01 Aplicaciones Bm Banco Sangre
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C2.1 APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR en el
Laboratorio del Banco de Sangre
C2.1.1 TAMIZAJE DE AGENTES VIRALES
Técnicas de Amplificación de Ácidos Nucleicos en Banco deSangre
En 1.999, la Cruz Roja Americana y dieciséis laboratorios miembros
de los Centros de Sangre Americanos comenzaron a evaluar la
sangre de donantes para el HIV 1 y el VHC con un nuevo método
conocido como “prueba de amplificación de ácidos nucleicos” (NAT,
en inglés). Esta prueba es conducida bajo los denominados
protocolos de investigación de drogas nuevas, aprobados por laFood and Drug Administration (FDA) de los EUA.
En años recientes, todos los donantes de sangre han sido evaluados
por medio de entrevista y de pruebas para diferentes marcadores
infecciosos. En 1.996, el riesgo de infección por HIV transmitido
mediante transfusión fue aproximadamente de 1 en 493.000
unidades transfundidas. Este riesgo representa una disminución
notable, considerando que en los inicios de 1.980 era tan alto como
1% por unidad transfundida, en algunas ciudades de los EUA.
Los donantes infectados pueden fallar al responder exactamente las
preguntas acerca de los factores de riesgo de las enfermedades
transmisibles en el momento de la donación de sangre.
Los riesgos actuales de infección por HIV y VHC transmitidas por
transfusión, aunque bajos, pueden ser reducidos con los métodos de
biología molecular capaces de amplificar y detectar el genoma viral.
Razones para implementar el NAT
Las razones para iniciar el uso de NAT en donantes de sangre es
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multifactorial.
En acatamiento con el Comité Europeo para Propietarios de
Productos Medicinales (CPMP), se requiere que todos los derivados
de plasma distribuidos en la Unión Europea después del 1 de julio de
1.999, sean obtenidos a partir de plasma que tenga pruebasnegativas para VHC por NAT. Este mandato se origina como
resultado de infecciones por VHC en algunos pacientes que
recibieron inmunoglobulinas comercialmente disponibles. Como
resultado de las infecciones por VHC ocurridas a través de estas
preparaciones que no fueron sometidas a inactivación viral, las
agencias regulatorias han ordenado que los fabricantes incluyan la
inactivación viral en la producción de Igs terapéuticas. Asimismo,como una etapa de seguridad, el CPMP europeo ordenó una prueba
directa para VHC por NAT y probablemente extienda estos
requerimientos para incluir la prueba genómica para HIV y VHB en el
futuro próximo.
Los lineamientos de la FDA establecieron que los fabricantes
de derivados sanguíneos y los Bancos de Sangre deben
implementar esta tecnología para disminuir o eliminar el período de
ventana durante el cual el donante es infeccioso pero no reactivo por
los métodos de laboratorio de rutina.
La demanda social ha avocado por una disminución adicional
en los riesgos de transfusión por el uso de técnicas más avanzadas.
Beneficios del NAT
El período que transcurre entre el momento de la infección por un
agente viral y la positividad de las pruebas serológicas se denomina
“período de ventana”.
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El NAT acorta este período ya que detecta directamente los
genomas virales y no la respuesta inmunológica del huésped
(anticuerpos).
Es importante aclarar que el NAT no excluye los ensayos de EIA
para anticuerpos y/o antígenos, ya que las dos metodologías soncomplementarias y no excluyentes.
La detección de anticuerpos es muy importante ya que una vez que
se sintetizan son detectados persistentemente, en cambio la viremia
es fluctuante a lo largo del tiempo pudiendo llegar a ser indetectable.
En la infección reciente la viremia es alta y la replicación puede
realizarse en horas.
La implementación del NAT para disminuir este período, ha sido
incorporada desde hace años en otros países. Las frecuencias
halladas indican que la probabilidad de encontrar un donante en esta
situación, es muy baja, no obstante estas frecuencias están
directamente relacionadas con el tipo de donante (voluntario, no
remunerado y repetitivo) y de la frecuencia de la infección en la
población general. En Argentina, a diferencia de muchos países, el
número de donantes de sangre voluntarios repetitivos es menor al 5%del total de los donantes, esta situación aumenta el riesgo de donación
en el período de ventana.
Principios técnicos del NAT
A pesar del escrutinio de rutina de los donantes de sangre mediante
EIA para la detección de antígenos (HBsAg, HIV p24) y anticuerpos
(anti-HIV 1/2, anti-HBc, anti-VHC), existe un riesgo residual deinfección postransfusional para HIV o virus de hepatitis adquiridos a
través de donantes que están en el período de ventana de la
infección.
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La eficacia de tal escrutinio depende de la prevalencia de la
infección en la población y la duración del período de ventana.
Veamos la siguiente figura para el caso del HIV:
Figura 1
El tiempo 0 indicaría el momento de la infección. La detección de
ARN HIV deja un período ventana de 11 días. El Ag p24 es
detectable a partir del día 16 y los anticuerpos con EIA de tercera
generación a los 22 días.
Para el VHC el período de ventana es de 70 días cuando se utiliza
EIA de tercera generación, el cual puede ser reducido a 12 días
mediante la utilización de NAT.
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Figura 2
El período de ventana para el VHB es de aproximadamente 50 días
hasta la aparición del Antígeno de superficie (primer marcador
detectable por ELISA).
La implementación del NAT para VHB es compensar el déficit de los
ensayos serológicos actuales en el período de ventana e identificar
donantes fuera del período de ventana, que están infectados con
cepas mutantes del virus B y que no son detectados por los ensayos
serológicos convencionales.
Figura 3
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Tecnología disponible para Banco de Sangre
I. Ensayos basados en PCR in-house.
II. Ensayo de amplificación mediada por transcripción (PROCLEIX
ULTRIO Assay de Chiron, detecta HIV-1 ARN, VHC ARN y VHB
ADN en forma simultánea)III. Ensayos basados en PCR en tiempo real (cobas TaqScreen MPX
Test, multiplex real-time PCR que detecta simultáneamente HIV-1
ARN, HIV-2 ARN, VHC ARN y VHB ADN)
Todos los usuarios de NAT que utilicen un kit comercial o un método
in house deben demostrar su especificidad, sensibilidad y robustez.
Ej.: evaluación frente a un estándar (WHO HCV InternationalStandard 96/790)
Los métodos manuales son laboriosos y están sujetos al error
humano. Los automatizados poseen menor error pero requieren
protocolos de validación más complejos y sólo se utilizan en centros
que procesan un volumen elevado de muestras.
Las técnicas de biología molecular, debido a su sensibilidad, se
realizan empleando pooles de muestras cuyo tamaño está
condicionado a recomendaciones internacionales, como por ejemplo
la del Paul Erlich Institute, en Alemania, que dispone que todos los
productos sanguíneos deben ser negativos por NAT utilizando
técnicas que detecten, en muestras individuales, 5.000 IU/ ml para
VHC y 10.000IU/ml para HIV. Utilizando diferentes técnicas, existen
experiencias internacionales de pooles de 6 a 512 donaciones. Los
tamaños menores se utilizan en Bancos de Sangre y los mayores en
el fraccionamiento industrial del plasma.
El tamaño de los pooles ha disminuido de manera considerable
cuando se incorpora el VHB en las detecciones simultáneas de los
tres virus y esto se debe a que el virus B tiene una velocidad de
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replicación mucho más baja que los otros y por consecuencia la
carga viral en el periodo de ventana es menor.
Algunos formatos comerciales están validados para ser utilizados en
muestras individuales.
La sensibilidad diminuye con el tamaño del pool. La presencia deinhibidores de las reacciones de amplificación, se minimiza cuando
aumenta el tamaño del pool.
Una de las ventajas de trabajar en pool radica en el menor número
de determinaciones diarias a realizar y la reducción de los elevados
costos de las determinaciones; aunque presenta la desventaja del
desdoblamiento del pool para identificar la muestra positiva que
genera demoras en la habilitación de los hemocomponentes.En nuestro país, en general, el NAT se realiza a las muestras que ya
tienen el estudio serológico convencional. Este esquema prolonga el
tiempo necesario para habilitar las unidades de sangre, ya que se
deberá contar primero con los resultados serológicos antes de
realizar las técnicas moleculares. Esto aunque retrasa la
disponibilidad de los hemocomponentes, disminuye el riesgo de
contaminación y de desdoblamientos de los pooles positivos. Cada
Banco de Sangre diseña su propia logística para disponer de
hemocomponentes aptos en el menor tiempo posible.
En nuestro Servicio las muestras NO REACTIVAS por EIA, para
anti-VHC, anti-HIV/p24, HBAgs /anti-core son evaluadas por NAT.
Para VHC y HIV utilizamos una técnica validada en nuestro
Laboratorio siguiendo las recomendaciones de la Farmacopea
Europea.
Los límites de detección (sensibilidad), obtenido por Probit analysis
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programs, para un 95% de positividad obtenido en nuestro
laboratorio son:
HCV: 98,5 UI/ml.
HIV: 294,5 UI/ml
HBV: 52,0 UI/ml
Controles Positivos (CP):
VHC: Standard Internacional 96/790 del National Institute for
Biological Standards and Control (NIBSC) reconocido por la
OMS como patrón internacional para ensayos NAT que
contiene 50.000UI de ARN/ HCV.
HIV: Standard Internacional 97/656 del NIBSC para NAT quecontiene 100.000 UI de ARN/HIV.
VHB: Standard Internacional 97/746
Breve descripción técnica
Para la extracción de los genomas virales (ARN de HIV, VHC
y ADN de VHB) se emplea un kit que utiliza membranas que poseen
alta capacidad de unión a ácidos nucleicos y por medio de una
cromatografía de adsorción y el empleo de buffers especiales
permite purificación y separación de ARN y ADN viral del resto de
los componentes celulares.
Para VHC y HIV se realiza una retrotranscripción con enzima
MMLV. Se emplean random primers para HIV y primers antisense
externo específico de la región 5’ no codificante para VHC. Luego se
realiza una nested PCR: el cADN es amplificado con 2 juegos de
primers de la región pol para el HIV y 2 juegos para la región 5’ NC
del genoma del VHC.
Para VHB el ADN purificado se emplea como templado en
una nested PCR, en la cual se utilizan cebadores que hibridan en la
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región core/ precore del genoma del virus B y se amplifica un
fragmento de 150 pb.
El revelado de los productos de amplificación se realiza con
geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. El producto de
amplificación es identificado teniendo como referencia un ladder de50-500 pares de bases (bp).
Foto 11
Foto 1
Desde que incorporamos el NAT para HIV y VHC (junio 2004)
hemos procesado a Julio de 2015: 77325 muestras, de las cuales
fueron reactivas por EIA y ECLIA (electroquimioluminiscencia) el
0.18% para anti-VHC, 0.082% para AgP24/anti-HIV. Ningún genoma
viral de VHC fue detectado por NAT en período ventana.Fue detectado por NAT un donante HIV no reactivo por EIA. Edad:
26 años, masculino, no refirió antecedentes de riesgo en el
interrogatorio previo a la donación, nunca había donado sangre, dijo
HIVCalle 1: ladderCalle 2, 3: poolCalle 4: Control Negativo (CN)
Calle 5: CP 100 UI (175bp)Calle 6: CP 200 UI (175bp)Calle 7: Control de amplificación
HCVCalle 1: ladderCalle 2, 3: poolCalle 4: CNCalle 5: CP 100UI/ml (250bp)Calle 6: CP 200 UI/ml (250 bp)Calle 7: Control de amplificación
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sentirse bien y gozar de buena salud. No se autoexcluyó.
La muestra de este donante fue evaluada con un kit para
determinación simultánea de anti-HIV y Agp24.
Desdoblado el pool positivo e identificada la muestra por NAT, fue
reevaluada por EIA dando resultados repetidamente NO reactivos. Alos 20 días el donante fue reevaluado por EIA con los mismos kits,
utilizados anteriormente, resultando REACTIVO.
A los fines de documentar este caso, las muestras del día 1 y 20
post-donación, fueron evaluadas con otros reactivos de diferentes
marcas y lotes y en 2 laboratorios distintos (ver el cuadro siguiente).
El segundo donante de 30 años de edad, masculino, que tambiénniega antecedentes de riesgo en la entrevista previa a la donación y
no se autoexcluyó en forma previa ni posterior a la misma. La
muestra de este donante fue evaluada con un kit para determinación
simultánea de anti-HIV y Agp24 de Roche.
A los 15 días el donante fue reevaluado, con los mismos reactivos,
resultando REACTIVO.
Día Anti-VIH/p24EIA(Biomerieux)
Anti-VIH Axsym(Abbott)
Ag p24EIA
(Biomerieux)
NAT(PCR)
CARGA VIRAL Amplicor.
Roche.
1(DONACIÓN)
NR NR R D 393972copias/ml
20(POST-
DONACIÓN)R R R D 602771copias/ml
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TABLA 1. * Este resultado fue obtenido con posterioridad al de NAT.
La utilización de NAT nos permitió detectar dos donantes NO
reactivo por EIA y ECLIA del cual habían sido preparados 3
hemocomponentes con una elevada carga viral del HIV.
En junio del 2.009 incorporamos NAT para la detección de VHB ADN
en la rutina de screening de donantes de sangre y a Julio de 2.015
procesamos 48661 muestras sin encontrar ningún donante en
período ventana.
Desde abril del 2.011 en nuestro Servicio las muestras NO
REACTIVAS por ECLIA, para anti-VHC, anti-HIV/p24, HBAgs /anti-
core son evaluadas por NAT por un método comercial en pooles de
6 donantes.
SISTEMAS AUTOMATIZADOS
El sistema Procleix Tigris (Novartis) fue el primer sistema totalmente
automatizado para NAT. Este sistema tiene formatos deprocesamientos en pooles o en muestras individuales (formato
aprobado por ANMAT en nuestro país).
El ensayo PROCLEIX® ULTRIO® Plus™ se utiliza para la detección
DIAELISAAg/Ac
BIOMERIEUX
ECLIAAg/Ac
Roche
NAT
(COBASTaqScreen MPX
Test V2.0Plataforma
COBAS S201–
Roche)
CARGA VIRAL
(COBAS TaqManHIV-1 test Roche
v2.0)
1 NR1.2
(CO=1)*Detectable
10.000.000copias RNA-
HIV1/ml plasma.
15 REACTIVO193
(CO=1)Detectable
15.000.000copias RNA-
HIV1/ml plasma
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de HIV-1, VHB y VHC en muestras individuales de donantes de
sangre.
Lisis viral, liberación de
genomas virales y captura con
partículas magnéticas
Incorporación de un control
interno
Amplificación de los genomasvirales
Detección de los genomas
virales y del control interno
Figura 4
Ensayo PROCLEIX® ULTRIO® Plus para la detección de HIV-1,
VHB y VHC.
Captura del Target (ácido nucleico viral)
La reacción se realiza en un único tubo.
Las partículas magnéticas tienen sondas que capturan los ácidos
nucleicos virales específicos. En esta etapa se incorpora un control
interno. Luego se lavan las partículas (con la ayuda de un magneto)
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para eliminar cualquier componente de la muestra y la reacción que
pueda inhibir la amplificación.
Transcription-Mediated Amplification (TMA)
Se amplifican diferentes secuencias de los genomas viralesmediante una Transcriptasa Reversa que sintetiza ARN utilizando
ADN o ARN como molde. Los amplicones de ARN son más fáciles
de decontaminar.
Para el HIV-1 se amplifican dos regiones del genoma (pol, LTR) que
permiten detectar HIV-1 Grupo M (subtipo A-H), Grupo N y O. De
VHC detecta genotipos 1-6.
También detecta variantes de HIV-1 y VHC.2Para VHB detecta los genotipos A-G
Detección mediante Cinética Dual
Las secuencias amplificadas se detectan mediante sondas
marcadas y se inactivan las sondas no hibridizadas (Hybridization
Protection Assay).
El luminómetro detecta simultáneamente las señales
quimioluminiscentes del control interno y de los ácidos nucleicos
virales estudiados.
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Tabla 1. Sensibilidad de ensayo PROCLEIX® ULTRIO, según lainformación del inserto.
Roche desarrolló una plataforma automatizada (cobas s 201) para la
aplicación de técnicas NAT. La automatización es total desde el
armado de pooles, extracción de ácidos nucleicos, amplificación,
detección e informe final de los resultados.
Con base en la tecnología de PCR en tiempo real, el ensayo cobas
TaqScreen MPX permite la detección de los agentes virales: HIV-1
(grupos M y O), HIV-2, VHB (genotipos A-G) y VHC (1-6) en una
única prueba multiplex.
La plataforma está configurada para pooles de 6 muestras de
donantes aunque está validada para pooles de hasta 24 muestras.
TEST UNIDADESLímite dedetección
Rango (nivel deconfianza del 95%)
HIV-1 (grupo M) UI/ml 49.0 42.4 – 58.1
HIV-1 (grupo O) copias/ml 154.0 97 – 371
HIV-2 copias/ml 2.2 1.9 – 2.6
VHC UI/ml 10.7 7.0 – 21.7
VHB UI/ml 3.7 3.3 – 4.4
Tabla 2. Sensibilidad de ensayo cobas TaqScreen MPX.
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C2. 1.2 TIPIFICACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS
C2. 1.2.1 PLAQUETARIOS
Las plaquetas humanas, al igual que el resto de los elementos
formes sanguíneos, presentan en la superficie externa de su
membrana estructuras polimórficas e inmunogénicas.Estas estructuras genéticamente determinadas y localizadas en las
proteínas y glicoproteínas (GP), pueden causar aloinmunización
durante el embarazo, la transfusión sanguínea o el transplante.
El interés del estudio de los antígenos y anticuerpos antiplaquetarios
radica en su importancia diagnóstica, pronóstica y terapéutica en los
cuadros clínicos asociados a la aloinmunización como: la Púrpura
Neonatal Aloinmune (PNAIoI), la Púrpura TrombocitopénicaPostransfusional (PPT) y la Refractariedad a la transfusión de
plaquetas (RTQ).
Resulta útil diferenciar entre aquellos aloantígenos presentes en la
plaqueta pero expresados en muchas otras células, conocidos como
“antígenos plaquetarios no específicos”, de aquellos con una
expresión relativamente restringida a la membrana plaquetaria y a
sus precursores, llamados “antígenos plaquetarios específicos”. Losprimeros, son causales de la mayoría de los cuadros de
refractariedad a la transfusión de plaquetas de causa inmunológica y
los últimos responsables casi excluyentes del resto de los cuadros.
Aloantígenos plaquetarios específicos (Sistemas HPA)
A pesar del gran número de glicoproteínas en la superficie
plaquetaria, los aloantígenos plaquetarios específicos descritos se
encuentran localizados principalmente en los complejos
glicoproteicos GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V, GPIa/IIa y en la proteína
CD109.
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Estos antígenos acompañan la herencia de estas glicoproteínas y se
heredan de manera autosómica codominante.
Actualmente se conocen treinta y tres aloantígenos plaquetarios
específicos definidos por sus correspondientes anticuerpos
humanos, de los cuales doce se hallan agrupados en seis sistemascompuestos por pares de antígenos, el tético y su correspondiente
antitético. Para los veintiún antígenos restantes, se cuenta
únicamente con los aloanticuerpos que los definen, pero no para su
correspondiente antitético. Una razón por la que anticuerpos contra
la estructura antitética aún no han sido descritos es que éstas se
presentan en tan baja frecuencia que los individuos homocigotos y
por lo tanto susceptibles a inmunizarse, no existen o sonextremadamente raros.
Pese a su denominación, muchos aloantígenos plaquetarios
previamente considerados como específicos han sido encontrados
también en otras células y tejidos. Muchos de estos antígenos son
portados por las integrinas, miembros de receptores de adhesión
celular, moléculas conocidas por estar involucradas en las
interacciones célula-célula o célula-matriz. Los aloantígenoslocalizados inicialmente en la subunidad β3 (GPIIIa) plaquetaria han
sido detectados en células endoteliales, células del músculo liso y en
los fibroblastos. Los antígenos asociados con la subunidad α2
integrina (GPIa) han sido encontrados en linfocitos T activados y en
células endoteliales. Aquellos antígenos asociados al CD109 se
encuentran también en los linfocitos T activados, en células
endoteliales y en varias líneas celulares tumorales. Contrariamente,
los aloantígenos localizados en la subunidad αIIb y en la subunidad
GPIb (miembros de la familia de glicoproteínas ricas en leucina),
parecen ser específicos del linaje megacariocítico.
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Nomenclatura HPA
Históricamente los antígenos plaquetarios específicos fueron
llamados con el nombre de los pacientes sensibilizados de quienes
se obtuvieron los antisueros específicos que los definían.
Esta nomenclatura se tornó confusa debido al descubrimientoindependiente de un mismo antígeno por diferentes grupos de
investigadores, sumado a cierto grado de controversia con respecto
a la prioridad en la asignación de los nombres.
Para solucionar este dilema, Von Dem Borne y Decary propusieron
en 1990 un sistema simplificado, al que llamaron HPA, acrónimo del
inglés Human Platelet Antigens (antígenos plaquetarios humanos), el
cual fue revisado en 1998 por Santoso y Kiefel y recientemente porMetcalfe y col. Según esta nomenclatura vigente, un antígeno
plaquetario específico es denominado un antígeno humano
plaquetario (HPA) cuando sus bases moleculares son conocidas.
Los antígenos plaquetarios humanos son agrupados en sistemas
basados en la existencia de aloanticuerpos que definen tanto al
antígeno tético como al antitético. Los HPAs y sus sistemas son
designados cronológicamente (HPA-1, HPA-2, HPA-3, etc.)
siguiendo el orden de la fecha de su descubrimiento y se nombran
alfabéticamente en orden según su frecuencia (de alta a baja) en la
población estudiada, designando al de mayor frecuencia como “a” y
al de baja frecuencia como “b”. Una designación “w” es agregada
después del nombre del antígeno si aún no se conoce un
aloanticuerpo contra el aloantígeno antitético.
Bases moleculares de los antígenos HPA
Se conocen las bases moleculares de treinta y dos de los treinta y
tres antígenos plaquetarios específicos definidos serológicamente
(Tabla 3) En todos excepto uno, la diferencia entre lo propio y lo no-
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propio es definida por la sustitución de un único aminoácido,
causado por un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el gen
que codifica la correspondiente glicoproteína de membrana. Para el
antígeno restante (HPA-14w) el polimorfismo obedece a una
deleción de tres nucleótidos que se traduce en un único aminoácidofaltante en la correspondiente glicoproteína.
A continuación se describen las glicoproteínas de la membrana
plaquetaria, portadoras de los aloantígenos HPA.
a) Polimorfismos en el complejo glicoproteico IIb/IIIa
Esta integrina juega un papel muy importante en la agregación
plaquetaria. Después de la activación, pasa por un cambioconformacional que le permite unirse al fibrinógeno y al factor de von
Willebrand (vWF). El fibrinógeno se une a la GPIIb/IIIa en dos
plaquetas adyacentes, haciendo la vez de puente y mediando la
agregación plaquetaria. Por ser esta una vía final, común y única, la
deficiencia de este complejo, tiene pronunciados efectos en la
funcionalidad plaquetaria, como sucede en la Tromboastenia de
Glanzmann. Hay aproximadamente 50-80.000 copias de este
complejo heterodimérico y requiere Ca2+ para su función. Este
consiste en la asociación no covalente de una subunidad αIIb y otra
β3. Los genes que codifican dichas subunidades se encuentran en el
brazo largo del cromosoma 17 (q21-23) muy cerca entre sí. La
GPIIIa (CD61, β3) es una proteína glicosilada de 90 kDa que
contiene tres dominios, uno grande extracelular con 28 puentes
disulfuro, un dominio transmembrana y un segmento citoplasmático
corto C-terminal. La GPIIb (CD41, αIIb) tiene una cadena
extracelular pesada de 116 kDa asociada covalentemente por un
puente disulfuro a una cadena liviana de transmembrana de 22 k-Da.
Sin duda este complejo porta el mayor número de antígenos y
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sistemas:
• en la cadena β3 se hallan los sistemas HPA-1 (residuo 33),
HPA-4 (residuo 143), HPA-6w (residuo 489), HPA-7w (residuo
407), HPA-8w (residuo 636), HPA-10w (residuo 62), HPA-11w
(residuo 633), HPA-14w (611del), HPA-16w (residuo 140),HPA-17w (residuo 195), HPA-19w (residuo 137) y HPA-21w
(residuo 628).
• en la cadena αIIb se encuentran los sistemas HPA-3 (residuo
843), HPA-9w (residuo 837) y HPA-20w (residuo 1949).
Figura 5
b) Polimorfismos en el complejo glicoproteico Ib/ IX/ VEste complejo glicoproteico está involucrado en las etapas iniciales
de la adhesión plaquetaria a la matriz subendotelial de los vasos
dañados mediado por el vWF. El receptor del vWF está constituido
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por cuatro componentes transmembranales, todos miembros de la
familia de proteínas ricas en repeticiones de leucina: la GPIbα
(CD42b, 143 kDa) está unida covalentemente a la GPIbβ (CD42c, 22
kDa) por un único puente disulfuro y asociada no covalentemente
con la GPIX (CD42a, 20 kDa) y GPV (CD42d, 83 kDa). Hayaproximadamente 25.000 copias del complejo GPIb/IX y 12.000 de
la GPV por plaqueta y el complejo está asociado funcionalmente al
Receptor FcγRII (CD32).
Figura 6
El sitio primario de unión del complejo glicoproteico al vWF está
localizado en la cadena GPIbα, pero el resto del complejo esnecesario para dicha unión. El gen que codifica para la GPIbα está
en el cromosoma 17, el gen de la GPIb β gene está en el
cromosoma 22 y los genes que codifican para la GPIX y la GPV
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están en el cromosoma 3.
En este complejo glicoproteico se han descrito dos sistemas
aloantigénicos hasta el momento:
• el polimorfismo HPA-2, situado en la GPIbα (residuo 142) y
• el HPA-12w (residuo15) en la GPIbβ.Se han descritos varias mutaciones silenciosas de la GPIbα pero sin
capacidad de inducir una aloinmunización.
c) Polimorfismos en el complejo glicoproteico Ia/ IIa
El complejo glicoproteico GPIa/IIa (CD49/CD29) o VLA-2 (very late
antigen 2) se trata de una integrina, constituida por la asociación no
covalente de una subunidad α2 (165 kDa) y otra β1 (145 kDa). Hayaproximadamente 800-2.800 copias del heterodímero por plaqueta.
Su ligando principal es el colágeno subendotelial expuesto. Se
conocen las bases genéticas para los dos sistemas aloantigénicos
presentes en el complejo GPIa/IIa. Tanto el sistema HPA-5 (residuo
505), HPA-13w (residuo 799) y el HPA-18w (residuo 716) se hallan
en la GPIa y son el resultado de la substitución de un único
nucleótido.
Figura 7
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194
d) Polimorfismos en la molécula CD109
Se trata de una glicoproteína de 175 kDa anclada a la membrana
plaquetaria por un grupo glicosil-fosfatidil-inositol. Está también
presente en monocitos, granulocitos, células T estimuladas y células
progenitoras mieloides CD34+
. Aunque la función de la moléculaCD109 no se conoce, se cree que puede estar involucrada en
interacciones célula-célula. La base genética de los antígenos Gov
(sistema HPA-15) en el CD109 también ha sido determinada
demostrándose una mutación puntual de C por A en la posición 2108
de la secuencia codificante, lo que se traduce en el cambio del
aminoácido serina por tirosina en el residuo 703 de la proteína..
e) Antígenos plaquetarios específicos no-HPA
El antígeno plaquetarios específico Moua no es un antígeno HPA,
debido a que su base molecular aún no ha sido dilucidada.
f) Otros polimorfismos
La glicoproteína GP IV (CD36, GPIIIb) se encuentra en la membrana
de las plaquetas y monocitos. Consiste en una cadena simple de
aminoácidos. Existen alrededor de 12000 a 14000 copias y tiene
función de receptor para la trombospondina actuando en la
estabilización del agregado plaquetario. Su deficiencia es muy
frecuente en individuos de origen japonés, los cuales pueden
desarrollar isoanticuerpos. La estructura blanco de los
isoanticuerpos fue confundida inicialmente con un aloantígeno y
recibió el nombre de Naka.
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Tabla 3. Antígenos Plaquetarios Humanos (HPA)Sistema Antígeno Sinónimos Glicoproteína HGNC* Cromosoma CD Ca
nu
HPA-1a Zwa
, Pl A1
T1
HPA-1 HPA-1b Zwb , Pl A2 GPIIIaITGB3 17 CD61 C1
HPA-2a Kob C4HPA-2HPA-2b Koa , Siba
GPIbα GP1BA 17 CD42bT4
HPA-3a Baka , Leka T2HPA-3HPA-3b Bakb
GPIIb ITGA2B 17 CD41G2
HPA-4a Yukb , Pena G5HPA-4HPA-4b Yuka , Penb
GPIIIa ITGB3 17 CD61 A5
HPA-5a Br b , Zavb G1HPA-5HPA-5b Br a, Zava, Hca
GPIa ITGA2 5 CD49b A1
G1
HPA-6bw Caa , Tua GPIIIa ITGB3 17 CD61 A1
C1
HPA-7bw Moa GPIIIa ITGB3 17 CD61
G1
C1
HPA-8bw Sr a GPIIIa ITGB3 17 CD61
T1
G2
HPA-9bw Maxa GPIIb ITGA2B 17 CD41
A2
G2
HPA-10bw Laa GPIIIa ITGB3 17 CD61
A2
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Tabla 3. Antígenos Plaquetarios Humanos (HPA) (continuación)Sistema Antígeno Sinónimos Glicoproteína HGNC* Cromosoma CD Ca
nu
G1
HPA-11bw Groa GPIIIaITGB3 17 CD61 A1
G1
HPA-12bw Iya GPIb β GP1BB 22 CD42c
A1
C2
HPA-13bw Sita GPIa ITGA2 5 CD49b
T2
AAHPA-14bw Oe a
GPIIIa ITGB3 17 CD61de
HPA-15a Gov b C2HPA-15HPA-15b Gov a
CD109 CD109 6 CD109 A2
C
4
HPA-16bw Duv a GPIIIa ITGB3 17 CD61 T4
C6
HPA-17bw Va(a)GPIIIa ITGB3 17 CD61
T6
G2
HPA-18bw CabaGPIa ITGA2 5 CD49b
T2
A4
HPA-19bw StaGPIIIa ITGB3 17 CD61
C4
C1
HPA-20bw KnoGPIIb ITGA2B 17 CD41
T1
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Tabla 3. Antígenos Plaquetarios Humanos (HPA) (continuación)Sistema Antígeno Sinónimos Glicoproteína HGNC* Cromosoma CD Ca
nu
G1
HPA-21bw Nos GPIIIaITGB3 17 CD61 A1
*HGNC: El comité en nomenclatura génica de la organización genoma humano
Los sombreados son los sistemas compuestos por pares de antígenos, en los restantes aún no está
antitéticos (ver explicación en el texto).
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TIPIFICACIÓN HPA
A) FENOTIPIFICACIÓN
El valor de la fenotipificación serológica de los antígenos
plaquetarios específicos es limitado debido a que a menudo no es
posible obtener suficientes plaquetas en pacientestrombocitopénicos y los reactivos para su determinación no resultan
fiables, con excepción de anti-HPA-1a y de anti-HPA-5b. Hasta hace
poco, la fenotipificación HPA dependía de la disponibilidad de suero
humano de individuos sensibilizados contra los aloantígenos
plaquetarios específicos. Estos sueros anti-HPA contenían con
frecuencia anticuerpos dirigidos contra los antígenos HLA de clase I,
limitando así su uso a los análisis “glicoproteína-específicos” talescomo el MAIPA. Si bien los anticuerpos monoclonales se utilizan
rutinariamente para fenotipar los glóbulos rojos, a excepción de
HPA-1a ninguno se ha utilizado para tipificar los HPA.
Recientemente se han publicado varios métodos para la
fenotipificación rápida usando anticuerpos policlonales anti-HPA-1a
de origen recombinante.
B) GENOTIPIFICACIÓN
La genotipificación HPA puede realizarse con ADN genómico
obtenido de cualquier material celular.
Esto es posible a partir de la caracterización molecular de estos
antígenos. Muchas técnicas se han descrito para caracterizar los
SNP: PCR primer secuencia especifica (PCR-SSP), polimorfismos
en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismo
de conformación de cadena individual de ADN (SSCP), hibridación
con oligonucleótidos secuencia especifica (SSO), reacción en
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cadena de la ligasa (LCR), mini-secuenciación, etc.
Muchas de ellas se han aplicado a la genotipificación de los
sistemas HPA, aunque solamente la técnica de PCR-SSP sola o
combinada con RFLP se utiliza extensamente en los estudios
poblacionales y en la práctica clínica especializada. A pesar de las grandes ventajas que presentan las técnicas de
genotipificación es improbable que reemplacen totalmente a la
fenotipificación serológica.
Esto se debe a casos excepcionales, donde la presencia del SNP
puede no resultar exactamente en la expresión del antígeno.
Recientemente se describió un tercer alelo de muy baja frecuencia
para el sistema HPA-1. En este se describió la pérdida de algunosde los epitopos del antígeno HPA-1a y cuya caracterización a través
del polimorfismo de un único nucleótido induciría a un error. Se han
descrito alelos silentes para el HPA-1b y HPA-3a que dan resultados
discordantes en individuos portadores de la Tromboastenia de
Glanzmann.
A continuación ejemplos de la utilización de PCR-SPP para la
genotipificacón HPA en el diagnóstico de una PNAIoI, en todos loscasos, los productos de amplificación fueron revelados en geles de
agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio. Como control interno
se empleó regiones monomórficas del gen que codifica la Proteína C
reactiva (PM: 440 bp)
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Foto 2. Genotipificación de los sistemas HPA-1,-2,-3,-4,-5 y -15 por PCR-SSP de la madre de un recién nacido afectado de PNAloI. La presencia de
los fragmentos de ADN de los correspondientes alelos (a y/o b) sonvisibles únicamente si los primers específicos son completamentecomplementarios a la secuencia blanco y se diferencian por su tamaño:Interpretación: 1b/1b, 2a/2a, 3a/3a, 4a/4a, 5a/5a, 15a/15a
Foto 3. Genotipificación de los sistemas HPA-1,-2,-3,-4,-5 y -15 por PCR-SSP de recién nacido con PNAloI. Interpretación: 1a/1b, 2a/2a, 3a/3a,4a/4a, 5a/5a, 15a/15b.
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Foto 4. Genotipificación de los sistemas HPA-1,-2,-3,-4,-5 y -15 por PCR-SSP del padre del recién nacido con PNAloI por anti-HPA-1a.Interpretación: 1a/1a, 2a/2a, 3a/3a, 4a/4a, 5a/5b, 15a/15b.
IMPLICANCIAS CLÍNICAS DE LOS POLIMORFISMOS HPA
Asociadas a la aloinmunización
Los anticuerpos contra las plaquetas están usualmente dirigidos
contra las moléculas HLA de clase I y contra los aloepitopos en las
glicoproteínas GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V, GPIa/IIa y CD109.
Los citados aloanticuerpos pueden causar los cuadros clínicos que
se describen a continuación:
1.Refractariedad a la transfusión de plaquetas
2.Trombocitopenia feto-neonatal aloinmune
3.Púrpura trombocitopénica post-transfusional
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Asociada a cambios en la funcionalidad
Debido al papel preponderante de las glicoproteínas plaquetarias en
la funcionalidad de las plaquetas, no es extraño, que polimorfismos
que afectan la expresión o la actividad de estas, puedan influenciar
el curso y pronóstico de enfermedades que involucran a lahemostasia.
Existen numerosos estudios epidemiológicos que relacionan varios
polimorfismos en las GP plaquetarias, entre ellos, algunos HPAs,
con el riesgo aumentado de enfermedad coronaria arterial e infarto
de miocardio en individuos jóvenes. Al igual que los estudios de
agregometría in vitro, muchos resultados son conflictivos.
Si bien esta nueva área de la genómica humana debe ser evaluadamuy detenidamente, ya existe evidencia substancial de que el alelo
HPA-1b, los alelos GPIb Met145 (VNTR A o B) y especialmente el
alelo 807T de la integrina α2 contribuyen al riesgo de infarto agudo
de miocardio en individuos jóvenes (< 60 años) y al desarrollo de la
retinopatía diabética. Se espera para los futuros años una
evaluación del riesgo acumulativo o efecto sinérgico de estos
factores de riesgo plaquetario junto con otros bien definidos en un
gran número de patologías muy prevalentes.
Frecuencias poblacionales de los polimorfismos HPA
Las frecuencias fenotípicas y génicas de los aloantígenos
plaquetarios humanos han sido determinadas en diversas
poblaciones y se han observado diferencias claras en la prevalencia
de algunos antígenos entre ellas.
Hay consenso en que las poblaciones estudiadas pueden agruparse
por similitudes en sus frecuencias alélicas HPA en dos grandes
“clusters”. En uno de ellos se encuentran a las poblaciones
caucásicas y en el otro a las orientales y amerindias.
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203
El grupo caucásico se caracteriza por poseer frecuencias
relativamente altas del alelo “b” de los sistemas HPA-1,-2,-3 y -5. En
cambio, para los sistemas HPA-4 y HPA-6, la frecuencia del alelo “b”
es muy baja o inexistente.
El grupo oriental presenta un patrón antigénico muy distinto, confrecuencias alélicas “b” significativamente menores que en
caucásicos para los sistemas HPA-1,-3 y -5 y frecuencias
significativamente mayores del alelo “b” para los sistemas HPA-4 y
HPA-6.
Estas diferencias tienen una buena correlación con la epidemiología
de la trombocitopenia feto-neonatal aloinmune, en lo que respecta a
la prevalencia y las especificidades antigénicas involucradas.En el año 2007 nuestro grupo realizó la primer y, hasta el momento,
única caracterización de las frecuencias alélicas HPA de una
población de una ciudad argentina (Rosario), observándose una
distribución similar a las descritas en poblaciones europeas.
Los pocos casos diagnosticados de PNAloI, el limitado conocimiento
sobre la naturaleza y la gravedad de este cuadro, sugieren que se
halla fuertemente subdiagnosticada en nuestro medio, al igual que elresto de los cuadros asociados a la aloinmunización HPA.
C2. 1.2.2 GRANULOCITARIOS
Los neutrófilos humanos, al igual que el resto de los elementos
formes sanguíneos, presentan en la cara externa de su membrana
estructuras capaces de despertar una respuesta inmune y/o de
reaccionar con el producto de ella. Dependiendo de la naturaleza de
la reacción inmune, podemos clasificar a estas estructuras como
autoantígenos y aloantígenos.
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204
A.AUTOANTÍGENOS
La pérdida de la autotolerancia conduce a un proceso autoinmune.
En el neutrófilo, las estructuras blanco de los autoanticuerpos suelen
ser porciones monomórficas del receptor de IgG FcγRIIIb o del
complejo CD11b/CD18 presentes en el individuo respondedor y enprácticamente todos los individuos. En ocasiones el autoanticuerpo
muestra una mayor afinidad por una estructura polimórfica,
simulando una especificidad aloinmune. A diferencia de esta última,
la estructura blanco de estos anticuerpos esta invariablemente
presente en el individuo respondedor.
B.ALOANTÍGENOSLos aloantígenos granulocitarios son estructuras polimórficas de la
membrana de los granulocitos, capaces de despertar una respuesta
inmune esencialmente humoral en individuos carentes de la
estructura al ser expuestos durante el embarazo, la transfusión
sanguínea o el transplante.
Los aloantígenos del granulocito se clasifican según su ubicuidad en
tres tipos:
a. Antígenos granulocitarios con una expresión restringida a la
membrana granulocitaria y a sus precursores, llamados “antígenos
específicos de granulocitos”.
b. Antígenos granulocitarios con una expresión más extendida,
generalmente presentes en otros leucocitos, llamados “antígenos
compartidos de granulocitos”.
c. Antígenos granulocitarios con una amplia expresión tisular. Estos
incluyen a los antígenos ya descritos incluidos en los sistemas de
grupo sanguíneo I y P, los antígenos Lex y sialil-Lex y a las
moléculas de HLA de clase I.
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Figura 8
NOMENCLATURA HNA
Los sistemas HNA son designados numéricamente dependiendo la
glicoproteína portadora (ej. HNA-1 = FcγRIIIb (CD16b); HNA-2 =
NB1 (CD177); etc.) y los antígenos alfabéticamente, siguiendo el
orden cronológico de su descubrimiento (ej. HNA-1a, HNA-1b, etc.),
Son cinco los sistemas HNA descritos que incluyen un total de siete
antígenos granulocitarios (Tabla 4). Aquellos antígenos parcialmente
caracterizados, no pueden incluirse hasta que sus bases genéticas,
bioquímicas y moleculares sean establecidas. Desafortunadamente,
para muchos antígenos descritos con anterioridad no se disponen de
los antisueros correspondientes de origen humano y por lo tanto no
es posible avanzar en su caracterización.
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Tabla 4. Aloantígenos de Neutrófilos Humanos (HNA)
SistemaHNA
AntígenosNombr e
anterior
Glicoproteína(CD)
Cambio deaminoácido
AlelosCambio denucleótido
C
HNA-1a NA1 FcγRIIIb(CD16b)
Arg36Leu38 Asn65 Ala78 Asp82Val106
FCGRB*01 G108C114 A197G247C266G319
HNA-1b NA2 FcγRIIIb(CD16b)
Ser36Leu38Ser65 Ala78 Asn82
Ile106
FCGRB*02 C108T114G197 A247C266
A319
HNA-1
HNA-1c SH FcγRIIIb(CD16b)
Ser36Leu38Ser65 Asp78 Asn82Ile106
FCGRB*03 C108T114G197 A247 A266 A319
NTRN
HNA-2 HNA-2 NB1 NB1 (CD177) Ausenciaproteína(fenotiponulo)
CD177*01 Defecto en laexpresión
NTRNN
HNA-3a 5b CTL-2(SLC44A2) Arg154 SLC44A2 G461 TRHNA-3HNA-3b 5a CTL-2
(SLC44A2)Gln154 SLC44A2 A461
HNA-4 HNA-4a MART Mac-1, CR3 oαMβ2 (CD11b)
Arg61 ITGAM*01 G 230N
HNA-5 HNA-5a OND LFA-1 o αLβ2(CD11a)
Arg766 ITGAL*01 G2372¿
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207
HNA-1
El sistema HNA-1 está compuesto por tres antígenos: HNA-1a, HNA-
1b y HNA-1c (antes llamados NA1, NA2 y SH respectivamente).
Estos antígenos se expresan únicamente en los granulocitos
neutrófilos y sus precursores, encontrándose en todos los neutrófilossegmentados, en alrededor de la mitad de los metamielocitos
neutrófilos y en un 10 % de los mielocitos neutrófilos. También se
encuentran en una forma soluble en el plasma y otros fluidos.
En función de los antígenos del sistema HNA-1 expresados en la
membrana del neutrófilo, la mayoría de los individuos son asignados
a uno de los cinco fenotipos descritos (Tabla 5). La herencia de
estos antígenos acompaña la de su glicoproteína portadora, elFcγRIIIb.
FcγRIIIb (CD16b)
El FcγRIII (CD16) es un miembro de la superfamilia de las
inmunoglobulinas, estrechamente relacionado a otros receptores de
la porción Fc de las IgG (FcγR). Este receptor existe en dos formas
no alélicas: FcγRIIIa (CD16a) y FcγRIIIb (CD16b) codificados por los
genes FCGR3A y FCGR3B respectivamente.
El FcγRIIIb (CD16b) es un receptor de baja afinidad para IgG1 e
IgG3, cuya función es la remoción de los inmunocomplejos
circulantes y la fagocitosis de microorganismos opsonizados. Este
receptor es específico del neutrófilo y se encuentra en gran número
en la membrana plasmática. La presencia del receptor en el plasma
se debe probablemente al clivaje de este como consecuencia de la
apoptosis de los neutrófilos.
Se trata de una glicoproteína de 186 aminoácidos, anclada a la
membrana plasmática vía un grupo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI).
Los anticuerpos contra los antígenos que componen el sistema
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HNA-1 reconocen tres variantes polimórficas e inmunogénicas del
FcγRIIIb (CD16b). Las tres variantes alotípicas de este receptor,
denominadas FcγRIIIbHNA-1a, FcγRIIIbHNA-1b y FcγRIIIbHNA-1c, difieren
bioquímicamente entre sí en su secuencia aminoacídica y en el
patrón de glicosilación. El FcγRIIIbHNA-1a
porta el antígeno HNA-1a, elFcγRIIIbHNA-1b, al HNA-1b y el FcγRIIIbHNA-1c debido a la alta
homología con el FcγRIIIbHNA-1b porta tanto el antígeno HNA-1c como
el HNA-1b.
A nivel de la secuencia de aminoácidos entre el FcγRIIIbHNA-1a y
FcγRIIIbHNA-1b las diferencias son 4 sustituciones en los residuos 36,
65, 82 y 106 de la proteína madura (Figura 9). Además, el
FcγRIIIb
HNA-1b
presenta seis sitios potenciales de N- glicosilaciónfrente a los cuatro del FcγRIIIbHNA-1a, resultando en una diferencia de
peso molecular aparente de 65-80 kDa y 50-65 kDa
respectivamente. Los sitios adicionales de glicosilación están
localizados en dos de los cuatro residuos del dominio distal tipo-
inmunoglobulina que define los polimorfismos HNA-1 y su
interacción con la IgG. El FcγRIIIbHNA-1c es semejante al
FcγRIIIbHNA-1b excepto por un cambio de una alanina por una ácido
aspártico en el residuo 78. Este cambio no elimina la
inmunorreactividad HNA-1b, de manera que no puede considerarse
al antígeno HNA-1c antitético de los antígenos HNA-1a y HNA-1b.
FCGR3B
El gen FCGR3B que codifica al FcγRIIIb está localizado en el brazo
largo del cromosoma 1 (1q23) y consiste en 5 exones.
Los tres alelos que codifican para las variantes FcγRIIIbHNA-1a,
FcγRIIIbHNA-1b y FcγRIIIbHNA-1c, fueron denominados siguiendo las
recomendaciones internacionales como FCGR3B*1, FCGR3B*2 y
FCGR3B*3 respectivamente.
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El alelo FCGR3B*1 difiere del FCGR3B*2, en cinco nucleótidos en
las posiciones 141, 147, 227, 277 y 349. Cuatro de los cambios
nucleotídicos resultan en las diferencias en la secuencia
aminoacídica entre los antígenos HNA-1a y HNA-1b y el quinto
polimorfismo en la posición 147 es silencioso. Como era de esperar,el alelo FCGR3B*3 es idéntico al FCGR3B*2 excepto por la
substitución de una adenina por una citosina en la posición 266,
responsable del cambio en el residuo 78 del FcγRIIIb ya comentado.
Esta gran homología estaría indicando probablemente que el alelo
FCGR3B*3 surgió como resultado de una mutación puntual del
FCGR3B*2 .
Inesperadamente no todos los individuos poseen dos copias delFCGR3B. Muchos individuos caucásicos HNA-1c (+) presentan tres
locus FCGR3B, probablemente por duplicación génica. Como
contrapartida, existen individuos que presentan una deleción del
gen, que en su forma homocigota es responsable del denominado
fenotipo HNA-1 nulo (herencia recesiva), caracterizado por la
ausencia del receptor FcγRIIIb y de los antígenos HNA-1 en los
granulocitos.
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Fenotipo GenotiposProbables
Haplotipo Alelo
HNA-1a+,1b–,1c– FCGR3B*01/FCGR3B*01
FCGR3B*01/deleción
HNA-1a+,1b–,1c–
FCGR3B*01
HNA-1a–,1b+,1c– FCGR3B*02/FCGR3B*02
FCGR3B*02/deleción
HNA-1a–,1b+,1c–
FCGR3B*02
HNA-1a+,1b+,1c– FCGR3B*01/FCGR3B*02
HNA-1a+,1b+,1c–
FCGR3B*01
HNA-1a+,1b+,1c+ FCGR3B*01/FCGR3B*03
HNA-1a+,1b+,1c+
HNA-1a–,1b+,1c+ FCGR3B*03/FCGR3B*03
FCGR3B*03/deleción
HNA-1a–,1b+,1c+
FCGR3B*03
HNA-1a–,1b–,1c–(HNA nulo)
deleción / deleción HNA-1a–,1b–,1c–(HNA nulo)
deleción
Tabla 5
Figura 9. Representación esquemática de la sustitución de aminoácidosque resultan en las formas HNA-1a, -1b y -1c del FcγRIIIb. Reproducidocon autorización del Dr. Paul Metcalfe.
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Frecuencias
La frecuencia de los antígenos HNA-1a, HNA-1b y HNA-1c varía
considerablemente entre las distintas poblaciones caracterizadas. En
las poblaciones negras y caucásicas, el antígeno HNA-1b se
presenta más frecuentemente que el HNA-1a (75–90% vs 44–74%),mientras que en las poblaciones orientales y amerindias se da el
caso contrario (36-70 % vs 83-91%).
El antígeno HNA-1c se observa con una frecuencia alta en la
población africana negra (20-30%), mientras que en las poblaciones
orientales y amerindias el hallazgo del antígeno es excepcional. En
caucásicos la frecuencia de este varía entre 5 y 10%.
La incidencia de la deficiencia del FcγRIIIb (fenotipo HNA-1 nulo) esmuy baja en las poblaciones caucásicas (
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isoanticuerpos contra el mismo, capaces de causar una neutropenia
aloinmune neonatal.
HNA-2 (NB1)
El antígeno HNA-2a fue descrito en 1971 por Lalezari ycolaboradores como el antígeno especifico de neutrófilo ‘NB1’. El
antígeno HNA-2a es un antígeno de alta frecuencia en africanos,
asiáticos y blancos (Tabla 6). El HNA-2a está asociado a una
glicoproteína de 56 a 64 kDa anclada en la membrana plasmática e
intracelularmente en la membrana de pequeñas vesículas y gránulos
específicos a través de un grupo GPI.
Una característica distintiva del antígeno HNA-2 es su expresiónlimitada a una subpoblación de los granulocitos neutrófilos.
Los individuos tipificados como HNA-2 negativo y la subpoblación de
neutrófilos HNA-2 negativo muestran un fenotipo HNA-2 nulo, es
decir, sus neutrófilos son deficientes de la glicoproteína portadora.
Los aloanticuerpos formados por los individuos HNA-2 negativo son
por lo tanto isoanticuerpos.
Genética
Kissel y col secuenciaron el gen que codifica al antígeno HNA-2 y lo
localizaron en el cromosoma 19q13·2. Además, identificaron un
seudogén homólogo a los exones 4 a 9 de HNA-2a que se encuentra
adyacente, pero orientado en la dirección opuesta. El cDNA de HNA-
2 consiste en 1.311pb que codifican para 437 aminoácidos
incluyendo un péptido señal de 21 aminoácidos.
El fenotipo HNA-2-nulo parecería ser resultado de un splicing
incorrecto que resulta en un ARNm que contiene secuencias
intrónicas y un codón stop prematuro, mientras que la expresión
heterogénea fue atribuida a la falta de transcripción génica en una
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subpoblación de neutrófilos.
Expresión
El antígeno HNA-2 se expresa únicamente en los neutrófilos,
encontrándose en la membrana plasmática, en la membrana de losgránulos secundarios (específicos) y en las vesículas secretorias.
Durante la activación del neutrófilo, el CD177 se transloca desde las
vesículas secretorias y gránulos específicos a la membrana
plasmática. Se observa en neutrófilos desde el estadio mielocito en
adelante. El antígeno HNA-2 es el único antígeno expresado
heterogéneamente solo en una subpoblación de neutrófilos. El
tamaño de la subpoblación de neutrófilos HNA-2-positivo varíaindividualmente entre 0 a 100% con un promedio de 55 ± 22%. No
se encontraron diferencias entre caucásicos, afromamericanos y
orientales. La expresión de HNA-2 ha sido reportada mayor en
mujeres (63%) que en hombres (53%) y disminuída en mujeres
mayores pero no en hombres, sugiriendo que los estrógenos podrían
influenciar la expresión de HNA-2. Esto está de acuerdo con el
hecho que la expresión de HNA-2 aumenta durante el embarazo.
Función y significación clínica
El CD177 estaría involucrado en la adhesión de los neutrófilos al
endotelio y participaría de la migración transendotelial.
Recientemente, se ha demostrado que la subpoblación de
neutrófilos que expresa CD177 en su membrana plasmática también
expresa mPR3, la cual está usualmente localizada intracelularmente
(gránulos primarios y secundarios, vesículas secretorias). La función
de esta co-expresión entre CD177 y mPR3 en la membrana
plasmática se desconoce.
Se observa una significativa up-regulation de la expresión de HNA-2
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en pacientes con infecciones bacterianas y Policitemia Vera así
como en donantes de células hematopoyéticas estimulados con
factores de crecimiento. Es tentador especular que la co-expresión
de CD177 y mPR3 desempeña un papel especial en la respuesta
aguda de neutrófilo a una infección. Sin embargo, las personas HNA2-negativo cuyos neutrófilos carecen de la glicoproteína CD177 no
parecen presentar un mayor riesgo de infección.
HNA-3a (5b) y HNA-3b (5a)
Los antígenos HNA-3a y HNA-3b (llamados anteriormente sistema 5)
fueron descubierto por van Leeuwen et al en 1.964 usando
antisueros obtenidos de gestantes inmunizadas.La base molecular de este sistema fue establecida recientemente:
un cambio de un único aminoácido en la posición 154 de la CTL-2
(choline transporter-like protein-2) por una arginina confiere a esa
proteína una especificidad HNA-3a. En cambio, una glutamina define
el antígeno HNA-3b.
Este antígeno ha sido estudiado sólo en poblaciones caucásicas
donde se reportan frecuencias fenotípicas que varían entre 89 y
96%.
Los aloanticuerpos anti-HNA-3a son detectados frecuentemente en
casos muy graves de TRALI, particularmente en los casos fatales o
aquellos que requieren ventilación asistida. También pueden causar
reacciones febriles transfusionales y neutropenia aloinmune
neonatal. La capacidad de estos anticuerpos para causar la
aglutinación de los neutrófilos es tan característica que la técnica
más adecuada para su detección es la leucoaglutinación.
HNA-4a (MART)
El antígeno “MART”, ahora llamado HNA-4a, fue descubierto en
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1.986 en Estados Unidos por Kline et al durante una búsqueda
sistemática de anticuerpos antigranulocitarios en mujeres multíparas.
El HNA-4a resulta del cambio de una arginina en lugar de una
histidina en el residuo 61 de la subunidad αM (CD11b) de la familia
de las integrinas β2 (CD18), como consecuencia de un cambio de unúnico nucleótido (SNP) 230A>G en la secuencia codificante
(ITGAM*01 (230G)).
Ambas subunidades forman el complejo CD11b/CD18 (también
conocido como Mac-1, CR3 o αMβ2) que presenta un patrón de
herencia autosómico dominante y se expresa en granulocitos,
monocitos, células NK y en una subpoblación de linfocitos T.
Este complejo juega un papel muy importante en la adhesión de losleucocitos a las células endoteliales y plaquetas y también en la
fagocitosis. No se conoce el efecto del polimorfismo sobre la función
del complejo CD11b/CD18.
El antígeno HNA-4a presenta una frecuencia fenotípica alta en todas
las poblaciones estudiadas. Este antígeno está presente en el 99.1
% en la población norteamericana, 98.6% en la alemana, 99.5 % en
la australiana y 100 % en la población coreana y amerindia.
La incompatibilidad fetomaterna para el antígeno HNA-4a ha sido
reportada como responsable de un único caso de neutropenia
neonatal aloinmune. El complejo CD11b/CD18 es un blanco
frecuente de autoanticuerpos antigranulocitarios.
HNA-5a (OND)
El antígeno “OND”, ahora llamado HNA-5a, fue descubierto en 1.979
por Décary et al. Este antígeno está localizado en la cadena αL
(CD11a) de la familia de las integrinas β2.
El HNA-5a está definido por una sustitución de una arginina por una
treonina en el residuo 766 de la subunidad CD11a, como
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consecuencia de un cambio de un único nucleótido 2372HC>G en
la secuencia codificante (ALELO: ITGAL*01 (2372G))
El complejo CD11a/CD18 también conocido como LFA-1 o integrina
αLβ2 se expresa en granulocitos, monocitos y linfocitos T y B. Este
complejo funciona como una molécula de adhesión. No se sabe si lafunción de la integrina está influenciada por el polimorfismo HNA-5a.
El antígeno presenta una frecuencia fenotípica entre 65 y 96% en las
diferentes poblaciones estudiadas (Tabla 6).
TIPIFICACIÓN DE LOS ANTÍGENOS DE NEUTRÓFILOS
A) FENOTIPIFICACIÓN SEROLÓGICA Actualmente se disponen comercialmente de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra los antígenos HNA-1a, -1b y -2a que
son usados para fenotipar neutrófilos por inmunofluorescencia y
citometría de flujo. Esta última metodología es rápida, permitiendo
utilizar sangre entera en lugar de neutrófilos aislados.
B) GENOTIPIFICACIÓN
La genotipificación HNA es posible a partir de la determinación de
las bases moleculares de estos antígenos. Ésta puede realizarse
con ADN genómico obtenido de cualquier material celular. Esto es
muy importante, ya que elimina la necesidad de trabajar con
granulocitos frescos, permitiendo diferir la tipificación inclusive
meses; situación muy distinta al día que exige la extrema labilidad de
los granulocitos para su empleo en técnicas serológicas.
Numerosas técnicas basadas en PCR se han descrito para
caracterizar los HNA: PCR y posterior secuenciación, PCR-SSP,
RFLP, SSCP, SSO, LCR, mini-secuenciación, etc.
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Frecuencias poblacionales
Como ya se comentó, las frecuencias fenotípicas y génicas de
algunos aloantígenos de neutrófilos humanos han sido determinadas
en diversas poblaciones y se han observado entre ellas diferencias
en su distribución (Tabla 6).
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Tabla 6. Frecuencias antigénicas (%) y frecuencias génicas en diferentes poblaciones
PoblacionesHNA-1a(NA1)
HNA-1b(NA2)
HNA-1c(SH)
HNAnulo(NA nulo)
HNA-2a(NB1)
H
Negros africanos68
(0.43)78
(0.53)28–38
(0.12–0.21)2 98
Africanos americanos 46(0.31)
84(0.69)
23(0.12)
nd nd
Chinos90
(0.68)52
(0.31)0 nd
99(0.91)
Indios Asiáticos44
(0.30)83
(0.70)16 nd nd
Japoneses88
(0.65)51–64
(0.30–0.38)
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C2.1.2.3 DESCRIPCIÓN MOLECULAR DE LOS GRUPOS
SANGUÍNEOS ERITROCITARIOS
Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios. Clasificación y
nomenclatura
Hasta la fecha, la ISBT (Sociedad Internacional de Transfusión
Sanguínea) reconoce 339 aloantígenos eritrocitarios, de los cuales
284 han sido asignados individualmente a alguno de los 33 sistemas
de antígenos de grupo sanguíneo (ej. ABO, Rh, Kell, etc.) (Tabla 7).
El resto de los antígenos no incluidos en un sistema (por no disponer
de suficiente información genética), forman parte de las colecciones
o de las series 700 y 901.
En las últimas reuniones, el grupo de trabajo en terminología de
antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios de la ISBT incorporó
nuevos Sistemas y agregó nuevos antígenos a los sistemas Rh,
MNS, Kell, Scianna, Cromer, Indian, Knops, Dombrock y JMH. La
clasificación actualizada periódicamente puede consultarse en el
sitio Web del Laboratorio de referencia internacional de grupos
sanguíneos (IBGRL)
Sistemas de Grupos Sanguíneos
Cada sistema de grupo sanguíneo comprende uno o más antígenos
codificados por uno, dos o tres genes homólogos, muy cercanos y
con poca o ninguna recombinación entre ellos. Por tratarse de una
entidad genética discreta, los antígenos incluidos en cada sistema se
heredan independientemente del resto de los antígenos. Se han
utilizado muchos estilos para nombrar a los antígenos y sistemas de
grupos sanguíneos: letras mayúsculas (ej. A, B, M, N); letras
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mayúsculas y minúsculas para representar antígenos antitéticos (S,
s, K, k); letras como supraíndice (Fya, Fyb) y números Lu4, Lu9.
En 1.980 un grupo de trabajo de la ISBT propuso una nomenclatura
alfanumérica en la que cada sistema tiene un símbolo de entre una y
tres letras mayúsculas (ej. RH) y un número de tres dígitos (ej 004),
y cada antígeno del sistema tiene a su vez otros tres números. De
esta manera, cada antígeno es inequívocamente identificado con un
número de seis dígitos. Por ejemplo, el antígeno D del sistema Rh,
es identificado por el número 004001 y por el símbolo alfanumérico
RH1.
Finalmente, los fenotipos se escriben en el formato RH:-1,-2,-3, 4, 5
(donde el signo menos representa la ausencia del antígeno). Los
genes son escritos en el formato KEL3 y los genotipos son escritos
en el formato KEL1, 2/ -1, 2. Mucha gente que trabaja con los grupos
sanguíneos prefiere el uso de la notación clásica. La ISBT no
desalienta el uso de los símbolos tradicionales, pero recomienda que
se usen solo aquellos listados en las publicaciones de la sociedad.
Por ejemplo, el antígeno D del sistema Rh debe ser llamado RH1 o
D, pero no Rhesus y el antígeno K del sistema Kell debe ser llamado
KEL1 o K, pero no antígeno Kell o K1.
Colecciones de antígenos
Incluyen antígenos serológica y/o bioquímicamente relacionados,
pero que, hasta el momento, no pueden ser considerados como
sistemas de grupos sanguíneos. Se han descrito seis colecciones de
antígenos de grupo sanguíneos.
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La serie 700
Incluye antígenos de baja frecuencia (90%) en la mayor parte de las
poblaciones estudiadas, que no incluidas hasta el momento en
ninguna colección o sistema de grupo sanguíneo.
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Tabla 7. Sistemas de Grupo Sanguíneo.
N° y Símbolo(ISBT)
NombreN° de
antígenosNombredel Gen
Localizacióncromosómica
Producto del gen Porción
001 ABO ABO 4 ABO 9q34.2α1,3-N-acetilgalactosaminil-
transferasaα1,3-galactosil-transferasa
(acetil(1,3)
002 MNS MNS 46GYPAGYPBGYPE
4q31.21Glicoforina AGlicoforina BGlicoforina E
Glicoppaso
003 P1PK P1PK 2 A4GALT1 22q11.2-qter α4Gal (1-4)
004 RH Rh 52RHD;RHCE
1p36.11RhD
RhCEGlicopde pa
005 LU Lutheran 20 BCAM 19q13.32Basal Cell Adhesion Molecule
(BCAM)Glicoppaso
006 KEL Kell 32 KEL 7q34 Glicoproteína KellProteín
úni
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Tabla 7. Sistemas de Grupo Sanguíneo. (Continuación)
N° ySímbolo(ISBT)
NombreN° de
antígenosNombredel Gen
Localizacióncromosómica
Producto del genPorc
antigé
007 LE Lewis 6 FUT3; 19p13.3 α3,4-fucosyltransferasa-3 (FUT3) (3-4)Fuco
008 FY Duffy 5 DARC 1q23.2 Antígeno Duffy Receptor para
quimioquinas (DARC)Glicoprotede paso m
009 JK Kidd 3 SLC14A1 18q12.3Solute Carrier Family 14 member 1
(SLC14A1)Glicoprotede paso m
010 DI Diego 22 SLC4A1 17q21.31Solute Carrier Family 4 Anion
Exchanger (SLC4A1)Glicoprotede paso m
011 YT Yt 2 ACHE 7q22.1 Acetilcolinesterasa Proteína-
012 XG Xg 2XG
MIC2Xp22.33Yq11.21
glicoproteína XgGlicoprotepaso únic
013 SC Scianna 7 ERMAP 1p34.2Erythroblast Membrane-Associated
Protein(ERMAP)
Proteínasúnico tipo
014 DO Dombrock 7 ART4 12p12.3 ADP-ribosyltransferase-4 (ART4) Proteína-G
015 CO Colton 4 AQP1 7p14.3 Acuaporina-1 (AQP1)Proteína Tpaso múl
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Tabla 7. Sistemas de Grupo Sanguíneo. (Continuación)
N° ySímbolo(ISBT)
NombreN° de
antígenosNombredel Gen
Localizacióncromosómica
Producto del genPorc
antigé
016 LWLandsteiner-
Wiener3 ICAM4 19p13.2
Molécula Adhesión Intercelular-4(ICAM4)
Glicoprotepaso únic
017CH/RG
Chido /Rodgers
9C4B;C4A
6p21.3 Componente Complemento 4 Proteína S
018 H Hh 1 FUT1 19q13.33 α1-2-Fucosiltransferasa (1,2)Fuco
019 XK Kx 1 XK Xp21.1 Glicoproteína Kx Glicoprote
020 GE Gerbich 11 GYPC 2q14.3Glicoforina CGlicoforina D
Glicoprotepaso únic
021CROM
Cromer 16 CD55 1q32.2Factor acelerador de la degradación -
Decay-Acelerating Factor (DAF)Proteína-
022 KN Knops 9 CR1 1q32.2 Receptor del Complemento 1 (CR1) Proteínasúnico tipo
023 IN Indian 4 CD44 11p13 Glicoproteína relacionada In(Lu)-Glicoprotepaso únic
024 OK OK 3 BSG 19p13.3 BasiginaGlicoprote
paso únic
025
MER2RAPH 1 CD151 11p15.5
Monoclonal Eleanor Roosevelt-2
(MER2)
Glicoprote
de paso m
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Tabla 7. Sistemas de Grupo Sanguíneo. (Continuación)
N° ySímbolo(ISBT)
NombreN° de
antígenosNombreDel Gen
LocalizaciónCromosómica
Producto del GenPorc
antigé
026 JMH JMH 6 SEMA7A 15q24.1 Semaphorin-7A (SEMA7A) Proteína-G
027 I I 1 GCNT2 6p24.2 β 1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa(1,6)N-
Acetilgluc
028
GLOBGlobósido 1 B3GALNT1 3q26.1
β 1,3-N-
acetilgalactosaminiltransferasa
(1,3)N-
Acetilgala
029 GIL GIL 1 AQP3 9p13.3 Acuaporina-3 (AQP3)Proteína
paso m
030
RHAG RHAG 3 RHAG 6p21-qter Glicoproteína asociada al Rh
Glicoprot
de paso
031
FORSForssman 1 GBGT1 9q34.13
Globosido α-3-N-acétil-D-
galactosaminil transferasa
α-3-N-a
galacto
032
JRJR 1 ABCG2 4q22 Proteína ABCG2
Glicoprot
de paso
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Tabla 7. Sistemas de Grupo Sanguíneo. (Continuación)
033
LANLangereis 1 ABCB6 2q36 Proteína ABCB6
Glicoprot
de paso
034
VEL Vel 2 SMIM1 1p36.32 small integral membrane protein 1
Glicoprot
paso ún
035
CD59CD59 1 CD59 11p13 CD59 Proteín
Nota: Se conoce la base molecular de los 35 sistemas de grupos sanguíneos. Cada sistema representa un único y altamente homólogos. Las bases moleculares para todos los polimorfismos de los 30 sistemas son (glicosiltransferasas), proteínas de transmembrana (TM), proteínas ancladas a la membrana por un grupo gexternas (Chido-Rodgers). (+) Todas las glicosiltransferasas son proteínas de tipo II. * Porción antigénica se antígenos de grupo sanguíneo. Resaltado en gris aquellos sistemas de grupos sanguíneos que agrupan antígeno
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Estructura de los antígenos de grupo sanguíneo
Los antígenos de los sistemas de grupos sanguíneos ABO, H, Lewis,
I, P1PK y Globósido son de naturaleza glucídica (carbohidratos) y se
encuentran formando parte de glicoproteínas y glicolípidos. Sus
antígenos son productos indirectos de genes, ya que estos últimos
codifican glicosiltransferasas, que catalizan la adición de un azúcar a
un precursor. Estas enzimas no se expresan en la superficie celular,
sino que en esta última aparecen los cambios en la glicosilación.
Los antígenos de los restantes 24 sistemas son codificados
directamente por sus correspondientes genes que resultan en la
expresión de proteínas asociadas a la membrana. Estas pueden ser
proteínas de transmembrana de paso único tipo I (extremo N-
terminal exofacial) o tipo II (extremo C-terminal exofacial), proteínas
de transmembrana de paso múltiple, o proteínas ancladas a la
membrana por grupos glicosil-fosfatidil-inositol (GPI).
El polimorfismo que da origen a un aloantígeno de grupo sanguíneo
(porción de una molécula que es reconocida por el sistema inmune
de otro individuo de la misma especie) puede ser un cambio en la
molécula portadora tan pequeño como una variación de un único
aminoácido (ej. Fya y Fyb) o una diferencia de solo un monosacárido
(ej. A y B) o tan marcados como la presencia o ausencia de toda una
macromolécula (ej. RhD).
La gran mayoría de los cambios a nivel del ADN que llevan a la
génesis de un antígeno de grupo sanguíneo suelen ser un cambio
de un único nucleótido (SNP) con cambio de sentido (missense); que
resulta en la substitución de un solo aminoácido. De hecho, con laexcepción de los antígenos del sistema de grupo sanguíneo ABO, el
RhD y el P1, todos los antígenos clínicamente importantes son el
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resultado de SNP que llevan a la sustitución de un único aminoácido
(Tabla 8).
Tabla 8. Polimorfismos de grupo sanguíneo nacidos de SNPSistema Gen Polimorfismo SNPa Cambio
aminoacídicob
ABO ABO A/B 526C>G,703G>A,796C>A,803G>C
R176G,G235S,L266M,G268A
MNS GYPA M/N 59C>T,71G>A,72T>G
S20L,G24E(S1L, G5Ec)
GYPB s/S 143C>T T48M (T29Mc)RH RHCE C/c 48C>G,
178A>C,203G>A,307T>C
C16W,
I60L,S68N,S103P
e/E 676G>C A226PLU LU Lub/Lua 230G>A R77H
Aua/Aub 1615A>G T539AKEL KEL k/K 578C>T T193M
Kpb/Kpa 841C>T R281WJsb/Jsa 1790T>C L597P
FY FY Fya/Fyb 125G>A G42DFyb/Fy -67T>C -
JK SLC14A1
Jka/Jkb 838G>A D280N
DI SLC4A1 Dib/Dia 2561C>T P854LYT ACHE Yta/Ytb 1057C>A H353NSC ERMAP Sc1/Sc2 169G>A G57RDO DO Dob/Doa 793G>A D265NCO AQP1 Coa/Cob 134C>T A45VLW ICAM4 LWa/LWb 299A>G Q100R (Q70Rc)CROM DAF Tca/Tcb 155G>T R52L (R18Lc)KN CR1 Kna/Knb 4681G>A V1561M
McCa/McCb 4768A>G K1590EIN CD44 Inb/Ina 137G>C R46P
a Contando desde el primer nucleótido de inicio de la traducción (codónmetionina); b Contando del primer residuo de la proteína madura
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Cambios genéticos que conducen al antígeno de grupo
sanguíneo
Los mecanismos a nivel del ADN que dan origen a la diversidad
aloantigénica son muy variados. Sin embargo, algunos cambios son
más comunes que otros. Estos varían entre los sencillos SNP a otros
eventos moleculares más complejos tales como intercambios intra- e
intergénicos, inversiones, inserciones, deleciones y splicing
alternativo.
Estos cambios de nucleótidos pueden resultar en cambios de
aminoácidos y modificaciones en la estructura secundaria y terciaria
de la proteína. Algunas veces hay una pérdida total de expresión de
los antígenos de un sistema de grupo sanguíneo, denominada
fenotipo “nulo”.
SNP en exón
Si bien cualquier posición única dentro de un determinado gen
puede ser ocupada por uno de los cuatro nucleótidos posibles, los
SNP asociados a antígenos de grupos sanguíneos suelen involucrar
casi siempre dos nucleótidos.
Los SNP pueden situarse en regiones codificantes (exones), no
codificantes o en regiones intergénicas (entre genes).
Los SNP en exones son clasificados como sinónimos, con cambio
de sentido y sin-sentido.
Los SNP sinónimos no tienen efecto en el aminoácido expresado
pero pueden alterar la expresión.
Los SNP sin-sentido generan un codón stop, donde el polipéptido
resultante está truncado y generalmente no se expresa o resulta no
funcional. Sin embargo, la perdida de expresión o función puede
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depender de la ubicación del codón stop. Para antígenos de grupos
sanguíneos, las mutaciones sin-sentido cuando son heredados en
doble dosis (homocigota) están frecuentemente asociadas con
fenotipos ‘nulos’.
Los SNP con cambio de sentido resultan en la substitución del
aminoácido. Este cambio en la secuencia primaria de aminoácidos,
puede afectar la estructura secundaria, la terciaria e incluso la
cuaternaria. Los antígenos Fya y Fyb son un ejemplo del cambio
genético que más frecuentemente lleva a la generación de antígenos
de grupo sanguíneo.
SNP en intrón
El procesamiento del ARN es necesario para eliminar los intrones
del pre-ARNm. Las mutaciones en los sitios de splicing pueden
activar un sitio críptico y con ello incorporar toda una región intrónica
en el ARNm maduro como si se tratase de un exón. A este tipo de
inserciones se les conoce como pseudoexones.
SNP en región regulatoria
Los SNP que ocurren en la región promotora de los genes de grupo
sanguíneo pueden modificar o abolir la expresión de los antígenos.
El ejemplo mejor caracterizado es el SNP en el motivo GATA-1 del
gen Duffy donde se observa una distribución tisular alterada de los
antígenos de grupo sanguíneo Duffy en individuos de origen
africano. La alteración de la GATA-1 box resulta en la pérdida de
afinidad de la secuencia con el factor de transcripción GATA-1, elcual es necesario para la expresión de la glicoproteína en los
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glóbulos rojos. En este caso, la glicoproteína se expresa en otros
órganos y tejidos.
Inserciones y deleciones de nucleótidos
Durante la replicación del ADN (meiosis), los nucleótidos pueden ser
agregados (inserciones) o eliminados (deleciones) de una secuencia
por varios mecanismos y luego transmitirse a la siguiente
generación. Existen sólo unos pocos ejemplos en la genética de los
grupos sanguíneos de este grupo de cambios nucleotídicos, que
suelen provocar un cambio en el marco de lectura y finalmente a un
codón stop que interrumpe la traducción.
El resultado más frecuente de la deleción de un nucleótido es la
pérdida de expresión de la proteína.
Deleción génica
La deleción en doble dosis de un gen que codifica para los antígenos
de grupo sanguíneo de un sistema, resultaría en la pérdida de
expresión de éstos, llamado también “fenotipo nulo”.
Genes híbridos e intercambio de exones
Los loci que contienen más de un gen presentan con frecuencia
intercambios entre sí.
Proteínas modificadoras de la expresión
La glicoproteína Lutheran porta un gran número de antígenos de
grupo sanguíneo cuya expresión dependen del gen LU, situado en elcromosoma 19. Muy frecuentemente, la base molecular del fenotipo
Lu(a-b–) no se localiza en el locus LU sino que se debe a la
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presencia de un gen inhibidor dominante (independiente del gen LU)
aún no caracterizado: In (LU).
Función de las moléculas portadoras de los antígenos de
grupos sanguíneos
La membrana eritrocitaria contiene muchas proteínas que están
ancladas o cruzan la bicapa lipídica una o más veces. Muchas de las
proteínas en la superficie de los glóbulos rojos son polimórficas y
llevan los diferentes grupos sanguíneos.
La importancia biológica de las moléculas portadoras de muchos
antígenos de grupo sanguíneo se ha establecido experimentalmente,
o bien se ha inferido de su estructura (Figura 10). El estudio sobre
los fenotipos “nulos” que se producen en muchos sistemas de grupo
sanguíneo ha aportado gran cantidad de información a tal fin.
Las siguientes funciones se han atribuido a las moléculas portadoras
de los antígenos de grupo sanguíneo:
Transportadores de moléculas de importancia biológica.
Enzimas
Receptores de estímulos externos / adhesión celular
Reguladores de la activación del complemento
Anclaje de la membrana celular al citoesqueleto
Protección de las células contra daños mecánicos y ataque
microbiano (Glicocalix)
Algunas son transportadores de moléculas biológicamente
importantes a través de la bicapa lipídica: la Banda 3 (Sistema
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Diego) proporciona un canal de intercambio para HCO3− y Cl−; la
glicoproteína Kidd es un transportador de urea; la glicoproteína
Colton es un canal de agua (Acuaporina 1); la glicoproteína GIL
transporta glicerol (Acuaporina 3).
Las glicoproteínas Lutheran, LW e Indian (CD44) son moléculas de
adhesión, actuando especialmente durante la eritropoyesis.
El antígeno MER2 se encuentra en la molécula CD151 y asocia a
integrinas con la membrana basal.
La glicoproteína Duffy es un receptor de quimioquinas. Los
antígenos Cromer y Knops son polimorfismos del factor acelerador
de la degradación (CD55) y del receptor del complemento 1 (CD35),
respectivamente, que protegen a las células de la destrucción por
complemento autólogo.
Algunas glicoproteínas portadoras de antígenos de grupo sanguíneo
parecen ser enzimas con actividad acetilcolinesterasa (Sistema Yt),
endopeptidasa (Sistema Kell) y ADP-ribosiltransferasa (Sistema
Dombrock).
Los dominios C-terminal de las GPC y GPD (Sistema Gerbich) y el
dominio N-terminal de la banda 3 (Sistema Diego) están conectados
a los componentes del citoesqueleto y cumplen funciones de anclaje
a la membrana externa.
Las porciones glucídicas de las glicoproteínas y glicolípidos de
membrana, especialmente los de las glicoproteínas más abundantes
(Banda 3 y GPA), constituyen el glicocalix, un escudo extracelular
que protege a las células de daños mecánicos y del ataque
microbiano.Las proteínas Rh están asociadas con la glicoproteína RhAG en la
membrana de los glóbulos rojos, formando parte de un
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macrocomplejo que incluyen banda 3, LW, GPA, GPB y CD47. La
función de las proteínas Rh y RhAG no se conocen, pero se ha
propuesto que RhAG podría formar canal para el oxígeno y el
dióxido de carbono o posiblemente un canal transportador de iones
amonio o amoníaco.
Sin embargo, poco se sabe de la importancia biológica de los
polimorfismos de estas moléculas y hay muy poca evidencia que
sugiera una ventaja significativa de una variante alélica en particular.
Algunos antígenos de grupo sanguíneo son explotados por
microorganismos patógenos como receptores para adherirse a las
células y luego invadirlas, por lo que en algunos casos, la ausencia o
cambios en esos antígenos podrían ser beneficios (presión
selectiva). Es probable que la interacción entre las moléculas de
superficie celular y los microorganismos haya sido un factor
importante en la evolución de los polimorfismos de grupo sanguíneo.
Fi ura 10
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Sistemas ABO (ISBT N° 001) y Hh (ISBT N° 018)
El sistema de grupos sanguíneos ABO es por mucho el más
importante clínicamente, debido a la presencia de anticuerpos
regulares y naturales. La observación original por Landsteiner que
algunas suspensiones de eritrocitos humanos eran aglutinadas por
otros sueros humanos, llevo al reconocimiento de polimorfismo ABO.
Esta observación sigue siendo un siglo después la piedra angular de
la práctica de transfusión moderna.
Antígenos y su síntesis
Los antígenos ABH se expresan en glicoproteínas y glicolípidos y se
sintetizan por glicosiltransferasas que agregan secuencialmente
monosacáridos específicos a una estructura precursora compuesta
por oligosacáridos. El azúcar terminal determina la especificidad del
antígeno.
El antígeno A es sintetizado por una α1, 3-N-acetilgalactosaminil-
transferasa (o Transferasa A) y el antígeno B por una α1, 3-
galactosil-transferasa (o Transferasa B), ambas codificadas por el
gen ABO (alelos ABO*1 y ABO*2 respectivamente). Hay un tercer
alelo que codifica una proteína sin actividad enzimática (alelo
ABO*3). El sustrato de estas enzimas es el antígeno H, cuyo azúcar
terminal es una fucosa añadida a un sustrato precursor por una α1-
2-fucosiltransferasa codificada por el gen FUT1.
Las transferasas A y B se diferencian por la naturaleza de la
monosacárido añadida al antígeno H: N-acetil-D-galactosamina es
agregado por la transferasa-A y D-galactosa por la transferasa-B.
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antígeno especificado, por ejemplo, Ael, A3, Ax, B3, B(A) y cisAB.
Esto puede causar problemas para determinar el grupo ABO de
sangre; pero para los pacientes que necesitan transfusiones de
inmediato, la selección de glóbulos rojos O y plasma AB son una
opción válida.
El excepcional fenotipo eritrocitario Bombay (reportados por primera
vez en Bombay, India) carece de antígeno H y en consecuencia,
también de los antígenos A y B. Existen otras variantes con
expresión débil de H en los glóbulos rojos, con o sin antígenos H en
secreciones denominadas fenotipos para-Bombay.
B Adquirido
En raras ocasiones individuos de grupo A pueden adquirir la
expresión de antígenos B y presentarse como grupo AB, aunque el
antígeno B suele estar débilmente expresado y también hay algún
debilitamiento del antígeno A. En la mayoría de los casos, este
fenómeno se produce en pacientes con enfermedades del tracto
digestivo, generalmente con carcinoma de colon.
La explicación habitual del fenotipo B adquirido es que las enzimas
bacterianas quitan el gru
