Tema 1. Introducción histórica a la Microbiología

Concepto de MicrobiologíaLa microbiología es una ciencia que estudia los microorganismos, entidades acelulares y organismos unicelulares, pluricelulares o cenocíticos, que no poseen organización tisular, que no son visibles a menos que sean observados en un microscopio, y que se estudian mediante el método del “cultivo puro”

El objeto formal de esta ciencia es el estudio de la estructura, función, desarrollo, metabolismo, genética, comportamiento, ordenación taxonómica y evolución de los microorganismos, así como el estudio de éstos para su explotación y control.

Historia de la microbiologíaLos microorganismos fueron observados por primera vez por Antonie Van Leeuwenhoek (1674-1723) mediante microscopios muy simples con lentes de 300 aumentos construidas por él mismo. A los microorganismos que vio les denominó “animálculos”.

A mediados del siglo XIX se producen grandes avances en el campo de la óptica, y se perfeccionan los microscopios.

Carl Zeiss & Ernest Abbe. Avances en la fabricación de microscopios compuestos. Robert Koch (1877) observación de preparaciones de Bacillus antracis. Ziehl y Neelsen (1882) realizan una observación de Mycobacterium tuberculosis. Christian Gram (1884)desarrolla la tinción de gram (tinción diferencial) Loeffler. Tinción de flagelos.

Controversia sobre la generación espontáneaEsta teoría sostenía que la vida y, por tanto, los seres vivos, surgían espontáneamente de sustancias inanimadas; este hecho se podía comprobar fácilmente, por ejemplo, si se dejaba a la intemperie un trozo de carne: al cabo de un tiempo aparecían gusanos, que se habían originado por generación espontánea. En 1668, el médico toscano Francesco Redi demostró que estos gusanos procedían, en realidad, de los huevos depositados en la carne por las moscas, quedando abolida la teoría de la GE para los animales.

John T. Needham era partidario de la teoría de la GE en microorganismos. Llevó a cabo un experimento para apoyar dicha teoría. Hirvió caldo de carne para destruir a todos los microorganismos y vertió el liquido en un matraz que tapó herméticamente. Al cabo de varios días, el caldo estaba repleto de pequeños seres microscópicos que se habrían generado a partir del caldo. Poco más tarde, Lázaro Spallanzani realizó el mismo experimento, pero en este caso cerró el matraz herméticamente y después lo hirvió. Pasado un tiempo lo abrió y observó que la infusión estaba libre de microorganismos, lo que significaba que los que aparecieron en el experimento de Needham, procedían del aire.

En la 2ª mitad del s. XVIII se desarrollaron diversas teorías sobre la química de los gases (Lavoisier, Cavendish & Priestley) y se produjo además el descubrimiento del oxígeno, responsable de la vida. Esto contribuyó a volver a apoyar la teoría de la GE, puesto que se supuso que en el experimento de Spallanzani, al no haber oxigeno, no se podía dar la vida microbiana dentro del matraz.

La teoría de la GE fue definitivamente abolida por Louis Pasteur en 1859 al quedar demostrado que había microorganismos en el aire, responsables, en los experimentos antes citados, de la putrefacción de la carne. Pasteur desarrolló unos filtros de algodón que le permitieron obtener muestras de microorganismos al hacer pasar una corriente de aire a través de éstos. Además inventó unos matraces con cuellos especiales, que permitían la circulación de oxigeno, pero no el contacto entre el líquido y los microorganismos.

Algún tiempo después, John Tyndall y Ferdinand Cohn, establecieron una distinción entre especies de microorganismos termolábiles y especies termorresistentes. En estas últimas descubrieron la existencia de las endosporas bacterianas, estructuras muy resistentes al calor, y desarrollaron métodos de esterilización.

Papel de los Microorganismos en las transformaciones de la materia orgánica, inorgánica y en la producción de enfermedadesDiversos microbiólogos observaron que cuando los microorganismos crecían sobre materia orgánica realizaban transformaciones de dos tipos:

- Putrefacción: Proteínas descomponedoras- Fermentación: láctica, alcohólica o butílica (organismos anaerobios)

Pasteur observó que distintos tipos de bacterias producían distintos tipos de fermentación. Descubrió que los microorganismos anaerobios daban lugar a fermentaciones butílicas (Gen. Clostridium butiricum). Estableció entonces la clasificación entre seres vivos aerobios y anaerobios.

El científico Robert Koch (1881) contribuyó al desarrollo de las técnicas microbiológicas, al destacar la importancia de los cultivos puros o axénicos (que contuvieran un solo tipo de microorganismo). Para desarrollar este tipo de cultivos se empezaron a utilizar medios sólidos (usando gelatina y, posteriormente agar-agar gracias a Fanny &Walter Hesse)

Microorganismos como agentes biogeoquímicos

Martinus Beijerinck (1851-1931) desarrolló los cultivos de enriquecimiento, con los que fue capaz de aislar bacterias fijadoras de nitrógeno (Rhizobium & Azotobacter)

Sergei Winogradsky (1856-1953) descubre organismos quimiolitotrofos autótrofos, capaces de usar CO2 para formar materia orgánica sin usar la luz (bacterias)

Microorganismos como agentes productores de enfermedades

M.T. Berkeley (1845) comprobó que el mildiu de la patata era producido por la acción de un hongo.Agostino Bassi observó que la pebrina, la enfermedad de los gusanos de seda, también era producida por un hongo.

Oliver Holmes & Ignaz Semmelweis (1850). Son los primeros en darse cuenta de que la fiebre puerperal se daba mas en las mujeres que daban a luz en el hospital que en las que lo hacían en su casa. Esto se debía a que durante las operaciones los médicos transmitían el microorganismo por no contar con las medidas de desinfección necesarias.

Joseph Lister es considerado el padre de la cirugía aséptica. Propuso la utilización de soluciones desinfectantes (fenoles) para lavar heridas e instrumental tras cada operación.

Tras diversos estudios sobre carbunco Robert Koch observó por primera vez que un microorganismo, Bacillus anthracis, podía transmitirse al hombre y a otros animales. A partir de sus observaciones desarrolló las bases de la llamada “Teoría microbiana de la enfermedad”, que se compone de cuatro postulados principales (“Postulados de Koch de las enfermedades infecciosas”) que aún en la actualidad siguen vigentes:

- El microorganismo patógeno ha de estar presente en el individuo enfermo, pero nunca en el individuo sano.

- El microorganismo patógeno ha de ser posible de aislar en cultivo puro a partir de muestras obtenidas en el individuo enfermo.

- La inoculación de cultivos puros del microorganismo patógeno en animales sanos causará en estos la enfermedad.

- Al intentar reaislar el microorganismo patógeno del animal que ha enfermado, este ha de ser igual al primero observado.

Este científico realizó también diversos estudios con el agente causante de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Bacilo de Koch), del cual pudo obtener cultivos puros. A raíz de estos descubrimientos siguieron haciéndose muchos más, creándose en la época dos escuelas, la francesa, con Pasteur a la cabeza, y la alemana, con Koch como representante.

Descubrimiento de los virusAlgunas enfermedades no se podían asociar con microorganismos bacterianos.

Charles Chamberland ideó unos filtros que retenían bacterias. Inventó el autoclave. A partir de estos filtros, Dimitri Ivanovsky (1882) y Martinus Beijerink (1989) observaron que al filtrar jugos de plantas de tabaco enfermas, se obtenía un filtrado también enfermo, lo cual indicaba que existían organismos más pequeños que las bacterias, que no quedaban retenidos en el filtro y causaban enfermedad, los virus. Observaron en su caso el virus del mosaico del tabaco.

Loeffler y Frosch (1900) Virus de la Glosopeda. Frederick Twort (1915), Felix d’Herelle (1917) Bacteriófagos.

Wendell Stanley (1935)Cristalización del virus del mosaico del tabaco. Se demuestra entonces la naturaleza proteica de estos.

Delbrück, Luria y Hershey. Bacteriófagos T pares. Howard Temin. Hipótesis acerca de la replicación del Virus del Sarcoma de Rous.

Virus que poseen proteínas que transforman el RNA en DNA (Transcriptasa inversa) Se trata de virus oncogénicos.

Luc Montaigner (1983) y Robert Gallo (1984) Virus de la inmunodeficiencia humana.

Desarrollo de la Quimioterapia Paul Erlich. Bala Mágica. Salvarsán 606 (derivado del arsénico). Se usó para el

tratamiento de la sífilis Gerhard Dagmagk. Colorantes inhibidores de crecimiento de organismos.

“Prontosil Rubrum” ( sulfamidas) contra estafilococos y estreptococos. Alexander Fleming. En 1929 descubrió un medicamento producido por el hongo

penicillium notatum, la penicilina. Hoy en día se sabe que puede ser producida de otras muchas formas y por otros hongos.

Howard Florey y Ernst Chain (1940) Aislamiento de la penicilina a partir de cultivos de un hongo.

Waksman (1935) Descubrimiento de la actinomicina (1940), estreptomicina (1943) y la neomicina (1948)

Desarrollo de la Inmunología

Edward Jenner observó que las vaqueras estaban inmunizadas frente al virus de la viruela humana, al haber contraído una variante menos agresiva de esta enfermedad propia de las vacas. A partir de estas observaciones, a finales del s. XVIII, desarrolla las primeras vacunas atenuadas.

Louis Pasteur (1932) descubrió que con el tiempo un virus podía quedar atenuado. Desarrolló entonces la vacuna del cólera aviar.

Salmon & Smith. Observaron que tras la inoculación de organismos muertos también se generaba inmunidad.

Widal (1888) Vacuna contra la fiebre tifoidea Haffkine (1892) Vacuna del cólera Jaime Ferrán Clua (1852-1929) Vacunas contra la tuberculosis, cólera, rabia y

tifus.

Desarrollo de la Genética

Beadle y Tatum (1941) Teoría de un gen-una enzima. Delbrück & Luria (1943) Estudio de las mutaciones. James Watson & Frances Crick (1953) Descubrimiento de la estructura de doble

hélice del DNA. Boyer, Cohen & Berg (1972-1973) Clonación de genes. Gilbert & Sanger (1976) Secuenciación del DNA.

Kary Mullis (1988) Reacción de la polimerasa en cadena (PCR). “Thermus aquaticus” produce la TAQ polimerasa. Se trata de una arquea resistente a las altas temperaturas. Determinante para el desarrollo de la PCR

Secuenciación de genomas: Haemophilus influenzae (1995), Saccharomyces cerevisiae (1996), Genoma humano (2001)

La microbiología en la actualidad: Perspectivas de futuro

Lucha contra las enfermedades infecciosasNuevos métodos de diagnosticoTecnología de vacunasBúsqueda de nuevos fármacos

Agricultura y ganaderíaLos microorganismos como insecticidas biológicosBúsqueda de nuevas cepas fijadoras de nitrógenoLos microorganismos como suplemento en la alimentación animal

Industria alimentaria y biotecnológicaControl de calidadObtención de enzimas, vitaminas, ácidos orgánicosMejora de la producción de un determinado producto

MedioambienteParticipación en los ciclos de los elementosUtilización en el reciclado de basuras y depuración de aguasEliminación de contaminantes del sueloDecoloración y detoxificación de efluentes textiles, papeleros...

Diversidad microbiana

Entidades acelulares:

- Virus

- Virus satélites

- Viroides

- Virusoides

- PrionesEntidades celulares:

- Organismos Procariotas (bacterias y arqueas)

- Organismos Eucariotas (Hongos, algas y protozoos)

VIRUS

Están compuestos por una cubierta proteica en cuyo interior se encuentra el ácido nucleico (DNA o RNA). En ocasiones también se pueden presentar enzimas; Lisozimas (virus bacterianos), transcriptasa inversa (retrovirus). Algunos poseen también envuelta lipídica. Los virus precisan del mecanismo de una célula viva para multiplicarse, por ello se les considera parásitos intracelulares obligados.

En su ciclo de vida se alternan dos estadios principales:

- Estadio extracelular (Virión) Metabólicamente inerte. Su función es dispersar el virus.

- Estadio intracelular. Se inicia cuando el virus penetra en el interior de una célula. Entonces actúa como agente infeccioso.

Los virus pueden entrar en la célula de diversas maneras. En algunos casos sólo entra el ácido nucleico (virus bacterianos).Una vez en el interior se apoderan de la mecánica celular para transcribir sus proteínas y el resto de componentes que lo forman. El fin del proceso es la salida al exterior de los virus maduros tras la lisis de la célula.Los virus pueden provocar enfermedades tanto en animales como en plantas, así como a bacterias, hongos, algas...

VIRUS SATÉLITE

Poseen cápside y ácido nucleico. Para llevar a cabo su ciclo vital necesita la colaboración de otro virus. Esto es debido a que su ácido nucleico codifica sólo la información para sintetizar las proteínas de la cápside, pero no para formar el ácido nucleico. Por eso precisan el mecanismo de un virus colaborador.

Ej: Virus de la Hepatitis D. Sólo es infectivo si aparece su virus colaborador, el virus de la Hepatitis C.

VIROIDES (Diener, 1967)

Partícula infectiva formada por RNA de cadena simple y circular (es sólo un ácido nucleico) Su tamaño oscila entre los 200-400 nucleótidos.

En diversas zonas de la cadena se producen “apareamientos intracatenarios”, lo cual da lugar a estructuras alargadas. Estos plegamientos le permiten al viroide escapar de las RNAsas de la célula hospedadora.

Los viroides sólo se han observado en plantas. No codifican. Producen infecciones.

PRIONES

Partículas infectivas de naturaleza proteica. No poseen ácidos nucleicos. Son variantes conformacionales de las proteínas comunes (generalmente son producidas por las células nerviosas)

Ej. patologías priónicas: Encefalopatía es y otras enfermedades degenerativas.

Organización estructural procariota

No poseen núcleo. Su material genético se encuentra libre en el citoplasma. No existe membrana nuclear ni orgánulos intracelulares. Sólo poseen ribosomas (70S; 30S y 50S)La única membrana unitaria que poseen es la membrana citoplasmática. El resto de membranas no son unitarias.Rodeando a la membrana plasmática poseen una pared celular que les confiere rigidez (ésta difiere entre bacterias y arqueas) Poseen de 1 a 3 moléculas de DNA, circular o lineal. Se reproducen asexualmente siempre. La variabilidad genética la consiguen mediante procesos de conjugación, transformación, transducción, etc...

Se clasifican en 2 grandes dominios: Dominio Bacteria y Dominio Archaea

Organización estructural eucariota

Poseen membranas unitarias en orgánulos, orgánulos citoplasmáticos, membrana nuclear, más de un cromosoma (siempre lineal), reproducción sexual... Podemos dividir a los organismos eucariotas en:

Hongos

- Mohos filamentosos. (No poseen pared celular) Son estructuras pluricelulares que dan lugar a estructuras filamentosas las cuales generan el micelio del hongo. Tienen gran importancia en la industria farmacéutica, alimentaria, química, ...

- Levaduras. Organismos unicelulares (circulares u ovalados) Algunas especies son de gran interés en la industria alimentaria (Saccharomyces cerevisiae) y otras se consideran agentes patógenos (Candida albicans)

- Hongos mucosos. Poseen una estructura cenocítica. Se trata de un protoplasma multinuclear. Se hallan en la materia en descomposición y se alimentan de otros microorganismos que habitan ese ambiente.

Algas

Organismos unicelulares o pluricelulares. Fototrofos. Poseen pared celular aunque su composición es muy diferente a la de procariotas y hongos

Algas verdeazuladas algas, sino bacterias (cianobacterias)

Protozoos

Son móviles. No poseen pared celular. Son organismos unicelulares. Algunos son patógenos (Malaria, enfermedad del sueño,...)

Posición de los organismos en la escala biológicaEn la antigüedad se consideraban sólo dos grandes reinos:

- Reino Plantae (donde se incluían plantas, además de algas y hongos)

- Reino Animalia (incluía al resto de animales junto con bacterias y protozoos)

En 1866, Ernst Haeckel, incorpora el reino Protista, en él incluye a bacterias, algas, hongos y protozoos. Establece además un grupo secundario, dentro de éste, llamado Monera, en el que estaban incluidos los protistas sin núcleo (bacterias)

A principios del s. XX se desarrollan nuevas disciplinas científicas (avances en la genética, teoría de Darwin,...) lo cual propicia que las clasificaciones se vayan complicando. Se incorporan las relaciones evolutivas entre organismos.

En 1937, Chatton propuso 2 nuevos términos (sin carácter taxonómico) Son:

- Procariota: Organismo que no posee núcleo. Bacterias / Algas verdeazuladas.

- Eucariota: Organismos con núcleo (el resto)

En 1960, Whittaker, basándose en características estructurales (fenotípicas) y en la alimentación, hizo una división en 5 reinos:

Monera o Procariota, Protista, Fungi, Plantae y Animalia

Carl Woese propuso establecer las relaciones evolutivas entre los organismos (Filogenia) Y para ello utilizar los llamados “cronómetros moleculares”. Se trata de moléculas que aparecieron muy pronto en la evolución. Deben estar presentes en todos los organismos vivos, cumpliendo la misma función. Ej: RNA ribosómico.

Lo que Woese propuso fue la comparación de secuencias de estas moléculas de todos los organismos.

Ribosomas en eucariotas (80S): - 60S: 28S y 5S

- 40S: 18S

Ribosomas en procariotas (70S): - 50S: 23S y 5S

- 30S: 16S

(Las secuencias en negrita fueron las utilizadas para compararse en los estudios de Woese)

La clasificación que resultó de estos estudios fue la siguiente:

Dominio Bacterya, Dominio Archaea y Dominio Eukarya

Todos los organismos vivos proceden de un ancestro universal. Woese acabó con la dicotomía de Chatton. En los eucariotas establece dos líneas de evolución. En los procariotas sólo una.

Evolutivamente, Archaea y Eukarya son más parecidos entre sí que respecto al Dominio Bacterya (ver tabla comparativa de los 3 dominios. Figura 19.8)

En 1992 Cavalier-Smith considera características estructurales y relaciones filogenéticas en las clasificaciones. Proponen 2 Imperios divididos en 8 Reinos:

Imperio Bacterya:

- R. Eubacterias

- R. Arqueobacterias (Arqueas)

Imperio Eukaryota:

- R. Archeozoa

- R. Chromista

- R. Protozoa

- R. Fungi

- R. Animalia

- R. Plantae

Teoría del endosimbionte (ver esquema en Brock)

Se cree que un organismo eucariota primitivo se unió con una bacteria aerobia en una relación de simbiosis (la bacteria le procuraba energía a la célula a cambio de un medio donde vivir) Mitocondrias

Se aprecian además grandes similitudes entre mitocondrias y bacterias (coeficiente de sedimentación de los ribosomas, 70S, membranas...)

La misma teoría se podría aplicar al caso de los cloroplastos (bacteria fototrofa que se une a una célula eucariota)

Tema 2. Observación de microorganismos

Fundamentos del microscopio óptico

Dependiendo de la fuente de iluminación que utilicen van a clasificarse en diversos tipos.

La fuente de luz que utilizan es la luz visible (luz con longitudes de onda comprendidas en la región visible del espectro) Pueden ser: (2-D)

- Microscopio de campo claro - Microscopio de campo oscuro- Microscopio de contraste de fases

Utilizan la luz ultravioleta como fuente de iluminación: (2-D)

- Microscopio de luz ultravioleta- Microscopio de fluorescencia

Otros tipos de fuentes de iluminación o visualización: (3-D)

- Microscopio confocal de barrido láser- Microscopio de contraste de interferencia- Microscopio de fuerza atómica

Microscopio de campo claro

El campo microscópico aparece iluminado y la muestra puede observarse debido a las diferencias de contraste entre los objetos y el medio en el que se encuentran.En el microscopio de campo claro se observan tres sistemas de lentes:

- Condensador. Su función es dirigir los rayos de luz procedentes de la fuente hacia la muestra. Ésta se sitúa sobre una base llamada platina

- Objetivos. Captan la imagen y generan una ampliación de ésta. Se colocan sobre una pieza llamada “revólver”. Los hay de diversos aumentos (5x, 10x, 40x, 100x) El aumento de 100x, también llamado “objetivo de inmersión”, precisa de la aplicación de un aceite (“aceite de inmersión”) para poder visualizar la muestra.

- Oculares. Realizan una nueva ampliación de la imagen. Generalmente son de 10x o 15x. El aumento resultante es el del objetivo por el del ocular. (Aumento máximo: 1500)

Es importante considerar el poder de resolución (d) Nos da la idea de la capacidad que tiene el microscopio para ver la separación entre dos puntos próximos entre sí.

[d] = m d = (0,5 * ) / AN

AN: Apertura numérica. AN = n * sen

n = índice de refracción del medio existente entre la muestra y el objetivo ( 1 para el aire, 1,2 – 1,4 para el aceite de inmersión)

sen = seno del ángulo

= la mitad del ángulo que forma el objetivo con la muestra

A menor valor de “d”, mayor poder de resolución tendrá el microscopio. A menor longitud de onda, mayor será el poder de resolución. El valor de “d” más pequeño para el microscopio óptico es de 200 nm (0,2m)

Para visualizar bien los elementos de la muestra es necesario aplicar tinciones

(Microscopios con imagen bidimensional)

Microscopio de campo oscuro

El medio aparece oscuro y los elementos aparecen en claro. El condensador posee un disco con el centro opaco. A la muestra le llegan los rayos de luz de los lados, sólo la luz que dispersa la muestra es laque llega al objetivo.Poseen un mayor poder de resolución que los de campo claro. No es necesario teñir la muestra para poder visualizarla.

Microscopio de contraste de fases

Se ideó para aumentar el contraste entre el medio y la muestra. No es necesaria la tinción. Se consigue ver el interior de los organismos y algunas estructuras.El condensador está modificado así como los objetivos. Su acción se basa en las diferencias de densidad e índice de refracción de la muestra y del medio.Cuenta con un diafragma anular. Los rayos que salen de la muestra aparecen retardados unos con respecto a otros. Los objetivos acentúan esa diferencia.

Microscopio de fluorescencia

Se basa en la existencia de algunos compuestos capaces de absorber las radiaciones UV de onda corta, y capaces también de emitir luz visible (se trata de los fluorocromos)La luz de la fuente de alimentación será UV y el condensador de cuarzo (el cristal no permite el paso de la luz UV) Los portaobjetos también han de ser de cuarzo.La muestra ha de ser teñida con fluorocromos (naranja de acridina, isotiocianato de fluorosina,...)Ésta metodología es muy usada en las relaciones antígeno-anticuerpo, para su observación y determinación de antígenos presentes en una muestra.

Microscopio de luz UV

Es muy similar al de fluorescencia. La luz se emite en UV y se absorbe también en UV. Todos los sistemas de lentes son de cuarzo. La imagen ha de imprimirse en una placa fotográfica para poder ser visualizada.

(Microscopios con imagen tridimensional)

Microscopio de contraste de interferencia

Utiliza una fuente de luz polarizada. El haz de luz atraviesa un prisma y se divide en dos haces, los cuales inciden en la muestra por separado, volviéndose a combinar después en el objetivo.Debido a las diferencias entre los índices de refracción de las diversas partes de la muestra, la imagen resultante va a ser tridimensional. Se pueden observar estructuras como las endosporas en bacterias, formas y estructuras nucleares...

Microscopio de fuerza atómica

Posee una especie de aguja que se sitúa muy próxima a la muestra. Se crean fuerzas atómicas de repulsión entre la aguja y los electrones de la muestra. Ésta aguja recorre la preparación y va determinando la topografía de la muestra, que después será visualizada

en un ordenador. Las imágenes son muy similares a las del microscopio electrónico. No se precisa tinción.

Microscopio confocal de barrido láser

Es muy usado en ecología microbiana. Utiliza el láser como fuente de luz. Las imágenes son muy similares a las del microscopio de campo claro, aunque poseen mejor resolución y aparecen en tres dimensiones (profundidad de campo). Se precisa tinción fluorescente de la muestra.

Preparación y tinción de muestras

1. Fijar la muestra en un porta: Frotis

Se coloca una gota de agua y una alícuota del microorganismo en el porta. Ésta se extiende con el asa de siembra. Después se pasa el porta por la llama del mechero para que la muestra quede fijada (coagulación de las proteínas y muerte de los microorganismos)

2. Tinción

2.1 Tinción simple. Se utiliza un único colorante

Colorantes ácidos (-): Nigrosina, tinta china,...

Colorantes básicos (+): Azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina,...Los microorganismos aparecen cargados negativamente. Si añadimos un colorante

ácido, el medio se teñirá, pero no ocurrirá eso con los microorganismos. Si añadimos un

colorante básico, ocurrirá lo contrario.

En la tinción simple se usan generalmente colorantes básicos (Ej. Azul de metileno)

Una vez añadido el colorante (tras 2 minutos) se lava la muestra con agua, se deja secar,

y se observa al microscopio. En una muestra teñida de este tipo no se le pone cubre.

La tinción simple con colorante ácido se llama también tinción negativa. En estos casos

el frotis se realiza directamente sobre el colorante (no se añade agua) Además, no se fija

a la llama, sino que se deja secar al aire (para que el colorante no se cuartee)

2.2 Tinción diferencial. Se usan 2 colorantes. Nos permite diferenciar unos microorganismos de otros. Hay varios tipos:

- Gram (Hans Christian Gram, 1884)

- Ácido – alcohol resistente (tinción de Ziehl Neeseln)

Tinción Gram

La tinción Gram permite diferenciar a las bacterias gram + de las gram –. El colorante primario es el cristal violeta, el secundario o de contraste, la safranina.

Metodología del proceso:

Frotis (fijación con calor) / Adición del colorante primario y lavado tras 2 minutos. Seguidamente se añade un “mordiente” (Lugol: I2 / IK) Intensifica el color del colorante primario. Se mantiene un minuto y se retira / Se lava la muestra con alcohol, produciéndose una decoloración de los elementos que no hayan absorbido el colorante primario / Adición del colorante secundario o de contraste. Secado al aire y observación

Las gram + quedarán teñidas con el colorante primario, y las -, con el colorante secundario o de contraste.

Tinción “live bac light”

Se trata de una tinción diferencial para observar on fluorescencia a gram positivas (naranja) y gram negativas (verde)

Tinción ácido – alcohol resistente

Se utiliza para la observación de microorganismos de los géneros Mycobacterium y Nocardia. Estos organismos presentan hidroxilípidos en su pared celular, lo que impide la utilización de la tinción gram. (Hidroxilípidos: ácidos micólicos)

Metodología del proceso:Frotis (fijación con calor) / Adición del colorante (fucsina fenicada) / Se mantiene durante 5 minutos dándole calor al porta / se lava y se añade el alcohol ácido (HCl + etanol) dejándose reposar durante 30 segundos / A continuación se añade el colorante de contraste (azul de metileno) y tras un minuto se lava y se deja secar.

Se observarán células de color rosa intenso (resisten la decoloración con alcohol) o de color azul (no resistentes a la decoloración) Éstas últimas no pertenecen entonces a los géneros antes citados.

Tinciones especiales

Nos permiten ver estructuras de organismos:

- Tinción de cápsulas . Algunos microorganismos aparecen cubiertos por cápsulas (fácilmente solubles en agua) Para poder visualizarlas se utiliza un colorante ácido (tinta china) Se realiza un frotis y se añade safranina. Tras un minuto, la bacteria aparecerá teñida de rojo rosado, el medio aparecerá en negro y la cápsula se podrá ver como un hueco vacío (transparente, blanco)

- Tinción de esporas (Tinción de Wirtz / Tinción de Schaffer – Fulton) Los microorganismos del Género Bacillus forman endosporas. Para poder verlas se realiza la siguiente tinción. Se añade el colorante primario (verde malaquita) y tras 5 minutos aplicando calor se retira / con el calor se consigue que el colorante penetre en la espora / Después se añade el colorante de contraste (safranina) y tras 1 minuto, se retira. La espora aparecerá en color verde y la célula vegetativa, en color rojo rosado.

- Tinción de flagelos . Los flagelos sólo se pueden visualizar al microscopio electrónico y en el microscopio de campo oscuro. Para verlo al microscopio de campo claro se utiliza esta tinción. Se usa un mordiente, una sustancia que se deposita en el flagelo y engrosa su tamaño (ácido tánico + alumbre de potasio, precipitan proteínas) La bacteria se tiñe con fucsina fenicada (tinción de Gray) El organismo se observa rosado y el flagelo también.

Fundamentos del microscopio electrónico

El microscopio electrónico nos permite estudiar en detalle los microorganismos. La fuente de alimentación son los electrones. Utiliza lentes electromagnéticas. Todo el interior ha de estar en el vacío para que la imagen sea clara.

Microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.)

Se utiliza para observar en detalle las estructuras internas. Los haces de electrones se producen por calentamiento de tungsteno. Están dirigidos a la muestra. Éstos electrones chocarán con la muestra o la atravesarán, llegando a una pantalla fluorescente o placa fotográfica, en la que podremos visualizar la imagen.

Se observarán diferentes tonalidades de blanco y negro, en función de la densidad de materia de la muestra. Las zonas más densas aparecerán más oscuras, debido a que los electrones encuentran más resistencia para atravesar ese espacio, y es menor la cantidad que llega a la pantalla.

Las muestras han de ser tratadas para poder visualizarlas con el T.E.M. Se realiza una fijación utilizando glutaraldehído o tetraóxido de osmio/se deshidrata la muestra (acetona o alcohol) / se coloca en resina líquida (inclusión), para que al solidificar quede perfectamente inmersa la muestra / Para la observación se precisa filetear la muestra con el ultramicrotomo (se obtienen láminas de 20 – 60 nm de grosor) Por último se realiza una tinción con metales pesados para aumentar el contraste.

Éste es el microscopio con mayor poder de resolución, ya que la longitud de onda de la radiación de los electrones es 0,005 nm. (d = 0,5 nm Se pueden ver separados dos puntos que se encuentren a 0,5 nm)

Microscopio electrónico de barrido (S.E.M.) (d = 7nm)

Se ven las estructuras superficiales, nunca el interior. En este caso, los electrones que llegan no son los que atraviesan la muestra, sino los que emite la propia muestra.

Mediante el calentamiento del tungsteno, se emiten electrones que van hacia la muestra. Un haz secundario de electrones se dirige hacia la pantalla. La muestra precisa ser deshidratada (en acetona o alcohol). Punto crítico. Se sustituye la acetona o el alcohol por CO2

Se procede entonces a la colocación en unos discos, y recubrimiento con una mezcla de oro y paladio. Con esto se evita la aparición de cargas eléctricas.

Tema 3. Estructura y función de los organismos procariotas

CARACTERÍSTICAS GENERALES

El tamaño de los organismos procariotas varía entre 0,2 y 1 m de diámetro y 1 y 50 m de longitud.

Algunos autores consideran la existencia de nanobacterias (otros aseguran que son “artefactos”, no bacterias)

El tamaño es inversamente proporcional a la velocidad de intercambio de nutrientes con el medio (adquisición y excreción)

El metabolismo también es mucho más rápido, lo cual implica un crecimiento también muy rápido.

Es importante la relación superficie / volumen. A menor tamaño, mayor será esta relación, por lo tanto, el transporte será mucho más eficaz en bacterias pequeñas.

Se definen 3 formas clásicas:

Circular (Cocos) (Ej. Estreptococcus)

Cilíndrica o alargada (Bacilos) (Ej. G. Bacillus)

Espiral:

o Espiral rígida (Spirillum)

o Espiral flexible (Espiroquetas)

o Espiral incompleta (Vibrios)

Hay también otras formas (bacterias pedunculadas, bacterias filamentosas, etc.)

Se pueden observar diferentes agrupaciones de células individuales:

Cocos

o Diplococos (Neisseria)

o Estreptococos (Streptococcus)

o Tétradas (Micrococcus)

o Grupos de 8 células (G. Sarcina)

o Formación de racimos (G. Staphylococcus)

Bacilos. Se dividen por su eje más corto

PARED CELULAR

La pared celular es una estructura compleja, semirígida, que rodea la membrana plasmática. Protege a la célula de las agresiones externas. Le confiere forma e impide la entrada de agua en la célula por acción de la presión osmótica. Constituye un punto de anclaje para las estructuras bacterianas (flagelos, etc.) y es diana de antibióticos, es decir, se usa para acabar con determinados organismos patógenos. Difiere entre bacterias y arqueas.

D. BACTERIA

Bacterias Gram negativas y Gram positivas poseen una pared celular diferente. Un elemento común en ellas es el peptidoglucano. Se trata de una estructura compuesta por:

Un heteropolímero de 2 aminoazúcares acetilados (N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina) unidos entre sí por enlaces b(1-4). Forman las cadenas de glucano

Aminoácidos que constituyen un tetrapéptido, el cual se une siempre al N-acetilmurámico. Los aminoácidos del tetrapéptido varían de unos organismos a otros, pero la combinación más frecuente es:

En Gram negativas: L-alanina, D-glutámico, ácido diamino-pinélico (DAP), D-alanina. (el DAP es similar a la lisina y es exclusivo del D. Bacteria)

En Gram positivas: L-alanina, D-glutámico, L-lisina, D-alanina.

Los tetrapéptidos adyacentes tienden a unirse entre sí (ver dibujo), dándole a la estructura un aspecto de malla. Las uniones más frecuentes son entre el 3er aminoácido de una cadena con el 4º aminoácido de la cadena adyacente. Esto se da sólo en la pared del cuerpo.En Gram positivas algunas veces se observan enlaces directos. También abundan las uniones mediante enlaces peptídicos (nunca se han observado puentes con aminoácidos aromáticos o azufrados)Los peptidoglucanos le confieren rigidez a la pared celular por su composición y estructura. Las variaciones se dan en los puentes peptídicos. Aparecen D-aminoazúcares, lo cual no ocurre en otras proteínas (aparecen normalmente sólo formas L)

ESTRUCTURA

Bacterias Gram positivas

Componentes principales:

- Peptidoglucano o mureína. Constituye hasta el 90% del peso de la pared. Presenta una gran cantidad de uniones interpeptídicas, lo que le da un aspecto compacto a la matriz.

- Ácidos Teicoicos. Polímeros de glicerol o ribitol, unidos por enlaces fosfodiester. Están constituidos por unas 10 unidades, las cuales llevan en ocasiones diversos constituyentes (D-alanina, azúcares tales como la glucosa, la galactosa, N-acetilglucosamina, etc.)

Los ácidos teicoicos aparecen unidos covalentemente al peptidoglucano. En algunas bacterias existen los denominados ácidos lipoteicoicos (polímeros de glicerol unidos mediante enlaces fosfodiester), que aparecen unidos a la superficie de la membrana plasmática.

Ácidos teicoicos y lipoteicoicos son los que proporcionan las cargas negativas a los microorganismos, por el fosfato de los enlaces. Gracias a esta propiedad, también se les

pueden unir metales. Además, favorecen el paso de cationes (fundamentalmente Magnesio, responsable de la estabilidad de la pared). Pueden funcionar también como antígenos de superficie. Son capaces de desencadenar una respuesta inmune (esta propiedad se utiliza en el diagnóstico de microorganismos). Son propios de bacterias gram positivas.

Algunas bacterias gram positivas (G. Nocardia, G. Mycobacterium) presentan en su pared ácidos micólicos (hidroxilípidos), que aparecen unidos al arabinogalactano.

Bacterias Gram negativas

- Peptidoglucano o mureína. No llega a representar más del 10% del peso de la pared. Presentan menos uniones interpeptídicas, adquiriendo la matriz un aspecto laxo, menos grueso.

- Membrana externa. Es similar a la membrana plasmática (unitaria, con fosfolípidos y proteínas transmembrana,...), aunque con algunas diferencias:

Muchos de los lípidos de la pared más externa de la bicapa están sustituidos por lipopolisacáridos. Se trata de unas estructuras que varían de unos organismos a otros. Tienen tres partes principales (ver esquema en fotocopias):

Lípido A: Ácidos grasos saturados (murístico / esteárico) unidos mediante enlaces esteramino a un dímero fosforilado de N-acetilglucosamina.

CORE: Unido al carbono 6 de la NAG se encuentra un compuesto específico de las bacterias gram negativas, el KDO (cetodesoxioctonato), junto con azúcares de 7 carbonos (muchos de ellos fosforilados) y azúcares de 6 carbonos (glucosa, galactosa, NAG, y algunos variables,...)

Polisacárido O: Formado por azúcares de 6 carbonos que también pueden variar y azúcares raros (desoxiazúcares) tales como la abecuosa, paratosa, tivelosa, etc.

Las secuencias de hexosas y desoxiazúcares se van repitiendo en unidades de 4 o 5 azúcares. Esta parte va a tener también un papel antigénico (como los ácidos teicoicos de las gram positivas) y se va a utilizar en el diagnóstico de microorganismos.

También hay lipoproteínas que unen la membrana externa con el peptidoglucano.Existen además unas proteínas llamadas porinas que permiten el paso de determinadas moléculas (canales de transporte). Están formadas por 3 subunidades que dejan un poro central por el que pasan las moléculas pequeñas al interior de la célula.

La membrana externa de las gram negativas es tóxica para animales y para el ser humano. Ello es debido al polisacárido, que se considera una endotoxina. La lisis de la bacteria y la consiguiente descomposición del lipopolisacárido provoca fiebre.

Protoplasto: Bacteria (u organismo) que ha perdido por completo su pared celular. Son de tamaño reducido por lo general y de aspecto redondeado.

Esferoplasto: Bacteria (u organismo) que no ha perdido la pared celular por completo, tan solo una parte. También son redondos.

Para mantenerlos se precisan condiciones osmóticas constantes que impidan el hinchamiento con agua de éstas.

Lisozimas. Enzimas hidrolíticas que rompen los enlaces B(1-4) (perdiéndose la pared celular de las bacterias). Se pueden hallar en la saliva, lágrimas, clara de huevo...

D. ARCHAEA

Componentes principales:

- Pseudopeptidoglicano o Pseudomureína. Se trata de NAG y NATalosaminurónico (en vez de NAMurámico) unidos por enlaces B(1-3). La lisozima no tiene efecto sobre la pared de las arqueas por presentar este tipo de enlaces.

Otros componentes de la pared son proteínas, glucoproteínas o glucolípidos. El pseudopeptidoglicano puede aparecer en algunos casos, aunque no es propio de todas las arqueas.

ORGANISMOS SIN PARED

Poseen membranas plasmáticas especiales. Algunos de ellos poseen esteroles (como las células eucariotas). Ej: Micoplasmas (D. Bacteria)Hopanoides. Se trata de estructuras lipídicas que le dan rigidez a las membranas de los procariotas sin pared. Ej: Thermoplasma (D. Archaea)

ESTRUCTURAS SUPERFICIALES

GLICOCÁLIX

Algunas bacterias y arqueas secretan unas sustancias viscosas que se sitúan en la periferia de la pared celular. Son de naturaleza polisacarídica (o también proteica). Si ésta sustancia está bien organizada y bien unida a la pared celular, se le denomina cápsula. Si la sustancia no está bien organizada, se le denomina capa mucosa (o slime).

Ej. Bacillus Anthracis posee una cápsula formada por ácidos glutámicos (naturaleza proteica) aunque fundamentalmente suelen estar compuestas por polisacáridos.

Funciones del glicocálix: Favorece la adherencia a superficies y a otros microorganismos. Protege al microorganismo de la desecación. En algún momento se puede utilizar como fuente de alimento. La cápsula es un factor de patogeneidad, protege a los organismos de ser

fagocitados. Puede hacer que una especie sea patógena sólo por tener cápsula.

CAPA S

Está formada fundamentalmente por proteínas. Aparece por fuera de la pared celular. Tiene una disposición bidimensional. Se encuentra en muchos organismos del D. Bacteria y en todas las arqueas. Se trata de una lámina plana que constituye, en muchos casos, la pared celular de las arqueas. También se llama capa paracristalina. Puede tener diversas simetrías (hexagonal, tetrámeros, trímeros, etc.)

FIMBRIAS Y PELOS

Apéndices largos de naturaleza proteica que se encuentran alrededor de la bacteria en un elevado número (1000). Se han encontrado en bacterias gram negativas. Siempre son más cortos que los flagelos (observables a microscopio electrónico).Poseen una parte cilíndrica que aparece inmersa en la membrana externa. Después le sigue el apéndice y en su extremo aparece una zona adhesiva. Las fimbrias están implicadas en la adhesión, nunca en el movimiento. Son un factor de patogeneidad en muchos organismos (pueden determinar que un organismo sea patógeno o no)

Algunos autores consideran que las fimbrias son iguales que los pelos. Los pelos, también de naturaleza proteica, aparecen en menor número.

La función de los pelos tiene que ver con la conjugación, la transferencia del material genético. Los plásmidos son transmitidos desde una bacteria “donadora” a otra “receptora” a través del pelo. El que una bacteria tenga pelos o no, no está codificado en los plásmidos. Otra función es la de receptores de los fagos.

FLAGELOS

Son estructuras implicadas en el movimiento de la célula. Existen otros medios locomotores (vesículas de gas, deslizamientos,...)Los flagelos son filamentos largos, de naturaleza proteica, con estructura helicoidal. Se pueden disponer en un polo (disposición polar) o alrededor de toda la célula (disposición peritrica)

Flagelo monotrico

Flagelo anfitrico

Flagelo lofotrico

Su longitud es de 5 – 10 m y su diámetro, normalmente, de unos 20 nm (el diámetro varía según la especie, así como la anchura de la hélice)

Están formados por tres unidades:

Cuerpo Basal: Está formado a su vez por 4 anillos de naturaleza proteica dispuestos alrededor de un eje. Hay 2 anillos internos situados en la membrana plasmática,

llamados anillos MS, y 2 anillos más externos llamados anillos LP. El anillo P está inmerso en el peptidoglucano, el anillo L, en la membrana externa.

Gancho: Es de naturaleza proteica. Su función es unir el cuerpo basal y el filamento. Está formado principalmente por una proteína llamada Flagelina. Se trata de una proteína globular cuyo peso molecular varia entre 15 – 60 kDa.

o Proteínas Mot : Situadas entre el anillo M y el anillo S. Canalizan la salida y entrada de protones para que la fuerza protón-motriz pueda mover el flagelo. Son canales membranosos..

o Proteínas Fli : Situadas alrededor de los anillos MS. Actúan como conmutadores, cambian el sentido de rotación del flagelo.

Filamento(Las bacterias Gram + no tienen anillos LP)

ESPACIO PERIPLÁSMICO

Espacio existente entre la membrana externa y la membrana plasmática. (espacio donde se encuentra el peptidoglucano) (ver membrana gram negativas)

En las bacterias gram positivas, es la región comprendida entre la membrana plasmática y el peptidoglucano.

En él podemos encontrar los siguientes elementos:

Enzimas hidrolíticas: degradan parcialmente los nutrientes antes de ser asimilados por la célula

Proteínas de enlace: para facilitar el transporte de sustratos Quimiorreceptores: moléculas que responden ante un determinado estímulo químico

(taxia o taxis)

MEMBRANA PLASMÁTICA

Es la estructura que rodea el citoplasma de la célula. Responde al modelo unitario de bicapa lipídica con proteínas transmembranales. Sólo en la membrana de algunos procariotas se pueden observar hopanoides y esteroles (en aquellos que no tienen pared celular)Las arqueas poseen una membrana de glicerol unido a cadenas de isoprenoides ramificados mediante enlaces éter. A este tipo de lípidos se les denomina fitanos o fitanil o glicerol diéter.

En bacterias termófilas se observa el diglicerol tetraéter (bifitanil), formado al fusionarse las dos partes de la bicapa, formando una monocapa.

La función de la membrana plasmática es la misma que para células eucariotas (barrera semipermeable, para mantener la forma de la célula,...)

CITOPLASMA

La mayor parte del citoplasma es agua (+ del 70%)

Posee ribosomas 70S:

50S- ARNr (23S, 5S)- Proteínas (34)

30S- ARNr (16S)- Proteínas (21)

Los ribosomas aparecen inmersos en el citoplasma o muy cerca de la membrana plasmática.

- Chaperonas: son proteínas implicadas en el plegamiento de otras proteínas. Ayudan a que otras proteínas adquieran su estructura cuaternaria. También están implicadas en la corrección de plegamientos erróneos o en el transporte de sustancias.

En la región nuclear es donde se encuentra el material genético. Se denomina nucleoide y no aparece membrana nuclear alrededor. Las células procariotas poseen de 1 a 3 cromosomas, lineales o circulares, de cadena simple. Algunos procariotas también poseen plásmidos (moléculas de DNA circular duplexo, que se replican de forma independiente al cromosoma principal) Éstos les proporcionan ventajas de resistencia frente a metales pesados, antibióticos, etc. La posesión o no de plásmidos puede determinar la patogeneidad de ciertos procariotas.

INCLUSIONES DE RESERVA

Acúmulos de sustancias que sintetizan los organismos en determinadas condiciones de crecimiento. Aparecen en el citoplasma, rodeadas o no de una envoltura (de naturaleza proteica)

Inclusiones de Reserva Orgánicas

- Glucógeno o almidón (según la especie). Polímero de reserva de carbono que se acumula cuando escasea el nitrógeno.

- Cianoficina. Polímero de reserva de nitrógeno muy común en las cianobacterias (fototrófas oxigénicas?). Se trata de un copolímero de ácido Aspártico y Arginina. Está formado por un núcleo central de Asp, el cual posee un carboxilo al que se une el grupo amino de Arg.

- Gránulos de poli--Hidroxibutirato (PHB). Son poliésteres de ácido b-hidroxibutírico. También es un polímero de reserva de carbono, y se va a sintetizar cuando halla deficiencia de nitrógeno.

Actualmente se sabe de la existencia de poli--Hidroxialcanoatos (PHA) (nombre genérico del grupo de sustancias entre las cuales se encuentran los PHB’s) Algunas bacterias que crecen en presencia de n-octano, sintetizan un PHA denominado poli--hidroxioctanoico, un polímero con propiedades termoplásticas, comercializado para la fabricación de envases plásticos (Biodegradable!)

- Algunos organismos, fundamentalmente los actinomicetos (bacterias filamentosas), acumulan hidrocarburos de distintos tamaños que pueden utilizar como nutrientes.

Inclusiones de Reserva Orgánicas

- Gránulos de Polifosfato o Volutina, o corpúsculos metacromáticos. Se trata de grupos fosfato unidos por enlaces ester, que constituyen una reserva de fósforo para la célula. Se empiezan a sintetizar cuando otro nutriente esencial escasea. Frente a determinadas tinciones (con colorantes básicos como el Azul de Metileno o el Azul de Toluidina) pueden cambiar de color y tornarse púrpuras o rojizos. Se pueden encontrar en bacterias del género Lactobacillus.

- Inclusiones o gránulos de azufre. Se encuentran en bacterias fototrofas (Ej. Bacterias Púrpura) y en algunos quimiotrofos (Ej. G. Beggiatoa) Estas bacterias utilizan en SH2

como donador de electrones en la fotosíntesis o en otros procesos metabólicos.

SH2 S SO4-

La primera oxidación es más rápida, por eso se producen acumulaciones de S en gránulos o inclusiones.

ORGÁNULOS

Los orgánulos de las células procariotas no poseen membranas unitarias, excepto en el caso de los tilacoides (presentes en cianobacterias)

CLOROSOMAS

Orgánulos rodeados por una membrana proteica. Se encuentran presentes en las “bacterias verdes” (bacterias fototrofas de fotosíntesis anoxigénica) Almacenan los pigmentos antena necesarios para la fotosíntesis. Estos orgánulos se encuentran por debajo de la membrana plasmática y a veces aparecen unidos a ella por un pedúnculo. Tienen forma ovalada.

CARBOXISOMAS

Orgánulos que se encuentran en las bacterias autótrofas y quimioautótrofas. Almacenan solamente la encima RubisCo (esencial para la fijación del CO2 en el ciclo de Calvin). Tienen forma poliédrica y aparecen rodeados por una membrana proteica.

MAGNETOSOMAS

Orgánulos sensores del campo magnético. Les permiten a las bacterias orientarse en el campo magnético terrestre. Las bacterias microaerófilas (viven en condiciones de bajas concentraciones de oxígeno) y anaerobias poseen estos orgánulos.

Suelen estar formados por cristales de magnetita (Fe3O4) Las bacterias que viven en ambientes ricos en azufre tienen magnetosomas formados por cristales de greignita (Fe3S4) o pirita (FeS2)Los cristales se suelen disponer siguiendo el eje longitudinal de la bacteria, en cadenas más o menos cortas. Esto les permite moverse a lo largo en los sedimentos en busca de las condiciones más idóneas.

VESÍCULAS DE GAS

Orgánulos de bacterias acuáticas. Les permite moverse en la vertical (Ej. Cianobacterias) Aparecen también en algunas arqueas. Tienen forma hexagonal, con el extremo en forma de pirámide truncada. Suelen aparecer unidas por uno de sus lados. Las vesículas aparecen rodeadas por una membrana proteica formada por dos proteínas:

GvpA. Es la proteína mayoritaria. Es de carácter hidrófobo. Se dispone en bandas. GvpC. Unen transversalmente a las anteriores

Estas proteínas son permeables a los gases, pero no al agua ni a los solutos. Les permite a las bacterias buscar lugares ricos en nutrientes.

ESTRUCTURAS ESPECIALES (De Resistencia)

ENDOSPORAS

Estructuras especiales que se encuentran en algunas especies del D. Bacteria, fundamentalmente en las bacterias gram negativas. Sus características son:

Son llamadas endosporas porque se forman en el interior de la célula (célula madre o célula vegetativa)

Son muy refringentes al microscopio óptico. Se precisan métodos especiales para teñirlas (tinción con calor) Al estado de latencia se le denomina también estado de Criptobiosis Se forman al final de lo que se denomina “fase exponencial de crecimiento” del

organismo, es decir, la esporulación responde a la falta de nutrientes (C, N, P) Cada célula vegetativa produce una única endospora (centra, terminal o subterminal) La espora puede o no deformar a la célula vegetativa (deformantes o no

deformantes)(Estos dos últimos aspectos son característicos de cada especie)

Los organismos que esporulan son generalmente de tipo bacilar (G. Bacillus, G. Clostridium) Aunque también hay otros casos (G. Sporosarcina es de tipo coco)

Suelen aparecer en ambientes naturales extremos o poco propicios.

Composición y estructura de una endospora

1. Protoplasto o Core. Es la parte más interna de la espora. Está rodeado por la membrana esporal interna. En él encontramos: DNA, ribosomas, ARNpolimerasa, ácido 3-fosfoglicérico, mono y dinucleósidos, nunca trinucleósidos (ATP no necesario,

porque se forma a partir del ácido 3-fosfoglicérico) No va a haber proteínas o enzimas relacionadas con el metabolismo, puesto que la endospora es una estructura latente. También encontramos unas proteínas llamadas SASP’s, ácidos solubles que se suelen unir al DNA para protegerlo de las radiaciones UV. Cuando llega el momento de la germinación, estas proteínas se hidrolizan para dar aminoácidos, necesarios como nutrientes o como componentes de las proteínas responsables de la síntesis de la futura célula vegetativa. Dentro del protoplasto encontramos grandes cantidades de Ca2+ y ácido Dipicolínico (agente quelante, es decir, captador de cationes, en este caso de calcio) Ambos se unen para formar el Dipicolinato cálcico (compuesto exclusivo de endosporas) Hace que el protoplasto esté muy deshidratado, lo cual hace a la endospora más resistente al calor.

2. Pared celular. Se trata de una fina capa de peptidoglucano que aparece unida a la membrana esporal interna. Constituye el germen de la pared celular de la futura célula madre.

3. Cortex o corteza. Está formado por un peptidoglucano especial más laxo que el de la pared celular (con menos uniones interpeptídicas) El 15% de las subunidades de NAM-NAG solo tienen el 1er aminoácido (Ala); un 30% tienen todo; el 55% restante tiene una unidad llamada lactama. Ésta confiere una gran resistencia a la corteza. Hace posible que la espora no sea hidrolizada por las Lisozimas

4. Membrana esporal externa.

5. Cubiertas. Están formadas por proteínas muy hidrófobas (Ricas en cisteina) Esto hace que la espora sea muy resistente a los compuestos químicos

6. Exosporio. Es una capa opcional. Está compuesto por proteínas, glucoproteínas y lípidos.

Proceso de esporulaciónCuando empiezan a escasear los nutrientes esenciales para el organismo procariota (C, N, P) se ponen en marcha una serie de mecanismos

1. El microorganismo empieza a generar flagelos que le permitan desplazarse a zonas con más nutrientes.

2. Síntesis de enzimas intracelulares que le van a permitir a la célula utilizar sustratos que en otras condiciones no utilizaría (Ej. Acetato)

3. Se sintetizan enzimas extracelulares que van a degradar sustratos que haya en el medio externo para posteriormente, incorporar los nutrientes al interior.

4. Esporulación. Se va a estudiar en Bacillus Subtilis. Dura aproximadamente 8 horas, durante las cuales se distingues 7 fases principales y 1 fase inicial (fase 0) en la que la célula aparece con 2 cromosomas (no puede dividirse por falta de nutrientes, por eso esporula) Fases de la esporulación:

I. Los 2 cromosomas se condensan y forman el filamento axial, que se localiza en el eje longitudinal de la célula.

II. En un polo de la célula se empieza a generar un septo en el que sólo está implicada la membrana plasmática (no la pared celular) La célula queda dividida entonces en 2 partes de distinto tamaño. Cada una tiene su copia completa de material genético (una proteína codificada en los genes spo se encarga de ello)

III. La membrana de la parte más grande de la célula envuelve a la otra parte más pequeña. El protoplasto queda entonces rodeado por 2 membranas (membrana esporal externa e interna)

IV. Entre las 2 membranas se empieza a sintetizar el Cortex. También empieza a entrar Ca2+ y comienza la síntesis de ácido dipicolínico. Como consecuencia de la formación de dipicolinato cálcico, el protoplasto empieza a deshidratarse. Empieza también a generarse el exosporio en aquellas células que lo poseen.

V. Se empiezan a sintetizar las cubiertas y continua entrando Ca2+ así como se sigue sintetizando ácido dipicolínico.

VI. Esta es la fase de maduración. La espora termina de formarse.

VII. La célula se lisa y la endospora sale al exterior.

De manera simultánea a la esporulación se produce la síntesis de los cuerpos parasporales. Se trata de cuerpos de estructura amorfa o, a veces, cristalina. Se generan en Bacillus thuringiensis, Bacillus popilliae y en algunas especies de Clostridium.Los cuerpos parasporales son cristales proteicos que se generan durante la cuarta fase de la esporulación. Se localizan en el citoplasma o en exosporio (en aquellos organismos que lo tengan) Son tóxicos para algunas larvas de lepidópteros y otros insectos, por ello constituyen un insecticida biológico, que se utiliza ya para controlar plagas. Al ser ingerido el microorganismo, el pH alcalino del estómago de la larva rompe los cristales y se liberan los agentes tóxicos, paralizando al individuo. Este mecanismo es muy ventajoso puesto que supone la generación de un medio rico en nutrientes para los microorganismos (el insecto al morir, se descompone y da lugar a nutrientes orgánicos)Mediante la ingeniería genética se han clonado los genes que codifican las proteínas que dan lugar a los cristales. Se usan en plantas, con fines agrícolas, control de plagas, etc.

Proceso de germinaciónEs el proceso opuesto a la esporulación. Se basa en la conversión de la espora en una célula vegetativa cuando se encuentra en un medio adecuado (rico en nutrientes) Se divide en varias etapas:

1. Preactivación. Las cubiertas han de estar un poco dañadas (en el ambiente los organismos dañan estas cubiertas, en el laboratorio se puede hacer mediante un calentamiento, sometiendo la endospora a una temperatura subletal, cambiando el pH, etc.)

2. Activación. Se lleva a cabo por compuestos químicos que varían de unos organismos a otros. En general suelen ser Mg y Mn, alanina, glucosa y otros azúcares, adenina y otras bases nitrogenadas, etc.

3. Germinación. La endospora empieza a perder Ca2+ y ácido dipicolínico. El ácido 3-fosfoglicérico se transforma en ácido 2-fosfoglicérico y éste en fosfoenolpirúvico. El enlace de alta energía de éste se va a romper para dar ATP a

partir de los dinucleósidos ya presentes. Las SASP’s se empiezan a romper dando lugar a aminoácidos utilizados para la síntesis de nuevas proteínas.

4. Terminación y crecimiento. Se sintetiza DNA. El protoplasto comienza a crecer. Se genera la pared celular. Las estructuras externas se rompen y sale al exterior la célula vegetativa completamente formada.

OTRAS ESTRUCTURAS DE RESISTENCIA

CISTOS: Aparecen por ejemplo en Azotobacter. Se forman por un engrosamiento de la pared celular, de tal forma que la estructura formada es mucho más resistente que la célula vegetativa.

ESPORAS (No endosporas): Los Actinomicetos forman estructuras de resistencia en una determinada parte de su ciclo de vida, respondiendo también a la falta de nutrientes en el ambiente. En primer lugar se forma un micelio en el sustrato, y después un micelio aéreo. La tabicación de este último va a dar lugar a las esporas, que en ocasiones aparecen metidas en sacos (esporangiosporas) Son estructuras más resistentes que la célula vegetativa.La esporulación también se produce por falta de nutrientes.

Tema 4. Estructura y función de los organismos eucariotas

Pared celularMisma función, composición diferente. Los protozoos no cuentan con pared celular

- Procariotaso Bacterias: Peptidoglicanoo Arqueas: Pseudopeptidoglicano (NAG-NAT)

- Eucariotaso Hongos: Quitina, glucosas, celulosas,...o Algas: Peptina, sílice, carbonatos,...

Membrana plasmática (bicapa lipídica con proteínas transmembrana_común)

- Procariotaso Bacterias: Glicerol unido a ácidos grasos por enlaces estero Arqueas: Glicerol y cadenas de isoprenoides ramificados unidos por

enlaces éter

- Eucariotas

o Glicerol y ácidos grasos unidos por enlaces ester. Poseen además esteroles (excepto Micoplasmas y algún otro grupo porque no tiene pared celular) Los esteroles dan más rigidez a las membranas

Orgánulos ( en eucariotas)Ribosomas

- 80So 60S: ARNr (28S, 5S, 5’8S), proteinas (49)o 40S: ARNr (18S), proteinas (33)

Los ribosomas de mitocondrias y cloroplastos poseen un coeficiente de sedimentación 70S. MitocondriasPoseen doble membrana, crestas mitocondriales, matriz interior. Son las centrales energéticas de la célula. En la matriz mitocondrial se produce el ciclo de Krebs. En las crestas es donde se localizan los transportadores de electrones (para sintetizar ATP mediante fosforilación oxidativa)(El equivalente en los organismos procariotas se encuentra en la membrana plasmática: citocromos, plastoquinonas, etc. El ciclo de Krebs se realiza en el citoplasma)El número de mitocondrias varía de un organismo a otro (de 1000 a 1 sola mitocondria)Las membranas son similares a las de los procariotas. No poseen esteroles, poseen DNA mitocondrial simplexo circular...CloroplastosSon similares a las mitocondrias en DNA, ribosomas, etc. Sólo aparecen en algas (refiriéndonos a microorganismos) Poseen doble membrana. Presentan en su interior (el estroma) una serie de sacos apilados (tilacoides). Al conjunto de estos sacos se le denomina grana. En el estroma se produce la fijación de CO2 a glucosa, por lo tanto ahí se encuentra la encima RubisCo (del Ciclo de Calvin). En los tilacoides se encuentran los pigmentos fotosintéticos, en los cuales se produce la síntesis de ATP.(El equivalente en procariotas fotosintéticos (cianobacterias)es la membrana plasmática. Ahí se encuentran los pigmentos fotosintéticos. El Ciclo de Calvin se realiza en el citoplasma. La RubisCo se encuentra almacenada en los carboxisomas)Núcleo

Membrana nuclear doble, con poros para la entrada y salida de ARNm. Aparece un determinado nº de cromosomas según el organismo.La región más densa del núcleo se denomina nucleolo. Ahí se forma el ARNr, de tal forma que las proteínas que forman los ribosomas se van a formar en el citoplasma. Pasan a través de los poros de la membrana nuclear al núcleo, y desde ahí se unen al ARNr para formar ribosomas, que vuelven a salir al citoplasma (los ribosomas también se forman una vez están en el citoplasma)Retículo endoplasmático

Está formado por un sistema de túbulos (sacos o cisternas)

- R.E. Rugoso: Síntesis de proteínas

- R.E. Liso: Síntesis de lípidos

No existe un equivalente en organismos procariotas. Todo se forma en el citoplasma

Aparato de Golgi

Formado por cisternas aplanadas. Está unido a la parte más externa de la membrana nuclear. En él se señalizan proteínas para su transporte a determinadas zonas (serie de glucosilaciones,...)En organismos procariotas no existe equivalente. Ocurre en el citoplasmaLisosomasVacuolas donde se producen digestiones de diversas moléculas. pH muy ácido. Enzimas digestivasCitoesqueleto

Por el gran tamaño celular, los organismos eucariotas precisan refuerzos estructurales y mecanismos de transporte en su interior. Distinguimos distintos tipos:

- Microfilamentos: Filamentos proteicos que participan en el movimiento celular. Participan también en los cambios de forma. Están constituidos por la proteína Actina

- Microtúbulos: Filamentos proteicos más grandes que los anteriores. Constituidos por la proteína Tubulina. Están implicados en movimientos celulares, cambios de forma y en el transporte intracelular.

En la célula procariota no existen microtúbulos ni microfilamentos. Se han encontrado proteínas análogas a la Actina ( la Mre B, implicada en el mantenimiento de la estructura del organismo. Se localiza en la membrana plasmática) y a la Tubulina (la Fts C, de la cual aparecen diversos tipos. Forman lo que se llama el divisoma. Están implicadas en la división celular. Se localizan formando un anillo alrededor de la célula. Distribuyen el material que va a ir a una célula y a otra en la división)

(SI SE QUIERE, AMPLIAR ESTE TEMA CON LIBROS DE BIOLOGÍA DE BACH)

Tema 5. Cultivo y Crecimiento de Microorganismos

1. Requerimientos nutricionales

Nutrientes Compuesto químico que un determinado organismo necesita para realizar sus rutas metabólicas y catabólicas. A continuación aparecen los nutrientes más importantes

ENERGIA Fuentes de energía

- Luz (fototrofos)

- Oxidación de un compuesto químico (quimiotrofos)

- Oxidación de un compuesto orgánico (quimiorganotrofos)

- Oxidación de un compuesto inorgánico, como SH2, NH3, H2. (quimiolitotrofos)

MACRONUTRIENTES (g/l o mg/l)

CARBONOSe trata de un macronutriente. Evaluaremos su concentración en g/l. Aparece generalmente formando parte de aminoácidos, hidratos de carbono, lípidos, etc.Los organismos pueden asimilarlo de diversas formas:

- A través de un compuesto orgánico (heterótrofos)

- Por fijación directa (autótrofos)

* Fototrofos

- Autótrofos: cianobacterias, bacterias verdes y púrpuras,...

- Heterótrofos: bacterias verdes, púrpuras “no del azufre”,...

* Quimiotrofos

- Quimiorganotrofos heterótrofos

- Quimiolitotrofos autótrofos

- Quimiolitotrofos heterótrofos (mixotrofos)

NITRÓGENOSe trata de otro macronutriente necesario para formar aminoácidos, bases nitrogenadas, hidratos de carbono, lípidos, etc. Se puede obtener de:

- Compuestos orgánicos: aminoácidos

- Fuentes inorgánicas: nitratos ** (NO3-) y amonio * (NH4

+)

- Fijación de nitrógeno atmosférico* Incorporación de NH4

+ en aminoácidos

Piruvato + NH4+ + NADN+H+ ------- (Alanina dh) ------- L-alanina + NAD+ + H2O

-Cetoglutarato + NH4+ + NADN+H+ -----(Glutamato dh)---- Glutámico + NAD + H2O

** Incorporación de nitratos (NO3- )

Reducción asimilatoria del nitrato

NO3- + NADPH + H+ --------------- NO2

- + NADP+ + H2O

NO2- --------------- [NOH] -------------- NH2OH ---------------- NH3 (NH4

+)nitrilo hidroxilamina

FÓSFOROSe trata de otro macronutriente, que aparece en el ambiente y es obtenido por los organismos en forma de fosfatos (compuestos inorgánicos). Forma parte de ácidos

nucleicos, fosfolípidos, cofactores, algunas proteínas,... Actúa también como sustancia tampón en medios líquidos.

AZUFREEvaluaremos su concentración en mg/l. Forma parte de aminoácidos (cis, met), coenzimas (biotina, CoA),...Este compuesto se puede obtener a partir de:

- Compuestos orgánicos: aminoácidos

- Compuestos inorgánicos: sulfatos (SO42-) *

* Incorporación de sulfatosSO4

2- ---------------- Adenosinfosfosulfato (APS) ------------- SO32- --------------- SH2

En hongos SH2 + serina ----------- cisteína + H2OEn bacterias: SH2 + acetilserina ------------- cisteína + acetato

OTROS MACRONUTRIENTESSe usan combinadosK+ se usa como activador de enzimasCa2+ se usa en la membrana, para la termorresistencia de la espora,...Mg2+ actúa como cofactor de enzimasFe2+ , Fe3+ en citocromos, cofactores,...

MICRONUTRIENTES (g/l): Co, Zn, Se, Mn,...Cuando se usa agua no destilada para el medio de cultivo no es necesario añadir este tipo de nutrientes, puesto que ya van incluidos en esa agua. Si el agua es muy pura sí que habrá que añadir estos oligoelementos.Factores de crecimiento

Compuestos orgánicos que se precisan en g/l que sólo son necesarios para algunos microorganismos:

- Aminoácidos

- Bases púricas o pirimidínicas

- Vitaminas

o p-aminobenzoico. Ácido fólico. Ácidos nucleicos

o Biotina (B8): Ácidos grasos

o Niacina: NAD

o Riboflavina: FAD y FMN

o Piridoxina (B6): transformaciones de aminoácidos

o Tiamina (B1)

o Cobalamina (B12): Síntesis de desoxirribosa

Condiciones ambientalesDependiendo de sus necesidades en cuanto a temperatura clasificamos a los organismos como:

- Organismos Psicrófilos: Temperaturas óptimas bajas ( pudiendo llegar a 0º C)

- Organismos Mesófilos: Temperaturas óptimas en torno a 30 – 35º C

- Organismos Termófilos: Temperaturas óptimas mayores de 50º C

Según sea su respuesta a la concentración de O2, podemos distinguir entre:

- Organismos Aerobios Estrictos : Crecen a presiones parciales de oxígeno similares a las que se dan en condiciones atmosféricas (en torno al 21%) Utilizan el oxígeno como aceptor final de electrones en su cadena respiratoria. Practican solamente respiración aeróbica.

- Organismos Microaerófilos (podemos considerarlos una clase de aerobios estrictos): No pueden soportar presiones parciales de oxígeno superiores al 10%. Sólo practican respiración aeróbica.

- Organismos Anaeróbios Facultativos : Pueden vivir en presencia y en ausencia de oxígeno. Si están en un medio con oxígeno, éste será el aceptor final de electrones (respiración aeróbica). Si están en un medio anoxigénico realizarán fermentación o respiración anaeróbica (el aceptor final de electrones será un compuesto oxidado distinto del oxígeno)

- Organismos Anaeróbios Estrictos : No pueden crecer en condiciones oxigénicas. Realizan fermentaciones o respiración anaeróbica.

- Organismos Aerotolerantes : Pueden crecer en presencia de oxígeno, pero no lo utilizan en su metabolismo nunca. Realizan fermentaciones.

2. Medios de cultivo. Composición y preparación

Aerobios Estrictos

- En medios líquidos crecen en la superficie. Para homogeneizarlo se precisan agitadores, corrientes de oxígeno, etc.

- En medios sólidos también crecen en la superficie.Anaeróbios Estrictos

- Precisan medios de cultivo sin oxígeno. Estos medios suelen contener sustancias reductoras (cisteina, tioglicolato,...)

- Al medio de cultivo se le insufla una fuente de oxígeno

- Se hierve el medio. Después se añade una capa de vaselina estéril, para evitar que entre oxígeno.

Los microorganismos anaeróbios se suelen cultivar en una “Jarra de anaeróbios”. Se colocan las placas en la jarra, apiladas. En la superficie de la tapa hay un catalizador (suele ser Pd). A través de las placas se dispone un generador de anaerobiosis. El más usado es el GASPACK® (Bicarbonato sódico y borohidruro sódico) Al añadir agua a este pack se produce dióxido de carbono e hidrógeno, que al combinarse con el oxígeno forma agua. La producción de dióxido de carbono es fundamental para la supervivencia de algunos microorganismos.Para la preparación de un medio de cultivo para el crecimiento de un microorganismo en primer lugar se pesan los componentes del mismo y se disuelven en agua. Después se esteriliza el medio (condiciones de presión: 1 atm; 15 – 20 minutos en el autoclave)Según sea la composición del medio vamos a diferenciar varios tipos:

- Medios de cultivo Sintéticos o Definidos: Son aquellos cuya composición química exacta es conocida

- Medios de Cultivo Complejos o Indefinidos : Son aquellos que contienen sustancias muy nutritivas pero de composición indeterminada. Un ejemplo son los medios con extractos (extracto de levadura, peptonas de carne, caseína...)

- Medios de Cultivo Semisintéticos: En ellos se conocen algunos nutrientes, pero no todos.

Hay microorganismos “fastidiosos” que precisan para crecer medios enriquecidos que han de llevar sangre, suero, tejidos,...Medios de Cultivo Agar-Sangre: Para el cultivo de patógenos

- Medios de Cultivo Selectivos: Se utilizan fundamentalmente para el crecimiento de determinados grupos de organismos. Son medios que contienen compuestos químicos que inhiben el crecimiento de algunos grupos de organismos, sin afectar al crecimiento del resto.

Por ejemplo, el medio Agar-Sabouranol, es utilizado para el cultivo de hongos. Contienen glucosa, sales y oxitetraciclinas que inhiben el crecimiento de las bacterias, por lo que en ese medio solo podrán crecer mohos y levaduras.

- Medios de Cultivo Diferenciales: Contienen componentes que nos permiten diferenciar unos microorganismos de otros (por el aspecto de la colonia o porque se da alguna reacción en el medio)

Por ejemplo, en el medio Agar-Sangre, en función de que hidrolicen o no los glóbulos rojos, distinguiremos los siguientes microorganismos:

- -hemolíticos: Alrededor de la colonia aparece un halo transparente, lo cual indica una hemólisis total (hidrólisis completa de los glóbulos rojos).

- -hemolíticos: Alrededor de la colonia aparece un halo verdoso, lo que indicará una hemólisis parcial.

- -hemolíticos: Alrededor de la colonia no aparece ningún halo. Indica que no ha habido hemólisis.

La mayor parte de los organismos patógenos son - o -hemolíticos.En el medio Agar-Levine (EMB_Eosin Metilen Blue) puede diferenciarse Escherichia coli de otros organismos coliformes. Si está presente en el medio aparecerán colonias de color verde metálico.

- Medios de Cultivo Selectivos y Diferenciales: Son aquellos que contienen colorantes que cambian de color con el pH, permitiendo diferenciar diferentes microorganismos.

Por ejemplo, en el caldo de Mc Conkey se puede apreciar la presencia de coliformes. Es un medio que contiene lactosa, cristal violeta, púrpura de bromocresol,...El cristal violeta inhibe el crecimiento de organismos gram positivo (esto le hace un medio selectivo). El púrpura de bromocresol actúa como indicador. A pH ácido es amarillo, a pH neutro y básico es violeta (medio diferencial)Si cultivamos coliformes en este medio, realizarán la fermentación de la lactosa, dando como resultado un medio ácido, haciendo que el medio tome color amarillento.

- Medios de Cultivo de Enriquecimiento Selectivo. Ej. Giolitti Cantoni: Se utiliza para el enriquecimiento selectivo de microorganismos del género Staphilococcus. Se trata de un medio de cultivo de enriquecimiento, selectivo y diferencial. Contiene piruvato y glicina (potencia el crecimiento de Staphilococcus), cloruro de litio (inhibe el crecimiento de organismos gram negativos), telurito potásico, que al ser reducido por los organismos del género Staphilococcus a teluro potásico, da un color negruzco como resultado.

Para hacer sólido un medio líquido se suelen usar 16 g/l de Agar-agar. Si se quiere un medio semisólido se utilizarán tan solo 5 g/l.

3. Obtención de cultivos purosEs aquel cultivo en el que aparece una sola especie de microorganismo. Se puede obtener de diversas maneras.

- Siembra por agotamiento : Se intentan obtener colonias aisladas formadas por clones de un mismo microorganismo. Con el asa de siembra previamente esterilizada se toma una alícuota del microorganismo y se deposita en un lado de la placa. Se dibujan una serie de estrías para extender la muestra. Se vuelve a esterilizar el asa y se hacen estrías otra vez en dirección perpendicular a las anteriores. Así sucesivamente, procurando que cada serie de estrías no toque al resto. En los últimos trazos, tras el cultivo, se observarán colonias aisladas.

- Diluciones sucesivas : Partiendo de una muestra con mezcla de microorganismos se van haciendo diluciones (decimales) sucesivas. Después se cultiva las muestras más diluidas en placas. Se realiza una siembra en superficie en placas con un medio de cultivo nutritivo (agar nutritivo, para que crezca cualquier microorganismo). El inóculo se extiende con un asa de vidrio estéril en la placa. Tras una incubación a 37º C durante 24 horas, se realiza un recuento de las

colonias que se encuentran de manera individual en las placas. La muestra más diluida será la que menor número de colonias tenga. Cada una de las colonias es un cultivo puro.

- Siembra en masa : Se dispone de varias placas. El medio de cultivo se conserva al baño maría a 55º C aproximadamente (para que el agar no solidifique). Se coloca un inóculo en las placas vacías (1ml) y después se vierte el medio de cultivo (Hay que homogeneizar la muestra). Tras la incubación aparecerán las colonias (cultivos puros / dilución previa)

Además de contar las colonias aisladas, estos métodos nos permite saber cuántos individuos hay en la muestra. Para ello solo es necesario aplicar la siguiente fórmula:

N = C * 1/D * 1/LN = nº total de organismos / g o ml D = concentración de la diluciónC = nº de colonias observadas L = volumen o masa de muestra inoculado

Ej: Se observan 30 colonias en una dilución 10-3. Alícuota = 0,1 ml

N = 30 * 1/10-3 * 1/10-1 = 3*104 u.f.c/ml (unidades formadoras de colonias por ml)

4. Mantenimiento y conservación de los microorganismos

1. Resiembras periódicas

2. Congelación. Para ello se prepara una disolución con glicerol (20-30%) y el microorganismo. Esta se almacena en recipientes esterilizados (Eppendorf) y se congela (-20º C). El glicerol impide que se formen cristales de hielo que puedan romper las células. Este método conlleva una pérdida de cierta viabilidad en la muestra, pero siempre quedan microorganismos que sobreviven. En la congelación se suele tratar la muestra con leche descremada para evitar también la formación de cristales de hielo.

5. Cultivo y colecciones de cultivoLos microorganismos con los que se trabaja en un laboratorio han de estar perfectamente clasificados. Hay instituciones que se encargan de ello. Cada país suele tener una serie, colección o catálogo de microorganismos.En España se trata de la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo), perteneciente a la Universidad de Valencia. Otro ejemplo es la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo)

6. Definición de Crecimiento

- Crecimiento: Aumento en el nº de células o en la masa de una población microbiana.

- Velocidad de crecimiento: Aumento del nº de células o incremento de la masa microbiana por unidad de tiempo.

- Tiempo de generación (g): Tiempo que una población microbiana tarda en duplicarse (También es llamado tiempo de duplicación). Ej: g (E. coli) = ½ h (Ver gráfico)

Se aprecia la tendencia de crecimiento exponencial. La población se duplica cada un tiempo determinado g.

7. Métodos para medir el crecimiento microbiano

NT : nº total de células durante el crecimiento exponencialN0 : nº de células iniciales en el cultivon : nº de generacionest : tiempo de crecimiento exponencial

log NT = log N0 + n * log 2 n = (log NT – log N0) / log 2Tiempo de generación: g = t / n

Ej1: N0 = 105 células Nt = 108 células t = 3 horasn = (log 108 – log 105) / log 2 = 3 / 0,3 = 10 generaciones (n)g = 3 / 10 = 0,3 horas

Ej2: N0 = 1 célula t = 48 horas g = 20 minutos Cto. exponencial20 min = 0,3 horas 0,3 = 48 / n n = 48 / 0,3 = 160 generacioneslog NT = log N0 + n * log 2log NT = log 1 + 160 * log 2 NT = 2,2 * 1043 !!!El resultado no es coherente. La población bacteriana tendría un peso 4.000 veces mayor que el de la Tierra. Afortunadamente, los microorganismos no pueden crecer exponencialmente siempre

8. Curva de crecimiento de una población microbianaEl proceso se compone de las siguientes fases:

1. Fase de Latencia (fase de adaptación al medio)Cuando una población se siembra en un medio fresco atraviesa por una fase de latencia en la que prácticamente el número de células permanece constante. Sucede porque las células no tienen porque tener todos los componentes necesarios para la replicación y puede que precisen sintetizarlos.También se observa fase de latencia cuando pasamos una población de un cultivo viejo a un medio fresco. Sin embargo, cuando tomamos una población microbiana creciendo exponencialmente y la pasamos a un cultivo fresco no se da periodo de latencia, puesto que el crecimiento ya ha comenzado.2. Fase Exponencial

t (h) nº células0,0 10,5 21,0 41,5 82,0 162,5 323,0 643,5 1284,0 256... ...

En la representación del crecimiento la pendiente de la curva va a variar de unos organismos a otros. El tiempo de generación depende del organismo y del medio de cultivo en el que se encuentre. En esta fase se puede producir esporulación.3. Fase EstacionariaComienza cuando algunos nutrientes esenciales se agotan. También hay que considerar que las sustancias de deshecho pueden llegar a ser tóxicas para los microorganismos. El balance de crecimiento en esta fase es 0, no hay incremento de la población puesto que se da un numero similar de crecimiento y muerte celulares.4. Fase de muerteEn esta fase se da una disminución sustancial del número de células produciéndose un decrecimiento también exponencial. (Muchos microorganismos se lisan)

9. Estimación del crecimientoTécnicas discretas para calcularlo:- Técnica de recuento al microscopio: Se precisan portas especiales, cámaras de recuento y la campana de Petroff-HauserSe trata de portas excavados, con una hendidura (área = 1mm2, h = 0,02 mm, V = 0,02 mm3) donde colocar el inóculo.En la cuadricula se pueden contar las células

(aquí falta algu .....)

A veces la observación se hace difícil. Si la muestra está muy diluida el resultado no es muy apropiado.Counter: Contadores automáticos de conteo de células. Se hace atravesar la muestra por un orificio de la máquina. Cada vez que pasa una célula, el contador aumenta en 1.Conductímetro: Al aumentar la concentración de células, disminuye la conductividad. La solución ha de estar muy limpia para que no haya errores.

Métodos indirectos para el recuento de u.f.c.’s:

1. Para bacterias y hongos filamentosos se utiliza el método de determinación del peso seco. La muestra se puede filtrar en un quitasato, con un papel de filtro previamente tarado. Inmediatamente después se puede pesar en una balanza de precisión el microorganismo que ha quedado en el papel. Transcurridas 24 horas se vuelve a pesar. La diferencia será el peso definitivo de la colonia.

2. Turbidez. En un cultivo, a mayor número de células, más turbidez tendrá el medio. Para estimar la cantidad de células se puede utilizar el espectrofotómetro. Haciendo una representación patrón del tiempo o del número de viables respecto a la absorbancia podríamos estimar el número de células en el cultivo.

3. El método del número más probable nos indica el número de organismos más probable en la muestra

4. Cultivo continuo. Se trata de un cultivo que está siempre en fase exponencial. Se precisa la utilización de un quimiostato. Este cuenta de dos recipientes conectados entre sí. Hay una válvula que permite el paso del medio del recipiente superior (reservorio de medio fresco) al inferior (cámara de cultivo). Por último hay un colector al que sale el medio de la cámara de cultivo cuando se han acabado los nutrientes. En estas condiciones los microorganismos están siempre en fase exponencial.

10. Factores físico-químicos que afectan al crecimientoTemperatura Es uno de los factores físicos más importantes. A mayor temperatura, mayor velocidad de las reacciones químicas, mayor velocidad de crecimiento de los microorganismos.Los microorganismos poseen una temperatura óptima de crecimiento, así como unos márgenes dentro de los cuales la vida es viable. La temperatura óptima está más cerca siempre de la temperatura máxima que de la mínima.Organismos Psicrófilos son aquellos que pueden vivir en rangos de temperatura de entre 0 y 20º C. Su temperatura óptima son 15ºC aprox. Organismos de la antártida, el ártico, los océanos,...Organismos Psicrotrofos son aquellos que pueden vivir en rangos de temperatura de entre 0 y 35º C. Su temperatura óptima está entre 20-30ºC. Viven en los frigoríficos.Las características comunes de estos organismos son los ácidos grasos insaturados, con muchos dobles enlaces (membrana no rígidas), enzimas con óptimos a bajas temperaturas (muchos aminoácidos polares), proteínas con predominancia de la -hélice en la estructura secundaria.Organismos Mesófilos son aquellos que pueden vivir a temperaturas de entre 15 / 20º C hasta 45º C. Su óptimo está entre 30 y 37º COrganismos Termófilos son aquellos que pueden vivir a temperaturas de entre 45 y 80ºC. Su temperatura óptima está en torno a los 55-65º C. Aparecen en suelos, compost, zonas de elevada temperatura. Luego está el caso extremo, los organismos Hipertermófilos. Viven a temperaturas de entre 55-110º C. Su temperatura óptima ronda los 80ºC. Mayoritariamente se trata de arqueas que viven en zonas volcánicas, fuentes termales,...

Adaptaciones a la termofília

- Membranas compuestas por ácidos grasos saturados, isoprenoides en las arqueas sin muchos dobles enlaces. Enlaces de tipo éter. (las arqueas poseen una membrana monocapa... tetraéteres de bifitanil) (repasar)

- Enzimas. Presentan un denso empaquetamiento con un interior muy hidrófobo. Las proteínas suelen tener unidas sustancias sintetizadas por el organismo y que estabilizan a la propia proteína (Di-inositol-fosfato, glicerol-fosfato)

- Chaperoninas en gran cantidad. Son proteínas que ayudan en el plegamiento de las proteínas.

- DNA peculiar. Tiene una serie de proteínas que ayudan a estabilizar las cadenas, en arqueas. Se trata de proteínas de tipo histona.

- También se ha visto que el enrollamiento del DNA (negativo en la mayoría de los organismos) es positivo (giro al revés). Esto favorece la estabilidad del ácido nucleico.

- El DNA tiene unida una molécula de 2,3-difosfoglicerato sódico cíclico. Impide la depurinización.

pHOrganismos Acidófilos. Viven en rangos de pH menores de 5-6. (Ej. Thiobacillus)Organismos Neutrófilos. Viven en rangos de pH en torno a 7Organismos Alcalófilos. Viven en rangos de pH que van desde 6-7 hasta 10-11. Se trata de aquellos organismos que viven en ambientes salados, carbonatados, etc.

Actividad de AguaAW = cantidad de agua disponible para el organismo = Pvsustrato / Pvagua. Su valor varía de 0 a 1. Cuanto más cercano sea a 0, más agua habrá disponible y, por consiguiente, mayor número de organismos crecerá.

Concentración de solutos

NaClOrganismos no Halófilos: Su crecimiento máximo se presenta en ausencia de salOrganismos Halófilos: Necesitan NaCl para crecer (1% como mínimo). Dentro de este grupo podemos distinguir varios tipos de halófilos.

- Halófilos discretos. 1-6 % de NaCl

- Halófilos moderados. 6-15 % de NaCl

- Halófilos extremos. 25-30% de NaClOrganismos Halotolerantes. Tienen un crecimiento óptimo cuando no hay sal, pero pueden crecer a concentraciones de sal en torno a 6-7 % como máximo.

Adaptaciones de halófilosProducen moléculas llamadas “solutos compatibles” que evitan la plasmólisis celular. Los produce el organismo o los toma del exterior. Ej. Aminoácidos (prolina, derivados,...), carbohidratos (Heliolosa?), alcoholes y otros...

O2

(Repasar la clasificación de microorganismo según sea su respuesta a la concentración de O2)El oxígeno es un agente oxidante, excelente aceptor de e-. Se reduce fácilmente. En la respuesta aeróbica, el oxígeno se reduce a agua:

O2 + 4e- + 4H+ ----------- 2H2ODurante este proceso se genera una serie de sustancias tóxicas para la célula. Son las formas tóxicas del oxígeno, y son las siguientes:

- Oxígeno “triplete” (3O2) Es el oxígeno común. Posee en su última capa 2e -

desapareados con espines paralelos.

- Anión superóxido (O2-) Es una forma más oxidante que la anterior. Oxida

fundamentalmente los lípidos pudiendo causar la muerte a la célula por rotura de la membrana. (aunque oxida casi cualquier cosa)

- Agua oxigenada (H2O2) Peróxido de hidrógeno. No es una especie tan nociva como la anterior. En su ultima capa no posee electrones desapareados.

- Agua + Radical Hidroxilo (H2O + OH·) Es la especie más tóxica. El radical hidroxilo combinado con un protón y un electrón volverá a dar agua.

Las células microbianas cuentan con enzimas específicas encargadas de detoxificar estos compuestos.

- Superóxido dismutasa. Detoxifica el anión superóxido.O2

- + O2- + 2H+ ----------SD------------- H2O2 + O2

- Catalasa. Detoxifica el agua oxigenada.H2O2 + H2O2 --------- catalasa --------- 2H2O + O2

+ 1e-

2 H+ + 1e-

1 H+ + 1e-

Algunos anaeróbios Aerotolerantes poseen complejos no proteicos de Manganeso. Poseen la misma función que la superóxido dismutasa. Se cree que estos complejos son la forma más primitiva de esta enzima, porque éstas necesitan al manganeso como cofactor. Generalmente, estos anaeróbios aerotolerantes no tienen catalasa. Para detoxificar el agua oxigenada utilizan la Peroxidasa.

- Peroxidasa. Detoxifica el agua oxigenada, como la catalasa, pero precisa NADHH2O2 + NADH + H+ ----------- peroxidasa ---------- H2O + NAD+

Generalmente en la célula pocas veces se generan radicales hidroxilo ya que las enzimas detoxificantes del agua oxigenada paran el proceso en ese punto impidiendo la síntesis del siguiente producto. Estos radicales pueden llegar a formarse por la exposición del organismo a radiaciones ionizantes (rayos cósmicos, rayos etc

Tema 6. Control del crecimiento microbiano

DEFINICIONESEsterilización

Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida (células vegetativas, esporas, virus, etc.) de cualquier objeto o material.

Desinfección

Proceso que tiene como finalidad eliminar los microorganismos patógenos de cualquier objeto o material no vivo. No se eliminan las esporas, sólo las células vegetativas.

Desinfectante: compuesto químico que se aplica sobre una superficie inanimada que elimina las células vegetativas pero no garantiza la eliminación de esporas o virus resistentes.

Antisepsia

La finalidad de este proceso es eliminar microorganismos patógenos de tejidos vivos. Es como un tipo de desinfección pero para tejidos en este caso (piel, mucosas,...)

Antiséptico: compuesto químico que se aplica sobre tejidos vivos para eliminar microorganismos patógenos.

Higienización

Disminución del número de microorganismos de una muestra hasta unos límites permitidos en salud pública mediante el lavado con productos químicos.

Germicida, bactericida, esporicida, funguicida, virucida,... Compuestos químicos destinados a la eliminación de determinados agentes infecciosos.

-estático

(Ej. Bacteriostático) Método o agente que inhibe el crecimiento de un determinado

organismo, pero no lo mata.

CONTROL DEL CTO DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS FÍSICOS

CALOREs el método más usado (y el más barato). Hay dos tipos:

- Calor Seco. Elimina los microorganismos por oxidación de los componentes celulares.

- Calor Húmedo. Destruye los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura terciaria de las proteínas.

Calor Seco

- Flameado. Para las bocas de los tubos de ensayo matraces, asa de siembra, etc. Se pasa el objeto por la llama del mechero (hasta que se ponga incandescente en el caso del asa de siembra)

- Horno Pasteur. Para el material de vidrio vacío (matraces, pipetas,...) Los objetos se someten a unas temperaturas de 160-180ºC durante 2 horas.

- Incineración. Para destruir todo el material (cepas contaminadas, por ej.)

Calor Seco

- Ebullición (100ºC). Muere gran cantidad de células vegetativas pero no se produce la esterilización.

- Autoclave. Si se cierra la salida de vapor del autoclave aumentará la presión en su interior. La temperatura que se alcanzará entonces será más alta. Se alcanza la esterilización (121ºC a 1 atm durante 15-20 minutos). Sirve para esterilizar medios de cultivo o instrumental quirúrgico, ropas, etc. (siempre material resistente a esas temperaturas)

- Tindalización. Sistema de vapor fluyente en el autoclave. Se usa para materiales muy lábiles al calor (ej. Glucosa, aminoácidos, enzimas). Durante 3 días consecutivos se someten 30 minutos a 37º C. Este proceso va encaminado a la eliminación de esporas (esporulación, eliminación de estas al día siguiente)

- Pasteurización. Controla el crecimiento de los microorganismos. No consigue la esterilización pero disminuye el numero de microorganismos. Su objetivo es eliminar células vegetativas patógenas (en alimentos como la leche, zumos, etc.) Las propiedades organolépticas de los alimentos que se someten a pasteurización se mantienen.Normalmente se someten durante 30 minutos a 62-63ºC (pasteurización a baja

temperatura). Se persigue la eliminación de patógenos como Mycobacterium

tuberculosis.

Actualmente, a 72 ºC durante 15 segundos se consigue la pasteurización y que

las propiedades permanezcan inalteradas.

Productos esterilizados. UHT (Ultra High Temperature) Los alimentos se

someten a unos 140ºC durante un tiempo menor a un segundo. (si se mantienen

más tiempo la leche, por ej, tiende a amarillear)

FILTRACIÓNSe utiliza para materiales líquidos o en disolución lábiles al calor. Ej. Glucosa y otros

azúcares, aminoácidos, antibióticos, etc.

Para filtrar medios de cultivo generalmente se recurre al uso de los denominados “filtros

de membrana” compuestos por una membrana de celulosa con poros menor al tamaño

bacteriano.

En ambientes como los de un quirófano, unidades de quemados,... se utilizan los filtros

HEPA (High Efficient Particulate Air filter) para la filtración del aire.

Las campanas de flujo laminar también poseen filtros especiales.

DESECACIÓNProceso que persigue la eliminación de agua de un producto o material. Produce un

efecto estático. No mata a los organismos pero detiene su crecimiento.

AUMENTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICAAñadiendo sales o azúcares a la muestra. Produce también un efecto estático.

RADIACIONES

- Ionizantes. ( < 1nm )Rayos (utilizando Co60 y Cs137): sirven para esterilizar alimentos. Son cada vez

más comunes.

Rayos X: realizan una esterilización fría, para materiales lábiles al calor

(material quirúrgico, antibióticos,...)

Su efecto letal se debe a que generan radicales hidroxilo que desnaturalizan el

DNA y las proteínas.

- No ionizantes. ( 200 < < 300 nm)Rayos UV. Se usan como desinfectante en campanas (lámparas germicidas),

para el agua, sobre superficies,...

260 nm es la más nociva. Afecta a los ácidos nucleicos. Se usan para inducir

mutaciones experimentales? Los rayos UV pueden producir dímeros de

pirimidinas.

CONTROL DEL CTO DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS QUÍMICOS

1. Fenol y derivados fenólicosActúan como desinfectantes, antisépticos, antibacterianos. Alteran la membrana

plasmática de las células vegetativas. Inactivan enzimas y desnaturalizan proteínas.

1.1 Fenol Irrita la piel. Olor desagradable. Muy tóxico. Es poco usado

1.2 Derivados fenólicos Fenol combinado con radicales para aumentar su eficacia. Se suele combinar con

jabones (ej. Cresoles, lysol®,...) (desinfectantes ambientales superficiales)

Hexaclorofeno. Fenoles halogenados. La adición de color lo hace más efectivo

(aumenta la efectividad antimicrobiana). Forma parte de cosméticos, etc. El uso

excesivo puede provocar lesiones neurológicas.

2. Clorhexidina

Posee una forma parecida a los derivados fenólicos. Se usa como antiséptico

generalmente. Su objetivo es la membrana plasmática de los organismos. Se usa en

colutorios bucales, pastas de dientes, gingivitis, etc. (pero no para heridas). Ej.

Hibiscrub®

3. Halógenos

- Yodo (como antiséptico)

- Cloro (como desinfectante)

3.1 Yodo

Se usa como antiséptico en la limpieza de la piel y para las heridas.

La acción del yodo es la inhibición de las proteínas al combinarse con el aminoácido

Tirosina y formar el complejo Diyodotirosina.

Antes se usaba en forma de tintura (solución hidroalcoholica I / IK). Manchaba mucho

la piel y podía causar alergias. Hoy se suele utilizar en forma de iodóforo (en

combinación con un detergente) Ej. Betadine®, Isodine®,... Posee una acción bactericida,

fungicida, antiviral y esporicida.

3.2 Cloro

Se usa como desinfectante, fundamentalmente en aguas, a las que se añade en forma

líquida o gaseosa. En contacto con esta se forma ácido hipocloroso (HClO), que es un

agente oxidante que impide el funcionamiento de muchos sistemas enzimáticos.

Otros compuestos del Cloro:

- Hipoclorito cálcico (cal) Se usa sobre paredes, superficies,...

- Hipoclorito sódico (lejía) Se usa en alimentos, agua, ropa,...

- Cloraminas (cloro + amoníaco) Se usa para potabilizar aguas (aunque no resulta tan eficaz como la adición de cloro gaseoso, el efecto es más duradero)

4. Alcoholes

Desnaturalizan proteínas y disuelven lípidos, dañando así las membranas celulares.

Las propiedades bactericidas del alcohol se incrementan con la longitud de la cadena.

Destruye eficazmente bacterias, hongos, pero no esporas. El alcohol etílico (60-90%) es

efectivo frente a virus.

El alcohol etílico 70% y el isopropanol 90% se usan como antisépticos para la piel (pero

no para heridas abiertas) y como desinfectantes de termómetros y otros objetos. El

isopropanol 70% se usa también para la limpieza del ombligo de los recién nacidos.

5. Metales pesados

Actúan como desinfectantes y antisépticos. Su acción es desnaturalizar proteínas al

combinarse con sus grupos –SH.

- Ag. En forma de AgNO3 (1%) tiene un efecto bactericida. Se usa en el tratamiento de infecciones oculares en recién nacidos. Actualmente no se utiliza en la mayoría de los países desarrollados.

- Hg. Se utilizan compuestos orgánicos del mercurio, como la mercromina, mercurocromo, meriolato. Poseen una acción antiséptica. Actualmente su uso no es muy recomendable por sus efectos alergénicos.

- Cu. En forma de CuSO4. Es un alguicida. Evita el enmohecimiento de las superficies.

- Zn. En forma de ZnCl. Tiene un efecto antiséptico. Se utiliza en colutorios bucales.

6. Agentes tensoactivos

- Jabones . Poseen un escaso valor antiséptico, pero son buenos higienizantes.

- Detergentes (catiónicos) Poseen propiedades bactericidas, funguicidas, viricidas, amebicidas. No actúan sobre endosporas.Ej. Cloruro de benzalconio. Se usa en colutorios, higiene íntima femenina,...

Su función consiste en alterar la permeabilidad celular (afectan a la membrana

plasmática) Se pueden usar como desinfectantes de la piel, utensilios,

superficies...

7. Ácidos orgánicos y derivados

Se usan como conservantes en la alimentación, en cosméticos (derivados de los

parabenes),...

- Ácido sórbico . Como función principal ejerce la inhibición del crecimiento de hongos.

- Ácido benzoico y derivados

- Ácido propiónico

8. Aldehídos

Son agentes antimicrobianos eficaces. Si se usan en forma de vapor pueden ejercer

como esterilizantes. Poseen un olor desagradable e irritante.

- Formaldehído (37%) (formol) Actúa como desinfectante de todo tipo de superficies (acción –cida)

- Glutaraldehído (2%) Se usa como esterilizante de instrumentos quirúrgicos, equipos de respiración asistida,... Inactivan proteínas.

9. Esterilizantes gaseosos

- Óxido de etileno . Desnaturaliza proteínas. Sustituye grupos (-SH, -COOH, -OH) por grupos alquilo (-CH2-CH2-OH)Resulta ser un agente explosivo y muy penetrante. Se usa para placas petri,

jeringuillas, etc. (en materiales plásticos lábiles al calor)

10. Agentes oxidantes

Oxidan los componentes celulares. Acción desinfectante.

- O3. Se va usando cada día mas en la desinfección de las aguas, en sustitución del cloro. Es más caro

- H2O2. Es un agente antiséptico y desinfectante. No es buen para heridas. Se utiliza en la desinfección de la piel y objetos. Puede ser esporicida. Para evitar el crecimiento de organismos anaeróbios en heridas profundas se utilizan otro tipo de peróxidos.

Tema 7. Fundamentos del metabolismo microbiano

1. Concepto de metabolismo (ampliar con libro de bach o Brock!)

Reacciones biosintéticas. Anabolismo. Consumo de energía (ATP)

Reacciones de degradación. Catabolismo. Obtención de energía (síntesis de ATP e intermediarios metabólicos)

2. Mecanismos de obtención de energía

Reacciones bioquímicas para la obtención de energía (Reacciones de oxido-reducción)

- Compuestos reductores (con H+) Cederán e-

- Compuestos oxidantes (Ej. O2) Captarán e-

No todas las moléculas poseen la misma capacidad para donar o ceder electrones, ésta varia en función de su potencial de reducción. Cuanto más negativo sea este potencial, más facilidad tendrán para donar los protones / electrones (el segundo componente del par). Cuanto más positivo sea, más facilidad tendrá para aceptar electrones.

A mayor diferencia de potencial entre el oxidante y el reductor, mayor cantidad de energía se obtendrá en la reacción.

El donador de protones o electrones es la fuente de energía. Esta energía se obtiene cuando se da la reacción de reducción completa.

Ver fotocopias. Enlaces de alta energía.

3. Metabolismo de los Qumioorganotrofos heterótrofos.

Fermentación y Respiración

La fermentación es el mecanismo más sencillo de obtención de energía. Los compuestos orgánicos actúan como donadores y aceptores de electrones. Nunca va a haber aceptores terminales de electrones exógenos al proceso de fermentación.

La respiración puede ser de dos tipos, dependiendo de cuál sea el aceptor terminal de electrones.

- Si el aceptor final de electrones es el oxígeno, se trata de una respiración aeróbica. Se trata del proceso más eficaz.

- Si el aceptor final de los electrones es otro compuesto orgánico o inorgánico (que no sea el oxígeno) oxidado, se tratará de una respiración anaeróbica.

En la fermentación el ATP siempre se forma por fosforilación a nivel de sustrato. En la respiración el ATP se formará por fosforilación oxidativa, en la cadena transportadora de electrones.

En la respiración el producto inicial está completamente oxidado, se produce una oxidación total. Sin embargo, en la fermentación se realiza una oxidación parcial del compuesto. Es por ello que el balance energético siempre va a ser menor que el de la respiración.

Hay una serie de rutas que conducen siempre de glucosa a pirúvico, y que son comunes a la respiración y a la fermentación.

1. Glucólisis

2. Ruta de Entner-Doudoroff

3. Ruta de las pentosas fosfato

1. GLUCÓLISIS

La realizan organismos como Escherichia coli, Enterobacter,...

2. Ruta de ENTNER-DOUDOROFF

La realizan organismos como los géneros Pseudomonas, Zymomonas,...

3. Ruta de las PENTOSAS FOSFATO

Algunas bacterias como Lactobacillus transforman la glucosa en piruvato a través de esta ruta

1. Fermentación Alcohólica

La llevan a cabo organismos como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae.

No hay donadores ni aceptores exógenos de electrones.

2. Fermentación Ácido-Mixta

La realiza algunas especies de la familia Enterobacteriaceae. Ejemplos: Géneros Escherichia y Salmonella.

En este proceso se genera una gran cantidad de ácidos que hace descender el pH (hasta 4). Una prueba para determinar si se está llevando a cabo este tipo de fermentación es la prueba del rojo de metilo (dentro del IMViC) El colorante rojo de metilo vira a color rojo rosado por debajo de un pH de 4,4.

Los donadores y aceptores de electrones están dentro del proceso. Balance de ATP = hasta 3 (es un proceso más energético que la fermentación alcohólica)

3. Fermentación Butanodiólica

La realiza la familia Enterobacteriaceae (junto con la fermentación Ácido-Mixta) y los géneros Enterobacter y Serratia.

Una prueba para determinar si se está realizando esta fermentación es la de Volgeis Proskawer (medio con glucosa, añadiendo -naptol y KOH)

4. Fermentación Láctica

Se lleva a cabo por bacterias llamadas “del ácido láctico”. Hay dos tipos de fermentación láctica:

4.1 F. Homoláctica

La realiza el género Streptococcus

4.2 F. Heteroláctica

La realizan algunas especies del género Lactobacillus.

5. Fermentación Propiónica

La realizan los microorganismos anaeróbios, como por ejemplo Propionibacterium, selenomonas, bacterias de la boca, del tracto intestinal, Succinivibrio,...

Utilizan el ácido láctico generado por otros microorganismos:

Ácido Láctico ------------ Ácido Propiónico + Ácido Acético

6. Fermentación Succínica

Ácido Pirúvico ------------ Ácido Succínico + Ácido Acético

7. Fermentación Acetobutírica

Es llevada acabo por el género Clostridium. A principios del s. XX era la única vía para obtener acetona.

Ácido Pirúvico ------------ Ácido Butírico + Ácido Acético + Butanol / Acetona / Etanol

RESPIRACIÓN en Quimiorganotrofos heterótrofos

Proceso mediante el que un compuesto orgánico reducido se oxida a CO2. Los electrones son aceptados por el oxígeno, en el caso de la respiración aeróbica, o por un compuesto orgánico oxidado (NO3

-, SO42-) en el caso de la respiración anaeróbica. El

ATP se forma mediante fosforilación oxidativa, gracias a la fuerza protón motriz.

Ácido Pirúvico ----- (Ciclo de Krebs) ------- CO2

Balance energético

1 Pirúvico-----3CO2 + 4NADH + 1FADH + 1ATP (15 ATP)

1 Glucosa-----6CO2 + 30ATP + 2ATP + 2NADH (38 ATP)

Las NADH deshidrogenasas son proteínas de membrana que transportan átomos de hidrógeno (protones) y electrones. Éstos son llevados hacia las flavoproteínas, las cuales expulsan los protones al exterior celular y ceden los electrones al siguiente transportador, las proteínas ferrosulfurosas o FeS. Estas proteínas van a llevar los electrones hasta las quinonas, las cuales captan protones del interior, se reducen, y los expulsan al exterior, enviando a su vez los electrones a los citocromos. Los citocromos pueden aparecer formando complejos. A través de ellos pasan los electrones hasta llegar al aceptor final, en este caso, el oxígeno. Gracias a la captación de estos protones y electrones se va a generar agua.

En el interior celular se va generando una carga negativa y, en el exterior, positiva. Aparece por tanto un gradiente de pH a ambos lados de la membrana, el cual lleva asociado un potencial electroquímico que hace más energética a la propia membrana. Cuando este potencial se disipa, es posible generar ATP.

La enzima ATPasa canaliza la entrada de protones desde el exterior. De este modo se disipa la energía y se propicia la formación de ATP mediante fosforilación oxidativa.

En esta reacción se obtiene mayor cantidad de energía en la modalidad aeróbica que en la anaeróbica.

RESPIRACIÓN en Quimiolitotrofos autótrofos

El ATP y el poder reductor se obtienen de la oxidación de compuestos inorgánicos.

Los organismos quimiolitotrofos autótrofos se clasifican en:

1. Bacterias oxidadoras del NH4+

Microorganismos anaeróbios. Respiración aeróbica.

2. Bacterias oxidadoras del azufre

La mayoría realizan respiración aeróbica (O2), aunque también se pueden observar procesos de respiración anaeróbica (NO3-) o los dos procesos simultáneamente (en el caso de microorganismos aerobios facultativos)

3. Bacterias oxidadoras del Fe2+

4. Bacterias oxidadoras del Hidrógeno

5. Bacterias oxidadoras del CO2

* En este tipo de microorganismos (excepto en las bacterias oxidadoras de hidrógeno), para sintetizar el NADH se tiene que usar el transporte inverso de electrones. Esto conlleva un consumo de ATP, el cual también se necesita para sintetizar componentes orgánicos

Cuanto más abajo nos incorporemos en la cadena de transporte, más ATP se precisará para sintetizar el poder reductor.

RESPIRACIÓN en Fototrofos autótrofos

Tema 8. Genética Microbiana

1. Mutación y Aislamiento de MutantesUna mutación es un cambio heredable en la secuencia de bases del DNA. El organismo que sufre el cambio se denomina mutante, el que no lo tiene es el individuo salvaje.

Los individuos mutantes y salvajes se diferencian en el genotipo, que llevará asociada generalmente una diferencia también en el fenotipo.

Aislamiento de mutantes

Aislamiento de mutantes resistentes a antibióticosNormalmente existe una frecuencia de mutación espontánea conocida. Ej. 10 -7 (cada 10.000.000 de células, 1 mutará espontáneamente)

Ej. AmpS (Amp+ individuo salvaje) Organismos sensibles a la ampicilina, mueren en un ambiente con este antibiótico.

Se quieren obtener células resistentes, mutantes (AmpR, Amp-). Lo que se hace es cultivar individuos en una placa con un medio que contenga ampicilina. En ella sólo podrán crecer los organismos mutantes.

Aislamiento de mutantes que utilizan azúcares

Ej. Lac+/ Lac- . Uso de caldo de McConkey, medio Agar-McConkey o VRBA

En un medio Agar-McConkey las colonias de Lac+ aparecerán coloreadas y las colonias de Lac- aparecerán transparentes.

Aislamiento de mutantes auxotrofos

Ej. Auxotrófos / Prototrofos para Leucina

Organismos auxotrofos para leucina (Leu-) son aquellos que no poseen las enzimas necesarias para sintetizar el aminoácido leucina. Para poder crecer precisarán un medio que contenga leucina.

Organismos prototrofos para leucina (Leu+) son aquellos que poseen las enzimas necesarias para sintetizar leucina.

Lo que se pretende es aislar organismos mutantes auxotrofos para leucina (Leu-)

Se utiliza el método de la “Réplica Placa”. Cosiste en hacer crecer en una placa con medio completo (con leucina) a todos los organismos. Crecerán tanto Leu+ como Leu-. Después se realiza una impresión con una muñequiña, y ésta se lleva a otras dos placas:

- Placa 1. Con medio completo (con leucina)

- Placa 2. Con medio mínimo (sin leucina)

En la placa 1 crecerán todos los organismos, pero en la placa 2 sólo crecerán los organismos prototrofos. Las colonias que hayan crecido en la placa 2 pero sí hayan crecido en la placa 1, serán las colonias de mutantes auxotrofos.

* Otro método es la técnica de enriquecimiento con penicilina. Se basa en la acción de la penicilina de inhibir el crecimiento de microorganismos actuando sobre la pared celular de éstos.

En un medio completo se hacen crecer organismos Leu+ y Leu-. Después se cultivan en un medio mínimo con penicilina. En esta fase, la penicilina inhibirá el crecimiento de los organismos prototrofos, pero no a los auxotrofos, ya que estos no pueden crecer en un medio mínimo. Tras una centrifugación para eliminar el antibiótico se cultivan dos placas, una con medio completo (donde crecerán los organismos auxotrofos, no inhibidos por la penicilina) y otra con medio mínimo (donde pueden crecer algunos organismos prototrofos que hayan resistido a la acción de la penicilina)

Aislamiento de mutantes termosensibles

Se pueden aislar aprovechando sus características de respuesta a diversas temperaturas. Hay organismos que crecerán a temperaturas permisivas, pero no a temperaturas restrictivas. Es el caso de Escherichia coli, cuya temperatura permisiva es 30ºC y temperatura restrictiva es 39ºC Test de Ames

Se usa para saber si un compuesto químico es mutagénico y, por consiguiente, potencialmente cancerigeno. Consiste en comparar la frecuencia de reversión de una mutación de auxotrofía en presencia y en ausencia del compuesto químico que se pretende analizar.

Ej. Salmonella typhimudioum (his-) o Escherichia coli (tryp-)

Se toma un cultivo de 108 u.f.c y se impregna un papel de filtro con el compuesto problema. Éste se coloca en el centro de una placa con medio mínimo. Se hace lo mismo en otra placa (también con medio mínimo), pero con el papel impregnado con un compuesto de control (agua)

En la placa de control aparecerán colonias de his+. Serán los revertientes espontáneos.

En la placa problema, si hay prácticamente las mismas colonias de his+ significará que el compuesto problema no es mutagénico. Si lo fuera aparecerían muchas más colonias de his+. (sería un compuesto que induciría una frecuencia mutagénica mayor en las células)

La cepa de Salmonella cuenta con una disfunción, no repara las mutaciones que ocurren en la secuencia del DNA (por ello puede haber errores en el test?)

2. El Genoma Bacteriano: el Cromosoma y los PlásmidosPlásmidos

Los plásmidos son secuencias de DNA duplexo, circular o lineal, de replicación autónoma. Contienen entre un 0,2 y un 4% del genoma bacteriano (puede haber plásmidos de diversos tamaños)

No todas las bacterias poseen plásmidos, por ello, estos no contienen genes esenciales para la vida de la célula. Tan solo confieren ventajas adaptativas a la hora de crecer en determinadas condiciones. Pueden contener:

- Genes de resistencia a antibióticos, metales pesados,...

- Genes que codifiquen para la síntesis de determinadas toxinas, lo que puede determinar la posible patogeneidad de un microorganismo.

- Genes que permitan a un microorganismo degradar una sustancia extraña. Ej. Pseudomonas poseen el plásmido “tol” (permite degradar tolueno) Se han usado en mareas negras para la degradación natural del vertido.

- Plásmido F. Confiere la capacidad de llevar acabo la conjugación.

Tipos de plásmidosPlásmido F o plásmido conjugativo. (ver en fotocopias el mapa genético del plásmido F de Escherichia coli)

Se trata de un plásmido grande (aprox. 100kbases) Suele haber 1 o 2, si son pequeños pueden aparecer hasta 100 copias en una misma célula. Tiene capacidad de transmisión de unas bacterias a otras. Las bacterias con el plásmido se denominarán F+ (Bacterias Donadoras) Podrá pasar a otras bacterias F- (Bacterias Receptoras)

Cualquier plásmido con la región “tra” es susceptible de ser transmitido. Todos los plásmidos conjugativos son transmisibles, pero no todos los transmisibles son conjugativos.

El origen de transmisión del plásmido es el punto Ori T

El origen de replicación del plásmido es el punto Ori R

- IS. Secuencias de inserción. Sólo poseen secuencias informativas para la transposición.

- Tn. Transposones. Son regiones más grandes que contienen secuencias informativas para la transposición y sobre otros genes.

Las secuencias transponibles pueden saltar y cambiar de posición en el cromosoma.

En el plásmido F hay al menos 1Tn y varias IS. Al nivel de las IS, F podrá integrarse en el cromosoma de la bacteria receptora. Cuando un plásmido se integra en el cromosoma de la bacteria se le denomina episoma.

En el plásmido F, entre otras cosas, están los genes que codifican para la formación de los pili (pelos conjugativos) Solo las bacterias que posea pili podrán conjugarse.Plásmidos de Resistencia

Confieren resistencias a antibióticos (generalmente a muchos _ multi-resistencia) El más estudiado ha sido, entre otros, el R-100. Este plásmido confiere resistencia a las sulfamidas, tetraciclinas, estreptomicinas, metales pesados (puede crecer en presencia de Hg). Como el resto de genes de resistencia, posee región “tra”, por lo que será susceptible de ser transmitido.Plásmidos Recombinantes

Se sintetizan artificialmente. Son los que se utilizan para el clonaje y la manipulación de genes.

Ej. pVC19. Se trata de un plásmido pequeño (aprox. 2,8 kbases) Se pueden hacer múltiples copias. Se diseña con origen de replicación (Ori R), con un gen marcador (de resistencia, para poder distinguir las células con el gen de interés) y con el gen que se pretende clonar.

3. Recombinación genética en bacteriasProceso mediante el cual dos moléculas de DNA se unen en una sola molécula.

3.1. Transformación de material genético en bacterias

Proceso mediante el cual DNA libre se incorpora a una célula receptora denominada “competente”. La transformación natural no ocurre frecuentemente, no todas las bacterias son capaces de transformarse. En algunos géneros ocurre con más frecuencia que en otros (Azotobacter -, Bacillus, Streptococcus +)

En gram - pueden entrar las dos cadenas de DNA dentro de la bacteria. Una de las cadenas será degradada en el citoplasma, la otra se recombinará.

En gram + una de las cadenas se degrada en el exterior de la célula. Sólo una logra penetrar en la célula.

Mediante ingeniería genética se puede lograr hacer a una célula “competente”. Si transformamos una célula con DNA de un virus, el proceso se denominará transfección.

3.2. Transducción de material genético en bacterias

En este proceso hay un paso de genes de una célula donadora a una célula receptora mediante un virus. Hay varios tipos de transducción:

- Transducción generalizada . Se lleva a cabo mediante la acción de un virus lítico (ver fotocopias) Se trata de un fragmento de DNA de la célula hospedadora (no vírico) que se encapsida y pasa a otra célula receptora mediante el mecanismo de transmisión del virus) En este proceso, tras la lísis de la célula infectada también saldrán encapsidados fragmentos del DNA vírico.

- Transducción especializada . Se lleva a cabo mediante la acción de un virus lisogénico. El DNA del virus se integra en el cromosoma celular en estado de profago. La transducción se producirá si se da el proceso de escisión anómalo del DNA del virus. Consiste en que parte de los genes del virus y parte de los genes de la bacteria quedan en el cromosoma del elemento contrario (ver fotocopias) Entonces el virus inicia el ciclo lítico con el gen de la bacteria integrado. Al infectar a otras células se va a transferir el gen de la bacteria primitiva.

3.3. Conjugación del material genético en bacterias

La conjugación es el proceso en el que se produce la transferencia de plásmidos (F, entre otros) o de genes cromosómicos de una bacteria donadora a una bacteria receptora. Se precisa contacto directo entre las bacterias mediante los pili (sintetizados por la bacteria donadora, la que posee el plásmido F)

En el origen de replicación se rompe el plásmido. Una de las cadenas pasará a la célula receptora. Posteriormente se dará una replicación para generar la cadena doble.

Células HFR (High Frecuency Recombination)

Son aquellas células que tienen integrado un plásmido F en su cromosoma. En el origen de transferencia se rompe el cromosoma. Una cadena pasará a la célula receptora en el proceso de conjugación que dura aprox. 100 minutos. No da tiempo a que se transfiera el plásmido completo, por ello, cuando una bacteria F- se conjuga con una célula HFR, seguirá siendo F-, pero contendrá también los genes cromosómicos de la otra célula.

Células F’

El plásmido F también puede desintegrarse de la célula pudiendo arrastrar genes cromosómicos con él. Una célula F’ es aquella que contiene el plásmido F y algún gen cromosómico. El plásmido está desintegrado (Igual que si fuera F+, pero desintegrado, es decir, sin formar episoma, y con algún gen cromosómico)

Tema 9. Principios de Taxonomía microbiana

Taxonomía: Ciencia que se encarga de la clasificación de los organismos vivos. Clasificar es agrupar los organismos en grupos o taxones. La unidad básica de clasificación en microbiología es la especie.

(Dominio – Filo – Clase – Orden – Familia – Género – Especie)

Nomenclatura: Dar un nuevo nombre o renombrar a los nuevos microorganismos.

Identificación: Se encarga de estudiar las distintas características de un nuevo aislado para saber en qué grupo se engloba.

Hay que diferenciar este proceso de la Filogenia. Esta ciencia se encarga de estudiar las relaciones evolutivas que existen entre los distintos organismos. Actualmente los organismos están empezando a clasificarse en función de la filogenia (clasificación filogenética)

Especie: Conjunto de cepas que componen la mayor parte de las características fundamentales y que difieren de otras cepas en características significativas. Una cepa es una población de bacterias que desciende de un único microorganismo. Las cepas que conforman una especie pueden diferir en algunas características.

- Diferencias en caracteres morfológicos: morfovares

- Diferencias en caracteres bioquímicos: biovares

- Diferencias en caracteres antigénicos: serovares

Ej. En E. coli se dan diferencias de carácter bioquímico (Indol + / Indol -)

La nomenclatura se realiza por el sistema binomial Ej. Micrococcus lutens o M. Lutens

IJSB. International Journal of Sisthematic Bacteriology. En esta publicación aparecen los descubrimientos de nuevos microorganismos.

Sistemas de clasificación:

1. Clasificación fenética. Se utilizan caracteres fenotípicos. Es la clasificación más clásica.

2. Clasificación filogenética. Se utilizan las similitudes o diferencias en el RNAr

3. Taxonomía clásica según caracteres:

a. Morfológicos. Forma, tamaño, colonia, presencia de flagelos, cápsula, respuesta a tinción gram,...

b. Bioquímicos y fisiológicos. Tipo de metabolismo, utilización de fuentes de carbono, relación con el oxígeno,...

c. Ecológicos. Relación del microorganismo con otros y con el ambiente, relaciones simbióticas, ciclos de vida,...

d. Genéticas. Presencia y tipos de plásmidos, según lleven a cabo transformación, conjugación,...

Con el desarrollo de la biología molecular se han empezado a tener en cuenta otras características sobre todo a nivel molecular:

- Caracterización de proteínas: movilidad electroforética, peso molecular, aminoácidos, secuenciación de la proteína.

- Contenido en DNA de Guanina-Citosina. El % nos dará una idea de la relación de parentesco existente entre los organismos.

% G-C = {(G-C) / (G-C) + (A-T)} * 100

* Se han llegado a secuenciar los ácidos nucleicos para saber cuáles son las relaciones de parentesco. En ocasiones no es necesario llegar a la secuenciación. Hay un paso intermedio en este proceso:

- Hibridación de ácidos nucleicos: Los organismos del mismo género cuentan con un % de hibridación de hasta el 70%. Estas técnicas se utilizan para llevar a cabo la clasificación filogenética.

Para clasificar filogenéticamente se utiliza RNAr (16S en procariotas, 18S en eucariotas)

El RNAr se denomina “cronómetro molecular” Se utiliza para conocer las distancias evolutivas en los distintos microorganismos. Para considerar a una molécula como “cronómetro molecular” ha de reunir una serie de condiciones:

- Tiene que estar ampliamente distribuida

- En todos los organismos tiene que cumplir la misma función

- Debe haberse conservado a lo largo de la evolución

Se ha demostrado que en el RNAr 16S hay más secuencias llamadas “firma” o “signatura”. Son secuencias que siempre están presentes dentro de un determinado grupo filogenético.

En el RNAr también hay unas secuencias que son más variables. Se hacen muy bien los estudios hasta género. Utilizamos un sistema de clasificación filogenética de Woese.

Dentro del dominio Archaea distinguimos tres filos:

- Euryarchaeota

- Crenarchaeota

- Korarchaeota. De este filo no se ha logrado cultivar ningún organismo en condiciones aisladas de laboratorio.

Los organismos más antiguos eran los más Termófilos (condiciones de la tierra en sus orígenes)

Dentro del dominio Bacteriae se conocen más de 50 filos. Nosotros estudiaremos:

- Proteobacteria (...). De gran diversidad metabólica

- Bacterias gram positivas ( con alto o bajo contenido G-C)

- Cyanobacteria. Un grupo muy homogéneo metabólicamente.

* Manual de Bergey. Realizó en 1923 un manual breve para clasificar microorganismos (manual de Bergey determinativo)

El nuevo manual revisado, editado en 1984-1989 es un compendio de todas las características clásicas de las bacterias. 4 volúmenes

Actualmente se ha iniciado una segunda edición de la cual solo se han publicado los dos primeros volúmenes. La diferencia con la primera edición es que ahora se utiliza un sistema de clasificación filogenético.

Tema 10. Bacterias Fototróficas

Bacterias fototróficas son aquellas que obtienen su energía a partir de la luz (fotofosforilación). Generalmente son organismos autótrofos, aunque puede haber también organismos heterótrofos.

Fototrofos Anoxigénicos Fototrofos Oxigénicos

Fotosíntesis anoxigénica:- 1 Fotosistema- P.F. Bacterioclorofilas- No hay fotólisis del agua. No se

produce O2

Fotosíntesis oxigénica:- 2 Fotosistemas- P.F. Clorofila a- Sí hay fotólisis del agua. Se

produce O2

Donadores de e-: compuestos reducidos del ambiente (SH2, H2, S, tiosulfuros,...)

Donadores de e-: H2O

Precisan ambientes anóxicos para vivir No pueden vivir en ambientes anóxicos

Organismos Fototrofos Anoxigénicos

- Bacterias Púrpuras- Bacterias Verdes- Heliobacterias

Pigmentos respiratorios. Bacterioclorofilas:

- Pigmentos antena. Se trata de bacterioclorofilas encargadas de captar la luz

Estudiaremos un esquema correspondiente a las bacterias púrpuras, pero que se puede extender al resto de fototrofos anoxigénicos, ya que las diferencias que presentan son mínimas.

- Centros de reacción. Fotosistema P870 (870 es la longitud de onda a la que absorbe la bacterioclorofila)

o Par especial de bacterioclorofílas ao Bacteriofeofitina (bacterioclorofila a sin Mg+) (Bph)o Quinonaso Proteínas de Fe y S

La luz es captada por los pigmentos antena, que transmiten la energía al par especial del centro de reacción que se excita y aumenta su potencial energético (adquiere un potencial muy electronegativo). Éste empieza a ceder e- a la Bph, y esta a su vez a las quinonas (conjunto de quinonas). Hasta este punto el proceso es muy rápido, después se ralentiza. Los e- pasan a una cadena de citocromos y de ahí otra vez al par especial del centro de reacción. (ver esquema en fotocopias)

La síntesis de ATP se obtiene por fosforilación oxidativa. La energía de la luz genera el transporte de electrones y la consiguiente extrusión de protones. Este hecho hace que se genere una fuerza protón motriz que dará lugar en ultima instancia al ATP.

La síntesis del poder reductor se lleva a cabo de la siguiente forma:El SH2 le cede los electrones a la cadena transportadora al nivel del citocromo c2. Éste se los cederá al Fotosistema P870 y así hasta llegar al par de quinonas. El potencial electroquímico de éstas (aprox. 0 V) no permitirá que se lleve a cabo la síntesis del poder reductor (potencial aprox. -0,3 V) de la forma habitual. Se ha de producir un flujo inverso de electrones (con gasto de ATP) para que se de la síntesis de NAD(P)H.

Podría darse una alternancia de ciclos por regulación lumínica. Con luz se produciría la síntesis de ATP y, sin luz, el flujo inverso de electrones para la síntesis de poder reductor.

1. Bacterias Púrpuras Se trata de microorganismos gram negativos, unicelulares, que pueden adquirir diversas formas. Son generalmente móviles.

Pigmentos fotosintéticos: Bacterioclorofila a y b (estructura muy similar a la de la clorofila excepto en los radicales: anillo porfirínico con un átomo de Mg2+. Estos van a determinar su máximo de absorción. Esto supone una ventaja ecológica, puesto que varios organismos con distintos máximos de absorción van a poder vivir en el mismo ambiente.Presentan invaginaciones de la membrana plasmática. Ahí se encuentran los pigmentos fotosintéticos. También aumentan la superficie de contacto con el medio.Tanto las bacterioclorofilas como las estructuras que las contienen se forman en ausencia de oxígeno.Poseen también compuestos carotenoides, que les confieren el color (púrpura, rojo)Algunas bacterias púrpuras pueden fijar nitrógeno.

Dentro de las bacterias púrpuras se pueden distinguir dos grandes grupos:

- Bacterias Púrpuras del azufre ( - proteobacterias)

Utilizan como donador de electrones para la síntesis de poder reductor al SH2

SH2 -----(proceso + rápido) ---------- S ------(proceso + lento) ----------SO42-

Se producen acumulaciones de azufre (en gránulos intra o extracelulares)

Estos microorganismos son mayoritariamente fototrofos autótrofos, fijan el CO2 por el ciclo de Calvin. Sin embargo hay algunas especies que pueden ser fotoheterótrofas (pueden utilizar el acetato para sintetizar compuestos orgánicos) En ausencia de luz algunos fototrofos van a crecer como quimiorganotrofos.

Estos son algunos ejemplos de bacterias púrpuras:

- Familia Ectothiorodospiraceae. Está formada por microorganismos que acumulan los gránulos de azufre en el exterior.

o Gen. Ectothiorodospira. Posee forma de espira, vive en ambientes salados.

- Familia Chromatiaceae. Acumulan los gránulos de azufre en el interior

o Gen. Thiospirillum, Chromatium, Thiocapsa.

Ecología

Se encuentran en las zonas anóxicas de los lagos y en zonas ricas en SH2 (ligeramente profundas, pero donde aún llegue la luz)

- Bacterias Púrpuras no del azufre ( - proteobacterias)

Poseen bacterioclorofilas a y b encerradas en sistemas de vesículas. Su nombre viene porque en un principio se pensaba que no podían utilizar el SH2 como donador de electrones. En realidad sí pueden hacerlo, pero sólo cuando éste se encuentra en concentraciones bajas.

Presentan una morfología diversa (formas bacilares, espirales,...). Pueden ser móviles o no.

Hábitat. En lagos donde la materia orgánica se abundante (lodos, estanques).

Son organismos muy versátiles metabólicamente. Van a poder utilizar los compuestos orgánicos para obtener el poder reductor y sus elementos carbonados (fotoorganotrofos heterótrofos) En zonas donde no llega la luz pueden vivir como quimiorganotrofos heterótrofos, pudiendo realizar tanto fermentación como respiración.

Son organismos siempre gram negativos. Algunos ejemplos:

- G. Rhodospirillum

- G. Rhodopseudomonas

- G. Rhodobacter

- G. Rhodocyclus

2. Bacterias VerdesNo son proteobacterias. Se trata de organismos gram negativos. Pueden ser unicelulares o filamentosos.

Pigmentos fotosintéticos:

- Bacterioclorofilas a + c, d o e (verdes del azufre)

- Bacterioclorofilas a + c (verdes no del azufre)

Los pigmentos aparecen en los clorosomas.

Poseen también carotenoides, gracias a los cuales toman colores verdosos o marrones.

Realizan fotosíntesis anoxigénica. En este caso el poder reductor no se sintetiza por flujo inverso de electrones porque éstos se incorporan al nivel de la ferredoxina. El potencial de la ferredoxina es más electronegativo que el del par NAD+ / NADH, por ello se puede sintetizar directamente.

Dentro de las bacterias verdes se pueden distinguir dos grandes grupos:

- Bacterias Verdes del Azufre

Poseen bacterioclorofilas a y b, c o d (en clorosomas). Generalmente son organismos inmóviles.

Son fotolitotrofos autótrofos. El CO2 no es asimilado por el ciclo de Calvin, sino por un ciclo inverso al de Krebs. Se denomina Ciclo de Krebs Reverso.

Algunos de estos microorganismos pueden fijar nitrógeno en anaerobiosis.

Ej. Gen. Chlorobium Gen. Pelodyction

Hábitat compartido con las bacterias púrpuras del azufre. Zonas ricas en SH2 y anóxicas

- Bacterias Verdes no del Azufre

Poseen bacterioclorofilas a y c. La mayoría son quimiolitotrofos autótrofos, pero pueden ser fotolitotrofos autótrofos si utilizan SH2 a concentraciones bajas. Son organismos muy versátiles metabólicamente. Al igual que las bacterias púrpuras no del azufre viven en hábitats con materia orgánica abundante, que van a poder utilizar para generar poder reductor y compuestos carbonados.

Actuarán como fotoorganotrofos heterótrofos en presencia de luz, y como quimiorganotrofos heterótrofos si no hay luz.

Cuando fijan CO2 no lo hacen por el ciclo de Calvin, sino por la ruta del Hidroxipropionato.

Ej. Gen. Chloroflexus (uno de los microorganismos más antiguos filogenéticamente)

Poseen un hábitat similar al de las bacterias púrpuras no del azufre.

3. HeliobacteriasSe trata de microorganismos fototrofos anoxigénicos. Poseen una pared gram positiva. Al hacer un gram se tiñen como gram negativas.Poseen un hábitat anóxico. Pigmentos fotosintéticos: Bacterioclorofila g (misma estructura que la clorofila a pero hidroxilada) Algunas especies son móviles por deslizamiento. También hay algunas capaces de formar endosporas.Organismos fotolitotrofos autótrofos. Para realizar la síntesis de poder reductor siguen el mismo proceso que en el caso de las bacterias verdes (los electrones se incorporan a la ferredoxina)

Ej. Gen. Heliobacterium Gen. Heliobacillus

Organismos Fototrofos Oxigénicos

Fotosíntesis oxigénica o fotosíntesis en Z

Aparecen dos fotosistemas:

- P680 (rojo)

- P700 (IR)

Por acción de la luz se produce la fotolisis del agua. Se produce la excitación de la clorofila del fotosistema P680. Ésta eleva su potencial de reducción. Cede electrones a la feofitina, ésta a las quinonas, y éstas al citocromo bf. De aquí pasan a la plastocianina (Pc) y de ahí a la clorofila del fotosistema P700. Éste se excita y se convierte en un reductor mucho más potente. Va a ceder electrones a las quinonas, éstas a la ferredoxina, de aquí a las flavoproteinas (donde se realiza la síntesis de poder reductor)

El ATP se forma en el transporte de electrones que existe entre los dos fotosistemas. Se genera un gradiente electroquímico por la extrusión de protones, lo que hace posible la fosforilación oxidativa.

Se trata de una fotosíntesis no cíclica. En ocasiones cuando sobra el NADH puede ocurrir que los electrones en vez de llegar al NADH, pasen de la ferredoxina al citocromo, volviendo a realizar el ciclo (para la síntesis de ATP?)

1. CianobacteriasSon las antiguamente llamadas algas verdeazuladas. Son microorganismos gram negativos, unicelulares o filamentosos.

Como pigmento fotosintético tienen la clorofila a aunque hay géneros que pueden poseer la clorofila a y b. Aparecen almacenados en el interior de los tilacoides, y estos aparecen a su vez adheridos a la membrana. (ficobilinas y quinonas pueden actuar también en la fotosíntesis como transportadores de energía)

Las cianobacterias asimilan CO2 por el ciclo de Calvin (fotoautótrofos) y obtienen el poder reductor del agua.

- Cianobacterias unicelulares: Pueden dividirse por fisión binaria y múltiple, dando lugar a unas células llamadas baeocitos. (de tamaño menor, que irán creciendo hasta tomar el mismo tamaño que la célula original)

- Cianobacterias filamentosas: Poseen un conjunto de células que forman un filamento (que puede ramificarse) denominado tricoma. Las células están unidas íntimamente. Los tricomas se pueden fragmentar dando lugar a los llamados hormogonios (son la forma más común utilizada para colonizar distintos ambientes)

Acinetos: Formas de resistencia que producen las cianobacterias filamentosas. No son endosporas. Son células del tricoma engrosadas, más resistentes ante los agentes externos.

Heterocistos: Son células diferenciadas (entre un 5-10% del total de las células que componen el filamento) que sirven para fijar nitrógeno.

Poseen una pared mas gruesa formada por glicolípidos (impermeable al oxígeno) En su interior poseen la enzima nitrogenasa (la cual solo puede actuar en ambientes anaeróbicos) No cuentan con el fotosistema II (P680) Se produce intercambio de nutrientes entre las células adyacentes, pero no intercambio de O2.

Cianoficina: Polímero de reserva de nitrógeno.

Las cianobacterias pueden vivir en ambientes terrestres y acuáticos (en la superficie de lagos) En ocasiones hay grandes afloramientos de cianobacterias, cuya masiva producción de toxinas (neurotoxinas) pueden provocar la muerta si son consumidas. También aparecen en la superficie de las rocas, en desiertos (en forma de costras en estado de latencia mientras no haya agua, acinetos) Hay algunas cianobacterias que establecen relaciones de simbiosis con helechos o hepáticas. También aparecen en ambientes extremos como zonas de aguas termales.

Podemos clasificarlas de la siguiente forma:

- O. Chroococcales (bacterias unicelulares de fisión binaria)

o G. Gloeobacter

o G. Gloeocapsa

o G. Prochloron *

* Antes considerado un orden aparte (Proclorofitos). Poseen clorofila ay b y tienen relación con las cianobacterias y los cloroplastos. Se pensaba que era un antecesor de éstos últimos, pero se demostró que no es así.

- O. Pleurocapsales (bacterias unicelulares de fisión múltiple)

o G. Pleurocapsa

o G. Dermocapsa

- O. Oscillatoriales (bacterias filamentosas)

o G. Oscillatoria (fija N2 sin heterocistos)

o G. Spirulina

- O. Nostocales (bacterias filamentosas. Poseen heterocistos)

o G. Nostoc

o G. Anabaena

- O. Stigonematales (bacterias filamentosas con heterocistos. Forman acinetos)

o G. Stigonema

o G. Fischerella

Tema 11. Bacterias Nitrificantes

Se trata de organismos quimiolitotrofos autótrofos. Obtienen la energía y el poder reductor a partir de la oxidación de compuestos inorgánicos (metabolismo respiratorio)

Pueden llevar a cabo respiración aeróbica (el aceptor final de electrones es el oxígeno) o anaeróbica (el aceptor final de electrones puede ser el oxígeno o el NO3

-)

La fijación de compuestos inorgánicos para obtener compuestos carbonados se lleva a cabo mediante el ciclo de Calvin.

Tipos de bacterias fijadoras de nitrógeno:

1. Bacterias nitrosificantes o bacterias oxidadoras del amonio

Oxidan NH3 / NH4+ a NO2

-

NH3 + O2 + H2+ + 2e- --- (amonio monooxigenasa)--- NH2OH (hidroxilamina) + H2O --

--- (hidroxilamina oxidoreductasa) ----- NO2- + 4H+ + 4e-

2e- de los 4 obtenidos van a ir dirigidos a la formación de la hidroxilamina, y los otros 2 e- van a pasar a la cadena de transporte electrónico a nivel del citocromo c (formación de ATP en última instancia)

Se produce menos cantidad de ATP que si los electrones se incorporaran al principio de la cadena. El poder reductor se va a generar por flujo inverso de electrones.

Estas bacterias están incluidas dentro del grupo de las -proteobacterias. Son gram negativas. Se diferencian en géneros en función de la morfología y la flagelación. También en función de la presencia o no de membranas intracitoplasmáticas. Si presentan membranas, en función de la forma de éstas.

- Nitrosomonas. Bacilos, flagelos polares, membranas laminares.

- Nitrosococcus. Cocos grandes, flagelos peritricos, membranas vesiculares.

- Nitrospira. Espirilos, flagelos peritricos, membranas vasculares.

- Nitrosolobus. Pleomórficos, flagelos peritricos, membranas vesiculares.

2. Bacterias nitrificantes

Oxidan NO2- a NO3

-

Obtienen la energía y el poder reductor de la oxidación de nitritos a nitratos mediante la actuación de la nitrooxidoreductasa o nitrooxidasa.

NO2- + ½ O2 ------------ NO3

- + 2H+ + 2e-

Se producen electrones que se van a incorporar a la cadena respiratoria a nivel del citocromo aa3 (al final). Producirán menos ATP que las bacterias nitrosificantes.

El poder reductor se sintetiza por flujo inverso de electrones. El gasto de ATP es mayor porque la incorporación de los electrones se produce al final de la cadena.

Pertenecen al grupo de las -proteobacterias. Gram negativas. Algunos ejemplos:

- G. Nitrobacter

- G. Nitrococcus

- G. Nitrospira

- G. Nitrospina

Su hábitat es el mismo que el de las cianobacterias. Aparecen ampliamente distribuidas en ambientes acuáticos, generalmente en lagos con aportes de aguas residuales (con O2

y NH4), en ambientes con proteolisis (putrefacción). Cuando el pH es muy ácido el amonio se oxida a HNO2, un agente mutagénico que va a inhibir la nitrificación.El proceso de nitrificación se da en pH de 6 aprox.

Tema 12. Bacterias oxidadoras del azufre y del hierro

1. Bacterias oxidadoras del AzufreObtienen la energía y el poder reductor de la oxidación de SH2, S, S2O3

2- a SO42-

El aceptor final de electrones es el oxígeno o el NO3-. Poseen un metabolismo

respiratorio (aerobios y anaeróbios)

(1) S ------ SO32- --------- (sulfito oxidasa) ------- SO4

2-

(2) S ------ SO32- --------- (AMPc) ------- APS --------- SO4

2-

Los organismos que realicen la ruta 2 van a poder obtener ATP por fosforilación oxidativa o a nivel de sustrato, mientras que los que realicen la ruta 1 sólo podrán obtener energía por fosforilación oxidativa. El que un microorganismo realice una vía u otra dependerá de las condiciones del ambiente.Dependiendo del producto inicial obtendremos mas o menos energía ya que cada uno se incorpora a un nivel distinto en la cadena de transporte de electrones (en función de su potencial) (ver esquema)El poder reductor se sintetiza por flujo inverso de electrones.SH2 ------- (proceso + rápido) -------- SO -------(proceso + lento) ------- SO4

2-

Esta diferencia de velocidad de los procesos va a provocar que se acumule azufre en la célula. Podemos hacer una clasificación en función de la forma en que se produzcan estas acumulaciones:Acumulaciones Intracelulares:

- Gen. Beggiatoa. Gram negativo. Utiliza SH2. Mantiene relaciones simbióticas con las plantas del arroz.

- Gen. Thermotrhrix. Aparece en fuentes termales de aguas sulfurosas. Algunas especies pueden usar NO3- como aceptor final de electrones.

(Estos dos géneros poseen especies mixotrofas: quimiolitotrofos heterótrofos)

- Gen. Thiovulum. Bacterias unicelulares, ovaladas y móviles (flagelos peritricos) Establecen relaciones simbióticas con gusanos del género Raftia. Poseen un tubo digestivo cerrado en cuyo interior hay SH2. El gusano se alimenta de productos de excreción de la bacteria o de bacterias muertas.

Acumulaciones Extracelulares

- Gen. Thiomicrospira. Bacteria espiral móvil (flagelos polares) Gram negativa. Se localizan en zonas de expansión del fondo oceánico. (emanaciones de SH2)

- Gen. Thiobacillus. Viven en zonas de pH ácido (minas de carbón, zonas de drenaje ácido,...) Podemos distinguir dos especies principales:

o Thiobacillus ferroxidans (oxida Fe también)

o Thiobacillus thiooxidans

Tema 13. Bacterias oxidadoras del Hidrógeno

H2 + ½ O2 ------- H2O

Poseen un metabolismo respiratorio aeróbico. Viven en ambientes Microaerófilos. Sólo hay dos especies que sean bacterias del hidrógeno obligadas:

- Aquifex pyrophillus- Hidrogenobacter thermofilus

Ambas especies pertenecen al grupo de bacterias “Deeply branched” (de ramificación profunda, es decir, que se ramifican más cerca del ancestro universal)

Existen otras bacterias del hidrógeno facultativas. Son organismos quimiorganotrofos heterótrofos que pueden actuar como quimiolitotrofos autótrofos si hay hidrógeno.

El organismo más característico es Ralstonia Eutropha (gram negativo). Posee dos enzimas hidrogenasas:

- Una aparece unida a la membrana. Interviene en la síntesis de ATP

- Otra aparece en el citoplasma. Interviene en la síntesis de poder reductor

El potencial del hidrógeno es mucho más negativo que el par NAD+ / NADH. El poder reductor en la enzima que aparece en el citoplasma se sintetizará de forma espontánea. En las bacterias que no poseen esta enzima el poder reductor se sintetiza por flujo inverso de electrones, a costa de gasto de ATP (el balance energético total será menor)

Su hábitat no es muy extendido. Utilizan el hidrógeno que producen otras bacterias (generalmente como resultado de fermentaciones) Hay otras bacterias que usan hidrógeno (fotosintéticas anoxigénicas, bacterias metanogénicas,...) Es la posible explicación de que la mayoría de oxidadores de hidrógeno sean facultativos.

* Bacterias oxidadoras de CO (Carboxidobacterias)

CO + H2O ------- CO2 + 2H+ + 2e-

En general todas las carboxidobacterias son facultativas. Ejemplos:

- Pseudomonas carboxidovorans (gram -)

- Bacillus Schlegelii (gram +)

Aparecen ampliamente distribuidas (el CO es un gas abundante). Estas bacterias se pueden considerar un sumidero de CO

Tema 14. Bacterias Metanotrofas y Metilotrofas

Hay un grupo de bacterias capaces de obtener la energía y los compuestos carbonados del CH4 (organismos metanotrofos). Aunque algunas otras bacterias pueden utilizar otros compuestos de un carbono (formaldehído, metanol,...), y también compuestos de dos carbonos pero sin enlaces C–C (dimetil formamida)

Las bacterias que crecen a partir de compuestos de 1 carbono o de 2 carbonos (sin enlaces C-C) son organismos metilotrofos. No viven a expensas sólo del metano.

1. Bacterias MetanotrofasEl metano es un compuesto muy abundante en la naturaleza. Es producido por las arqueas metanogénicas en ambientes anóxicos. Se trata del principal gas componente de los lodos anoxigénicos, apareciendo además en zonas pantanosas, lagos, rumen, intestino de animales, gas natural y formaciones carboníferas,...Las bacterias metanotrofas son organismos gram negativos, generalmente móviles. Poseen diferentes morfologías (espiral, bacilar, cocoide,...) Presentan esteroles en sus membranas. Además presentan una serie de formaciones membranosas distribuidas por toda la célula o en la periferia (relacionadas con la oxidación del metano). Podemos distinguir dos tipos de bacterias metanotrofas:

- Metanotrofos de tipo I. Poseen las estructuras membranosas por todo el citoplasma. No poseen ciclo de Krebs completo. Forman su materia celular por el ciclo de la Ribulosa Monofosfato. Dan lugar a estructuras de resistencia (cistes). Ej. Methylosynus, Methylocystis.

- Metanotrofos de tipo II. Poseen estructuras membranosas en la periferia celular. Poseen ciclo de Krebs completo. En su lugar utilizan la ruta de la Serina para formar el material celular. Dan lugar a estructuras de resistencia (exosporas)

Ambos tipos pertenecen a las - proteobacterias. Se localizan en zonas pantanosas, en lugares de condiciones aerobias. Se ha visto que pueden establecer simbiosis con moluscos bivalvos (ej. mejillones)Son utilizadas como alimento proteico para animales. “Single cell protein”

2. Bacterias Metilotrofas

- G. Methylophylus (obligado)

- G. Pseudomonas (gram -)

- G. Vibrio (gram -)

- G. Bacillus (gram +)

- G. Streptomyces (gram +)

2. Bacterias oxidadoras del HierroEn condiciones aeróbicas en pHs ácidos obtienen la energía de la oxidación del hierro2+

al hierro 3+. Se obtendrá una cantidad pequeña de energía porque existe poca diferencia de potencial entre el oxígeno (aceptor final de electrones) y el hierro.En condiciones anaeróbicas cuando el pH es básico el Fe2+ se oxida espontáneamente.Algunos ejemplos son:

- Gen. Sphaerotilus (natans)

- Gen. Gallionella (ferruginea)

- Thiobacillus (ferroxidans)Su hábitat es la interfase entre condiciones anóxicas y oxigénicas. En pH neutro o alcalino.En ambientes ácidos podemos encontrar a Thiobacillus ferroxidans ( y Leptospirillum ferroxidans). Posee rusticianina, una enzima periplásmica. Toma el electrón que se libera en la oxidación del hierro y lo pasa a la cadena de transporte a nivel del citocromo c, para producir ATP por fosforilación oxidativa.Otra forma de sintetizar ATP por fosforilación oxidativa es aprovechar el gradiente de pH que se crea entre el medio ambiente ácido y el pH neutro del interior celular.El poder reductor se sintetiza por flujo inverso de electrones. Se precisa un gran gasto de energía porque la incorporación de los electrones se da al final de la cadena de transporte.Estos microorganismos precisan estar oxidando hierro constantemente.Thiobacillus ferroxidans vive en ambientes de pH entre 1 y 2 (zonas de drenaje de las minas) (SFe2 ---------- H2SO4 hace que el pH sea muy ácido)FeS2 + ½ O2 + H2O ------------- Fe2+ + 2SO4

2- + 2H+ (estos productos finales acidifican el medio)El Fe3+ en pH ácido, pero no muy bajo, precipita en forma de hidróxido de hierro (le da colores rojizos a las aguas, no se observa su crecimiento como forma microbiana)Cuando el pH es muy ácido, el Fe3+ precipita en forma de jarosita (HFe3(SO4)2OH6) (dándole un color amarillento a las aguas)A pH ácido se solubiliza el aluminio, que se va a incorporar al medio. Resulta muy perjudicial para los ecosistemas acuáticos.Lixiviación: Proceso mediante el cual se extrae un mineral utilizando para ello un organismo vivo en una mena que tenga poca concentración del mineral. Generalmente en las menas poco concentradas resulta muy cara la extracción. Si se utiliza un microorganismo el proceso es más rentable. Ej. CuS2------CuSO4 (cavelita). El Cu es muy soluble en agua, así se podrá extraer con facilidad.

Tema 15. Bacterias reductoras de sulfato

Organismos de metabolismo quimiorganotrofo heterótrofo. Versátiles metabólicamente (utilizan ácidos orgánicos, alcoholes y ácidos grasos). Son organismos anaeróbios estrictos. Vivirán en ambientes anóxicos.Poseen un metabolismo respiratorio. No fermentan. Realizan respiración anaerobia, utilizando como aceptor final de electrones los sulfatos mayoritariamente.

Síntesis de SH2 (ver fotocopias)

Sulfato---(activación con ATP)---APS---Bisulfito----Trionato----Tiosulfato----Sulfuro

APS. Adenosín fosfosulfato

Este proceso se denomina Reducción Desasimilatoria del sulfato. Las bacterias enriquecen el ambiente en S llevando a cabo esta serie de reacciones.

Sin embargo, para poder ser asimilado, el azufre ha de ser reducido primero a ácido sulfhídrico, que posteriormente se incorporará a los compuestos orgánicos.

Sulfato---(1ª activación con ATP)---APS---(2ª activación con ATP)---PAPS-----Sulfuro

Esta reacción se denomina Reducción Asimilatoria del sulfato.

Se trata de organismos gram negativos. Son -proteobacterias. Algunos ejemplos son:

- G. Desulfovibrio

- G. Desulfobacter

- G. Desulfuromonas

Un ejemplo gram positivo es G. Desulfotomaculum. Se tiñe como un organismo gram negativo, pero tiene una pared de gram positivo (gram + con bajo contenido G-C). Es un género con morfología bacilar que produce endosporas. A veces produce alteraciones en las latas de conserva (ennegrecimiento por acción del SH2, precipita SH2Fe)

Columna de Winogradsky

Tradicionalmente se ha utilizado en el enriquecimiento (con el fin de aislar) bacterias fototrofas anoxigénicas (púrpuras, verdes y Heliobacterias), bacterias reductoras del sulfato y otros microorganismos anaeróbios.

Se trata de un ecosistema anóxico a pequeña escala que hacemos crecer en el laboratorio. Consta de un cilindro de vidrio lleno hasta su mitad de lodo rico en materia orgánica. También se añade una fuente de carbono que no sea fácilmente metabolizable (por ejemplo, papel) Después se añade agua hasta llenarlo. Después se tapa (pero no herméticamente) y se mantienen un par de días en la oscuridad, para después dejarlo expuesto a la claridad.

En la parte superior crecerán cianobacterias (microorganismos oxigénicos). En las zonas anóxicas (en el lodo rico en materia orgánica) crecerán las bacterias reductoras del sulfato dando lugar a ácido sulfhídrico, sustancia que podrán utilizar los fototrofos anoxigénicos. En un ámbito sin luz ese ácido sulfhídrico podría ser utilizado por los quimiolitotrofos autótrofos.

Tema 16. Pseudomonas (y bacterias relacionadas) y Legionella

PseudomonasEs un grupo de bacilos gram negativos que tienen la característica común de ser aerobios estrictos. Poseen un metabolismo respiratorio. El aceptor final de electrones es el oxígeno (aunque algunas van a poder usar los nitratos y realizar una respiración anaerobia). Nunca van a realizar fermentación. Son organismos quimiorganotrofos heterótrofos.

Este grupo no tiene una entidad taxonómica real. Comprende 4 géneros principales con unas características comunes, que son las siguientes.Morfología bacilar. Gram negativos. Móviles por flagelos polares siempre (excepto Burkholderia mallei, que es inmóvil) No esporulan. Muchos de ellos acumulan gránulos de poli-OH-butirato como sustancia de reserva. Poseen una membrana externa bastante impermeable, lo que les hace muy resistentes a muchos agentes antimicrobianos. Utilizan la ruta de Entner-Doudoroff para obtener piruvato.Son microorganismos muy versátiles metabólicamente. Pueden utilizar azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, alcoholes, compuestos aromáticos, etc.En general no precisan factores de crecimiento. Algunos pueden ser quimiolitotrofos autótrofos (ej. Pseudomona carboxidoborans utiliza hidrógeno y CO2) Poseen plásmidos R (les confieren resistencias). Pueden ser patógenos de animales y plantas. Pueden ser utilizados como degradadores de vertidos petrolíferos.

G. PseudomonasP. aeuroginosa. Es capaz de producir dos pigmentos característicos:

- Pioverdina . Es de color verdoso. Fluorescente a la luz UV

- Piocianina . Es de color azul. Poseen propiedades antimicrobianas (puede suponer una ventaja a la hora de competir por el nicho)

Es capaz de crecer a temperaturas de 43-44 ºC. Se trata de un patógeno oportunista para el hombre. En determinadas condiciones puede causar infecciones (gastroenteritis, infecciones urinarias, conjuntivitis,...) Se controla su presencia en alimentos y aguas (en aguas de piscinas de forma significativa) Es además un patógeno nosocomial.Patógeno nosocomial es aquel que se adquiere en los hospitales (durante traqueotomías, en unidades de quemados, en la implantación de catéteres,...). En las quemaduras produce el llamado “pus azul” (por el efecto de la piocianina) Para tratarlo se utilizan antibióticos como las cefalosporinas.

P. fluorescens. Solo produce el pigmento pioverdina. Se trata de un microorganismo cuya temperatura óptima de crecimiento es 28ºC, por ello no constituye un patógeno para el hombre. Se ha utilizado como modelo para el estudio de rutas metabólicas. Está ampliamente distribuido (suelo, agua,...)

P. putida. Al igual que la anterior sólo produce el pigmento pioverdina. Posee un genoma y unas características fisiológicas muy parecidas a P. fluorescens. Presenta el plásmido TOL, que le permite degradar tolueno y otros compuestos difícilmente metabolizables, por ello se utiliza cuando se produce un vertido en un ecosistema acuático, por ejemplo.

P. syringae. Es un patógeno de plantas. Este tipo de microorganismos está muy adaptado a sus huéspedes, ya que su único hábitat son precisamente éstos. Se trata de un organismo citocromo oxidasa negativo, No presenta citocromo c en la cadena respiratoria. La mayoría de los microorganismos del género Pseudomonas son citocromo oxidasa positivos. Ésta es la única excepción. En su pared posee una proteína que permite que las moléculas de agua se alineen unas con otras y formen cristales de hielo (sirve para crear nieve artificial)

G. Comamonas

La diferencia con el resto es que se trata de un grupo compuesto por microorganismos no pigmentados. Poseen gránulos de reserva de poli-OH-butirato.Es un grupo poco versátil metabólicamente. Utilizan fundamentalmente ácidos orgánicos y aminoácidos raros (ej. norleucina). Incluso hay una cepa capaz de utilizar la testosterona (C. testosteroni)

G. BurkholderiaSon microorganismos no pigmentados que acumulan gránulos de poli-OH-butirato. Algunos ejemplos son:

- B. pseudomallei. Es un patógeno endémico en el sudeste asiático. Se transmite a través de heridas. Produce necrosis de los tejidos, afecciones pulmonares, etc.

- B. cepacea. Es un patógeno de plantas (bulbo de la cebolla, produce necrosis)

- B. mallei. Es un patógeno de animales. En los caballos produce la enfermedad llamada “muermo”. Se trata de un aletargamiento. Puede transmitirse al hombre.

G. RalstoniaLos microorganismos de este género requieren factores de crecimiento para desarrollarse (como vitaminas). Algunos ejemplos son:

- R. eutropha. Antes llamada Alcaligenes eutrophus. Utiliza el H2

- R. solanacearum. Es un patógeno de plantas (como la patata). Como todos los patógenos de plantas, aparece muy adaptado a su hospedador.

Géneros relacionados

G. XanthomonasSon microorganismos de forma bacilar, quimiorganotrofos heterótrofos, citocromo oxidasa negativos. Producen pigmentos (xantomonodina) que les confieren colores rojizos. Precisan factores de crecimiento para su desarrollo. Son patógenos de plantas. Por ejemplo, Xanthomonas campestris produce una gran cantidad de toxinas y enzimas. Es una especie muy proteolítica, destruye los tejidos de la planta.

G. ZoogleaSon microorganismos de forma bacilar, citocromo oxidasa positivos. Requieren vitamina B12 para crecer.Un ejemplo es Zooglea ramígera, un microorganismo que se utiliza en la depuración de aguas residuales. Los individuos de esta especie poseen un metabolismo muy activo, son capaces de degradar gran cantidad de materia orgánica. Excretan un mucílago que se queda alrededor del microorganismo. Esto hace que puedan unirse entre sí formando lo que se llama un flóculo (tamaño microscópico). Permiten la decantación.Este microorganismo forma parte de los denominados fangos activados.

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G. Legionella (no entra dentro del grupo de pseudomonas)Es un género de microorganismos de forma bacilar, gram negativos. Entran dentro del grupo de las -proteobacterias. Son organismos aerobios estrictos (metabolismo respiratorio) Quimiorganotrofos heterótrofos. Precisan factores de crecimiento (iones y algunas moléculas diversas, Fe, cys,...) para desarrollarse.Habitan en el suelo o en ambientes acuáticos de aguas cálidas. También se encuentran en las torres de refrigeración y en duchas.Se trata de un microorganismo patógeno para el hombre. Produce neumonía (fiebre alta, tos improductiva,...) No se transmite de persona a persona, sino por aerosoles que el hombre inhala (mayor incidencia en hombres adultos con hábitos fumadores,...) Su prevención parte del aseo de los sistemas de aire acondicionado y duchas colectivas, etc.L. pneumophila. Es el microorganismo implicado en la legionelosis. También produce la “enfermedad de Pantiac” (afección respiratoria leve)

Tema 17. Bacterias fijadoras de nitrógeno

Son microorganismos gram negativos, de forma bacilar, aerobios estrictos. Poseen un metabolismo respiratorio aeróbico. Quimiorganotrofos heterótrofos. Son móviles pero nunca por flagelos polares (serán laterales, subpolares, peritricos,...)

Podemos distinguir dos grupos, que son los siguientes:

- Bacterias fijadoras de nitrógeno en simbiosis con leguminosas- Bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre

Bacterias fijadoras de nitrógeno en simbiosis con leguminosas

Son -proteobacterias. Distinguimos 2 géneros principales:

- G. Rhizobium- G. Bradyrhizobium

Beijerinck aisló por primera vez los nódulos fijadores de nitrógeno en leguminosas. Existe una gran especificidad entre los microorganismos fijadores y la planta.

Proceso de formación de los nódulos:

1. Adherencia. Es preciso que el microorganismo se una a los pelos radicales de la planta. Este proceso se lleva a cabo por las ricadesinas

2. Síntesis de factores NOD. Estos están implicados en la curvatura inicial del pelo radical.

3. Penetración del microorganismo en el interior del pelo radical.

4. Crecimiento del tubo de infección (propiciado por los factores NOD). Este tubo va creciendo, de forma simultánea a la entrada del microorganismo en el pelo radical, hasta llegar al cortex de la raíz (en el tubo es donde están las bacterias)

5. Formación de los nódulos estimulada por los factores NOD. Éstos activan el crecimiento celular de la planta, dando lugar a estas excreciones celulares que son los nódulos.

En el interior de los nódulos, a medida que se van formando, los rizobios se van transformando en las formas activas de fijación de nitrógeno (los bacteroides). Son células que presentan una forma indeterminada, amorfa, ramificados. Generalmente se encuentran solos en el nódulo o en grupos, y siempre rodeados por una membrana (membrana peribacteroidal). A este conjunto de células y membrana se le denomina simbiosoma.

Bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre

Llevan a cabo su metabolismo en condiciones aeróbicas. Distinguimos dos géneros principales:

- G. Azotobacter- G. Azomonas

Ambos géneros pertenecen a la familia Pseudomonadaceae

Los individuos del género Azotobacter son bacilos rectos gram negativos, aerobios estrictos, móviles por flagelos peritricos. Fijan nitrógeno atmosférico. También tienen nitrogenasa. Para crear condiciones de anaerobiosis (para que la nitrogenasa pueda actuar) cuentan con una elevada tasa metabólica. Consumen mucho oxígeno (para el caso de Azomonas ocurre lo mismo)

Azotobacter además forma cistes como estructuras de resistencia (son células engrosadas, no endosporas)

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G. AgrobacteriumNo se trata de organismos fijadores de nitrógeno, pero pertenecen a la familia Rhizobiaceae. Son -proteobacterias. Poseen una morfología bacilar, gram negativos, móviles por flagelos (1-4 flagelos laterales) Aerobios estrictos. Poseen un metabolismo aeróbico respiratorio. Son capaces de formar tumores en plantas

- A. tumefaciens. Forma tumores en los tallos. Se debe a la presencia de un plásmido (plásmido Ti)

- A. rhizogenes. Forma tumores en las raíces. También se debe a la presencia de un plásmido (plásmido Ri)

(Ver en fotocopias los esquemas de los plásmidos) Los plásmidos presentan las siguientes regiones:

T-DNA. Región en la que están codificados los oncogenes y más moléculas llamadas opinas.

Genes vir (virulencia). Hay varios tipos

A. tumefaciens penetra en la planta a través de las heridas. La región del T-DNA se recombina con los cromosomas de la planta. Después comienza a formarse el tumor (en el tallo, en este caso)

Cuando una planta tiene heridas se empiezan a sintetizar compuestos fenólicos que activan los genes vir. Estos genes están implicados en la rotura del plásmido a nivel del T-DNA y en la formación del poro en el núcleo para que el T-DNA pueda entrar a la célula.

Los oncogenes se expresan una vez en el interior. Comienzan entonces a sintetizarse proteínas que generan un crecimiento celular incontrolado. Las opinas permiten que el organismo siga creciendo (le sirven de alimento)

Forman lo que se denomina “agallas en corona”

Este microorganismo ha servido como modelo para el estudio de tumores. Es de gran interés también en ingeniería genética ya que en el plásmido se pueden incorporar genes de resistencia a plagas, pesticidas, etc...

A. rhizogenes actúa utilizando el mismo mecanismo. Los tumores se producen en este caso en las raíces. Se observan entonces las llamadas “raíces pilosas”.

Los oncogenes producen la síntesis de auxinas, y estas propician un crecimiento incontrolado de las raíces.

Tema 18. Bacilos gram negativos anaerobios facultativos

En este tema se van a estudiar organismos de morfología bacilar (bacilos rectos y curvados), gram negativos, anaerobios facultativos, que van a tener diversos tipos de metabolismo (respiratorio y fermentativo)

Familia Enterobacteriaceae

Pertenecen al grupo de las -proteobacterias. Esta familia está formada por bacilos rectos y cortos, también llamados cocobacilos. Son gram negativos. Inmóviles y móviles (por flagelos peritricos). Anaerobios facultativos. No producen esporas. Algunos poseen cápsula. Algunos también pueden utilizar nitratos como aceptor final de electrones. Ven estimulado su crecimiento en medios de cultivo por la bilis. No requieren otros factores especiales de desarrollo.Poseen hábitats muy diversos. Pueden vivir en medios terrestres, acuáticos y en el intestino de animales y seres humanos. Por ello los microorganismos de esta familia constituyen un indicador de contaminación fecal.Todos realizan la fermentación de la glucosa con producción de ácido (sólo los que poseen la enzima HLF producirán gases) (HLF: hidrogenoliasa fórmica)

Para degradar la glucosa van a poder utilizar dos vías:- Fermentación ácido-mixta (con producción de ácidos, acidificando el medio)- Fermentación butanodiólica (con producción de ácidos también y alcoholes (en

mayor proporción), neutralizando el medio.

Las enterobacterias son todas oxidasas negativas (a diferencia de las pseudomonas, que son oxidasas positivas y poseen flagelos polares)

G. EscherichiaDe este género forma parte Escherichia coli. Su hábitat es el intestino, por ello constituye un indicador de contaminación fecal, y un parámetro a controlar en los análisis de aguas. Es un organismo implicado en la síntesis de algunas vitaminas (K).

Se trata de un bacilo corto, crece a 37 y 43ºC y fermenta la lactosa (organismo coliforme)

Dentro de la familia de las enterobacterias se distinguen dos grupos:

- Fermentan la lactosa (lac+): Coliformes

- No fermentan la lactosa (lac-): No coliformes

E.coli sí es capaz de fermentar la lactosa a 43ºC, por eso decimos que se trata de un coliforme fecal.

La prueba del IMViC revela como positivas las pruebas del Indol y del rojo de metileno para E.coli. El resto de pruebas son negativas

Solo algunas cepas, la minoría, son de carácter patógeno:

* E.coli K12. Se relaciona con casos de meningitis. Posee cápsula.

Otras cepas se relacionan con infecciones alimentarias, contaminación de aguas, problemas gastrointestinales:

- E.coli enterotoxigénica (ECET). Provoca la “gastroenteritis del viajero”

- E.coli enterohemorrágica (ECEH) [O157.H7]

G. SalmonellaSe trata de un género compuesto por bacilos cortos, con flagelos peritricos. Organismos patógenos, no coliformes (no fermentan la lactosa). La prueba del IMViC revela como positivas las pruebas del rojo de metileno y del citrato. El resto son negativas

- S. typhi Agente causante de las “fiebres tifoideas”. Se transmitía vía agua, alimentación o a través de personas portadoras.

- S. enteritidis y S. typhimurium. Microorganismos productores de la salmonelosis.

G. ShigellaPosee las mismas características que E.coli, excepto que se trata de un organismo no móvil, ni coliforme (no fermenta lactosa). La prueba del IMViC revela como positiva la

prueba del rojo de metileno. La prueba del Indol tiene un resultado variable. El resto son negativas

- S. dysenteriae. Causa la disentería (gastroenteritis que cursa con diarreas, sangre y un largo etc de cosas muy desagradables)

- S. sonnei. Provoca una gastroenteritis muy agresiva (circula por Europa aún)

G. YersiniaBacilo corto, inmóvil, no coliforme (no fermenta lactosa) Hay cepas patógenas para hombre y animales. La prueba del rojo de metileno resulta positiva para estos organismos.

- Y. pestis. Agente productor de la peste bubónica

- Y. enterocolitica. Provoca gastroenteritis. Se controla su presencia en alimentos

G. EnterobacterBacilo, móvil. La prueba del IMViC resulta positiva para el Citrato y para Volges Proskawer. Fermentan la lactosa a 37ºC (coliforme no fecal)

- E. aerogenes. No es un organismo patógeno (patógeno oportunista sí)

G. SerratiaOrganismos móviles. Fermentan la glucosa por la vía butanodiólica

- S. marcescens, Produce un pigmento de color rojo llamado “prodigiosina” (milagro de las ostias sangrantes...)

Géneros de bacterias coliformes (lac+)

- G. Escherichia

- G. Enterobacter

- G. Citrobacter

- G. Klebsiella

Familia Vibrionaceae

Esta familia pertenece al grupo de las -proteobacterias. Se trata de microorganismos con forma de bacilos curvados (vibrios). Son gram negativos, anaeróbios facultativos (realizan respiración y fermentación) La mayoría son móviles por flagelos polares. Son oxidasa positivos. Viven en ambientes acuáticos, marinos y de agua dulce.

G. VibrioPoseen las características generales de la familia. La mayor parte de las especies son halófilas, es decir, precisan concentraciones de NaCl más o menos elevadas para vivir.

Una excepción es V. cholerae, que es una especie de agua dulce. Es el microorganismo que produce el cólera (diarreas muy agresivas). (La solución para erradicarlo es la utilización de buenos sistemas de potabilización de aguas)

Otra especie es V. parahaemolyticus. Produce gastroenteritis asociada al consumo de pescado y marisco (crudo fundamentalmente) Es uno organismo halófilo.

G. PhotobacteriumEs un género compuesto por bacterias luminiscentes de forma bacilar, con flagelos polares. Están asociadas a ambientes acuáticos (viven sobre peces muertos, en simbiosis con organismos acuáticos,...) Emiten luminiscencia por la presencia de una enzima llamada “luciferasa” (de interés en microbiología agrícola), la cual solo actúa en ambientes oxigénicos. Ej. P. phosphoreum

(Dentro del género vibrio también aparece alguna especie luminiscente)

Tema 19. Bacilos y Cocos Gram positivos. No esporulados

G. Micrococcus

Poseen forma cocoide. Se agrupan dando lugar a estructuras características (tétradas). Son microorganismos aerobios estrictos. Llevan a cabo un metabolismo respiratorio. Son organismos inmóviles. Aparecen ampliamente distribuidos en el ambiente (también en la superficie cutánea, en el pelo,...). No son patógenos.

Un ejemplo es M. luteus. Produce pigmentos carotenoides (amarillentos)

G. StaphylococcusSe trata de un género formado por cocos gram positivos, que se agrupan por parejas o en racimos. Son anaeróbios facultativos (a diferencia de los micrococos que son aerobios estrictos). Realizan también fermentación (produciendo ácido láctico)

Son catalasa positivos (a diferencia de las bacterias del ácido láctico)

Se trata de microorganismos pigmentados en su mayoría. Producen pigmentos carotenoides. No son exigentes metabólicamente. Viven sobre la piel, en las glándulas cutáneas, en las mucosas, aire, alimentos, etc...

- S. epidermidis. Generalmente es el que está en la superficie de la piel. No es un patógeno, pero puede serlo en condiciones de inmunodeficiencia (patógeno oportunista)

- S. aureus. Se trata de un organismo patógeno. Aparece en la piel, en las mucosas (nasales principalmente). Origina gran cantidad de enfermedades: Contamina heridas, provoca la aparición de forúnculos y granos, diversas afecciones de la piel (impétigo, síndrome de la piel escaldada, síndrome del shock tóxico,...) También produce intoxicaciones alimentarias de carácter leve.

Este microorganismo posee un poder patógeno muy amplio. Una enzima que se utiliza en la detección de este microorganismo es la cogulasa (S. aureus coagula el plasma de conejo)

Las dos especies producen slime (polisacárido que excretan para fijarse a las superficies lisas, a modo de pegamento. Eso aumenta su poder patógeno)

G. DeinococcusEste es un grupo de microorganismos pertenecientes a las bacterias “deeply branched”. Son cocos gram positivos, anaeróbios facultativos, muy resistentes a las radiaciones (ionizantes y no ionizantes)

Un ejemplo es D. radiodurans. Es una especies que se aísla en lugares con altos niveles de radiación (reactores nucleares, cercanías). Es un microorganismo gram positivo. En la parte exterior al Peptidoglicano tiene una capa similar a la membrana externa de las bacterias gram negativas (pero sin lípido A). Esto es lo que le hace tan resistente.

Las enzimas implicadas en la reparación de las mutaciones en el DNA son más efectivas de lo habitual en estos organismos.

Bacterias de ácido lácticoSe trata de cocos y bacilos, todos ellos gram positivos con un bajo contenido G-C. Son organismos aerotolerantes (solo realizan fermentación) Pueden ser:

- Homofermentadores. Producen ácido láctico

- Heterofermentadores. Producen ácido láctico, etanol y CO2

Son organismos catalasa negativos. No degradan al agua oxigenada. Muy exigentes metabólicamente (microorganismos fastidiosos, precisan muchos nutrientes para crecer) Viven en ambientes ricos en nutrientes, como los alimentos, mucosas (vaginal e intestinal) No son pigmentados

Homofermentadores

G. StreptococcusAparecen agrupados en parejas o cadenas. Son unos microorganismos importantes para la industria alimentaria, pero también hay especies patógenas.

- S. thermophilus. Se usa como cultivo iniciador para producir yogur.

- S. pyogenes. Es un agente implicado en el impétigo, faringitis, amigdalitis, escarlatina (producida por algunas cepas de S. pyogenes en las que aparece lisogeneizado un fago). Las afecciones provocadas por esta especie han de ser tratadas rápidamente con antibióticos, ya que pueden dejar secuelas afectando al riñón (glomerulonefritis aguda), al corazón (fiebres reumáticas), etc.

- S. pneumoniae. Provoca neumonías. Generalmente aparece agrupado de dos en dos, con cápsula (neumococos)

- S. mutans. Produce la caries dental

G. EnterococcusLas especies de este género aparecen en parejas o en cadenas. No se suelen usar en la industria alimentaria. Sirven como indicadores de contaminación fecal (estreptometría)

E. faecalis. Habita en el intestino. No es un patógeno, pero puede serlo en condiciones de inmunodeficiencia

G. LactococcusLas especies de este género aparecen en parejas o en cadenas. Es un microorganismo muy importante en la industria alimentaria. Ej. L. lactis, L. cremoris, actúan como organismos iniciadores para producir quesos, mantequilla, etc.

G. PediococcusSe trata de un género importante en la industria alimentaria. Produce la fermentación en la producción de salchichas, salamis,... Algunas especies están implicadas en el deterioro de la cerveza.

Heterofermentadores

G. LactobacillusDentro de este grupo hay algunas especies homofermentadoras. Tienen forma bacilar, se encuentran en parejas o en grupos densos. No son organismos patógenos. Son de gran importancia en la industria alimentaria (fabricación de leches fermentadas, encurtidos...)

Ej. L. delbrueckii subsp. bulgaricus es el microorganismo que produce el yogur.

L. acidophilus o bacilo de Doderlein. Forma parte de la flora vaginal, mantienen el pH ácido e impide que se produzcan infecciones, principalmente por cándidas (levaduras)

G. LeuconostocTambién es un género importante para la industria alimentaria. Son cultivos iniciadores en la fabricación de encurtidos (pepinillos, aceitunas, etc.) Morfología cocoide.

Tema 20. Bacilos y cocos gram positivos. Esporulados

G. BacillusSe trata de un grupo formado por bacilos rectos. Generalmente son anaeróbios o anaeróbios facultativos. Viven en el suelo. Son organismos quimiorganotrofos heterótrofos. Llevan a cabo un metabolismo respiratorio aeróbico o realizan fermentaciones (ácido-mixta o butanodiólica) Suelen ser organismos mesófilos (viven a 30-37ºC), pero también hay especies termófilas y psicrófilas.

Algunas especies pueden presentar cápsula como es el caso de B. anthracis, el agente productor del carbunco. Existen diversos tipos de carbunco:

- Carbunco cutáneo. La infección se produce a través de heridas

- Carbunco pulmonar. Inhalación de esporas

- Carbunco gastrointestinal. Ingestión por esporas. Es el tipo más grave.

Otra especie de carácter patógeno es B. cereus, que provoca meningitis, endocarditis e intoxicaciones alimentarias como:

- Síndrome diarreico

- Síndrome emético (provocado por el consumo de arroz)

Dentro de este género hay especies utilizadas como insecticidas biológicos. Es el caso de B. thuringiensis, que produce hasta 4 tipos de cristales parasporales que afectan a diversas clases de insectos. Otros microorganismos que producen este tipo de cristales son B. sphaericus y B. popiliae.

El género Bacillus también tienen una importancia industrial por la producción de enzimas.B. subtilis y B. licheniformis son los principales productores de amilasas (fabricación de edulcorantes, tratamiento de tejidos duros), celulasas (fabricación de pan, zumos, tratamiento de tejidos duros), lipasas y proteasas (fabricación de detergentes).

G. PaenibacillusEste es un género compuesto por algunas especies del género Bacillus. Un ejemplo es P. polymyxa. Es un organismo productor de antibióticos (polimixina)

G. SporosarcinaLos microorganismos de este género son de forma cocoide y esporulan.

G. ThermoactinomycesMicroorganismos con forma bacilar, productores de esporas, termófilos y de carácter filamentoso.

G. ClostridiumSe trata de bacilos gram positivos, productores de esporas. En este caso la espora deforma a la célula vegetativa.Los clostridios son anaeróbios estrictos (siempre fermentan) Pueden utilizar azúcares y fermentarlos dando lugar a ácido butírico (fermentación acetobutírica) Son también capaces de degradar la celulosa dando como resultado etanol y ácidos orgánicos. El etanol puede a su vez servir de combustible (generado de forma natural a partir de residuos madereros _ se investiga su posible aplicación)Como fuente de carbono utilizan aminoácidos. Siempre productos proteicos. Como consecuencia de su degradación se producen compuestos con malos olores, como la “cadaverina” o la “putrescina”Hay algunas especies patógenas:

- C. tetani. Agente causante del tétanos. Se produce cuando las esporas penetran a través de una herida. Germinan en heridas profundas, donde se dan condiciones

de anaerobiosis, y producen toxinas que provocan una contracción muscular generalizada.

- C. botulinum. Es el agente causante del botulismo, una intoxicación alimentaria muy grave. Se produce por ingestión de alimentos contaminados por este microorganismo. La espora germina en éste y produce toxinas (toxina botulínica) que actúan sobre el sistema nervioso central dando lugar a la llamada parálisis fláccida (que causa la muerte por parada cardiorrespiratoria)

Tema 21. Actinomicetos y bacterias relacionadas

En este tema se van a estudiar organismos gram positivos, con un alto contenido G-C. Muchos de ellos son microorganismos filamentosos. Pertenecen a la Clase Actinobacteria. Aparecen diferentes grupos:

1. CorinebacteriasMicroorganismos con forma bacilos rectos que pueden presentar extremos afilados o en forma de maza.

Cuando se dividen no se separan las masas celulares, produciéndose unas agrupaciones con morfología de letras chinas.

G. Corinebacterium

- C. diphteriae. Agente causante de la difteria

* La vacuna DPT protege frente a la difteria, la tos ferina y el tétanos.

2. Micobacterias

G. Micobacterium

Está formado por bacilos rectos o ligeramente curvados y que a veces se ramifican formando filamentos. Estos filamentos se fragmentan para dar lugar a las formas bacilares de partida, incluso pudiendo generar también cocos.

Son microorganismos aeróbicos. Posen un crecimiento muy lento (de al menos 20 días en medios de cultivo en laboratorio)

- M. bovis: tuberculosis en animales

- M. tuberculosis: tuberculosis en el ser humano

- M. leprae: agente productor de la lepra

Se trata de organismos ácido-alcohol resistentes, por la posesión de ácidos micólicos en sus membranas. Para observarlos se utiliza la tinción de Ziehl-Neelsen.

3. Bacterias NocardiformesMicroorganismos capaces de formar un micelio sustrato (conjunto de hifas que crecen adheridas a una superficie sólida) y un micelio aéreo.

Participan en la degradación de los hidrocarburos. Contribuyen al deterioro de las juntas de goma de las tuberías. Hay especies patógenas relacionadas con diversas afecciones pulmonares.

4. Bifidobacterias

G. Bifidobacterium

Son organismos gram positivos, aerobios o anaerobios facultativos. Poseen morfología bacilar aunque pueden hincharse y ramificarse.

Estos microorganismos constituyen la mayor parte de la flora intestinal de los recién nacidos (si son alimentados con leche materna) Tienen además una gran importancia en la industria láctea.

5. Propionibacterias

G. Propionibacterium

Este género está formado por microorganismos de forma bacilar pleomórficos (pueden adoptar diversas morfologías)

Se utilizan en la industria láctea en la producción de queso Emmental. Los agujeros característicos de este queso se deben a la producción de CO2 en la fermentación propiónica que llevan a cabo las propionibacterias.

6. Actinomicetos

G. Streptomyces

Está constituido por bacterias filamentosas. A lo largo de su ciclo de vida se puede observar un micelio sustrato y un micelio aéreo. A partir de una espora se forma un micelio sustrato (conjunto de hifas delgadas que crecen muy bien adheridas a una superficie sólida) y a partir de éste se formará otro micelio que se eleva hacia el exterior (micelio aéreo) compuesto por hifas gruesas. El micelio aéreo se fragmenta para dar lugar a las esporas de partida.

Se trata de microorganismos aerobios estrictos. Llevan a cabo un metabolismo respiratorio. Utilizan una gran cantidad de compuestos carbonados para sintetizar energía.

Sintetizan antibióticos (casi todos los que utilizamos)

Son estos organismos los que producen el olor a tierra mojada cuando llueve. Producen además una gran cantidad de enzimas hidrolíticas, algunas de las cuales se están

investigando para su utilización en la industria papelera (Ej. Xilanasas y mananasas para el blanqueo de papel)

Generalmente no son organismos patógenos, aunque aparecen algunas especies patógenas de plantas. Degradan la materia orgánica. Se está estudiando su utilización para la degradación de compuestos xenobióticos (de difícil descomposición)

Tema 22. Dominio Archaea

El Dominio Archaea está compuesto por organismos gram positivos y gram negativos (o que se tiñen como tales).

Aparecen microorganismos con forma de coco, bacilo, espirilo, lobulados... Pueden ser de tipo unicelular y filamentosos (llegando a formar agregados)

Se dividen por fisión binaria, múltiple, por gemación,... Pueden ser aerobios, anaeróbios facultativos o anaeróbios estrictos.

Su pared celular está compuesta por pseudopeptidoglucano. Algunas especies tienen paredes celulares formadas por proteínas o glucoproteínas, o simplemente formadas por material polisacarídico (polisacáridos complejos). Los lípidos de membrana son cadenas de isoprenoides.

Poseen un metabolismo quimiorganotrofo heterótrofo o quimiolitotrofo autótrofos. No hay fototrofos.

La mayoría de las arqueas no realiza la glucólisis (carecen de la enzima 6-fosfofructoquinasa) Utilizan para la síntesis de piruvato la ruta de Entner-Doudoroff. Hay arqueas que poseen ciclo de Krebs y otras que lo tienen modificado.

Poseen un cromosoma circular más pequeño que los de las bacterias. Poseen pocos plásmidos. El T-RNA iniciador no tiene timina, sino pseudouridina, por ello el primer aminoácido de las proteínas será la metionina, a diferencia de la formilmetionina, presente en bacterias y eucariotas.

Viven en lugares de condiciones extremas (aguas hirvientes, hielo, zonas hiperácidas, hipersaladas, etc.)

Se considera la existencia de 3 reinos o filum:

1. Filum KorarchaeotaNo se han aislado aún en el laboratorio microorganismos pertenecientes a este reino. Se tiene constancia de su existencia por el aislamiento de su DNA (aislados moleculares) Se han obtenido de las fumarolas del parque de Yellowstone, zonas ricas en H2. Se trata de microorganismos que utilizan el hidrógeno como fuente de energía. Como aceptor final de electrones pueden utilizar azufre, nitratos, nitritos o hierro (respiración anaeróbica) Estos eran los componentes del ambiente primitivo de la tierra, por eso se piensa que son unos organismos muy antiguos y que podrían llegar a aislarse en ambientes extraterrestres de estas características.

2. Filum CrenarchaeotaDentro de este reino hay microorganismos que pueden encontrarse en una gran variedad de ambientes. La mayoría son termófilos y suelen ser también acidófilos. Crecen en zonas ricas en azufre. También pueden ser psicrófilos.

Hay microorganismos anaerobios estrictos o facultativos y aerobios. Los anaeróbios van a utilizar generalmente como aceptor final de electrones a compuestos diferentes al oxígeno.

Se observaron también en el parque de Yellowstone en unas zonas llamadas “sulfateras”, que se encuentran a altas temperaturas. También se encuentran en zonas de actividad volcánica

- G. Staphylotermus. Este género ha sido aislado junto a zonas volcánicas, a 2.500 m de profundidad.

- G. Sulfolobus. Microorganismos gram negativos. Son aerobios. Presentan formas irregulares (lobuladas) Su temperatura óptima de crecimiento está entre 70 y 80ºC. El pH en torno a 2-3. Utiliza el oxígeno como aceptor final de electrones, aunque también puede utilizar el hierro.

- G. Thermoproteus. Microorganismos gram negativos. Son anaeróbios estrictos. Su temperatura óptima de crecimiento está en torno a los 80-97ºC y en un pH de 2,5-6. Generalmente son quimiorganotrofos heterótrofos, utilizan como aceptor final de electrones sulfatos o sulfitos, aunque algunos pueden crecer como quimiolitotrofos autótrofos.

3. Filum EuryarchaeotaPodemos distinguir los siguientes grupos dentro de este reino:

3.1 HalobacteriasSon las denominadas “halófilas extremas”. Es un grupo importante de arqueas. Precisan para sobrevivir concentraciones en NaCl de al menos 1,5 M, si no es así sus membranas se destruyen. Las condiciones óptimas de crecimiento están en torno a las concentraciones de 2 a 4 M. Existen formas cocoides (Ej. Halococcus)

G. Halobacterium

Este género está formado por bacilos móviles. Viven en ambientes salinos (salinas, lagos muy salados como el Mar Muerto, y en alimentos en salazón)

Estos microorganismos son generalmente pigmentados. Producen unos pigmentos anaranjados-rojizos (carotenoides) que les sirven de protección frente a la luz.

H. salinarum. Es capaz de obtener energía de la luz sin presentar ningún tipo de clorofilas. Es un organismo aerobio. En presencia de oxígeno se comporta como un quimiorganotrofo heterótrofo, realiza respiración aeróbica. Pero cuando los niveles de oxígeno son más bajos y hay una gran cantidad de luz, el microorganismo utiliza esta fuente de energía para sintetizar ATP.

El microorganismo genera lo que se denomina una membrana púrpura (modifica su membrana) En ella existe una proteína denominada “bacteriorrodopsina”. Su estructura es muy similar a la de la rodopsina que hay en los conos y bastones de la retina. Unido a ella aparece un carotenoide derivado del retinal y que recibe ese mismo nombre.

La luz, al incidir sobre el retinal, hace que éste pase de configuración trans a configuración cis. En esta transformación se produce la salida de protones al exterior celular. Cuando no hay luz el retinal vuelve a su configuración trans captando un protón del interior celular.

Cuando hay suficientes protones en el exterior se crea un gradiente electroquímico que será aprovechado por la ATPasa para generar ATP gracias a la fuerza protón motriz.

Debido a que la concentración salina externa es muy alta estos microorganismos utilizan los llamados “solutos compatibles” para que la célula no se colapse, es decir, acumulan grandes cantidades de K (en este caso) para equilibrar las concentraciones a un lado y a otro de la membrana y evitar así la plasmólisis.

3.2 Bacterias MetanogénicasSe trata de un grupo compuesto por anaeróbios estrictos. Utilizan diferentes compuestos como el CO2, H2, metanol y ácido acético para formar metano. En este proceso se sintetiza también la energía (se trata de una reducción, no una oxidación)

G. Methanobacterium

Género compuesto por bacilos gram positivos. Presentan en su pared celular pseudomureína.

G. Methanosarcina

Grupo compuesto por cocos gram positivos. Su pared celular está formada por proteínas

G. Methanospirilum

Son organismos gram negativos. Poseen una pared celular formada por polisacáridos.

Se trata de un grupo con características muy diversas. Metabólicamente son también especiales. Presentan enzimas y coenzimas exclusivas de este tipo de organismos:

- Tetrahidroximetanopterina

- Metanofurano

- Coenzima M

- Coenzimas F420 y F430

Viven en ambientes anaeróbicos ricos en materia orgánica (rúmen, intestino, pantanos, ciénagas, digestores de anaeróbios de plantas depuradoras,...)

Poseen una gran importancia ecológica puesto que son unos microorganismos muy activos y producen grandes cantidades de metano, un gas invernadero que, junto con el

CO2, contribuye al calentamiento global. El metano también se puede utilizar como combustible (Ej. Autoabastecimiento de una planta de depuración de aguas)

La materia orgánica al degradarse dará lugar a dióxido de carbono, hidrógeno y ácidos orgánicos, y dichos productos serán utilizados por las bacterias metanogénicas para crecer. A su vez, el metano producido por estos organismos será aprovechado por muchos otros (bacterias metanotrofas y metilotrofas)

Proceso de formación del metano

- CO2 + H2 ---------------------- CH4 + 2H2O (-131 kj)

- CH3OH + H2 ------------------ CH4 + H2O (-131 kj)

- CH3-COO- + H2O ------------ CH4 + CO2 (-31 kj)

Los organismos que realizan la primera reacción, fijarán CO2 (autótrofos) pero no por el Ciclo de Calvin. Los que realicen las otras dos rutas serán heterótrofos.

Las bacterias metanogénicas obtienen ATP mediante un sistema particular. En la reducción de metilo a metileno (catalizada por la coenzima metilreductasa o complejo F430, que se sitúa en la membrana) sobra un protón, el cual es extruido al exterior celular. Se va creando así un gradiente electroquímico de protones que, al disiparse, generará una fuerza protón motriz que será aprovechada por la ATPasa para sintetizar energía por fosforilación oxidativa.

3.3 ThermoplasmasLos organismos de este grupo son termoacidófilos y no presentan pared celular.

G. Thermoplasma

Es un género asociado a las pilas de desperdicios de las minas de carbón (ricas en pirita, que al ser descompuesta por otro tipo de bacterias dará como producto ácido sulfúrico, entre otras cosas) El pH en este hábitat es muy bajo, y la temperatura es relativamente elevada.

Son organismos anaeróbios facultativos. Su temperatura y pH óptimos de crecimiento son unos 60ºC y de 1 a 2 puntos de pH. Para resistir a la acidez del medio cuentan con una membrana plasmática diferente, compuesta por cadenas de isoprenoides (diéteres de bifitanil) unidos a polisacáridos y proteínas.

G. Picrophilus

Presentan una capa S proteica alrededor de la membrana plasmática. Su temperatura y pH óptimos de crecimiento son unos 50-65ºC y de 0 (0,0006) a 3,5 puntos de pH (no sobrevive a pH mayores de 3,5)

3.4. ThermococosSon microorganismos de forma cocoide. Pueden vivir en las condiciones de temperatura más extremas.

G. Thermococcus

Organismos anaeróbios estrictos. Su temperatura óptima de crecimiento está entre 90 y 100ºC

G. Thermopyrus

Son organismos de forma cocoide (metanogénicos) Su temperatura óptima de crecimiento está en torno a 100ºC, aunque se ha encontrado ejemplares a 110ºC