-complementación Expresión proteínas-BM 2009 Cepa E. coli LacZ
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-complementación
Expresión proteínas-BM 2009
Cepa E. coli LacZ
Diseño de una estrategia para expresión de proteínasDiseño de una estrategia para expresión de proteínas
Elección del vectorAplicación u objetivos experimentales con la proteína expresadaInformación conocida de la proteína. Selección de la estrategia de clonado: solubilidad/localización subcelular/fusión a tags/regulación de la expresión.
Preparación del vectorcorte con ER/desfosforilación/purificación
Preparación del inserto de DNA plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación
Clonado del inserto dentro del vectorLigación/transformación en huesped/identificación.
De clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación.
Transformación dentro del huesped para expresión.
Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés análisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica.
Scale-up Purificaión de la proteína y análisis funcional
0-Expresión proteínas-BM 2009
Sistemas de expresión de proteínasSistemas de expresión de proteínas
1-Expresión proteínas-BM 2009
Sistema Vel de crecimiento/ Costo
Nivel de
expresión
Modificaciones post-traduccionales
E. coli 30 min.
Bajo
Alto NO
Levaduras 90 min
Bajo
Medio glicosilación
Alta manosa
Células insectos 18-24 hs.
Alto
Medio glicosilación
(largo, contenido manosa)
Células mamíferos 24 hs
Alto
Bajo Si
2-Expresión proteínas-BM 2009
Elección del sistema de expresión en Elección del sistema de expresión en E. coliE. coli
1) Tamaño de la proteína:
< 100 aminoácidos: estables como proteínas de fusión.
>100 aminoácidos: inestables van a cuerpos de inclusión.
Cuerpos de inclusión: agregados insolubles intracelulares.Ruptura células (sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis
2) Cantidad de proteína:
- Poca cantidad (screening de mutantes): plásmidos de expresión standard
- Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de purificación.
3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión.
3-Expresión proteínas-BM 2009
Proteínas expresadas en Proteínas expresadas en E. coliE. coli
1) Proteínas de fusión:
Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target.
Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión
purificación
protege de proteólisis a la proteína de interés
mejora la solubilidad de la proteína
estabiliza a la proteína de interés
oriAmpr
ATG A B MCSPromotor
A Secuencia “tag”:*Dominio con función enzimática*Señales topogénicas
B Secuencias consenso paraCorte con una proteasa
MCS Sitio múltiple de clonado
Esquema genérico del vector
4-Expresión proteínas-BM 2009
Fusion partner gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... EndATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of fusion partner gene must be removedNote: reading frame of fusion protein must be contiguous
Construcción de una proteína de fusiónConstrucción de una proteína de fusión
Secuencias consenso para el corte con una proteasa– Clivan una secuencia corta y definida de aa– La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés
fusion partner gene of interest
protease cleavage sequence
5-Expresión proteínas-BM 2009
Esquema general purificación de proteínas de fusión:GSTEsquema general purificación de proteínas de fusión:GST
Glutation
Corte con proteasa
GST Proteína
1-
2-
3-
4- Elution
6-Expresión proteínas-BM 2009
Optimización de la expresión de proteínas en Optimización de la expresión de proteínas en E. coliE. coli
1) Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA
Se requiere optimizar la traducción.
UAAGGAGGAUUCCUCC AUG5’ 3’
mRNA
3’ 5’16S rRNA
small ribosomal subunit
Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en
16S rRNA (subunidad pequeña del ribosoma)
Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG
7-Expresión proteínas-BM 2009
2) Uso de codones: El código genético es redundante, usa 61 codones para 20 aa.Los codones (excepto Met y Trp con 1 codón c/u) que codifican para un aa no sonusados con igual frecuencia. Algunos codones usados infrecuentemente=↓[RNAt]
Codon Aminoácido Frec. uso en E. coli
Frec. uso en humanos
GAG Glutámico 0,3 0,59
GAA Glutámico 0,7 0,41
CCG Prolina 0,55 0,11
CCA Prolina 0,20 0,27
CCU Prolina 0,16 0,29
CCC Prolina 0,10 0,33
Cepa RosettaTM: cepa diseñada para aumentar la expresión de proteínas eucariotas que poseen codones de baja frecuencia en E.coli.
8-Expresión proteínas-BM 2009
3) Estructura del mRNA:
Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNAno debe ser complementaria a sí misma, podría bloquear el movimiento del ribosoma y evitar la traducción
4) Cepas deficientes en proteasas: Lon y OmpT
9-Expresión proteínas-BM 2009
10-Expresión proteínas-BM 2009
Elección del promotor Elección del promotor
Promotores basados en el operón Lac:
1) Promotor Lac
Lac promoter
11-Expresión proteínas-BM 2009
pGEM®-3Z Vector sequence reference points.T7 RNA polymerase transcription initiation site 1; multiple cloning region 5-61SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3) 67-86; SP6 RNA polymerase transcription initiation site 69lac operon sequences 94.323; 2564-2724binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 104-125lacZ start codon 108; lacZ operator 128-144β-lactamase (Ampr) coding region 1265-2125binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2677-2700T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2727-3Cepa huesped: lacZM15. Expresa LacIq
2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac
• Híbrido de promotores lac y trp
• Regulado por el represor lac
• Independiente de la regulación por cAMP
12-Expresión proteínas-BM 2009
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
-35 promotor trp -10 promotor lac
Separación16 pb=promotor tac
17 pb=promotor trc
Gen de interés
Ptac promoter
MalE: secuencia señal de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP), periplásmica con alta afinidad por maltosa.
Promotor Ptac/IPTG:
Polylinker:
: terminador de la transcripción
13-Expresión proteínas-BM 2009
3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriófago T7:
14-Expresión proteínas-BM 2009
Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para expresarse
lac pro T7 RNA Pol
g10 pro gene of interest
Protein of Interest
Inducer
T7 RNA Pol
T7 RNA PolEl gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el control del promotor lac en genómico de E.coli
El gen de interés puede estar bajo el control del
promotor del gen 10
T7 promoter
15-Expresión proteínas-BM 2009
pRSET Expression Vector
The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers:
•High-level expression from the bacteriophage T7 promoter
•T7 gene 10 sequence to provide protein stability
•N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin
•N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody
•Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag
•f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis
18-Expresión proteínas-BM 2009
PL promoter- triptofano
17-Expresión proteínas-BM 2009Mechanism of transcriptional regulation with pLEX
POPtrp cI repressor
Bacterial Chromosome
POPL ATG-GENE
cI repressorNo transcription
Transcription
pLEX vector
No tryptophan
POPtrp cI repressor
Bacterial Chromosome
POPL ATG-GENE
No transcription
Transcription
pLEX vector
Tryptophan
trp repressor
4) Promotores basados en el promotor del bacteriófago pL:
Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:• Inestables.• Sin actividad biológica.• Contaminantes procarióticos.
Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas• Esp. importantes para proteínas terapéuticas.• Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y
funcionales a la proteína natural.
Modificaciones post-traduccionales– Formación de uniones disulfuro correctas.– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación,
agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos
19-Expresión proteínas-BM 2009
Levaduras como sistema de expresiónLevaduras como sistema de expresión
• Rápido crecimiento, bajo costo similar a E coli. • Modificaciones postraduccionales escenciales para la función proteica.• Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y O-glicosilación: uso de levaduras con N-gycosilación humanizada.
Saccharomyces cerevisiae• Económico, bioseguro para aplicaciones humanos.• Posee características bioquímicas, genéticas, similiar a eucariotas superiores.• Es adaptable a fermentación gran escala. • Herramienta para estudios de complementación. •otros Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.
20-Expresión proteínas-BM 2009
Tipos de vectores
• YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma
• YEp: episomales: ori 2 (alto número de copias)
• YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)
Promotores
Vectores de levadurasVectores de levaduras
Promoter Status
Acid phosphatase PHO5 InducibleAlcohol dehydrogenase I ADH I ConstitutiveAlcohol dehydrogenase II ADH II InducibleGalctokinase GAL 1 InducibleMetallothionein Cup 1 InduciblePhosphoglycerate kinase PGK ConstitutiveTriose Phosphate isomerase TPI Constitutive
21-Expresión proteínas-BM 2009
Vectores episomales
22-Expresión proteínas-BM 2009
Vectores centroméricos
23-Expresión proteínas-BM 2009
Expresión de proteínas en Expresión de proteínas en Pichia pastorisPichia pastoris
1) Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae)
2) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular)
3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento proteolítico.
4) Kits de expresión disponibles.
5) Empleo del gen AOX1
24-Expresión proteínas-BM 2009Diagrama general de un vector P pastoris shuttle
MCS
Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli
AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.
AOX1t: secuencias terminador transcripción.
MCS: sitio múltiple clonado.
HIS4: marcador biosintético.
3´-AOX1
25-Expresión proteínas-BM 2009
Integración del vector de P. pastoris
•Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión.
•Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)
•Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos.
•Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas).
Inserto
Inserto
Selección en medio his-
Cepa resultante aox1=Muts
Metanol: crec lento, alta producción prot.
26-Expresión proteínas-BM 2009
Pichia methanolica Expression System
Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol oxidasa):
reprimido por glicerol o glucosa
Inducido por metanol
-factor: péptido señal para secreción de la proteína expresada.
V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5
6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa.
ADE2: marcador biosintético.