Microbiología GeneralFacultad de Ciencias Exactas - UNLP

Seminario: Pruebas bioquímicas e identificación

1- Con el propósito de conocer la calidad sanitaria de helados de fabricación industrial y la presencia de especies patógenas en los mismos, se examinaron una serie de muestras procedentes de 5 establecimientos elaboradores de San Luis. Se investigó la presencia de Staphylococcus aureus y Yersinia enterocolítica en 1 g.El St. aureus es un coco Gram+, anaerobio facultativo, reduce las sales de telurito a teluro con ennegrecimiento de los medio e hidroliza lecitina (fosfolípido).a)Seleccione y fundamente las pruebas mínimas que debería realizar para lograr la identificación del microorganismo investigado.

Prueba bioquímicas St. aureusSt. epidermidis St. saprophyticus Micrococcus

Lecitinasas + + + +Reducción de telurito+ + + +OF-glucosa F F F OFerm. manitol + - V -Reducción de nitrato + V - -Hemolisinas + V - -Novobiocina S S R ND

b) Explique y fundamente cómo puede determinar la tolerancia por el oxígeno que posee el microorganismo. c) Explique cómo se lleva a cabo la prueba de reducción de nitratos y cuál es el fundamento de la prueba. d) La siguiente Tabla presenta la proporción de resultados positivos para una serie de pruebas para cuatro cepas de Staphylococcus aureus. Considerando los resultados obtenidos en pruebas complementarias, calcule la probabilidad de identificación a nivel de cepa del microorganismo estudiado: Pigmentos (+),a-hemolisinas(-), ß-hemolisinas(+), Cloranfenicol (S), Ampicilina(R) y Eritromicina (R).

Prueba MicroorganismosSt.1 St.2 St.3 St.4

Pigmentos 0.92 0.50 0.65 0.05a-hemolisinas 0.13 0.20 0.15 0.65ß-hemolisinas 0.90 0.98 0.75 0.01Sensibilidad a:

0.99 0.85 0.01 0.90 CloranfenicolAmpicilina 0.45 0.20 0.05 0.80

Eritromicina 0.95 0.01 0.10 0.70

2- Con el objetivo de determinar la especie de una cepa de Pseudomonas, se realizaron las pruebas que figuran en la tabla obteniéndose los siguientes resultados: NO 3

- (+), Gelatina (+), Manitol (+), Arabinosa (-) y Manosa (+)Porcentaje de reacciones positivas en distintas especies del género Pseudomonas

EspeciesPruebas P. aeruginosa P. putida P. cepacia P. stutzeriUtilización de NO3

- 96 3 39 94Gelatina 92 0,3 85 1Manitol as. 89 5 96 67Arabinosa as. 1 70 75 1Manosa as. 1 57 99 10

a) Explique como puede determinar el tipo de metabolismo que posee y cuál es el fundamento de la prueba.b) ¿Cómo se realiza la prueba de asimilación de azúcares?c) Exprese gráficamente la relación de semejanza existente entre la bacteria aislada y las citadas como referencia. Justifique el procedimiento. Considere como positivos aquellos valores ³ 50%.

3- Usted desea realizar un análisis de agrupamiento de tres cepas de E. coli aisladas de agua (I, II y III) con tres cepas de referencia (E. coli 1, E. coli 2 y E. coli 3). Utilizando un sistema de identificación comercial, se encuentran los siguientes resultados:

PRUEBA CEPASI II III E. coli 1 E. coli 2 E. coli 3

TDA - - - - - -H2S - - - - - -ESC - - - - - -IND + + + - - +URE - + - - - -LDC + + + + + -ODC + + + + + +ADH + + + - - -GLU + + + + + +CIT - - - - - -MAL - - + - - -VP - - - - - -RHA + - + - + -SUC - - + - - -ADO - - - - - -INO - - - - - -XYL + + + + + -SORB - + + + + -ONPG + - + - - -ONPX + + - - - -PGUR + + + + + +

a) Construya la matriz de similitud.

b) Agrupe los microorganismos de la tabla utilizando un dendrograma. Utilice el método del ligamiento promedio.

4- La proporción de resultados positivos para una serie de pruebas para cinco microorganismos se muestra a continuación:

PRUEBA MICROORGANISMOSI II III IV V

citrato 0.95 0.50 0.95 0.01 0.99movilidad 0.05 0.95 0.95 0.05 0.01VP 0.01 0.95 0.01 0.20 0.60oxidasa 0.50 0.01 0.05 0.30 0.78indol 0.80 0.01 0.99 0.99 0.01

a) Se aisla un microorganismo que tiene las siguientes características: citrato (-), movilidad (+), Voges Proskauer (-), oxidasa (-) e indol (+). Calcule la probabilidad de que sea cada uno de los microorganismos de la tabla. ¿Cuál es la probabilidad de identificación?b) Explique cómo se lleva a cabo la prueba de citrato, cuál es el fundamento de la misma y cómo debería darle dicha prueba a su aislado.c) Explique cómo se lleva a cabo la prueba de Voges Proskauer, cuál es el fundamento de la misma y la interpretación de la misma teniendo en cuenta el resultado de su aislado. Para concluir que tipo de fermentación realiza su aislado, debería hacer alguna otra prueba? Fundamente.

5- La leche vacuna es susceptible a la acción de microorganismos. Los equipos utilizados para ordeñar, transportar, almacenar y procesar la leche parecen ser la fuente principal de contaminación. Ciertas especies de Pseudomonas son la principal causa de enranciamiento, también Alcaligenes y Staphylococcus. La viscosidad se atribuye a la proliferación de microorganismos coliformes (Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, ambos Gram (-)), Alcaligenes, Micrococcus y Bacillus spp. Las bacterias del ácido láctico (Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc y Lactobacillus), todas Gram (+), son bacilos cortos o largos o cocos, no forman esporas, excepto Sporolactobacillus inulinus. Para la obtención de energía dependen exclusivamente de la fermentación de hidratos de carbono y excretan ácido láctico produciendo el agriamiento de la leche. Son bacterias anaeróbicas pero aerotolerantes, pueden crecer con oxígeno atmosférico. No son capaces de reproducirse en medio mineral con glucosa y sales amónicas. Requieren para su desarrollo una serie de vitaminas (lactoflavina, tiamina, ácido pantoténico, ácido nicotínico, ácido fólico, biotina) y aminoácidos, purinas y pirimidinas. Por esta razón se cultivan sobre medios complejos, que contienen cantidades relativamente altas de extracto de levadura, jugo de tomate, suero y sangre. Son capaces de utilizar lactosa al igual que E. coli. Son catalasa (-). El género Streptococcus, Gram (+), no formador de esporas, no móvil, es anaerobio facultativo. Las células son de forma esférica u ovoide y se ordenan en cadenas o pares. La formación de cadenas se aprecia mejor a partir de cultivos en medios líquidos. Fermenta los carbohidratos principalmente con producción de ácido láctico, sin gas. Algunas especies fermentan ácido málico y cítrico y los aminoácidos serina y arginina. Es catalasa negativo. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37º C. El colorante cristal violeta, en concentración del orden de 0,0002 g/litro, resulta inhibitorio para la flora Gram (+) pero no perjudica el desarrollo de Streptococcus y puede

usarse como factor selectivo. Los Streptococcus ß hemolíticos son estimulados intensamente por los ácidos nucleicos presentes en el extracto de levadura y por el aminoácido lisina. Una cepa aislada a partir de una muestra de leche cruda muestra al microscopio cocos en cadena, fermenta glucosa, maltosa, sacarosa y trehalosa generando ácido. Fermenta glicerol sólo aeróbicamente. En una placa de ágar sangre crece rápidamente, dando hemólisis ß. Puede desarrollar en medios conteniendo 40% de bilis. En placas con DNA muestra, luego del revelado, un halo traslúcido alrededor de la estría.

a) Basándose en la descripción proponga un protocolo para aislar Streptococcus spp a partir de una muestra de leche cruda indicando medios y cantidades necesarios, tiempos y temperatura de incubación. Indique si considera necesario realizar algún tipo de coloración en alguna etapa del aislamiento.b) Suponga ahora que ha logrado aislar la cepa mencionada y tiene un cultivo puro conservado a 4ºC en ágar inclinado. Enumere las pruebas bioquímicas que podría emplear para su identificación e indique cómo procedería para inocular las mismas a partir de ese cultivo. Especifique medios, tiempos y temperaturas de incubación, así como los resultados que arrojará cada prueba. Dé el género y la especie del microorganismo aislado.

StreptococcusCaracterísticas pyogenes agalactiae dysgalactiae pneumoniae equiÁcido a partir de lactosa

+ - + + -

manitol - - - - -rafinosa - - - + -ribosa - + + - -trehalosa + + + + -a-hemólisis - - + + -ß-hemólisis + + - - +DNAsa +* +* NT NT NTVoges-Proskauer - + - - -

*Algunas cepas. NT No testeado.

c) ¿Cómo procedería para aislar Pseudomonas de esta misma muestra? De acuerdo a la información que maneja ¿qué pruebas sugeriría para identificarla?