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J O H N J A I R O H I N C A P I E P H . D .
J E S S I C A G A R C Í A R E C I L L A S I N G . A G R .
J O S E L U I S M A R T Í N E Z Q U I N T E R O I N G . A G R .
Implementación de un protocolo de fertilización in vitro en bovinos en el
laboratorio de reproducción animal de Zamorano
Biotecnología de la reproducción • Herramientas
Fertilización In Vitro (FIV) • Ventajas
Producción de embriones • Obtención de oocitos • Maduración in vitro • Fertilización in vitro • Cultivo in vitro
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Preparación de medios:
• Solución salina al 0.9% (NaCl) • Medio de Colección de Oocitos (OCM) • Medio de Maduración de Oocitos (CCOs-MMO) • Soluciones TL • Medios TALP (Tyrode´s Albumina Lactato Pyruvato) • Fluido Sintético de Oviducto (SOF) • Percoll 90%
2. Lavado de ovarios:
• Solución de transporte
3. Recolección de oocitos:
• Microgotas flotantes de 50µL • Incubadora • Selección de ovarios y aspiración • Medio OCM a baño María (5mL) • Placa de búsqueda y placa nunclon • 20 oocitos por microgota
4. Maduración in vitro:
• Búsqueda en placa grid • Lavado y transferencia de oocitos
5. Fertilización in vitro:
• Elaboración de Percoll • Percoll 90% y Percoll 45% • Evaluación de semen • Placa nunclon y Hepes-TALP • Capacitación del semen • Penicilamina-Hipotaurina-
Epinefrina. • IVF-TL
6. Cultivo de embriones:
• Microgotas de SOF • Hepes- TL y hialuronidasa • Vortex • Lavado de embriones • Desarrollo embrionario al tercer día • Adición de suero fetal inactivado: quinto día • Blastocistos al día 7
Fernández et al. (1999): 45.98% y 54.01% Huanca et al. (2007): 60.7%. Cansino Arroyo et al. (2008): 63.14% y 36.89%
Número de oocitos recuperados utilizando la técnica de aspiración ovárica.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Repetición Ovarios
aspirados Oocitos
extraídos Oocitos viables
extraídos
Oocitos degenerados
Promedio de oocitos viables
por ovario
1 32 221 145 (65.61%) 76 (34.38%) 4.5
2 37 223 147 (65.92%) 76 (34.08%) 4.0
Total 69 444 292 (65.76%) 152 (34.23%) 4.2
Zona pelúcida
Zona pelúcida
Células del cumulus
oophorus
Detritus
A B
Oocitos obtenidos de la punción ovárica con sus estructuras. A) Oocito viable B) Oocito degenerado.
Fernández Reyes et al. (2010): en cerdas 32.1% y 67.8% Cansino Arroyo et al. (2008): SIT (74.93%), SIA (74.68%) y SIC (69.87%).
Porcentaje de Maduración In Vitro (MIV)
Repetición Oocitos iniciales Oocitos madurados Oocitos no madurados
1 145 85.52% (124) 14.48% (21)
2 147 73.47% (108) 26.53% (39)
Total 292 79.45% (232) 20.55% (60)
Oocitos obtenidos de maduración in vitro. A) Partes de un oocito madurado B) Oocito madurado y no madurado.
A B
Cansino Arroyo et al. (2008): SIT (42.48%), SIA (34.94%) y SIC (31.12%). Fernández et al. (1999): 70%
Porcentaje de fertilización in vitro de oocitos bovinos.
Repetición Oocitos maduros
iniciales Oocitos fecundados Oocitos no fecundados
1 124 45.16% (56) 54.83% (68)
2 108 41.66% (45) 58.33% (63)
Total 232 43.53% (101) 56.46% (131)
Lopez et al. (2007): 31%, 32% ,37% y 43% . Mejía Isaza et al. (2009): KSOMaa (44%)
Porcentaje de clivaje y apoptosis
Repetición Número de oocitos
fecundados Oocitos en proceso
de clivaje Oocitos en proceso de
apoptosis
1 56 58.9% (33) 41.1% (23)
2 45 51.1% (23) 48.8% (22)
Total 101 55.4% (56) 44.5% (45)
Embriones en clivaje obtenidos en el Laboratorio de Reproducción Animal de la EAP Zamorano. A) Estados embrionarios de clivaje. B) Selección de blastocistos con la pipeta Drummond.
Pipeta Drummond
B A
Embriones en clivaje
(Blastocisto)
Fernández et al. (2007): 0%, 2.1 % y 2.6% Mejía Isaza et al. (2009): KSOMaa (0%) y CR1aa (15%) Ratto et al. (1999): 15.7% en células oviductuales y 0% en medio condicionado. Ahuja Aguirre et al. (2009): KSOM (31.6%)
Porcentaje de blastocitos obtenidos al día siete.
Repetición Oocitos en proceso de clivaje Número de blastocistos
1 33 45.5% (15)
2 23 65.2% (15)
Total 56 53.6% (30)
CONCLUSIONES Bajo las condiciones del Laboratorio de Reproducción Animal de la EAP Zamorano se obtuvieron:
• Mayor número de oocitos viables extraídos y un promedio de oocitos viables
por ovario similar al de la literatura citada.
• Mayor porcentaje en maduración in vitro y blastocistos al día 7.
• Menor porcentaje de fertilización in vitro y apoptosis.
• Porcentaje de clivaje similar a los reportados en la literatura científica
Ingrediente Sp-TL HEPES-TL IVF-TL
Agua (mL) 79.232 177.0 40.157
Solución 17: NaCl (mL) 4.34 10.0 2.5
Solución 18: KCl (mL) 1.96 4.0 1.0
Solución 19: bicarb (mL) 10.00 1.6 5.0
Solución 20: phosphate (mL) 1.0 2.0 0.50
Solución 1: Na-lactate (mL) 0.368 0.372 0.093
Solución 21: HEPES (mL) 1.0 2.0 0
Solución 22: Ca chloride (mL) 1.0 2.0 0.50
Solución 23: Mg chlor (mL) 1.10 1.0 0.25
pH 7.4 7.3 7.4
Osmolaridad (mOsm) 295-305 275-285 290-300
Ingrediente Sp-TALP HEPES-TALP IVF-TALP
TL (mL) 38.0 100.0 50.0
BSA, Fracción V (mg) 240 300 0
BSA, EFAF (mg)* 0 0 300
Solución 2: pyruvato (mL) 2.0 1.0 0.5
Solución 8: gentamicina (μL) 80 150 50
Solución 7: heparina (μL) 0 0 250
Nº de ovocitos por ovario puncionado= 10
Porcentaje de ovocitos clivados / ovocitos totales = 80
Porcentaje de embriones / ovocitos totales al día 7 de
cultivo = 30
Porcentaje de preñez al día 30 = 50
Eficiencia del sistema de producción in vitro
100 ovocitos = 30 embriones transferibles
15 preñeces a los 30 días
13 nacimientos
Eficiencia global
Q|
Producción in vitro de embriones
• Transgénesis • Clonado
Aplicaciones/Ventajas
• Aumenta y estandariza su producción
• Facilita el progreso genético (puede duplicar la producción in vivo por
superovulación)
• Optimiza el uso de semen de alto valor
• Aprovechar donantes
Producción in vitro de embriones
Aplicaciones/Ventajas
Aumenta y estandariza su producción, facilita el progreso genético
•IA o Servicio Natural: 6 terneros •SOTE: 40 terneros •OPU: 80 terneros
Producción in vitro de embriones
Aplicaciones/Ventajas
Optimiza la utilización de semen de alto valor
•IA 1,5 dosis: 1 ternero •SOTE 2 dosis: 2 terneros •PIV 1 dosis: 1 hasta 120 terneros
Producción in vitro de embriones
Aplicaciones/Ventajas
Aprovechar donantes
•Hembras prepúberes
•Hembras con defectos adquiridos que impidan
la gestación
•Hembras sin respuesta superovulatoria
•Hembras preñadas
•Hembras faenadas/castradas