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Prácticas de Bioquímica I Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASASANGUÍNEA

Objetivos

Al finalizar el trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de:

- Conocer la forma y condiciones para obtener un preparado de catalasa sanguínea.

- Verificar el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la catalasa

sanguínea.

- Reconocer el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

- Demostrar la influencia del pH sobre la actividad enzimática.

- Probar el efecto de la concentración de substrato sobre la actividad de la catalasa

sanguínea.

- Verificar la influencia de un inhibidor sobre la actividad enzimática.

Introducción

El metabolismo celular de los tejidos animales y vegetales genera peróxido de hidrógeno

(H2O2) molécula que resulta tóxica para la célula. A través de la evolución estos organismos

han desarrollado sistemas enzimáticos que descomponen este peróxido y evitan daños a la

célula. Uno de estos sistemas enzimáticos lo representa la catalasa.

La catalasa es una cromoproteína porfirínica cuya masa molecular es de 225.000 kDa,

contiene cuatro grupos hemo por molécula y su contenido de hierro es 0.9%. Esta proteína

presenta actividad enzimática del tipo oxido-reductasa sobre el peróxido de hidrógeno (H2O2)

el cuál constituye el sustrato para esta enzima y lo descompone en oxígeno y dos moléculas de

agua Su nombre sistemático de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímica es H2O2

oxidoreductasa y cataliza la siguiente reacción:

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2H2O2

CatalasaO2 + 2H2O

Peroxido de hidrógeno

En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad

mayor en el hígado, riñón y eritrocitos. Un mol de catalasa puede descomponer 5.000.000 de

moléculas de H2O2 por minuto a 37°C, esto se conoce como número de recambio y representa

uno de los más altos de toda la enzimología.

La actividad de la catalasa de los eritrocitos puede determinarse mediante algunos

principios bioquímicos de los cuales los más sencillos están basados en la desaparición del

H2O2 al incubarlos con preparaciones crudas o purificadas de la enzima. A su vez la

desaparición del H2O2 puede estimarse por varios métodos, uno de ellos es el método

titrimétrico por permanganimetría. En este método una preparación de catalasa se incuba

con una concentración conocida de peróxido de hidrógeno durante cierto tiempo y en

condiciones adecuadas. Al cabo de este tiempo, la reacción se detiene por adición de H2SO4

2N y luego se titula con una solución de permanganato de potasio (KMnO4).

La reacción de peróxido de hidrógeno con el permanganato de potasio en medio ácido

es la siguiente:

2 KMnO4 + 3 H2SO4 + 5 H2O2 K2SO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O + 5 O2

Esta reacción constituye una típica titulación de oxidación-reducción, la cual se hace en

proporciones estequiométricas entre el permanganato y el peróxido de hidrógeno.

Los experimentos que se realizarán en este trabajo práctico, se basarán en el método

titrimétrico por permanganimetría y en cada uno de ellos se realizará la titulación de un tubo

control, el cuál constituye una medida de peróxido presente al comienzo del experimento.

La titulación de los tubos experimentales representa la medida del peróxido remanente

después que la enzima ha actuado sobre el sustrato.

La diferencia entre las dos titulaciones (control – experimental) representa la cantidad

de peróxido descompuesto en una unidad de tiempo, es decir, la velocidad de la reacción.




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MATERIALES Y REACTIVOS

- Matraces erlenmeyer

- Tubos de ensayo

- Embudo

- Bureta y soporte universal

- Gradilla

- Baños de calentamiento

- Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.

- H2SO4 2 N

- Buffer fosfato 0,01 M, pH 3, 7 y 8. Debe contener H2O2 para gastar aproximadamente15 mL de KMnO4 0,012 N.

- KMnO4 0,012 N

- Soluciones de KCN 10-2 M., 10-3 M., 10-4 M a pH 7 las cuales deben ser preparadas eldía de su uso.

Obtención de un preparado de catalasa sanguínea: (será preparada con anticipación por el

docente).

Para obtener una preparación cruda y altamente activa de la enzima se sigue el siguiente

procedimiento:

1.- Pipetear 25 mL de agua destilada en un tubo de ensayo grande y enfriarla sobre hielo

picado.

2.- Con ayuda de una lanceta estéril, extraer sangre capilar (del dedo pulgar), descartar la

primera gota de sangre y luego pipetear 0,02 mL de sangre con una pipeta de Shalli.

3.- Agregar los 0.02 mL de sangre en los 25 mL de agua destilada fría. Lavar varias veces la

pipeta en el agua.

4.- Mantener la preparación de enzima en baño de agua helada con suficiente hielo para

prevenir el deterioro de la enzima.




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Experimentos.

Se estudiarán los siguientes factores que modifican la actividad enzimática:

a. Concentración de enzima.

b. Concentración de substrato.

c. Temperatura.

d. pH.

e. Efectos de inhibidor: concentración progresiva de inhibidor y concentración progresiva de

substrato con concentración fija del inhibidor.

PRIMERA PARTE (Semana 1)

Experimento 1

Efecto de la concentración de enzima

La velocidad de reacción es afectada por la concentración de enzima presente en el

medio de incubación. A medida que se incrementa la concentración de enzima, la velocidad de

la reacción es mayor.

En este experimento se variará la concentración de enzima y se mantienen constantes

todos los demás factores.

a. Tomar 5 frascos erlenmeyer de 125 mL c/u; rotularlos del 1 al 5 y proceder a agregar

las cantidades que indica la siguiente tabla:

FrascoN°

H2O2

pH 7 Enzima Tiempoen min H2SO4 2N

mLgastadosKmnO4

1 5 mL 0,1 mL 5' 5 mL2 5 mL 0,2 mL 5' 5 mL3 5 mL 0,4 mL 5' 5 mL4 5 mL 0,8 mL 5' 5 mL

5* 5 mL ----- 5' 5 mL

*Tubo control.




5

b. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco

para luego detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).

c. Titule los frascos con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente.

Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco.

d. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales

Volumen deenzima

Concentraciónde

Enzima (UI)

Velocidad de reacción(Calculada)

0,1 mL 2 x 10-3

0,2 mL 4 x 10-3

0,4 mL 8 x 10-3

0,8 mL 1,6 x 10-2

e. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de la enzima. Nota: usar papel milimetrado.

Experimento 2

Efecto de la temperatura.

Toda reacción enzimática presenta una temperatura óptima la cuál es definida como la

temperatura a la cual la velocidad de la reacción es mayor, manteniendo constante los otros

factores. En este experimento se utilizaran tres temperaturas diferentes para observar el efecto

de la misma sobre la actividad de la catalasa.

a. Preparar tres series de tubos de ensayo (cada serie consta de dos tubos).

b. Proceder a rotular los tubos de la siguiente manera:

- 1era serie: tubos 1A y 1B.

- 2da serie: tubos 2A y 2B.

- 3era serie: tubos 3A y 3B.

Los tubos "A" serán controles y los "B" experimentales.

c. Agregar a cada uno de los tubos los reactivos y volúmenes indicados en la siguiente

tabla:




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TuboNº

H2O2

pH 7 Temperatura Enzima Tiempo H2SO4 2NmL

gastadosKmnO4

1A 5 mL 10°C -- 5' 5 mL1B 5 mL 10°C 0,5 mL 5' 5 mL2A 5 mL 37°C -- 5' 5 mlL2B 5 mL 37°C 0,5 mL 5' 5 mL3A 5 mL 60°C -- 5' 5 mL3B 5 mL 60°C 0,5 mL 5' 5 mL

d. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco

para luego detener la reacción con ácido sulfúrico.

e. Transfiera el contenido de los tubos a frascos erlenmeyer y titule con KMnO4 hasta que

aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato

gastado para cada frasco.

f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales

Temperatura°C

Velocidad dereacción

(calculada)103760

g. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la

temperatura. Nota: usar papel milimetrado.

Experimento 3

Efecto del pH

La mayoría de las enzimas muestran su máximo de actividad en un rango limitado de

pH. Es conocido que la conformación del sitio activo y su relación con el sustrato son

afectadas por este factor. Esto es el resultado de la suma de una serie de factores tales como:

ionización de la enzima, ionización del substrato, difusión de productos, etc.




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En este experimento se determinará la actividad de la catalasa a diferentes valores de pH,

para observar el efecto de este importante factor sobre la velocidad de la reacción.

a. Rotular tres series de erlenmeyer al igual que en el experimento anterior.

b. Adicione los reactivos y sus cantidades según la siguiente tabla:

FrascoN°

H2O2

pH 3H2O2

pH 7H2O2

pH 8 Enzima Tiempo H2SO4 2NmL gastados

KmnO4

1A 5 mL -- --- -- 5' 5 mL1B 5 mL -- --- 0,5 mL 5' 5 mL2A -- 5 mL --- -- 5' 5 mlL2B -- 5 mL -- 0,5 mL 5’ 5 mL3A -- -- 5 mL -- 5’ 5 mL3B -- -- 5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL

c. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco


d. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el

volumen de permanganato gastado para cada frasco.

e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales

pH Velocidad de reacción(calculada)

378

f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y el pH.

Nota: usar papel milimetrado.




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SEGUNDA PARTE (Semana 2)

Experimento 4

Efecto de la concentración del substrato

A medida que aumenta la concentración del sustrato, la velocidad de reacción aumenta.

El aumento en la concentración de sustrato puede llegar a sobrepasar la capacidad de la enzima

de convertirlo en producto, llegando esta a la velocidad conocida como máxima. (Vmax)

En este experimento se aumentará progresivamente la concentración de peróxido de

hidrógeno con el objetivo de determinar la velocidad máxima (Vmax)

Procedimiento:


b. Adicione los reactivos y sus cantidades según la siguiente tabla:

FrascoNo.

H2O2

pH 7H2O

destilada Enzima Tiempo H2SO4

2N

mL gastadosKmnO4

1A 1,25 mL 3,75 mL -- 5' 5 mL1B 1,25 mL 3,75 mL 0,5 mL 5' 5 mL2A 2,50 mL 2,50 mL -- 5' 5 mL2B 2,50 mL 2,50 mL 0,5 mL 5' 5 mL3A 5 mL --- -- 5' 5 mL3B 5 mL --- 0,5 mL 5' 5 mL



d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el






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Volumen desustrato

Concentración deSustrato

Velocidad de reacción(calculada)

1,25 mL 1,25 x 10-2 M2,5 mL 2,5 x 10-2 M5 mL 5 x 10-2 M

f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato. Nota: usar papel milimetrado.

Efectos del inhibidor.

La actividad de la catalasa es fuertemente inhibida por agentes capaces de combinarse

con el hierro de su grupo prostético porfirínico, tales como el KCN. Indudablemente la mayor

parte de los efectos letales del cianuro se deben a la inhibición de enzimas ferroporfirínicas

como la catalasa, citrocromo-oxidasa, etc.

En este experimento se demostrará el efecto inhibitorio de concentraciones progresivas

de cianuro sobre la velocidad de reacción enzimática. Se hará también la reacción con una sola

concentración de cianuro y dosis progresivas de substrato, para determinar el tipo de inhibición

producida por el cianuro sobre la enzima.

Experimento 5

Efecto de la concentración progresiva del substrato sobre una sola concentración del

inhibidor


b. Proceder de igual forma al experimento N° 4. La única diferencia entre ambos

experimentos es la presencia en todos los tubos de KCN. Contrastando los datos con

los del experimento 4, podremos determinar que tipo de inhibición lleva a cabo el

cianuro de potasio sobre la catalasa sanguínea.

c. Coloque en los frascos lo que se indica en la tabla siguiente:




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FrascoN°

H2O2

pH 7 H2OKNC10

-3M Enzima Tiempo H2SO4 2NmL

gastadosKmnO4

1A 1,25 mL 3,75 mL 0,5 mL -- 5’ 5 mL1B 1,25 mL 3,75 mL 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL2A 2,50 mL 2,50 mL 0,5 mL -- 5’ 5 mL2B 2,50 mL 2,50 mL 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL3A 5 mL -- 0,5 mL -- 5’ 5 mL3B 5 mL -- 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL

d. Una vez agregada la enzima deberán transcurrir exactamente 5 minutos en cada frasco


e. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el


f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales,

así como los inversos de las velocidades 1/[V] y de las concentraciones de sustrato

1/[S] de los experimentos N° 4 y 6 (gráfico de los inversos recíprocos)

Volumen desustrato

Concentraciónde sustrato

Velocidad dereacción

1 / [S]Exp 4

1 / [S]Exp 5

1 / [V]Exp 4

1 / [V]Exp 5

1,25 mL2,5 mL5 mL

g. Construya un gráfico que muestre la relación entre el inverso de la velocidad de

reacción y el inverso de la concentración de sustrato en presencia o no del inhibidor.

Nota: usar papel milimetrado.

Experimento 6

Efecto de la concentración progresiva de cianuro

a. Tomar 5 erlenmeyer de 125 mL y roturarlos del 1 al 5.

b. Agregar a cada uno de los erlenmeyer lo que se indica en la siguiente tabla:




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FrascoNº

H2O2

pH 7

KNC10-4 M

KNC10-3 M

KNC10-2 M Enzima Tiempo H2SO4 2N

mLgastadosKmnO4

1 5 mL 0,5 mL -- -- 0,5 mL 5’ 5 mL2 5 mL -- 0,5 mL -- 0,5 mL 5’ 5 mL3 5 mL -- -- 0,5 mL 0,5 mL 5’ 5 mL4 5 mL -- -- -- 0,5 mL 5’ 5 mL5 5 mL -- -- -- --- 5’ 5 mL



d. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el



Concentración deInhibidor (M)

Velocidad de reacción(calculada)

010-4

10-3

10-2

f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de la enzima. Nota: usar papel milimetrado.

Cálculos de la velocidad de reacción

La velocidad de reacción para cualquier tubo experimental se expresa en la siguiente unidad:

ν= mmoles de H2O2 destruidos / minuto

Para obtener el resultado de velocidad expresado en esa unidad deben realizarse los siguientes

cálculos siguiendo esta secuencia:

a. mEq de KmnO4 = N KMnO4 x Volumen gastado (mL)

b. mEq de H2O2 = mEq de KmnO4

c. mmoles de H2O2 = mEq de H2O2 / N° de hidrógenos (2)

d. mmoles destruidos de H2O2 = mmoles totales (control) – mmoles remanentes

(experimental)




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e. ν (velocidad de reacción) = mmoles destruidos de H2O2 / tiempo de reacción (5

minutos)

Los cálculos deberán realizarse para cada tubo experimental en todos los experimentos.

Construya las siguientes gráficas:

a. Concentración enzimática contra velocidad de reacción (Experimento 1)

b. Temperatura contra velocidad de reacción (Experimento 2)

c. pH contra velocidad de reacción (Experimento 3)

d. Concentración de sustrato contra velocidad de reacción (Experimento 4)

e. Inverso de la concentración de sustrato contra inverso de la velocidad de reacción con ysin inhibidor (Experimentos 4 y 5)

f. Concentración progresiva de inhibidor contra velocidad de reacción (Experimento 6)

Auto evaluación

1. ¿Como cree usted que será el efecto de las temperaturas 15°C, 37°C y 60°C sobre la

actividad enzimática de la catalasa sanguínea?

2. Explique que diferencia existe entre los tubos controles y experimentales de esta práctica.

3. ¿En que se basa el método titrimétrico por permanganimetría?

4. Que función cumple el H2SO4 N en los experimentos de esta práctica.

Bibliografía

Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981.

Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.

Universidad Simón Bolívar. Prácticas de Bioquímica I: BC-3181. Departamento de Biología

Celular. 1999.



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