Xenotrasplante de islotes Xenotrasplante de islotes porcinos y células de Sertoli en porcinos y células de Sertoli en

pacientes diabéticos tipo 1. pacientes diabéticos tipo 1.

Dr. Rafael Valdés González-Salas

Laboratorio de Xenotrasplantes,Hospital Infantil de México Federico Gómez,

México, D.F. MEXICO.

AntecedentesAntecedentes

AntecedentesAntecedentes

• Diabetes en México.• Evolución del tratamiento

convencional.• Evolución del esquema intensivo• Trasplante de islotes (alogénico).• Trasplante de islotes (xenogénico).

JustificaciónJustificación

• Aún con el esquema intensivo las complicaciones aparecerán.

• En transplantes alogénicos:– Escasez de donadores cadavéricos.– Mayor riesgo de transmisión de

enfermedades. – Complicaciones quirúrgicas – Daño hepático– Alto costo del tratamiento inmunosupresor– Alto riesgo de complicaciones secundarias– Tiempo de sobrevida corto

XenotrasplanteXenotrasplante

• Riesgo de infección por Retrovirus Endógeno Porcino (PERV)

• Otras zoonosis

Retos del XenotrasplanteRetos del Xenotrasplante

• Supervivencia de las células implantadas: – Rechazo inmunológico– Factores no inmunológicos

• Compatibilidad funcional de las células implantadas– De la insulina porcina y otras hormonas– De los sistemas reguladores humanos

Diseño ExperimentalDiseño Experimental

a) Creación de un sitio inmunológicamente privilegiado:

• Dispositivo • Formación de colágena autóloga• Inmunomodulación por células de

Sertoli

b) Trasplante Islotes + Sertoli

DispositivoDispositivo

Usamos un dispositivo diseñado en Usamos un dispositivo diseñado en nuestro laboratorio, que consiste en un nuestro laboratorio, que consiste en un cilindro de malla metálica de 6 cm de largo, cilindro de malla metálica de 6 cm de largo, con dos tapones de polipropileno, uno de con dos tapones de polipropileno, uno de ellos con un émbolo que llena el cilindro. ellos con un émbolo que llena el cilindro.

Implante del dispositivoImplante del dispositivoDos meses antes del xenotrasplante, Dos meses antes del xenotrasplante, dos a cuatro dispositivos fueron dos a cuatro dispositivos fueron implantados subcutáneamente en la implantados subcutáneamente en la pared abdominal anterior. pared abdominal anterior.

Procesamiento de Islotes y Procesamiento de Islotes y SertolisSertolis

El páncreas y los testículos son El páncreas y los testículos son macerados y digeridos con una macerados y digeridos con una

solución de Liberasa HI. solución de Liberasa HI.

Se utilizan Se utilizan cerdos de 7 cerdos de 7 días de vidadías de vida

El páncreas es El páncreas es removido removido

inmediatamentinmediatamente después de e después de eutanasia por eutanasia por

exanguinación. exanguinación.

Los islotes y las Sertolis Los islotes y las Sertolis son cultivados son cultivados

separadamente a 37°Cseparadamente a 37°C

Control de calidadControl de calidadLa pureza de los islotes La pureza de los islotes

es de 88%es de 88%Con tinción de Ditizona.Con tinción de Ditizona.

Pureza de Sertoli 93.6%:Pureza de Sertoli 93.6%:por MIS y sox9.por MIS y sox9.

La viabilidad es determinada por La viabilidad es determinada por tinción de ioduro de propidio tinción de ioduro de propidio (Islotes:94%, Sertoli 95%) (Islotes:94%, Sertoli 95%)

Apoptosis (Islotes: 4.8%, Apoptosis (Islotes: 4.8%, Sertoli 10.5%)Sertoli 10.5%)

Cytometría de flujo contra Cytometría de flujo contra Annexina Annexina

Funcionalidad:Funcionalidad:

Índices de Índices de estimulación de estimulación de

Islotes =11.5Islotes =11.5

Sertoli:Sertoli:detección de detección de ClosterinasClosterinas

Diseño ExperimentalDiseño Experimental

– Reclutamiento Reclutamiento totalmente voluntariototalmente voluntario

– Pronóstico con Pronóstico con tratamientos actualestratamientos actuales

– Procedimiento Procedimiento ExperimentalExperimental

– ObjetivosObjetivos

– MetasMetas– RiesgosRiesgos– Costo económicoCosto económico– Obligaciones del Obligaciones del

voluntariovoluntario– Obligaciones del Obligaciones del

HospitalHospital

•12 adolescentes con Diabetes Tipo 1 12 adolescentes con Diabetes Tipo 1 •Consentimiento Informado:Consentimiento Informado:

BioéticaBioética

• Instituciones revisoras:– Comisión Nacional de Bioética– Facultad de Medicina, UNAM– Hospital Infantil de México Federico

Gómez

BioéticaBioética• Cumplimiento de la declaración de Helsinki

– “Art. 32. Cuando los métodos preventivos, diagnósticos o terapéuticos disponibles han resultado ineficaces en la atención de un enfermo, el médico, con el consentimiento informado del paciente, puede permitirse usar procedimientos preventivos, diagnósticos y terapéuticos nuevos o no probados, si, a su juicio, ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible, tales medidas deben ser investigadas a fin de evaluar su seguridad y eficacia. En todos los casos, esa información nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, publicada. Se deben seguir todas las otras normas pertinentes de esta Declaración..”

Diseño ExperimentalDiseño Experimental• Monitoreo:

– Requerimientos de insulina exógena– Hemoglobina glicosilada– Insulina porcina circulante – Antígenos Anti -Gal y hemolíticos de cerdo– PERV (incluyendo familiares cohabitantes)

• 1 dispositivo removido 3-5 años después, para permitir el retrasplante y tratar de obtener independencia de la insulina.– Detección inmunohistoquímica de:

• Células positivas a Glucagon• Células positivas a Insulina• Células positivas a CD3, CD4 y CD8• Células positivas a MIS y sox9 (Sertoli)

SeguridadSeguridad

• Medidas de seguridad de los animales en la granja:– Granja cerrada y aislada (5km).– Red contra aves.– Barreras contra roedores.– Programa extensivo de vacunación– Cuarentena estricta (Baño de entrada – Baño

de salida).– Monitoreo de salud aleatorio.– Registro e identificación detallada de cada

animal.

SeguridadSeguridad• Medidad de seguridad de los animales

donadores.• Tamiz microbiológico para:

– Aujeszky (elisa)– Erisipela (elisa)– Salmonella sp.(elisa)– Salmonella sp.(cultivo de hígado y válvula ileocecal)– Brucella a. (aglutinación).– Influenza Porcina (inhibición de aglutinación)– Leptospira (microaglutinación 16 especies).– Mycoplasma hyopneumoniae (elisa)– Coronavirus (elisa)– Toxoplasmosis (elisa)

ContingenciasContingenciasObserv. Clínica o Observ. Clínica o

de Lab de Lab sospechosasospechosa

Reunión Reunión de de

PersonaPersonall

DiagnósticoDiagnóstico

Tratamiento Tratamiento específicoespecífico

SeguimientoSeguimiento TratamientoTratamiento

HospitalHospitalOMSOMS

Granja Granja ProductoraProductora

Manual de Manual de bioseguridad de bioseguridad de

la granjala granja

Instituciones Instituciones ExternaExterna

ContactarContactarfamilias yfamilias yPersonas Personas cercanascercanas

Secretaría Secretaría de Saludde Salud

CuarentenaCuarentena

Retrovirus Endógeno PorcinoRetrovirus Endógeno Porcino

20361636

1018

506396

1 2 3 4

PERV 814 bp

Carriles:

1. Marcadores de tamaño

2. Control Negativo

3. DNA porcino

4. DNA de Pacientes

ResultadosResultados• Anticuerpos Anti -Gal

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

PreTx Día 7 Día 14 1mes 3mes 6mes Día 7 1mes

títu

los

1año

Tiempo Post trasplante

2nd Tx2° Tx

1212

1212

1212

88

1111

99

8855

1212

Anticuerpos en el ensayo Anticuerpos en el ensayo Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco

(1990-1993)(1990-1993)Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001: exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001: 8; 273-283.8; 273-283.

22

44

88

1616

3232

6464

128128

256256

Valdes et al.Valdes et al. Groth et al.Groth et al.

**p<0.0001, Mann-Whitney U testp<0.0001, Mann-Whitney U test

Tit

er (

mea

n ±

sem

)T

iter

(m

ean

±se

m)

Requerimientos de InsulinaRequerimientos de Insulina

ResultadosResultados

0102030405060708090

ML (97%)

JO (68%)

PA (51%)

GS(100%)

AA (34%)

DO (86%)

Insu

lina E

xógena

Uni

dades/

día

Pre Tx Post Tx

•El primer grupo de 12 pacientes trasplantados al primer año del trasplante,

•6 no tuvieron reducciones, 6 mostraron reducciones variadas.

Paciente (% Reducción)

13

13 99

9.9

9.9

6.6

6.6

7.9

7.9 77 12

12

6.7

6.7

10

.81

0.8

7.4

7.4

8.9

8.9

7.1

7.1

HemoglobinaHemoglobinaGlicosiladaGlicosilada

ResultadosResultados

• Detección de insulina porcina en suero por HPLC

ResultadosResultados

• Un dispositivo fue removido de cada uno de los pacientes, para poder ser retrasplantados y posiblemente llegar a la independencia de insulina.

• Los dispositivos removidos fueron analizados por inmunohistoquímica para insulina, glucagon, MIS (un marcador de células de Sertoli), y CD3, CD4 y CD8.

InsulinaInsulina

11 11

22 22

33 334444

HEHE

GlucagonGlucagon

Sustancia Inhibidora Sustancia Inhibidora Mulleriana (MIS)Mulleriana (MIS)

ResultadosResultados

11

11

22

22

33

3344

44

55

55

66

66

CD3 HumanoCD3 Humano

InsulinaInsulina

Q-03-164-5Q-03-164-5

ResultadosResultados

ConclusionesConclusiones

• No ha habido señales de zoonosis• No hay complicaciones metabólicas• No hay intolerancia al dispositivo o al

procedimiento. • El sistema inmune de los pacientes

se mantiene intacto, medido por reacciones intradérmicas.

ConclusionesConclusiones

• Respuesta Inmune– Persistencia de insulina (100% de los

dispositivos removidos) y células positivas a glucagon (90%) en cantidades variables después de 5 años, y de manera sorprendente, coexistiendo con linfocitos T

– No hay correlación entre los niveles de anticuerpo y supervivencia de las células.

– No hay una respuesta típica después del retrasplante

ConclusionesConclusiones

• Modificaciones en los requerimientos de insulina exógena– En 50% de los casos hubo reducciones, en

algunos casos cerca de 100% por varios meses.

– El otro 50% pudiera no haber tenido suficientes células supervivientes, o una menor sensibilidad a la insulina.

• La presencia de insulina porcina se ha podido detectar en la circulación por medio de HPLC

Pasos InmediatosPasos Inmediatos

• Identificar los sistemas antigénicos en el cerdo que sean importantes para el xenotrasplante a humano– Respuesta humoral

• Anticuerpos Anti -Gal• Grupos sanguíneos tipo ABO• Fenómeno de Acomodamiento en los dispositivos• Pruebas de reactividad cruzada para antígenos

proteicos en islotes y Sertolis contra anticuerpos humanos preformados.

– Respuesta celular• Caracterización de los linfocitos T en los

dispositivos.

Pasos InmediatosPasos Inmediatos

• Cuantificación de la composición celular dentro de los dispositivos.

Hospital Infantil de México Hospital Infantil de México “Federico Gómez”“Federico Gómez”

Colaboración con otras Colaboración con otras Instituciones.Instituciones.

Dr Camillo Ricordi, Dr Luca InverardiDiabetes Research Institute,

University of Miami

Dr David White,Robarts Research Institute,University of Western Ontario

Dr Gordon Weir,Joslin Diabetes Center.Boston, MA

Dr Robert Elliott,Diatranz Ltd, New Zealand