por intermediarios

posteriores del ciclo. La disponibilidad de oxaloacetato y acetil CoA, sustratos de citrato sintetasa, varía con las

circunstancias metabólicas y algunas veces puede limitar la velocidad de formación del citrato. Las deshidrogenasas de isocitrato y α-cetoglutarato son inhibidas por cocientes [NADH]/[NAD+] elevados.

Los iones calcio, que en los vertebrados son la señal, para la contracción y el aumento en la demanda concomitante de ATP, activa ambas deshidrogenasas y al complejo

Bajo condiciones normales, las velocidades de la glicólisis y del ciclo del ácido cítrico están integradas de manera que la cantidad de glucosa que se metabolice a piruvato depende de la cantidad de combustible que requiere el ciclo de Krebs, en forma de grupos acetilo (de acetil CoA).

La velocidad de glicólisis está asociada a la velocidad del ciclo del ácido cítrico no solo por la inhibición por altos niveles de ATP y NADH, los cuales son componentes comunes de ambas etapas de la oxidación de glucosa, la glicolítica y la respiratoria, sino también por citrato.

El citrato, producto de la primera etapa del ciclo, sirve como un inhibidor alostérico importante de la fosfofructocinasa-1. (b) OPCIONAL ¿Cómo se regula la isocitrato deshidrogenasa en las bacterias? El isocitrato tiene dos destinos principales en algunas plantas y bacterias. Cuando la energía se necesita, se descarboxila oxidativamente a α-CG. Por el contrario, cuando la energía es abundante, el isocitrato se escinde a succinato y glioxalato. El ciclo del ácido cítrico y el ciclo del glioxalato compiten por isocitrato en este punto de ramificación clave. En tiempo de abundancia, la isocitrato deshidrogenasa es inactivada por fosforilación, lo cual sirve para derivar al isocitrato a la vía del glioxilato para la formación de intermediarios biosintéticos. El mecanismo de desactivación es simple, la fosforilación del residuo de serina 113 en el sitio activo bloquea directamente la unión del isocitrato. La cinasa que fosforila a la isocitrato deshidrogenasa y la fosfatasa que remueve el grupo fosfato están en la misma cadena polipeptídica. Estas reacciones opuestas están catalizadas por el mismo sitio activo. Sus velocidades están reguladas recíprocamente por varios metabolitos. El AMP, por ejemplo, activa a la fosfatasa e inhibe a la cinasa. 5. (a) ¿Qué significa que el ciclo de Krebs es una vía anfibólica? En los organismos aeróbicos el ciclo del ácido cítrico es una vía anfibólica (sirve en procesos catabólicos y anabólicos). No solo funciona en el catabolismo oxidativo de los carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos, sino que también proporciona precursores para muchas vías biosintéticas, como en los ancestros anaeróbicos.

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(b) ¿Qué productos se pueden sintetizar a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs? Por la acción de varias enzimas auxiliares, ciertos intermediarios del ciclo del ácido cítrico, particularmente oxaloacetato y α-cetoglutarato, pueden ser removidos del ciclo para servir como precursores de aminoácidos. Aspartato y glutamato provienen de ellos, ya que tiene el mismo esqueleto de carbones y pueden ser sintetizados por transaminación simple. A través de aspartato y glutamato, los carbonos de OA y α-CG son usados para construir otros aa y así como nucleótidos de purinas y pirimidinas. También se verá como el OA es convertido en glucosa en el proceso de gluconeogénesis. Succinil Co-A es un intermediario central en la síntesis del anillo de porfirinas del grupo hemo que sirven como acarreador de oxígeno (en hemoglobina y mioglobina) y de electrones (en los citocromos). Dado el número de productos biosintéticos derivados de los intermediarios del CAC, este ciclo claramente tiene un papel crítico, aparte de su función en el metabolismo productor de energía (c) ¿Qué es una reacción anaplerótica? De al menos dos ejemplos de este tipo de reacciones.

Cuando los intermediarios del ciclo del ácido cítrico son removidos para servir como precursores biosintéticos, se esperaría, que la disminución resultante en la concentración de estos intermediarios, disminuya el flujo a través del ciclo. Sin embargo, los intermediarios pueden reponerse por reacciones anapleróticas.

Bajo condiciones normales, las reacciones por medio de las cuales los intermediarios del ciclo con

removidos y son repuestos están en un balance dinámico, de tal manera que la concentración de los intermediarios del ciclo permaneces casi constantes. piruvato carboxilasa. Piruvato + CO2 + ATP --<à OA + ADP + Pi Hígado. riñón fosfoenolpiruvato carboxicinasa. PEP + CO2 + GDP -<à OA + GTP Corazón, músculo esq. fosfoeneolpiruvato carboxilasa. PEP + HCO3

- -<à OA + Pi Plantas superiores, bacterias levaduras enzima málica. Piruvato + HCO3

- + NAD(P)H <à malato + NAD(P)+ Eucariontes y procariontes. (d) ¿En que reacción(es) anaplerótica(s) la biotina es una coenzima, y cuál es su mecanismo de acción? En la de la piruvato carboxilasa. La biotina juega un papel clave en muchas reacciones de carboxilación. Esta vitamina es un acarreador especializado de grupos de 1-carbono en su forma mas oxidada: CO2. Los grupos carboxilo están unidos a la biotina en el grupo ureido dentro del sistema de anillo de biotina. La piruvato carboxilasa está compuesta de cuatro subunidades idénticas, cada una contiene una molécula de biotina unida covalentemente a través de un enlace amida entre su cadena latera de valerato y un grupo ε-amino de un residuo de lisina específico en el sitio activo de la enzima; esta biotinlisina se llama biocitina. La carboxilación del piruvato procede en dos pasos: 1º. Un grupo carboxilo derivado del HCO3

- se une a la biotina. 2º. El grupo carboxilo es transferido al piruvato para formar OA. (e) ¿Qué reacciones de la glicólisis, ciclo de Krebs o anapleróticas son inhibidas por avidina? La biotina es una vitamina requerida en la dieta humano, es abundante en muchos alimentos y es sintetizada por bacterias intestinales. La enfermedad por deficiencia es rara y es observada solo cuando se ingieren grandes cantidades de huevo crudo. Los huevos crudos contiene una gran cantidad de la proteína avidina, la cual une a la biotina muy fuertemente y previene su absorción en el intestino. La avidina en la clara del huevo crudo puede ser un mecanismo de defensa contra el crecimiento de las bacterias. Cuando los huevos son cocinados, la avidina es desnaturalizada (y por lo tanto inactivada) junto con las otras proteínas de la clara del huevo.

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La reacción que es inhibida la de la piruvato carboxilasa 6. (a) ¿En que consiste el ciclo del glioxilato, cuál es su ecuación balanceada, en que parte de la célula se lleva a cabo y cuál es la diferencia con el ciclo de Krebs?

Muchas bacterias y plantas son capaces de crecer de acetato u otro componente que produzca

acetil CoA. Usan una vía metabólica que convierte unidades de 2 carbonos en una unidad de cuatro carbonos (succinato) para la producción de energía y biosíntesis.

Esta secuencia de reacciones, llamada ciclo del glioxilato, esquiva los dos pasos de descarboxilación en el ciclo del ácido cítrico. Otra diferencia clave es que las dos moléculas de acetil CoA entran por turno del ciclo del glioxilato, comparado con una en el ciclo del ácido cítrico.

El ciclo del glioxilato, empieza con la condensación de acetil CoA y oxaloacetato para formar

citrato, el cual es isomerizado a isocitrato. En lugar de descarboxilarse, el isocitrato es escindido por la enzima isocitrato liasa a succinato y glioxalato.

Los pasos subsiguientes regeneran oxaloacetato a partir de glioxalato. La acetil CoA se condensa

con glioxalato para formar malato, en una reacción catalizada por malato sintetasa, la cual se parece a la citrato sintetasa. Finalmente, el malato es oxidado a OA, como en el ciclo del ácido cítrico. La suma de las reacciones es la siguiente

2 acetilCoA +NAD+ + 2H2O à succinato + 2 CoA + 2NADH + 2H+

En las plantas, estas reacciones se llevan a cabo en los organitos llamados glioxisomas. Las bacterias y plantas pueden sintetizar acetilCoA a partir de acetato y CoA por una reacción

impulsada por ATP y que es catalizada por acetil CoA sintetasa. Acetato + CoA + ATP à acetil CoA + AMP + PPi

(b) ¿Se puede considerar al ciclo del glioxalato como una reacción anaplerótica? ¿Por qué? Si se puede considerar una reacción anaplerótica ya que se sintetiza succinato, un intermediario del ciclo del ácido cítrico. (c) OPCIONAL. Describa como se desarrolla el beriberi

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8. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

1. (a) Defina fosforilación oxidativa e indique donde se lleva a cabo este proceso en eucariontes y en procariontes. La síntesis de ATP impulsada por la transferencia de electrones al oxígeno, involucra la reducción de O2 a agua con electrones donados por NADH y FADH2, y ocurre de igual manera en la luz y en la oscuridad. En los eucariontes se lleva a cabo en la mitocondria y en las bacterias en el citoplasma y membrana celular.

(b) ¿Cuántas moléculas de ATP se sintetizan por la oxidación de una molécula de NADH y de una molécula de FADH2? Se sintetizan tres moléculas de ATP por cada NADH y dos moléculas de ATP por cada molécula de FADH2.

(c) Explique si se requiere de membranas intactas para que se lleve a cabo la fosforilación oxidativa. Porque la síntesis del ATP es impulsada por un gradiente de protones, el cual se genera por el transporte de electrones y por la impermeabilidad de la membrana interna mitocondrial al paso de estos. (d) ¿Cuáles son las diferencias en permeabilidad de la membrana interna y de la membrana externa mitocondrial? La membrana externa mitocondrial es permeable libremente a la mayoría de los iones y moléculas pequeñas, mientras que la interna es impermeable a la mayoría de los iones y moléculas pequeñas incluyendo a los protones. La permeabilidad de la membrana externa se debe a la presencia de una proteína llamada porina que forma canales transmembranales en la misma y que permiten el paso de moléculas de peso molecular menor a 5,000. Las únicas moléculas que pasan por la membrana interna mitocondrial son aquellas para las cuales existen transportadores específicos. 2. (a) ¿Qué enzimas recolectan los electrones que van a alimentar la cadena de transporte de electrones y de dónde se recolectan? Las deshidrogenasas recolectan electrones de las reacciones de oxidación del complejo de la piruvato deshidrogenasa, del ciclo del ácido cítrico, de la vía de β-oxidación, y de los pasos oxidativos del catabolismo de aminoácidos. Dé ejemplos específicos de estas enzimas: Deshidrogenasas de piruvato, de isocitrato, de α-cetoglutarato, de malato o de gliceradehído 3-fosfato, de lactato, de β-hidroxiacil CoA, de glutamato y de glucosa 6-fosfato. (b) ¿Que enzima cataliza la reacción NADPH + NAD+ ---> NADH + NADP+? Transhidrogenasa de nucleótidos de piridina. Por medio de esta enzima, el NAD+ también puede recolectar equivalentes reductores de sustratos de deshidrogenasas enlazados a NADP+. El NADH y el NADPH son acarreadores de electrones que están asociados reversiblemente con las deshidrogenasas. (c) ¿Cuáles son las tres maneras en que los electrones son transferidos por los grupos prostéticos de los acarreadores de electrones de la cadena respiratoria mitocondrial? La cadena respiratoria mitocondrial consiste de una serie de acarreadores de electrones, la mayoría de los cuales son proteínas integrales de membrana, con grupos prostéticos capaces de aceptar y donar uno o dos electrones. Cada componente de la cadena puede aceptar electrones del acarreador precedente y transferirlos al siguiente en una secuencia específica. Hay cuatro tipos de transferencia de electrones en los sistemas biológicos: (1) transferencia directa de electrones como en la reducción de Fe+3 a Fe+2;

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(2) transferencia de un átomo de hidrógeno (H+ + e-); (3) transferencia de un ion hidruro (:H-), el cual lleva dos electrones; y (4) combinación directa de un reductor orgánico con el oxígeno. Cada uno de los primeros tres tipos ocurre en la cadena respiratoria. Algunas de las reacciones en estas secuencias son transferencias de 1 electrón y otras involucran la transferencia de dos electrones. 3. (a) Además de las flavoproteínas y del NAD+, ¿cuáles son los 3 tipos de acarrreadores de electrones presentes en la cadena respiratoria? Describa brevemente cada uno de estos tipos. (a1) Una benzoquinona hidrofóbica (ubiquinona) y (a2) dos tipos de proteínas que contienen hierro (citocromos y proteínas hierro-azufre). La ubiquinona (también llamada coenzima Q o simplemente UQ) es una benzoquinona liposoluble con una cadena isoprenoide lateral muy larga. Los compuestos estrechamente relacionados plastoquinona (encontrado en los cloroplastos de las plantas) y menaquinona (encontrado en las bacterias), juegan papeles análogos al de la UQ, todos acarrean electrones en cadenas de transferencia de electrones asociados a la membrana. La UQ puede aceptar un electrón para llegar a ser el radical semiquinona UQH. ) o dos electrones para formar el ubiquinol (UQH2) y. como las flavoproteínas es capaz de actuar en la unión de un donador de dos electrones y un aceptor de un electrón. Debido a que UQ es pequeña e hidrofóbica, difunde libremente dentro de la bicapa de lípidos de la membrana interna mitocondrial y puede transportar equivalentes reductores entre otras moléculas acarreadora de electrones menos móviles. Los citocromos son proteínas de la membrana interna mitocondrial, de la membrana de los tilacoides de los cloroplastos y la membrana plasmática de las bacterias que contiene hierro y que transportan electrones. El color fuerte, característico de los citocromos, es producido por el grupo prostético hemo. Hay tres clases de citocromos que se distinguen por sus diferencias en su espectro de absorción de luz y que se designan como a, b y c. Cada tipo de citocromo en su estado reducido (Fe+2) tiene tres bandas de absorción en el rango visible. La banda de longitud de onda mas grande (la banda alfa) está cerca de los 600 nm en citocromo tipo a, cerca de los 560 nm en el tipo b y cerca de los 550 en el tipo c. El grupo hemo de los citocromos a y b está fuertemente unido, pero no en forma covalente a sus proteínas asociadas, los grupos hemos de los citocromos tipo c sí están unidos covalentemente a través de residuos de cisteína. En algunas proteínas de transferencia de electrones que contienen hierro, las proteínas hierro-azufre, el hierro está presente en forma no hémica (como en los citocromos) pero en asociación con los átomos de azufre inorgánico y/o los átomos de Cis en la proteína. Estos centros hierro-azufre van desde simples estructuras con un solo átomo de Fe (Fe-S) coordinado a cuatro residuos de cisteína a través del azufre en el azufre en la cadena lateral de la cisteína a centros Fe-S mas complejos con dos o cuatro átomos de Fe. Estas proteínas participan en transferencias de 1 electrón. (b) ¿Cuántos complejos de transporte de electrones están presentes en la cadena respiratoria, cuáles son éstos, de donde a donde transportan los electrones y cuáles son sus grupos prostéticos? Son cuatro complejos y son: Nombre complejo Transporte e- PM y subunidades Grupos prostéticos I NADH deshidrogenasa NADH y UQ 850, >25 FMN, Fe-S II Succinato deshidrogen. Succinato y U 140, 4 FAD, Fe-S III UQ-cit c oxidorreductasa UQ y cit c 13, 1 Hemo IV Citocromo oxidasa Cit c y O2 160, 6-13 Hemo, CuA y CuB (c) Describa como se ha deducido el orden en el que actúan los acarreadores de electrones en la membrana interna mitocondrial. Se ha deducido de varias maneras

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(c1): Se ha determinado experimentalmente el potencial de reducción estándar. Uno espera que los acarreadores funcionen en orden creciente de potencial de reducción, debido a que los electrones tienden a fluir espontáneamente de acarreadores de bajo potencial a acarreadores de alto potencial (E’

o). El orden deducido por este método es: NADH, UQ, Cit b, Cit c1, Cit c y Cit a+a3. (c2) Cuando toda la cadena de acarreadores es reducida experimentalmente proporcionando una fuente de electrones pero no un aceptor final (O2) y entonces el oxígeno se introduce rápidamente en el sistema, la velocidad a la cual los acarreadores se oxidan (medido espectroscópicamente), muestra el orden en el cual los acarreadores funcionan. El acarreador mas cerca del oxígeno (al final de la cadena) cede sus electrones primero, el segundo acarreador del extremo es oxidado en seguida y así sucesivamente. (c3) Los agente que inhiben el flujo de electrones a través de la cadena se han usado en combinación con las determinaciones del grado de oxidación del acarreador. En la presencia de oxígeno y un donador de electrones, los acarreadores que funcionan antes del paso inhibido se espera que estén totalmente reducidos, y aquellos que funcionan después del bloqueo deben estar totalmente oxidados. Usando varios inhibidores que bloquean al principio o al final de la cadena, se ha deducido la secuencia entera. Es la misma que se dedujo de los dos enfoques anteriores. (c4) el tratamiento suave de la membrana interna mitocondrial con detergentes permitió la resolución de los cuatro complejos acarreadores de electrones. Cada uno de estos complejos separados tiene su composición específica y cada uno es capaz de catalizar la transferencia de electrones a través de una porción de la cadena. 4 (a) ¿Cómo se puede calcular el cambio de energía libre estándar con el potencial de reducción? Consideremos la reducción de piruvato por NADH: (a1) Piruvato + NADH+ + H+ <---> lactato + NAD+ El potencial de reducción del par NAD+:NADH es -0.32 V, mientras que el potencial del par piruvato:lactato es -0.19 V. Por convención, los potenciales de reducción se refieren a las reacciones parciales escritas como reducciones: oxidante + e- --> reductor. De aquí: (a2) Piruvato + 2H+ + 2e- ---> lactato E’o = -0.19 V (a3) NAD+ + H+ + 2 e- ----> NADH E’

o = -0.32 V Para obtener la ecuación global (a1) a partir de (a2) y (a3), necesitamos invertir la dirección de la reacción (a3) para que el NADH aparezca en el lado izquierdo de la flecha. Haciendo esto, el signo de E’

o debe también cambiarse y nos dará un valor de +0.32 V. Por lo tanto, la suma algebraica de los potenciales de ambas reacciones colocadas en el sentido correcto es de -0.19+0.32 = +0.13 V. Con esta dato ya podemos calcular el ΔGo’ para la reducción del piruvato por NADH, usando la siguiente fórmula. ΔGo’ = -nFΔE’

o; en donde n es el número de electrones transferidos, F es una constante de proporcionalidad llamada Faraday (23.06 kcal/Vmol), ΔE’

o está en volts y ΔGo’ en kcal/mol. Nota que ΔGo’ es la cantidad de energía libre que puede obtenerse por mol de una transformación, mientras que ΔE’

o es la diferencia en el potencial entre dos estados. De aquí que ΔE’o debe multiplicarse por

nF para determinar el cambio de energía libre. Para la reacción ya mencionada, n=2, y ΔGo’ = -2x23.06x0.13; = -6 kcal/mol. Un ΔE’

o positivo (pero un ΔGo’ negativo) significa una reacción exergónica bajo condiciones estándar. (b) ¿Cuál es el cambio de energía libre que se libera por el transporte de electrones a través de toda la cadena respiratoria? Las reacciones parciales pertinentes son:

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(b1) ½ O2 + 2H+ + 2 e- ----> H2O ΔE’o = +0.82 V

(b2) NAD+ + H+ + 2 e- -----> NADH ΔE’o = -0.32 V

Restando la reacción (b1) de la reacción (b2) nos da: (b3) ½ O2 + NADH + H+ <---> H2O + NAD+ ΔE’

o = 1.14 V ΔGo’ = -2x23.06x1.14; = -52.6 kcal/mol. (c) Calcule el potencial de reducción de la reducción de piruvato por NADH: Piruvato + NADH +H+ -----> lactato + NAD+ (Contestada en (a). 5 (a) ¿Cuál es el peso molecular, el número de subunidades del complejo NADH deshidrogenasa y las reacciones que cataliza? Ver Tabla arriba y

Las reacciones son: NADH + H+ + FMN à FMNH2 +NAD+ A continuación, los electrones se transfieren a los centros FeS de la proteína y estos a su vez a UQ para dar UQH2.

La reacción global es: NADH + H+ + UQ à NAD+ + UQH2. El amital (un barbiturato), la rotenona (un producto de las plantas usado comúnmente como insecticida), y el antibiótico piercidina A inhiben el flujo de electrones de los centros Fe-S a la UQ (b) ¿Qué otro nombre recibe el complejo II (la única enzima unida a membrana del ciclo de Krebs) y a través de que grupos prostéticos de este complejo, pasan los electrones hasta llegar a la ubiquinona? Succinato deshidrogenasa y las coenzimas son: FAD y centros hierro azufre. Los electrones pasan del succinato al FAD, entonces a los centros FeS y a la UQ. (c) ¿Cómo transfieren sus electrones las enzimas acil CoA deshidrogenasa y glicerol 3 fosfato deshidrogenasa a la UQ? Otros sustratos de las deshidrogenasas mitocondriales también pasan los electrones a la cadena respiratoria al nivel de UQ, pero no a través del complejo II. El primer paso en la β-oxidación de graso acil-CoA, catalizado por la flavoproteína acil-CoA deshidrogenasa, involucra la transferencia de electrones del sustrato al FAD de la deshidrogenasa, entonces a una flavoproteína que transfiere electrones (ETFP), la cual a su vez los pasa a la oxidorreductasa ETFP-ubiquinona. Esta reductasa, una proteína hierro-azufre también contiene un nucleótido de flavina unido, pasa los electrones a la cadena respiratoria reduciendo UQ en la membrana interna mitocondrial. Por otro lado, el glicerol 3-fosfato puede ser convertido a dihidroxiacetona fosfato por la enzima glicerol-3 fosfato deshidrogenasa (una flavoproteína localizada en la superficie exterior de la membrana interna mitocondrial) que, al igual que la succinato deshidrogenasa y la acil-CoA deshidrogenasa canaliza los electrones a la cadena respiratoria reduciendo a la UQ. Esta enzima es la involucrada en la transferencia de los equivalentes reductores del citosol (NADH producido en la glicólisis por la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa) a la mitocondria en el músculo esquelético y en cerebro.

6. (a) ¿Cuáles proteínas componen el complejo III de transporte de electrones? Este complejo se llama también complejo citocromo bc1 o ubiquinona citocromo c oxidorreductasa y contiene los citocromos b562 y b566, citocromo c1, una proteína FeS y al menos otras seis subunidades de proteínas. El complejo III funciona como una bomba de protones; como un resultado de la orientación asimétrica del complejo, los protones producidos cuando UQH2 es oxidado a UQ son liberados al espacio intermembrana, produciendo una diferencia transmembrana de concentración de protones. (b) ¿Qué otro nombre recibe el complejo IV y cuáles son sus componentes? Citocromo oxidasa y contiene los citocromos a y a3. Estos citocromos consisten de dos grupos hemo unidos a diferentes regiones de la misma proteína y son, por lo tanto, espectral y funcionalmente diferentes.

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La citocromo oxidasa contiene dos iones cobre, CuA y CuB que son cruciales en la transferencia de electrones al oxígeno. Este complejo ha evolucionado para realizar la reducción del oxígeno por cuatro electrones sin generar intermediarios reducidos incompletamente como peróxido de hidrógeno o radicales libres hidroxilo- especies muy reactivas que dañarían a los componentes celulares. El flujo de electrones del citocromo c al O2 a través del complejo IV causa el movimiento neto de protones de la matriz al espacio intermembrana y así el complejo IV funciona como una bomba de protones que contribuye a la fuerza protón motriz. (c) ¿A que nivel es inhibido el transporte de electrones por rotenona, amital, antimicina A, CN- y CO (monóxido de carbono)? Rotenona y amital bloquean la transferencia del complejo NADH deshidrogenasa a la UQ; antimicina A de UQH2 a citocromo c1, y CN-, azida y CO de la citocromo oxidasa al O2. 7 (a) ¿Cuál es la estructura de ATP sintetasa y su topología en la membrana interna mitocondrial? Esta compuesto de dos componentes principales (o factores), F1 y Fo. El subíndice o en Fo denota que es la porción del complejo que le confiere sensibilidad a oligomicina, un potente inhibidor del complejo enzimático y así de la fosforilación oxidativa. La porción F1 tiene forma de esfera o de perilla, sobresalen de la membrana interna mitocondrial, y están colocadas de cara hacia el interior de la matriz. Esta porción es la que sintetiza ATP cuando está en la membrana interna mitocondrial y expuesta a un gradiente de protones. Sin embargo en forma soluble, F1 hidroliza el ATP (cataliza la reacción reversa que cuando está en la membrana). F1 consiste de 5 clases de cadenas polipeptídicas con la estequiometría α3β3γδε y una masa de 378 kd. La fracción Fo es el canal de protones del complejo y atraviesa la membrana interna mitocondrial. Consiste de 4 clases de cadenas polipeptídicas. La cadena de 8 kd, de la cual hay 6 por F1 probablemente forma el poro transmembrana para los protones. El tallo entre Fo y F1 varias proteínas. Una de ellas le da la sensibilidad a la oligomicina, un antibiótico que bloquea la síntesis de ATP. (b) Describa la manera en que la fosforilación y la oxidación están acopladas. Explique la teoría quimiosmótica. Peter Mitchel propuso en 1961 la hipótesis quimiosmótica que postula que el transporte de electrones y la síntesis de ATP están acoplados por un gradiente de protones en la membrana interna mitocondrial en vez que por intermediarios covalentes de alta energía. En este modelo, la transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria conduce al bombeo de protones desde la matriz al otro lado de la membrana mitocondrial. La [H+] llega a ser mayor en el lado citosólico y se genera concomitantemente un potencial eléctrico. Mitchel postuló que esta fuerza protón motriz impulsa la síntesis de ATP por el complejo ATPasa. En esencia, el evento de conservación de emergía inducido por el transporte de e- es la generación de una fuerza protón motriz a través de membrana interna mitocondrial. Las evidencias que apoyan este modelo son: (b1) El transporte de electrones genera un gradiente de protones a través de la membrana interna mitocondrial. El pH afuera es 1.4 unidades menor que adentro, la fuerza protón motriz Δp (en volts) consiste de la contribución del potencial de membrana (Em) y la contribución del gradiente químico (ΔpH). En la siguiente ecuación, R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta y F es el cambio de energía libre cuando 1 mol de electrones pasa a través de un potencial eléctrico de 1 volt. Δp = Em - (2.3 RT/F) ΔpH = Em -0.06 ΔpH = 0.14 - 0.06(-1.4) = 0.224 V. Esta fuerza protón motriz total de 0.224 V corresponde a una energía libre de 5.2 kcal/mol de protones. (b2) El ATP es sintetizado cuando un gradiente de pH se impone sobre la mitocondria o cloroplasto en ausencia de un transporte de electrones.

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(b3) La bacteriorodopsina, una proteína de membrana púrpura de halobacterias, bombea protones cuando se ilumina. Las vesículas sintéticas que contienen esta proteína bacteriana y una ATPasa purificada de mitocondria cardiaca de res sintetizan ATP cuando se iluminan. En este experimento, la bacteriorodopsina reemplaza la cadena respiratoria, lo cual demuestra que la cadena respiratoria y la sintetasa de ATP son sistemas bioquímicos independientes unidos solo por la fuerza protón-motriz. (b4) Los complejos de transporte de e- I, II y IV bombean protones desde la matriz. Su regreso a la matriz impulsa la síntesis de ATP por la ATP sintetasa. (b5) Un compartimiento cerrado es esencial para la fosforilación oxidativa. La síntesis de ATP acoplado a la transferencia de electrones no ocurre en preparaciones solubles o en fragmentos de membrana que carecen de estos compartimientos exteriores e interiores bien definidos. (b6). Las sustancias que acarrean protones a través de mic disipan el gradiente de protones y por lo tanto desacoplan la oxidación y la fosforilación. (c) ¿Con qué experimentos puede demostrarse que la oxidación y la fosforilación son procesos acoplados? Puede usar mitocondrias aisladas y los siguientes reactivos: ADP, Pi, succinato, CN-, venturicidina, oligomicina y dinitrofenol. Las mitocondrias aisladas se suspenden en un medio con amortiguador y un electrodo de O2 se usa para medir el consumo de este gas. A diferentes intervalos, las muestran se remueven y se ensaya para medir la presencia de ATP. La adición de ADP y Pi solos resultan en poco o ningún incremento en el consumo de O2 o la síntesis de ATP. Cuando se adiciona el succinato, la respiración y la síntesis del ATP inician. La adición de CN-, inhibe ambos procesos. Por otro lado, la adición de oligomicina o venturicidina (inhibidores de la sintetasa de ATP) mitocondrias con succinato, ADP y Pi que están respirando y sintetizando ATP, bloquea la respiración y la fosforilación. La adición subsecuente de DNP (el cual introduce protones a la matriz) restaura la respiración, pero no la fosforilación, la cual permanece inhibida. De esta manera el 2,4 dinitrofenol actúa como desacoplante de estos dos proceso. (d) ¿Qué es un ionóforo? Dé un ejemplo. Carbonil cianuro fenilhidrazona y (ver respuesta anterior). 8. (a) ¿Cómo ingresa el ADP y el fosfato a la matriz mitocondrial y como sale el ATP de ésta? ¿Cómo afecta el atractilósido este proceso?.

La mic es generalmente impermeable a especies cargadas, pero dos sistemas específicos en la mic transportan ADP y Pi a la matriz y ATP al citosol. La translocasa de nucleótidos de adenina, la cual atraviesa la mic, une ADP3- en la superficie exterior (citosólica) de la mic. y lo transporta al interior en intercambio con ATP4- que es transportado hacia afuera.

Debido a que este antiporter mueve 4 cargas negativas hacia afuera por cada tres cargas negativas que se mueven hacia el interior, su actividad es favorecida por el gradiente electroquímico transmembrana, el cual le da a la matriz una carga neta negativa.

Este antiporter es inhibido específicamente por atractilósido, un glicósido tóxico formado por un cardo específico y que desde hace siglos se ha sabido que el ganado que pasta y que como esta planta se envenena. El segundo sistema de transporte de membrana esencial para la fosforilación oxidativa, es la translocasa de fosfato, que promueve el simporte de un H2PO4

- y un H+ hacia la matriz. Este transporte también es favorecido por el gradiente de protones transmembrana. (b) ¿Cómo ingresa a la mitocondria NADH que se produce en el citosol?

Describa la vía de glicerol fosfato deshidrogenasa y la vía de malato aspartato. La primera vía se describió en la pregunta 2c y provee solo de energía para sintetizar 2 ATP por par de electrones.

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Las mitocondrias de las plantas superiores tienen una NADH deshidrogenasas orientada externamente que es capaz de transferir electrones directamente del NADH citosólico a la cadena respiratoria. La vía malato-aspartato ocurre en dos fases de tres reacciones cada una.

Fase A (transporte de e- a la matriz). A1. El NADH es reoxidado por el OA citosólico y con la enzima citosólica malato deshidrogenasa. A2. El acarreador malato-α-cetoglutarato transporta a la matriz el malato formado en la reacción

anterior, en intercambio con α-cetoglutarato. A3 En la matriz, el malato es reoxidado a OA por la enzima mitocondrial malato deshidrogenasa, y

así reduciendo el NAD+ a NADH.

Fase B (regeneración del OA citosólico). B4. Una trasaminasa convierte el OA mitocondrial en Asp con la concomitante conversión de Glu a α-

cetoglutarato. B5. Asp es transportado de la matriz al citosol por el acarreador Asp-Glu en intercambio con Glu

citosólico. B6. El Asp citosólico es convertido a OA por una transaminasa con la conversión de α-cetoglutarato a

Glu. Por lo tanto, los electrones del NADH citosólico son transferidos al NADH mitocondrial que es sujeto

de la reoxidación por la cadena de transporte de e-. Este sistema produce 3 ATP por cada NADH citosólico, uno mas que el del sistema de glicerol 3 fosfato. Este sistema es activo en mitocondrias de hígado, riñón, y corazón, mientras que el de glicerol-3-fosfato es activo en músculo y cerebro. (c) ¿Cuántas moléculas de ATP se sintetizan cuando se oxida completamente una molécula de glucosa? 36 o 38 dependiendo del acarreador que se use para oxidar el NADH extramitocondrial. 9. Problemas 1,3 y 4, Cap. 17.